KR20220097985A - Car-t 세포의 제조 방법 - Google Patents

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줄리 카슨
데메트리오스 칼라이치디스
시위앤 탄
후이 유
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Abstract

본 개시의 양태는 종래의 제조 방법에 비하여 몇몇의 개선을 제공함으로써 임상적으로 유용한 CAR T-세포 요법의 강건한 공급을 야기하게 할 수 있는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 유전학적으로 조작된 T 세포의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

CAR-T 세포의 제조 방법
관련 출원에 관한 상호 참조
본 출원은 이로써 그의 전체가 참조로 포함되는 2019년 11월 13일자 출원된 미국 특허 가출원 제62/934,999호에 대한 우선권의 이익을 주장한다.
키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 요법은 혈액암의 치료에서 유망한 치료 효과를 나타낸 바 있다. 전형적으로, CAR T 세포는 환자 면역 세포(자가) 또는 무관한 인간 공여자 유래의 면역 세포(동종이계) 중 어느 하나의 유전학적 조작(genetic engineering)에 의해 생성된다. 고품질의 임상 등급 CAR-T 세포의 생성은 이 기술의 광범위한 적용을 위한 전제 조건이다. 따라서 CAR-T 세포의 대규모 생성을 위한 효율적인 제조 방법을 개발하는 것에 큰 관심이 있다.
본 개시는 적어도 부분적으로, 종래의 제조 방법에 비하여 몇몇의 개선을 제공하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 유전학적으로 조작된 T 세포를 제조하기 위한 방법의 개발에 기초한다. 이러한 개선은 임상적으로 유용한 CAR T 세포 요법의 강건한 공급을 야기하게 할 수 있는 본원에 기재된 유전학적 변형의 일관성 및 효율의 개선(예를 들어, 3중 게놈 편집의 일관성 및 효율의 개선)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
따라서, 본 개시의 일 양태는 유전학적으로 조작된 T 세포의 제조 방법을 제공하며, 당해 방법은 (i) T 세포의 제1 집단을 제공하는 단계; (ii) 제1 Cas9 효소 및 CD70 유전자를 표적화하는 제1 가이드 RNA(gRNA)를 포함하는 제1 리보핵단백질(RNP) 복합체를 T 세포의 제1 집단 내로 도입하여, T 세포의 제2 집단을 생성하는 단계로서, T 세포의 제2 집단이 파괴된 CD70 유전자를 갖는 T 세포를 포함하는 단계; (iii) 제2 Cas9 효소 및 T 세포 수용체 알파 사슬 불변 영역(TRAC) 유전자를 표적화하는 제2 gRNA를 포함하는 제2 RNP 복합체 및 제3 Cas9 효소 및 베타-2 마이크로글로불린(β2M) 유전자를 표적화하는 제3 gRNA를 포함하는 제3 RNP 복합체를 T 세포의 제2 집단 내로 도입하여, T 세포의 제3 집단을 생성하는 단계로서, T 세포의 제3 집단이 파괴된 CD70 유전자, 파괴된 TRAC 유전자 및 파괴된 β2M 유전자를 갖는 활성화된 T 세포를 포함하는 단계; (iv) T 세포의 제3 집단을 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터와 함께 인큐베이션시켜, T 세포의 제4 집단을 생성하는 단계로서, AAV 벡터가 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 핵산 서열은 TRAC 유전자에 대한 상동성 서열이 측접하며, T 세포의 제4 집단이 파괴된 CD70 유전자, 파괴된 TRAC 유전자 및 파괴된 β2M 유전자를 갖는, CAR을 발현하는 활성화된 T 세포를 포함하는 단계; (v) T 세포의 제4 집단을 증량(expanding)시킴으로써, 증량된 T 세포 집단을 생성하는 단계; (vi) 증량된 T 세포 집단으로부터 TCRαβ+ T 세포를 제거하여, 유전학적으로 조작된 T 세포의 집단을 생성하는 단계로서, 유전학적으로 조작된 T 세포의 집단이 파괴된 CD70 유전자, 파괴된 TRAC 유전자 및 파괴된 β2M 유전자를 갖는, CAR을 발현하는 활성화된 T 세포를 포함하는 단계; 및 (vii) 유전학적으로 조작된 T 세포의 집단을 수거하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, T 세포의 제1 집단은 인간 혈액 세포로부터 농축된 동결보존된 T 세포로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, T 세포의 제1 집단은 하기를 포함하는 방법에 의해 제조된다: (a) 인간 공여자로부터 혈액 세포를 수득하는 단계; 및 (b) CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포를 혈액 세포로부터 농축시키는 단계. 일부 실시형태에서, 단계 (b)는 항-CD4 및/또는 항-CD8 항체와 컨쥬게이트된 자성 비드를 사용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, T 세포의 제1 집단은 적어도 약 80%의 세포 생존력 및/또는 적어도 약 80%의 순도의 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 갖는다. 일부 실시형태에서, 방법은 (c) 단계 (b)에서 생성되는 농축된 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 동결보존하는 단계를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 단계 (ii)는 전기천공법에 의해 수행된다. 일부 실시형태에서, 제1 Cas9 효소의 농도는 약 0.15 ㎎/㎖이며, CD70 유전자를 표적화하는 제1 gRNA의 농도는 약 0.16 ㎎/㎖이다. 일부 실시형태에서, 단계 (ii)에서 세포 농도는 약 100x106개 세포/㎖ 내지 약 400x106개 세포/㎖이다. 일부 실시형태에서, 단계 (ii)에서 세포 농도는 약 100x106개 세포/㎖ 내지 약 350x106개 세포/㎖이다. 일부 실시형태에서, 단계 (ii)에서 세포 농도는 약 300x106개 세포/㎖이다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에, T 세포의 제2 집단을 세포 배양 용기에서 T 세포 활성화제의 존재 하에 인큐베이션시켜, T 세포의 활성화된 집단을 생성하는 단계로서, T 세포의 활성화된 집단이 파괴된 CD70 유전자를 갖는 활성화된 T 세포를 포함하는 단계를 더 포함한다. T 세포 활성화제는 CD3 효능제 및 CD28 효능제를 포함할 수 있으며, CD3 효능제 및 CD28 효능제는 나노매트릭스 입자에 부착된다. 세포 배양 용기에서 T 세포 활성화제의 존재 하에 T 세포의 제2 집단을 인큐베이션시키는 단계는 약 2x106개/㎠의 세포 씨딩 밀도 및 약 2x106개 세포/㎖의 세포 농도로 약 72시간 동안 행해질 수 있다. 일부 실시형태에서, 혼합물 중 T 세포 활성화제 대 배지의 비는 약 1:12.5(v/v)이다. 또 다른 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 T 세포의 제2 집단을 T 세포 활성화제의 존재 하에 인큐베이션시킨 후에 T 세포 활성화제를 T 세포의 활성화된 집단에서 희석하여, 단계 (iii) 이전에 활성화를 감소시키고, 세포가 회복되게 하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 단계 (iii)은 전기천공법에 의해 수행된다. 일부 실시형태에서, 단계 (iii)은 하나의 전기천공법 이벤트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 RNP 복합체 및 제3 RNP 복합체는 하나의 전기천공법 이벤트에서 활성화된 T 세포 내로 도입된다. 일부 실시형태에서, 제2 RNP 복합체 내의 제2 Cas9 효소의 양은 제3 RNA 복합체 내의 제3 Cas9 효소의 양과 같다. 일부 실시형태에서, 제2 Cas9 효소의 농도는 약 0.3 ㎎/㎖이고, 제3 Cas9 효소의 농도는 약 0.3 ㎎/㎖이고, TRAC 유전자를 표적화하는 제2 gRNA의 농도는 약 0.08 ㎎/㎖이고, β2M 유전자를 표적화하는 제3 gRNA의 농도는 약 0.2 ㎎/㎖이다. 일부 실시형태에서, 단계 (iii)에서 세포 농도는 약 100x106개 세포/㎖ 내지 약 400x106개 세포/㎖이다. 일부 실시형태에서, 단계 (iii)에서 세포 농도는 약 300 x 106개 세포/㎖이다. 다른 실시형태에서, 단계 (iii)(예를 들어, 전기천공법)에서 사용되는 각각의 용기 내의 총 세포 수는 약 5x108개 내지 약 2.5x109개의 세포, 예를 들어, 약 7x108개의 세포일 수 있다. 일부 예에서, 다수의 용기, 예를 들어, 약 5 내지 10개의 용기가 단계 (iii)(예를 들어, 전기천공법)에서 사용될 수 있다. 구체적인 예에서, 7개만큼 많은 용기가 단계 (iii)에서 사용될 수 있으며, 이는 예를 들어, 전기천공법을 위하여 약 1.5x109개 내지 약 3x109개의 세포(예를 들어, 약 2.1x109개의 세포 또는 약 2.7x109개의 세포)를 함유할 수 있다.
일부 실시형태에서, AAV 벡터는 약 10,000 내지 약 80,000의 감염 다중도(MOI) 값을 갖는다. 일부 실시형태에서, AAV 벡터의 MOI는 약 20,000이다. 일부 실시형태에서, AAV 벡터는 AAV 혈청형 6(AAV6) 벡터이다.
일부 실시형태에서, 단계 (v)는 T 세포의 제4 집단을 세포 배양 용기에서 약 2x105개 세포/㎠ 내지 약 5x105개 세포/㎠의 씨딩 밀도로 약 7일 내지 약 12일 동안 배양함으로써 수행된다. 일부 실시형태에서, T 세포의 제4 집단은 약 150,000개 세포/㎠ 내지 약 600,000개 세포/㎠의 씨딩 밀도로 세포 배양 용기에 씨딩될 수 있다. 일부 실시형태에서, T 세포의 제4 집단은 약 3x105개 세포/㎠ 내지 약 5x105개 세포/㎠의 씨딩 밀도로 배양된다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 용기는 배지 교체 없이 약 10일 내지 약 12일 동안 세포 증량을 가능하게 하는 정적 세포 배양 용기(본원에서 상호 교환 가능하게 정적 배양 용기로도 지칭됨)이다.
일부 실시형태에서, 단계 (vi)은 증량된 세포를 항-TCRαβ 항체가 고정된 비드와 접촉시키고, 비결합 세포를 수집함으로써 수행된다.
일부 실시형태에서, 제1 Cas9 효소, 제2 Cas9 효소 및/또는 제3 Cas9 효소는 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9(spCas9)로부터의 Cas9 효소이다. 일부 실시형태에서, 제1 Cas9 효소, 제2 Cas9 효소 및 제3 Cas9 효소는 동일하다. 일부 실시형태에서, 제1 Cas9 효소, 제2 Cas9 효소 및 제3 Cas9 효소는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, CD70 유전자를 표적화하는 제1 gRNA는 SEQ ID NO: 4의 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD70 유전자를 표적화하는 제1 gRNA는 SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, TRAC 유전자를 표적화하는 제2 gRNA는 SEQ ID NO: 8의 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, TRAC 유전자를 표적화하는 제2 gRNA는 SEQ ID NO: 6의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, β2M 유전자를 표적화하는 제3 gRNA는 SEQ ID NO: 12의 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, β2M 유전자를 표적화하는 제3 gRNA는 SEQ ID NO: 10의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 gRNA, 제2 gRNA, 제3 gRNA 및/또는 이의 조합은 하나 이상의 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 변형을 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR은 암 항원을 표적화하는 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 동시-자극 도메인 및 CD3ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포외 도메인은 단일-쇄 가변 단편(scFv)을 포함하고/하거나, 막횡단 도메인은 CD8a로부터 유래되고/되거나, 동시-자극 도메인은 4-1BB로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, scFv 단편은 CD70에 결합한다. 일부 실시형태에서, CAR은 SEQ ID NO: 46의 아미노산 서열을 포함한다.
따라서, 본 개시의 일 양태는 유전학적으로 조작된 T 세포의 제조 방법을 제공하며, 당해 방법은 (i) T 세포의 제1 집단을 제공하는 단계; (ii) 제1 Cas9 효소 및 CD70 유전자를 표적화하는 제1 가이드 RNA(gRNA)를 포함하는 제1 리보핵단백질(RNP) 복합체를 T 세포의 제1 집단 내로 도입하여, T 세포의 제2 집단을 생성하는 단계로서, T 세포의 제2 집단이 파괴된 CD70 유전자를 갖는 T 세포를 포함하는 단계; (iii) 세포 배양 용기에서 T 세포 활성화제의 존재 하에 T 세포의 제2 집단을 인큐베이션시켜, T 세포의 제3 집단을 생성하는 단계로서, T 세포의 제3 집단이 파괴된 CD70 유전자를 갖는 활성화된 T 세포를 포함하는 단계; (iv) 제2 Cas9 효소 및 T 세포 수용체 알파 쇄 불변 영역(TRAC) 유전자를 표적화하는 제2 gRNA를 포함하는 제2 RNP 복합체, 및 제3 Cas9 효소 및 베타-2 마이크로글로불린(β2M) 유전자를 표적화하는 제3 gRNA를 포함하는 제3 RNP 복합체를 T 세포의 제3 집단 내로 도입하여, T 세포의 제4 집단을 생성하는 단계로서, T 세포의 제4 집단이 파괴된 CD70 유전자, 파괴된 TRAC 유전자 및 파괴된 β2M 유전자를 갖는 활성화된 T 세포를 포함하는 단계; (v) T 세포의 제4 집단을 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터와 함께 인큐베이션시켜, T 세포의 제5 집단을 생성하는 단계로서, AAV 벡터가 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 핵산 서열은 TRAC 유전자에 대한 상동성 서열이 측접하며, T 세포의 제5 집단이 파괴된 CD70 유전자, 파괴된 TRAC 유전자 및 파괴된 β2M 유전자를 갖는, CAR을 발현하는 활성화된 T 세포를 포함하는 단계; (vi) T 세포의 제5 집단을 증량시킴으로써 증량된 T 세포 집단을 생성하는 단계; (vii) 증량된 T 세포 집단으로부터 TCRαβ+ T 세포를 제거하여, 유전학적으로 조작된 T 세포의 집단을 생성하는 단계로서, 유전학적으로 조작된 T 세포의 집단이 파괴된 CD70 유전자, 파괴된 TRAC 유전자 및 파괴된 β2M 유전자를 갖는, CAR을 발현하는 활성화된 T 세포를 포함하는 단계; 및 (viii) 유전학적으로 조작된 T 세포의 집단을 수거하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성되는 유전학적으로 조작된 T 세포 집단.
본 발명의 하나 이상의 실시형태의 상세사항은 하기 설명에 제시되어 있다. 본 발명의 다른 특징 또는 이점은 하기의 도면 및 몇몇의 실시형태의 상세한 설명, 및 또한 첨부된 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1은 소규모 제조 공정에서 제조된 T 세포의 편집 후 T 세포 증량을 보여주는 그래프이다. RNP 복합체는 괄호 안에 나타나 있다. 2d: 2일(48시간) 동안 활성화된 T 세포; 3d: 3일(72시간) 동안 활성화된 T 세포; 1x EP: 단일의 전기천공법; 2x EP: 2-단계 전기천공법.
도 2a 및 도 2b는 전좌율(translocation rate)에 대한 단일의 전기천공법 또는 2-단계 전기천공법의 영향을 보여주는 그래프를 포함한다. 도 2a: 11개의 표기된 전좌의 전좌 퍼센트를 보여주는 그래프. 도 2b: 8개의 표기된 전좌의 전좌 퍼센트를 보여주는 그래프.
도 3a 및 도 3b는 CTX130 T 세포의 제조 방법의 흐름도를 포함하며, 이는 항-CD70 CAR을 발현하며, 유전학적으로 파괴된 CD70, β2M 및 TRAC 유전자를 갖는다. 도 3a는 본원에 기재된 기술의 일부 실시형태에 따른 항-CD70 CAR을 발현하는 T 세포를 제조하기 위한 예시적인 제조 공정의 흐름도를 포함한다. CAR: 키메라 항원 수용체; EDTA: 에틸렌디아민테트라아세트산; HSA: 인간 혈청 알부민; IL: 인터류킨; PBS: 인산염 완충 염수; rAAV: 재조합 아데노-연관 바이러스; sgRNA: 단일 가이드 리보핵산; TCRαβ: T 세포 수용체 알파 쇄 및 T 세포 수용체 베타 쇄; 보충된 X-VIVO™ 15: 5% 남성 인간 혈청 AB, 100 IU/㎖ rhIL-2 및 100 IU/㎖ rhIL-7이 있는 X-VIVO™ 15. 도 3b는 본원에 기재된 기술의 일부 실시형태에 따른 항-CD70 CAR을 발현하는 T 세포를 포함하는 약품을 제조하기 위한 예시적인 제조 공정의 흐름도를 포함한다.
본 개시는 적어도 부분적으로, 제조 방법의 하나 이상의 단계에 대한 개선된 조건을 포함하는, CAR-T 세포, 특히 동종이계 CAR-T 세포를 생성하기 위한 개선된 제조 방법의 개발에 기초한다. 본원에 개시된 개선된 제조 방법은 적어도 하기의 유리한 결과를 야기한다:
(a) 본원에 제공되는 개선된 T 세포 활성화 조건으로부터 초래되는 전기천공법 이후의 %CAR+ 발현 증가 및 세포 소실 약화.
(b) 본원에 제공되는 활성화된 T 세포의 개선된 CRISPR-Cas9-매개의 유전자 편집 조건으로부터 초래되는 T 세포에서의 β2M 유전자 파괴의 일관성 개선 및 효율 개선.
(c) 본원에 제공되는 개선된 T 세포 전기천공법 조건으로부터 초래되는 더 낮은 전좌율.
(d) 본원에 기재되는 개선된 제조 방법에 의해 제공되는 감소된 생성 시간 및 감소된 생성 비용으로부터 초래되는 CAR T-세포 요법의 공급 증가.
(e) 본원에 기재되는 개선된 제조 방법을 사용하여 균일한 고 품질 CAR T-요법의 생성으로부터 초래되는 제조된 약품의 가변성 감소.
(f) T 세포에서 높은 CAR 발현 수준을 유지하면서, 단순화된 AAV 형질도입 조건.
따라서, CAR 구축물, 예컨대 암 항원, 예를 들어, CD70을 표적화하는 CAR 구축물을 발현하는, CD70, TRAC 및 β2M 유전자가 낙아웃된, 유전학적으로 조작된 T 세포의 제조 방법이 본원에 제공된다. 본원에 기재된 방법에 의해 생성되는 유전학적으로 조작된 T 세포 집단 및 이의 치료적 용도는 또한, 본 개시의 범주 내에 있다.
I. 유전학적으로 조작된 T 세포의 제조
본 개시의 양태는 파괴된 분화 클러스터 70(CD70) 유전자, 파괴된 베타-2-마이크로글로불린(β2M) 유전자 및 파괴된 T 세포 수용체 알파 사슬 불변 영역(TRAC) 유전자, 및 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 삽입된 핵산을 포함하는 유전학적으로 조작된 T 세포의 제조 방법을 제공한다.
CD70 유전자의 파괴는 유전학적으로 조작된 T 세포의 제조 동안 세포-대-세포 동족살해(fratricide)를 방지한다. 대안적으로 또는 추가적으로, CD70 유전자의 파괴는 유전학적으로 조작된 T 세포의 증가된 건강 및 기능(예를 들어, 연장된 증식, 감소된 소진)을 가능하게 한다. β2M 유전자 및 TRAC 유전자의 파괴는 유전학적으로 조작된 T 세포를 비-동종반응성이 되게 하고, 동종이계 이식에 적합하게 한다. CAR을 인코딩하는 핵산의 삽입은 유전학적으로 조작된 T 세포가 그의 표면 상에 CAR을 발현하게 하며, 이는 유전학적으로 조작된 T 세포를 암 세포에 표적화한다.
따라서, 본원에 개시된 유전학적으로 조작된 T 세포의 제조 방법은 일부 실시형태에서, CD70, TRAC 및 β2M 유전자의 발현을 파괴하기 위한 CRISPR-Cas9 유전자 편집의 이용 및 CAR을 인코딩하는 핵산을 삽입하기 위한 아데노-연관 바이러스(AAV) 형질도입의 이용을 포함한다.
일반적으로, 본원에 개시된 CAR-T 세포의 제조 방법은 (i) 적합한 인간 면역 세포 공급원으로부터 CD4+/CD8+ T 세포를 농축하는 단계, (ii) 농축된 CD4+/CD8+ T 세포를 활성화시키는 단계, (iii) 활성화된 T 세포를 유전학적으로 조작하여, 파괴된 CD70, TRAC 및 β2M 유전자를 갖는 CAR-T 세포를 생성하는 단계; 및 유전학적으로 조작된 T 세포를 치료적 이용을 위하여 수거하는 단계를 포함할 수 있다. 필요한 경우, 농축된 CD4+/CD8+ T 세포를 장래의 이용을 위하여 동결보존을 통해 보관할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 유전학적으로 조작된 T 세포는 수거 전에 시험관 내에서 증량될 수 있다. TCRαβ+ T 세포는 이에 따라 생성된 CAR-T 세포 집단으로부터 고갈될 수 있다.
(i) T 세포 농축
본원에 개시된 임의의 제조 방법은 출발 물질로서 인간 혈액 세포를 사용할 수 있다. 예를 들어, T 세포는 당업자에게 공지된 기법, 예컨대 침강, 예를 들어, FICOLL™ 분리를 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액의 단위로부터 수득될 수 있다. 대안적으로, 유전학적으로 조작된 T 세포의 제조에서 사용하기 위한 T 세포는 시험관 내 분화를 통해 줄기 세포(예를 들어, HSC 또는 iPSC)로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 혈액 세포는 개별 인간 공여자로부터 수득될 수 있다. 다른 실시형태에서, 혈액 세포는 다수의 인간 공여자(예를 들어, 2, 3, 4 또는 5명의 인간 공여자)로부터 수득될 수 있다.
