CN110760480B

CN110760480B - 一种抗肿瘤nk细胞及其制备方法

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Publication number: CN110760480B
Application number: CN201910613806.0A
Authority: CN
Inventors: 黄常新; 王聪洁; 李永强; 杨丽丽; 张嗣玉; 苏萌; 高岚岚; 葛钻敏
Original assignee: Hangzhou Normal University
Current assignee: Suzhou Keqi Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-07-09
Filing date: 2019-07-09
Publication date: 2021-07-02
Anticipated expiration: 2039-07-09
Also published as: CN110760480A

Abstract

本发明通过CRISPR‑CAS9基因编辑技术使NK92恒定高表达细胞因子IL2与IL12，实验发现恒定高表达的IL2与IL12经过自分泌途径作用于NK92细胞自身及其它邻近细胞，明显提高NK92细胞的增殖能力与对K562肿瘤细胞的杀伤活性。由此，本发明成功研制能够持续增殖和抗肿瘤活性明显增强的新型高效的NK细胞。

Description

一种抗肿瘤NK细胞及其制备方法

技术领域

本发明属于医学免疫治疗领域，涉及可持续增殖的新型高效抗肿瘤NK细胞及其研制。

背景技术

目前，包括CAR-T、NK细胞和免疫检查点抑制剂等的肿瘤免疫治疗成为最有前景的肿瘤治疗方法。其中NK细胞具有强大的天然抗肿瘤，且无需肿瘤细胞抗原(靶点)预先致敏即可识别并攻击肿瘤细胞，回避了实体肿瘤细胞缺乏理想的靶点这个障碍。但瘤体组织内活化NK细胞数量少、活性低是针对实体肿瘤的NK细胞免疫治疗的疗效的主要障碍。

采用体外扩增方法获得高数量、高纯度NK细胞，是近年研究NK细胞过继免疫治疗的热点。随扩增方法进步，NK细胞活性、纯度提高，为NK细胞成为肿瘤过继免疫治疗提供重要平台。但是，过继输注的NK细胞只有很少部分透过毛细血管进入实体肿瘤微环境，接触并杀伤肿瘤细胞，并不能解决瘤体组织内活化NK细胞数量少这个问题。最近研究发现肿瘤可能导致NK细胞数量减少，即患者外周血中能刺激转化为NK细胞的效应细胞数量较少，同时功能有不同程度的损害，可能导致扩增出的自体NK细胞功能低下。

目前NK细胞过继免疫治疗分为两类：自体NK细胞治疗和异体NK细胞治疗。但是，NK细胞只能杀伤缺乏及配型不一致的HLA分子肿瘤细胞，对表达HLA分子的肿瘤细胞没有杀伤作用。如果患者肿瘤细胞表达HLA分子。那么NK细胞表面的抑制性受体将发挥主要作用，患者自体激活的NK细胞将不能起到杀伤作用。

许多学者试图建立应用异体NK细胞用于肿瘤生物治疗，NK-92是唯一进入临床研究的细胞系，其对不同来源肿瘤细胞系，如白血病、乳腺癌等都表现出高效的杀伤活性。其表面表达大量活化受体，如NKp30、NKp46、NKG2D、NKG2E；抑制受体的表达极少，缺乏大多数正常NK细胞克隆表达的KIRs，却保留穿孔素/颗粒酶介导的细胞毒作用。I期临床试验研究表明，异体NK细胞治疗恶性肿瘤无毒副作用以及移植物抗宿主反应，提示NK细胞可能成为恶性肿瘤治疗的新路径。但是也存在着异体NK细胞在受者体内存活时间短、免疫排斥等问题。

研究表明，NK细胞可以通过直接的细胞毒作用以及与细胞因子相结合的方式来控制肿瘤的生长。为了克服肿瘤细胞对NK细胞介导的溶解性的抵抗，提高对肿瘤识别能力，嵌合受体被广泛研究；特异性的嵌合受体一旦接触抗原，嵌合受体信号即可激活NK细胞。

现有的使患者NK细胞增殖与活性增强的技术方案是：全身使用IL-2、IL-12等细胞因子，或转基因技术使局部某种细胞高表达这些细胞因子，从而使NK细胞增殖与活性增强。但全身使用的细胞因子作用于NK细胞的浓度并不高，且毒副反应大；转基因技术使局部某种细胞，如肿瘤细胞高表达这些细胞因子，缺点是细胞因子表达水平难以控制，直接作用于NK细胞的浓度也不高。更重要的是，细胞因子转基因修饰方式受到主要组织相容性复合基因MHC分子限制性的控制，使其应用受到限制。

本技术发明的NK细胞CRISPR-CAS9基因编辑技术等基因改造技术可克服这些局限性。

参考文献

D.SGOURAS,R.DUNCAN*.Methods for the evaluation ofbiocompatibility ofsoluble synthetic polymers which have potential for biomedical use:1-Use ofthe tetrazolium-based colorimetric assay(MTT)as a preliminary screen forevaluation of in vitro cytotoxicity.JOURNAL OF MATERIALS SCIENCE:MATERIALS INMEDICINE I(1990)61-68.

Suleyman Aydin*A short history,principles,and types of ELISA,and ourlaboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA.Peptides 72(2015)4–15.

