CN118086216A - iPSC衍生的心脏成纤维细胞hCF-N1及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种iPSC衍生的心脏成纤维细胞hCF‑N1及其应用。该iPSC衍生的心脏成纤维细胞hCF‑N1，于2024年1月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No：64265。该iPSC衍生的心脏成纤维细胞hCF‑N1的细胞株有以下用途：(1)hCF‑N1可以持续向外界分泌P61，可作为持续生产P61的“活体药物工厂”；(2)hCF‑N1与人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞(hiPSC‑CM)共培养，可以显著促进hiPSC‑CM增殖，在规模化生产中提高hiPSC‑CM的产量；(3)利用生物3D打印技术构建包含hCF‑N1的细胞补片，对心肌坏死有显著的治疗效果。

Description

iPSC衍生的心脏成纤维细胞hCF-N1及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及iPSC衍生的心脏成纤维细胞hCF-N1及其应用。
背景技术
神经调节蛋白1(Neuregulin-1,NRG-1)是神经调节蛋白家族成员之一，其编码基因(NRG1)位于8号染色体上，包含21个外显子，可产生30多个转录本。NRG-1的蛋白结构由N端的胞外结构域(extracellular structural domain,ECD)、跨膜结构域、C端的胞内结构域(intracellular structural domain,ICD)构成。其中，胞外结构域中还包含一个EGF样结构域(EGF-like structural domain)，它是NRG-1与ErbB受体结合的关键区域。NRG1基因编码的NRG-1前体是一种跨膜蛋白，被蛋白酶的切割后才产生成熟的NRG-1蛋白释放到胞外。
NRG-1根据氨基端序列、EGF样结构域可变剪切等情况分为六种亚型，其中，根据EGF样结构域的不同，有NRG-1α和NRG-1β两种亚型。研究显示NRG-1β是在心血管领域被研究得较广泛的一种亚型。NRG-1β主要由心内的血管内皮细胞分泌，与细胞膜上的ErbB家族受体结合启动NRG-1-ErbB信号通路，在心脏发育、心脏正常功能的维持、促进心肌细胞增殖等方面发挥重要作用。其中，ErbB家族受体包括ErbB1,ErbB2(HER2),ErbB3(HER3)和ErbB4(HER4)，而成人心肌细胞主要表达ErbB2和ErbB4两种受体。ErbB2或ErbB4基因敲除小鼠在宏观上呈现心室肌肥大、室壁增厚、收缩力减弱等表型，在微观上呈现心肌细胞的肌节结构异常等表型，提示ErbB2和ErbB4两种受体在维持心肌细胞的结构和功能方面起到重要作用。
尽管NRG-1有多种结构各异的亚型，但是每种亚型都含有相似的EGF样结构域，而仅仅EGF样结构域(并不需要完整的蛋白)便可以与ErbB家族受体结合并启动下游的信号通路。多项研究证实，NRG-1β蛋白或其活性多肽(NRG-1β2的第177-237位氨基酸的多肽，即EGF样结构域区域)能够促进治疗多种心脏疾病，包括动脉粥样硬化、心肌梗死、缺血再灌注造成的损伤、心力衰竭、心脏毒性、心律失常等。
目前，NRG-1β蛋白或其活性多肽在治疗心力衰竭方面的临床研究主要集中在以下方面：(1)利用人重组全长NRG-1β3蛋白(也称NRG-1GGF亚型，或Cimaglerminα)进行针对左心收缩功能不全及心力衰竭的治疗；(2)利用人重组蛋白rhNRG-1进行慢性心力衰竭的治疗；(3)利用包含了NRG-1活性多肽和抗ErbB3的单克隆抗体的融合蛋白治疗射血分数降低(HFrEF)型心力衰竭。以上蛋白的给药方式是静脉注射或经皮给药(皮下缓释)。然而，以上的制剂形式和给药方式存在以下问题：(1)NRG-1蛋白尤其是其活性多肽在体内的半衰期较短，容易被降解；NRG-1蛋白或其活性多肽在经历体内循环及相关脏器的代谢作用后，最终到达心肌的活性蛋白的含量存疑；(2)由于NRG-1蛋白或其活性多肽的主要受体之一是ErbB2(HER2)，而HER2在多种恶性肿瘤中高表达，与肿瘤的发生、侵袭、转移和复发密切相关，是肿瘤增殖、侵袭的重要驱动；因此，静脉注射或经皮注射使NRG-1蛋白或其活性多肽进入全身循环系统，具有成瘤或促进肿瘤转移的潜在风险。此外，美国一项临床试验显示，静脉注射人重组全长NRG-1β3蛋白会产生肝脏毒性。
