CN112040986A - 用于改进的免疫疗法的基因调控组合物和方法 - Google Patents
用于改进的免疫疗法的基因调控组合物和方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112040986A CN112040986A CN201980019397.XA CN201980019397A CN112040986A CN 112040986 A CN112040986 A CN 112040986A CN 201980019397 A CN201980019397 A CN 201980019397A CN 112040986 A CN112040986 A CN 112040986A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- group
- immune effector
- target
- seq
- effector cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 522
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 22
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 title claims description 42
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 title description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 title description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 281
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 claims abstract description 256
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 claims abstract description 256
- 230000006870 function Effects 0.000 claims abstract description 124
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 101
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 41
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims abstract description 27
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 20
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 11
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims abstract 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims abstract 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 410
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims description 235
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 196
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 131
- 101000737265 Homo sapiens E3 ubiquitin-protein ligase CBL-B Proteins 0.000 claims description 126
- 102100035273 E3 ubiquitin-protein ligase CBL-B Human genes 0.000 claims description 122
- -1 TANK Proteins 0.000 claims description 118
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 claims description 113
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 claims description 112
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 112
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 111
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 111
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 claims description 108
- 101100165236 Homo sapiens BCOR gene Proteins 0.000 claims description 102
- 102100021247 BCL-6 corepressor Human genes 0.000 claims description 98
- 108010047933 Tumor Necrosis Factor alpha-Induced Protein 3 Proteins 0.000 claims description 87
- 102100024596 Tumor necrosis factor alpha-induced protein 3 Human genes 0.000 claims description 83
- 108090000772 Neuropilin-1 Proteins 0.000 claims description 76
- 102000004207 Neuropilin-1 Human genes 0.000 claims description 76
- 102100037799 DNA-binding protein Ikaros Human genes 0.000 claims description 75
- 101000599038 Homo sapiens DNA-binding protein Ikaros Proteins 0.000 claims description 75
- 101000961071 Homo sapiens NF-kappa-B inhibitor alpha Proteins 0.000 claims description 75
- 101000742854 Homo sapiens Roquin-1 Proteins 0.000 claims description 75
- 102100039337 NF-kappa-B inhibitor alpha Human genes 0.000 claims description 75
- 102100038043 Roquin-1 Human genes 0.000 claims description 75
- 101000663000 Homo sapiens TNFAIP3-interacting protein 1 Proteins 0.000 claims description 74
- 102100033456 TGF-beta receptor type-1 Human genes 0.000 claims description 74
- 102100037667 TNFAIP3-interacting protein 1 Human genes 0.000 claims description 74
- 108010011702 Transforming Growth Factor-beta Type I Receptor Proteins 0.000 claims description 74
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 claims description 73
- 101000889276 Homo sapiens Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Proteins 0.000 claims description 73
- 101001137987 Homo sapiens Lymphocyte activation gene 3 protein Proteins 0.000 claims description 73
- 101000819111 Homo sapiens Trans-acting T-cell-specific transcription factor GATA-3 Proteins 0.000 claims description 73
- 102000017578 LAG3 Human genes 0.000 claims description 73
- 102100025751 Mothers against decapentaplegic homolog 2 Human genes 0.000 claims description 73
- 101710143123 Mothers against decapentaplegic homolog 2 Proteins 0.000 claims description 73
- 102100021386 Trans-acting T-cell-specific transcription factor GATA-3 Human genes 0.000 claims description 73
- 102100027581 Forkhead box protein P3 Human genes 0.000 claims description 72
- 108010007707 Hepatitis A Virus Cellular Receptor 2 Proteins 0.000 claims description 72
- 102100034458 Hepatitis A virus cellular receptor 2 Human genes 0.000 claims description 72
- 101000861452 Homo sapiens Forkhead box protein P3 Proteins 0.000 claims description 72
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 claims description 72
- 102000003714 TNF receptor-associated factor 6 Human genes 0.000 claims description 72
- 108090000009 TNF receptor-associated factor 6 Proteins 0.000 claims description 72
- 108700009171 B-Cell Lymphoma 3 Proteins 0.000 claims description 71
- 101150072667 Bcl3 gene Proteins 0.000 claims description 71
- 101000611936 Homo sapiens Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 claims description 71
- 101000831007 Homo sapiens T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains Proteins 0.000 claims description 71
- 101000599042 Homo sapiens Zinc finger protein Aiolos Proteins 0.000 claims description 71
- 102100024834 T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains Human genes 0.000 claims description 71
- 102000004060 Transforming Growth Factor-beta Type II Receptor Human genes 0.000 claims description 71
- 102100037798 Zinc finger protein Aiolos Human genes 0.000 claims description 71
- 101000761581 Homo sapiens Serine/threonine-protein phosphatase 2A 55 kDa regulatory subunit B delta isoform Proteins 0.000 claims description 70
- 101000617285 Homo sapiens Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 6 Proteins 0.000 claims description 70
- 102100024927 Serine/threonine-protein phosphatase 2A 55 kDa regulatory subunit B delta isoform Human genes 0.000 claims description 70
- 108010082684 Transforming Growth Factor-beta Type II Receptor Proteins 0.000 claims description 70
- 102100021657 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 6 Human genes 0.000 claims description 70
- 101150045565 Socs1 gene Proteins 0.000 claims description 66
- 108700027336 Suppressor of Cytokine Signaling 1 Proteins 0.000 claims description 66
- 101000599037 Homo sapiens Zinc finger protein Helios Proteins 0.000 claims description 60
- 102100037796 Zinc finger protein Helios Human genes 0.000 claims description 60
- 102100034614 Ankyrin repeat domain-containing protein 11 Human genes 0.000 claims description 55
- 101000924476 Homo sapiens Ankyrin repeat domain-containing protein 11 Proteins 0.000 claims description 55
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 54
- 108010040168 Bcl-2-Like Protein 11 Proteins 0.000 claims description 52
- 102000001765 Bcl-2-Like Protein 11 Human genes 0.000 claims description 52
- 102100025579 Calmodulin-2 Human genes 0.000 claims description 52
- 102100030299 Cysteine-rich hydrophobic domain-containing protein 2 Human genes 0.000 claims description 52
- 108010052167 Dihydroorotate Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 52
- 102100032823 Dihydroorotate dehydrogenase (quinone), mitochondrial Human genes 0.000 claims description 52
- 102100032610 Guanine nucleotide-binding protein G(s) subunit alpha isoforms XLas Human genes 0.000 claims description 52
- 101000984150 Homo sapiens Calmodulin-2 Proteins 0.000 claims description 52
- 101000991100 Homo sapiens Cysteine-rich hydrophobic domain-containing protein 2 Proteins 0.000 claims description 52
- 101001014590 Homo sapiens Guanine nucleotide-binding protein G(s) subunit alpha isoforms XLas Proteins 0.000 claims description 52
- 101001014594 Homo sapiens Guanine nucleotide-binding protein G(s) subunit alpha isoforms short Proteins 0.000 claims description 52
- 101001014610 Homo sapiens Neuroendocrine secretory protein 55 Proteins 0.000 claims description 52
- 101000735354 Homo sapiens Poly(rC)-binding protein 1 Proteins 0.000 claims description 52
- 101000797903 Homo sapiens Protein ALEX Proteins 0.000 claims description 52
- 101000601770 Homo sapiens Protein polybromo-1 Proteins 0.000 claims description 52
- 101001076715 Homo sapiens RNA-binding protein 39 Proteins 0.000 claims description 52
- 102100034960 Poly(rC)-binding protein 1 Human genes 0.000 claims description 52
- 102100037516 Protein polybromo-1 Human genes 0.000 claims description 52
- 102100025858 RNA-binding protein 39 Human genes 0.000 claims description 52
- 102100037545 Semaphorin-7A Human genes 0.000 claims description 52
- 102100022524 Alpha-1-antichymotrypsin Human genes 0.000 claims description 49
- 101000678026 Homo sapiens Alpha-1-antichymotrypsin Proteins 0.000 claims description 49
- 101000866298 Homo sapiens Transcription factor E2F8 Proteins 0.000 claims description 49
- 101000854918 Homo sapiens WD repeat-containing protein 6 Proteins 0.000 claims description 49
- 102100031555 Transcription factor E2F8 Human genes 0.000 claims description 49