发明内容

瘤体组织内活化NK细胞数量少、活性低是NK细胞免疫治疗的疗效的主要障碍。本技术使用CRISPR-CAS9基因编辑技术使NK92细胞的IL-2、IL-12两基因恒定持久地(可遗传给子代NK细胞)上调高表达，通过自分泌途径(NK细胞分泌到细胞外后在局部又作用于该NK细胞膜受体,即分泌系统与作用系统在同一NK细胞)，持续作用于NK细胞自身，使其在肿瘤组织内持续扩增和活化，解决肿瘤瘤体组织内NK数量不足的问题，提高NK细胞杀伤活性，并活化局部免疫微环境；

简要步骤：构建的SSA报告载体用T4DNA连接酶连接,高纯度提取后构建其慢病毒载体转染NK92细胞，使用表达“具有核定位信号的其C-端具有VP64转录激活结构域的D10A与H840A双突变的无酶切活性的Cas9蛋白”的质粒,；通过NCBI的数据库分别确定IL-2、IL-12基因转录起始位点上游5KB DNA片段序列，设计并合成其sgRNA。IL2-IL12A-IL12B gRNA序列，中间由2A基因间隔表达，骨架选择PUC57(含puro抗性，GFP绿色荧光蛋白等元件)，通过双链与BbsI内切酶酶切后线性化的Cas9表达质粒结合，测序验证,通过T4链接酶构建表达gRNA质粒(LW593)，sgRNA表达后与质粒LW415表达的VP64-Cas9绑定，sgRNA可以引导Cas9核酸酶识别并切割靶DNA序列，对Cas9蛋白中具有核酸酶活性的结构域进行突变得到无核酸酶活性的Cas9(dCas9)，定点突变后失去核酸酶活性的dCas9融合了转录激活域(VP64)，表达的融合蛋白在sgRNA的引导下靶向识别目的基因启动子区域，融合表达的转录激活结构域或转录调节结构域会招募相关的转录因子，从而准确特异地调控靶基因的表达。

较为概括地，本发明第一方面提供了一种遗传修饰的NK细胞的制备方法，所述制备方法为：通过基因工程手段，使NK细胞高表达IL2和/或IL12。

在一些实施方式中，所述基因工程手段是通过转录激活型CRISPR-CAS9系统实现的。

在一些实施方式中，所述CRISPR-CAS9系统中，针对IL2的sgRNA靶序列为：GGATCTCCTCAAGTGTCCCC，如SEQ ID NO.1所示；针对IL12A的sgRNA靶序列为：GCCGACGTTGCACCAGGTGC，如SEQ ID NO.3所示；针对IL12B的sgRNA靶序列为：TCCTCGTTATTGATACACAC，如SEQ ID NO.5所示；其中IL12A指IL12的第一亚基，IL12B指IL12的第二亚基。

在一些实施方式中，所述基因工程操作的步骤为：

(1)sgRNA载体的构建：构建慢病毒载体，所述慢病毒载体中包含所述针对IL2的sgRNA靶序列和/或所述针对IL12的sgRNA靶序列，其中，所述针对IL12的sgRNA靶序列包括所述针对IL12A的sgRNA靶序列和所述针对IL12A的sgRNA靶序列；

(2)dCas9质粒的构建：合成dCas9质粒，所述dCas9质粒具有核定位信号，所述dCas9质粒的C-端具有VP64转录激活结构域，所述dCas9质粒具有D10A与H840A双突变，所述dCas9质粒无酶切活性；

(3)NK细胞的感染：用所述sgRNA载体和所述dCas9质粒转染293T细胞，制造慢病毒液，PEG8000浓缩后联合病毒原液感染NK细胞，得到所述遗传修饰的NK细胞。

在一些实施方式中，所述293T细胞的转染是通过脂质体介导的转染进行的，NK细胞的感染通过慢病毒感染进行的。

较为详细地，

(1)购买表达“具有核定位信号的其C-端具有VP64转录激活结构域的D10A与H840A双突变的无酶切活性的Cas9”的质粒，质粒名称为：LW415，购买自北京合生基因公司；货号为：A-FW-201804200137；

(2)通过美国国立信息技术中心(NCBI)的数据库中获得IL-2、IL-12靶基因转录起始位点上游5KB DNA片段序列设计并合成sgRNA，根据http://crispr-era.Stanford选择效应性和特异性评分较好的激活gRNA序列，并检测脱靶效应，委托合生基因公司合成IL2-IL12A-IL12B gRNA，中间通过2A基因间隔，PCR扩增形成cDNA，通过T4DNA连接酶与线性化骨架PUC57vetcor结合构建慢病毒载体(pLV-U6-gRNA1-U6-gRNA2-U6-gRNA3-CMV-EGFP)，转化DH5a感受态，挑取单克隆，小提质粒并测序验证。高纯度提取质粒，SSA报告载体(骨架PUC57质粒)购买自北京合生基因公司；货号为：A-FW-201807200313。

(3)培养293T细胞，Lipo3000转染293T细胞，转染比例：6孔板：A液：Lipo30003.75μl，α-MEM培养基(无血清)121.25μl，B液：α-MEM培养基，ps PAX21.5μg、PMD2.G 0.5μg、LW4152μg、LW5932μg，P300012μl(2μl/μg)比例配置混合液；5分钟后B液加至A液，混匀，20分钟后均匀加入293T细胞培养液，混匀，48小时、96小时后荧光显微镜下观察荧光效果，收取慢病毒液，4℃4000g离心20分钟，取上清液。PEG8000浓缩病毒液，免疫荧光法检测滴度，确定感染浓度，感染NK92细胞，puro抗性筛选。