일부 예에서, 적합한 인간 공여자 유래의 류코팩(leukopak) 샘플이 사용될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 류코팩 샘플은 말초 혈액으로부터 수집되는 농축된 백혈구성분채집 생성물이다. 이는 전형적으로, 단핵구, 림프구, 혈소판, 혈장 및 적혈구를 포함하는 다양한 혈액 세포를 함유한다. 인간 공여자는 바람직하게는 건강한 인간 공여자이다. 예를 들어, 인간 공여자 후보는 HBV, HCV, HIV, HTLV, WNV, 트리파노소마 크루지(trypanosoma cruzi) 및/또는 CMV에 대한 스크리닝으로 처리될 수 있다. 스크리닝에서 음성 결과를 보이는 인간 대상체가 혈액 세포에 대한 공여자로서 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용되는 T-세포의 공급원은 특별히 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, T 세포 은행으로부터의 T 세포는 본원에 개시된 임의의 제조 방법에서 출발 물질로서 사용될 수 있다. T 세포 은행은 세포 배양물에서 T 세포 지속성을 개선시키기 위하여 특정 유전자(예를 들어, 세포 자가 재생, 아폽토시스 및/또는 T 세포 소진 또는 복제 노화에 관여하는 유전자)의 유전학적 편집을 갖는 T 세포를 포함할 수 있다. T 세포 은행은 보나파이드(bonafide) T 세포, 예를 들어, 비-형질전환된 T 세포, 최종 분화된 T 세포, 안정한 게놈을 갖는 T 세포 및/또는 증식 및 증량을 위해 사이토카인 및 성장 인자에 의존하는 T 세포로부터 생성될 수 있다. 대안적으로, 이러한 T 세포 은행은 전구체 세포, 예컨대 조혈 줄기 세포(예를 들어, iPSC), 예를 들어, 시험관 내 배양물로부터 생성될 수 있다. 일부 예에서, T 세포 은행에서의 T 세포는 세포 자가-재생에 관여하는 하나 이상의 유전자, 아폽토시스에 관여하는 하나 이상의 유전자 및/또는 T 세포 소진에 관여하는 하나 이상의 유전자의 유전학적 편집을 포함하여, 이러한 유전자를 파괴하거나 이의 발현을 감소시켜, 배양물에서 지속성을 개선시킬 수 있다. T 세포 은행에서의 편집된 유전자의 예에는 Tet2, Fas, CD70, Regnase-1 또는 이의 조합이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 비-편집된 T 대응물과 비교하여, T 세포 은행에서의 T 세포는 배양 중 향상된 증량 능력, 향상된 증식 능력, 더 큰 T 세포 활성화 및/또는 감소된 아폽토시스 수준을 가질 수 있다.
적합한 T 세포는 종래의 방법 또는 본원에 개시된 방법을 사용하여 인간 혈액 세포로부터 농축될 수 있다. 유전학적으로 조작된 T 세포를 제조하는 데 사용하기 위한 T 세포는 CD4+, CD8+ 또는 이의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 T 세포 마커 중 하나 이상을 발현할 수 있다. 일부 실시형태에서, CD4+ T 세포는 인간 혈액 세포로부터 농축될 수 있다. 다른 실시형태에서, CD8+ T 세포는 농축될 수 있다. 특정 예에서, CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 모두는 인간 혈액 세포로부터 정제된다.
CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포는 당업계에 알려져 있는 임의의 방법 또는 본원에 개시된 것들을 사용하여, 예를 들어, 표적 T 세포에 대한 특정 세포-표면 바이오마커에 결합할 수 있는 항체, 예를 들어, CD4에 특이적인 항체 및/또는 CD8에 특이적인 항체를 사용하여 적합한 혈액 세포 공급원, 예컨대 본원에 기재된 것들로부터 단리될 수 있다. 일부 실시형태에서, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 농축하는 단계는 자성 비드에 컨쥬게이트된 항-CD4 및 항-CD8 항체를 사용하여 수행될 수 있다. 비드에 컨쥬게이트된 항체를 통해 자성 비드로의 표적 T 세포의 결합을 가능하게 하기에 적합한 조건 하에서 적합한 기간 동안 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하는 세포 집단을 이러한 자성 비드와 함께 인큐베이션시킬 수 있다. 비-결합 세포를 세척할 수 있고, 비드에 결합된 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 일상적인 방법을 사용하여 수집할 수 있다.
농축된 T 세포(예를 들어, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포)는 일상적인 관례에 따라 표적 T 세포의 세포 생존력 및/또는 순도와 같은 특징에 대하여 평가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 농축 단계로부터의 T 세포 집단은 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 이상)의 세포 생존력을 가질 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 농축된 T 세포 집단은 적어도 약 80%, 예를 들어, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97%, 약 98% 이상의 순도의 표적 T 세포(예를 들어, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포)를 가질 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 농축된 T 세포 집단은 적어도 약 70%, 예를 들어, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97%, 약 98% 이상의 순도의 표적 T 세포(예를 들어, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포)를 가질 수 있다.
용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해서 결정되는 특정 값에 대한 허용 가능한 오차 범위 이내를 의미하며, 이것은 그 값이 측정되거나 결정되는 방법, 즉, 측정 시스템의 한계에 부분적으로 좌우될 것이다. 예를 들어, "약"은 당업계의 실시에 따라서, 허용 가능한 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 ±20%, 바람직하게는 최대 ±10%, 보다 바람직하게는 최대 ±5%, 보다 더 바람직하게는 최대 ±1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 방법과 관련하여, 이 용어는 값의 10배 이내, 바람직하게는 2배 이내를 의미할 수 있다. 특정 값이 출원서 및 청구범위에 기재된 경우, 달리 언급되지 않는 한, 용어 "약"은 암시적이며, 이 맥락에서 특정 값에 대한 허용 가능한 오차 범위 이내를 의미한다.
농축된 T 세포 집단(이는 또한 본 개시의 범주 이내임)은 본원에 개시된 바와 같은 추가의 처리를 위해 바로 사용될 수 있다. 대안적으로, 농축된 T 세포 집단은 장래의 이용을 위하여 적합한 조건 하에, 예를 들어, 동결보존을 통해 보관될 수 있다. 추가의 처리 이전에, 동결보존된 T 세포는 일상적인 절차에 따라 해동될 수 있다. 해동된 세포의 세포 생존력을 평가하여 해동된 세포가 추가의 처리에 적합한지 여부를 결정할 수 있다.
(ii) 농축된 T 세포의 CRISPR-CAS9-매개된 유전자 편집
본원에 개시된 임의의 절차에 의해 제조되는 농축된 T 세포를 유전자 편집으로 처리하여, 예를 들어, CRISPR-Cas9 유전자 편집 기술을 통해 CD70을 낙아웃시킬 수 있다. 제1 전기천공법 단계에서의 CD70 유전자의 낙아웃에 이어서, 제2 전기천공법 단계에서의 TRAC 및 β2M 유전자의 낙아웃은 편집 효율을 유의미하게 증가시켰으며, 유전자 편집 동안 생성되는 전좌의 수를 감소시켰다. 하기 실시예를 참조한다.
CD70 유전자는 종양 괴사 인자 상과의 구성원을 인코딩하며, 이의 발현은 활성화된 T 림프구 및 B 림프구 및 성숙 수지상 세포에 제한된다. CD70은 이의 리간드, CD27과의 상호작용을 통해 종양 세포 및 조절 T 세포 생존에 연루된다. CD70 유전자의 파괴는 유전학적으로 조작된 T 세포의 제조 동안 세포-대-세포 동족살해의 위험을 최소화시키고, 제조되는 유전학적으로 조작된 T 세포의 증가된 건강 및 기능을 가능하게 한다.
CRISPR-Cas9-매개된 유전자 편집 시스템
CRISPR-Cas9 시스템은 유전자 편집에 사용되는 RNA-가이드 DNA-표적화 플랫폼으로 용도가 변경된 원핵생물의 자연 발생적 방어 메커니즘이다. 이는 DNA의 절단을 표적화하기 위해 DNA 뉴클레아제 Cas9, 및 두 개의 비코딩 RNA, crisprRNA(crRNA)와 트랜스-활성화 RNA(tracrRNA)에 의존한다. CRISPR은, 예를 들어 원핵생물을 감염시키거나 공격한 바이러스에 의해 세포에 이전에 노출된 외래 DNA와 유사성을 갖는 DNA의 단편(스페이서 DNA)을 함유하는 박테리아 및 고세균의 게놈에서 발견된 DNA 서열의 패밀리인 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부의 약어이다. 이들 DNA 단편은 후속하는 공격 동안 예를 들어 유사한 바이러스로부터의 재도입 시 유사한 외래 DNA를 검출하고 파괴시키도록 원핵생물에 의해 사용된다. CRISPR 유전자좌의 전사는 외래 외인성 DNA를 인식하고 절단할 수 있는 Cas(CRISPR 연관) 단백질과 회합하고 이를 표적화하는 스페이서 서열을 포함하는 RNA 분자의 형성을 야기한다. CRISPR/Cas 시스템의 많은 유형 및 클래스가 기재되어 있다(예를 들어, 문헌[Koonin et al, (2017) Curr Opin Microbiol 37:67-78] 참조).
crRNA는 전형적으로 표적 DNA에서 20개의 뉴클레오티드(nt) 서열과의 왓슨-클릭(Watson-Crick) 염기 쌍형성을 통해 CRISPR-Cas9 복합체의 서열 인식 및 특이성을 유도한다. crRNA에서의 5' 20 nt의 서열의 변경은 특정 유전자좌로의 CRISPR-Cas9 복합체의 표적화를 허용한다. 표적 서열 뒤에 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)라 칭해지는 특이적인 짧은 DNA 모티프(서열 NGG를 가짐)가 있으면 CRISPR-Cas9 복합체는 crRNA의 처음 20 nt에 일치하는 서열을 함유하는 DNA 서열에만 결합한다.
TracrRNA는 crRNA의 3' 말단과 혼성화되어 RNA-듀플렉스 구조를 형성하고, 이는 Cas9 엔도뉴클레아제에 의해 결합되어, 이후 표적 DNA를 절단할 수 있는 촉매 활성 CRISPR-Cas9 복합체를 형성한다.
CRISPR-Cas9 복합체가 표적 부위에서 DNA에 결합되면, Cas9 효소 내의 두 개의 독립적인 뉴클레아제 도메인은 각각 PAM 부위의 상류에 DNA 가닥의 하나를 절단하여, 이중-가닥 파단(DSB)을 남기고, 여기서 DNA의 가닥 둘 모두는 염기 쌍으로 종료된다(블런트 말단).
특이적 표적 부위에서의 DNA로의 CRISPR-Cas9 복합체의 결합 및 부위-특이적 DSB의 형성 후, 다음의 핵심 단계는 DSB의 수선이다. 세포는 DSB를 수선하기 위한 두 개의 주요 DNA 수선 경로를 이용한다: 비상동성 말단 연결(NHEJ) 및 상동성-지정 수선(HDR).
NHEJ는 비분열 세포를 포함하는 대부분의 세포 유형에서 고도로 활성으로 보이는 강력한 수선 메커니즘이다. NHEJ는 오류 발생이 쉽고, 흔히 DSB의 부위에서 1 개의 뉴클레오티드 내지 수백 개의 뉴클레오티드의 제거 또는 부가를 발생시킬 수 있긴 하지만, 이러한 변형은 전형적으로 20 nt 미만이다. 생성된 삽입 및 결실(인델(indel))은 유전자의 코딩 또는 비코딩 영역을 파괴할 수 있다. 대안적으로, HDR은 고충실도로 DSB를 수선하기 위해 내인성으로 또는 외인성으로 제공된 상동성 공여자 DNA의 긴 스트레치를 이용한다. HDR은 분열 세포에서만 활성이고, 대부분의 세포 유형에서 비교적 낮은 빈도로 생긴다. 본 개시의 많은 실시형태에서, NHEJ는 수선 오페란트(operant)로서 이용된다.
(a) Cas9
일부 실시형태에서, Cas9(CRISPR 연관 단백질 9) 엔도뉴클레아제는 본원에 개시된 바와 같은 유전학적으로 조작된 T 세포를 제조하기 위한 CRISPR 방법에 사용된다. 다른 Cas9 동족체가 또한 사용될 수 있지만, Cas9 효소는 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 것일 수 있다. 야생형 Cas9가 사용될 수 있거나, Cas9의 변형된 버전(예를 들어, Cas9의 진화된 버전, 또는 Cas9 오쏠로그 또는 변이체)이 본원에 제공된 바와 같이 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 일부 실시형태에서, Cas9는 C-말단 및 N-말단 SV40 대형 T 항원 핵 국소화 서열(NLS)을 포함하도록 조작된 스트렙토코커스 피오게네스-유래 Cas9 뉴클레아제 단백질을 포함한다. 생성된 Cas9 뉴클레아제(sNLS-spCas9-sNLS)는, 재조합 이. 콜라이(E. coli) 발효에 의해 생성되고 크로마토그래피에 의해 정제된 162 kDa 단백질이다. spCas9 아미노산 서열은 본원에서 SEQ ID NO: 1로 제공된 UniProt 수탁 번호 Q99ZW2로서 확인될 수 있다.
(b) 가이드 RNA(gRNA)
본원에 기재된 바와 같은 CRISPR-Cas9-매개 유전자 편집은 가이드 RNA 또는 gRNA의 사용을 포함한다. 본원에서 사용되는 "gRNA"는 특정 표적 서열에서 유전자 편집을 위해 CD70 유전자 또는 TRAC 유전자 또는 β2M 유전자 내의 특정 표적 서열로 Cas9를 유도할 수 있는 게놈-표적화 핵산을 지칭한다. 가이드 RNA는 편집을 위한 표적 유전자 내의 표적 핵산 서열에 혼성화하는 적어도 하나의 스페이서 서열, 및 CRISPR 반복 서열을 포함한다.
CD70 유전자를 표적화하는 예시적인 gRNA는 SEQ ID NO: 2에 제공된다. 또한, 본원에 언급된 주제 및 목적에 대하여 관련 개시가 본원에 참조로 포함되는 제WO2019/215500호로서 이제 공개된 2019년 5월 10일자 출원된 국제 출원 제PCT/IB2019/000500호를 참조한다. 다른 gRNA 서열은 염색체 19(GRCh38: 염색체 19: 6,583,183-6,604,103; Ensembl; ENSG00000125726)에 위치한 CD70 유전자 서열을 이용하여 설계될 수 있다.
일부 실시형태에서, CD70 게놈 영역를 표적화하는 gRNA 및 Cas9는 CD70 게놈 영역에서 파단을 생성하여 mRNA 또는 단백질의 발현을 파괴하는 CD70 유전자 내의 인델을 초래한다. 일부 실시형태에서, CD70 게놈 영역을 표적화하는 gRNA는 표 11의 서열로부터 선택되는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CD70 유전자 내에 인델을 생성한다. 일부 실시형태에서, CD70 게놈 영역을 표적화하는 gRNA(SEQ ID NO: 2)는 표 11의 서열로부터 선택되는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 CD70 유전자 내에 인델을 생성한다.
TRAC 유전자를 표적화하는 예시적인 gRNA는 SEQ ID NO: 6에 제공된다. 또한, 본원에 언급된 목적 및 주제에 대하여 관련 개시가 본원에 참조로 포함되는 제WO2019/097305A2호로서 공개된 2018년 5월 11일자 출원된 국제 출원 제PCT/IB2018/001619호를 참조한다. 다른 gRNA 서열은 염색체 14(GRCh38: 염색체 14: 22,547,506-22,552,154;. Ensembl; ENSG00000277734)에 위치한 TRAC 유전자 서열을 이용하여 설계될 수 있다.
일부 실시형태에서, TRAC 게놈 영역를 표적화하는 gRNA 및 Cas9는 TRAC 게놈 영역에서 파단을 생성하여 mRNA 또는 단백질의 발현을 파괴하는 TRAC 유전자 내의 인델을 초래한다. 일부 실시형태에서, TRAC 게놈 영역을 표적화하는 gRNA는 표 9의 서열로부터 선택되는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 TRAC 유전자 내에 인델을 생성한다. 일부 실시형태에서, TRAC 게놈 영역을 표적화하는 gRNA(SEQ ID NO: 6)는 표 9의 서열로부터 선택되는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 TRAC 유전자 내에 인델을 생성한다.
β2M 유전자를 표적화하는 예시적인 gRNA는 SEQ ID NO: 10에 제공된다. 또한, 본원에 언급된 목적 및 주제에 대하여 관련 개시가 본원에 참조로 포함되는 제WO2019/097305A2호로서 공개된 2018년 5월 11일자 출원된 국제 출원 제PCT/IB2018/001619호를 참조한다. 다른 gRNA 서열은 염색체 15(GRCh38 좌표: 염색체 15: 44,711,477-44,718,877 ; Ensembl: ENSG00000166710)에 위치한 β2M 유전자 서열을 이용하여 설계될 수 있다.
일부 실시형태에서, β2M 게놈 영역를 표적화하는 gRNA 및 RNA-가이드 뉴클레아제는 β2M 게놈 영역에서 파단을 생성하여 mRNA 또는 단백질의 발현을 파괴하는 β2M 유전자 내의 인델을 초래한다. 일부 실시형태에서, β2M 게놈 영역을 표적화하는 gRNA는 표 10의 서열로부터 선택되는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 β2M 유전자 내에 인델을 생성한다. 일부 실시형태에서, β2M 게놈 영역을 표적화하는 gRNA(SEQ ID NO: 10)는 표 10의 서열로부터 선택되는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 β2M 유전자 내에 인델을 생성한다.
II형 시스템에서, gRNA는 또한 tracrRNA 서열로 불리는 제2 RNA를 포함한다. II형 gRNA에서, CRISPR 반복 서열 및 tracrRNA 서열은 서로 혼성화되어 듀플렉스를 형성한다. V형 gRNA에서, crRNA는 듀플렉스를 형성한다. 두 시스템 모두에서, 듀플렉스는 부위-지정 폴리펩티드에 결합하고, 그에 따라 가이드 RNA와 부위-지정 폴리펩티드는 복합체를 형성한다. 일부 실시형태에서, 게놈-표적화 핵산은 부위-지정 폴리펩티드와 이의 회합으로 인해 복합체에 표적 특이성을 제공한다. 따라서 게놈-표적화 핵산은 부위-지정 폴리펩티드의 활성을 유도한다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 각각의 가이드 RNA는 이의 게놈 표적 서열에 상보적인 스페이서 서열을 포함하도록 설계된다. 문헌[Jinek et al, Science, 337, 816-821 (2012)] 및 문헌[Deltcheva et al, Nature, 471, 602-607 (2011)]을 참조한다.
일부 실시형태에서, 게놈-표적화 핵산(예를 들어, gRNA)은 이중-분자 가이드 RNA이다. 일부 실시형태에서, 게놈-표적화 핵산(예를 들어, gRNA)은 단일-분자 가이드 RNA이다.
이중-분자 가이드 RNA는 두 가닥의 RNA 분자를 포함한다. 제1 가닥은, 5'에서 3' 방향으로, 선택적인 스페이서 연장 서열, 스페이서 서열 및 최소 CRISPR 반복 서열을 포함한다. 제2 가닥은 최소 tracrRNA 서열(최소 CRISPR 반복 서열에 상보적인), 3' tracrRNA 서열 및 선택적인 tracrRNA 연장 서열을 포함한다.
II형 시스템에서 단일-분자 가이드 RNA("sgRNA"로 지칭됨)는, 5'에서 3'방향으로, 선택적 스페이서 연장 서열, 스페이서 서열, 최소 CRISPR 반복 서열, 단일-분자 가이드 링커, 최소 tracrRNA 서열, 3' tracrRNA 서열 및 선택적 tracrRNA 연장 서열을 포함한다. 선택적 tracrRNA 연장은 가이드 RNA에 추가 기능(예를 들어, 안정성)을 제공하는 요소를 포함할 수 있다. 단일-분자 가이드 링커는 최소 CRISPR 반복부와 최소 tracrRNA 서열을 연결하여 헤어핀 구조를 형성한다. 선택적 tracrRNA 연장부는 하나 이상의 헤어핀을 포함한다. V형 시스템에서 단일-분자 가이드 RNA는, 5'에서 3' 방향으로, 최소 CRISPR 반복 서열 및 스페이서 서열을 포함한다.
"표적 서열"은 PAM 서열에 인접한 표적 유전자에 있으며, Cas9에 의해 변형될 서열이다. "표적 서열"은 PAM-가닥 및 상보적 비-PAM 가닥을 함유하는 이중-가닥 분자인 "표적 핵산"에서 소위 PAM-가닥에 있다. 당업자는 gRNA 스페이서 서열이 관심 표적 핵산의 비-PAM 가닥에 위치한 상보적 서열에 혼성화된다는 것을 인식한다. 따라서, gRNA 스페이서 서열은 표적 서열의 RNA 등가물이다.
예를 들어, CD70 표적 서열이 5'-GCTTTGGTCCCATTGGTCGC-3'(SEQ ID NO: 15)인 경우, gRNA 스페이서 서열은 5'- GCUUUGGUCCCAUUGGUCGC-3'(SEQ ID NO: 5)이다. 또 다른 예에서, TRAC 표적 서열이 5'-AGAGCAACAGTGCTGTGGCC-3'(SEQ ID NO: 17)인 경우, gRNA 스페이서 서열은 5'- AGAGCAACAGUGCUGUGGCC-3'(SEQ ID NO: 9)이다. 또 다른 예에서, β2M 표적 서열이 5'- GCTACTCTCTCTTTCTGGCC-3'(SEQ ID NO: 19)인 경우, gRNA 스페이서 서열은 5'- GCUACUCUCUCUUUCUGGCC-3'(SEQ ID NO: 13)이다. gRNA의 스페이서는 혼성화(즉, 염기 쌍형성)를 통해 서열-특이적 방식으로 관심 표적 핵산과 상호작용한다. 따라서, 스페이서의 뉴클레오티드 서열은 관심 표적 핵산의 표적 서열에 따라 달라진다.
본원의 CRISPR/Cas 시스템에서, 스페이서 서열은 시스템에 사용된 Cas9 효소에 의해 인식 가능한 PAM의 5'에 위치한 표적 핵산의 영역에 혼성화하도록 설계된다. 스페이서는 표적 서열과 완벽하게 일치하거나 불일치를 가질 수 있다. 각각의 Cas9 효소는 이것이 표적 DNA에서 인식하는 특정 PAM 서열을 갖는다. 예를 들어, 에스. 피오게네스는 표적 핵산에서, 서열 5'-NRG-3'을 포함하는 PAM을 인식하며, 여기서 R은 A 또는 G를 포함하고, N은 임의의 뉴클레오티드이고, N은 스페이서 서열에 의해 표적화된 표적 핵산 서열의 바로 3' 바로 옆에 있다.
일부 실시형태에서, 표적 핵산 서열은 20개 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산은 20개 미만의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산은 20개 초과의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산은 적어도 5개, 10개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 30개 이상의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산은 최대 5개, 10개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 30개 이상의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산 서열은 PAM의 첫 번째 뉴클레오티드의 5' 바로 옆에 20개의 염기를 갖는다. 예를 들어, 5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNRG-3'을 포함하는 서열에서, 표적 핵산은 N에 대응하는 서열일 수 있으며, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있고, 밑줄 표시된 NRG 서열은 에스. 피오게네스 PAM이다.
gRNA 내의 스페이서 서열은 관심 표적 유전자의 표적 서열(예를 들어, DNA 표적 서열, 예컨대 게놈 표적 서열)을 정의하는 서열(예를 들어, 20개 뉴클레오티드 서열)이다. CD70 유전자를 표적화하는 gRNA의 예시적인 스페이서 서열은 SEQ ID NO: 4에 제공된다. TRAC 유전자를 표적화하는 gRNA의 예시적인 스페이서 서열은 SEQ ID NO: 8에 제공된다. β2M 유전자를 표적화하는 gRNA의 예시적인 스페이서 서열은 SEQ ID NO: 12에 제공된다.