- 102100020706 WD repeat-containing protein 6 Human genes 0.000 claims description 49
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims description 46
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 46
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 30
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 30
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 25
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 25
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 claims description 12
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 12
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 12
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 claims description 12
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 claims description 10
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 claims description 10
- 102100035880 Max-interacting protein 1 Human genes 0.000 claims description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 8
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 8
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 8
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 7
- 230000003007 single stranded DNA break Effects 0.000 claims description 7
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 claims description 6
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 5
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 claims description 4
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 4
- 101100074187 Caenorhabditis elegans lag-1 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 claims description 4
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 claims description 4
- 101001000302 Homo sapiens Max-interacting protein 1 Proteins 0.000 claims description 4
- 101710112905 Max-interacting protein 1 Proteins 0.000 claims description 4
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 claims description 4
- 102100039124 Methyl-CpG-binding protein 2 Human genes 0.000 claims description 4
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims description 4
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 claims description 4
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 claims description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 4
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 claims description 4
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 claims description 4
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 claims description 4
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 claims description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 4
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 claims description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 4
- 101150095421 tig gene Proteins 0.000 claims description 4
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 102100025744 Mothers against decapentaplegic homolog 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 101700032040 SMAD1 Proteins 0.000 claims description 3
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 claims description 3
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 claims description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 claims description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 claims description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 claims description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 claims description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000012584 pre-descemet corneal dystrophy Diseases 0.000 claims description 3
- 238000010361 transduction Methods 0.000 claims description 3
- 230000026683 transduction Effects 0.000 claims description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 3
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 claims description 2
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 claims description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 claims description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims description 2
- 101150083522 MECP2 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 108010072388 Methyl-CpG-Binding Protein 2 Proteins 0.000 claims description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 claims description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 claims description 2
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 claims description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 claims description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 2
- 102100021570 B-cell lymphoma 3 protein Human genes 0.000 claims 39
- 102100024779 Suppressor of cytokine signaling 1 Human genes 0.000 claims 34
- 102100030334 Friend leukemia integration 1 transcription factor Human genes 0.000 claims 27
- 101001062996 Homo sapiens Friend leukemia integration 1 transcription factor Proteins 0.000 claims 27
- 101000807596 Homo sapiens Orotidine 5'-phosphate decarboxylase Proteins 0.000 claims 27
- 101000893493 Homo sapiens Protein flightless-1 homolog Proteins 0.000 claims 27
- 101000739767 Homo sapiens Semaphorin-7A Proteins 0.000 claims 27
- 102100037214 Orotidine 5'-phosphate decarboxylase Human genes 0.000 claims 27
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 claims 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims 7
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims 4
- 102000027596 immune receptors Human genes 0.000 claims 4
- 108091008915 immune receptors Proteins 0.000 claims 4
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims 2
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 claims 1
- 101001117317 Homo sapiens Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 claims 1
- 101100069395 Mus musculus Gzmb gene Proteins 0.000 claims 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims 1
- 239000012270 PD-1 inhibitor Substances 0.000 claims 1
- 239000012668 PD-1-inhibitor Substances 0.000 claims 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 102100039087 Peptidyl-alpha-hydroxyglycine alpha-amidating lyase Human genes 0.000 claims 1
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 claims 1
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 claims 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 claims 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 claims 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 claims 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 claims 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 208000037841 lung tumor Diseases 0.000 claims 1
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 claims 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims 1
- 229940121655 pd-1 inhibitor Drugs 0.000 claims 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 abstract description 13
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 abstract description 3
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 abstract description 3
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 abstract description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 102000052666 B-Cell Lymphoma 3 Human genes 0.000 description 32
- 102000058018 Suppressor of Cytokine Signaling 1 Human genes 0.000 description 32
- 102000048854 Friend leukemia integration 1 transcription factor Human genes 0.000 description 25
- 108010080989 Proto-Oncogene Protein c-fli-1 Proteins 0.000 description 25
- 101710199489 Semaphorin-7A Proteins 0.000 description 25
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 19
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 101150005105 Bcor gene Proteins 0.000 description 2
- 101150116845 Cblb gene Proteins 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 101150046249 Havcr2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150030213 Lag3 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100369641 Mus musculus Tigit gene Proteins 0.000 description 2
- 101150051337 NRP1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150056500 Ptpn6 gene Proteins 0.000 description 2
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 101150093886 TGFBR2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150031549 Tgfbr1 gene Proteins 0.000 description 2
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 101100510624 Caenorhabditis elegans lagr-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 101100047641 Mus musculus Txnrd3 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000033540 T cell apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000011467 adoptive cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000012830 cancer therapeutic Substances 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000009172 cell transfer therapy Methods 0.000 description 1
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4632—T-cell receptors [TCR]; antibody T-cell receptor constructs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
- A61K39/464412—CD19 or B4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/46449—Melanoma antigens
- A61K39/464491—Melan-A/MART
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/46449—Melanoma antigens
- A61K39/464492—Glycoprotein 100 [Gp100]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70517—CD8
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
- A61K2239/50—Colon
