CN111635886A - 一种间充质干细胞的制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及间充质干细胞技术领域，且公开了一种间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：1)从骨髓中收集样本，将血液样本和细胞分离液加入分离罐中进行细胞分离，得到细胞胚胎，使胚胎体附着到培养皿以诱导胚胎体自发分化为间充质干细胞，以增殖性方式培养间充质干细胞，对细胞进行分选以获得间充质干细胞，同时维持间充质干细胞的一致性。该间充质干细胞的制备方法与应用，提升间充质干细胞的抗炎能力并促进其细胞外囊泡大量释放，通过鼻内注入间充质干细胞及细胞外囊泡，抑制大脑小胶质细胞的激活，增加树突棘(大脑中提供认知弹性的结构)的密度，对于阿兹海默症有所疗效。
Description
技术领域
本发明涉及间充质干细胞技术领域，具体为一种间充质干细胞的制备方法与应用。
背景技术
间充质干细胞是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力，在临床应用也最多，与造血干细胞联合应用，可以提高移植的成功率，加速造血重建，当患者接受大剂量化疗后，将间充质干细胞与造血干细胞一同输入，可明显加速患者血细胞恢复时间，且安全无不良反应。
通过鼻内注射细胞外囊泡能减少炎症，而炎症被认为是阿尔茨海默病的主要因素，从而加强了这一观点，它们还会引发保护大脑神经元免受进一步退化影响的行动，通过非侵入性途径应用细胞外囊泡方式并配合其抗炎功效，提供了一种间充质干细胞的制备方法与应用加强对间充质干细胞的研究。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种间充质干细胞的制备方法与应用，针对间充质干细胞及细胞外囊泡在阿尔茨海默病上应用的问题。
(二)技术方案
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
1)从健康的人类捐献者的骨髓中收集样本，将血液样本和细胞分离液加入分离罐中进行细胞分离，得到细胞胚胎，使胚胎体附着到培养皿以诱导胚胎体自发分化为间充质干细胞，以增殖性方式培养间充质干细胞，对细胞进行分选以获得间充质干细胞，同时维持间充质干细胞的一致性；
2)将获得的间充质干细胞转移至培养罐，向培养罐中加入微载体以使间充质干细胞贴附微载体生长，向培养罐中加入培养基，排出培养罐中的废液，并向培养罐中加入微载体，以使间充质干细胞扩增；
3)当细胞密度接近90％时，加入含有抗坏血酸的完全培养液培养8-9天，用称为细胞因子的蛋白质对间充质干细胞进行预处理，以增强间充质干细胞的抗炎能力并促进其细胞外囊泡释放；
4)加入脱细胞液分离细胞外囊泡以及间充质干细胞；
5)收集获得的间充质干细胞和细胞外囊泡终产品，进行细胞洗涤后包装。
优选的，细胞外囊泡作为细胞间通信的一种形式在细胞间运输货物，细胞外囊泡包括DNA、RNA和蛋白质，可以清除细胞中的有害物质，本方法采用的细胞外囊泡不含动物源成分。
优选的，所述培养基内包括有α-MEM(液体培养基)和胎牛血清，它们的体积比为(4-9):1，并且培养基含有抗生素，抗生素的含量为10～200U/mL，培养基中还含有抗坏血酸100-200uM。
本发明提供的间充质干细胞在治疗阿兹海默症领域的时，通过鼻内注入间充质干细胞及细胞外囊泡，抑制大脑小胶质细胞的激活，增加树突棘(大脑中提供认知弹性的结构)的密度。
本发明提供的间充质干细胞在细胞培养时，可直接加入，延缓细胞衰老。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种间充质干细胞的制备方法与应用，具备以下有益效果：
该一种间充质干细胞的制备方法与应用，提升间充质干细胞的抗炎能力并促进其细胞外囊泡大量释放，通过鼻内注入间充质干细胞及细胞外囊泡，抑制大脑小胶质细胞的激活，增加树突棘(大脑中提供认知弹性的结构)的密度，对于阿兹海默症有所疗效。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