본원에 개시된 가이드 RNA는 crRNA 내의 스페이서 서열을 통해 임의의 관심 서열을 표적화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자 내의 표적 서열과 가이드 RNA의 스페이서 서열 사이에 상보성 정도는 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자 내의 표적 서열과 가이드 RNA의 스페이서 서열은 100% 상보성이다. 다른 실시형태에서, 표적 유전자 내의 표적 서열과 가이드 RNA의 스페이서 서열은 최대 10개의 불일치, 예를 들어, 최대 9개, 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개, 최대 3개, 최대 2개, 또는 최대 1개의 불일치를 함유할 수 있다.
본원에 제공된 바와 같이 사용될 수 있는 gRNA의 비-제한적 예는 제WO2019/097305A2호로 공개된 2018년 5월 11일자 출원된 제PCT/IB2018/001619호, 및 제WO2019/215500호로 이제 공개된 2019년 5월 10일자 출원된 제PCT/IB2019/000500호에 제공된다. 각각의 종래 출원의 관련 개시는 본원에 언급된 목적 및 주제에 대하여 본원에 참조로 포함된다. 본원에 제공된 임의의 gRNA 서열에 대하여, 명시적으로 변형을 나타내지 않는 것들은 비변형 서열과 임의의 적합한 변형을 갖는 서열 둘 모두를 포괄하는 것을 의미한다.
본원에 개시된 임의의 gRNA에서 스페이서 서열의 길이는, 또한 본원에 개시된 임의의 표적 유전자를 편집하는 데 사용되는 CRISPR/Cas9 시스템 및 구성성분에 좌우될 수 있다. 예를 들어, 상이한 박테리아 종으로부터의 상이한 Cas9 단백질은 다양한 최적의 스페이서 서열 길이를 갖는다. 따라서, 스페이서 서열은 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 또는 50개 초과의 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 스페이서 서열은 18개 내지 24개 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적화 서열은 19개 내지 21개 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 스페이서 서열은 20개 뉴클레오티드 길이를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, gRNA는 sgRNA 서열의 5' 말단에 20개 뉴클레오티드 스페이서 서열을 포함할 수 있는 sgRNA일 수 있다. 일부 실시형태에서, sgRNA는 sgRNA 서열의 5' 말단에 20개 미만의 뉴클레오티드 스페이서 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, sgRNA는 sgRNA 서열의 5' 말단에 20개 초과의 뉴클레오티드 스페이서 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, sgRNA는 sgRNA 서열의 5' 말단에 17개 내지 30개의 뉴클레오티드를 갖는 다양한 길이의 스페이서 서열을 포함한다. 예는 실시예 5에서 표 8에 제공된다.
일부 실시형태에서, sgRNA는 sgRNA 서열의 3' 말단에 우라실을 포함하지 않는다. 다른 실시형태에서, sgRNA는 sgRNA 서열의 3' 말단에 하나 이상의 우라실을 포함할 수 있다. 예를 들어, sgRNA는 sgRNA 서열의 3' 말단에 1개 내지 8개의 우라실 잔기, 예를 들어, sgRNA 서열의 3' 말단에 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 또는 8개의 우라실 잔기를 포함할 수 있다.
임의의 sgRNA를 포함하는 본원에 개시된 임의의 gRNA는 변형되지 않을 수 있다. 대안적으로, 이는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드 및/또는 변형된 백본을 함유할 수 있다. 예를 들어, sgRNA와 같은 변형된 gRNA는, 5' 말단, 3' 말단, 또는 이 둘 모두에 위치할 수 있는 하나 이상의 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 1개 초과의 가이드 RNA는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템과 함께 사용될 수 있다. 각각의 가이드 RNA는 CRISPR/Cas 시스템이 하나보다 많은 표적 핵산을 절단하도록 상이한 표적화 서열을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 가이드 RNA는 Cas9 RNP 복합체 내에서 동일하거나 상이한 성질, 예컨대 활성 또는 안정성을 가질 수 있다. 하나보다 많은 가이드 RNA가 사용되는 경우, 각각의 가이드 RNA는 동일하거나 상이한 벡터에서 인코딩될 수 있다. 하나보다 많은 가이드 RNA의 발현을 구동하는 데 사용되는 프로모터는 동일하거나 상이하다.
1개 초과의 적합한 Cas9 및 1개 초과의 적합한 gRNA가 본원에 기재된 방법, 예를 들어, 당업계에 공지되거나 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 일부 실시형태에서, 방법은 당업계에 공지된 Cas9 효소 및/또는 gRNA를 포함한다. 예는 예를 들어, 제WO 2019/097305A2호로 공개된 2018년 5월 11일자 출원된 제PCT/IB2018/001619호 및 제WO2019/215500호로 이제 공개된 2019년 5월 10일자 출원된 제PCT/IB2019/000500호에서 찾을 수 있으며, 각각의 종래 출원의 관련 개시는 본원에 언급된 목적 및 주제에 대하여 본원에 참조로 포함된다.
CD70, TRAC 및 β2M 유전자의 유전자 편집
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 농축된 T 세포는 종래의 조건에 의해 제공되는 것들에 비하여 더 높고 더욱 일관적인 유전자 편집 효율 및 더 낮은 전좌율을 초래할 본원에 개시된 조건 하에서 CRISPR-Cas9-매개된 유전자 편집을 통해 CD70 유전자, TRAC 유전자 및 β2M 유전자의 유전자 편집을 겪을 수 있다.
구체적인 예에서, CD70 유전자를 표적화하는 RNP 복합체는 약 0.15 ㎎/㎖ Cas9(예를 들어, SEQ ID NO:1의 Cas9) 및 약 0.16 ㎎/㎖의 CD70 유전자를 표적화하는 gRNA(예를 들어, CD70-7의 gRNA)를 포함할 수 있다. RNP는 유전자 편집에 유용한데, 그 이유는 적어도 이들이 핵산-풍부 세포 환경에서 번잡한 상호작용의 위험을 최소화하고, RNA를 분해로부터 보호하기 때문이다. RNP의 형성 방법은 당업계에 공지되어 있다.
본원에 개시된 CD70을 표적화하는 RNP는 RNP를 적합한 양의 농축된 T 세포와 혼합함으로써 농축된 T 세포 내로 도입될 수 있으며, 이에 따라 형성되는 혼합물을 적합한 조건 하에서 전기천공법으로 처리하여, 세포 내로의 RNP의 전달을 가능하게 한다. 일부 예에서, 농축된 T 세포의 적합한 양은 약 100x106개 세포/㎖ 내지 약 400x106개 세포/㎖의 범위일 수 있다. 예를 들어, 제1 전기천공법 단계를 위한 T 세포의 적합한 양은 약 200x106개 세포/㎖ 내지 약 350x106개 세포/㎖의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, 농축된 T 세포의 농도는 약 100x106개 세포/㎖일 수 있다. 일부 실시형태에서, 농축된 T 세포의 농도는 약 200x106개 세포/㎖일 수 있다. 일부 실시형태에서, 농축된 T 세포의 농도는 약 300x106개 세포/㎖ 또는 약 350x106개 세포/㎖일 수 있다.
전기천공법 후에, 파괴된 CD70 유전자를 갖는 T 세포는 신선한 배지에서 회복에 적합한 기간 동안 배양될 수 있다. 유전자 편집 효율은 일상적인 실시에 따라 수행할 수 있다. 이에 따라 생성된 유전학적으로 편집된 T 세포는 하류 유전자 편집 효율을 개선시키기 위한 T 세포 활성화 단계 및 T 세포 증량 단계로 처리될 수 있다.
TRAC 유전자는 TCR 복합체의 구성성분을 인코딩한다. TRAC 유전자의 파괴는 TCR의 기능의 소실을 야기하며, 조작된 T 세포가 비-동종반응성이 되게 하고, 동종이계 이식에 적합하여, 이식편대숙주병의 위험을 최소화시킨다. β2M 유전자는 주요 조직적합성 복합체(MHC) I 복합체의 공통(불변) 구성성분을 인코딩한다. β2M 유전자의 파괴에 의해, 숙주 대 치료적 동종이계 T 세포 반응을 방지할 수 있다. TRAC 유전자 및 β2M 유전자 둘 모두의 낙 아웃은 세포 요법에 사용하기 위한 동종이계 T 세포의 생성을 초래할 것이다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 제조 방법은 T 세포에서 표적 유전자(CD70, TRAC 및 β2M)를 순차적으로 편집하고, 발현을 위하여 CAR-코딩 핵산을 T 세포 내로 도입하기 위한 다수의 유전자 편집 단계를 포함할 수 있다. 각각의 유전자 편집 단계는 표적 유전자(CD70, TRAC 및 β2M)의 유전학적 편집, 및 T 세포에서의 CAR 발현을 위하여 가이드 RNA, Cas9 효소(들) 및/또는 CAR-코딩 핵산을 T 세포 내로 도입하기 위한 전기천공법 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, CD70은 제1 전기천공법 이벤트에서 편집되며, β2M/TRAC는 제2 전기천공법 이벤트에서 편집된다. 예를 들어, 도 3a를 참조한다. 그러나, 본원에 기재된 방법이 상기 단계의 순서에 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 도 2a 및 도 2b에 제공된 데이터에 의해, 제1 전기천공법에서 전달되는 CD70 및 β2M에 대한 가이드 둘 모두가 유리하게 더 낮은 전좌율을 야기하였음이 뒷받침된다. 따라서, 다른 실시형태에서, 둘 모두의 CD70 및 β2M은 제1 전기천공법 이벤트에서 표적화될 수 있다.
일부 예에서, CD70 유전자를 표적화하는 하나 이상의 가이드 RNA 및 Cas9 효소를 T 세포 내로 도입하여, 제1 전기천공법 단계에서 CD70 유전자를 파괴할 수 있으며, TRAC 및 β2M 유전자를 표적화하는 하나 이상의 가이드 RNA, Cas9 효소 및 CAR-코딩 핵산을 제1 전기천공법 단계 후에 제2 전기천공법 단계에서 T 세포 내로 도입하여, TRAC 및 β2M 유전자를 파괴하고, CAR-코딩 핵산을 T 세포 내로 도입할 수 있다. 일부 예에서, T 세포는 제1 전기천공법 단계 이후 및 제2 전기천공법 단계 이전에 하나 이상의 T 세포 활성화제, 예를 들어, 본원에 기재된 것들을 사용하여 활성화로 처리될 수 있다. 하기 실시예 3에 나타낸 바와 같이, 이 설계는 제1 전기천공법 단계로부터 초래되는 파괴된 CD70 유전자를 갖는 높은 수준의 T 세포를 유지하면서, 제2 전기천공법 단계에서 적어도 β2M 유전자의 효율적인 유전학적 편집을 가능하게 한다.
제1 유전자 편집 단계에서, 제1 Cas9 효소 및 CD70 유전자를 표적화하는 제1 gRNA를 포함하는 제1 RNP 복합체를 농축된 T 세포 내로 도입하여, 파괴된 CD70 유전자를 갖는 T 세포를 생성한다. 이러한 T 세포를 제2 유전자 편집 단계를 수행하기 전에 활성화시켜, 제1 유전자 편집 단계로부터 초래되는 세포 손실을 약화시킬 수 있다.
제2 유전자 편집 단계에서, 제2 Cas9 효소 및 TRAC 유전자를 표적화하는 제2 gRNA를 포함하는 제2 RNP 복합체, 및 제3 Cas9 효소 및 β2M 유전자를 표적화하는 제3 gRNA를 포함하는 제3 RNP 복합체를 T 세포 내로 도입하여, 파괴된 CD70, TRAC, β2M 유전자를 갖는 T 세포를 생성한다. Cas9 효소 및 TRAC 유전자 및 β2M 유전자를 표적화하는 gRNA는 하나 이상의 리보핵단백질(RNP) 복합체를 형성할 수 있으며, 이를 본원에 개시된 바와 같은 파괴된 CD70 유전자를 갖는 활성화된 T 세포 내로 전달할 수 있다.
일부 실시형태에서, 선택적으로 활성화될 수 있는 파괴된 CD70 유전자를 갖는 T 세포 내로 도입된 제2 RNP 복합체 및 제3 RNP 복합체는 동일한 양의 Cas9 효소를 함유할 수 있다. 예를 들어, 제2 RNP 복합체 및 제3 RNP 복합체 둘 모두는 약 0.1 내지 0.3 ㎎/㎖(예를 들어, 약 0.1 내지 0.2 ㎎/㎖)의 Cas9 효소(예를 들어, SEQ ID NO:1의 Cas9 효소)를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 제2 RNP 복합체 및 제3 RNP 복합체의 각각은 SEQ ID NO:1의 Cas9 효소일 수 있는, 약 0.15 ㎎/㎖의 Cas9 효소를 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 제2 RNP 복합체 및 제3 RNP 복합체는 상이한 양의 Cas9 효소를 함유할 수 있다. 일부 예에서, TRAC 유전자를 표적화하는 제2 RNP 복합체는 β2M 유전자를 표적화하는 제3 RNP 복합체에 비하여 더 많은 양의 Cas9 효소를 포함할 수 있다. 대안적으로, β2M 유전자를 표적화하는 제2 RNP 복합체는 TRAC 유전자를 표적화하는 제3 RNP 복합체에 비하여 더 많은 양의 Cas9 효소를 포함할 수 있다.
제2 RNP 복합체 및 제3 RNP 복합체는 동일한 양의 gRNA(하나는 TRAC를 표적화하고, 다른 하나는 β2M을 표적화함)를 포함할 수 있다. 대안적으로, 제2 RNP 복합체 및 제3 RNP 복합체는 상이한 양의 gRNA를 포함할 수 있다. 예를 들어, TRAC 유전자를 표적화하는 gRNA의 양은 약 0.035 ㎎/㎖ 내지 약 0.8 ㎎/㎖, 예를 들어, 약 50 ㎍/㎖ 내지 약 80 ㎍/㎖의 범위일 수 있다. 구체적인 예에서, TRAC 유전자를 표적화하는 gRNA의 양은 약 0.08 ㎎/㎖이다. 대안적으로 또는 추가적으로, β2M 유전자를 표적화하는 gRNA의 양은 약 0.075 ㎎/㎖ 내지 약 0.3 ㎎/㎖, 예를 들어, 약 0.1 ㎎/㎖ 내지 약 0.3 ㎎/㎖의 범위일 수 있다. 구체적인 예에서, β2M 유전자를 표적화하는 gRNA의 양은 약 0.2 ㎎/㎖이다.
구체적인 예에서, TRAC 유전자를 표적화하는 RNP 복합체는 약 0.15 ㎎/㎖의 Cas9(예를 들어, SEQ ID NO:1의 Cas9) 및 약 0.08 ㎎/㎖의 TRAC 유전자를 표적화하는 gRNA(예를 들어, TA-1의 gRNA)를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, β2M 유전자를 표적화하는 RNP 복합체는 약 0.15 ㎎/㎖의 Cas9(예를 들어, SEQ ID NO:1의 Cas9) 및 약 0.2 ㎎/㎖의 β2M 유전자를 표적화하는 gRNA(예를 들어, β2M-1의 gRNA)를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 제2 RNP 복합체 및 제3 RNP 복합체가 전기천공법을 통해 순차적으로, 즉, 2개의 전기천공법 이벤트를 통해 활성화된 T 세포 내로 도입될 수 있다. 대안적으로, 제2 RNP 복합체 및 제3 RNP 복합체는 활성화된 T 세포 내로 동시에, 즉 1개의 전기천공법 이벤트를 통해 도입될 수 있다. 이 경우에, 제2 RNP 복합체 및 제3 RNP 복합체를 조합하여, 전기천공법 이벤트 이전에 혼합물을 형성할 수 있다.
본원에 개시된 임의의 RNP는 RNP(들)를 적합한 양의 활성화된 T 세포와 혼합함으로써 활성화된 T 세포 내로 도입될 수 있으며, 이에 따라 형성된 혼합물은 세포 내로의 RNP의 전달을 허용하기에 적합한 조건 하에서 전기천공법으로 처리된다. 일부 예에서, 활성화된 T 세포의 적합한 양은 약 100x106개 세포/㎖ 내지 약 300x106개 세포/㎖의 범위일 수 있다. 예를 들어, 전기천공법 단계를 위한 T 세포의 적합한 양은 약 200x106개 세포/㎖ 내지 약 300x106개 세포/㎖의 범위일 수 있다. 일부 예에서, 활성화된 T 세포의 농도는 약 100x106개 세포/㎖일 수 있다. 일부 실시형태에서, 활성화된 T 세포의 농도는 약 200x106개 세포/㎖일 수 있다. 일부 실시형태에서, 활성화된 T 세포의 농도는 약 300x106개 세포/㎖일 수 있다.
일부 실시형태에서, 활성화된 T 세포의 적합한 양은 약 1x108개 내지 약 1x1010개의 세포, 예를 들어, 약 5x108개 내지 약 8x109개의 세포, 약 1x109개 내지 약 5x109개의 세포 또는 약 1x109개 내지 약 3x109개의 세포의 범위일 수 있다.
전기천공법에 사용하기 위한 T 세포는 사용되는 전기천공법 기기에 따라, 다중 셀 카세트(multiple cell cassette) 내에 배치될 수 있다. 적합한 전기천공법 기기는 당업자에게 공지되어 있으며, Lonza Nucleofector, Maxcyte GT 및 MaxCyte GTx를 포함하는 정적 및 유동 전기천공기를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 다중 셀 카세트가 전기천공법 방법에서 사용될 수 있다. 더욱 상세한 사항은 하기 실시예 6에 제공된다.
구체적인 예에서, 총 약 0.3 ㎎/㎖의 Cas9 효소(예를 들어, SEQ ID NO:1의 Cas9 효소), 약 0.08 ㎎/㎖의 TA-1의 gRNA 및 약 0.2 ㎎/㎖의 β2M-1의 gRNA를 포함하는 상기 개시된 제2 RNP 복합체 및 제3 RNP 복합체를 약 100x106개 세포/㎖ 내지 약 400x106개 세포/㎖(예를 들어, 약 300x106개 세포/㎖)의 양으로 활성화된 T 세포와 혼합할 수 있다. 이어서, 혼합물을 T 세포 내로의 RNP의 전달을 위하여 전기천공법으로 처리한다.
일부 예에서, 제1 Cas9 효소, 제2 Cas9 효소 및 제3 Cas9 효소는 동일하며, 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 유래의 Cas9(spCas9) 또는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는 Cas9 효소이다.
전기천공법 후에, 세포를 신선한 배지에서 회복에 적합한 기간 동안 배양할 수 있다. 유전자 편집 효율을 일상적인 실시에 따라 결정할 수 있다. 이에 따라 생성된 유전학적으로 편집된 T 세포는 CAR 발현을 위해 구성된 핵산의 전달을 위하여 바이러스 벡터 형질도입으로 처리될 수 있다.
(iii) T 세포 활성화
본원에 개시된 임의의 T 세포, 예를 들어, 제1 전기천공법 단계로부터 초래되는 파괴된 CD70 유전자를 갖는 T 세포를 활성화 단계로 처리하여, T 세포 증식 및 T 세포 증량을 가능하게 할 수 있다. 본원에 개시된 T 세포 활성화 조건은 높은 T 세포 활성화 효율, 높은 %CAR+ 발현을 제공하고, CD70 유전자의 편집으로부터 초래되는 세포 손실을 약화시킨다. 추가로, 본원에 개시된 T 세포 활성화 조건은 종래의 조건에 비하여 더 높은 유전자 편집 효율과 편집 이후 더 큰 T 세포 증량 속도를 제공하였다. 하기 실시예를 참조한다.
일부 실시형태에서, T 세포 활성화는 T 세포 활성화제, 예를 들어, CD3/TCR-매개된 신호전달 경로 및/또는 동시-자극 분자(예를 들어, CD28) 매개된 신호전달 경로를 자극하는 작용제를 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, T 세포 활성화제는 CD3 효능제(예를 들어, 효능작용 항-CD3 항체)일 수 있으며, CD3/TCR-매개된 세포 신호전달 경로를 활성화시킨다. 대안적으로 또는 추가적으로, T 세포 활성화제는 CD28 효능제(예를 들어, 항-CD28 항체)일 수 있으며, CD28에 의해 매개되는 동시-자극 신호전달 경로를 활성화시킨다. 본원에 개시된 방법에 이용하기 위한 임의의 T 세포 활성화제는 지지 부재, 예컨대 나노매트릭스 입자에 컨쥬게이트될 수 있다. 이러한 상황에서, T 세포 활성화제는 동일한 지지 부재에 컨쥬게이트될 수 있다. 대안적으로, 각각의 T 세포 활성화제는 상이한 지지 부재에 컨쥬게이트될 수 있다. 구체적인 예에서, 본원에 개시된 방법에 사용하기 위한 T 세포 활성화제는 나노매트릭스 입자에 컨쥬게이트될 수 있는 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, T 세포 활성화제는 나노매트릭스 입자에 부착된 CD3 효능제 및 CD28 효능제를 포함한다. 일부 실시형태에서, CD3 효능제 및 CD28 효능제는 동일한 나노매트릭스 입자에 부착된다. 일부 실시형태에서, CD3 효능제 및 CD28 효능제는 상이한 나노매트릭스 입자에 부착된다.
T 세포 활성화를 달성하기 위하여, 본원에 개시된 바와 같은 파괴된 CD70 유전자를 갖는 T 세포를 세포 배양 용기에서 적합한 세포 씨딩 밀도 및 적합한 세포 농도로 배치하고, T 세포 활성화를 유도하기에 적합한 기간 동안 본원에 개시된 임의의 T 세포 활성화제의 존재 하에 인큐베이션시킬 수 있다.
일부 예에서, 세포 배양 용기 내의 T 세포 활성화제 대 세포 배양 배지의 비는 약 1:10(v/v) 내지 약 1:15(v/v)의 범위일 수 있다. 일부 예에서, 세포 배양 용기 내의 T 세포 활성화제 대 세포 배양 배지의 비는 약 1:10(v/v), 약 1:10.5(v/v), 약 1:11(v/v), 약 1:11.5(v/v), 약 1:12(v/v), 약 1:12.5(v/v), 약 1:13(v/v), 약 1:13.5(v/v), 약 1:14(v/v), 약 1:14.5(v/v) 또는 약 1:15(v/v)일 수 있다. 구체적인 예에서, 세포 배양 용기 내의 T 세포 활성화제 대 배양 배지의 비는 약 1:12.5(v/v)이다.
대안적으로 또는 추가적으로, 적합한 세포 씨딩 밀도는 약 1.0 x 106개 내지 2.5 x 106개(예를 들어, 2x106개/㎠)일 수 있으며, 적합한 세포 농도는 약 1.0 x 106개 내지 2.5 x 106개(예를 들어, 2x106개/㎖)일 수 있다. 파괴된 CD70 유전자를 갖는 T 세포를 약 60 내지 80시간, 예를 들어, 약 66시간 또는 약 72시간 동안 T 세포 활성화제와 함께 인큐베이션시킬 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 적합한 세포 씨딩 밀도는 약 1.5 x 106개 내지 2.5 x 106개(예를 들어, 2x106개/㎠)일 수 있으며, 적합한 세포 농도는 약 1.5 x 106개 내지 2.5 x 106개(예를 들어, 2x106개/㎖)일 수 있다. 파괴된 CD70 유전자를 갖는 T 세포를 약 66 내지 80시간, 예를 들어, 약 72시간 동안 T 세포 활성화제와 함께 인큐베이션시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포 배양 용기는 정적 배양 용기일 수 있으며, 이는 본원에 개시된 바와 같은 유전학적으로 조작된 T 세포의 상대적으로 대규모의 생성을 가능하게 할 것이다. 종래의 세포 배양 플라스크에 비하여, 정적 세포 배양 용기는 혼합 또는 진탕 없이 T 세포에 산소 및 영양소를 공급하는 배지에 침지된 고 기체 투과성 막 상에 T 세포가 잔존하게 한다. 정적 배양 용기는 배지 교체 없이 T 세포 제조를 가능하게 한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 임의의 방법에서 T 세포 활성화 방법은 배지 교체를 포함하지 않을 수 있다.