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/09—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a nuclear localisation signal
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor
- C07K2319/81—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor containing a Zn-finger domain for DNA binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
- C12N2310/122—Hairpin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/50—Physical structure
- C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
- C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
Abstract
本公开提供了与免疫效应细胞的提高治疗功效的修饰有关的方法和组合物。在一些实施方案中，提供了经修饰以降低一种或多种内源靶基因的表达或降低内源蛋白的一种或多种功能来增强所述免疫细胞的效应子功能的免疫效应细胞。在一些实施方案中，提供了通过引入赋予抗原特异性的诸如外源T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的转基因进一步修饰的免疫效应细胞。还提供了使用本文所述的修饰的免疫效应细胞治疗诸如癌症的细胞增殖性病症的方法。
Description
相关申请的交叉参考
本申请要求2018年3月15日提交的美国临时申请号62/643,578，2018年6月29日提交的美国临时申请号62/692,010，2018年11月16日提交的美国临时申请号62/768,428，2018年3月15日提交的美国临时申请号62/643,584，2018年6月29日提交的美国临时申请号62/692,016，2018年11月16日提交的美国临时申请号62/768,441，2019年1月9日提交的美国临时申请号62/790,179，2019年2月12日提交的美国临时申请号62/804,261，2018年9月25日提交的美国临时申请号62/736,185，以及2019年1月9日提交的美国临时申请号62/790,192的优先权，这些申请以引用的方式整体并入文。
电子提交的文本文件的描述
随此电子提交的文本文件的内容以引用的方式整体并入本文：序列表的计算机可读格式拷贝(文件名：KSQT_006_05WO_SeqList_ST25.txt，录入时间：2019年3月14日；文件大小266千字节)。
技术领域
本公开涉及用于编辑靶核酸序列或调节靶核酸序列的表达的方法、组合物和组分，及其结合免疫疗法(包括与受体工程化的免疫效应细胞一起使用)在细胞增殖性疾病、炎性疾病和/或传染性疾病的治疗中的应用。
背景技术
利用遗传修饰的T细胞(特别是CAR-T细胞)的过继性细胞转移已经作为实体和血液恶性肿瘤的治疗剂进入临床测试。迄今为止的结果是好坏参半。在血液恶性肿瘤(尤其是淋巴瘤、CLL和ALL)中，多数患者分别在1期和2期试验中表现出至少部分应答，其中一些表现出完全应答(Kochenderfer等人,2012Blood 1 19,2709-2720)。在2017年，FDA批准了两种CAR-T疗法KymriahTM和YescartaTM，它们均用于治疗血液癌症。但是，在大多数肿瘤类型(包括黑素瘤、肾细胞癌和结直肠癌)中，观察到较少的应答(Johnson等人,2009Blood 114,535-546；Lamers等人,2013Mol.Ther.21,904-912；Warren等人,1998Cancer GeneTher.5,S1-S2)。因此，过继性T细胞疗法仍有很大的改进空间，因为成功主要限于靶向B细胞谱系的血液恶性肿瘤的CAR-T细胞方法。
发明内容
需要改进修饰的免疫细胞的过继性转移在癌症治疗中的功效，特别是提高过继性细胞疗法对实体恶性肿瘤的功效，因为在这些肿瘤类型中观察到应答降低(黑素瘤、肾细胞癌和结直肠癌；Yong,2017,Imm Cell Biol.,95:356-363)。另外，即使在已经观察到过继性转移的益处的血液恶性肿瘤中，也并非所有患者都会做出应答，并且复发的发生频率高于期望的频率，这可能是由于过继性转移的T细胞功能减弱所致。
限制遗传修饰的免疫细胞作为癌症治疗剂的功效的因素包括(1)细胞增殖，例如过继性转移后T细胞的有限增殖；(2)细胞存活，例如通过肿瘤环境中的因子诱导T细胞凋亡；和(3)细胞功能，例如在制造过程中和/或转移后，由宿主免疫细胞和癌细胞分泌的抑制因子对细胞毒性T细胞功能的抑制和免疫细胞的耗竭。
被认为增加免疫细胞的抗肿瘤作用的具体特征包括细胞的以下能力：1)过继性转移后在宿主中增殖；2)浸润肿瘤；3)在宿主中持续存在和/或表现出对免疫细胞耗竭的抗性；以及4)以能够杀伤肿瘤细胞的方式起作用。本公开提供了包含降低的一种或多种内源靶基因的表达和/或功能的免疫细胞，其中所述修饰的免疫细胞表现出一种或多种效应子功能的增强，其包括增加的增殖、增加的对肿瘤的浸润、免疫细胞在受试者中的持续存在和/或增加的对免疫细胞耗竭的抗性。本公开还提供了用于修饰免疫效应细胞以引发针对肿瘤细胞的增强的免疫细胞活性的方法和组合物，以及适用于过继性免疫细胞转移疗法的背景的方法和组合物。
在一些实施方案中，本公开提供了一种修饰的免疫效应细胞，其包含能够降低选自以下的一种或多种内源靶基因的表达和/或功能的基因调控系统：(a)由BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS组成的组；或(b)由SOCS1和ANKRD11组成的组；其中所述降低的一种或多种内源基因的表达和/或功能增强免疫效应细胞的效应子功能。在一些实施方案中，基因调控系统能够降低选自以下的两种或更多种内源靶基因的表达和/或功能：(a)由BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS组成的组；(b)由SOCS1和ANKRD11组成的组。
在一些实施方案中，本公开提供了一种修饰的免疫效应细胞，其包含能够降低选自由以下组成的组的一种或多种内源靶基因的表达和/或功能的基因调控系统：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR，其中所述降低的一种或多种内源基因的表达和/或功能增强所述免疫效应细胞的效应子功能。在一些实施方案中，基因调控系统能够降低选自由以下组成的组的两种或更多种内源靶基因的表达和/或功能：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR。在一些实施方案中，内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、和IKZF2，并且内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR。
在一些实施方案中，本公开提供了一种修饰的免疫效应细胞，其包含能够降低以下的表达和/或功能的基因调控系统：选自(a)由BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS组成的组；或(b)由SOCS1和ANKRD11组成的组的一种或多种内源靶基因，以及选自IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR的一种或多种内源靶基因。在一些实施方案中，基因调控系统能够降低以下的表达和/或功能：选自由BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS组成的组的至少一种内源靶基因，以及选自由IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR组成的组的至少一种内源靶基因。在一些实施方案中，基因调控系统能够降低以下的表达和/或功能：选自由SOCS1和ANKRD11组成的组的至少一种内源靶基因以及选自由IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR组成的组的至少一种内源靶基因。
在一些实施方案中，基因调控系统能够降低SOCS1和CBLB的表达和/或功能。在一些实施方案中，基因调控系统能够降低SOCS1和BCOR的表达和/或功能。在一些实施方案中，基因调控系统能够降低SOCS1和TNFAIP3的表达和/或功能。在一些实施方案中，基因调控系统能够降低ANKRD11和CBLB的表达和/或功能。在一些实施方案中，基因调控系统能够降低ANKRD11和BCOR的表达和/或功能。在一些实施方案中，基因调控系统能够降低ANKRD11和TNFAIP3的表达和/或功能。在一些实施方案中，基因调控系统能够降低ANKRD11和SOCS1的表达和/或功能。
在一些实施方案中，基因调控系统包含(i)一种或多种核酸分子；(ii)一种或多种酶蛋白；或(iii)一种或多种指导核酸分子和酶蛋白。在一些实施方案中，一种或多种核酸分子选自siRNA、shRNA、微小RNA(miR)、微小RNA拮抗剂(antagomiR)或反义RNA。在一些实施方案中，基因调控系统包含siRNA或shRNA核酸分子。
在一些实施方案中，一种或多种内源靶基因选自由以下组成的组：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR，并且其中所述siRNA或shRNA分子包含与由表5A和表5B中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。在一些实施方案中，所述siRNA或shRNA包含与由选自由SEQ ID NO:154-813组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
在一些实施方案中，一种或多种内源靶基因选自由以下组成的组：BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS，并且其中所述siRNA或shRNA分子包含与由表6A和表6B中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。在一些实施方案中，所述siRNA或shRNA包含与由选自由SEQ ID NO:814-1064组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
在一些实施方案中，一种或多种内源靶基因是SOCS1，并且其中所述siRNA或shRNA分子包含与由表6C和表6D中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。在一些实施方案中，所述siRNA或shRNA包含与由选自由SEQ ID NO:1088-1232组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。在一些实施方案中，一种或多种内源靶基因是ANKRD11，并且其中所述siRNA或shRNA分子包含与由表6E和表6F中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。在一些实施方案中，所述siRNA或shRNA包含与由选自由SEQ ID NO:1065-1087组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
在一些实施方案中，基因调控系统包含多种siRNA或shRNA分子并且能够降低两种或更多种内源靶基因的表达和/或功能。
在一些实施方案中，内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS，并且内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR。在一些实施方案中，多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由表6A和表6B中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由表5A和表5B中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。在一些实施方案中，多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQID NO:814-1064组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:154-813组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
在一些实施方案中，内源靶基因中的至少一种选自由BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS组成的组，并且内源靶基因中的至少一种是CBLB。在一些实施方案中，多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:814-1064组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:499-524组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。在一些实施方案中，内源靶基因中的至少一种选自由BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS组成的组，并且内源靶基因中的至少一种是CBLB、TNFAIP3或BCOR。
在一些实施方案中，内源靶基因中的至少一种是SOCS1，并且内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR。在一些实施方案中，多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由表6C和表6D中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由表5A和表5B中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。在一些实施方案中，多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:1088-1232组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:154-813组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
在一些实施方案中，内源靶基因中的至少一种是SOCS1，并且内源靶基因中的至少一种是CBLB。在一些实施方案中，多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQID NO:1088-1232组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:499-524组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。在一些实施方案中，内源靶基因中的至少一种是SOCS1，并且内源靶基因中的至少一种是CBLB、TNFAIP3或BCOR。
在一些实施方案中，内源靶基因中的至少一种是ANKRD11，并且内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR。在一些实施方案中，多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由表6E和表6F中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由表5A和表5B中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。在一些实施方案中，多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:1065-1087组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:154-813组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
在一些实施方案中，内源靶基因中的至少一种是ANKRD11，并且内源靶基因中的至少一种是CBLB。在一些实施方案中，多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:1065-1087组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:499-524组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。在一些实施方案中，内源靶基因中的至少一种是ANKRD11，并且内源靶基因中的至少一种是CBLB、TNFAIP3或BCOR。
在一些实施方案中，内源靶基因中的至少一种是SOCS1，并且内源靶基因中的至少一种是ANKRD11。在一些实施方案中，多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由表6C和表6D中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由表6E和表6F中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。在一些实施方案中，多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:1065-1087组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:1088-1232组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
在一些实施方案中，基因调控系统包含酶蛋白，并且其中所述酶蛋白已经被工程化以与所述内源基因中的一种或多种中的靶序列特异性结合。在一些实施方案中，蛋白质是转录激活物样效应核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶或大范围核酸酶。
在一些实施方案中，基因调控系统包含指导核酸分子和酶蛋白，其中所述核酸分子是指导RNA(gRNA)分子并且所述酶蛋白是Cas蛋白或Cas直系同源物。
在一些实施方案中，一种或多种内源靶基因选自由以下组成的组：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR，并且其中所述gRNA分子包含与由表5A和表5B中所示的一组基因组坐标定义的核酸序列结合的靶向结构域序列。在一些实施方案中，gRNA分子包含与选自由SEQ ID NO:154-813组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。在一些实施方案中，gRNA分子包含由选自由SEQ ID NO:154-813组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列。
在一些实施方案中，一种或多种内源靶基因选自由以下组成的组：BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS，并且其中所述gRNA分子包含与由表6A和表6B中所示的一组基因组坐标定义的核酸序列结合的靶向结构域序列。在一些实施方案中，gRNA分子包含与选自由SEQ ID NO:814-1064组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。在一些实施方案中，gRNA分子包含由选自由SEQ IDNO:814-1064组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列。
在一些实施方案中，一种或多种内源靶基因是SOCS1，并且其中所述gRNA分子包含与由表6C和6D中所示的一组基因组坐标定义的核酸序列结合的靶向结构域序列。在一些实施方案中，gRNA分子包含与选自由SEQ ID NO:1088-1232组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。在一些实施方案中，gRNA分子包含由选自由SEQ ID NO:1088-1232组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列。
在一些实施方案中，一种或多种内源靶基因是ANKRD11，并且其中所述gRNA分子包含与由表6E和6F中所示的一组基因组坐标定义的核酸序列结合的靶向结构域序列。在一些实施方案中，gRNA分子包含与选自由SEQ ID NO:1065-1087组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。在一些实施方案中，gRNA分子包含由选自由SEQ ID NO:1065-1087组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列。
