CN112553147A - 一种促进肌肉干细胞增殖的生长因子组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种促进肌肉干细胞增殖的生长因子组合物及其应用，属于干细胞培养及细胞培养肉技术领域。本发明通过多轮MTT及细胞计数等实验结果分别筛除了生长因子MGF、IGF‑I、TGF‑β、TNF‑α、IFN‑γ、IL‑6、VEGF和HGF，确定了一个细胞因子组合LR3‑IGF‑Ⅰ、PDGF‑BB、bFGF和EGF，并将该细胞因子组合用于肌肉干细胞培养，可以使肌肉干细胞高效增殖，大大缩短了细胞的培养时间，且降低了FBS的使用量，为细胞培养肉产业种子细胞和肌肉干细胞的研究提供充足的细胞来源。

Description

一种促进肌肉干细胞增殖的生长因子组合物及其应用
技术领域
本发明涉及一种促进肌肉干细胞增殖的生长因子组合物及其应用，属于干细胞培养及细胞培养肉技术领域。
背景技术
随着世界人口的不断增长和人类经济社会发展水平的不断提升，作为食品供应中重要组成之一的肉制品的消耗量将快速增长。到2050年，全球肉制品消耗预计将超过30000亿美元，市场需求缺口将达到3800万吨，只凭借传统的养殖业很难满足这一需求。同时，传统养殖业也消耗了大量的自然资源，带来大量温室气体的排放且容易造成环境污染。近年来，“人造肉”由于在营养、健康、安全、环保等方面均较传统养殖肉类有显著优势，在社会上引起广泛关注。通常所说的“人造肉”，一般可以分为“植物蛋白肉”和“细胞培养肉”两大类，是未来农产品生产的重要发展趋势。细胞培养肉(Cultured Meat，亦称为培养肉或培育肉)是依据动物肌肉组织生长和修复的原理，利用其干细胞在体外进行人工培养和诱导分化而获得的肉类，只需要少量动物组织来获取细胞即可生产大量肉类，避免了大规模的动物养殖，降低了能源消耗，减少了温室气体排放等问题。
要实现细胞培养肉的大规模生产，首先要高效地获得大量具有分化为肌管潜力的种子细胞。肌肉干细胞(Muscle Stem Cell，又称肌卫星细胞，Satellite Cell)是肌肉组织中的专能干细胞，可以从动物新鲜的肌肉中分离获取，具有肌源性分化的能力，达到一定细胞密度后可自发进行融合从而分化形成肌管和成熟的肌纤维，因此也常作为细胞培养肉的首选种子细胞。肌肉干细胞进行体外增殖培养时其增殖速率和细胞干性会随着培养时间的增加而迅速降低，因此找到合适的物质促进肌肉干细胞在保持干性的前提下能够快速地增殖分裂对肌肉干细胞的体外培养和细胞培养肉的大规模生产十分重要。
生长因子(Growth factor)是由细胞分泌的多肽类物质，对细胞生长、繁殖和分化具有重要作用，主要通过调节不同通路从而调控细胞增殖和分化的过程。在体外培养肌肉干细胞时，添加适合的生长因子，既可以促进干细胞的增殖，也可共同作用以维持细胞的功能，还能替代培养基血清中部分高分子物质从而降低血清的浓度。多种生长因子的联合作用能够使干细胞体外培养达到更好的效果。因此，筛选获得促进干细胞增殖的最佳生长因子组合，有利于在更短的时间内获得大量具有分化为肌纤维潜力的肌肉干细胞，用于肌肉干细胞的研究和细胞培养肉的生产。
发明内容
本发明的目的提供一种促进肌肉干细胞增殖的生长因子组合并将其用于促进肌肉干细胞增殖。
本发明的第一个目的是提供生长因子组合物在制备促进肌肉干细胞增殖和/或肌源性分化的产品方面的应用，所述生长因子组合物由LR3-IGF-Ⅰ、PDGF-BB、bFGF和EGF组成；所述LR3-IGF-Ⅰ浓度选自10～100ng/mL，PDGF-BB、bFGF和EGF的作用浓度分别选自1～50ng/mL。
在一种实施方式中，所述生长因子组合物由50ng/ml LR3-IGF-Ⅰ、10ng/ml PDGF-BB、10ng/ml bFGF和10ng/ml EGF组成。
在一种实施方式中，所述肌肉干细胞包括但不限于哺乳动物的肌肉干细胞。
本发明的第二目的是提供一种可以促进肌肉干细胞生长及增殖的培养基，该培养基包含基础培养基DMEM、5％胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)、1％抗生素。
在一种实施方式中，所述抗生素为1％青霉素-链霉素双抗。