(4)qPCR、ELISA验证gRNA活性，比较gRNA序列对目的基因表达水平。

(5)SCID小鼠瘤体内验证NK细胞体内增殖活性。

在一些实施方式中，所述NK细胞的感染是通过慢病毒感染进行的。

本发明第二方面提供了一种遗传修饰的NK细胞，所述遗传修饰的NK细胞是通过本发明第一方面所述的制备方法制备得到的所述遗传修饰的NK细胞。

本发明第三方面提供了一种遗传修饰的NK细胞，所述遗传修饰的NK细胞高表达IL2和/或IL12。

本发明第四方面提供了一种应用于转录激活型CRISPR-CAS9系统的sgRNA，所述sgRNA的靶序列包括：针对IL2的sgRNA靶序列和/或针对IL12的sgRNA靶序列，其中，所述针对IL12的sgRNA靶序列包括所述针对IL12A的sgRNA靶序列和所述针对IL12A的sgRNA靶序列，所述IL12A指所述IL12的第一亚基，所述IL12B指所述IL12的第二亚基；

所述针对IL2的sgRNA靶序列为：GGATCTCCTCAAGTGTCCCC，如SEQ ID NO.1所示；

所述针对IL12A的sgRNA靶序列为：IL12A:GCCGACGTTGCACCAGGTGC，如SEQ ID NO.3所示；

所述针对IL12B的sgRNA靶序列为：TCCTCGTTATTGATACACAC，如SEQ ID NO.5所示。

本发明第五方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒中含有如本发明第四方面所述的sgRNA。

本发明第六方面如本发明第二方面或第三方面所述的遗传修饰的NK细胞在肿瘤的预防、抑制或治疗中的用途。

本技术发明创新地研制成功持续增殖的活性增强的新型抗肿瘤异体NK细胞，较好地解决自体NK细胞的问题。CRISPR-CAS9基因编辑技术克服了转基因方案的是过表达时间短、表达量难以控制，直接作用于NK细胞的IL-2、IL-12水平低等缺点。

附图说明

图1为本发明的技术路线图。

图2为LW415质粒图图谱。

图3为LW593质粒图图谱。

图4为慢病毒转染照片。

其中，A：293T细胞慢病毒质粒转染48小时后，于荧光显微镜下观察细胞感染效率，绿色荧光表达即转染率约为99％以上。B：NK92细胞慢病毒感染48小时后，于荧光显微镜下观察细胞感染效率，绿色荧光表达即感染率约为20％左右，经间隔重复感染及嘌呤霉素多次筛选后阳性率可达80-90％左右。

图5为ELISA法检测结果柱状图。

其中，A:经ELISA法检测，IL2表达水平以空白对照组IL2水平最高(≈921pg/ml)，其次为慢病毒感染组NK92细胞(≈783pg/ml)，普通型NK92细胞培养基IL2表达量最低(≈505pg/ml)；B：经ELISA法检测，实验组培养基中含有IL12(≈10pg/ml)，野生型NK92对照组及空白培养基组不含IL12蛋白含量。修饰组NK92细胞IL2/IL12蛋白表达较野生型NK92表达量明显提高。

图6示出了转染水平。

其中，A：内部方块较大的柱形代表实验组(慢病毒转染NK92组)，内部方块较小的柱形代表对照组(野生型NK92组)，柱形高低代表转染水平。NK92细胞慢病毒感染,检测48小时后IL2/IL12mRNA转录表达水平。慢病毒转染组较野生型NK92细胞表达水平明显提高，IL2/IL12mRNA基因表达可见IL2/IL12mRNA表达水平较野生型NK92明显提高。B：白色区域为实验Qpcr产物经凝胶电泳后所得，对照纵坐标大小约200bp左右,片段大小证实为目的基因，符合引物设计PCR产物大小。

图7示出了细胞杀伤率。其中，A为实验组，B为对照组，纵坐标代表杀伤作用，横坐标代表不同水平的效靶比。实验组NK92细胞对K562细胞的杀伤作用较普通NK92细胞杀伤活性明显增强，NK细胞对K562细胞的杀伤活性A组>B组(P<0.05)，且随着效靶比从1.25：1，2.5：1，5：l到10：l，NK92细胞对K562细胞的杀伤率逐步提高(P<0.05)。

图8示出了NK92细胞的增殖活性随时间变化的曲线图。其中，圆点代表不同时间NK92细胞的增殖活性大小。细胞增殖活性＝[实验组OD值-空白培养基OD值]/[对照组OD值-空白培养基OD值]×100％。NK92细胞慢病毒转染组的增殖活性较对照组明显增强，且随时间延长逐渐增加，12-24小时增殖曲线明显，48小时最佳，约为对照组1.75倍左右。

图9示出了小鼠瘤体内活体荧光成像图，其中，左边为灰度图，右边为荧光成像图，蓝色为背景，绿色荧光为慢病毒转染NK92所至，越接近红色荧光表示慢病毒转染NK92的数量越多。结果示：慢病毒转染组小鼠瘤体NK92持续增殖，4周后NK92瘤体内绿色荧光表达量对比2周时明显提高。