在一些实施方案中，基因调控系统包含多种gRNA分子并且能够降低两种或更多种内源靶基因的表达和/或功能。
在一些实施方案中，内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS，并且内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR。在一些实施方案中，多种gRNA分子中的至少一种包含与由表6A和表6B中所示的一组基因组坐标定义的核酸序列结合的靶向结构域序列，并且多种gRNA分子中的至少一种包含与由表5A和表5B中所示的一组基因组坐标定义的核酸序列结合的靶向结构域序列。在一些实施方案中，多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:814-1064组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列，并且多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:154-813组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。在一些实施方案中，多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ ID NO:814-1064组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列，并且多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ ID NO:154-813组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列。
在一些实施方案中，内源靶基因中的至少一种选自由BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS组成的组，并且内源靶基因中的至少一种是CBLB。在一些实施方案中，多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:814-1064组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列，并且多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:499-524组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。在一些实施方案中，多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ IDNO:814-1064组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列，并且多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ ID NO:499-524组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列。在一些实施方案中，内源靶基因中的至少一种选自由BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS组成的组，并且内源靶基因中的至少一种是CBLB、TNFAIP3或BCOR。
在一些实施方案中，内源靶基因中的至少一种是SOCS1，并且内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR。在一些实施方案中，多种gRNA分子中的至少一种包含与由表6C和表6D中所示的一组基因组坐标定义的核酸序列结合的靶向结构域序列，并且多种gRNA分子中的至少一种包含与由表5A和表5B中所示的一组基因组坐标定义的核酸序列结合的靶向结构域序列。在一些实施方案中，多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQID NO:1088-1232组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列，并且多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:154-813组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。在一些实施方案中，多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ ID NO:1088-1232组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列，并且多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ ID NO:154-813组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列。
在一些实施方案中，内源靶基因中的至少一种是SOCS1，并且内源靶基因中的至少一种是CBLB。在一些实施方案中，多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:1088-1232组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列，并且多种gRNA分子中的至少一种包含靶向结构域序列在一些实施方案中，多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ IDNO:1088-1232组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列，并且多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ ID NO:499-524组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列。在一些实施方案中，内源靶基因中的至少一种是SOCS1，并且内源靶基因中的至少一种是CBLB、TNFAIP3或BCOR。
在一些实施方案中，内源靶基因中的至少一种是ANKRD11，并且内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR。在一些实施方案中，多种gRNA分子中的至少一种包含与由表6E和表6F中所示的一组基因组坐标定义的核酸序列结合的靶向结构域序列，并且多种gRNA分子中的至少一种包含与由表5A和表5B中所示的一组基因组坐标定义的核酸序列结合的靶向结构域序列。在一些实施方案中，多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQID NO:1065-1087组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列，并且多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:154-813组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。在一些实施方案中，多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ ID NO:1065-1087组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列，并且多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:154-813组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。
在一些实施方案中，内源靶基因中的至少一种是ANKRD11，并且内源靶基因中的至少一种是CBLB。在一些实施方案中，多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ IDNO:1065-1087组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列，并且多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:499-524组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。在一些实施方案中，多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ ID NO:1065-1087组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列，并且多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQID NO:499-524组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列。在一些实施方案中，内源靶基因中的至少一种是ANKRD11，并且内源靶基因中的至少一种是CBLB、TNFAIP3或BCOR。
在一些实施方案中，内源靶基因中的至少一种是SOCS1，并且内源靶基因中的至少一种是ANKRD11。在一些实施方案中，多种gRNA分子中的至少一种包含与由表6E和表6F中所示的一组基因组坐标定义的核酸序列结合的靶向结构域序列，并且多种gRNA分子中的至少一种包含与由表6C和表6D中所示的一组基因组坐标定义的核酸序列结合的靶向结构域序列。在一些实施方案中，多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:1065-1087组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列，并且多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:1088-1232组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。在一些实施方案中，多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ ID NO:1065-1087组成的组的DNA序列编码的靶向结构域序列，并且多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ ID NO:1088-1232组成的组的DNA序列编码的靶向结构域序列。
在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含Cas蛋白其中：Cas蛋白是野生型Cas蛋白，其包含两个酶活性结构域并能够诱导双链DNA断裂；Cas蛋白是Cas切口酶突变体，其包含一个酶活性结构域并且能够诱导单链DNA断裂；或Cas蛋白是失活的Cas蛋白(dCas)并且与能够调节一种或多种内源靶基因的表达的异源蛋白相关联。在一些实施方案中，Cas蛋白是Cas9蛋白。在一些实施方案中，异源蛋白选自由MAX相互作用蛋白1(MXI1)、Krüppel相关盒(KRAB)结构域、甲基-CpG结合蛋白2(MECP2)和四个串联的mSin3结构域(SID4X)组成的组。
在一些实施方案中，基因调控系统将失活突变引入一种或多种内源靶基因中。在一些实施方案中，失活突变包括在所述两种或更多种内源基因的基因组序列中缺失、取代或插入一个或多个核苷酸。在一些实施方案中，缺失是所述两种或更多种内源靶基因的部分或完全缺失。在一些实施方案中，失活突变是移码突变。在一些实施方案中，失活突变降低了两种或更多种内源靶基因的表达和/或功能。
在一些实施方案中，通过微流体装置通过细胞膜的转染、转导、电穿孔或物理破坏将基因调控系统引入免疫效应细胞中。在一些实施方案中，基因调控系统以编码所述系统的一种或多种组分的多核苷酸、蛋白质或核糖核蛋白(RNP)复合物的形式引入。
在一些实施方案中，本公开提供了一种修饰的免疫效应细胞，其包含降低的选自由以下组成的组的一种或多种内源基因的表达和/或功能：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR，其中所述降低的一种或多种内源基因的表达和/或功能增强免疫效应细胞的效应子功能。
在一些实施方案中，本公开提供了一种修饰的免疫效应细胞，其包含降低的选自以下的一种或多种内源基因的表达和/或功能：(a)由IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6和IKZF2组成的组；或(b)由CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR组成的组，其中所述降低的一种或多种内源基因的表达和/或功能增强免疫效应细胞的效应子功能。
在一些实施方案中，本公开提供了一种修饰的免疫效应细胞，其包含降低的选自以下的一种或多种内源基因的表达和/或功能：(a)由BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS组成的组；(b)SOCS1；或(c)ANKRD11；其中所述降低的一种或多种内源基因的表达和/或功能增强修饰的免疫效应细胞的效应子功能。在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含降低的SOCS和ANKRD11的表达和/或功能。
在一些实施方案中，本公开提供了一种修饰的免疫效应细胞，其包含降低的选自以下的两种或更多种靶基因的表达和/或功能：Ikzf1、Ikzf3、GATA3、Bcl3、Tnip1、Tnfaip3、NFKBIA、SMAD2、Tgfbr1、Tgfbr2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、Cblb、Ppp2r2d、Nrp1、Havcr2、Lag3、Tigit、Ctla4、Ptpn6、Pdcd1和BCOR，其中所述降低的两种或更多种内源基因的表达和/或功能增强修饰的免疫效应细胞的效应子功能。在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含降低的CBLB和BCOR的表达和/或功能。
在一些实施方案中，本公开提供了一种修饰的免疫效应细胞，其包含降低的两种或更多种靶基因的表达和/或功能，其中至少一种靶基因选自由BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS组成的组，并且其中至少一种靶基因选自由IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR组成的组，其中所述降低的两种或更多种内源基因的表达和/或功能增强修饰的免疫效应细胞的效应子功能。
在一些实施方案中，本公开提供了一种修饰的免疫效应细胞，其包含降低的两种或更多种靶基因的表达和/或功能，其中至少一种靶基因选自由以下组成的组：BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS，并且其中至少一种靶基因是CBLB。
在一些实施方案中，本公开提供了一种修饰的免疫效应细胞，其包含降低的两种或更多种靶基因的表达和/或功能，其中至少一种靶基因是SOCS1，并且其中至少一种靶基因选自由IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR组成的组，其中所述降低的两种或更多种内源基因的表达和/或功能增强修饰的免疫效应细胞的效应子功能。在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含降低的SOCS1和CBLB的表达和/或功能。在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含降低的SOCS1和TNFAIP3的表达和/或功能。在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含降低的SOCS1和BCOR的表达和/或功能。
在一些实施方案中，本公开提供了一种修饰的免疫效应细胞，其包含降低的两种或更多种靶基因的表达和/或功能，其中至少一种靶基因是ANKRD11，并且其中至少一种靶基因选自由IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR组成的组，其中所述降低的两种或更多种内源基因的表达和/或功能增强修饰的免疫效应细胞的效应子功能。在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含降低的ANKRD11和CBLB的表达和/或功能。在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含降低的ANKRD11和TNFAIP3的表达和/或功能。在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含降低的ANKRD11和BCOR的表达和/或功能。
在一些实施方案中，本公开提供了一种修饰的免疫效应细胞，其包含在选自由以下组成的组的一种或多种内源基因中的失活突变：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR。
在一些实施方案中，本公开提供了一种修饰的免疫效应细胞，其包含在选自以下的一种或多种内源基因中的失活突变：(a)由IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6和IKZF2组成的组；或(b)由CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR组成的组。
在一些实施方案中，本公开提供了一种修饰的免疫效应细胞，其包含在选自以下的一种或多种内源基因中的失活突变：(a)由BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS组成的组；或(b)SOCS1；或(c)ANKRD11。在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含在SOCS1和ANKRD11中的失活突变。
一种修饰的免疫效应细胞，其包含在选自以下的两种或更多种靶基因中的失活突变：Ikzf1、Ikzf3、GATA3、Bcl3、Tnip1、Tnfaip3、NFKBIA、SMAD2、Tgfbr1、Tgfbr2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、Cblb、Ppp2r2d、Nrp1、Havcr2、Lag3、Tigit、Ctla4、Ptpn6、Pdcd1和BCOR。在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含在所述CBLB和BCOR基因中的失活突变。
在一些实施方案中，本公开提供了一种修饰的免疫效应细胞，其包含在两种或更多种靶基因中的失活突变，其中至少一种靶基因选自由BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS组成的组，并且至少一种靶基因选自由IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR组成的组。
在一些实施方案中，本公开提供了一种修饰的免疫效应细胞，其包含在两种或更多种靶基因中的失活突变，其中至少一种靶基因选自由以下组成的组：BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS，并且至少一种靶基因是CBLB。
在一些实施方案中，本公开提供了一种修饰的免疫效应细胞，其包含在两种或更多种靶基因中的失活突变，其中至少一种靶基因是SOCS1，并且至少一种靶基因选自由IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR组成的组。在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含在SOCS1和TNFAIP3基因中的失活突变。在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含在SOCS1和BCOR基因中的失活突变。在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含在SOCS1和CBLB基因中的失活突变。
在一些实施方案中，本公开提供了一种修饰的免疫效应细胞，其包含在两种或更多种靶基因中的失活突变，其中至少一种靶基因是ANKRD11，并且至少一种靶基因选自由IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR组成的组。在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含在ANKRD11和TNFAIP3基因中的失活突变。在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含在ANKRD11和BCOR基因中的失活突变。在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含在ANKRD11和CBLB基因中的失活突变。