本发明的第三个目的是提供一种细胞生长促进剂，含有LR3-IGF-Ⅰ、PDGF-BB、bFGF和EGF；所述LR3-IGF-Ⅰ浓度选自10～100ng/mL，PDGF-BB、bFGF和EGF的作用浓度分别选自1～50ng/mL。
在一种实施方式中，所述细胞生长促进剂含有50ng/ml LR3-IGF-Ⅰ、10ng/mlPDGF-BB、10ng/ml bFGF和10ng/ml EGF。
本发明的第四个目的是提供一种体外培养肌肉干细胞的方法，是将细胞接种至含所述生长因子组合物的培养基中，于37℃、5％CO2条件下培养。
本发明还要求保护所述生长因子组合物、或所述细胞生长促进剂、或所述方法在食品领域制备动物蛋白肉中的应用。
本发明的有益效果：
本发明根据MTT多轮筛选，最终从十二种生长因子中组合筛选得到促进肌肉干细胞生长的最佳组合，筛选到的生长因子组合能够明显提高肌肉干细胞的增殖速度，在相同生长时间内，添加细胞生长因子组合培养的肌肉干细胞比未添加的对照组细胞相比，细胞数提高3.85倍。同时，EdU细胞增殖分析和PI染色法细胞周期检测结果显示，添加生长因子的细胞增殖速率和处于分裂期的细胞相比对照组有提高；根据免疫荧光等结果可知，添加生长因子培养后的肌肉干细胞仍然可以分化为多核肌管，具有肌源性分化的能力。因此证明本发明筛选得到的生长因子组合能够有效促进肌肉干细胞的增殖，同时也不影响其肌源性分化的能力，大大缩短了细胞的培养时间，且降低了FBS的使用量，为细胞培养肉产业种子细胞和肌肉干细胞的研究提供充足的细胞来源。
附图说明
图1为不同浓度IGF-Ⅰ、MGF和LR3-IGF-ⅠMTT结果比较；
图2为MTT倒筛法初筛细胞因子组合；其中，“全加”表示加入柱状图中所有生长因子的培养基；“对照”为不加生长因子的培养基，其余为在“全加”的基础上去除相应生长因子的培养基；A：筛去IGF-Ⅰ、MGF后第一轮筛选；B：筛去IGF-Ⅰ、MGF、TGF-β后第二轮筛选；C：筛去IGF-Ⅰ、MGF、TGF-β、TNF-α后第三轮筛选；D：筛去IGF-Ⅰ、MGF、TGF-β、TNF-α、IFN-γ、IL-6后第四轮筛选；E：筛去IGF-Ⅰ、MGF、TGF-β、TNF-α、IFN-γ、IL-6、VEGF、HGF后第五轮筛选；
图3为生长因子组合促进肌肉干细胞生长能力验证；
图4为对照组及实验组EdU细胞增殖检测结果；A图为未添加生长因子组合的对照组；B图为添加生长因子组合的实验组；
图5为对照组及实验组细胞周期检测结果；A图为未添加生长因子组合的对照组；B图为添加生长因子组合的实验组；
图6为对照组与实验组Pax7免疫荧光染色情况；图为10×视野，A图为未添加生长因子组合的对照组；B图为添加生长因子组合的实验组；
图7为对照组与实验组MyoD免疫荧光染色情况；图为10×视野，A图为未添加生长因子组合的对照组；B图为添加生长因子组合的实验组；
图8为对照组与实验组Desmin免疫荧光染色情况；图为10×视野，A图为未添加生长因子组合的对照组；B图为添加生长因子组合的实验组；
图9为对照组与实验组α-Actin免疫荧光染色情况；图为10×视野，A图为未添加生长因子组合的对照组；B图为添加生长因子组合的实验组。
具体实施方式
实施例中使用的青链霉素为Penicillin-Streptomycin(10,000U/mL)(ThermoFisher Scientific货号：15140163)。
实施例1促进肌肉干细胞增殖的生长因子组合筛选
选取12种可能促进细胞增殖的生长因子：力生长因子(Mechano growth factor,MGF)、胰岛素样生长因子-I(Insulin-1ike growth factor-I,IGF-I)、长链重组人胰岛素样生长因子(Long chain human insulin-like growth factor-I，LR3-IGF-I)、血小板衍生生长因子-BB(Platelet derived growth factor BB，PDGF-BB)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、表皮细胞生长因子(Epidermal growthfactor，EGF)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)、转化生长因子-β(transforming growthfactor-β,TGF-β)、干扰素-γ(interferon-gamma,IFN-γ)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和人肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)进行组合筛选。