필요한 경우, 활성화제를 하류 유전자 편집 이벤트 이전에 세포 배양 용기로부터 제거하거나, 희석하여, 유전자 편집 동안 활성화제가 부여할 수 있는 임의의 가능한 영향을 최소화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 활성화제는 일상적인 방법, 예를 들어, 원심분리를 사용하여 세포 배양 용기로부터 제거될 수 있다. 대안적으로, 활성화제는 유전자 편집 이전에 세포 배양 용기에서 희석될 수 있으며, 예를 들어, 세포 배양 용기로의 배지의 첨가에 의해 희석될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 임의의 T 세포 활성화 방법으로부터 유래되는 파괴된 CD70 유전자를 갖는 활성화된 T 세포를 하룻밤 배양하여(예를 들어, 약 16시간), T 세포가 유전자 편집 이전에 회복되게 할 수 있다. 일부 예에서, 파괴된 CD70 유전자를 갖는 활성화된 T 세포의 배양물은 T 세포 활성화제를 여전히 함유할 수 있다. 다른 예에서, 파괴된 CD70 유전자를 갖는 활성화된 T 세포의 배양물은 T 세포 활성화제를 거의 갖지 않거나, 이의 존재가 전혀 없을 수 있다.
(iv) T 세포 형질도입
CD70, TRAC 및/또는 β2M 유전자가 낙 아웃된 유전학적으로 편집된 T 세포를 바이러스 벡터, 예컨대 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터로의 형질도입으로 처리하여, CAR을 발현하는 T 세포의 집단을 생성할 수 있다.
키메라 항원 수용체(CAR)
키메라 항원 수용체(CAR)는 원하지 않는 세포, 예를 들어, 암 세포와 같은 이환된 세포에 의해 발현되는 항원을 인식하고 이에 결합하도록 조작된 인공 면역 세포 수용체를 지칭한다. CAR 폴리펩티드를 발현하는 T 세포는 CAR T 세포로 지칭된다. CAR은 T-세포 특이성 및 반응성을 비-MHC-제한된 방식으로 선택된 표적에 대하여 재유도하는 능력을 갖는다. 비-MHC-제한된 항원 인식은 항원 가공과 관계없이 항원을 인식하여, 그에 의해 주요 종양 회피 메커니즘을 우회하는 능력을 CAR-T 세포에 제공한다. 더욱이, T-세포에서 발현되는 경우, CAR은 유리하게는 내인성 T-세포 수용체(TCR) 알파 및 베타 사슬과 이량체화하지 않는다.
다양한 세대의 CAR이 존재하며, 이의 각각은 상이한 성분을 함유한다. 제1 세대 CAR은 항체-유래 scFv를 힌지 및 막횡단 도메인을 통하여 T-세포 수용체의 CD3제타(ζ 또는 z) 세포내 신호전달 도메인에 연결시킨다. 제2 세대 CAR은 동시자극 신호를 제공하기 위해 추가의 동시-자극 도메인, 예를 들어, CD28, 4-1BB(41BB) 또는 ICOS를 혼입한다. 제3-세대 CAR은 TCR CD3ζ 쇄와 융합된 2개의 동시자극 도메인(예를 들어, CD27, CD28, 4-1BB, ICOS, 또는 OX40의 조합)을 함유한다(문헌[Maude et al, Blood. 2015; 125(26):4017-4023]; 문헌[Kakarla and Gottschalk, Cancer J. 2014; 20(2):151-155]). 임의의 다양한 세대의 CAR 구축물이 본 개시의 범위 내에 있다.
일반적으로, CAR은 표적 항원을 인식하는 세포외 도메인(예를 들어, 항체의 단일-쇄 가변 단편(scFv) 또는 다른 항체 단편) 및 T-세포 수용체(TCR) 복합체(예를 들어, CD3ζ)의 신호전달 도메인 및 대부분의 경우에 동시-자극 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드이다(문헌[Enblad et al, Human Gene Therapy. 2015; 26(8):498-505]). CAR 구축물은 세포외 도메인과 세포내 도메인 사이에 힌지 및 막횡단 도메인, 뿐만 아니라 표면 발현을 위한 N-말단에서의 신호 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 신호 펩티드의 예는 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP(SEQ ID NO: 52) 및 MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO: 53)를 포함한다. 다른 신호 펩티드가 사용될 수 있다.
(a) 항원 결합 세포외 도메인
항원-결합 세포외 도메인은 CAR이 세포 표면에서 발현될 때 세포외액에 노출되는 CAR 폴리펩티드의 영역이다. 일부 예에서, 신호 펩티드는 세포 표면 발현을 용이하게 하기 위해 N-말단에 위치할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 단일-쇄 가변 단편(scFv, 항체 중쇄 가변 영역(VH) 및 항체 경쇄 가변 영역(VL)(어느 한 배향)을 포함할 수 있음)일 수 있다. 일부 예에서, VH 및 VL 단편은 펩티드 링커를 통해 연결될 수 있다. 링커는, 일부 실시형태에서, 유연성을 위한 글리신 및 세린의 스트레치뿐만 아니라, 부가되는 가용성을 위한 글루탐산염 및 리신의 스트레치를 갖는 친수성 잔기를 포함한다. scFv 단편은 scFv 단편이 유래된 부모 항체의 항원-결합 특이성을 보유한다. 일부 실시형태에서, scFv는 인간화된 VH 및/또는 VL 도메인을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, scFv의 VH 및/또는 VL 도메인은 완전 인간이다.
항원-결합 세포외 도메인은 관심 표적 항원, 예를 들어, 병리학적 항원, 예컨대 종양 항원에 특이적일 수 있다. 일부 실시형태에서, 종양 항원은 일반적으로 비종양 세포에서보다 종양 세포에서 더 높은 수준으로 발현되는 면역원성 분자, 예컨대 단백질을 언급하는 "종양 연관 항원"이고, 비종양 세포에서 이것은 전혀 발현되지 않거나, 낮은 수준으로만 발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, 종양 보유 숙주의 면역계에 의해 인식되는 종양 연관 구조는 종양 연관 항원으로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 종양 연관 항원은 이것이 대부분의 유형의 종양에 의해 광범위하게 발현되는 경우, 공통 종양 항원이다. 일부 실시형태에서, 종양 연관 항원은 분화 항원, 돌연변이 항원, 과발현된 세포 항원, 또는 바이러스 항원이다. 일부 실시형태에서, 종양 항원은 종양 세포에 고유한 단백질과 같은 면역원성 분자로 언급되는 "종양 특이적 항원" 또는 "TSA"이다. 종양 특이적 항원은 배타적으로 종양 세포에서, 예를 들어, 특정 유형의 종양 세포에서 발현된다.
일부 예에서, 본원에 개시된 CAR 구축물은 CD70에 결합할 수 있는 scFv 세포외 도메인을 포함한다. 일부 예에서, 본원에 개시된 CAR 구축물은 CD19에 결합할 수 있는 scFv 세포외 도메인을 포함한다. 일부 예에서, 본원에 개시된 CAR 구축물은 BCMA에 결합할 수 있는 scFv 세포외 도메인을 포함한다. 항-CD70 CAR의 예는 하기 실시예에 제공된다.
(b) 막횡단 도메인
본원에 개시된 CAR 폴리펩티드는 막을 가로지르는 소수성 알파 나선일 수 있는 막횡단 도메인을 함유할 수 있다. 본원에서 사용되는 "막횡단 도메인"은 세포막, 바람직하게는 진핵 세포막에서 열역학적으로 안정한 임의의 단백질 구조를 지칭한다. 막횡단 도메인은 이를 함유하는 CAR의 안정성을 제공할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에서 제공된 바와 같은 CAR의 막횡단 도메인은 CD8 막횡단 도메인일 수 있다. 다른 실시형태에서, 막횡단 도메인은 CD28 막횡단 도메인일 수 있다. 추가의 다른 실시형태에서, 막횡단 도메인은 CD8 및 CD28 막횡단 도메인의 키메라이다. 다른 막횡단 도메인은 본원에 제공된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 막횡단 도메인은 하기의 서열을 함유하는 CD8a 막횡단 도메인이다:
Figure pct00001
또는
Figure pct00002
. 다른 막횡단 도메인도 또한 사용될 수 있다.
(c) 힌지 도메인
일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 CAR의 세포외 도메인(항원 결합 도메인 포함)과 막횡단 도메인 사이에, 또는 CAR의 세포질 도메인과 막횡단 도메인 사이에 위치할 수 있다. 힌지 도메인은 폴리펩티드 쇄에서 막횡단 도메인을 세포외 도메인 및/또는 세포질 도메인에 연결시키는 기능을 하는 임의의 올리고펩티드 또는 폴리펩티드일 수 있다. 힌지 도메인은 CAR, 또는 이의 도메인에 유연성을 제공하도록, 또는 CAR, 또는 이의 도메인의 입체 장애를 방지하도록 기능을 할 수 있다.
일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 최대 300개의 아미노산(예를 들어, 10개 내지 100개의 아미노산, 또는 5개 내지 20개의 아미노산)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 힌지 도메인(들)은 CAR의 다른 영역에 포함될 수 있다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 CD8 힌지 도메인일 수 있다. 다른 힌지 도메인이 사용될 수 있다.
(d) 세포내 신호전달 도메인
임의의 CAR 구축물은 수용체의 기능적 말단인 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인(예를 들어, CD3ζ, 및 선택적으로 하나 이상의 동시-자극 도메인)을 함유한다. 항원 인식 후에, 수용체는 클러스터링되고, 신호는 세포로 전달된다.
CD3ζ는 T 세포 수용체 복합체의 세포질 신호전달 도메인이다. CD3ζ는 세 개(3)의 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 함유하며, 이는 T 세포가 동족 항원과 결합된 후 활성화 신호를 T 세포로 전달한다. 많은 경우에, CD3ζ는 완전히 적격인 활성화 신호가 아니라 일차 T 세포 활성화 신호를 제공하고, 이는 동시-자극 신호전달을 필요로 한다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 CAR 폴리펩티드는 하나 이상의 동시-자극 신호전달 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, CD28 및/또는 4-1BB의 동시-자극 도메인은 CD3ζ에 의해 매개되는 일차 신호전달과 함께 완전한 증식/생존 신호를 전달하는 데 사용될 수 있다. 일부 예에서, 본원에 개시된 CAR은 CD28 동시-자극 분자를 포함한다. 다른 예에서, 본원에 개시된 CAR은 4-1BB 동시-자극 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 CD3ζ 신호전달 도메인 및 CD28 동시-자극 도메인을 포함한다. 다른 실시형태에서, CAR은 CD3ζ 신호전달 도메인 및 4-1BB 동시-자극 도메인을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, CAR은 CD3ζ 신호전달 도메인, CD28 동시-자극 도메인 및 4-1BB 동시-자극 도메인을 포함한다.
본원에 기재된 방법은, 예를 들어, 당업계에 공지되거나 본원에 개시된 CAR을 발현하는 유전학적으로 조작된 T 세포를 생성하는 데 사용될 수 있는 1가지 초과의 적합한 CAR을 포함하는 것을 이해해야 한다. 예는, 예를 들어, 제WO 2019/097305A2호로 공개된 2018년 5월 11일에 출원된 제PCT/IB2018/001619호 및 2019년 5월 10일자 출원된 제PCT/IB2019/000500호에서 찾아볼 수 있으며, 종래 출원의 각각의 관련 개시는 본원에서 언급되는 목적 및 주제에 대하여 본원에 참조로 포함된다.
예를 들어, CAR은 CD70에 결합한다("CD70 CAR" 또는 "항-CD70 CAR"로도 알려져 있음). CD70에 결합하는 예시적인 CAR의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 46에 제공된다(하기 실시예 5에서 표 12 참조).
T 세포로의 CAR 구축물의 전달을 위한 AAV 벡터
CAR 작제물을 인코딩하는 핵산은 아데노-연관 바이러스(AAV)를 사용하여 세포로 전달될 수 있다. AAV는 숙주 게놈에 부위 특이적으로 통합되어 CAR과 같은 전이유전자를 전달할 수 있는 작은 바이러스이다. 역위 말단 반복부(ITR)는 AAV 게놈 및/또는 관심 전이유전자에 측접하여 존재하고, 복제 원점으로서 작용한다. 또한 AAV 게놈에는, 전사될 때 표적 세포로의 전달을 위해 AAV 게놈을 캡슐화하는 캡시드를 형성하는 rep 및 cap 단백질이 존재한다. 이러한 캡시드의 표면 수용체는 AAV 혈청형을 부여하며, 이는 캡시드가 어느 표적 기관에 주로 결합할지를 결정하여 AAV에 의해 가장 효율적으로 감염될 세포를 결정한다. 현재 12개의 인간 AAV 혈청형이 알려져 있다. 일부 실시형태에서, CAR-코딩 핵산을 전달하는 데 사용되는 AAV는 AAV 혈청형 6(AAV6)이다.
아데노-연관 바이러스는 여러 이유로 유전자 요법에 가장 흔히 사용되는 바이러스 중 하나이다. 첫째, AAV는 인간을 비롯한 포유동물로의 투여 시 면역 반응을 유발하지 않는다. 둘째, AAV는 특히 적절한 AAV 혈청형 선택을 고려할 때, 표적 세포로 효과적으로 전달된다. 마지막으로, AAV는 게놈이 통합 없이 숙주 세포에서 지속할 수 있으므로 분열 세포와 비분열 세포 둘 모두를 감염시킬 수 있는 능력을 갖는다. 이러한 특성으로 인해 AAV는 유전자 요법에 이상적인 후보물질이다.
CAR을 인코딩하는 핵산은 숙주 T 세포에서 관심 게놈 부위로 삽입되도록 설계될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 게놈 부위는 세이프 하버(safe harbor) 유전자좌에 있을 수 있다.
일부 실시형태에서, CAR을 인코딩하는 핵산(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터에 의해 운반될 수 있는 공여자 주형을 통해)은 유전학적으로 조작된 T 세포에서 TRAC 유전자를 파괴하고 CAR 폴리펩티드를 발현하도록 TRAC 유전자 내의 위치에 삽입될 수 있도록 설계될 수 있다. TRAC의 파괴는 내인성 TCR의 기능 상실로 이어진다. 예를 들어, TRAC 유전자의 파괴는 본원에 기재된 것들과 같은 엔도뉴클레아제 및 하나 이상의 TRAC 게놈 영역을 표적화하는 하나 이상의 gRNA로 생성될 수 있다. TRAC 유전자 및 표적 영역에 특이적인 임의의 gRNA, 예를 들어, 본원에 개시된 것들이 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다.
일부 예에서, TRAC 유전자의 게놈 결실 및 CAR 코딩 세그먼트로의 치환은 상동성 지정 수선 또는 HDR에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터의 일부일 수 있는 공여자 주형 사용). 일부 예에서, gRNA 표적 서열 또는 이의 부분은 결실된다(예를 들어, SEQ ID NO: 17). 일부 실시형태에서, TRAC 유전자에서의 파괴는 본원에 개시된 것들과 같은 엔도뉴클레아제 및 하나 이상의 TRAC 게놈 영역을 표적화하여 CAR 코딩 세그먼트를 TRAC 유전자로 삽입하는 하나 이상의 gRNA로 생성될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 공여자 주형은 CAR에 대한 코딩 서열을 함유할 수 있다. 일부 예에서, CAR-코딩 서열은, 예를 들어, CRISPR-Cas9 유전자 편집 기술을 이용하여 TRAC 유전자에서 관심 게놈 위치에 효율적인 HDR이 가능하도록 두 개의 상동성 영역이 측접될 수 있다. 이 경우에, 표적 유전자좌에서 DNA의 두 가닥 모두 표적 유전자좌에 특이적인 gRNA에 의해 가이드된 CRISPR Cas9 효소로 절단될 수 있다. 이후, HDR이 발생하여 이중-가닥 파단(DSB)을 수선하고 CAR을 코딩하는 공여자 DNA를 삽입한다. 이것이 정확하게 발생하기 위해, 공여자 서열은 TRAC 유전자와 같은 표적 유전자에서 DSB 부위를 둘러싸는 서열에 상보적인 측접 잔기(이하, "상동성 아암")로 설계된다. 이들 상동성 아암은 DSB 복구를 위한 주형으로서 작용하여, 본질적으로 오류가 없는 메커니즘의 HDR을 가능하게 한다. 상동성 지정 수선(HDR)의 속도는 돌연변이와 절단 부위 사이의 거리의 함수이므로, 중복되거나 가까운 표적 부위를 선택하는 것이 중요하다. 주형은 상동성 영역이 측접된 추가 서열을 포함할 수 있거나, 게놈 서열과 상이한 서열을 함유할 수 있으므로, 서열 편집이 가능하다.
대안적으로, 공여자 주형은 DNA의 표적화된 위치에 대해 상동성 영역을 갖지 않을 수 있으며, 표적 부위에서의 절단 후 NHEJ-의존성 말단 연결에 의해 통합될 수 있다.
공여자 주형은 단일-가닥 및/또는 이중-가닥의 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 선형 또는 원형 형태로 세포에 도입될 수 있다. 선형 형태로 도입되는 경우, 공여자 서열의 말단은 당업자에게 알려진 방법에 의해 (예를 들어, 핵외 분해로부터) 보호될 수 있다. 예를 들어, 선형 분자의 3' 말단에 하나 이상의 디데옥시뉴클레오티드 잔기가 추가되고/되거나, 한쪽 또는 양쪽 말단에 자가-상보성 올리고뉴클레오티드가 라이게이션된다. 예를 들어, 문헌[Chang et al, (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84:4959-4963]; 문헌[Nehls et al, (1996) Science 272:886-889]을 참조한다. 외인성 폴리뉴클레오티드를 분해로부터 보호하는 추가의 방법은 말단 아미노기(들)의 추가 및 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 및 O-메틸 리보스 또는 데옥시리보스 잔기와 같은 변형된 뉴클레오티드간 연결기의 사용을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
공여자 주형은, 예를 들어, 복제 원점, 프로모터, 및 항생제 내성을 인코딩하는 유전자와 같은 추가 서열을 갖는 벡터 분자의 일부로서 세포에 도입될 수 있다. 또한, 공여자 주형은 네이키드 핵산으로서 도입되거나, 리포솜 또는 폴록사머와 같은 작용제와 복합체화된 핵산으로서 도입되거나, 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스, AAV, 헤르페스바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 및 인테그라제 결함 렌티바이러스(IDLV))에 의해 전달될 수 있다.
공여자 주형은, 일부 실시형태에서, 내인성 프로모터 부근(예를 들어, 하류 또는 상류)의 부위에 삽입될 수 있고, 이에 따라 이의 발현이 내인성 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 다른 실시형태에서, 공여자 주형은 CAR 유전자의 발현을 제어하기 위해 외인성 프로모터 및/또는 인핸서, 예를 들어 구성성 프로모터, 유도성 프로모터, 또는 조직 특이적 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 외인성 프로모터는 EF1α 프로모터이다. 다른 프로모터가 사용될 수 있다.
게다가, 외인성 서열은 또한 전사 또는 번역 조절 서열, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 인슐레이터, 내부 리보솜 진입 부위, 2A 펩티드를 인코딩하는 서열, 및/또는 폴리아데닐화 신호를 포함할 수도 있다.
T 세포 형질도입
본원에 개시된 CAR 구축물(예를 들어, 항-CD70 CAR)을 인코딩하는 적합한 양의 임의의 바이러스 벡터, 예컨대 AAV 벡터를 T 세포 내로의 바이러스 벡터의 유입을 허용하기에 적합한 기간 동안 적합한 양의 T 세포, 예컨대 본원에 개시된 유전학적으로 편집된 T 세포와 함께 인큐베이션시킬 수 있다. 예를 들어, 형질도입 방법은 CAR+ T 세포의 백분율을 증가시키는 최적화된 감염 다중도(MOI)의 범위의 이용을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 형질도입 방법에서 AAV 벡터의 MOI는 약 1,000 내지 약 150,000, 예컨대 약 10,000 내지 약 80,000의 범위일 수 있다. 일부 예에서, 형질도입 방법에서 사용되는 AAV 벡터의 MOI는 약 1,000 내지 약 150,000, 약 5,000 내지 약 100,000, 약 10,000 내지 약 100,000, 약 10,000 내지 약 90,000, 약 10,000 내지 약 80,000, 약 10,000 내지 약 70,000, 약 10,000 내지 약 60,000, 약 10,000 내지 약 50,000, 약 10,000 내지 약 40,000, 약 10,000 내지 약 30,000, 약 10,000 내지 약 20,000, 약 20,000 내지 약 80,000, 약 30,000 내지 약 80,000, 약 40,000 내지 약 80,000, 약 50,000 내지 약 80,000, 약 60,000 내지 약 80,000, 또는 약 70,000 내지 약 80,000일 수 있다. 일부 예에서, 형질도입 방법에서 사용되는 AAV 벡터의 MOI는 약 1,000, 약 2,500, 약 5,000, 약 10,000, 약 15,000, 약 20,000, 약 25,000, 약 30,000, 약 31,000, 약 32,000, 약 33,000, 약 34000, 약 35,000, 약 40,000, 약 50,000, 약 60,000, 약 70,000, 약 80,000, 약 90,000, 약 100,000, 약 110,000, 약 120,000, 약 130,000, 약 140,000 또는 약 150,000일 수 있다.
일부 실시형태에서, AAV 벡터는 항-CD70 CAR(예를 들어, 하기 실시예 5에서 표 12에 개시된 바와 같음)을 인코딩하며, 형질도입 방법에서 사용하기 위한 이러한 AAV 벡터의 MOI는 약 20,000이다. 다른 실시형태에서, AAV 벡터는 항-CD19 CAR을 인코딩하며, 형질도입 방법에서 사용하기 위한 이러한 AAV 벡터의 MOI는 약 20,000이다. 다른 실시형태에서, AAV 벡터는 항-BCMA CAR을 인코딩하며, 형질도입 방법에서 사용하기 위한 이러한 AAV 벡터의 MOI는 약 20,000이다.
형질도입 후에, T 세포는 적합한 세포 배양 배지에서 회복에 적합한 기간 동안 배양될 수 있다. CD70, TRAC 및 β2M 유전자가 낙아웃된, CAR을 발현하는 유전학적으로 조작된 T 세포는 하기 개시된 바와 같이 시험관 내에서 증량될 수 있다.