在一些实施方案中，失活突变包括在所述两种或更多种内源基因的基因组序列中缺失、取代或插入一个或多个核苷酸。在一些实施方案中，缺失是所述两种或更多种内源靶基因的部分或完全缺失。在一些实施方案中，失活突变是移码突变。在一些实施方案中，失活突变降低了两种或更多种内源靶基因的表达和/或功能。在一些实施方案中，与未修饰或对照免疫效应细胞相比，一种或多种内源靶基因的表达降低了至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。在一些实施方案中，与未修饰或对照免疫效应细胞相比，一种或多种内源靶基因的功能降低了至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞还包含展示在细胞表面上的工程化免疫受体。在一些实施方案中，工程化免疫受体是包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域的CAR。在一些实施方案中，工程化免疫受体是工程化TCR。在一些实施方案中，工程化免疫受体与靶细胞上表达的抗原特异性结合，其中所述抗原是肿瘤相关抗原。
在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞还包含表达免疫活化分子的外源转基因。在一些实施方案中，免疫活化分子选自由细胞因子、趋化因子、共刺激分子、活化肽、抗体或其抗原结合片段组成的组。在一些实施方案中，抗体或其结合片段与由NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4或PDCD1编码的蛋白质特异性结合并抑制其功能。
在一些实施方案中，免疫效应细胞是其中，在一些实施方案中，淋巴细胞是肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
在一些实施方案中，效应子功能选自细胞增殖、细胞存活力、肿瘤浸润、细胞毒性、抗肿瘤免疫应答和/或对耗竭的抗性。
在一些实施方案中，本公开提供了包含本文所述的修饰的免疫效应细胞的组合物。在一些实施方案中，组合物还包含药学上可接受的载剂或稀释剂。在一些实施方案中，组合物包含至少1x 104、1x 105或1x 106个修饰的免疫效应细胞。在一些实施方案中，组合物适合于施用于有需要的受试者。在一些实施方案中，组合物包含衍生自有需要的受试者的自体免疫效应细胞。在一些实施方案中，组合物包含衍生自供体受试者的同种异体免疫效应细胞。
在一些实施方案中，本公开提供了一种基因调控系统，其能够降低选自以下的细胞中的一种或多种内源靶基因的表达和/或功能：(a)由IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6和IKZF2组成的组；或(b)由CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR组成的组，其中所述系统包含(i)核酸分子；(ii)酶；或(iii)指导核酸分子和酶蛋白
在一些实施方案中，本公开提供了一种基因调控系统，其能够降低选自以下的细胞中的一种或多种内源靶基因的表达：(a)由BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS组成的组；(b)SOCS1；或(b)ANKRD11，其中所述系统包含(i)核酸分子；(ii)酶；或(iii)指导核酸分子和酶蛋白。
在一些实施方案中，所述系统包含指导RNA(gRNA)核酸分子和Cas核酸内切酶。
在一些实施方案中，一种或多种内源靶基因选自IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6和IKZF2，或选自CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR，并且其中所述gRNA分子包含与由表5A和表5B中所示的一组基因组坐标定义的靶DNA序列互补的靶向结构域序列。在一些实施方案中，一种或多种内源靶基因选自IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6和IKZF2，并且其中所述gRNA分子包含与选自由SEQ ID NO:154-498组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。在一些实施方案中，gRNA分子包含由选自由SEQ ID NO:154-498组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列。
在一些实施方案中，一种或多种内源靶基因选自CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR，并且其中所述gRNA分子包含与选自由SEQ ID NO:499-813组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。在一些实施方案中，gRNA分子包含由选自由SEQ ID NO:499-813组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列。
在一些实施方案中，一种或多种内源靶基因选自BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS，并且其中所述gRNA分子包含与由表6A和表6B中所示的一组基因组坐标定义的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。在一些实施方案中，gRNA分子包含与选自由SEQ ID NO:814-1064组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。在一些实施方案中，gRNA分子包含由选自由SEQ ID NO:814-1064组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列。
在一些实施方案中，一种或多种内源靶基因包括SOCS1，并且其中所述gRNA分子包含与由表6C和表6D中所示的一组基因组坐标定义的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。在一些实施方案中，gRNA分子包含与选自由SEQ ID NO:1088-1232组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。在一些实施方案中，gRNA分子包含由选自由SEQ ID NO:1088-1232组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列。
在一些实施方案中，一种或多种内源靶基因包括ANKRD11，并且其中所述gRNA分子包含与由表6E和表6F中所示的一组基因组坐标定义的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。在一些实施方案中，gRNA分子包含与选自由SEQ ID NO:1065-1087组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。在一些实施方案中，gRNA分子包含由选自由SEQ ID NO:1065-1087组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列。
在一些实施方案中，基因调控系统包含siRNA或shRNA核酸分子。在一些实施方案中，一种或多种内源靶基因选自IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6和IKZF2，或选自CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR，并且其中所述siRNA或shRNA分子包含与由表5A和表5B中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。在一些实施方案中，一种或多种内源靶基因选自IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6和IKZF2，并且其中所述siRNA或shRNA分子包含与由选自SEQ ID NO:154-498的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。在一些实施方案中，一种或多种内源靶基因选自CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR，并且其中所述siRNA或shRNA分子包含与由选自SEQ IDNO:499-813的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
在一些实施方案中，一种或多种内源靶基因选自BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS，并且其中所述siRNA或shRNA分子包含与由表6A和表6B中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。在一些实施方案中，所述siRNA或shRNA分子包含与由选自SEQ ID NO:814-1064的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
在一些实施方案中，一种或多种内源靶基因包括SOCS1，并且其中所述siRNA或shRNA分子包含与由表6C和表6D中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。在一些实施方案中，所述siRNA或shRNA分子包含与由选自SEQ IDNO:1088-1232的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。在一些实施方案中，一种或多种内源靶基因包括ANKRD11，并且其中所述siRNA或shRNA分子包含与由表6E和表6F中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。在一些实施方案中，所述siRNA或shRNA分子包含与由选自SEQ ID NO:1065-1087的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
在一些实施方案中，本公开提供了一种基因调控系统，其能够降低细胞中的两种或更多种内源靶基因的表达和/或功能，其中内源靶基因中的至少一种选自：(a)由BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS组成的组；(b)SOCS1；或(b)ANKRD11；并且内源靶基因中的至少一种选自：(a)由IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6和IKZF2组成的组；或(b)由CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR组成的组，其中所述系统包含(i)核酸分子；(ii)酶；或(iii)指导核酸分子和酶蛋白
在一些实施方案中，所述系统包含多种指导RNA(gRNA)核酸分子和Cas核酸内切酶。
在一些实施方案中，内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS，并且内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR。在一些实施方案中，多种gRNA中的至少一种与由表6A和表6B中所示的一组基因组坐标定义的靶DNA序列结合，并且其中多种gRNA中的至少一种与由表5A和表5B中所示的一组基因组坐标定义的靶DNA序列结合。在一些实施方案中，多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:814-1064组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列，并且其中多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。在一些实施方案中，多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ ID NO:814-1064组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列，并且其中多种gRNA分子中的至少一种包含由选自SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813的核酸序列编码的靶向结构域序列。
在一些实施方案中，内源靶基因中的至少一种选自由BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS组成的组，并且内源靶基因中的至少一种是CBLB。在一些实施方案中，多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:814-1064组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列，并且其中多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:499-524组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。在一些实施方案中，多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQID NO:814-1064组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列，并且其中多种gRNA分子中的至少一种包含由选自SEQ ID NO:499-524的核酸序列编码的靶向结构域序列。
在一些实施方案中，内源靶基因中的至少一种是SOCS1，并且内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR。在一些实施方案中，多种gRNA中的至少一种与由表6C和表6D中所示的一组基因组坐标定义的靶DNA序列结合，并且其中多种gRNA中的至少一种与由表5A和表5B中所示的一组基因组坐标定义的靶DNA序列结合。在一些实施方案中，多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:1088-1232组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列，并且其中多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。在一些实施方案中，多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ ID NO:1088-1232组成的组的DNA序列编码的靶向结构域序列，并且其中多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813组成的组的DNA序列编码的靶向结构域序列。在一些实施方案中，内源靶基因中的至少一种是SOCS1，并且内源靶基因中的至少一种是CBLB。在一些实施方案中，内源靶基因中的至少一种是SOCS1，并且内源靶基因中的至少一种是TNFAIP3。在一些实施方案中，内源靶基因中的至少一种是SOCS1，并且内源靶基因中的至少一种是BCOR。在一些实施方案中，多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:1088-1232组成的组的靶核酸序列结合的靶向结构域序列，并且其中多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自SEQ ID NO:499-524的靶核酸序列结合的靶向结构域序列。在一些实施方案中，多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ ID NO:1088-1232组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列，并且其中多种gRNA分子中的至少一种包含由选自SEQ ID NO:499-524的核酸序列编码的靶向结构域序列。
在一些实施方案中，内源靶基因中的至少一种是ANKRD11，并且内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR。在一些实施方案中，多种gRNA中的至少一种与由表6E和表6F中所示的一组基因组坐标定义的靶DNA序列结合，并且其中多种gRNA中的至少一种与由表5A和表5B中所示的一组基因组坐标定义的靶DNA序列结合。在一些实施方案中，多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:1065-1087组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列，并且其中多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。在一些实施方案中，多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ ID NO:1065-1087组成的组的DNA序列编码的靶向结构域序列，并且其中多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813组成的组的DNA序列编码的靶向结构域序列。在一些实施方案中，内源靶基因中的至少一种是ANKRD11，并且内源靶基因中的至少一种是CBLB。在一些实施方案中，内源靶基因中的至少一种是ANKRD11，并且内源靶基因中的至少一种是TNFAIP3。在一些实施方案中，内源靶基因中的至少一种是ANKRD11，并且内源靶基因中的至少一种是BCOR。在一些实施方案中，多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:1065-1087组成的组的靶核酸序列结合的靶向结构域序列，并且其中多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自SEQ ID NO:499-524的靶核酸序列结合的靶向结构域序列。在一些实施方案中，多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ ID NO:1065-1087组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列，并且其中多种gRNA分子中的至少一种包含由选自SEQ ID NO:499-524的核酸序列编码的靶向结构域序列。
在一些实施方案中，内源靶基因中的至少一种是ANKRD11，并且内源靶基因中的至少一种是SOCS1。在一些实施方案中，多种gRNA中的至少一种与由表6E和表6F中所示的一组基因组坐标定义的靶DNA序列结合，并且其中多种gRNA中的至少一种与由表6C和表6D中所示的一组基因组坐标定义的靶DNA序列结合。在一些实施方案中，多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:1065-1087组成的组的靶核酸序列结合的靶向结构域序列，并且其中多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自SEQ ID NO:1088-1232的靶核酸序列结合的靶向结构域序列。在一些实施方案中，多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQID NO:1065-1087组成的组的DNA序列编码的靶向结构域序列，并且其中多种gRNA分子中的至少一种包含由选自SEQ ID NO:1088-1232的DNA序列编码的靶向结构域序列。
在一些实施方案中，Cas蛋白是：野生型Cas蛋白，其包含两个酶活性结构域，并能够诱导双链DNA断裂；Cas切口酶突变体，其包含一个酶活性结构域并且能够诱导单链DNA断裂；失活的Cas蛋白(dCas)，并且与能够调节一种或多种内源靶基因的表达的异源蛋白相关联。在一些实施方案中，异源蛋白选自由MAX相互作用蛋白1(MXI1)、Krüppel相关盒(KRAB)结构域和四个串联的mSin3结构域(SID4X)组成的组。在一些实施方案中，Cas蛋白是Cas9蛋白。
在一些实施方案中，所述系统包含核酸分子，并且其中所述核酸分子是siRNA、shRNA、微小RNA(miR)、微小RNA拮抗剂或反义RNA。在一些实施方案中，该系统包含多个shRNA或siRNA分子。