其中，MGF是人类IGF-I基因通过mRNA选择性剪接产生三种不同的亚型之一，LR3-IGF-I是在IGF-I的基础上经过改造，提高了IGF-I的生物活性，他们三种互为结构类似物，因此需要考察其分别对肌肉干细胞生长增殖的作用，确定效果最佳的一种参与后续筛选，具体为：各组均有相同的初始细胞数，并以DMEM完全培养基(DMEM、5％FBS和1％青霉素-链霉素双抗)作为初始培养基，分别在各实验组添加不同浓度的MGF、IGF-I或LR3-IGF-I，根据已有研究报道三种添加物最佳添加浓度：MGF(5ng/mL)、IGF-I(100ng/mL)或LR3-IGF-I(50ng/mL)，考察了外源添加不同浓度IGF-I(10、50、100、150、200ng/mL)及其类似物MGF(1、2、3、5、10ng/mL)和LR3-IGF-I(5、10、30、50、100ng/mL)对肌肉干细胞生长的影响，在37℃、5％CO2条件下培养细胞48h，通过MTT的方法测定各组在490nm处的吸光值，确定一个最佳的生长因子以及最适的作用浓度(图1)。
由图1结果可知，LR3-IGF-Ⅰ在50ng/ml时具有最高的吸光值，表示在此时具有最多的活细胞数，因此在后续细胞生长因子组合筛选时IGF-Ⅰ、MGF和LR3-IGF-Ⅰ三者中选取LR3-IGF-Ⅰ进行因子组合筛选，添加浓度为50ng/ml。
因为添加不同的生长因子间可能存在相互作用，因此需要考察各因子在组合中对肌肉干细胞生长的影响，确定一个促进干细胞增殖效果最佳的生长因子组合。筛选方法采用倒筛法，具体方法为：在每轮筛选实验中，设置不加生长因子组合的对照组和本轮生长因子组合全加的实验组，同时在生长因子全加的实验组基础上，设置分别减少组合中的一种生长因子的实验组，考察该种生长因子在组合中对肌肉干细胞生长的影响，若去掉该种生长因子，相比全加的实验组肌肉干细胞生长情况更好，则说明在此组合中，该种生长因子可以筛除；若去掉该种生长因子，相比全加的实验组肌肉干细胞生长情况更差，则说明该种生长因子在此组合中对细胞生长具有促进作用，需要继续保留筛选，直至组合中每一种生长因子均不可减少，得到生长因子的最小、最优组合。
向DMEM完全培养基(DMEM、5％FBS和1％青霉素-链霉素双抗)培养基中加入生长因子组合，其中，第一轮“全加”的实验组加入终浓度为50ng/mL的LR3-IGF-Ⅰ与包括10ng/mLPDGF-BB、10ng/mL bFGF、10ng/mL EGF、10ng/mL VEGF、10ng/mL HGF、10ng/mL TGF-β、100ng/mL IFN-γ、10ng/mL IL-6和100ng/mL TNF-α在内的9种生长因子；其余实验组分别在“全加”的实验组的基础上减去PDGF-BB、bFGF、EGF、VEGF、HGF、TGF-β、IFN-γ、IL-6和TNF-α中的一种。结果如图2A所示，应筛去TGF-β。
第二轮“全加”的实验组加入终浓度为50ng/mL的LR3-IGF-Ⅰ与包括10ng/mL PDGF-BB、10ng/mL bFGF、10ng/mL EGF、10ng/mL VEGF、10ng/mL HGF、100ng/mL IFN-γ、10ng/mLIL-6和100ng/mL TNF-α在内的8种生长因子；其余实验组分别在“全加”的实验组的基础上减去PDGF-BB、bFGF、EGF、VEGF、HGF、IFN-γ、IL-6和TNF-α中的一种。结果如图2B所示，应筛去TNF-α。