发明内容
本发明构建了能够表达并分泌NRG-1蛋白的活性多肽(P61)的细胞株-iPSC衍生的心脏成纤维细胞hCF-N1，于2024年1月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No：64265。该细胞株有以下用途：(1)hCF-N1可以持续向外界分泌P61，可作为持续生产P61的“活体药物工厂”；(2)hCF-N1与人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞(hiPSC-CM)共培养，可以显著促进hiPSC-CM增殖，在规模化生产中提高hiPSC-CM的产量；(3)利用生物3D打印技术构建包含hCF-N1的细胞补片，对心肌坏死有显著的治疗效果。
附图说明
图1为实施例1中pHIV-Puro-P61载体质粒图谱；
图2为实施例3中的hCF-N1、hEC-N1中P61的mRNA表达水平；
图3为实施例3中的hCF-N1、hEC-N1及其培养上清中的P61的表达情况；
图4为实施例4中的hCF-N1与hiPSC-CM共培养显著促进hiPSC-CM增殖；
图5为实施例4中的hEC-N1与hiPSC-CM共培养显著促进hiPSC-CM增殖；
图6为实施例4中的共培养装置示意图；
图7为实施例4中的hCF-N1、hEC-N1与hiPSC-CM共培养显著促进hiPSC-CM增殖；
图8为实施例5中的细胞补片结构示意图；
图9为实施例5中的各组大鼠在不同时间点的LVEF值及LVFS值。
具体实施方式
为让本领域的技术人员更加清晰直观的了解本发明，下面将结合附图，对本发明作进一步的说明。
实施例1：构建慢病毒表达载体
所有限制性内切酶、T4连接酶均购自Thermo Fisher Scientific；质粒小量提取纯化试剂盒、质粒大量提取试剂盒、DNA凝胶回收与纯化试剂盒和PCR纯化回收试剂盒均购自Axygen；化学感受态细胞DH5α菌株：购自上海生工生物工程有限公司。Puro-T2A-P61的cDNA序列由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
1.1用常规分子克隆方法将合成的cDNA序列亚克隆到pHIV-iRFP720-E2A-Luc载体(Addgen，104587)中，得到pHIV-Puro-P61的慢病毒表达载体。
P61的氨基酸序列：
Ser His Leu Val Lys Cys Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn GlyGly Glu Cys PheMet Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro Ser Arg Tyr Leu Cys Lys CysPro Asn Glu Phe Thr Gly AspArg Cys Gln Asn Tyr Val Met Ala Ser Phe Tyr LysAla Glu Glu Leu Tyr Gln(SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQNYVMASFYK AEELYQ)(SEQ ID NO:1)。
Puro-T2A-P61序列(882bp)：
GCCACCATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCAGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGATCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCCCTAGGGGCAGTGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCAATGCATAGCCATCTTGTAAAATGTGCGGAGAAGGAGAAAACTTTCTGTGTGAATGGAGGGGAGTGCTTCATGGTGAAAGACCTTTCAAACCCCTCGAGATACTTGTGCAAGTGCCCAAATGAGTTTACTGGTGATCGCTGCCAAAACTACGTAATGGCCAGCTTCTACAAGGCGGAGGAGCTGTACCAGCACCACCACCATCACCACTAA(SEQ ID NO:2)。
1.1.1以合成的cDNA序列为模板，设计引入酶切位点的引物，引物序列如下表：
引物名称 序列(5’-3’) 酶切位点
Puro-F1 TAGAATTCGCCACCATGACCGAGTACAA EcoRΙ SEQ ID NO:3
P61-R1 TAATCGATTTAGTGGTGATGGTGGTGGTGC Bsu15Ι SEQ ID NO:4
PCR反应体系(20μl)如下表：
PCR扩增程序为：95℃5min；95℃30sec，56℃3min，72℃1min，循环30次；72℃10min。
反应完成后，用DNA凝胶回收和纯化试剂盒回收目的片段。
1.1.2将pHIV-iRFP720-E2A-Luc载体使用EcoRΙ和Bsu15Ι酶切，酶切体系如下：
充分混匀后放置于37℃水浴2h，之后取2μl与DNAloading buffer混合后进行琼脂糖凝胶电泳验证成功切开。使用DNA凝胶回收与纯化试剂盒回收，获得线性pHIV-iRFP720-E2A-Luc载体片段。
1.1.3连接转化：将线性载体与PCR扩增得到的Puro-T2A-P61连接，连接体系如下：
样本充分混匀后16℃过夜反应，然后进行转化。转化步骤为：从-80℃冰箱中取出1支感受态细胞放于冰上解冻，全部连接产物与50μl感受态细胞轻柔混匀，在冰上放置30min后放置于42℃水浴锅中热激30s，立即置于冰上5min，在超净工作台中向上述混合物中加入400μl灭菌后的无抗生素LB液体培养基，轻轻吹打混匀后置于摇床中37℃，170rpm孵育1h。孵育结束后在超净工作台中吸取150μl加入到氨苄浓度为150μg/mL的LB固体培养基中进行涂板，之后倒置于37℃培养箱中过夜培养。
1.1.4挑菌验证：向1.5ml离心管中加入1ml含有氨苄的LB液体培养基，挑取若干单克隆菌落，恒温摇床37℃、200rpm振荡培养6h，再取200ul菌液加入5ml含有氨苄的LB液体培养基，恒温摇床37℃、200rpm振荡过夜培养。小量提取质粒，送测序验证是否连接成功，测序正确的菌落进行扩大培养，使用质粒大量提取试剂盒提取确定连接成功的慢病毒表达载体pHIV-Puro-P61，质粒图谱如图1所示。
实施例2构建表达P61的hCF-N1、hEC-N1。
2.1包装慢病毒
2.1.1接种HEK293T细胞到6孔板中，用D10培养液(DMEM培养液+10％胎牛血清+1％PS)进行培养，待细胞汇合度达到70％-80％时准备进行转染。
2.1.2在转染前1h，弃去原来培养液，加入2mL/孔预热的无血清DMEM培养液。
2.1.3按照说明书用EZ Trans细胞转染试剂(李记生物，AC04L091)进行转染。将pHIV-Puro-P61(20μg)、pVSVg(10μg)、psPAX2(15μg)共转染HEK293T细胞。
2.1.4 6h后，将培养液更换成D10培养液。
2.1.5继续培养约60h后，取培养液于3000rpm、4℃离心10min，取上清液。