图10为免疫荧光照片，其中，第一行为野生组瘤体小鼠体内NK92细胞荧光表达率图，第二、三行为慢病毒转染组瘤体小鼠体内NK92细胞荧光表达率图。本发明使用兔抗人CD56抗体、羊抗兔IgG抗体(cy3红色荧光)标记NK92细胞，DAPI染细胞核(蓝色荧光)进行免疫荧光检测。慢病毒转染组小鼠体内兔抗人CD56、羊抗兔cy3标记NK92细胞红色荧光较野生型瘤体内明显，仍持续表达绿色荧光。

图11示出了本发明CRISPR-CAS9工作原理示意图。

具体实施方式

为了更好的解释本发明的技术方案，下面结合附图详细介绍本发明的实施例。以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的固定或限制。若未特别指明，实施例中所用的技术特征可以替换为具有在不背离发明构思前提下等同或相似功能或效果的其他本领域已知的技术特征。

1.实施的技术方案的主要步骤

1.1针对细胞免疫治疗肿瘤的疗效的主要障碍：浸润到肿瘤组织的活化免疫细胞数量不足和瘤体微环境的免疫抑制，本技术方案在已建立的NK体外培养平台基础上，使用CRISPR-CAS9基因编辑技术上调NK92细胞的IL-2、IL-12的转录水平，使NK细胞恒定过/高表达IL-2、IL-12。

1.2建立结肠癌移植瘤模型，评价肿瘤内NK细胞的浸润情况及检测NK细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。评价NK的抑瘤效果和毒副反应。

1.3开发研制在肿瘤瘤体内可持续增殖的、活性增强的新颖抗肿瘤NK92细胞；同时所研制的NK还保留具有天然抗感染免疫活性。

2.实施的技术方案的试剂及材料

本研究所用NK-92细胞株由杭州师范大学朴正浩教授赠送(购买自ATCC)；293T和K562细胞株由申请人的实验室保存；Ecoli-DH5α感受态细胞由上海生物工程有限公司购买；慢病毒包装质粒ps PAX2、PMD2.G杭州师范大学转化医学中心提供。核心质粒dcas9-vp64(LW415)、gRNAIL2/IL12(LW593)委托北京合生基因公司合成。α-MEM培养基(gibco)；胎牛血清(gibco澳洲)；马血清(gibco)；IL2(peprotech)；青链霉素(北京，China)；Scid小鼠，6-8周龄，T与B淋巴细胞缺陷动物(南京，china)；IL12、IL2Elisa试剂盒(联科生物，杭州)；qPCR试剂盒(takara)；兔抗人CD56抗体(ab75813)、山羊抗兔IgG(ab150077Abcam)；qPCR引物由上海生物工程有限公司合成；cck8、胰酶、PBS缓冲液、PEG8000等购相关配套器材购自宝日医生物技术工程(北京)有限公司和博士德生物有限公司；37℃、5％CO₂的二氧化碳培养箱等相关器材由杭州师范大学转化医学平台及申请人拥有。

细胞培养基：293T细胞：10％胎牛血清、1％青链霉素的DMEM培养基、6cm、10cmdish培养皿培养；K562细胞：用含10％胎牛血清、1％青链霉素的RPMI 1640培养基，T25培养瓶中培养；NK92细胞：12.5％胎牛血清、12.5％马血清、1％青链霉素、100U/ml IL2的α-MEM培养基、T25培养瓶中培养；置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，2天更换培养基。

实施例1：IL2、IL12慢病毒载体质粒构建

1.1设计gRNA引物(见表1)

基因编辑技术原理：本发明采用转录激活型CRISPR-CAS9系统提高IL-2、IL-12转录活性，本发明IL-12A、IL-12B指IL-12的两个亚基，原理如图11所示，概述如下下文3.1节所述。

根据前述原理，进行IL-2、IL-12A、IL-12B基因操作，方法与过程为：通过美国国立信息技术中心(NCBI)的数据库中分别获得IL-2靶基因(GenBank号为：NM_000586)、IL-12A靶基因(GenBank号为：NM_000882)、IL-12B靶基因(GenBank号为：NM_002187)转录起始位点上游5KB DNA片段序列设计并合成sgRNA，根据http://crispr-era.Stanford.edu/选择效应性和特异性评分较好的激活gRNA序列，并通过该网站预测脱靶效应，选择脱靶效应最低的gRNA使用，委托合生基因公司合成IL2-IL12A-IL12B gRNA，IL2gRNA、IL12AgRNA、IL12BgRNA的序列分别参见表1，中间通过2A基因间隔，2A基因序列为：

GGATCTGGCGCCACCAACTTCTCTCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCAGGCCCA，2A基因仅起到终止作用；PCR扩增形成双链DNA，分别通过PacI,AgeI限制酶酶切PUC57vetcor，然后通过T4DNA连接酶与线性化骨架PUC57vetcor结合构建慢病毒载体(pLV-U6-gRNA1-U6-gRNA2-U6-gRNA3-CMV-EGFP)，其中，pLV为慢病毒质粒，U6为U6启动子序列，gRNA1、gRNA2、gRNA3分别表示IL2gRNA、IL12AgRNA、IL12B gRNA，CMV表示CMV启动子序列，EGFP表示绿色荧光蛋白序列。用重组载体转化DH5a感受态细胞，挑取单克隆，小提质粒并测序验证。高纯度提取质粒，SSA报告载体(骨架PUC57质粒)购买自北京合生基因公司；货号为：A-FW-201807200313。(结构为：pLV-U6-gRNA1-U6-gRNA2-U6-gRNA3-CMV-EGFP)