第三轮“全加”的实验组加入终浓度为50ng/mL的LR3-IGF-Ⅰ与包括10ng/mL PDGF-BB、10ng/mL bFGF、10ng/mL EGF、10ng/mL VEGF、10ng/mL HGF、100ng/mL IFN-γ和10ng/mLIL-6在内的7种生长因子；其余实验组分别在“全加”的实验组的基础上去除PDGF-BB、bFGF、EGF、VEGF、HGF、IFN-γ和IL-6中的一种。结果如图2C所示，应筛去IFN-γ和IL-6。
第四轮“全加”的实验组加入终浓度为50ng/mL的LR3-IGF-Ⅰ与包括10ng/mL PDGF-BB、10ng/mL bFGF、10ng/mL EGF、10ng/mL VEGF和10ng/mL HGF在内的5种生长因子；其余实验组分别在“全加”的实验组的基础上减去PDGF-BB、bFGF、EGF、VEGF、HGF中的一种。结果如图2D所示，应筛去VEGF和HGF。
第五轮“全加”的实验组加入终浓度为50ng/mL的LR3-IGF-Ⅰ与包括10ng/mL PDGF-BB、10ng/mL bFGF和10ng/mL EGF在内的3种生长因子；其余实验组分别在“全加”的实验组的基础上减去PDGF-BB、bFGF、EGF中的一种。结果如图2E所示，本轮无筛除的生长因子。
综合以上筛选结果，如图2所示，通过每轮MTT筛选，分别筛除了MGF、IGF-I、TGF-β、TNF-α、IFN-γ、IL-6、VEGF和HGF，得到生长因子组合LR3-IGF-Ⅰ、PDGF-BB、bFGF和EGF，可以促进肌肉卫星细胞的快速增殖。
生长因子组合包括LR3-IGF-Ⅰ、PDGF-BB、bFGF和EGF，LR3-IGF-Ⅰ浓度选自10～100ng/mL，PDGF-BB、bFGF和EGF的作用浓度分别选自1～50ng/mL。
实施例2生长因子组合促进肌肉干细胞增殖
设置实验组为在DMEM完全培养基(含5％FBS和1％青霉素-链霉素双抗)基础上添加终浓度为50ng/ml LR3-IGF-Ⅰ、10ng/ml PDGF-BB、10ng/ml bFGF和10ng/ml EGF的生长因子组合，同时设置不添加生长因子的对照组，以5000个细胞/孔接种至96孔板的不同培养基中，相同条件下连续培养，细胞长满孔板时全部消化后依次转移至更大孔板(48孔板、24孔板、12孔板、6孔板)，分别于第三天、第六天和第九天进行细胞计数，考察两组细胞数量。
根据图3结果显示，在第三天、第六天和第九天，生长因子组合全加的实验组都有最高细胞数，第九天细胞数提高3.85倍。
将生长因子组合中LR3-IGF-Ⅰ浓度调整至10～100ng/mL，PDGF-BB、bFGF和EGF的终浓度分别调整至1～50ng/mL，按照相同的方法培养细胞，均可使细胞数相比于对照组提高2～3倍。
实施例3 EdU细胞增殖及细胞周期检测
(1)EdU细胞增殖检测
EdU是一种胸腺嘧啶核类似物，其连有的炔烃基团在天然化物中很少见，能在DNA复制时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在合成的DNA分子中。在反应中采用点击化学-CuAAC(铜催化的叠氮化物-炔烃环加成反应)，使用该反应可直接测量在细胞周期S期的DNA合成。EdU的炔基是一种生物惰性基团，可以通过CuAAC反应与染料的叠氮基发生极强的选择性反应，从而成1,2,3-三唑产物。EdU和Cy3/Cy5 azide具有生物学上独特的基团，其连接后可以荧光标记增殖细胞的DNA，可以通过流式细胞术定量地检测，本专利采用的是Cy5 azide与EdU进行连接后荧光标记增殖细胞的DNA，可通过流式细胞仪进行检测(Cy5 azide最大激发波长为646nm，最大发射波长为662nm)。具体操作方法如下：
将适量细胞接种在6孔板中，待细胞培养过夜并且恢复到正常生长状态，对照组及实验组分别用不含生长因子组合的DMEM完全培养基(5％FBS)和添加4种生长因子组合(50ng/ml LR3-IGF-Ⅰ、10ng/ml PDGF-BB、10ng/ml bFGF、10ng/ml EGF)的DMEM完全培养基进行换液培养；
培养至适当细胞密度后，采用APE BIO公司的EdU Flow Cytometry Assay Kits(Cy5)试剂盒进行检测。根据图4对照组及实验组EdU细胞增殖检测结果分析可知，在短时间2h EdU孵育处理后，添加细胞因子组合在对照组基础上，EdU+细胞比例提高25％，说明添加生长因子组合促进了肌肉干细胞的增殖生长，加快了其分裂增殖的速度。