(v) T 세포 증량
본원에 개시된 바와 같은 유전학적으로 조작된 T 세포는 유전학적으로 조작된 T 세포의 집단을 임상적으로 유의미한 규모로 생성하기에 적합한 조건 하에서 시험관 내에서 증량될 수 있다. 이 증량 단계에서 사용되는 세포 배양 조건은 적어도 부분적으로, 더 짧은 인큐베이션 기간에 더 높은 최종 세포 밀도(이에 의한 제조 비용의 감소) 및 세포 요법에 사용하기 위한 더 강력한 T 세포를 달성하고자 한다. 효력은 다양한 T 세포 기능, 예를 들어, 증식, 표적 세포 사멸, 사이토카인 생성, 활성화, 이동 및 이의 조합에 의해 나타날 수 있다.
일부 실시형태에서, T 세포 증량 단계는 세포 배양 용기에서 T 세포의 집단(예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 유전학적으로 조작된 T 세포)을 세포 용기 내에 약 150,000개 세포/㎠ 내지 약 600,000개 세포/㎠의 씨딩 밀도로 씨딩함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 세포 용기에 약 300,000개 세포/㎠ 내지 약 500,000개 세포/㎠로 씨딩될 수 있다. 일부 양태에서, T 세포 증량은 T 세포의 집단을 세포 배양 용기에 적어도 약 60,000개 세포/㎠, 적어도 약 62,500개 세포/㎠ 또는 적어도 약 83,000개 세포/㎠의 씨딩 밀도로 씨딩함으로써 수행된다. 일부 양태에서, T 세포 증량은 T 세포의 집단을 세포 배양 용기에 적어도 약 150,000개 세포/㎠, 또는 적어도 약 250,000개 세포/㎠, 또는 적어도 약 300,000개 세포/㎠, 또는 적어도 약 400,000개 세포/㎠, 또는 적어도 약 500,000개 세포/㎠, 또는 적어도 약 600,000개 세포/㎠의 씨딩 밀도로 씨딩함으로써 수행된다. 일부 양태에서, 씨딩 밀도는 약 250,000개 세포/㎠이다. 다른 양태에서, 씨딩 밀도는 약 500,000개 세포/㎠이다. 다른 양태에서, 씨딩 밀도는 약 600,000개 세포/㎠이다.
일부 실시형태에서, T 세포 증량 단계는 T 세포의 집단(예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 유전학적으로 조작된 T 세포)을 세포 배양 용기에서 약 2x105개 세포/㎠ 내지 약 7x105개 세포/㎠의 씨딩 밀도로 씨딩하고, 세포를 약 6일 내지 약 12일 동안 배양함으로써 수행될 수 있다. 일부 예에서, T 세포 증량은 T 세포의 집단을 세포 배양 용기에서 약 2x105개 세포/㎠ 내지 약 7x105개 세포/㎠, 약 2x105개 세포/㎠ 내지 약 5x105개 세포/㎠, 약 2x105개 세포/㎠ 내지 약 4x105개 세포/㎠, 2x105개 세포/㎠ 내지 약 3x105개 세포/㎠, 3x105개 세포/㎠ 내지 약 5x105개 세포/㎠, 또는 4x105개 세포/㎠ 내지 약 5x105개 세포/㎠의 씨딩 밀도로 씨딩하고, 세포를 약 6일 내지 약 12일, 약 6일 내지 약 11일, 약 6일 내지 약 10일, 약 6일 내지 약 9일, 약 6일 내지 약 8일, 약 6일 내지 약 7일, 약 7일 내지 약 12일, 약 7일 내지 약 11일, 약 7일 내지 약 10일, 약 7일 내지 약 9일, 약 7일 내지 약 8일, 약 8일 내지 약 12일, 약 8일 내지 약 9일, 약 9일 내지 약 12일, 약 10일 내지 약 12일, 또는 약 11일 내지 약 12일 동안 배양함으로써 수행된다. 일부 실시형태에서, T 세포 증량은 T 세포의 집단을 세포 배양 용기에서 약 3x105개 세포/㎠ 내지 약 5x105개 세포/㎠의 씨딩 밀도로 씨딩하고, 세포를 약 7일 내지 약 9일 동안 배양함으로써 수행된다.
일부 실시형태에서, T 세포 증량 단계는 세포 배양물을 리플레이팅하는 것(즉, 세포 배양물을 새로운 배양 용기 내로 분할하는 것)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물을 추가의 증량을 위하여 편집 후 제3일, 제4일, 제5일, 제6일 또는 7일에 1:4 비(4개의 새로운 용기 내로 1개의 용기 분할)로 리플레이팅할 수 있다.
T 세포 증량을 배지 교체 없이 T 세포의 증량을 가능하게 하는 정적 배양 용기에서 수행할 수 있다. 예를 들어, T 세포를 정적 배양 용기에서 배지 교체 없이 약 7일 내지 약 12일, 또는 약 7일 내지 약 9일 동안 증량시킬 수 있다.
(vi) TCRαβ + T 세포의 고갈
일부 실시형태에서, TCRαβ+ T 세포를 본원에 개시된 증량된 T 세포 집단으로부터 고갈시켜, 세포 요법에서 사용하기 위한 동종이계 T 세포의 집단을 생성할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, "TCRαβ+ T 세포 고갈"은 TCRαβ+ T 세포를 포함하는 세포의 집단으로부터 TCRαβ+ T 세포를 고갈시키는 것을 나타낸다. TCRαβ+ T 세포 고갈 후에, 생성된 T 세포 집단은 상당한 낮은 수준의 TCRαβ+ T 세포(예를 들어, 전체 세포 집단 중 3% 미만, 또는 전체 세포 집단 중 2% 미만, 1% 미만, 또는 0.5% 미만)를 가질 수 있다. 일부 예에서, 생성된 T 세포 집단에는 TCRαβ+ T 세포가 없을 수 있으며, 즉, TCRαβ+ T 세포의 존재는 통상적인 방법을 통해(예를 들어, TCRαβ+에 결합하는 항체를 사용하는 면역 검정에서 또는 유세포측정에 의해) 검출 가능하지 않다.
TCRαβ+ T 세포 고갈은 TCRαβ+ T 세포를 인식하는 작용제를 사용하여 TCRαβ+ T 세포를 포획함으로써, 이들을 TCRαβ+가 결여된 것들로부터 분리하여, 예를 들어, 자성 세포 분리를 수행함으로써 수행될 수 있다. 이러한 방법은 상기 개시된 증량된 T 세포를 항-TCRαβ 항체가 고정화된 비드와 접촉시키고, 결합되지 않은 세포를 수집함으로써 수행될 수 있다. 이에 따라 수집된 비결합 세포(TCRαβ+가 결여된 것들)를 배양하여, 사전에 세포 회복을 가능하게 할 수 있으며, 예를 들어, 비결합 세포를 하룻밤 배양하여, 세포가 회복되게 할 수 있다.
(vii) 유전학적으로 조작된 T 세포의 수거
이어서, 본원에 개시된 임의의 방법에 의해 생성되는 유전학적으로 조작된 T 세포를 당업계에 공지된 통상적인 방법을 사용하여 치료적 이용을 위해 수거할 수 있다. 예를 들어, 유전학적으로 조작된 T 세포를 수거하는 것은 TCRαβ+가 고갈된 세포를 수집하는 것을 포함할 수 있다. 수거된 유전학적으로 조작된 T 세포의 집단은 약물 물질로서 사용될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, "약물 물질"은 환자에 투여될 수 있는 유전학적으로 조작된 T 세포의 집단을 나타낸다. 약물 물질을 치료적 이용을 위하여 제형화할 수 있으며, 예를 들어, 보관 배지(예를 들어, CryoStor CS5)에서 제형화하고 장래의 이용을 위해 동결보존할 수 있다.
약물 물질을 하나 이상의 오염물질, 예를 들어, 마이코플라스마, 인간 바이러스(예를 들어, HIV, HBV, HCV, CMV) 및 박테리아 내독소에 대하여 시험할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 약물 물질을 무균성에 대하여 시험할 수 있다. 오염물질 부재 약물 물질을 개별 환자 용량으로 분취할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 오염물질 부재 약물 물질을 치료적 이용을 위하여 보관할 수 있다.
따라서, 본 개시의 양태는 유전학적으로 조작된 T 세포의 집단(약물 물질)을 제공한다. 유전학적으로 조작된 T 세포의 집단은 파괴된 CD70 유전자, 파괴된 TRAC 유전자, 파괴된 β2M 유전자 및 CAR을 인코딩하는 핵산, 예를 들어, 본원에 기재된 것들을 갖는다. 일부 실시형태에서, CAR은 병리학적 세포 상에 발현되는 항원에 결합한다. 일부 실시형태에서, CAR은 CD70에 결합한다. 일부 실시형태에서, CAR은 CD19에 결합한다. 일부 실시형태에서, CAR은 BCMA에 결합한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성되는 유전학적으로 조작된 T 세포의 집단의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%는 CAR을 발현한다. 다른 양태에서, CAR을 발현하는 이들 세포는 추가로 검출 가능한 수준의 표면 CD70 및/또는 검출 가능한 수준의 표면 TCR 및/또는 검출 가능한 수준의 표면 β2M을 발현하지 않는다.
다른 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성되는 유전학적으로 조작된 T 세포의 집단의 적어도 30%는 CAR을 발현하며, 당해 세포의 집단은 약 5% 이하, 약 2% 이하 또는 약 1% 이하의, 표면 CD70을 발현하는 T 세포를 포함한다.
다른 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성되는 유전학적으로 조작된 T 세포의 집단의 적어도 30%가 CAR을 발현하는 경우, 해당 세포의 집단은 약 1.0% 이하, 약 0.5% 이하, 약 0.4% 이하, 또는 약 0.15% 이하의 표면 TCR을 발현하는 T 세포(예를 들어, TCRα/β+ 세포)를 포함한다.
다른 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성되는 유전학적으로 조작된 T 세포의 집단의 적어도 30%가 CAR을 발현하는 경우, 해당 세포의 집단은 약 50% 이하, 약 40% 이하 또는 약 30% 이하의 표면 β2M을 발현하는 T 세포를 포함한다.
또한, Cas9 효소, CD70 유전자를 표적화하는 gRNA, TRAC 유전자를 표적화하는 gRNA, β2M 유전자를 표적화하는 gRNA, 및 CAR(예를 들어, CD70 CAR 또는 CD19 CAR 또는 BCMA CAR)을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터를 포함하는 본원에 기재된 방법에 의해 생성되는 유전학적으로 조작된 T 세포 집단이 본 개시의 범주 이내이다.
II. 치료적 응용
본원에 기재된 방법에 의해 생성되는 유전학적으로 조작된 T 세포의 집단은 치료적 목적, 예를 들어, 유전학적으로 조작된 T 세포의 집단에 의해 발현되는 CAR 구축물에 의해 표적화된 암의 치료를 위하여 대상체에 투여될 수 있다.
대상체는 진단, 치료 또는 요법이 요망되는 임의의 대상체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다.
본원에 기재된 방법에 의해 생성되는 유전학적으로 조작된 T 세포 집단을 사용하여 치료될 수 있는 암의 비제한적인 예는 다발성 골수종, 백혈병(예를 들어, T 세포 백혈병, B 세포 급성 림프아구성 백혈병(B-ALL), 및/또는 만성 림프구성 백혈병(C-CLL)), 림프종(예를 들어, B 세포 비호지킨 림프종(B-NHL), 호지킨 림프종, 및/또는 T 세포 림프종), 및/또는 투명 세포 신장 세포 암종(ccRCC), 췌장암, 위암, 난소암, 자궁경부암, 유방암, 신장암, 갑상선암, 비인두암, 비소세포 폐암(NSCLC), 교모세포종, 및/또는 흑색종을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
투여는 원하는 효과(들)가 생성될 수 있도록 원하는 부위, 예컨대 종양 부위에 유전학적으로 조작된 T 세포 집단이 적어도 부분적으로 국소화되게 하는 방법 또는 경로에 의한 대상체 내로의 유전학적으로 조작된 T 세포 집단의 배치(예를 들어, 이식)를 포함할 수 있다. 유전학적으로 조작된 T 세포 집단은 이식된 세포 또는 세포의 구성성분 중 적어도 일부가 생존 가능하게 남아 있는 대상체 내의 원하는 위치로의 전달을 초래하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 대상체로의 투여 후의 세포의 생존 가능 기간은 몇시간, 예를 들어, 24시간 내지 며칠만큼 짧을 수 있고, 몇년 또는 심지어 대상체의 수명만큼 길 수 있고, 즉, 장기간 생착일 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 일부 양태에서, 유효량의 유전학적으로 조작된 T 세포 집단은 전신 투여 경로, 예컨대 복강내 또는 정맥내 경로를 통해 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 유전학적으로 조작된 T 세포 집단은 전신으로 투여되며, 이는 표적 부위, 조직 또는 기관으로 직접적으로 투여하는 것을 제외하고, 대신에, 이것이 대상체의 순환계에 유입됨에 따라, 대사 및 기타 유사 과정을 겪도록 세포의 집단을 투여하는 것을 나타낸다. 적합한 투여 방식은 주사, 주입, 설치 또는 섭취를 포함한다. 주사는 제한 없이 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 심실내, 낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 기관지경, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척주관내, 뇌척수액내 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다. 일부 실시형태에서, 경로는 정맥내이다.
유효량은 의학적 질환(예를 들어, 암)의 적어도 하나 이상의 징후 또는 증상을 예방하거나 완화하는 데 필요한 유전학적으로 조작된 T 세포 집단의 양을 지칭하고, 원하는 효과를 제공하기에 충분한, 예를 들어, 의학적 질환을 갖는 대상체를 치료하기에 충분한 유전학적으로 조작된 T 세포 집단의 양과 관련된다. 유효량은 또한, 질병의 증상의 발생을 예방하거나 지연시키거나, 질병의 증상의 경과를 변경하거나(예를 들어, 비제한적으로, 질병의 증상의 진행을 늦춤), 질병의 증상을 역전시키기에 충분한 양을 포함한다. 임의의 주어진 경우에, 적절한 유효량은 일상적인 실험을 이용하여 당업자에 의해 결정될 수 있는 것으로 이해된다.
유전학적으로 조작된 T 세포 집단의 유효량은 적어도 102개의 세포, 적어도 5x102개의 세포, 적어도 103개의 세포, 적어도 5x103개의 세포, 적어도 104개의 세포, 적어도 5x104개의 세포, 적어도 105개의 세포, 적어도 2x105개의 세포, 적어도 3x105개의 세포, 적어도 4x105개의 세포, 적어도 5x105개의 세포, 적어도 6x105개의 세포, 적어도 7x105개의 세포, 적어도 8x105개의 세포, 적어도 9x105개의 세포, 적어도 1x106개의 세포, 적어도 2x106개의 세포, 적어도 3x106개의 세포, 적어도 4x106개의 세포, 적어도 5x106개의 세포, 적어도 6x106개의 세포, 적어도 7x106개의 세포, 적어도 8x106개의 세포, 적어도 9x106개의 세포, 또는 이의 배수를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이 제조된 유전학적으로 조작된 T 세포 집단을 사용한 치료의 효능은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 치료는 징후 또는 증상 중 어느 하나 또는 전부, 일례로서 기능 표적의 수준이 유리한 방식으로 변경(예를 들어, 적어도 10% 증가)되거나, 질병(예를 들어, 암)의 다른 임상적으로 허용되는 증상 또는 마커가 개선되거나 호전되는 경우, "유효한" 것으로 간주된다. 효능은 또한, 입원에 의해 평가되는 바와 같이 대상체가 악화되지 않거나 의료 개입이 필요하지 않은 것(예를 들어, 질병의 진행이 중단되거나 적어도 둔화됨)에 의해 측정될 수 있다. 이들 적응증을 측정하는 방법은 당업자에게 알려져 있고/있거나 본원에 기재되어 있다. 치료는 대상체에서의 질병의 임의의 치료를 포함하며, (1) 질병을 저해하는 것, 예를 들어 증상의 진행을 저지하거나 둔화시키는 것; 또는 (2) 질병을 완화시키는 것, 예를 들어 증상의 퇴행을 야기하는 것; 및 (3) 증상의 발생을 방지하거나 또는 이의 가능성을 낮추는 것을 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이 제조되는 유전학적으로 조작된 T 세포 집단은 또한 병용 요법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 제조되는 유전학적으로 조작된 T 세포 집단은 동일한 적응증을 치료하기 위하여 또는 유전학적으로 조작된 T 세포 집단의 효능을 향상시키기 위하여 및/또는 유전학적으로 조작된 T 세포 집단의 부작용을 감소시키기 위하여 다른 치료제와 동시에 사용될 수 있다.
일반적인 기법
본 개시의 실시는 달리 나타내지 않는 한, 당업계의 기술 내에 있는 분자 생물학(재조합 기법 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학, 및 면역학의 통상적인 기법을 사용할 것이다. 이러한 기법은 문헌, 예컨대 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press]; 문헌[Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed. 1984)]; 문헌[Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1989) Academic Press]; 문헌[Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. 1987)]; 문헌[Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press]; 문헌[Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds. 1993-8) J. Wiley and Sons]; 문헌[Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)]; 문헌[Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.): Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987)]; 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds. 1987)]; 문헌[PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds. 1994)]; 문헌[Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991)]; 문헌[Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)]; 문헌[Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997)]; 문헌[Antibodies (P. Finch, 1997)]; 문헌[Antibodies: a practice approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)]; 문헌[Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)]; 문헌[Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)]; 문헌[The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds. Harwood Academic Publishers, 1995)]; 문헌[DNA Cloning: A practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985)]; 문헌[Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds.(1985]; 문헌[Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984]; 문헌[Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986]; 문헌[Immobilized Cells and Enzymes (lRL Press, (1986]; 및 문헌[B. Perbal, A practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.)]에 충분히 설명되어 있다.
추가 설명 없이, 당업자는 상기 설명에 기초하여 본 발명을 이의 가장 완전한 정도로 활용할 수 있는 것으로 사료된다. 따라서, 다음의 특정 실시형태는 어떤 식으로든 나머지 개시의 제한이 아니라 단지 예시적인 것으로 해석되어야 한다. 본원에 언급된 목적 또는 주제에 대하여 본원에 인용된 모든 간행물은 참조로 포함된다.
실시예
기재된 본 발명이 더욱 완전히 이해될 수 있도록, 하기의 실시예가 제시된다. 본 출원에 기재된 실시예는 본원에 제공되는 방법 및 조성물을 예시하기 위하여 제공되며, 어떠한 방식으로든 이들의 범주를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.
실시예 1: T 세포 농축을 위한 최적화된 조건의 확인.
본 실시예에는 자동화 세포 처리 시스템을 사용하여 류코팩으로부터 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 농축시키기 위한, T 세포 농축을 위한 최적화된 조건의 확인이 보고된다.
방법
류코팩 및 완충제 제조
인간 류코팩을 HemaCare 또는 Stem Express로부터 수집하고, T 세포 농축을 위해 처리하였다. PBS/EDTA 완충제(인산염 완충 염수, pH 7.2, 1 mM EDTA가 보충됨)에 0.5% 인간 혈청 알부민(HSA)을 보충하고, T 세포 선택 동안 처리, 프라이밍, 세척 및 용리를 위해 사용하였다.
류코팩 공여자를 하기에 대하여 스크리닝하였다:
· B형 간염 표면 항원(HBsAg EIA)
· C형 간염 바이러스 항체(항-HCV EIA)
· 인간 면역결핍 바이러스 항체(HIV 1/2 플러스(plus) O)
· 인간 T-림프친화 바이러스 항체(HTLV-I/II)
· HIV-1/HCV/HBV 핵산 시험
· WNV 핵산 시험
· 트리파노소마 크루지 항체(선택적 샤가스병 시험, 공여자마다 단일의 생애 시험)
· HIV/HBV/HCV
· CMV
· IDS
상기 임의의 시험의 양성 결과를 보이는 공여자를 배제하였다. 본원에 개시된 실시예에서 사용되는 공여자의 인구통계 정보는 표 1에 나타나 있다.
Figure pct00003
Sysmex를 사용한 류코팩 혈액학 분석
들어오는 류코팩 유래의 샘플을 제조처의 설명에 따라 Sysmex XP300(Sysmex, 일련 번호: B0628)을 사용하여 혈액학 분석을 위하여 처리하였다. 백혈구(WBC) 계수를 사용하여, 자동화된 세포 처리 시스템 내에 로딩된 총 세포 질량을 계산하였다.
T 세포 농축
처리 완충제, 류코팩, CD4 마이크로비드 및 CD8 마이크로비드를 실행을 시작하기 전에 자동화된 세포 처리 시스템에 로딩하였다. 세포를 챔버에서 세척하고 표지하고, 분리를 위하여 자성 컬럼으로 지향시켰다. CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포획하고 처리 완충제에서 표적 백(bag) 내로 추가로 용리시켰다.
세포 계수 및 생존력
세포 계수 및 생존력 평가를 디폴트 프로파일을 사용하여 COUNTESS® II(Life Technologies, Cat: AMQAX1000)로 수행하였다. 세포(20 ㎕)를 버블(bubble)의 도입 없이 위 아래로 수회 피펫팅함으로써 트립판 블루(20 ㎕)와 혼합하였다. 세포/트립판 블루 혼합물(10 ㎕)을 COUNTESS® II 세포 계수 챔버 슬라이드 내에 로딩하였다.
유세포측정
약 1x106개의 전핵 세포를 실온(RT)에서 10분 동안 95 ㎕의 염색 완충제(0.5% 소 혈청 알부민(BSA)/DPBS)) 중 5 ㎕의 인간 TruStain FcX™를 사용하여 블로킹하였다. 세포를 4℃에서 30분 동안 Pacific blue-컨쥬게이트된 항-인간 CD45 항체(1:50), BV510-컨쥬게이트된 항-인간 CD3 항체(1:50), APC-Cy7-컨쥬게이트된 항-인간 CD4 항체(1:50), PE-Cy7-컨쥬게이트된 항-인간 CD8 항체(1:50), APC-컨쥬게이트된 항-인간 CD19 항체(1:50), FITC-컨쥬게이트된 항-인간 CD56 항체(1:50) 및 PE-컨쥬게이트된 항-인간 CD33 항체(1:50)와 추가로 인큐베이션시켰다. 이어서, 5 ㎕의 7-아미노-악티노마이신 D(7-AAD) 생존력 염색 용액을 함유하는 1 ㎖의 암모늄-클로라이드-칼륨(ACK) 용해 완충제를 각각의 샘플에 제공하였다. ACK 용해 완충제를 실온에서 10분 동안 인큐베이션한 후에, 세포를 NovoCyte-3000 유세포측정기를 사용하여 획득하였다.
결과
류코팩 샘플 내의 백혈구(WBC)
시험된 류코팩 내의 WBC는 8.14x109개 내지 21.36x109개 세포의 범위였으며, 림프구 개수는 5.77x109개 내지 17.32x109개의 범위였다.