表1：

1.2慢病毒质粒包装

6孔板培养293T细胞(DMEM培养基，10％FBS,1％青链霉素)，细胞密度达到70％-80％，且贴壁均匀，生长状态良；Lipofectamine3000转染试剂，按照A液：lipo30003.75μl，α-MEM培养基(无血清)121.25μl，B液：α-MEM培养基，ps PAX21.5μg、PMD2.G 0.5μg、LW4152μg、LW5932μg，P300012μl(2μl/μg)比例配置混合液；5分钟后B液加至A液，混匀，20分钟后均匀加入293T细胞培养液，混匀，48小时、96小时后荧光显微镜下观察荧光效果，收取慢病毒液，4℃3000g离心20分钟，取上清液。`

1.3PEG8000病毒浓缩

将病毒上清液收集后用0.45μm滤筛过滤，每30ml中加入7.5ml灭菌后的5xPEG8000母液；每30min混合病毒液一次，共进行3-5次，4℃静置过夜；4℃4000g离心20min；用一定量的PBS溶解病毒液，溶解后的病毒悬液分装成50μl每份，-80℃保存。

1.4病毒滴度测定

检测前一天，对293T细胞传代，96孔板中每个孔加1×10⁴个细胞，37℃培养24h。转导前，消化一个孔的细胞进行细胞计数，获取其细胞量，取100μL病毒上清液加100ul的培养基(DMEM+10％FBS)，混匀后，标记为10^-1，依次以10倍梯度稀释，直到稀释至10^-8。(每组6孔)，取1μL病毒浓缩液加200ul的培养基(DMEM+10％FBS)，混匀后，标记为10^-1，依次以10倍梯度稀释，直到稀释至10^-8。(每组6孔)，选取所需细胞孔，吸去培养孔中的培养液，加入梯度稀释好的病毒原液190μL，轻轻混匀后于37℃，5％CO₂培养箱中培养。待24h后，在荧光显微镜下观察个孔中的荧光数细胞并进行计数(拍照前吸弃培养液，PBS洗涤2次)。更换新鲜完全培养基200μL继续培养24h，在荧光显微镜下观察个孔中的荧光数细胞并进行计数。病毒滴度(IU/mL)＝(转染细胞数*稀释倍数*感染百分比)/(每mL所含病毒体积(mL)。病毒浓缩液滴度(IU/mL)＝1.8×10⁴×1000×3％/0.005＝1.08×10⁷IU/mL，病毒上清液滴度(IU/mL)＝1.8×10⁴×100×3％/0.5＝5.4×10⁶IU/mL。

实施例2：NK92-IL2-IL12细胞株构建

方法与过程：

T25培养瓶培养NK92细胞(α-MEM培养基，12.5％FBS，12.5％马血清，1％青链霉素，100U/ml IL2)，取生长状态较好的NK92细胞进行感染，细胞浓度约为65-80％。T25培养瓶中定容至2ml，取离心后实施例1所制备的重组病毒液3ml(病毒滴度约10^6)和病毒浓缩液50μl(病毒滴度约10^7)感染12h小时后换液，更换为完全培养基5ml，于48h、72h后于荧光显微镜下观察细胞感染效率，为进一步提高转染效率，按1:1000加入5ul polybrene以提高感染效率，同时可间隔两天重复感染；于培养基中添加按1:1000加入5μl嘌呤霉素(配置浓度2mg/ml)多次筛选后，每次筛选时间24小时，将无感染成功的细胞致死，使细胞稳定增殖出阳性细胞。见图4。

结果显示：

293T细胞慢病毒转染后绿色荧光表达水平较高，转染率约为99％以上(图4A)；提取慢病毒液浓缩后感染NK92细胞，感染48小时后细胞绿色荧光表达水平见(图4B)，感染率约为20％左右，经间隔重复感染及嘌呤霉素多次筛选后阳性率可达80-90％左右。

实施例3：ELISA和qPCR表达与鉴定

方法与过程：

分别取对数生长期慢病毒转染组(用实施例1所的重组慢病毒感染)和野生型组NK92细胞(α-MEM培养基，12.5％FBS，12.5％马血清，1％青链霉素，100U/ml IL2(1000pg/ml))，计数10⁷个，加入T25培养瓶中，定容至5ml，置入37℃、5％CO₂培养箱中培养48小时后离心取培养基，参照ELISA试剂盒protocol检测IL2、IL12蛋白表达量，每组设3副孔，分为空白培养基组，因子修饰组、野生型NK92组培养基检测；见图5。因子修饰组、野生型NK92组细胞采用Triol法提取RNA，Takara试剂盒逆转录成cDNA，QPCR荧光定量检测IL2、IL12基因表达量，设置因子修饰组和野生型NK92细胞组，每组设置3组平行孔，重复三次，qPCR结果行凝胶电泳观察扩增片段大小，比对基因大小，见图6。

结果显示：

IL2表达水平以空白对照组IL2水平最高(实际培养基浓度1000pg/ml)，其次为慢病毒感染组NK92细胞，普通型NK92细胞培养基IL2表达量最低(见5A)；实验组培养基中含有IL12，野生型NK92对照组及空白培养基组不含IL12蛋白含量(见5B)。IL2/IL12mRNA基因表达可见IL2/IL12mRNA表达水平较野生型NK92明显提高(见图6A)。qPCR产物经凝胶电泳大小约200bp左右，符合引物设计PCR产物大小，确为目的基因(见图6B)。