(2)细胞周期检测
将适量细胞接种在6孔板中，待细胞培养过夜并且恢复到正常生长状态，对照组及实验组分别用不含生长因子组合的DMEM完全培养基(5％FBS)和添加4种生长因子组合(50ng/ml LR3-IGF-Ⅰ、10ng/ml PDGF-BB、10ng/ml bFGF、10ng/ml EGF)的DMEM完全培养基进行换液培养，培养至适当细胞密度后，采用碧云天细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(CellCycle and Apoptosis Analysis Kit)进行检测，利用流式细胞仪仪分析处于G0/G1期、G2/M期、S期细胞的比例。
根据图5对照组及实验组细胞周期检测结果分析可知，添加细胞生长因子组合的实验组在对照组基础上，细胞处于S期、G2/M期的比例提高18.36％，说明添加生长因子组合促进了肌肉干细胞的增殖生长，加快了其分裂增殖的速度。
因此EdU细胞增殖检测和细胞周期检测结果均显示添加细胞生长因子组合加快了肌肉干细胞分裂增殖的速度，对肌肉干细胞增殖生长具有很好促进作用。
实施例4肌肉干细胞特征因子免疫荧光方法鉴定
封闭液：1％BSA、含终浓度22.52mg/mL甘氨酸的PBST；PBST为含0.1％Tween20的PBS。
肌源性细胞会表达特异性的转录因子，包括Pax7以及其它肌肉调节因子，肌原性调节因子(MRFs)在肌肉的再生和发育过程中均发挥关键作用。在分子水平，静止期肌肉卫星细胞被激活的特征是两种MRFs(Myf5，MyoD)的迅速上调。MyoD在12小时内最早表达上调，因此通过免疫荧光的方法，对肌肉干细胞特征因子Pax7和MyoD进行鉴定，具体方法如下：
在共聚焦小皿中接种培养2-3天的肌肉干细胞待达到适当密度后，用PBS缓冲液清洗细胞，加入4％(质量体积比)多聚甲醛(4℃预冷)固定，室温下通透15min后除去多聚甲醛，用PBS缓冲液小心清洗；加入0.5％(体积百分比)Triton X-100处理15min，用PBS缓冲液小心清洗；加入封闭液，室温孵育30min后用PBS缓冲液小心清洗。分别加入在1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS中稀释的Pax7抗体(1：100)、MyoD抗体(1：100)，室温孵育1h后4℃过夜处理。过夜处理后，放至室温1h后，用PBS清洗3次，加入在1％BSA的PBS溶液中1：200稀释的荧光标记的二抗，室温避光孵育1-1.5h；用PBS清洗后，加入20μM DAPI，室温避光孵育10min，用PBS清洗后，加入抗淬灭封片剂，在荧光显微镜下观察拍照。
对照组与实验组Pax7和MyoD免疫荧光染色情况如图6和图7所示，可以看出添加生长因子组合的实验组与对照组相比，Pax7和MyoD的表达情况基本相同，两组肌肉干细胞均能正常表达Pax7和MyoD，表明添加生长因子组合对肌肉干细胞Pax7和MyoD的表达无影响，仍然具有肌肉干细胞干性标志。
实施例5肌肉干细胞分化能力免疫荧光方法鉴定
分化培养基(按体积百分比)：97％DMEM培养基、2％马血清、1％青霉素-链霉素双抗。
封闭液：1％BSA、含终浓度22.52mg/mL甘氨酸的PBST；PBST为含0.1％Tween20的PBS。
肌肉干细胞增殖期后，随着p21的激活，在细胞内出现生肌素和MRF4(MRF成员)的表达，细胞开始分化；随着肌肉特异性蛋白如结蛋白(Desmin)和肌动蛋白(Actin)等的表达，分化程序完成。因此通过免疫荧光的方法，对肌肉干细胞特征蛋白Desmin和α-Actin进行鉴定，具体方法如下：