CD4 및 CD8 농축 - 순도, 생존력, 세포 회수 및 수율
시험된 9개의 뱃치 중에, 4개를 프로그램 A로 평가하고, 5개를 프로그램 B로 평가하였다. 모든 뱃치는 90% 초과의 순도 및 90% 초과의 생존력을 갖는 T 세포를 제공하였다(표 2). 프로그램 A로부터의 세포 회수는 31%였던 한편, 프로그램 B로부터의 세포 회수는 55.69%였다.
Figure pct00004
종합하여, 이들 결과는 건강한 공여자(HD) 류코팩으로부터의 T 세포가 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 대하여 높은 순도(90% 초과) 및 높은 생존력(90% 초과)으로 농축되었음을 보여준다.
실시예 2: T 세포 활성화를 위한 최적화된 조건의 확인.
본 실시예에는 재조합 인간화된 CD3 및 CD28 효능제에 컨쥬게이트된 콜로이드성 폴리머 나노매트릭스를 사용한 T 세포 활성화를 위한 최적화된 조건의 확인이 보고된다. 유전자 편집 및/또는 CAR 발현 수준을 상이한 조건에서 활성화된 T 세포 상에서 시험하여, 뛰어난 유전자 편집 및/또는 CAR 발현 수준을 달성하는 최적화된 T 세포 활성화 조건을 확인하였다. 요약하여, 유전학적으로 조작된 T 세포를 소규모 공정에서 제조하였으며, 여기서, 농축된 T 세포를 해동시킨 후에, 활성화 이전에 1회의 전기천공법 또는 2회의 전기천공법을 사용하여 48시간 또는 72시간 동안 활성화시켰으며, %CAR+ 발현을 유세포측정에 의해 형질도입 7일 후에 결정하였다.
소규모 제조 공정을 시작하기 위하여, 냉동바이얼(cryovial)을 액체 질소 보관으로부터 회수하고, 소량의 동결된 물질이 유지될 때까지 수조에서 해동시켰다. 이어서, 세포를 10X 부피의 완전 성장 배지(X-VIVO™ 15, 5% 인간 AB 혈청, 50 ng/㎖ IL7 및 10 ng/㎖ IL2)에 적가하고, 실온에서 10분 동안 300g에서 원심분리에 의해 펠렛화시켰다. 세포를 1x106개 세포/㎖의 농도로 재현탁화시키고, 하류 변형을 개선시키는 재조합 인간화된 CD3 및 CD28 효능제에 컨쥬게이트된 콜로이드성 폴리머 나노매트릭스-매개된 활성화로 처리하거나, 전기천공시켜, CRISPR-Cas9 의존적 유전자 편집을 위한 구성성분을 도입하였다.
단리된 T 세포를 콜로이드성 폴리머 나노매트릭스에 공유적으로 부착된 재조합 CD3 및 CD28로 활성화시켰다. 재조합 인간화된 CD3 및 CD28 효능제에 컨쥬게이트된 콜로이드성 폴리머 나노매트릭스를 비처리된 플라스크에서 1:12.5 비 또는 1x106개의 세포당 40 ㎕로 세포에 적용하였다. 세포를 48시간 또는 72시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이터 내의 재조합 인간화된 CD3 및 CD28 효능제에 컨쥬게이트된 콜로이드성 폴리머 나노매트릭스와 함께 유지하였다. 인큐베이션 후에, 세포를 실온에서 10분 동안 300g에서 원심분리한다. 이어서, 세포 펠렛을 완전 성장 배지에서 재현탁화시키고, 유전자 변형 이전에 1x106개 세포/㎖의 농도로 하룻밤 배양하였다.
전기천공을 위하여, 총 세포 수 및 세포 생존력을 트립판 블루의 첨가 및 COUNTESS® 세포계수기에서의 계수에 의해 정량화하였다. 이어서, 세포를 실온에서 10분 동안 300g에서 원심분리하였다. 세포 펠렛을 10 ㎖의 전기천공법 완충제 중에서 세척하고, 다시 원심분리하였다. 세포를 원심분리하는 동안, 리보핵단백질(RNP) 복합체를 제조하였다. RNP 복합체를 개별적으로 형성한 다음, 다중의 편집을 수행한다면 함께 조합한다. 4개의 개별 RNP 복합체를 표기된 농도의 gRNA 및 Cas9를 사용하여 형성하였다(표 3). 각각의 RNP 복합체를 SEQ ID NO: 1을 포함하는 Cas9를 사용하여 형성하였다. 또한, Cas9 및 gRNA 서열에 대해서는 실시예 5를 참조한다.
Figure pct00005
세포를 유동 전기천공법에 기초한 트랜스펙션 시스템을 사용하여 전기천공시켰다. 일단 각각의 개별 큐벳을 전기천공시킨 후에, 세포 및 RNP 용액을 비-처리된 12-웰 플레이트 내로 분취하였으며, 각각의 웰은 500 ㎕의 X-VIVO™ 15 배지(인간 AB 혈청, IL2 또는 IL7 부재)를 함유한다. 세포를 인큐베이터에서 20분 동안 휴지되게 하였다. 총 세포 수 및 세포 생존력을 트립판 블루의 첨가 및 COUNTESS® 세포계수기에서의 계수에 의해 정량화하였다.
휴지 이후의 총 세포 수에 기초하여, 세포를 원하는 농도에 도달하도록 X-VIVO™ 15(인간 AB 혈청, IL2 또는 IL7 부재)로 추가로 희석할 필요가 있을 수 있다. 형질도입을 수행하기 위하여 필요한 AAV의 부피를 계산하기 위하여 총 세포 수가 필요하다.
필요한 AAV의 ㎕ = (총 세포 수)(원하는 MOI(즉, 20K))/(바이러스 vgc/㎖(즉, 1.5x10 13 ))
AAV 및 세포 현탁액을 혼합하고, 37℃ 및 5% CO2에서 1시간 동안 비-처리된 플라스크에서 인큐베이션되게 하였다. AAV를 포함하는 전체 부피를 100 ㎖의 완전 배지를 함유하는 정적 배양 용기에 첨가하였다. 정적 배양 용기를 3일 동안 인큐베이션시켜, 세포 증량을 가능하게 하였다.
전기천공법 후에, 정적 배양 용기의 각각의 웰을 100 ㎖의 완전 성장 배지로 채웠다. 유전자 변형된 세포를 100 ㎖의 완전 성장 배지에서 5x105개 세포/㎖ 내지 1x106개 세포/㎖의 농도로 씨딩하였다. 정적 배양 용기를 3일 내지 4일 동안 인큐베이션시켜, 세포 증량을 가능하게 하였다. IL2 및 IL7을 100U/㎖의 최종 작업 농도 또는 10 ng/㎖ IL2 및 50 ng/㎖ IL7로 3일 내지 4일마다 보충하였다. 총 세포 수를 트립판 블루의 첨가 및 COUNTESS® 세포계수기에서의 계수에 의해 3일 내지 4일마다 정량화하였다. 세포를 전기천공법 이후 9일 내지 12일 동안 배양 중에 유지하여, 최대 총 세포 수를 달성하였다.
(i) T 세포 활성화를 위한 최적화된 조건은 %CAR + 발현을 증가시킨다
전기천공을 사용하여, CD70, PD1, β2M 및 TRAC 유전자를 포함하는 4가지 표적 유전자의 CRISPR-Cas9 의존적 유전자 편집을 위하여 gRNA 및 Cas9를 T 세포 내로 도입하였다. 모든 4개의 유전자를 한꺼번에 표적화하기 위하여 단일의 전기천공법을 수행하였다. 2회의 전기천공 수행하는 경우, 제1 전기천공법에서 CD70 및 PD1 유전자를 표적화하는 RNP 복합체를 T 세포 내로 도입하고, 제2 전기천공법에서 β2M 및 TRAC 유전자를 표적화하는 RNP 복합체를 이들 T 세포 내로 도입하였다.
표 4에 나타낸 바와 같이, 1회의 전기천공 또는 2회의 전기천공 이전에 48시간 동안 활성화된 T 세포는 각각 54.7% 및 57.5%의 %CAR+ 발현을 보였다. 72시간 동안 활성화된 T 세포는 T 세포가 1회 전기천공되었는지 2회 전기천공되었는지와 관계 없이, 48시간 동안 활성화된 T 세포보다 대략 10% 더 많은 총 %CAR+ 발현을 나타내었다(표 4).
Figure pct00006
이들 결과는 72시간 동안의 T 세포 활성화가 48시간의 T 세포 활성화에 의해 제공되는 것에 비하여 %CAR+ 발현을 증가시켰음을 입증하였다. PD1을 표적화하는 RNP 복합체가 전기천공에 포함되지 않았던 경우에, 유사한 결과가 관찰되었다.
(ii) T 세포 활성화를 위한 최적화된 조건은 전기천공으로부터의 세포 손실을 약화시킨다
제1 전기천공법 단계를 T 세포 상에서 수행하여, CD70 유전자 및 PD1 유전자의 CRISPR-Cas9 의존적 편집을 위한 구성성분을 도입하였다. 세포 수를 48시간 또는 72시간 동안의 T 세포 활성화 이전 및 이후에 결정하였다.
표 5에 나타낸 바와 같이, T 세포를 48시간 동안 활성화시키는 경우, 제2 전기천공법 이전에 수득된 세포 계수는 활성화를 위해 초기에 씨딩된 세포의 수보다 더 낮았다. 대조적으로, T 세포를 72시간 동안 활성화시키는 경우, 제2 전기천공법 이전에 수득된 세포 계수는 활성화를 위해 초기에 씨딩된 세포의 수보다 더 컸다(표 5).
Figure pct00007
이들 결과는 72시간 동안의 T 세포 활성화가 T 세포를 48시간 동안만 활성화시키는 경우 관찰되었던 제1 전기천공법 후의 세포 손실을 약화시켰음을 입증하였다. PD1을 표적화하는 RNP 복합체를 전기천공법에 포함시키지 않았던 경우에 유사한 결과가 관찰되었다.
실시예 3 : β2M의 낙아웃을 위한 최적화된 조건의 확인.
본 실시예에는 CRISPR-Cas9 의존적 유전자 편집을 사용한 β2M의 낙아웃을 위한 최적화된 조건의 확인이 보고된다. β2M의 낙아웃을 제1 전기천공법 또는 제2 전기천공법에서 수행할 수 있다. TCR의 낙다운을 일반적으로 제2 전기천공법에서 또는 형질도입 이전에 수행하여, CD70 CAR의 HDR-매개된 삽입을 보장한다. CD70의 낙아웃을 일반적으로 초기 전기천공법에서 수행하여, CD70 CAR의 삽입 이전에 가능한 세포-대-세포 동족살해를 방지한다.
요약하여, 유전학적으로 조작된 T 세포를 소규모 공정에서 제조하였으며, 여기서, β2M을 표적화하는 RNP 복합체가 형성되었으며, 단일의 전기천공법 또는 2-단계 전기천공법 공정을 통해 T 세포 내로 도입하였다. 상세사항에 대해서는 상기 실시예 2를 참조한다.
제1 전기천공법에서의 β2M의 낙아웃을 위하여, CD70 및 β2M 유전자를 표적화하는 RNP 복합체를 제1 전기천공법에서 T 세포 내로 도입하였으며, PD1 및 TRAC 유전자를 표적화하는 RNP 복합체를 제2 전기천공법에서 T 세포 내로 도입하였다. 제2 전기천공법에서 β2M의 낙아웃을 위하여, CD70 및 PD1 유전자를 표적화하는 RNP 복합체를 제1 전기천공법에서 T 세포 내로 도입하였으며, β2M 및 TRAC 유전자를 표적화하는 RNP 복합체를 제2 전기천공법에서 T 세포 내로 도입하였다. 또한, CD70, PD1, β2M 및 TRAC 유전자를 표적화하는 RNP 복합체를 사용하여 단일의 전기천공법 이벤트에서 T 세포를 전기천공시켰다.
표 6에 나타낸 바와 같이, β2M을 표적화하는 RNP 복합체가 제1 전기천공법에서 포함되는 경우, T 세포를 48시간 동안 활성화시키든지 72시간 동안 활성화시키든지와 관계 없이, 잔류 β2M+ 발현은 형질도입 7일 후에 약 60%였다. β2M을 표적화하는 RNP 복합체가 단일의 전기천공법에 또는 제2 전기천공법에 포함되는 경우, 잔류 β2M+ 발현은 약 20%였다(표 6). 잔류 CD70+ 발현은 형질도입 7일 후에 검출 가능하지 않았다(표 7). 잔류 CD70+ 발현 세포는 CD70을 표적화하는 RNP 복합체를 사용한 낙아웃에 의해 제거되거나, CD70 CAR+ 세포에 의해 제거될 수 있다. 시험된 각각의 β2M 낙아웃 조건에 대하여 유사한 T 세포 성장 및 T 세포 생존력이 관찰되었다(도 1).
Figure pct00008
Figure pct00009
이들 결과는 제2 전기천공법 단계에서 β2M을 표적화하는 RNP 복합체를 도입하는 것이 CD70의 효율적인 낙아웃 또는 세포 성장 및 세포 생존력을 유지하면서, β2M의 뛰어난 낙아웃을 제공하였음을 입증하였다. PD1을 표적화하는 RNP 복합체가 전기천공법에 포함되지 않았던 경우에 유사한 결과가 관찰되었다.
실시예 4 : T 세포 전기천공법을 위한 최적화된 조건의 확인
본 실시예에는 CRISPR-Cas9 의존적 유전자 편집을 위한 다수의 RNP 복합체를 전기천공법을 통해 T 세포 내로 도입하기 위한 최적화된 조건의 확인이 보고된다.
요약하여, 유전학적으로 조작된 T 세포를 소규모 공정에서 제조하였으며, 여기서, RNP 복합체가 단일의 전기천공법 또는 2-단계 전기천공법 공정을 통해 T 세포 내로 도입되었다. 상세사항에 대해서는 상기 실시예 2를 참조한다. 전좌율을 ddPCR에 의해 결정하였다.
1회의 전기천공법을 사용하여 유전학적으로 조작된 T 세포는 PD1 및 CD70을 표적화하는 RNP 복합체를 제1 전기천공법에서 함께 조합한 경우를 제외하고, 2 단계로 전기천공된 것들보다 유의미하게 더 높은 전좌율을 보였다(도 2a). CD70을 표적화하는 gRNA를 (RNP 복합체를 통해) 제1 전기천공법에서 전달한 경우, 전좌율은 2% 미만이었다. 도 2a 및 도 2b를 참조한다. 4가지 RNP 복합체로 함께 전기천공시킨 T 세포의 세포유전 분석에 의해, 전좌가 PD1(염색체 2), β2M(염색체 15), TCR(염색체 14) 및 CD70(염색체 19)을 수용하는 염색체에서 발생할 가능성이 있는 것으로 드러났다(데이터 미도시).
종합하여, 이들 결과는 2 단계로 수행되는 전기천공법을 통해 RNP 복합체를 도입함으로써 더 낮은 전좌율이 달성될 수 있음을 입증하였다. PD1을 표적화하는 RNP 복합체가 전기천공법에 포함되지 않았던 경우에 유사한 결과가 관찰되었다.
실시예 5 : 유전학적으로 파괴된 CD70 , TRAC 및 β2M 유전자를 갖는, 항-CD70 CAR을 발현하는 유전학적으로 조작된 T 세포를 제조하기 위한 제조 공정 개발(CTX130).
개요
CTX130은 CRISPR-Cas9(클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부/CRISPR 연관 단백질 9) 유전자 편집 구성성분(sgRNA 및 Cas9 뉴클레아제)을 사용하여 생체외에서 유전학적으로 변형된 동종이계 T 세포로 구성된 CD70-유도된 T 세포 면역요법이다.
변형은 T 세포 수용체 알파 불변(TRAC), β2M 및 CD70의 표적화된 파괴를 포함한다. TRAC 유전자좌의 파괴는 T 세포 수용체(TCR)의 발현의 소실을 초래하며, 이식편대숙주병(GvHD)의 가능성을 감소시키고자 하는 한편, β2M 유전자좌의 파괴는 주요 조직적합성 복합체 I형(MHC I) 단백질의 발현의 결여를 초래하며, 숙주 거부의 가능성을 감소시킴으로써 지속성을 개선시키고자 한다. CD70의 파괴는 CD70의 발현의 소실을 초래하며, 이는 CD70 CAR의 삽입 이전에 가능한 세포-대-세포 동족살해를 방지한다. 항-CD70 CAR의 부가는 변형된 T 세포를 CD70-발현 종양 세포를 향해 지향시킨다.
항-CD70 CAR은 CD70에 특이적인 항-CD70 단일-쇄 가변 단편(scFv)에 이어서, CD8 힌지, 및 4-1BB의 세포내 동시-신호전달 도메인 및 CD3ζ 신호전달 도메인에 융합된 막횡단 도메인으로 구성된다.
CTX130에 대한 예시적인 제조 공정은 도 3a에 도시되어 있다.
제조 공정의 진화
실시예 1 내지 4에 기재된 최적화된 공정에 의해 결정되는 조건에 기초하여, CTX130 제조 공정을 연구 규모, 개발 규모 및 임상 규모를 포함하는 3가지 생성 규모로 수행하였다. 연구 규모 공정을 소규모로 수행하였으며, 연구 규모 공정을 개발 규모 공정 및 임상 규모 공정을 위해 규모 확대하여 전달하였다. 초기 활동(4개 롯트)을 운영 파라미터의 실행 가능성 및 조정을 위하여 약물 물질에 대한 실험실-등급 출발 물질을 사용하여 행하였다. 이후에, 개발 규모 공정과 운영상 동일한 임상 규모 공정을 위하여, GMP-공급 출발 물질(sgRNA, Cas9 및 rAAV-145b)의 이용 및 정량적 허용 기준을 구현하였다.
출발 물질의 선택
CTX130의 생성을 위한 출발 물질은 하기를 포함한다:
- 건강한 공여자로부터 수집되는 류코팩,
- 박테리아 유래 Cas9 뉴클레아제,
- 3개의 단일 가이드 RNA(sgRNA), CD70 유전자좌를 표적화하는 CD70-7 sgRNA, TRAC 유전자좌를 표적화하는 TA-1 및 β2M 유전자좌를 표적화하는 β2M-1, 및
- 항-CD70 CAR 유전자를 인코딩하는 재조합 AAV-6 벡터(rAAV-145b).
편집된 TRAC 및 β2M 유전자좌, 및 CTX110의 유전학적 변형을 만드는 데 사용되는 구성성분에 대한 구조적 정보는 하기에 제공되어 있다:
Cas9 뉴클레아제의 아미노산 서열(SEQ ID NO:1):
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CTX130의 제조 공정 설명
(i) T 세포 농축
T 세포를 자동화 세포 처리 시스템을 사용하여 항-CD8 및 항-CD4 항체-코팅된 자성 비드의 혼합물을 사용하여 자성 분리를 통해 백혈구성분채집술 물질(류코팩)로부터 농축시켰다. 농축 전에, 류코팩을 세포 계수 및 생존력(80% 이상)을 위하여 샘플링하였다.
농축된 세포를 HSA가 존재하는 PBS/EDTA 완충제에서 단리한 다음, 세포 계수, 생존력(80% 이상), T 세포 순도(70% 이상 CD3) 및 무균성을 위하여 샘플링하였다. 이어서, 세포를 4 ± 1℃에서 원심분리하고, 50×106개의 생존 가능한 세포/㎖의 표적 농도로 CryoStor CS5 중에 재현탁화시켰다.
(ii) T 세포 동결보존
세포를 세포 계수, 생존력(80% 이상)을 위해 샘플링한 다음, 2,500×106개 세포/백(30 내지 70 ㎖의 세포 현탁액)의 표적 세포 수로 에틸 비닐 아세테이트 냉동백 내로 분취하였다. 1 내지 2개의 백의 T 세포를 생성하는 데 하나의 류코팩이 충분할 수 있다. 각각의 백을 열-밀봉하고, 표지하고, 제어-속도 냉동기로 옮길 때까지 2 내지 8℃에서 보관한 다음, 보관을 위하여 증기상 액체 질소로 옮긴다.
(iii) T 세포 해동, 제1 전기천공법 및 활성화
하나의 동결된 백의 농축된 T 세포를 해동시키고, 3ℓ 백으로 옮기고, 보충된 X-VIVO™ 15 배지(X-VIVO™ 15, 5% 인간 혈청, 100 IU/㎖ rhIL2, 100 IU/㎖ rhIL7) 내로 희석하였다. 세포를 세포 계수 및 생존력(70% 이상)을 위하여 샘플링하였다.
세포를 540 g에서 20 ± 1℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 세포 펠렛을 전기천공법 완충제 중에 재현탁화시키고, 동일한 조건 하에 다시 원심분리하였다. 세포를 두번째로 300x106개 세포/㎖의 표적 농도까지 전기천공법 완충제 중에 재현탁화시켰다.
Cas9 뉴클레아제를 마이크로원심분리 튜브에서 CD70-7 sgRNA와 혼합하고, 실온에서 10분 이상 동안 인큐베이션시켜, 리보핵단백질(RNP) 복합체를 형성하였다. 이어서, Cas9/sgRNA를 세포와 혼합하여, Cas9 및 CD70-7 sgRNA가 각각 0.15 ㎎/㎖ 및 0.16 ㎎/㎖의 최종 농도가 되게 하였다.
혼합물을 피펫팅에 의해 분취하고, 전기천공법 카세트 내로 로딩하였다. 카세트를 캡핑하고, 순차적으로 유동 전기천공법에 기초한 트랜스펙션 시스템을 사용하여 전기천공시켰다.
전기천공법 후에, 세포를 125 ㎖ 삼각 플라스크에서 각각의 카세트로부터 풀링하고, 37℃에서 20분 이상 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 생존력(50% 이상) 및 계수를 위하여 샘플링하였다. 이어서, 재조합 인간화된 CD3 및 CD28 효능제에 컨쥬게이트된 가용성 콜로이드성 폴리머 나노매트릭스 용액을 1:12.5(v/v)의 비로 첨가하여, 세포를 활성화시켰다.
세포를 정적 세포 배양 용기 내에, 각각 대략 500 ㎖의 총 부피의 보충된 X-VIVO™ 15 배지/재조합 인간화된 CD3 및 CD28 효능제에 컨쥬게이트된 콜로이드성 폴리머 나노매트릭스로, 2×106개의 생존 가능한 세포/㎖의 표적 밀도로 씨딩하였다.
정적 세포 배양 용기를 37 ± 1℃ 및 5 ± 1% CO2에서 72 ± 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 공정 내내, 정적 세포 배양 용기를 취급할 때는 언제나, 이들을 구멍 및 누수, 및 투명한 황색 배지의 존재에 대하여 검사하였다.
(iv) 희석
삼(3)일 후에, 보충된 X-VIVO™ 15 배지를 각각의 정적 세포 배양 용기에 5 ℓ의 최종 부피까지 첨가하였다. 세포를 37 ± 1℃ 및 5 ± 1% CO2에서 하룻밤 추가로 인큐베이션시켰다.