实施例4：NK92细胞杀伤活性检测

方法与过程：

收集对数生长期K562细胞、野生型NK92细胞和IL2/IL12基因修饰NK92细胞(α-MEM培养基，12.5％FBS，12.5％马血清，1％青链霉素，50U/ml IL2)。以K562细胞为靶细胞，调整细胞密度为2×10⁴/ml；NK细胞为效应细胞，根据不同效靶比分别调整细胞密度为2×10⁵/ml，按梯度稀释为1.25×10⁴/ml、0.25×10⁵/ml、0.5×10⁵/ml、1×10⁵/ml。按不同效靶比(1.25:1，2.5:1,5：l,10：1)将效应细胞与靶细胞混合，同时设相应的靶细胞(K562细胞)孔、效应细胞(野生型和IL2/IL12基因修饰型NK92细胞)孔和培养基空白对照孔，即单独靶细胞孔、单独效应细胞孔、单独培养基空白孔。每组均设3个平行孔。置37℃，5％CO₂培养箱中培养4小时后每孔加入l0μl CCK8(CellCounting Kit8)，混匀，于37℃、5％CO₂：培养箱中继续培养2h后用酶标仪测定每孔450nm波长处的OD值。细胞毒活性的计算方法：求出3个平行孔的平均值，按以下方法计算NK细胞毒活性，以杀伤率(％)表示。细胞毒活性＝[1-(效靶细胞作用孔OD值-效应细胞孔OD值)/靶细胞孔OD值×100％。见图7。

结果显示：

NK92细胞对K562细胞杀伤活性比较，IL2/IL12基因编辑组杀伤活性较野生组水平明显提高，且随效靶比成正比。

实施例5：NK92细胞增殖活性比较

方法与过程：

分别收集对数生长期的野生型和IL2/IL12基因编辑的NK92细胞(α-MEM培养基，12.5％FBS，12.5％马血清，1％青链霉素，50U/mlIL2)，调整细胞密度为1×10⁵/ml，每孔加入100μl(10⁴个)置入96孔板，置37℃，5％CO₂培养箱中分别培养6小时，12小时，24小时，48小时小时后每孔加入l0μl CCK8，混匀，于37℃、5％CO₂培养箱中继续培养2h后用酶标仪测定每孔450nm波长处的OD值。细胞毒增殖活性的计算方法：求出3个平行孔的平均值，按以下方法计算NK细胞毒活性。细胞增殖活性＝[实验组OD值-空白培养基OD值]/[对照组OD值-空白培养基OD值]×100％。见图8。

结果显示：

IL2/IL12基因编辑的NK92细胞增殖活性较野生型NK92细胞明显增强，且随时间延长逐渐增加，12-24小时增殖曲线明显，48小时最佳，约为对照组1.75倍左右。(见图8)。慢病毒转染组小鼠瘤体NK92持续增殖，4周后NK92瘤体内绿色荧光表达量对比2周时明显提高。(见图9)。

实施例6：小鼠体内NK92增殖水平比较

方法与过程：

取6-7周龄SCID小鼠，分为实验组和对照组，皮下注射2*10⁵个HT29细胞成瘤，2周后小鼠可见直径约2-3cm大小瘤体，瘤体内分别注射野生型和IL2/IL12基因修饰的NK92细胞10⁸(注射前细胞经过PBS清洗消除残留的IL2)，2周，4周观察瘤体内NK细胞荧光效应，见图9。4周后处死，取瘤体约中心处一米粒大小组织，4％多聚甲醛固定24小时，分别经过20％蔗糖、30％蔗糖脱水(沉底)后晾10分钟，加入OCT包埋剂，液氮冷冻15s后，-35℃切片机切片，羊血清封闭30分钟，兔抗人CD56抗体4℃过夜、羊抗兔IgG抗体(cy3红色荧光)标记NK92细胞37℃2小时，DAPI染细胞核(蓝色荧光)进行免疫荧光检测，比较NK细胞数量。见图10。