2.1.6用0.45μm低蛋白结合滤膜(Millipore Steriflip HV/PVDF)过滤上清液，彻底去除细胞残渣。
2.1.7将含病毒的培养液按照体积比4:1与10％蔗糖缓冲液(50mM Tris-Hcl，pH7.4，100mM NaCl，0.5mM EDTA)，10000g、4℃离心4h。小心弃去上清液，离心管倒放在吸水纸上沥干3min，加入1×PBS重悬获得浓缩病毒液，-80℃保存。
2.2转染细胞
2.2.1hCF的培养：将细胞接种于明胶(Sigma，V900863)包被的平板上，用培养液①进行培养，培养液①具体组成为10％胎牛血清(HyClone，SH30396.03)；1％PS(Invitrogen，10378016)；1％的非必需氨基酸NEAA(Invitrogen，11140050)；余量为DMEM(Gibco，C11995500BT)。每隔3天或在细胞培养达到80-90％汇合度时传代。hEC的培养：将细胞接种于明胶(Sigma，V900863)包被的平板上，用培养液②进行培养，培养液②具体组成为Endothelial Cell Medium内皮细胞培养基(ScienCell，1001)。每隔3天或在细胞培养达到80-90％汇合度时传代。
2.2.2慢病毒感染：待hCF、hEC细胞汇合度达到70％-80％时，使用2.1制备的慢病毒感染细胞。感染复数(MOI)约为0.3-0.5。感染24h后，将培养液更换成新鲜培养基。培养2天后，将培养液更换成新鲜培养基(含终浓度为2ug/ml的嘌呤霉素(InvivoGen))进行筛选。经过3～4天筛选，挑取单个的克隆接种到不同的培养皿中培养，即获得工程化细胞株hCF-N1(hCF-N1，于2024年1月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No：64265)、hEC-N1(hEC-N1，于2024年1月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No：64266。)。
实施例3：工程化细胞株的鉴定
3.1总RNA提取：用EZ-10总RNA小量提取试剂盒(Sangon Biotech，B618583-0050)提取细胞总RNA(样品使用RNase-Free DNA清除试剂盒，Sangon Biotech，B618253-0050)清除残留基因组DNA)，对照组为野生型hCF和hEC。
野生型hCF的制备
hiPSC的分化：根据Dilip Thomas等报道的方法定向分化成纤维细胞。具体方法如下：
A.在hiPSC汇合度达到90％-95％时，用PBS洗涤平板，每孔加入2mL含11μM CHIR的分化培养基(Media#1)。
B.在第3天，加入2mL含5μM IWR-1-endo分化培养基促进心脏祖细胞扩增。
C.第4天，将培养基更换为2mL心肌成纤维细胞分化培养基。每2天更换新鲜培养基，直至第16天。
D.在第18天，用0.05％胰蛋白酶消化细胞，按照6×104cell/cm2密度重新接种在0.15％明胶包被的平板，用含10％血清的DMEM/F12培养基培养至传代。
hCF的鉴定：使用流式细胞术检测Vimentin阳性细胞比例。
实验结果
细胞形态：分化得到的hiPSC衍生的成纤维细胞(hCF)形态呈梭形。
流式鉴定结果:经流式鉴定，实验分化得到的hCF有99.8％表达波形蛋白(Vimentin)。
野生型hEC的制备
hiPSC的分化与筛选：根据Dilip Thomas等报道的方法定向分化内皮细胞。Thomas,D.,Kim,H.,Lopez,N.,Wu,J.C.Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arraysusing Human iPSC-Derived Cardiomyocytes,Cardiac Fibroblasts,and EndothelialCells.J.Vis.Exp.(169),e61879,doi:10.3791/61879(2021).