在一些实施方案中，内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS，并且内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR。在一些实施方案中，多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由表6A和表6B中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由表5A和表5B中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。在一些实施方案中，多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQID NO:814-1064组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且其中多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
在一些实施方案中，内源靶基因中的至少一种选自由BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS组成的组，并且内源靶基因中的至少一种是CBLB。在一些实施方案中，多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:814-1064组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且其中多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:499-524组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
在一些实施方案中，内源靶基因中的至少一种是SOCS1，并且内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR。在一些实施方案中，多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由表6C和表6D中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由表5A和表5B中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。在一些实施方案中，多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:1088-1232组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。在一些实施方案中，内源靶基因中的至少一种是SOCS1，并且内源靶基因中的至少一种是CBLB。在一些实施方案中，多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:1088-1232组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:499-524组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
在一些实施方案中，内源靶基因中的至少一种是ANKRD11，并且内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR。在一些实施方案中，多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由表6E和表6F中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由表5A和表5B中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。在一些实施方案中，多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:1065-1087组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
在一些实施方案中，内源靶基因中的至少一种是ANKRD11，并且内源靶基因中的至少一种是CBLB。在一些实施方案中，多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:1065-1087组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:499-524组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
在一些实施方案中，内源靶基因中的至少一种是ANKRD11，并且内源靶基因中的至少一种是SOCS1。在一些实施方案中，多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由表6C和表6D中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由表6E和表6F中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。在一些实施方案中，多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:1088-1232组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:1065-1087组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
在一些实施方案中，所述系统包含含有DNA结合结构域和酶结构域的蛋白质，并且选自锌指核酸酶和转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)。
在一些实施方案中，本公开提供了一种基因调控系统，其包含编码一种或多种gRNA的载体和编码Cas核酸内切酶蛋白的载体，其中所述一种或多种gRNA包含由选自以下的核酸序列编码的靶向结构域序列：SEQ ID NO:814-1064、SEQ ID NO:1065-1087、SEQ IDNO:1088-1232、SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813。
在一些实施方案中，本公开提供了一种基因调控系统，其包含编码多种gRNA的载体和编码Cas核酸内切酶蛋白的载体，其中所述多种gRNA中的至少一种包含由选自SEQ IDNO:814-1064、SEQ ID NO:1065-1087和SEQ ID NO:1088-1232的核酸序列编码的靶向结构域序列，并且其中所述多种gRNA中的至少一种包含由选自SEQ ID NO:154-498或SEQ IDNO:499-813的核酸序列编码的靶向结构域序列。
在一些实施方案中，本公开提供了一种基因调控系统，其包含编码一种或多种gRNA的载体和编码Cas核酸内切酶蛋白的mRNA分子，其中所述一种或多种gRNA包含由选自以下的核酸序列编码的靶向结构域序列：SEQ ID NO:814-1064、SEQ ID NO:1065-1087、SEQID NO:1088-1232、SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813。
在一些实施方案中，本公开提供了一种基因调控系统，其包含编码多种gRNA的载体和编码Cas核酸内切酶蛋白的mRNA分子，其中所述多种gRNA中的至少一种包含由选自SEQID NO:814-1064、SEQ ID NO:1065-1087和SEQ ID NO:1088-1232的核酸序列编码的靶向结构域序列，并且其中所述多种gRNA中的至少一种包含由选自SEQ ID NO:154-498或SEQ IDNO:499-813的核酸序列编码的靶向结构域序列。
在一些实施方案中，本公开提供了一种基因调控系统，其包含一种或多种gRNA和Cas核酸内切酶蛋白，其中所述一种或多种gRNA包含由选自以下的核酸序列编码的靶向结构域序列：SEQ ID NO:814-1064、SEQ ID NO:1065-1087、SEQ ID NO:1088-1232、SEQ IDNO:154-498或SEQ ID NO:499-813，并且其中所述一种或多种gRNA和所述Cas核酸内切酶蛋白复合以形成核糖核蛋白(RNP)复合物。
在一些实施方案中，本公开提供了一种基因调控系统，其包含多种gRNA和Cas核酸内切酶蛋白：其中所述多种gRNA中的至少一种包含由选自SEQ ID NO:814-1064、SEQ IDNO:1065-1087和SEQ ID NO:1088-1232的核酸序列编码的靶向结构域序列，其中所述多种gRNA中的至少一种包含由选自SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813的核酸序列编码的靶向结构域序列，并且其中所述一种或多种gRNA和所述Cas核酸内切酶蛋白复合以形成核糖核蛋白(RNP)复合物。
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含本文所述的基因调控系统的试剂盒。
在一些实施方案中，本公开提供了一种gRNA核酸分子，其包含与内源靶基因中的靶序列互补的靶向域核酸序列，所述内源靶基因选自：(a)由BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS组成的组；(b)SOCS1；(c)ANKRD11；(d)由IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6和IKZF2组成的组；或(e)由CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR组成的组。
在一些实施方案中，内源基因选自由BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS组成的组，并且gRNA包含与位于选自表6A和6B中所示的基因组坐标处的靶DNA序列互补的靶向结构域序列；内源基因是SOCS1，并且gRNA包含与位于选自表6C和表6D中所示的基因组坐标处的靶DNA序列互补的靶向结构域序列；内源基因是ANKRD11，并且gRNA包含与位于选自表6E和表6F中所示的基因组坐标处的靶DNA序列互补的靶向结构域序列；内源基因选自由IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6和IKZF2组成的组，并且gRNA包含与位于选自表5A和表5B中所示的基因组坐标处的靶DNA序列互补的靶向结构域序列；或内源基因选自由CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR组成的组，并且gRNA包含与位于选自表5A和表5B中所示的基因组坐标处的靶DNA序列互补的靶向结构域序列。
在一些实施方案中，gRNA包含与选自以下的靶DNA序列结合的靶向结构域序列：SEQ ID NO:814-1064、SEQ ID NO:1088-1232、SEQ ID NO:1065-1087、SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813。在一些实施方案中，gRNA包含由选自以下的序列编码的靶向结构域序列：SEQ ID NO:814-1064、SEQ ID NO:1088-1232、SEQ ID NO:1065-1087、SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813。在一些实施方案中，靶序列包含PAM序列。
在一些实施方案中，gRNA是模块化gRNA分子。在一些实施方案中，gRNA是双gRNA分子。在一些实施方案中，靶向结构域的长度为16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或更多个核苷酸。在一些实施方案中，gRNA包含在其5'末端处或附近(例如，在其5'末端的1-10、1-5或1-2个核苷酸内)的修饰和/或在其3'末端处或附近(例如，在其3'末端的1-10、1-5或1-2个核苷酸内)的修饰。在一些实施方案中，修饰的gRNA在引入T细胞中时表现出增加的对核酸酶的稳定性。在一些实施方案中，修饰的gRNA在引入T细胞时表现出降低的先天性免疫应答。
在一些实施方案中，本公开提供了一种编码本文所述的gRNA分子的多核苷酸分子。在一些实施方案中，本公开提供了一种组合物，其包含一种或多种本文所述的gRNA分子或编码所述gRNA分子的多核苷酸。在一些实施方案中，本公开提供了一种试剂盒，其包含本文所述的gRNA分子或编码所述gRNA分子的多核苷酸。
在一些实施方案中，本公开提供了一种产生修饰的免疫效应细胞的方法，其包括：从受试者获得免疫效应细胞；将如权利要求157-244中的任一项所述的基因调控系统引入免疫效应细胞中；以及培养免疫效应细胞，使得一种或多种内源靶基因的表达和/或功能与未修饰的免疫效应细胞相比降低。
在一些实施方案中，本公开提供了一种产生修饰的免疫效应细胞的方法，其包括将如权利要求157-244中任一项所述的基因调控系统引入所述免疫效应细胞中。在一些实施方案中，所述方法还包括引入编码选自CAR和TCR的工程化免疫受体的多核苷酸序列。在一些实施方案中，通过微流体装置通过细胞膜的转染、转导、电穿孔或物理破坏将基因调控系统和/或编码工程化免疫受体的多核苷酸引入免疫效应细胞中。在一些实施方案中，基因调控系统以编码系统的一种或多种组分的多核苷酸序列、蛋白质或核糖核蛋白(RNP)复合物的形式引入。
在一些实施方案中，本公开提供了一种产生修饰的免疫效应细胞的方法，其包括：扩增培养中的免疫效应细胞的群体；以及将本文所述的基因调控系统引入免疫效应细胞的群体中。在一些实施方案中，所述方法还包括从受试者获得免疫效应细胞群体。在一些实施方案中，在扩增之前、期间或之后将基因调控系统引入免疫效应细胞群体中。在一些实施方案中，免疫效应细胞群体的扩增包括第一轮扩增和第二轮扩增。在一些实施方案中，在第一轮扩增之前、期间或之后，将基因调控系统引入免疫效应细胞群体中。在一些实施方案中，在第二轮扩增之前、期间或之后，将基因调控系统引入免疫效应细胞群体中。在一些实施方案中，在第一轮和第二轮扩增之前，将基因调控系统引入免疫效应细胞群体中。在一些实施方案中，在第一轮和第二轮扩增之后，将基因调控系统引入免疫效应细胞群体中。在一些实施方案中，在第一轮扩增之后和第二轮扩增之前，将基因调控系统引入免疫效应细胞群体中。
在一些实施方案中，本公开提供了一种治疗有需要的受试者中的疾病或病症的方法，其包括施用有效量的本文所述的修饰的免疫效应细胞或其组合物。在一些实施方案中，所述疾病或病症是细胞增殖性病症、炎性病症或感染性疾病。在一些实施方案中，所述疾病或病症是癌症或病毒感染。在一些实施方案中，癌症选自白血病、淋巴瘤或实体瘤。在一些实施方案中，实体瘤是黑素瘤、胰腺肿瘤、膀胱肿瘤、肺肿瘤或转移、结直肠癌或头颈癌。在一些实施方案中，癌症是PD1抗性或不敏感性癌症。在一些实施方案中，受试者先前已经用PD1抑制剂或PDL1抑制剂进行治疗。在一些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用与由NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4或PDCD1编码的蛋白质特异性结合并抑制其功能的抗体或其结合片段。
在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞对于受试者是自体的。在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞对于受试者是同种异体的。
在一些实施方案中，本公开提供了一种杀伤癌性细胞的方法，其包括将癌性细胞暴露于本文所述的修饰的免疫效应细胞或其组合物。在一些实施方案中，暴露是在体外、在体内或离体的。
在一些实施方案中，本公开提供了一种增强免疫效应细胞的一种或多种效应子功能的方法，其包括将本文所述的基因调控系统引入免疫效应细胞中。在一些实施方案中，本公开提供了一种增强免疫效应细胞的一种或多种效应子功能的方法，其包括将本文所述的基因调控系统引入免疫效应细胞中，其中与未修饰的免疫效应细胞相比，修饰的免疫效应细胞表现出一种或多种增强的效应子功能。在一些实施方案中，一种或多种效应子功能选自细胞增殖、细胞存活力、细胞毒性、肿瘤浸润、增加的细胞因子产量、抗肿瘤免疫应答和/或对耗竭的抗性。
附图说明
图1A-图1B示出了可以通过本文所述方法修饰的内源靶基因的组合。
图2A-图2B示出了可以通过本文所述方法修饰的内源靶基因的组合。
图3A-图3B示出了可以通过本文所述方法修饰的内源靶基因的组合。
图4A-图4D示出了使用本文所述方法对TRAC和B2M基因的编辑。
图5A-图5B示出了用于编辑原代人T细胞中CBLB的TIDE分析数据。
图6示出了与未编辑的对照(D6551-WT)相比，用CBLB sgRNA(D6551-CBLB)编辑的原代人T细胞中CBLB蛋白的蛋白质印迹。
图7A-图7B示出了在鼠B16/Ova同基因肿瘤模型中随时间推移的肿瘤生长。图7A示出了与对照编辑的OT1 T细胞相比，用Cblb编辑的OT1 T细胞治疗的小鼠中的肿瘤生长。图7B示出了与对照和Pd1编辑的OT1 T细胞相比，用Socs1编辑的OT1 T细胞治疗的小鼠中的肿瘤生长。
图8A-图8B示出了在鼠MC38/gp100同基因肿瘤模型中随时间推移的肿瘤生长。图8A示出了与对照编辑的T细胞相比，用Socs1编辑的PMEL T细胞治疗的小鼠中的肿瘤生长。图8B示出了与对照编辑的T细胞相比，用Ankrd11编辑的PMEL T细胞治疗的小鼠中的肿瘤生长。
图9示出了在鼠A375异种移植模型中，与对照编辑的T细胞相比，用CBLB编辑的T细胞治疗的小鼠中随时间推移的肿瘤生长。
图10示出了用BCOR编辑的、CBLB编辑的或BCOR/CBLB双重编辑的抗CD19 CAR T细胞治疗的小鼠中随时间推移的肿瘤生长。将肿瘤生长与未用CAR T细胞治疗的小鼠或用未编辑的抗CD19 CAR T细胞治疗的小鼠进行比较。
图11示出了在体外培养系统中BCOR编辑的或BCOR/CBLB编辑的CD19CAR T细胞的积累。
图12示出了在体外培养系统中BCOR编辑的或BCOR/CBLB编辑的CD19CAR T细胞的IL-2产量。
图13示出了在体外培养系统中BCOR编辑的或BCOR/CBLB编辑的CD19CAR T细胞的IFNγ产量。
图14示出了在鼠B16/Ova同基因肿瘤模型中用Cblb/Socs1双重编辑的OT1 T细胞治疗的小鼠中随时间推移的肿瘤生长。
图15示出了PD1/Lag3双重编辑的转基因T细胞在B16-Ova鼠肿瘤模型中的抗肿瘤功效。
图16示出了在SOCS1缺失后，响应于IL-2信号转导，原代人CD8 T细胞中pSTAT5水平的增加。
图17示出了在SOCS1平铺式筛选中的gRNA富集。
图18示出了具有靶向SOCS1的gRNA的CD4+和C8+人T细胞的体外积累。
图19示出了与靶向T细胞功能、PP2R2D、CBL和SOCS3的已知调控剂的指导物相比，具有靶向SOCS1的gRNA或靶向CBLB的gRNA的CD4+和C8+人T细胞的体外积累。
图20示出了具有靶向SOCS1的gRNA的鼠CD8+ T细胞的体外积累。
图21示出了与靶向T细胞功能、PDCD1和靶标-A的其他调控剂的指导物相比，具有靶向SOCS1的gRNA的鼠CD8+ T细胞的体外积累。
图22示出了具有靶向SOCS1和CBLB的指导物的人CAR-T细胞响应于抗原特异性刺激的体外积累。
图23A-图23B示出了PD1和CD25(图23A)以及4-1BB(图23B)在SOCS1编辑和对照编辑的肿瘤浸润淋巴细胞上的表面表达。
具体实施方式
本公开提供了与免疫效应细胞在免疫疗法的背景下提高其治疗功效的修饰有关的方法和组合物。在一些实施方案中，通过本公开的方法修饰免疫效应细胞以降低一种或多种内源靶基因的表达，或降低内源蛋白的一种或多种功能，使得免疫细胞的一种或多种效应子功能得以增强。在一些实施方案中，通过引入赋予抗原特异性的转基因来进一步修饰免疫效应细胞，诸如引入T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)表达构建体。在一些实施方案中，本公开提供了用于修饰免疫效应细胞的组合物和方法，诸如基因调控系统的组合物。在一些实施方案中，本公开提供了治疗细胞增殖性病症诸如癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用本文所述的修饰的免疫效应细胞。
I.定义
如本说明书和所附权利要求书中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一(a)”，“一(an)”和“所述(the)”包括复数指示物。
如本说明书中所使用的，除非另外指出，否则在本公开中使用的术语“和/或”是指“和”或“或”。
在整个说明书中，除非上下文另外要求，否则词语“包括(comprise)”或诸如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”的变型将被理解为暗示包括陈述的元件或整数或者元件或整数的组，但不排除任何其他元件或整数或者元件或整数的组。