在共聚焦小皿中接种培养2-3天的肌肉干细胞待达到适当密度后，用PBS缓冲液清洗细胞，加入分化培养基，培养3天左右后，显微镜下见到细长状多核肌管。吸弃培养基，PBS清洗后，加入4％(质量体积比)多聚甲醛(4℃预冷)固定，室温下通透15min后除去多聚甲醛，用PBS缓冲液小心清洗；加入0.5％(体积百分比)Triton x-100处理15min，用PBS缓冲液小心清洗；加入封闭液，室温孵育30min后用PBS缓冲液小心清洗。分别加入在1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS中稀释的Desmin抗体(1：100)、α-Actin(1：100)，室温孵育1h后4℃过夜处理。过夜处理后，放至室温1h后，用PBS清洗3次，加入在1％BSA的PBS溶液中1：200稀释的荧光标记的二抗，室温避光孵育1-1.5h；用PBS清洗后，加入20μM DAPI，室温避光孵育10min，用PBS清洗后，加入抗淬灭封片剂，在荧光显微镜下观察拍照。
对照组与实验组Desmin和α-Actin免疫荧光染色情况如图8和图9所示，可以看出添加生长因子组合的实验组与对照组相比，均可以表达Desmin和α-Actin，肌肉干细胞可以融合为多核肌管，表明添加生长因子组合不影响肌肉干细胞分化能力，仍然具有肌源性分化的能力。
实施例6应用生长因子组合物培养的细胞用于制备含动物蛋白肉的食品
按照实施例2的方法培养肌肉干细胞，收集培养后的肌肉干细胞，以0.5～1×106接种在胶原蛋白水凝胶支架上，添加分化培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养3～5天，使肌肉干细胞分化形成肌纤维。收集分化完成的肌纤维，添加交联剂及食品风味剂。可选地，交联剂及食品风味剂按添加量的百分比包括：谷氨酰转氨酶5-10‰，食用盐10-15‰，焦磷酸盐3-5‰，三聚磷酸盐3-5‰，大豆蛋白15-20‰，重组血红素30-45‰，经通过充分混合，形成具有真实肉色和肉风味的细胞培养肉产品，可以根据需求进行烹调处理。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.生长因子组合物在制备促进肌肉干细胞增殖和/或肌源性分化的产品方面的应用，其特征在于，所述生长因子组合物由LR3-IGF-Ⅰ、PDGF-BB、bFGF和EGF组成；所述LR3-IGF-Ⅰ浓度为10～100ng/mL，PDGF-BB、bFGF和EGF的作用浓度分别选自1～50ng/mL。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生长因子组合物由50ng/ml LR3-IGF-Ⅰ、10ng/ml PDGF-BB、10ng/ml bFGF和10ng/ml EGF组成。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述肌肉干细胞为哺乳动物的肌肉干细胞。
4.一种可以促进肌肉干细胞生长及增殖的培养基，其特征在于，培养基包含基础培养基DMEM、5％胎牛血清、抗生素和生长因子组合物；
所述生长因子组合物包括LR3-IGF-Ⅰ、PDGF-BB、bFGF和EGF组成；所述LR3-IGF-Ⅰ浓度为10～100ng/mL，PDGF-BB、bFGF和EGF的作用浓度分别选自1～50ng/mL。
5.根据权利要求4所述的培养基，其特征在于，所述抗生素为1％青霉素-链霉素双抗。
6.一种细胞生长促进剂，其特征在于，含有LR3-IGF-Ⅰ、PDGF-BB、bFGF和EGF；所述LR3-IGF-Ⅰ浓度选自10～100ng/mL，PDGF-BB、bFGF和EGF的作用浓度分别选自1～50ng/mL。
7.根据权利要求6所述的细胞生长促进剂，其特征在于，含有50ng/ml LR3-IGF-Ⅰ、10ng/ml PDGF-BB、10ng/ml bFGF和10ng/ml EGF。
8.一种体外培养肌肉干细胞的方法，其特征在于，将细胞接种至含权利要求5或6所述细胞生长促进剂的培养基中，于35～38℃、含CO2的条件下培养。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述培养基为含胎牛血清的DEME培养基。
10.权利要求4或5所述的培养基，或权利要求6或7所述的细胞生长促进剂，或权利要求8或9所述的方法在食品领域制备动物蛋白肉中的应用。
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