具体方法如下：
A.在hiPSC汇合度达到75％-80％时，用PBS洗涤平板，每孔加入2mL含6μM CHIR的分化培养基(Media#1)。
Media#1：在500mL RPMI 1640基础培养基(Gibco，C11875500BT)中加入10mL B27添加剂(Gibco，17504-044)。
B.在分化第2天，将培养基更换为含2μM CHIR的分化培养基(Media#1)。
C.在分化第4天，培养基更换为2mL EGM添加bFGF-2(20ng/mL)、VEGF165(50ng/mL)、BMP4(20ng/mL)和SB431542(8μM)。每2天更换培养基。
D.在第12天，用流式细胞仪分选CD31阳性细胞，分选后的细胞铺在0.15％明胶包被的6孔板，用添加SB431542(8μM)的EGM培养基培养至传代。
鉴定：使用流式细胞术检测内皮细胞特异性标志物(CD31)阳性细胞比例。
实验结果
细胞形态：分化得到的iPSC衍生的内皮细胞(iPSC-EC)形态呈圆形或梭形。
流式鉴定结果：经流式鉴定，本次实验分化得到的iPSC-EC有98.8％表达内皮细胞特异性蛋白CD31。
3.2逆转录：用逆转录试剂盒Ⅲ1st Strand cDNASynthesis Kit(YEASEN，11139ES60)进行逆转录实验。
3.3利用实时定量PCR检测各样本中P61的mRNA表达水平。利用Primer3软件设计相关引物(引物序列见下表)，使用TBFast qPCR Mix(TAKARA，RR430B)和/>480(Roche)系统进行实时定量PCR。结果如图2所示，在mRNA水平，hCF-N1的P61的表达是野生型hCF的180倍，hEC-N1的P61的表达是野生型hEC的258倍。**表示p<0.001。
序列名称 序列(5’-3’)
GAPDH-RT-F TGGGTGTGAACCATGAGAAG SEQ ID NO:5
GAPDH-RT-R GTGTCGCTGTTGAAGTCAGA SEQ ID NO:6
P61-RT-F TGTAAAATGTGCGGAGAAGGAG SEQ ID NO:7
P61-RT-R AGAAGCTGGCCATTACGTAG SEQ ID NO:8
3.5检测hCF-N1、hEC-N1分泌P61的情况
3.5.1收集各株细胞的培养上清：将hCF-N1、hEC-N1、野生型hCF、野生型hEC接种于10cm培养皿，待细胞密度达到70％左右，使用1×PBS洗2次，更换培养液为不含血清的DMEM培养液。每两天收集一次上清，收集2次后将培养上清2000rpm离心10min后，使用0.45μm低蛋白结合滤膜过滤上清液，去除细胞残渣。过滤后的培养上清放置于10cm培养皿中，-80℃预冷过夜，然后冷冻干燥24小时获得冻干粉。用1ml蒸馏水复溶冻干粉，经去盐柱(上海生工，C006868)脱盐处理。脱盐后可进行免疫印迹鉴定检测。
3.5.2免疫印迹检测P61的表达情况：取等量的各组脱盐培养液上清及细胞裂解液通过SDS-PAGE分离，转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF，默克millipore,ISEQ00010)上。用5％脱脂牛奶在室温下封闭膜1小时。然后，用抗6×His-Tag单克隆抗体(Proteintech，66005-1-Ig)在4℃孵育过夜，然后用HRP-conjugated affinipure goat anti-rabbit IgG(H+L)(Proteintech，SA00001-2)二抗孵育。用Plus超敏化学发光试剂(上海勤翔,1810212)检测蛋白表达水平，用ChemiScope 6100化学发光板成像系统观察条带。结果如图3所示，hEC-N1、hCF-N1表达并分泌P61到培养上清中，但是hEC和hCF不表达P61。
实施例4hCF-N1、hEC-N1与hiPSC-CM共培养，可以显著促进hiPSC-CM增殖
4.1实验材料准备
4.1.1hCF、hCF-N1的培养：同2.2.1。
4.1.2hEC、hEC-N1的培养：同2.2.1。