1)从健康的人类捐献者的骨髓中收集样本(需要质量更高的样本，猪、牛等生物难以满足应用需求，以科研目的收集志愿者的样本即可)，将血液样本和细胞分离液加入分离罐中进行细胞分离，得到细胞胚胎，使胚胎体附着到培养皿以诱导胚胎体自发分化为间充质干细胞，以增殖性方式培养间充质干细胞，对细胞进行分选以获得间充质干细胞，同时维持间充质干细胞的一致性；
2)将获得的间充质干细胞转移至培养罐，向培养罐中加入微载体以使间充质干细胞贴附微载体生长，向培养罐中加入培养基，排出培养罐中的废液，并向培养罐中加入微载体，以使间充质干细胞扩增；
3)当细胞密度接近90％时，加入含有抗坏血酸的完全培养液培养8-9天，用称为细胞因子的蛋白质对间充质干细胞进行预处理，以增强间充质干细胞的抗炎能力并促进其细胞外囊泡释放；
4)加入脱细胞液分离细胞外囊泡以及间充质干细胞；
5)收集获得的间充质干细胞和细胞外囊泡终产品，进行细胞洗涤后包装。
优选的，细胞外囊泡作为细胞间通信的一种形式在细胞间运输货物，细胞外囊泡包括DNA、RNA和蛋白质，可以清除细胞中的有害物质，本方法采用的细胞外囊泡不含动物源成分。
优选的，所述培养基内包括有α-MEM(液体培养基)和胎牛血清，它们的体积比为(4-9):1，并且培养基含有抗生素，抗生素的含量为10～200U/mL，培养基中还含有抗坏血酸100-200uM。
本发明提供的间充质干细胞在治疗阿兹海默症领域的时，通过鼻内注入间充质干细胞及细胞外囊泡，抑制大脑小胶质细胞的激活，增加树突棘(大脑中提供认知弹性的结构)的密度。
本发明提供的间充质干细胞在细胞培养时，可直接加入，延缓细胞衰老。
本发明的有益效果是：提升间充质干细胞的抗炎能力并促进其细胞外囊泡大量释放，通过鼻内注入间充质干细胞及细胞外囊泡，抑制大脑小胶质细胞的激活，增加树突棘(大脑中提供认知弹性的结构)的密度，对于阿兹海默症有所疗效。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (7)
1.权利要求1所述的一种间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)从骨髓中收集样本，将血液样本和细胞分离液加入分离罐中进行细胞分离，得到细胞胚胎，使胚胎体附着到培养皿以诱导胚胎体自发分化为间充质干细胞，以增殖性方式培养间充质干细胞，对细胞进行分选以获得间充质干细胞，同时维持间充质干细胞的一致性；
2)将获得的间充质干细胞转移至培养罐，向培养罐中加入微载体以使间充质干细胞贴附微载体生长，向培养罐中加入培养基，排出培养罐中的废液，并向培养罐中加入微载体，以使间充质干细胞扩增；
3)当细胞密度接近90％时，加入含有抗坏血酸的完全培养液培养8-9天，用称为细胞因子的蛋白质对间充质干细胞进行预处理，以增强间充质干细胞的抗炎能力并促进其细胞外囊泡释放；
4)加入脱细胞液分离细胞外囊泡以及间充质干细胞；
5)收集获得的间充质干细胞和细胞外囊泡终产品，进行细胞洗涤后包装。
2.根据权利要求1所述的细胞外囊泡，其特征在于，细胞外囊泡作为细胞间通信的一种形式在细胞间运输货物，细胞外囊泡包括DNA、RNA和蛋白质，可以清除细胞中的有害物质，本方法采用的细胞外囊泡不含动物源成分。
3.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述培养基内包括有α-MEM和胎牛血清，它们的体积比为(4-9):1，并且培养基含有抗生素，抗生素的含量为10～200U/mL，培养基中还含有抗坏血酸100-200uM。
4.权利要求1所述细胞外囊泡在治疗阿兹海默症领域的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，通过鼻内注入间充质干细胞及细胞外囊泡，抑制大脑小胶质细胞的激活，增加树突棘的密度。
6.权利要求1所述间充质干细胞在细胞培养中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将待培养细胞接种在间充质干细胞培养板中，在37℃、5％CO2环境下培养。
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