如本申请中所使用的，术语“约”和“近似”被用作等同物。在本申请中使用的具有或不具有约/近似的任何数字旨在覆盖相关领域的普通技术人员所理解的任何正常波动。在某些实施方案中，术语“近似”或“约”是指落入在所述参考值的任一方向(大于或小于)上的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小范围内的值范围，除非另外说明或以另外的方式从上下文明显看出(除了这样的数值将超过可能值的100％的情况)。
“减小”或“降低”是指与参考值相比特定值减小或降低至少5％，例如减小5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％。特定值的减小或降低也可以表示为与参考值相比值的倍数变化，例如与参考值相比减小至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000倍或更多。
“增加”是指与参考值相比特定值增加至少5％，例如增加5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％、200％、300％、400％、500％或更多。特定值的增加也可以表示为与参考值相比值的倍数变化，例如与参考值的水平相比增加至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000倍或更多。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用并且是指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可包括编码和非编码氨基酸、化学或生物化学修饰的或衍生的氨基酸以及具有修饰的肽骨架的多肽。
本文可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。因此，此术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体或包含嘌呤碱基和嘧啶碱基或其他天然的、化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。“寡核苷酸”通常是指单链或双链DNA的约5与约100个核苷酸之间的多核苷酸。然而，出于本公开的目的，寡核苷酸的长度不存在上限。寡核苷酸也被称为“寡聚体(oligomers)”或“寡聚体(oligos)”，并且可以从基因中分离，或通过本领域已知的方法化学合成。术语“多核苷酸”和“核酸”应理解为包括如可适用于所描述的实施方案的单链(例如有义或反义)和双链多核苷酸。
“片段”是指包含少于整个多肽或多核苷酸序列的多肽或多核苷酸分子的一部分。在一些实施方案中，多肽或多核苷酸的片段包含参考多肽或多核苷酸全长的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，多肽或多核苷酸片段可以包含5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多个核苷酸或氨基酸。
术语“序列同一性”是指两个多核苷酸或多肽序列之间的碱基或氨基酸相同且在相同的相对位置中的百分比。因此，与另一种多核苷酸或多肽序列相比，一个多核苷酸或多肽序列具有一定百分比的序列同一性。对于序列比较，通常将一个序列用作参考序列，将其与测试序列进行比较。术语“参考序列”是指与测试序列进行比较的分子。
“互补”是指通过碱基堆积和特异性氢键在包含天然或非天然存在的碱基或其类似物的两个序列之间配对的能力。例如，如果核酸的一个位置处的碱基能够与靶的对应位置处的碱基形成氢键，则认为所述碱基在该位置处彼此互补。核酸可包含通用碱基或者对氢键不提供正或负贡献的惰性无碱基间隔区。碱基配对可以包括规范的Watson-Crick碱基配对和非Watson-Crick碱基配对(例如，Wobble碱基配对和Hoogsteen碱基配对)。应当理解，对于互补碱基配对，腺苷型碱基(A)与胸苷型碱基(T)或尿嘧啶型碱基(U)互补，胞嘧啶型碱基(C)与鸟苷型碱基(G)互补，并且诸如3-硝基吡咯或5-硝基吲哚的通用碱基可以与任何A、C、U或T杂交并被认为与其互补。Nichols等人,Nature,1994；369:492-493和Loakes等人,Nucleic Acids Res.,1994；22:4039-4043。肌苷(I)在本领域中也被认为是通用碱基，并且被认为与任何A、C、U或T互补。参见Watkins和SantaLucia,Nucl.Acids Research,2005；33(19):6258-6267。
如本文所指，“互补核酸序列”是包含使其能够在适当的体外和/或体内温度和溶液离子强度的条件下以序列特异性、反平行的方式(即，核酸特异性结合互补核酸)非共价结合至另一核酸的核苷酸序列的核酸序列。
用于比较和确定序列同一性百分比和互补性百分比的序列比对方法是本领域众所周知的。用于比较的序列的最佳比对可以通过以下来进行，例如，通过Needleman和Wunsch,(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman,(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444的相似性检索方法，通过这些算法(威斯康星州遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package),Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)的计算机化实现，通过人工比对和目测检查(参见，例如，Brent等人,(2003)Current Protocols in MolecularBiology)，通过使用本领域已知的算法，包括BLAST和BLAST 2.0算法，其分别在Altschul等人,(1977)Nuc.Acids Res.25:3389-3402；和Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中描述。用于执行BLAST分析的软件为通过国家生物技术信息中心(National Centerfor Biotechnology Information)可公开获得的。
在本文中，术语“杂交”是指互补核苷酸碱基之间(例如，腺嘌呤(A)与DNA分子中的胸腺嘧啶(T)和RNA分子中的尿嘧啶(U)形成碱基对，鸟嘌呤(G)与DNA和RNA分子中的胞嘧啶(C)形成碱基对)形成双链核酸分子的配对。(参见，例如，Wahl和Berger(1987)MethodsEnzymol.152:399；Kimmel,(1987)Methods Enzymol.152:507)。另外，本领域中还已知对于两个RNA分子(例如，dsRNA)之间的杂交，鸟嘌呤(G)碱基与尿嘧啶(U)配对。例如，G/U碱基配对是在tRNA反密码子碱基配对mRNA中的密码子的背景下的遗传密码简并(即，冗余)的部分原因。在本公开的背景下，指导RNA分子的蛋白结合区段(dsRNA双链体)的鸟嘌呤(G)被认为与尿嘧啶(U)互补，并且反之亦然。因此，当可以在给定的核苷酸位置对指导RNA分子的蛋白质结合区段(dsRNA双链体)制造G/U碱基对时，不认为所述位置是非互补的，而是认为是互补的。在本领域中应理解，多核苷酸的序列不需要与其可特异性杂交的靶核酸的序列100％互补。此外，多核苷酸可以在一个或多个区段上杂交以使得居间或相邻的区段不参与杂交事件(例如环结构或发夹结构)。多核苷酸可包含与其靶向的靶核酸序列内的靶区域至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％、或100％的序列互补性。
术语“修饰的”是指与对应的未修饰的物质或化合物相比已经改变或变化的物质或化合物(例如细胞、多核苷酸序列和/或多肽序列)。
如本文所用，当用于核酸、多肽、细胞或生物体时，术语“天然存在的”是指在自然界中发现的核酸、多肽、细胞或生物体。例如，可从自然中的来源分离并且不通过人在实验室中有意修饰的存在于生物体(包括病毒)中的多肽或多核苷酸序列为天然存在的。
“分离的”是指在不同程度上与在其天然状态下发现的通常伴随其的组分分离的材料。
“表达盒”或“表达构建体”是指可操作地连接至启动子的DNA多核苷酸序列。“可操作地连接”是指其中所述组分处于允许它们以其预期的方式起作用的关系的并置。例如，如果启动子影响多核苷酸序列的转录或表达，则启动子可操作地连接到多核苷酸序列。
如本文所用，术语“重组载体”是指能够转移或转运插入载体中的另一种多核苷酸的多核苷酸分子。插入的多核苷酸可以是表达盒。在一些实施方案中，重组载体可以是病毒载体或非病毒载体(例如质粒)。
术语“样品”是指进行分析和/或遗传修饰的生物组合物(例如，细胞或组织的一部分)。在一些实施方案中，样品是直接从受试者获得的“原始样品”；在一些实施方案中，“样品”是处理原始样品以例如去除某些组分和/或分离或纯化感兴趣的某些组分的结果。
术语“受试者”包括动物，例如哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是灵长类动物。在一些实施方案中，哺乳动物是人。在一些实施方案中，受试者是家畜，诸如牛、绵羊、山羊、牛、猪等；或家养动物，诸如狗和猫。在一些实施方案中(例如，特别是在研究背景下)，受试者是啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠)、兔、灵长类动物或猪(诸如近交猪)等。术语“受试者”和“患者”在本文可互换使用。
“施用”在本文中是指将药剂或组合物引入受试者。
如本文所用，“治疗”是指将药剂或组合物递送至受试者以影响生理结果。
如本文所用，术语“有效量”是指产生特定生理作用所需的药剂或组合物的最小量。特定药剂的有效量可以基于药剂的性质以多种方式表示，诸如质量/体积、细胞的数量/体积、颗粒/体积、(药剂的质量)/(受试者的质量)、细胞的数量/(受试者的质量)、或颗粒/(受试者的质量)。特定药剂的有效量也可以表示为半最大有效浓度(EC50)，其是指导致特定生理应答的量值为参考水平与最大应答水平之间的一半的药剂浓度。
细胞的“群体”是指大于1的任意数量的细胞，但优选地至少1x103个细胞、至少1x104个细胞、至少1x105个细胞、至少1x106个细胞、至少1x107个细胞、至少1x108个细胞、至少1x109个细胞、至少1x1010个细胞或更多个细胞。细胞群体可以指体外群体(例如，培养中的细胞群体)或体内群体(例如，位于特定组织中的细胞群体)。
分子和细胞生物化学中的一般方法可以在标准教科书中找到，诸如MolecularCloning:A Laboratory Manual,第3版(Sambrook等人,HaRBor Laboratory Press 2001)；Short Protocols in Molecular Biology,第4版(Ausubel等人编辑,John Wiley&Sons1999)；Protein Methods(Bollag等人,John Wiley&Sons 1996)；Nonviral Vectors forGene Therapy(Wagner等人编辑,Academic Press 1999)；Viral Vectors(Kaplift&Loewy编辑,Academic Press 1995)；Immunology Methods Manual(I.Lefkovits编辑,AcademicPress 1997)；以及Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures inBiotechnology(Doyle&Griffiths,John Wiley&Sons 1998)，其公开内容以引用的方式并入本文。
II.修饰的免疫效应细胞
在一些实施方案中，本公开提供了修饰的免疫效应细胞。本文中，术语“修饰的免疫效应细胞”涵盖包含导致降低的一种或多种内源靶基因的表达和/或功能的一种或多种基因组修饰的免疫效应细胞，以及包含能够降低一种或多种内源靶基因的表达和/或功能的基因调控系统的免疫效应细胞。本文中，“未修饰的免疫效应细胞”或“对照免疫效应细胞”是指其中基因组未被修饰并且不包含基因调控系统或包含对照基因调控系统(例如，空载体对照、非靶向gRNA、加扰siRNA等)的细胞或细胞群体。
术语“免疫效应细胞”是指参与进行先天性和适应性免疫应答的细胞，包括但不限于淋巴细胞(诸如T细胞(包括胸腺细胞)和B细胞)、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞和肥大细胞。在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞是T细胞，诸如CD4+T细胞、CD8+ T细胞(也称为细胞毒性T细胞或CTL)、调控性T细胞(Treg)、Th1细胞、Th2细胞或Th17细胞。
在一些实施方案中，免疫效应细胞是从肿瘤样品中分离的T细胞(本文中称为“肿瘤浸润淋巴细胞”或“TIL”)。不希望受理论的束缚，认为TIL对肿瘤抗原具有增加的特异性(Radvanyi等人,2012 Clin Canc Res 18:6758-6770)，并且因此可以介导肿瘤抗原特异性免疫应答(例如，对癌细胞的活化、增殖和细胞毒性活性)，从而在不引入外源工程化受体的情况下导致癌细胞破坏(Brudno等人,2018 Nat Rev Clin Onc 15:31-46)。因此，在一些实施方案中，从受试者的肿瘤中分离出TIL，将其进行离体扩增，并再输注到受试者中。在一些实施方案中，修饰TIL以表达对自体肿瘤抗原具有特异性的一种或多种外源受体，将TIL进行离体扩增，并再输注到受试者中。可以使用体内小鼠模型来对此类实施方案进行建模，其中小鼠已经移植了表达癌症抗原(例如CD19)的癌细胞系，并用表达对癌症抗原具有特异性的外源受体的修饰的T细胞治疗(参见例如，实施例10和11)。
在一些实施方案中，免疫效应细胞是动物细胞或来源于动物细胞，包括无脊椎动物和脊椎动物(例如，鱼、两栖动物、爬行动物、鸟类或哺乳动物)。在一些实施方案中，免疫效应细胞是哺乳动物细胞或来源于哺乳动物细胞(例如，猪、牛、山羊、绵羊、啮齿动物、非人灵长类动物、人等)。在一些实施方案中，免疫效应细胞是啮齿动物细胞或来源于啮齿动物细胞(例如，大鼠或小鼠)。在一些实施方案中，免疫效应细胞是人细胞或来源于人细胞。
在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含在内源靶基因的基因组DNA序列中的一个或多个修饰(例如，一个或多个核酸的插入、缺失或突变)，从而导致降低的内源基因的表达和/或功能。此类修饰在本文中称为“失活突变”，而包含失活突变的内源基因称为“修饰的内源靶基因”。在一些实施方案中，失活突变降低或抑制mRNA转录，从而降低编码的mRNA转录物和蛋白质的表达水平。在一些实施方案中，失活突变降低或抑制mRNA翻译，从而降低编码的蛋白的表达水平。在一些实施方案中，失活突变编码与内源蛋白的未修饰(即，野生型)型式(例如，下文所述的显性-负突变体)相比功能降低或改变的修饰的内源蛋白。
在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含在内源靶基因以外的基因组位置处的一种或多种基因组修饰，其导致降低的内源靶基因的表达和/或功能或导致内源蛋白的修饰型式的表达。例如，在一些实施方案中，将编码基因调控系统的多核苷酸序列插入基因组中的一个或多个位置中，从而在基因调控系统表达时降低内源靶基因的表达和/或功能。在一些实施方案中，将编码内源蛋白的修饰型式的多核苷酸序列插入基因组中的一个或多个位置处，其中与蛋白质的未修饰或野生型型式(例如，下文所述的显性-负突变体)相比，蛋白质的修饰型式的功能降低。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的免疫效应细胞包含一种或多种修饰的内源靶基因，其中与未修饰的免疫效应细胞相比，所述一种或多种修饰导致由内源靶基因编码的基因产物(即，mRNA转录物或蛋白质)的表达和/或功能降低。例如，在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞表现出降低的mRNA转录物表达和/或降低的蛋白质表达。在一些实施方案中，与未修饰的免疫效应细胞中基因产物的表达相比，修饰的免疫效应细胞中基因产物的表达降低至少5％。在一些实施方案中，与未修饰的免疫效应细胞中基因产物的表达相比，修饰的免疫效应细胞中基因产物的表达降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在一些实施方案中，与未修饰的免疫效应细胞中基因产物的表达相比，本文所述的修饰的免疫效应细胞表现出由多种(例如，两种或更多种)内源靶基因编码的基因产物的降低的表达和/或功能。例如，在一些实施方案中，与未修饰的免疫效应细胞中基因产物的表达相比，修饰的免疫效应细胞表现出2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种内源靶基因的基因产物的降低的表达和/或功能。
在一些实施方案中，本公开提供了修饰的免疫效应细胞，其中一种或多种内源靶基因或其部分被缺失(即，“敲除”)，使得修饰的免疫效应细胞不表达mRNA转录物或蛋白质。在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包括多种内源靶基因或其部分的缺失。在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种内源靶基因的缺失。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的免疫效应细胞包含一种或多种修饰的内源靶基因，其中与在未修饰的免疫效应细胞中表达的对应蛋白(例如，“未修饰的内源蛋白”)的功能相比，对靶DNA序列的一种或多种修饰导致功能降低或改变的蛋白质(例如，“修饰的内源蛋白”)的表达。在一些实施方案中，本文所述的修饰的免疫效应细胞包含编码2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种修饰的内源蛋白的2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种修饰的内源靶基因。在一些实施方案中，修饰的内源蛋白表现出对由修饰的免疫效应细胞表达或由另一种细胞表达的另一种蛋白质的降低或改变的结合亲和力；降低或改变的信号传导能力；降低或改变的酶活性；降低或改变的DNA结合活性；或者降低或改变的作为支架蛋白的能力。
在一些实施方案中，修饰的内源靶基因包含一个或多个显性负突变。如本文所用，“显性负突变”是指靶基因的一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，使得编码的蛋白质对由未修饰的靶基因编码的蛋白质起拮抗作用。突变是显性负突变，因为负表型相对于对应的未修饰基因的正表型赋予基因优势。包含一个或多个显性负突变的基因和由其编码的蛋白质被称为“显性负突变体”，例如，显性负基因和显性负蛋白质。在一些实施方案中，显性负突变蛋白质由插入在免疫效应细胞的基因组中一个或多个位置处的外源转基因编码。
主导负性的各种机制是已知的。通常，显性负突变体的基因产物保留未修饰基因产物的某些功能，但缺乏未修饰基因产物的一种或多种关键的其他功能。这导致显性负突变体拮抗未修饰的基因产物。例如，作为说明性的实施方案，转录因子的显性负突变体可能缺少功能性活化结构域，但是保留功能性DNA结合结构域。在此实例中，显性负转录因子不能像未修饰的转录因子那样活化DNA的转录，但是显性负转录因子可以通过阻止未修饰的转录因子与转录因子结合位点的结合来间接抑制基因表达。作为另一个说明性的实施方案，作为二聚体的蛋白质的显性负突变是已知的。此类二聚体蛋白的显性负突变体可以保留与未修饰的蛋白质二聚的能力，但是不能发挥其他功能。显性负单体通过与未修饰的单体二聚形成异二聚体，阻止未修饰的单体形成功能性同二聚体。
在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含能够降低一种或多种内源靶基因的表达或功能的基因调控系统。基因调控系统可以通过多种机制降低内源靶基因修饰的表达和/或功能，所述机制包括通过修饰内源靶基因的基因组DNA序列(例如，通过在基因组DNA序列中插入、缺失或突变一个或多个核酸)；通过调控内源靶基因的转录(例如，抑制或阻遏mRNA转录)；和/或通过调控内源靶基因的翻译(例如，通过mRNA降解)。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的免疫效应细胞包含基因调控系统(例如，基于核酸的基因调控系统、基于蛋白质的基因调控系统或基于蛋白质/核酸组合的基因调控系统)。在此类实施方案中，包含在修饰的免疫效应细胞中的基因调控系统能够修饰一种或多种内源靶基因。在一些实施方案中，本文所述的修饰的免疫效应细胞包含基因调控系统，其包含：
(a)一种或多种核酸分子，其能够降低由一种或多种内源靶基因编码的基因产物的表达或修饰其功能；
(b)一种或多种多核苷酸，其编码能够降低由一种或多种内源靶基因编码的基因产物的表达或修饰其功能的核酸分子；
(c)一种或多种蛋白质，其能够降低由一种或多种内源靶基因编码的基因产物的表达或修饰其功能；
(d)一种或多种多核苷酸，其编码能够降低由一种或多种内源靶基因编码的基因产物的表达或修饰其功能的蛋白质；
(e)一种或多种指导RNA(gRNA)，其能够与内源基因中的靶DNA序列结合；
(f)一种或多种多核苷酸，其编码一种或多种能够与内源基因中的靶DNA序列结合的gRNA；
(g)一种或多种定点修饰多肽，其能够与gRNA相互作用并修饰内源基因中的靶DNA序列；