4.1.3制备hiPSC-CM：将人诱导多能干细胞hiPSC接种于Matrigel基质(Corning，354277)包被的平板上，然后用Stemflex培养基(Gibco，A3349401)进行培养。StemFlex培养基每两天更换一次。hiPSC每隔3天或在细胞培养达到80-90％汇合度时传代。在分化培养基(成分为：RPMI1640培养基(Gibco，C11875500BT)+213μg/mL AA2P(l-抗坏血酸2-磷酸镁)(Sigma,A8960)和0.1％牛血清白蛋白(Sigma,A1470))中加入小分子化合物CHIR99021(Tocris，4423,终浓度为10mM)后，处理hiPSC 24小时，然后用分化培养基孵育48小时。在分化第4天，在分化培养基中添加小分子化合物IWP2(Tocris，3533,终浓度5μM)后处理细胞。48小时后换用分化培养基培养48小时。在随后的实验中，用培养液③培养心肌细胞，培养液③组成为3％的血清替代物(Gibco，10828-028)；1％PS(Invitrogen，10378016)；1％的非必需氨基酸NEAA(Invitrogen，11140050)；余量为RPMI1640培养液。使用代谢选择方法纯化hiPSC-CM。代谢选择培养基为添加0.1％牛血清白蛋白(Sigma,A1470)和1×亚油酸-油酸-白蛋白(Sigma,L9655)的DMEM培养基(Gibco,11966-025)。用代谢选择培养基处理细胞6天。之后用培养液③培养细胞至分化第18天，然后细胞用于共培养实验。
4.2利用嵌入皿进行共培养
4.2.1将hiPSC-CM用0.05％胰蛋白酶消化，按照1×105Cell/孔接种于12孔板，恢复培养3天后开始共培养。
4.2.2将hCF、hCF-N1、hEC、hEC-N1用0.05％胰蛋白酶消化，按照2×104Cell/孔接种到嵌入皿(洁特，TCS012012)中，分别用培养液①和培养液②培养3天，之后将嵌入皿放入已接种hiPSC-CM的12孔板中，使用培养液③进行共培养。同时设置一组hiPSC-CM单独培养作为对照。每组设6个生物学重复(细胞活力测定实验有3个生物学重复，细胞计数实验有3个生物学重复)。
4.2.3细胞活力测定：分别于共培养1、2、4、6天后，移开嵌入皿，用CCK-8测定各组hiPSC-CM活力。
4.2.4心肌细胞数量测定：共培养6天后，用0.05％胰蛋白酶消化hiPSC-CM，使用细胞计数仪(Countstar)对每组细胞总数进行统计。
4.2.5结果分析：嵌入皿法共培养结果如图4和图5所示，在共培养第4天和第6天时，与hCF-N1、hEC-N1共培养的心肌细胞数量显著高于对照组。其中，共培养6天，hCF-N1和hEC-N1与hiPSC-CM共培养组的心肌细胞数目分别是hiPSC-CM组的1.72倍和1.33倍，hCF-N1和hEC-N1与hiPSC-CM共培养组的心肌细胞活力是hiPSC-CM组的1.50倍和1.39倍，说明hCF-N1、hEC-N1与hiPSC-CM共培养可以显著促进hiPSC-CM增殖。
4.3利用特制的培养皿进行共培养
4.3.1可以进行大规模培养hiPSC-CM的培养皿：如图6所示，在150mm规格的培养中设2条坝，截面宽5mm，高5mm，将培养皿划分为B1、A、B2区，以实现不同细胞的分区域接种；坝的两端与培养皿内壁不贴合，保留1mm空隙，使得B1、A、B2区在添加培养液后可相互连通；为使A区细胞能够尽可能均匀接种，我们在A区设r＝0.5mm半圆柱状的纵横缓冲带，将A区划分出主要的24个方形区域，每个区域大小为20mm×20mm。
4.3.2在4.3.1所述培养皿中，A区接种hiPSC-CM共2×106Cell，其中每个小方形区域接种200μL细胞悬液(约8.3×104Cell)，在B1、B2区接种hCF、hCF-N1、hEC或hEC-N1细胞悬液共2mL，接种细胞总数为1×106。37℃培养4-6h，待细胞贴壁后，加入50mL培养液③，使整个培养皿的培养液连通，开始共培养。同时设置一组hiPSC-CM单独培养作为对照。每组设3个生物学重复。