结果显示：

慢病毒转染组小鼠体内兔抗人CD56、羊抗兔cy3标记NK92细胞红色荧光较野生型瘤体内明显，仍持续表达绿色荧光。

3.主要实验方法

3.1sgRNA-PUC57(LW593)质粒的合成及提取

CRISPRassociated作为具有催化活性的dCas9蛋白，一个用于RNA引导DNA靶向的通用平台。dCas9与执行器的融合启用具有不同调节功能的域稳定有效的转录激活在人类细胞NK92中，具有传递位点完全由共同表达的简短向导决定(sg)的RNA。dCas9与转录的结合激活域(VP64)融合可以激活表达多个内源基因(IL2,IL12)。本发明的研究结果表明，CRISPR激活(CRISPRactive)介导转录激活是高度特异性的,CRISPR系统可以可作为模块化、灵活的DNA结合平台用于招募蛋白质到目标DNA顺序，揭示了CRISPRa作为基因精确调控的通用工具在真核细胞中的表达。RNAs粘附在sgRNA末端不会影响sgRNA绑定Cas9，因此将功能蛋白与无核酸酶活性的Cas9(dCas9)融合，从而实现功能蛋白(比如，转录激活因子)与DNA序列的结合。因此，Cas9携带一些融合蛋白或融合RNA到双链DNA序列，可以调控基因的表达和染色体结构。本发明通过合成IL2-IL12A-IL12B gRNA序列(gene synthesis)，中间由2A基因间隔表达，骨架选择PUC57(含puro抗性，GFP绿色荧光蛋白等元件)，通过T4链接酶构建表达gRNA质粒(LW593)，sgRNA表达后与质粒LW415表达的vp64-cas9绑定，sgRNA可以引导Cas9核酸酶识别并切割靶DNA序列，对Cas9蛋白中具有核酸酶活性的结构域进行突变得到无核酸酶活性的Cas9(dCas9)，定点突变后失去核酸酶活性的dCas9融合了转录激活域(VP64)，表达的融合蛋白在sgRNA的引导下靶向识别目的基因启动子区域，融合表达的转录激活结构域或转录调节结构域会招募相关的转录因子，从而准确特异地调控靶基因的表达。

IL2-IL12A-IL12B X序列(gene synthesis)，骨架选择PUC57，序列如下所示，其中三个方框中的序列本别依次为IL2、IL12A、IL12B的gRNA靶序列。

使用CRISPR-CAS9技术恒定上调高表达IL-2、IL-12，已经完成的实验简要步骤：购买表达“具有核定位信号的其C-端具有VP64转录激活结构域的D10A与H840A双突变的无酶切活性的Cas9”的质粒，质粒名称为：LW415，购买自北京合生基因公司；货号为：A-FW-201804200137；通过美国国立信息技术中心(NCBI)的数据库中获得IL-2、IL-12靶基因转录起始位点上游5KB DNA片段序列设计并合成sgRNA，根据http://crispr-era.Stanford.edu/选择效应性和特异性评分较好的激活gRNA序列，并检测脱靶效应，委托合生基因公司合成IL2-IL12A-IL12B gRNA，中间通过2A基因间隔，pcr扩增形成cDNA，通过T4DNA连接酶与线性化骨架PUC57vetcor结合构建慢病毒载体(pLV-U6-gRNA1-U6-gRNA2-U6-gRNA3-CMV-EGFP)，转化DH5a感受态，挑取单克隆，小提质粒并测序验证。高纯度提取质粒，SSA报告载体(骨架PUC57质粒)购买自北京合生基因公司；货号为：A-FW-201807200313。(1.连接：PUC57vetcor 2μl，IL2-IL12A-IL12B gRNA(PCR产物)1ul，T4DNAligase 0.5μl，ddH2O 5μl，RT1小时。2.转化：取5μL连接产物加入到刚解冻的50μL DH5α感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min后，42℃热激45s，立即放冰上静止2min，加950μL 37℃预热的LB液体培养基，37℃震荡培养45min，取100μL涂于氨苄青霉素抗性的平板。5.阳性克隆鉴定：挑3～4个单菌落摇菌，提取质粒DNA进行测序。测序引物为TS-SP002:CAGGAAGAGGGCCTATTTCCC)。

IL2ID3558Transcript ID:NM_000586,Distance to TSS:-962,Location:123378612；IL12A ID 3592,Transcript ID:NM_000882,Distance to TSS:-288,Location:159706334；IL12B ID 3593,Transcript ID:NM_002187,Distance to TSS:-163,Location:158757644.

IL2基因组序列(包含内含子)如下所示，其中方框所标识序列为基因修饰靶序列，下划线标识序列为编码序列。

3.2NK92细胞的培养及转染

在NK细胞体外培养平台基础上，用已构建的载体，使用Lipon2000转染试剂转染NK92细胞，并通过SSA报告载体报告转染成功的NK细胞，常规培养，慢病毒载体转染成功后NK细胞基因组获得IL-2、IL-12靶基因敲进并恒定持久高表达(已获RT-PCR和WB实验证实)。通过ELISA检测[1]发现IL-2、IL-12分泌水平明显提高(普通NKIL-2≈505pg/ml，转染NKIL-2≈738pg/ml，普通NKIL-12≈0pg/ml，转染NKIL-12≈10pg/ml)，MTT法[2]检测发现NK的增殖明显增强(增强80％)和对肿瘤杀伤活性大幅提高(从10％提高到80％)。

3.3结肠癌移植瘤模型的构建

人结肠癌移植瘤模型：人结肠癌细胞株由本申请申请人的科室保存。有限稀释法至单细胞常规培养，收获对数生长期细胞，制备细胞悬液。将5×10⁶个/ml细胞悬液100μl注射到裸鼠左侧背部皮下，定期测量肿瘤的大小。基因编辑的NK92细胞细针注入瘤体，分组观察裸鼠的生活情况和移植瘤的生长情况。测量肿瘤长短径及厚度，肿瘤抑制百分率(抑瘤率＝(对照组瘤体重-实验组瘤体重)/对照组平均瘤体重)。

4.本发明技术方案带来的有益效果

NK细胞具有强大的天然抗肿瘤和抗感染免疫作用；其抗肿瘤活性无需肿瘤细胞抗原(靶点)即可识别并攻击肿瘤细胞，因而NK细胞具有独特的抗肿瘤优势。但NK细胞免疫治疗实体肿瘤的疗效的制约瓶颈之一是瘤体组织浸润的NK细胞少、杀伤活性低。在实体肿瘤的目前常用的NK细胞治疗中，未能很好解决这个问题而显疗效不佳。

按NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性60％(这已经是较高的了),效靶比通常1:25计算，2500个NK细胞围攻100个肿瘤细胞，只有60个肿瘤细胞被杀死。实际上在人体肿瘤瘤体中肿瘤细胞数远远超过NK数(这还不计算肿瘤不断增殖的部分)。因此体内肿瘤组织中NK细胞数和杀伤活性都是远远不够的，即使静脉输注NK，数量也有限且不能透过毛细血管进入瘤体，这也是目前常用的NK细胞治疗方法治疗实体瘤疗效不理想的主要原因。大量研究证明IL-2、IL-12可大幅度提高NK的生存时间、持续增殖和杀伤活性，在此基础上，本发明技术通过基因编辑技术改造NK92的相关基因，使NK92过表达IL-2、IL-12，通过自分泌在局部高浓度反作用于NK92本身，从而使NK92细胞持续增殖并大幅提高杀伤活性，得到本项目实验证实；避免外源性输给IL-2、IL-12的巨大的全身毒副作用和转基因方法的MHC限制，达到大幅度提高NK92的生存时间、持续增殖和杀伤活性的目的：NK92细胞生存时间延长10-20倍，并能持续增殖，对肿瘤的杀伤活性也明显提高(约达90％)。

通常的基因转染只能瞬时过表达，且有MHC的限制，而且容易在细胞增殖后丢失转染的基因，不能使NK细胞持久恒定高/过表达某种蛋白分子；本发明技术再编辑NK细胞基因组，相关基因能够稳定传于子代NK细胞，使IL-2、IL-12的高表达得以恒定持久，获得可持续增殖的，活性大幅增强的NK92细胞。

在本发明技术中，经过慢病毒包装感染得到相应的病毒，经过48h的感染、整合，通过荧光显微镜观察以及嘌呤霉素的抗性筛选，得到表达纯度达80-90％以上的细胞，各组NK92细胞的qPCR、ELISA检测证明了细胞因子IL2与IL12在NK92细胞中成功表达，并且分泌至胞外，由此证明本研究成功构建了NK92-IL2-IL12的目的细胞株。本研究所构建的NK92-IL2-12细胞株能够保持IL2与IL12持续稳定的表达，释放在培养上清中的细胞因子能够作用于细胞自身，并且发挥促增殖的作用。在此，我们利用CCK-8法对细胞的增殖功能进一步验证，通过48小时的连续检测以及小鼠体内持续4周的检测，可以观察到含IL2、IL12修饰的NK92细胞其生长一直维持活性状态，不断增殖，由此可知NK92-IL2-12在能促进细胞增殖同时维持细胞生长状态。

以上各个实施例只是用于进一步说明本发明，并不是用来限制本发明的保护范围，凡是基于本发明的构思所作出的等同变换及对本发明的各个技术方案显而易见的改进，均落入本发明的保护范围。

序列表

<110> 杭州师范大学

<120> 一种抗肿瘤NK细胞及其制备方法

<141> 2019-07-09

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggatctcctc aagtgtcccc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggggacactt gaggagatcc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gccgacgttg caccaggtgc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcacctggtg caacgtcggc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcctcgttat tgatacacac 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtgtgtatca ataacgagga 20

Claims

1.一种遗传修饰的NK细胞的制备方法，所述制备方法为：通过基因工程手段，使NK细胞高表达IL2和IL12；

所述基因工程手段是通过转录激活型CRISPR-CAS9系统实现的；

所述CRISPR-CAS9系统中，针对IL2的sgRNA靶序列为：GGATCTCCTCAAGTGTCCCC，如SEQID NO.1所示；针对IL12 A 的sgRNA靶序列为： GCCGACGTTGCACCAGGTGC，如SEQ ID NO.3所示; 针对IL12 B 的sgRNA靶序列为：TCCTCGTTATTGATACACAC，如SEQ ID NO.5所示；其中IL12A指IL12的第一亚基，IL12B指IL12的第二亚基；

所述基因工程操作的步骤为：

（1）sgRNA载体的构建：构建慢病毒载体，所述慢病毒载体中包含所述针对IL2的sgRNA靶序列和所述针对IL12的sgRNA靶序列，其中，所述针对IL12的sgRNA靶序列包括所述针对IL12A的sgRNA靶序列和所述针对IL12B的sgRNA靶序列，其中，各个靶序列之间由2A基因间隔，2A基因序列为GGATCTGGCGCCACCAACTTCTCTCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCAGGCCCA；

（2）dCas9质粒的构建：合成dCas9质粒，所述dCas9质粒具有核定位信号，所述dCas9质粒的C-端具有VP64转录激活结构域，所述dCas9质粒具有D10A与H840A双突变，所述dCas9质粒无酶切活性；

（3）NK细胞的感染：用所述sgRNA载体和所述dCas9质粒转染293T细胞，制造慢病毒液，PEG8000浓缩后联合病毒原液感染NK细胞，得到所述遗传修饰的NK细胞。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述293T细胞的转染是通过脂质体介导的转染进行的，NK细胞的感染是通过慢病毒感染进行的。

3.一种遗传修饰的NK细胞，所述遗传修饰的NK细胞是通过如权利要求1或2所述的制备方法制备得到的所述遗传修饰的NK细胞。