(v) 제2 전기천공법 및 형질도입
보충된 X-VIVO™ 15 배지의 부피를 정적 세포 배양 용기 딥-튜브에 연결된 펌프를 사용하여 대략 500 ㎖의 최종 부피로 감소시켰다.
정적 세포 배양 용기를 세포가 배지 중에 재현탁화되도록 온건하게 와류시켰다. 세포를 세포 계수, 생존력(70% 이상)을 위해 샘플링하였다.
세포를 500 ㎖ 원심분리용 튜브로 옮기고, 540 g, 20 ± 1℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 세포 펠렛을 전기천공법 완충제 중에 재현탁화시키고, 동일한 조건 하에 다시 원심분리하였다. 세포를 두번째로 300×106개 세포/㎖의 표적 농도로 전기천공법 완충제 중에 재현탁화시켰다.
개별 마이크로원심분리용 튜브에서 Cas9 뉴클레아제를 TA-1 sgRNA와, 그리고 β2M-1 sgRNA와 혼합하였다. 각각의 용액을 10분 이상 동안 실온에서 인큐베이션시켜, 각각의 리보핵단백질(RNP) 복합체를 형성하였다. 2가지 Cas9/sgRNA 혼합물을 조합하고, 세포와 혼합하여, Cas9, TA-1 및 β2M-1이 각각 0.3 ㎎/㎖, 0.08 ㎎/㎖ 및 0.2 ㎎/㎖의 최종 농도가 되게 하였다.
혼합물을 피펫팅에 의해 분취하고, 전기천공법 카세트 내로 로딩하였다. 카세트를 캡핑하고, 순차적으로 유동 전기천공법에 기초한 트랜스펙션 시스템을 사용하여 전기천공시켰다.
전기천공법 후에, 세포를 125 ㎖ 삼각 플라스크에서 각각의 카세트로부터 풀링하고, 37℃에서 20분 이상 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 생존력(70% 이상) 및 계수를 위하여 샘플링하였다. 세포를 X-VIVO™ 15 배지를 사용하여 1x107개 세포/㎖의 표적으로 희석하고, 신선하게 해동된 rAAV-145b를 20,000 내지 50,000 vg/세포의 MOI로 첨가하였다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 60분 이상 동안 인큐베이션시켰다.
(vi) 세포 증량
세포를 보충된 X-VIVO™ 15 배지를 사용하여 희석하고, 세포 생존력(70% 이상) 및 계수를 위하여 샘플링하고, 2개의 정적 세포 배양 용기 및 세포 모니터링을 위한 위성 배양물로서 기능하는 하나의 더 작은 세포 정적 세포 배양 용기 내로 0.2 × 106개의 생존 가능 세포/㎠ 내지 0.5 × 106개의 생존 가능 세포/㎠의 밀도로 씨딩하였다. 정적 세포 배양 용기를 37 ± 1℃ 및 5 ± 1% CO2에서 인큐베이션시켰다.
세포 배양물을 최대 9일 동안 인큐베이션시켰다. 이 시간 동안 배양물에, 배양 부피 ㎖당 100 IU의 rhIL2 및 rhIL7을 3일 내지 4일마다 보충하였다.
위성 세포 배양물을 증량 내내 세포 계수, 생존력 및 T 세포 순도에 대하여 시험하였다. 위성 배양물 내의 세포 밀도가 대략 30×106개/㎠에 도달하는 때, TCRαβ 고갈을 수행하였다. 위성의 세포 밀도가 30×106개/㎠에 도달하지 않는다면, 주 배양물에서 TCRαβ 고갈을 제9일에 수행하였다.
(vii) TCRαβ 고갈
각각의 정적 세포 배양 용기의 배지를 정적 세포 배양 용기 딥-튜브에 연결된 펌프를 사용하여 대략 500 ㎖의 최종 부피로 감소시켰다. 대량의 배지를 제거한 후에, 정적 세포 배양 용기를 온건하게 와류시켜, 세포를 배지 중에 재현탁화시켰다.
세포를 정적 세포 배양 용기에 연결하는 딥-튜브와 핏팅된 500 ㎖ 원심분리용 튜브로 옮겼다. 세포를 생존력(70% 이상), 계수 및 %CAR를 위하여 샘플링하였다. 그 다음, 세포를 540 g에서, 20 ± 1℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 세포 펠렛을 재현탁화시키고, 0.5% HSA를 함유하는 650 ㎖ 미만의 PBS/EDTA 중에 풀링하였다. 세포 현탁액을 멸균 백으로 옮겼으며, 이는 자동화 세포 처리 시스템에 연결된다. 자동화 세포 처리 시스템에서, 세포를 비오틴-컨쥬게이트된 항-TCRαβ 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 세포를 세척하고, 항-비오틴 자성 비드와 함께 인큐베이션시켜, 자동화 세포 처리 시스템을 사용하여 TCRαβ+ 세포의 고갈을 가능하게 하였다.
세포를 세포 계수, 생존력(70% 이상) 및 %CAR 세포에 대하여 시험하였다.
(viii) 세포 회복
고갈된 세포를 보충된 X-VIVO™ 15 배지 중에 재현탁화시키고, 3ℓ 백(들)으로 옮기고, 정적 세포 배양 용기(들) 내로 씨딩하고, 37 ± 1℃ 및 5 ± 1% CO2에서 하룻밤 인큐베이션시켰다.
(ix) 세포 수거(약물 물질)
세포를 수거하기 위하여, 정적 세포 배양 용기를 인큐베이터로부터 제거하고, 세포의 침강을 위하여 휴지되게 하였다. 성장 배지를 펌프를 사용하여 대략 500 ㎖의 최종 부피까지 각각의 정적 세포 배양 용기로부터 제거하였다. 제거된 배지를 무균성을 위해 샘플링하였다.
정적 세포 배양 용기를 온건하게 와류시켜, 세포가 배지 중에 재현탁화되게 하였다. 각각의 정적 세포 배양 용기의 내용물을 펌프를 사용하여 3 ℓ 전달 백으로 옮기고, 농도, 생존력 및 약물 물질 롯트 출하 시험을 위하여 샘플링하였다. 이어서, 세포를 중력에 의해 40 ㎛ 수혈 필터를 통해 개별 무균 3 ℓ 백 내로 여과하였다.
CTX130의 특성화
CTX130은 유전학적으로 파괴된 CD70, TRAC 및 β2M 유전자를 갖는 항-CD70 CAR을 발현하는 동종이계 T 세포로 구성된 CD70-유도된 T 세포 면역요법이다. 비임상 약리학 및 독성학 연구를 행하여, CTX130의 비-GMP 개발 롯트의 잠재적인 효능 및 독성을 특성화하였다.
CTX130의 비-GMP 개발 롯트의 생성 및 특성화
본 연구의 목적은 비-GMP CD70 CAR T 세포의 재현 가능한 생성이 본원에 기재된 방법을 사용하여 달성되었는지 여부를 결정하는 것이었다.
초기 단계에서 Cas9 및 CD70에 대한 gRNA를 함유하는 RNP에 이어서 제2 단계에서 Cas9, 및 TRAC 및 β2M에 대한 gRNA를 함유하는 RNP에 이어서 CAR을 인코딩하는 공여자 주형을 함유하는 AAV6으로의 형질도입을 사용하여 3명의 개별 인간 T 세포 공여자를 편집하여, CTX130의 비-GMP 개발 롯트를 생성하였다. 세포를 이후에 컬럼 정제를 사용하여 남아 있는 잔류 TCR+ 세포에 대하여 고갈시켰다.
요약하여, 3명의 개별 공여자로부터의 T 세포를 해동시키고, Cas9 및 CD70 유전자좌를 표적화하는 gRNA를 함유하는 RNP와 함께 전기천공시킨 다음, 재조합 인간화된 CD3 및 CD28 효능제에 컨쥬게이트된 콜로이드성 폴리머 나노매트릭스를 사용하여 3일 동안 활성화시켰다. 제4일에, 비드를 희석하고, T 세포를 하루 더 증량되게 하였다. 제5일에, 세포를 Cas9, 및 TRAC 및 β2M 유전자좌를 표적화하는 gRNA를 함유하는 RNP와 함께 전기천공법으로 처리한 후에, CD70 CAR을 함유하는 HDR 주형을 함유하는 AAV6과 함께 인큐베이션시켰다. 제2 유전자 편집 단계 10일 후에, 세포를 유세포측정기를 사용하여 분석하여, TRAC, β2M 및 CD70의 낙아웃 효율 및 CAR을 발현하는 세포의 백분율을 평가하였다. TRAC, β2M 및 CD70 단백질에 대한 항체를 사용하여 염색을 수행하는 한편, CAR 발현을 비오틴으로 표지된 항-마우스 Fab2 항체를 사용한 염색에 이어서 형광 스트렙트아비딘과의 인큐베이션을 통해 검출하였다.
편집된 세포의 분석에 의해, 99.7 ± 0.1%의 TRAC 음성 세포, 79.4 ± 1.1%의 β2M 음성 세포 및 98.9 ± 0.3%의 CD70- 세포가 나타났다(표 13). CAR 발현이 3명의 시험된 공여자에서 80.8 ± 8.4%의 세포에서 검출되었다(표 13). CTX130의 추가의 연구 롯트를 동일한 공정을 사용하여 제4 공여자(공여자 4)를 사용하여 생성하였지만, 연구 롯트는 남아 있는 잔류 TCR+ 세포에 대하여 고갈시키지 않았다.
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(i) 이펙터 사이토카인 방출
본 연구의 목적은 CD70+ 또는 CD70- 세포와 동시-배양하는 경우, 인터페론-감마(IFNγ) 및 인터류킨 2(IL-2)를 분비하는 CTX130 세포의 능력을 평가하는 것이었다.
인간 표적 세포(CD70+ 세포주 A498 및 ACHN, 및 CD70- 세포주 MCF7)를 96-웰 플레이트에서 웰당 50,000개의 표적 세포로 T 세포와 다양한 비(0.125:1 내지 4:1의 T 세포 대 표적 세포)로 24시간 동안 동시-배양하였다. 표적 세포를 CTX130 세포 또는 대조군 세포(비편집된 T 세포)와 함께 인큐베이션시켰다. 배양 배지 상청액 중 IFNγ 및 IL-2의 수준을 측정하였으며, CTX130은 CD70+와 동시-배양되는 경우에는 IFNγ 및 IL-2를 분비하는 능력을 갖지만, CD70- 세포와 동시-배양되는 경우에는 그렇지 않은 것이 입증되었다.
(ii) 종양 세포 세포독성
본 연구의 목적은 CD70+ 세포를 사멸시키는 CTX130 세포의 능력을 평가하는 것이었다. 요약하여, 인간 표적 CD70+ 세포(A498 및 ACHN)를 96-웰 플레이트에서 웰당 50,000개의 표적 세포로 하룻밤 플레이팅한 다음, CTX130 또는 비편집된 T 세포와 다양한 비(0.125:1 내지 4:1의 T 세포 대 표적 세포)로 24시간 동안 동시-배양하였다. 표적 세포의 사멸을 측정하였으며, CTX130 세포가 시험관 내에서 CD70+ 세포주를 사멸시켰음이 입증되었다.
(iii) 기타 연구
기타 연구는 신장 세포 암종 및 세자리 증후군의 피하 모델에서 종양 세포 성장을 제한하는 CTX130 세포의 능력을 보여주었으며, CTX130 처리가 생존, GvHD의 임상적 징후 및 체중을 포함하는 측정되는 종점의 각각에 관하여 마우스에 의한 내약성이 좋았음을 입증하였다.
(iv) 인간 조직 교차 반응성
본 연구의 목적은 면역조직화학-기반의 조직 교차-반응성 연구에서 CTX130에 함유된 항-CD70 CAR의 선택성을 평가하는 것이었다. 본 연구에서 사용되는 시험 물품은 CTX130의 scFv 부분이 유래되었던 항체였다. 인간 조직으로의 임의의 잠재적인 결합을 포획하기 위한 시도로, 32개의 인간 조직의 표준 패널을 2가지 농도의 항체에서 평가하였다: 최적의 농도(2.5 ㎍/㎖) 및 고농도(10.0 ㎍/㎖). 시험되는 각각의 조직에 있어서, 3명의 공여자로부터의 섹션을 평가하였다. 정상적인 CD70 발현 패턴과 일치하게, 최소 내지 중등도 양성 염색이 일부 림프 조직(림프절 및 편도)에서 관찰되었다. 염색이 남아 있는 패널의 조직에서 관찰되지 않았다. 강력한 염색이 양성 대조군(인간 신장 세포 암종 종양 세포)에서 관찰되었다.
(v) 사이토카인-독립적 성장
본 연구의 목적은 혈청 및 사이토카인 IL-2 및 IL-7의 부재 하에 증식하는 CTX130의 능력을 평가하는 것이다. 요약하여, 연구 롯트 및 비-GMP 개발 롯트로부터의 CTX130 세포를 완전 T 세포 배지, 혈청을 함유하지만 IL2 또는 IL7 사이토카인을 함유하지 않거나(혈청 단독), 혈청 또는 사이토카인을 함유하지 않는(기저 배지) 배지 중 어느 하나에서 성장시켰다. 제0일은 게놈 편집 후 14일에 일어난다. 사이토카인의 부재 하에 성장은 연구 롯트 및 비-GMP 개발 롯트 둘 모두에 대하여 관찰되지 않았다. 이들 결과는 게놈 편집 이후 혈청 및 사이토카인 부재 배지에서의 성장 및 증식의 결여를 보여준다.
실시예 6: 개선된 세포 증량
증가된 CTX130 세포 증량 산출을 위한 최적화된 전기천공법
본 개시에 기재된 바와 같은 방법은 전기천공법을 사용하여, 예를 들어, Cas9 및 가이드 RNA 복합체를 포함하는 다양한 리보핵단백질(RNP) 복합체를 포함하는 다양한 핵산 및 폴리펩티드를 수여자 T 세포에 전달한다. 다양한 제조처로부터의 임의의 적합한 전기천공법 기기가 본원에 기재된 방법에서 사용될 수 있기 때문에, 전기천공법 공정에 사용되는 기기는 특별히 제한되지 않는다. 전기천공법에 사용되는 세포 씨딩 밀도는 특별히 제한되지 않는다.
본 실시예는 효율적인 편집을 유지하면서, 더 큰 부피를 유지할 수 있는 카세트에서 증가된 수의 세포를 전기천공시킬 수 있는 전기천공법 기기를 사용한다. 더 큰 전기천공법 용량은 형질도입 및 증량을 위하여 더 많은 수의 편집된 세포를 제공함으로써, 임의의 제공된 조작된 T-세포, 예를 들어, CTX130 조작된 T-세포 생성물의 산출을 예를 들어, 2배만큼 증가시킨다. 이 증가된 용량이 세포 배가 및 또는 공정 기간을 연장할 필요 없이 제공되기 때문에, 이는 제조에서 유리하다.
예를 들어, 추가의 세포가 추가의 T-세포 배양 용기(5000 ㎖ 배지 용량을 갖는 500 ㎠ 기체 투과성 막 표면적), 예컨대 2개 이상의 추가의 배양 용기를 씨딩하는 데 이용 가능하다. 예를 들어, 증가된 수의 세포를 사용하여, 최대 4x 배양 용기가 씨딩될 수 있으며, 여기서, 300e6 ≤ x ≤ 600e6개의 세포가 2x 배양 용기에 씨딩될 수 있거나, 600e6 ≤ x ≤ 800e6개의 세포가 3x 배양 용기에 씨딩될 수 있거나, 800e6개 이하의 세포가 4x 배양 용기에 씨딩될 수 있다.
일부 양태에서, 배양 용기당 약 400,000개 세포/㎠ 내지 500,000개 세포/㎠를 씨딩한다. 대안적으로, 배양 용기당 약 250,000개 세포/㎠ 내지 500,000개 세포/㎠가 씨딩되거나, 배양 용기당 약 300,000개 세포/㎠ 내지 500,000개 세포/㎠가 씨딩되거나, 배양 용기당 약 150,000개 세포/㎠ 내지 250,000개 세포/㎠가 씨딩되거나, 배양 용기당 약 150,000개 세포/㎠ 내지 500,000개 세포/㎠가 씨딩되거나, 배양 용기당 약 150,000개 세포/㎠ 내지 600,000개 세포/㎠가 씨딩된다.
일부 양태에서, 표적 씨딩 밀도는 적어도 약 150,000개 세포/㎠, 또는 적어도 약 250,000개 세포/㎠, 또는 적어도 약 300,000개 세포/㎠, 또는 적어도 약 400,000개 세포/㎠, 또는 적어도 약 500,000개 세포/㎠이다.
일부 양태에서, 표적 씨딩 밀도는 약 250,000개 세포/㎠이다. 다른 양태에서, 표적 씨딩 밀도는 약 500,000개 세포/㎠이다.
최대 1 ㎖의 부피를 유지할 수 있는 전기천공법 카세트가 사용될 수 있다. 이 시스템을 사용하여, 2.7 x 109개의 세포를 최대 7개의 G1000 카세트에서 전기천공시킬 수 있다. 3 ㎖ 주사기에 부착된 일회용 블런트 팁 니들을 사용한 카세트로부터의 세포의 회수는 삼각 플라스크 내로의 마이크로피펫 팁의 방출의 위험을 없앨 것이다.
더 큰 용량을 갖는 시스템의 이용도 또한 세포 형질도입 단계를 용이하게 한다. 형질도입을 위한 현재의 최대 7e8개의 세포에서 1.4e9개의 세포로의 배가는 증량을 위하여 최대 4개의 세포 배양 용기를 씨딩하기에 충분한 물질을 생성한다. 따라서, 고정된 제9일 고갈을 유지하여, 효율적으로 동일한 양의 처리 시간에 실행당 산출량을 최대 배가시킬 수 있다.
CTX130 생성의 공정에서 다른 단계는 상기 실시예에 기재된 바와 같다.
균등물
본 발명의 여러 실시형태가 본원에 기술되고 예시되었지만, 당업자는 기능을 수행하고/수행하거나 본원에 기술된 결과 및/또는 하나 이상의 이점을 얻기 위한 다양한 다른 수단 및/또는 구조를 용이하게 구상할 것이고, 이러한 각각의 변화 및/또는 수정은 본원에 기재된 본 발명의 실시형태의 범위 내에 있는 것으로 여겨진다. 보다 일반적으로, 당업자는 본원에 기재된 모든 매개변수, 치수, 재료 및 구성이 예시적인 것을 의미하고, 실제 매개변수, 치수, 재료 및/또는 구성이 특정 적용 또는 본 발명의 교시(들)가 이용되는 적용에 좌우될 것임을 용이하게 인지할 것이다. 당업자는 단지 일상적인 실험을 이용하여 본원에 기재된 구체적인 본 발명의 실시형태에 대한 많은 균등물을 인식하거나 알아낼 수 있을 것이다. 따라서, 전술한 실시형태는 단지 예로서 제시된 것이며, 첨부된 청구항 및 이에 대한 균등물의 범위 내에서 본 발명의 실시형태는 구체적으로 기술되고 청구된 것과 달리 실시될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 본 개시의 창의적 실시형태는 본원에 기재된 각각의 개별적인 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트, 및/또는 방법에 관한 것이다. 또한, 이러한 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트, 및/또는 방법이 서로 일치하지 않는 경우, 둘 이상의 이러한 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트 및/또는 방법의 임의의 조합은 본 개시의 발명의 범위 내에 포함된다.
본원에 정의되고 사용되는 모든 정의는 사전 정의, 참조로 포함된 문서의 정의, 및/또는 정의된 용어의 일반적인 의미보다 우선되는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 개시된 모든 참고문헌, 특허 및 특허 출원은 각각이 인용된 주제와 관련하여 참조로 포함되며, 일부 경우에는 문서 전체를 포함할 수 있다.
본 명세서 및 청구항에서 사용되는 단수형 부정 관사는 달리 상반되게 분명히 표시되지 않는 한 "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서 및 청구항에서 본원에 사용되는 문구 "및/또는"은 이와 같이 결합된 요소, 즉, 일부 경우에 결합적으로 존재하고 다른 경우에 별개로 존재하는 요소의 "어느 하나 또는 둘 모두"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는"으로 나열된 다수의 요소들은 동일한 방식으로, 즉, 이와 같이 결합된 요소 중 "하나 이상"으로 해석되어야 한다. 구체적으로 확인된 요소와 관련이 있는지 여부에 관계없이 "및/또는" 절에 의해 구체적으로 확인된 요소 이외의 다른 요소가 선택적으로 존재할 수 있다. 따라서, 비-제한적 예로서, "A 및/또는 B"에 대한 언급은 "포함하는"과 같은 개방형 언어와 함께 사용될 때, 일 실시형태에서, A만(선택적으로 B 이외의 요소 포함); 또 다른 실시형태에서, B만(선택적으로 A 이외의 요소 포함); 추가의 또 다른 실시형태에서, A와 B 둘 모두(선택적으로 다른 요소 포함) 등을 지칭할 수 있다.
본 명세서 및 청구항에서 본원에 사용되는 "또는"은 상기 정의된 바와 같은 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록에서 항목을 분리할 때, "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적인, 즉, 다수의 요소들 또는 요소들의 목록, 및, 선택적으로 추가의 나열되지 않은 항목 중 또한 하나 초과를 포함하여 적어도 하나의 포함인 것으로 해석되어야 한다. "~ 중 하나만" 또는 "~ 중 정확히 하나"와 같이 상반되게 분명히 지시되는 용어, 또는 청구항에서 사용되는 경우, "~로 이루어진"만이 다수 요소들 또는 요소들의 목록 중 정확히 하나의 요소의 포함을 지칭할 것이다. 일반적으로, 본원에서 사용되는 용어 "또는"은 "~ 중 어느 하나", "~ 중 하나", "~ 중 하나만", 또는 "~ 중 정확히 하나"와 같은 배제적인 용어가 선행하는 경우에 배제적인 대안(즉, "둘 모두가 아니라 하나 또는 다른 하나")을 지시하는 것으로만 해석되어야 한다. 청구항에 사용되는 "~로 본질적으로 이루어진"은 특허법 분야에서 사용되는 바와 같은 일반적인 의미를 갖는다.
본 명세서 및 청구항에서 본원에 사용되는, 하나 이상의 요소의 목록과 관련하여 문구 "적어도 하나"는, 반드시 요소의 목록 내에 구체적으로 나열되고 요소의 목록의 요소의 임의의 조합을 배제하지 않는 각각의 및 모든 요소 중 적어도 하나를 포함하는 것은 아니지만, 요소의 목록에서 요소 중 어느 하나 이상의 요소로부터 선택된 적어도 하나의 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 정의는 또한 문구 "적어도 하나"가 지칭하는 요소들의 목록 내에서, 구체적으로 확인된 요소들과 관련이 있든 아니든 간에, 구체적으로 확인된 요소들 이외의 요소들이 선택적으로 존재할 수 있다는 것을 허용한다. 따라서, 비-제한적 예로서, "A 및 B 중 적어도 하나"(또는, 동등하게, "A 또는 B 중 적어도 하나", 또는 동등하게 "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는, 일 실시형태에서, B가 존재하지 않지 않으면서, 선택적으로 하나 초과를 포함하여 적어도 하나의 A(및 선택적으로 B 이외의 요소를 포함함); 또 다른 실시형태에서, A가 존재하지 않지 않으면서, 선택적으로 하나 초과를 포함하여 적어도 하나의 B(및 선택적으로 A 이외의 요소를 포함함); 추가의 또 다른 실시형태에서, 선택적으로 하나 초과를 포함하여 적어도 하나의 A, 및 선택적으로 하나 초과를 포함하여 적어도 하나의 B(및 선택적으로 다른 요소를 포함함) 등을 지칭할 수 있다.