4.3.3共培养6天后，用细胞刮刀轻轻刮下B区域培养的hCF、hCF-N1、hEC或hEC-N1，用吸液器将其吸走，再用PBS清洗2次，随后加入10mL 0.05％胰蛋白酶，收集A区域培养的hiPSC-CM并用细胞计数仪(Countstar)计数。
4.3.4结果分析：使用图6所示的培养皿进行共培养的结果见图7，与hCF-N1、hEC-N1共培养的心肌细胞数量分别是对照的1.80倍和1.48倍，说明与hCF-N1、hEC-N1共培养可以显著促进hiPSC-CM增殖。
实施例5hCF-N1、hEC-N1构建的细胞补片显著促进心肌梗死后心脏功能的恢复
5.1细胞补片的制备
5.1细胞准备
5.1.1hCF、hCF-N1的培养：同2.2.1。
5.1.2hEC、hEC-N1的培养：同2.2.1。
5.2甲基丙烯酰化明胶(GelMA)溶液制备：按照甲基丙烯酰化明胶(EFL-GM-60，Engineering For Life)说明书配制1.8-3.5％(w/v)浓度的GelMA。具体步骤为：称取所需质量GelMA放入离心管；加入对应体积的引发剂标准溶液；以60-70℃水浴避光加热溶解20-30分钟，期间振荡数次；将GelMA溶液立即用0.22μm无菌针头过滤器灭菌，37℃水浴保温备用。
5.3细胞墨水制备：将hCF、hCF-N1、hEC、hEC-N1细胞用0.05％胰蛋白酶消化，离心收集细胞，用5.2中配制的GelMA溶液重悬细胞，细胞密度为5～10×107cell/mL。
5.4生物3D打印：使用气动挤出式生物3D打印机(EFL-BP6602 Pro)按照如图8所示结构打印细胞补片，补片大小为5mm×5mm×0.2mm。其中块状表示hCF或hCF-N1，条状表示hEC或hEC-N1。打印完成后，用培养液①和培养液②1:1混合液进行培养。4-6天后，在该补片上打印一层5mm×5mm×0.2mm，厚度为0.1-0.2mm的GelMA((w/v)浓度为10％)，两块补片可融为一体。
5.5实验分组
对照组：与实验组1、2浓度相同的GelMA；
实验组1：按照5.4描述的细胞补片，其中块状区域为hCF，条状区域为hEC；
实验组2：按照5.4描述的细胞补片，其中块状区域为hCF-N1，条状区域为hEC-N1。
5.6大鼠心肌梗死模型
5.6.1实验材料：(1)SPF级Sprague-Dawley大鼠：成年，雄性，体重为280g至340g；所有的对Sprague-Dawley大鼠的操作，都依据美国国立卫生研究所(NIH)发布的实验动物饲养和使用指南进行。(2)麻醉镇静药物：戊巴比妥钠(2％，0.2ml/100g)。
5.6.2实验方法：(1)Day0：构建心肌梗死(MI)模型大鼠及假手术大鼠：腹腔注射戊巴比妥钠(2％，0.2ml/100g)进行麻醉，手术区脱毛，进行气管插管；左胸部切口，肌肉分离以暴露肋骨，用显微剪于第3至第4肋间打开胸腔充分暴露心脏，于左心耳根部下方肺动脉圆锥旁以5-0无创缝合线穿过左冠状动脉前降支，形成永久性结扎，形成心肌梗死模型(n＝30，n为大鼠总数)。对于假手术大鼠(n＝5，n为大鼠总数)，在第3至第4肋间开胸暴露心脏，用5-0缝针于左心耳下缘约2mm处穿线，不结扎左冠状动脉前降支。在心肌梗死造模过程中，左冠状动脉前降支结扎20分钟后，将对照组、实验组1、实验组2的补片附着在心脏白色缺血区域，使用镊子小心将心包膜固定补片，然后关闭胸腔，由内向外逐层缝合各层肌肉和皮肤。整个实验过程中，对照组、实验组1、假手术组各有一只大鼠死亡，因此对照组有9只大鼠，实验组1有9只大鼠，实验组2有10只大鼠，假手术组有4只大鼠参与后续的检测。
(2)Day7：心梗术后第7天，用高分辨率超声成像系统检测大鼠心脏功能。
(3)Day30：心梗术后第30天，用高分辨率超声成像系统检测大鼠心脏功能。
5.6.3结果分析：
高分辨率超声成像系统检测结果(图9)显示，对于LVEF指标，相比于假手术组，各时间点的对照组、实验组1、实验组2的LVEF值均显著降低；在Day 7和Day 30，实验组1和对照组的LVEF值无显著差别；在Day 7，实验组2的LVEF值显著高于对照组(实验组2vs.对照组，55.28％vs.44.28％，p＝0.0027)和实验组1(实验组2vs.实验组1，55.28％vs.46.70％，p＝0.021)；在Day 30，实验组2的LVEF值显著高于对照组(实验组2vs.对照组，71.10％vs.45.04％，p＝2.1273E-10)和实验组1(实验组2vs.实验组1，71.10％vs.47.17％，p＝3.5232E-11)。对于LVFS指标，相比于假手术组，各时间点的对照组、实验组1、实验组2的LVFS值均显著降低；在Day 7和Day 30，实验组1和对照组的LVFS值无显著差别；在Day 7，实验组2的LVFS值显著高于对照组(实验组2vs.对照组，26.91％vs.17.35％，p＝0.0029)和实验组1(实验组2vs.实验组1，26.91％vs.19.46％，p＝0.018)；在Day 30，实验组2的LVFS值显著高于对照组(实验组2vs.对照组，40.64％vs.18.02％，p＝9.4785E-12)和实验组1(实验组2vs.实验组1，40.64％vs.19.87％，p＝2.7313E-11)。
结论：由hCF-N1、hEC-N1构建的细胞补片能够显著促进心肌梗死后心脏功能的恢复。
上述对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，对于本发明做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.iPSC衍生的心脏成纤维细胞hCF-N1，于2024年1月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No：64265。
2.根据权利要求1所述的iPSC衍生的心脏成纤维细胞hCF-N1在制备治疗心脏疾病的产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述心脏疾病包括动脉粥样硬化、心肌梗死、缺血再灌注造成的损伤、心力衰竭、心脏毒性、心律失常。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品为细胞补片。
5.一种治疗心脏疾病的产品，其特征在于，包括权利要求1所述的iPSC衍生的心脏成纤维细胞hCF-N1。
6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述心脏疾病包括动脉粥样硬化、心肌梗死、缺血再灌注造成的损伤、心力衰竭、心脏毒性、心律失常。
7.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述产品为细胞补片。
8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，其制备方法如下：
S1、细胞墨水制备：将iPSC衍生的心脏成纤维细胞hCF-N1、血管内皮细胞hEC-N1用0.05％胰蛋白酶消化，离心收集细胞，用甲基丙烯酰化明胶溶液重悬细胞，细胞密度为5～10×107cell/mL；
S2、生物3D打印：使用气动挤出式生物3D打印机打印细胞补片，打印完成后，用培养液①和培养液②1:1混合液进行培养；4-6天后，在该补片上打印一层甲基丙烯酰化明胶，两块补片可融为一体；
培养液①包括10％胎牛血清、1％PS、1％的非必需氨基酸NEAA、余量的DMEM；培养液②包括Endothelial Cell Medium内皮细胞培养基。
9.根据权利要求1所述的iPSC衍生的心脏成纤维细胞hCF-N1在人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞的培养基中作为增殖促进剂的应用。
10.一种人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞的培养基，其特征在于，包括权利要求1所述的iPSC衍生的心脏成纤维细胞hCF-N1。
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