또한, 달리 상반되게 분명히 지시되지 않는 한, 하나 초과의 단계 또는 행위를 포함하는 본원에 청구된 임의의 방법에서, 방법의 단계 또는 행위의 순서는 반드시 방법의 단계 또는 행위가 언급되는 순서로 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> CRISPR Therapeutics AG <120> METHODS OF MANUFACTURING CAR-T CELLS <130> 095136-0146-003WO1 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 62/934,999 <151> 2019-11-13 <160> 66 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1368 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 1 Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val 1 5 10 15 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 20 25 30 Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 35 40 45 Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 50 55 60 Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 85 90 95 Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys 100 105 110 His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr 115 120 125 His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp 130 135 140 Ser Thr Asp Lys Ala Asp 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 46 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 20 25 30 Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr 65 70 75 80 Tyr Ala Asp Ala Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser 85 90 95 Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Asp Tyr Gly Met Asp Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asp Ile Val Met Thr 145 150 155 160 Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile 165 170 175 Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Met 180 185 190 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 195 200 205 Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 210 215 220 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu 225 230 235 240 Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Glu Val Pro Trp Thr 245 250 255 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ala Ala Ala Phe Val 260 265 270 Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro 275 280 285 Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro 290 295 300 Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu 305 310 315 320 Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys 325 330 335 Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg 340 345 350 Asn Arg Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro 355 360 365 Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys 370 375 380 Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe 385 390 395 400 Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu 405 410 415 Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp 420 425 430 Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys 435 440 445 Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala 450 455 460 Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys 465 470 475 480 Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr 485 490 495 Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 500 505 <210> 47 <211> 735 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 47 Cys Ala Gly Gly Thr Cys Cys Ala Gly Thr Thr Gly Gly Thr Gly Cys 1 5 10 15 Ala Ala Ala Gly Cys Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Ala Gly Gly Thr 20 25 30 Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Cys Cys Cys Gly Gly Cys Gly Cys Thr 35 40 45 Thr Cys Cys Gly Thr Gly Ala Ala Gly Gly Thr Gly Thr Cys Cys Thr 50 55 60 Gly Thr Ala Ala Gly Gly Cys Gly Thr Cys Cys Gly Gly Thr Thr Ala 65 70 75 80 Thr Ala Cys Gly Thr Thr Cys Ala Cys Gly Ala Ala Cys Thr Ala Cys 85 90 95 Gly Gly Gly Ala Thr Gly Ala Ala Thr Thr Gly Gly Gly Thr Thr Cys 100 105 110 Gly Cys Cys Ala Ala Gly Cys Gly Cys Cys Gly Gly Gly Gly Cys Ala 115 120 125 Gly Gly Gly Ala Cys Thr Gly Ala Ala Ala Thr Gly Gly Ala Thr Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Thr Gly Gly Ala Thr Ala Ala Ala Thr Ala Cys Cys Thr 145 150 155 160 Ala Cys Ala Cys Cys Gly Gly Cys Gly Ala Ala Cys Cys Thr Ala Cys 165 170 175 Ala Thr Ala Cys Gly Cys Cys Gly Ala Cys Gly Cys Thr Thr Thr Thr 180 185 190 Ala Ala Ala Gly Gly Gly Cys Gly Ala Gly Thr Cys Ala Cys Thr Ala 195 200 205 Thr Gly Ala Cys Gly Cys Gly Cys Gly Ala Thr Ala Cys Cys Ala Gly 210 215 220 Cys Ala Thr Ala Thr Cys Cys Ala Cys Cys Gly Cys Ala Thr Ala Cys 225 230 235 240 Ala Thr Gly Gly Ala Gly Cys Thr Gly Thr Cys Cys Cys Gly Ala Cys 245 250 255 Thr Cys Cys Gly Gly Thr Cys Ala Gly Ala Cys Gly Ala Cys Ala Cys 260 265 270 Gly Gly Cys Thr Gly Thr Cys Thr Ala Cys Thr Ala Thr Thr Gly Thr 275 280 285 Gly Cys Thr Cys Gly Gly Gly Ala Cys Thr Ala Thr Gly Gly Cys Gly 290 295 300 Ala Thr Thr Ala Thr Gly Gly Cys Ala Thr Gly Gly Ala Cys Thr Ala 305 310 315 320 Cys Thr Gly Gly Gly Gly Thr Cys Ala Gly Gly Gly Thr Ala Cys Gly 325 330 335 Ala Cys Thr Gly Thr Ala Ala Cys Ala Gly Thr Thr Ala Gly Thr Ala 340 345 350 Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Cys Gly Gly Cys Ala Gly 355 360 365 Thr Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala Gly Cys 370 375 380 Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Thr Thr Cys Thr Gly 385 390 395 400 Gly Thr Gly Ala Cys Ala Thr Ala Gly Thr Thr Ala Thr Gly Ala Cys 405 410 415 Cys Cys Ala Ala Thr Cys Cys Cys Cys Ala Gly Ala Thr Ala Gly Thr 420 425 430 Thr Thr Gly Gly Cys Gly Gly Thr Thr Thr Cys Thr Cys Thr Gly Gly 435 440 445 Gly Cys Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Cys Ala Ala Cys Gly Ala Thr 450 455 460 Thr Ala Ala Thr Thr Gly Thr Cys Gly Cys Gly Cys Ala Thr Cys Ala 465 470 475 480 Ala Ala Gly Ala Gly Cys Gly Thr Thr Thr Cys Ala Ala Cys Gly Ala 485 490 495 Gly Cys Gly Gly Ala Thr Ala Thr Thr Cys Thr Thr Thr Thr Ala Thr 500 505 510 Gly Cys Ala Thr Thr Gly Gly Thr Ala Cys Cys Ala Gly Cys Ala Ala 515 520 525 Ala Ala Ala Cys Cys Cys Gly Gly Ala Cys Ala Ala Cys Cys Gly Cys 530 535 540 Cys Gly Ala Ala Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Thr Cys Thr Ala 545 550 555 560 Cys Thr Thr Gly Gly Cys Thr Thr Cys Ala Ala Ala Thr Cys Thr Thr 565 570 575 Gly Ala Gly Thr Cys Thr Gly Gly Gly Gly Thr Gly Cys Cys Gly Gly 580 585 590 Ala Cys Cys Gly Ala Thr Thr Thr Thr Cys Thr Gly Gly Thr Ala Gly 595 600 605 Thr Gly Gly Ala Ala Gly Cys Gly Gly Ala Ala Cys Thr Gly Ala Cys 610 615 620 Thr Thr Thr Ala Cys Gly Cys Thr Cys Ala Cys Gly Ala Thr Cys Ala 625 630 635 640 Gly Thr Thr Cys Ala Cys Thr Gly Cys Ala Gly Gly Cys Thr Gly Ala 645 650 655 Gly Gly Ala Thr Gly Thr Ala Gly Cys Gly Gly Thr Cys Thr Ala Thr 660 665 670 Thr Ala Thr Thr Gly Cys Cys Ala Gly Cys Ala Cys Ala Gly Thr Ala 675 680 685 Gly Ala Gly Ala Ala Gly Thr Cys Cys Cys Cys Thr Gly Gly Ala Cys 690 695 700 Cys Thr Thr Cys Gly Gly Thr Cys Ala Ala Gly Gly Cys Ala Cys Gly 705 710 715 720 Ala Ala Ala Gly Thr Ala Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ala Ala 725 730 735 <210> 48 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Ala Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Tyr Gly Asp Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser 130 135 140 Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser 145 150 155 160 Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln 165 170 175 Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu 180 185 190 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 195 200 205 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr 210 215 220 Tyr Cys Gln His Ser Arg Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr 225 230 235 240 Lys Val Glu Ile Lys 245 <210> 49 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 49 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Ala Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Tyr Gly Asp Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 50 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 50 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 51 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 51 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 <210> 52 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 52 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro 20 <210> 53 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 53 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro 20 <210> 54 <211> 84 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 54 Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro 1 5 10 15 Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu 20 25 30 Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg 35 40 45 Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly 50 55 60 Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn 65 70 75 80 His Arg Asn Arg <210> 55 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 55 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr 20 <210> 56 <211> 126 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 56 aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60 actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120 gaactg 126 <210> 57 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 57 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 58 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 58 tcaaagcgga gtaggttgtt gcattccgat tacatgaata tgactcctcg ccggcctggg 60 ccgacaagaa aacattacca accctatgcc cccccacgag acttcgctgc gtacaggtcc 120 <210> 59 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 59 Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro 1 5 10 15 Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro 20 25 30 Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 35 40 <210> 60 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 60 cgagtgaagt tttcccgaag cgcagacgct ccggcatatc agcaaggaca gaatcagctg 60 tataacgaac tgaatttggg acgccgcgag gagtatgacg tgcttgataa acgccggggg 120 agagacccgg aaatgggggg taaaccccga agaaagaatc cccaagaagg actctacaat 180 gaactccaga aggataagat ggcggaggcc tactcagaaa taggtatgaa gggcgaacga 240 cgacggggaa aaggtcacga tggcctctac caagggttga gtacggcaac caaagatacg 300 tacgatgcac tgcatatgca ggccctgcct cccaga 336 <210> 61 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 61 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 62 <211> 800 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 62 gagatgtaag gagctgctgt gacttgctca aggccttata tcgagtaaac ggtagtgctg 60 gggcttagac gcaggtgttc tgatttatag ttcaaaacct ctatcaatga gagagcaatc 120 tcctggtaat gtgatagatt tcccaactta atgccaacat accataaacc tcccattctg 180 ctaatgccca gcctaagttg gggagaccac tccagattcc aagatgtaca gtttgctttg 240 ctgggccttt ttcccatgcc tgcctttact ctgccagagt tatattgctg gggttttgaa 300 gaagatccta ttaaataaaa gaataagcag tattattaag tagccctgca tttcaggttt 360 ccttgagtgg caggccaggc ctggccgtga acgttcactg aaatcatggc ctcttggcca 420 agattgatag cttgtgcctg tccctgagtc ccagtccatc acgagcagct ggtttctaag 480 atgctatttc ccgtataaag catgagaccg tgacttgcca gccccacaga gccccgccct 540 tgtccatcac tggcatctgg actccagcct gggttggggc aaagagggaa atgagatcat 600 gtcctaaccc tgatcctctt gtcccacaga tatccagaac cctgaccctg ccgtgtacca 660 gctgagagac tctaaatcca gtgacaagtc tgtctgccta ttcaccgatt ttgattctca 720 aacaaatgtg tcacaaagta aggattctga tgtgtatatc acagacaaaa ctgtgctaga 780 catgaggtct atggacttca 800 <210> 63 <211> 1178 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 63 ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg 60 ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt 120 gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca 180 gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc 240 gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt 300 acttccactg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga agtgggtggg 360 agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt gaggcctggc 420 ctgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt ctcgctgctt 480 tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt tttttctggc 540 aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt tttggggccg 600 cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg ggcctgcgag 660 cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct ctggtgcctg 720 gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg tcggcaccag 780 ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca aaatggagga 840 cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg gcctttccgt 900 cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg cacctcgatt 960 agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt tatgcgatgg 1020 agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac ttgatgtaat 1080 tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag cctcagacag 1140 tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtga 1178 <210> 64 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 64 aataaaatcg ctatccatcg aagatggatg tgtgttggtt ttttgtgtg 49 <210> 65 <211> 804 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 65 tggagcaaca aatctgactt tgcatgtgca aacgccttca acaacagcat tattccagaa 60 gacaccttct tccccagccc aggtaagggc agctttggtg ccttcgcagg ctgtttcctt 120 gcttcaggaa tggccaggtt ctgcccagag ctctggtcaa tgatgtctaa aactcctctg 180 attggtggtc tcggccttat ccattgccac caaaaccctc tttttactaa gaaacagtga 240 gccttgttct ggcagtccag agaatgacac gggaaaaaag cagatgaaga gaaggtggca 300 ggagagggca cgtggcccag cctcagtctc tccaactgag ttcctgcctg cctgcctttg 360 ctcagactgt ttgcccctta ctgctcttct aggcctcatt ctaagcccct tctccaagtt 420 gcctctcctt atttctccct gtctgccaaa aaatctttcc cagctcacta agtcagtctc 480 acgcagtcac tcattaaccc accaatcact gattgtgccg gcacatgaat gcaccaggtg 540 ttgaagtgga ggaattaaaa agtcagatga ggggtgtgcc cagaggaagc accattctag 600 ttgggggagc ccatctgtca gctgggaaaa gtccaaataa cttcagattg gaatgtgttt 660 taactcaggg ttgagaaaac agctaccttc aggacaaaag tcagggaagg gctctctgaa 720 gaaatgctac ttgaagatac cagccctacc aagggcaggg agaggaccct atagaggcct 780 gggacaggag ctcaatgaga aagg 804 <210> 66 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> modified with 2'-O-methyl phosphorothioate <220> <221> misc_feature <222> (97)..(100) <223> modified with 2'-O-methyl phosphorothioate <400> 66 cugcagcuuc uccaacacau guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

Claims (47)

  1. 유전학적으로 조작된 T 세포의 제조 방법으로서, 상기 방법이 하기를 포함하는 방법:
    (i) T 세포의 제1 집단을 제공하는 단계;
    (ii) 제1 Cas9 효소 및 CD70 유전자를 표적화하는 제1 가이드 RNA(gRNA)를 포함하는 제1 리보핵단백질(RNP) 복합체를 상기 T 세포의 제1 집단 내로 도입하여, T 세포의 제2 집단을 생성하는 단계로서, 상기 T 세포의 제2 집단이 파괴된 CD70 유전자를 갖는 T 세포를 포함하는 단계;
    (iii) 제2 Cas9 효소 및 T 세포 수용체 알파 사슬 불변 영역(TRAC) 유전자를 표적화하는 제2 gRNA를 포함하는 제2 RNP 복합체, 및 제3 Cas9 효소 및 베타-2 마이크로글로불린(β2M) 유전자를 표적화하는 제3 gRNA를 포함하는 제3 RNP 복합체를 상기 T 세포의 제2 집단 내로 도입하여, T 세포의 제3 집단을 생성하는 단계로서, 상기 T 세포의 제3 집단이 파괴된 CD70 유전자, 파괴된 TRAC 유전자 및 파괴된 β2M 유전자를 갖는 T 세포를 포함하는 단계;
    (iv) 상기 T 세포의 제3 집단을 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터와 함께 인큐베이션시켜, T 세포의 제4 집단을 생성하는 단계로서, 상기 AAV 벡터가 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 상기 핵산 서열은 TRAC 유전자에 대한 상동성 서열이 측접하며, 상기 T 세포의 제4 집단이 파괴된 CD70 유전자, 파괴된 TRAC 유전자 및 파괴된 β2M 유전자를 갖는, CAR을 발현하는 활성화된 T 세포를 포함하는 단계;
    (v) 상기 T 세포의 제4 집단을 증량(expanding)시킴으로써, 증량된 T 세포 집단을 생성하는 단계;
    (vi) 상기 증량된 T 세포 집단으로부터 TCRαβ+ T 세포를 제거하여, 유전학적으로 조작된 T 세포의 집단을 생성하는 단계로서, 상기 유전학적으로 조작된 T 세포의 집단이 파괴된 CD70 유전자, 파괴된 TRAC 유전자 및 파괴된 β2M 유전자를 갖는, CAR을 발현하는 T 세포를 포함하는 단계; 및
    (vii) 상기 유전학적으로 조작된 T 세포의 집단을 수거하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 T 세포의 제1 집단이 인간 혈액 세포로부터 농축된 동결보존된 T 세포로부터 유래되는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 T 세포의 제1 집단이 하기를 포함하는 프로세스에 의해 제조되는, 방법: (a) 혈액 세포를 인간 공여자로부터 수득하는 단계; 및 (b) CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포를 상기 혈액 세포로부터 농축시키는 단계.
  4. 제3항에 있어서, 단계 (b)가 항-CD4 및/또는 항-CD8 항체와 컨쥬게이트된 자성 비드를 사용하여 수행되는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포의 제1 집단이 적어도 약 80%의 세포 생존력 및/또는 적어도 약 80%의 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 순도를 갖는, 방법.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, (c) 단계 (b)에서 생성되는 농축된 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 동결보존하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii)가 전기천공법에 의해 수행되는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 제1 Cas9 효소의 농도가 약 0.15 ㎎/㎖이고, 상기 CD70 유전자를 표적화하는 제1 gRNA의 농도가 약 0.16 ㎎/㎖인, 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 단계 (ii)에서 세포 농도가 약 100x106개 세포/㎖ 내지 약 350x106개 세포/㎖인, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 단계 (ii)에서 세포 농도가 약 300 x 106개 세포/㎖인, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 증량 단계가 세포 용기에서 T 세포를 약 150,000개 세포/㎠ 내지 약 600,000개 세포/㎠, 선택적으로 약 300,000개 세포/㎠ 내지 약 500,000개 세포/㎠의 밀도로 씨딩하는 것을 포함하는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 단계 (ii) 이후에 그리고 단계 (iii) 이전에, 상기 T 세포의 제2 집단을 세포 배양 용기에서 T 세포 활성화제의 존재 하에 인큐베이션시켜, T 세포의 활성화된 집단을 생성하는 것을 추가로 포함하며, 상기 T 세포의 활성화된 집단이 파괴된 CD70 유전자를 갖는 활성화된 T 세포를 포함하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 T 세포 활성화제가 CD3 효능제 및 CD28 효능제를 포함하며, 상기 CD3 효능제 및 CD28 효능제가 나노매트릭스 입자에 부착되는, 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 T 세포의 제2 집단을 세포 배양 용기에서 T 세포 활성화제의 존재 하에 인큐베이션시키는 것이 약 2x106개/㎠의 세포 씨딩 밀도 및 약 2x106개 세포/㎖의 세포 농도에서 약 72시간 동안 이루어지는, 방법.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합물 중 T 세포 활성화제 대 배지의 비가 약 1:12.5(v/v)인, 방법.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포의 제2 집단을 T 세포 활성화제의 존재 하에 인큐베이션시킨 후에 상기 T 세포의 활성화된 집단에서 T 세포 활성화제를 희석하여, 활성화를 감소시키고, 단계 (iii) 이전에 세포가 회복되게 하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (iii)이 전기천공법에 의해 수행되는, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (iii)이 하나의 전기천공법 이벤트를 포함하는, 방법.
  19. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 RNP 복합체 및 상기 제3 RNP 복합체가 하나의 전기천공법 이벤트에서 상기 활성화된 T 세포 내로 도입되는, 방법.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 RNP 복합체 내의 제2 Cas9 효소의 양이 상기 제3 RNA 복합체 내의 제3 Cas9 효소의 양과 같은, 방법.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 Cas9 효소의 농도가 약 0.15 ㎎/㎖이고, 상기 제3 Cas9 효소의 농도가 약 0.15 ㎎/㎖이고, 상기 TRAC 유전자를 표적화하는 제2 gRNA의 농도가 약 0.08 ㎎/㎖이고, 상기 β2M 유전자를 표적화하는 제3 gRNA의 농도가 약 0.2 ㎎/㎖인, 방법.
  22. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (v)에서 증량된 T 세포 집단 내의 세포의 농도가 약 100x106개 세포/㎖ 내지 약 400x106개 세포/㎖인, 방법.
  23. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (iv)에서 세포 수가 약 3 x 108개 세포인, 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 벡터가 약 10,000 내지 약 80,000의 감염 다중도(MOI) 값을 갖는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 AAV 벡터의 MOI가 약 20,000인, 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 AAV 벡터가 AAV 혈청형 6(AAV6) 벡터인, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (v)가 T 세포의 제4 집단을 세포 배양 용기에서 약 2x105개 세포/㎠ 내지 약 7x105개 세포/㎠의 씨딩 밀도로 약 6일 내지 약 12일 동안 배양함으로써 수행되는, 방법.
  28. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (v)가 T 세포의 제4 집단을 세포 배양 용기에서 약 2x105개 세포/㎠ 내지 약 5x105개 세포/㎠의 씨딩 밀도로 약 7일 내지 약 9일 동안 배양함으로써 수행되는, 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 T 세포의 제4 집단이 약 3x105개 세포/㎠ 내지 약 5x105개 세포/㎠의 씨딩 밀도로 배양되는, 방법.
  30. 제27항 또는 제29항에 있어서, 상기 세포 배양 용기가 배지 교체 없이 약 10일 내지 약 12일 동안 세포 증량을 가능하게 하는 정적 세포 배양 용기인, 방법.
  31. 제27항, 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 세포 배양 용기가 배지 교체 없이 약 7일 내지 약 9일 동안 세포 증량을 가능하게 하는 정적 세포 배양 용기인, 방법.
  32. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (vi)이 증량된 세포를 항-TCRαβ 항체가 고정된 비드와 접촉시키고, 결합되지 않은 세포를 수집함으로써 수행되는, 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 Cas9 효소, 제2 Cas9 효소 및/또는 제3 Cas9 효소가 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9 뉴클레아제(spCas9)인, 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 Cas9 효소, 제2 Cas9 효소 및 제3 Cas9 효소가 동일한, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 제1 Cas9 효소, 제2 Cas9 효소 및 제3 Cas9 효소가 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD70 유전자를 표적화하는 제1 gRNA가 SEQ ID NO: 4의 스페이서 서열을 포함하는, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 CD70 유전자를 표적화하는 제1 gRNA가 SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TRAC 유전자를 표적화하는 제2 gRNA가 SEQ ID NO: 8의 스페이서 서열을 포함하는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 TRAC 유전자를 표적화하는 제2 gRNA가 SEQ ID NO: 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 β2M 유전자를 표적화하는 제3 gRNA가 SEQ ID NO: 12의 스페이서 서열을 포함하는, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 β2M 유전자를 표적화하는 제3 gRNA가 SEQ ID NO: 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  42. 제36항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 gRNA, 제2 gRNA, 제3 gRNA 및/또는 이의 조합이 하나 이상의 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 변형을 포함하는, 방법.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAR이 암 항원을 표적화하는 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 동시-자극 도메인 및 CD3ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함하는, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 세포외 도메인이 단일 쇄 가변 단편(scFv)을 포함하고/하거나, 상기 막횡단 도메인이 CD8a로부터 유래되고/되거나, 상기 동시-자극 도메인이 4-1BB로부터 유래되는, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 scFv 단편이 CD70에 결합하는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 CAR이 SEQ ID NO: 46의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성되는, 유전학적으로 조작된 T 세포 집단.
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