(h)一种或多种多核苷酸，其编码能够与gRNA相互作用并修饰内源基因中的靶DNA序列的定点修饰多肽；
(i)一种或多种指导DNA(gDNA)，其能够与内源基因中的靶DNA序列结合；
(j)一种或多种多核苷酸，其编码一种或多种能够与内源基因中的靶DNA序列结合的gDNA；
(k)一种或多种定点修饰多肽，其能够与gDNA相互作用并修饰内源基因中的靶DNA序列；
(l)一种或多种多核苷酸，其编码能够与gDNA相互作用并修饰内源基因中的靶DNA序列的定点修饰多肽；
(m)一种或多种gRNA，其能够与由内源基因编码的靶mRNA序列结合；
(n)一种或多种多核苷酸，其编码一种或多种能够与由内源基因编码的靶mRNA序列结合的gRNA；
(o)一种或多种定点修饰多肽，其能够与gRNA相互作用并修饰由内源基因编码的靶mRNA序列；
(p)一种或多种多核苷酸，其编码能够与gRNA相互作用并修饰由内源基因编码的靶mRNA序列的定点修饰多肽；或
(q)以上的任何组合。
在一些实施方案中，将编码基因调控系统的一种或多种多核苷酸插入免疫效应细胞的基因组中。在一些实施方案中，编码基因调控系统的一种或多种多核苷酸是附加型表达的，并且不插入免疫效应细胞的基因组中。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的免疫效应细胞包含降低的一种或多种内源靶基因的表达和/或功能，并且还包含插入在一个或多个基因组基因座处的一种或多种外源转基因(例如，遗传“敲入”)。在一些实施方案中，一种或多种外源转基因编码可检测标签、安全转换系统、嵌合转换受体和/或工程化抗原特异性受体。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的免疫效应细胞还包含编码可检测标签的外源转基因。可检测标签的实例包括但不限于FLAG标签、聚组氨酸标签(例如6xHis)、SNAP标签、Halo标签、cMyc标签、谷胱甘肽-S-转移酶标签、抗生物素蛋白、酶、荧光蛋白、发光蛋白、化学发光蛋白、生物发光蛋白和磷光蛋白。在一些实施方案中，荧光蛋白选自由以下组成的组：蓝色/UV蛋白(诸如BFP、TagBFP、mTagBFP2、Azurite、EBFP2、mKalama1、Sirius、Sapphire和T-Sapphire)；青色蛋白(诸如CFP、eCFP、Cerulean、SCFP3A、mTurquoise、mTurquoise2、单体Midoriishi-Cyan、TagCFP和mTFP1)；绿色蛋白(诸如：GFP、eGFP、meGFP(A208K突变)、Emerald、Superfolder GFP、单体Azami Green、TagGFP2、mUKG、mWasabi、Clover和mNeonGreen)；黄色蛋白(诸如YFP、eYFP、Citrine、Venus、SYFP2和TagYFP)；橙色蛋白(诸如单体Kusabira-Orange、mKOκ、mKO2、mOrange和mOrange2)；红色蛋白(诸如RFP、mRaspberry、mCherry、mStrawberry、mTangerine、tdTomato、TagRFP、TagRFP-T、mApple、mRuby和mRuby2)；远红色蛋白(诸如mPlum、HcRed-Tandem、mKate2、mNeptune和NirFP)；近红外蛋白(诸如TagRFP657、IFP1.4和iRFP)；长斯托克斯位移蛋白(诸如mKeima Red、LSS-mKate1、LSS-mKate2和mBeRFP)；光活化蛋白(诸如PA-GFP、PAmCherry1和PATagRFP)；光转换蛋白(诸如Kaede(绿色)、Kaede(红色)、KikGR1(绿色)、KikGR1(红色)、PS-CFP2、PS-CFP2、mEos2(绿色)、mEos2(红色)、mEos3.2(绿色)、mEos3.2(红色)、PSmOrange和PSmOrange)；和光可转换蛋白(诸如Dronpa)。在一些实施方案中，可检测标签可以选自AmCyan、AsRed、DsRed2、DsRedExpress、E2-Crimson、HcRed、ZsGreen、ZsYellow、mCherry、mStrawberry、mOrange、mBanana、mPlum、mRasberry、tdTomato、DsRed单体和/或AcGFP，所有这些均可从Clontech获得。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的免疫效应细胞还包含编码安全转换系统的外源转基因。安全转换系统(本领域中也称为自杀基因系统)包含编码一种或多种蛋白质的外源转基因，所述蛋白质能够在将细胞施用于受试者后消除修饰的免疫效应细胞。安全转换系统的实例在本领域中是已知的。例如，安全转换系统包括编码将无毒性前药转化为有毒性化合物的蛋白质的基因，诸如单纯疱疹胸苷激酶(Hsv-tk)和更昔洛韦(GCV)系统(Hsv-tk/GCV)。Hsv-tk将无毒性GCV转化为细胞毒性化合物，其导致细胞凋亡。因此，向已经用包含编码Hsv-tk蛋白的转基因的修饰的免疫效应细胞治疗的受试者施用GCV可以选择性地消除修饰的免疫效应细胞，同时保留内源免疫效应细胞。(参见例如，Bonini等人,Science,1997,276(5319):1719-1724；Ciceri等人,Blood,2007,109(11):1828-1836；Bondanza等人,Blood 2006,107(5):1828-1836)。
另外的安全转换系统包括编码细胞表面标记的基因，使得通过经由ADCC施用对细胞表面标记物具有特异性的单克隆抗体能够消除修饰的免疫效应细胞。在一些实施方案中，细胞表面标记物是CD20，并且可以通过施用抗CD20单克隆抗体(诸如利妥昔单抗)来消除修饰的免疫效应细胞(参见例如，Introna等人,Hum Gene Ther,2000,11(4):611-620；Serafini等人,Hum Gene Ther,2004,14,63-76；van Meerten等人,Gene Ther,2006,13,789-797)。在国际PCT公开号WO 2018006880中描述了使用EGF-R和西妥昔单抗或帕尼单抗的类似系统。另外的安全转换系统包括编码促凋亡分子的转基因，所述促凋亡分子包含一个或多个用于二聚化的化学诱导剂(CID)的结合位点，使得能够通过施用CID来消除修饰的免疫效应细胞，所述CID诱导促凋亡分子的寡聚化和凋亡途径的活化。在一些实施方案中，促凋亡分子是Fas(也称为CD95)(Thomis等人,Blood,2001,97(5),1249-1257)。在一些实施方案中，促凋亡分子是胱天蛋白酶9(Straathof等人,Blood,2005,105(11),4247-4254)。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的免疫效应细胞还包含编码嵌合转换受体的外源转基因。嵌合转换受体是工程化细胞表面受体，其包含来自内源细胞表面受体的细胞外结构域和异源细胞内信号传导结构域，使得细胞外结构域对配体的识别导致信号级联的活化，其与野生型形式的细胞表面受体所活化的信号级联不同。在一些实施方案中，嵌合转换受体包含与细胞内结构域融合的抑制性细胞表面受体的细胞外结构域，所述细胞内结构域导致传递活化信号而不是通常由抑制性细胞表面受体转导的抑制信号。在特定的实施方案中，来源于已知抑制免疫效应细胞活化的细胞表面受体的细胞外结构域可以与活化细胞内结构域融合。然后，对应配体的接合将活化信号级联，其增加而不是抑制免疫效应细胞的活化。例如，在一些实施方案中，本文所述的修饰的免疫效应细胞包含编码PD1-CD28转换受体的转基因，其中PD1的细胞外结构域与CD28的细胞内信号传导结构域融合(参见例如，Liu等人,Cancer Res 76:6(2016),1578-1590和Moon等人,Molecular Therapy 22(2014),S201)。在一些实施方案中，本文所述的修饰的免疫效应细胞包含编码CD200R的细胞外结构域和CD28的细胞内信号传导结构域的转基因(参见Oda等人,Blood 130:22(2017),2410-2419)。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的免疫效应细胞还包含识别由靶细胞表达的蛋白质靶的工程化抗原特异性受体，所述靶细胞诸如肿瘤细胞或抗原呈递细胞(APC)，本文称为“修饰的受体工程化细胞”或“修饰的RE-细胞”。术语“工程化抗原受体”是指非天然存在的抗原特异性受体，诸如嵌合抗原受体(CAR)或重组T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，工程化抗原受体是CAR，其包含经由铰链和跨膜结构域与包含信号传导结构域的细胞质结构域融合的细胞外抗原结合结构域。在一些实施方案中，CAR细胞外结构域以MHC非依赖性方式与由靶细胞表达的抗原结合，从而导致RE细胞的活化和增殖。在一些实施方案中，CAR的细胞外结构域识别与抗体或其抗原结合片段融合的标签。在此类实施方案中，CAR的抗原特异性取决于标记的抗体的抗原特异性，使得单个CAR构建体可以通过用一种抗体取代另一种抗体来靶向多种不同的抗原(参见例如，美国专利号9,233,125和9,624,279；美国专利申请公开号20150238631和20180104354)。在一些实施方案中，CAR的细胞外结构域可包含来源于抗体的抗原结合片段。可用于本公开的抗原结合结构域包括例如scFv；抗体；抗体的抗原结合区；重链/轻链的可变区；和单链抗体。
在一些实施方案中，CAR的细胞内信号传导结构域可以来源于TCR复合物ζ链(诸如CD3ξ信号传导结构域)、FcγRIII、FcεRI或T淋巴细胞活化结构域。在一些实施方案中，CAR的细胞内信号传导结构域还包含共刺激结构域，例如4-1BB、CD28、CD40、MyD88或CD70结构域。在一些实施方案中，CAR的细胞内信号传导结构域包含两个共刺激结构域，例如4-1BB、CD28、CD40、MyD88或CD70结构域中的任意两个。示例性CAR结构和细胞内信号传导结构域是本领域已知的(参见例如，WO 2009/091826；US 20130287748；WO 2015/142675；WO 2014/055657；和WO 2015/090229，以引用的方式并入本文)。
对多种肿瘤抗原具有特异性的CAR是本领域中已知的，例如CD171特异性CAR(Park等人,Mol Ther(2007)15(4):825-833)、EGFRvIII特异性CAR(Morgan等人,Hum Gene Ther(2012)23(10):1043-1053)、EGF-R特异性CAR(Kobold等人,J Natl Cancer Inst(2014)107(1):364)、碳酸酐酶K特异性CAR(Lamers等人,Biochem Soc Trans(2016)44(3):951-959)、FR-α特异性CAR(Kershaw等人,Clin Cancer Res(2006)12(20):6106-6015)、HER2特异性CAR(Ahmed等人,J Clin Oncol(2015)33(15)1688-1696；Nakazawa等人,Mol Ther(2011)19(12):2133-2143；Ahmed等人,Mol Ther(2009)17(10):1779-1787；Luo等人,Cell Res(2016)26(7):850-853；Morgan等人,Mol Ther(2010)18(4):843-851；Grada等人,Mol TherNucleic Acids(2013)9(2):32)、CEA特异性CAR(Katz等人,Clin Cancer Res(2015)21(14):3149-3159)、IL13Rα2特异性CAR(Brown等人,Clin Cacner Res(2015)21(18):4062-4072)、GD2特异性CAR(Louis等人,Blood(2011)118(23):6050-6056；Caruana等人,Nat Med(2015)21(5):524-529)、ErbB2特异性CAR(Wilkie等人,J Clin Immunol(2012)32(5):1059-1070)、VEGF-R特异性CAR(Chinnasamy等人,Cancer Res(2016)22(2):436-447)、FAP特异性CAR(Wang等人,Cancer Immunol Res(2014)2(2):154-166)、MSLN特异性CAR(Moon等人,Clin Cancer Res(2011)17(14):4719-30)、NKG2D特异性CAR(VanSeggelen等人,MolTher(2015)23(10):1600-1610)、CD19特异性CAR(Axicabtagene ciloleucel
和Tisagenlecleucel
还参见Li等人,J Hematol和Oncol(2018)11(22)，其综述了肿瘤特异性CAR的临床试验。
在一些实施方案中，工程化抗原受体是工程化TCR。工程化TCR包含已从识别特定靶抗原的T细胞群体中分离并克隆的TCRα和/或TCRβ链。例如，TCRα和/或TCRβ基因(即TRAC和TRBC)可以从分离自患有特定恶性肿瘤的个体的T细胞群体或已分离自用特异性肿瘤抗原或肿瘤细胞免疫的人源化小鼠的T细胞群体中克隆而来。工程化TCR通过与其内源对应物相同的机制识别抗原(例如，通过识别在靶细胞表面上表达的主要组织相容性复合物(MHC)蛋白的背景下呈递的其同源抗原)。这种抗原接合刺激内源信号转导途径，从而导致TCR工程化细胞的活化和增殖。
对肿瘤抗原具有特异性的工程化TCR是本领域已知的，例如WT1特异性TCR(JTCR016，Juno Therapeutics；WT1-TCRc4，美国专利申请公开号20160083449中所描述)、MART-1特异性TCR(包括DMF4T克隆，Morgan等人,Science 314(2006)126-129中所描述)；DMF5T克隆，Johnson等人,Blood114(2009)535-546中所描述)；以及ID3T克隆；van denBerg等人,Mol.Ther.23(2015)1541-1550中所描述)、gp100特异性TCR(Johnson等人,Blood114(2009)535-546)、CEA特异性TCR(Parkhurst等人,Mol Ther.19(2011)620-626)、NY-ESO和LAGE-1特异性TCR(1G4T克隆，Robbins等人,J Clin Oncol 26(2011)917-924；Robbins等人,Clin Cancer Res 21(2015)1019-1027；和Rapoport等人,Nature Medicine 21(2015)914-921中所描述)和MAGE-A3特异性TCR(Morgan等人,J Immunother 36(2013)133-151)和Linette等人,Blood122(2013)227-242)。(还参见，Debets等人,Seminars in Immunology23(2016)10-21)。
在一些实施方案中，工程化抗原受体针对选自以下的靶抗原：分化分子簇，诸如CD3、CD4、CD8、CD16、CD24、CD25、CD33、CD34、CD45、CD64、CD71、CD78、CD80(也称为B7-1)、CD86(也称为B7-2)、CD96、CD116、CD117、CD123、CD133和CD138、CD371(也称为CLL1)；肿瘤相关表面抗原，诸如5T4、BCMA(也称为CD269和TNFRSF17，UniProt#Q02223)、癌胚抗原(CEA)、碳酸酐酶9(CAIX或MN/CAIX)、CD19、CD20、CD22、CD30、CD40、双唾液酸神经节苷脂诸如GD2、ELF2M、导管上皮粘蛋白、肝配蛋白B2、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、ErbB2(HER2/neu)、FCRL5(UniProt#Q68SN8)、FKBP11(UniProt#Q9NYL4)、神经胶质瘤相关抗原、糖鞘脂、gp36、GPRC5D(UniProt#Q9NZD1)、mut hsp70-2、肠羧基酯酶、IGF-I受体、ITGA8(UniProt#P53708)、KAMP3、LAGE-1a、MAGE、间皮素、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、NKG2D、Nkp30、NY-ESO-1、PAP、前列腺酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、前列腺特异性抗原(PSA)、PSMA、前列腺素(prostein)、RAGE-1、ROR1、RU1(SFMBT1)、RU2(DCDC2)、SLAMF7(UniProt#Q9NQ25)、存活素、TAG-72和端粒酶；呈递肿瘤特异性肽表位的主要组织相容性复合物(MHC)分子；肿瘤基质抗原，诸如纤连蛋白的额外结构域A(EDA)和额外结构域B(EDB)；腱生蛋白C的A1结构域(TnCA1)和成纤维细胞相关蛋白(FAP)；细胞因子受体，诸如表皮生长因子受体(EGFR)、EGFR变体III(EGFRvIII)、TFGβ-R或其组分诸如内皮糖蛋白；主要组织相容性复合物(MHC)分子；病毒特异性表面抗原，诸如HIV特异性抗原(诸如HIV gp120)；EBV特异性抗原、CMV特异性抗原、HPV特异性抗原、Lassa病毒特异性抗原、流感病毒特异性抗原以及这些表面抗原的任何衍生物或变体。
A.效应子功能
在一些实施方案中，本文所述的修饰的免疫效应细胞表现出一种或多种免疫细胞效应子功能的增加。在本文中，术语“效应子功能”是指与针对靶细胞或靶抗原的免疫应答的产生、维持和/或增强有关的免疫细胞的功能。在一些实施方案中，与未修饰的免疫效应细胞相比，本文所述的修饰的免疫效应细胞表现出以下特征中的一种或多种：增加的向肿瘤的浸润或迁移，增加的增殖，增加的或延长的细胞存活力，增加的对周围微环境中抑制因子的抗性使得细胞的活化状态延长或增加，增加的促炎免疫因子(例如，促炎细胞因子、趋化因子和/或酶)的产生，增加的细胞毒性，和/或增加的对耗竭的抗性。
在一些实施方案中，与未修饰的免疫效应细胞相比，本文所述的修饰的免疫效应细胞表现出增加的向肿瘤的浸润。在一些实施方案中，增加的修饰的免疫效应细胞对肿瘤的浸润是指与在相同的时间段内浸润到肿瘤中的未修饰的免疫效应细胞的数目相比，在给定的时间段内浸润到肿瘤中的修饰的免疫效应细胞的数目增加。在一些实施方案中，与未修饰的免疫细胞相比，修饰的免疫效应细胞表现出1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多倍的肿瘤浸润增加。可以通过从受试者中分离一个或多个肿瘤并通过流式细胞术、免疫组织化学和/或免疫荧光评估样品中修饰的免疫细胞的数目来测量肿瘤浸润。
在一些实施方案中，与未修饰的免疫效应细胞相比，本文所述的修饰的免疫效应细胞表现出细胞增殖的增加。在这些实施方案中，结果是在给定的时间段之后，与未修饰的免疫效应细胞相比，存在的修饰的免疫效应细胞的数目增加。例如，在一些实施方案中，与未修饰的免疫效应细胞相比，修饰的免疫效应细胞表现出增加的增殖速率，其中修饰的免疫效应细胞以比未修饰的免疫效应细胞更快的速率分裂。在一些实施方案中，与未修饰的免疫细胞相比，修饰的免疫效应细胞表现出1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多倍的增殖速率增加。在一些实施方案中，与未修饰的免疫效应细胞相比，修饰的免疫效应细胞表现出延长的增殖时间，其中修饰的免疫效应细胞和未修饰的免疫效应细胞以相似的速率分裂，但是其中修饰的免疫效应细胞维持更长一段时间的增殖状态。在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞维持增殖状态的时间比未修饰的免疫细胞长1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多倍。
在一些实施方案中，与未修饰的免疫效应细胞相比，本文所述的修饰的免疫效应细胞表现出增加的或延长的细胞存活力。在此类实施方案中，结果是在给定的时间段之后，与未修饰的免疫效应细胞相比，存在的修饰的免疫效应细胞的数目增加。例如，在一些实施方案中，本文所述的修饰的免疫效应细胞保持活力并持续的时间比未修饰的免疫细胞长1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多倍。
在一些实施方案中，与未修饰的免疫效应细胞相比，本文所述的修饰的免疫效应细胞表现出增加的对抑制因子的抗性。示例性抑制因子包括免疫检查点分子(例如，PD1、PDL1、CTLA4、LAG3、IDO)和/或抑制性细胞因子(例如，IL-10、TGFβ)的信号传导。
在一些实施方案中，与未修饰的T细胞相比，本文所述的修饰的T细胞表现出增加的对T细胞耗竭的抗性。T细胞耗竭是抗原特异性T细胞功能障碍的一种状态，其特征在于效应子功能降低并导致随后的抗原特异性T细胞的缺失。在一些实施方案中，耗竭的T细胞缺乏响应于抗原而增殖的能力，表现出细胞因子产量的降低，和/或表现出对靶细胞(诸如肿瘤细胞)的细胞毒性的降低。在一些实施方案中，耗竭的T细胞通过改变的细胞表面标记物和转录因子的表达来鉴定，诸如通过降低的CD122和CD127的细胞表面表达；增加的抑制性细胞表面标记物(诸如PD1、LAG3、CD244、CD160、TIM3和/或CTLA4)的表达；和/或增加的转录因子(诸如Blimp1、NFAT和/或BATF)的表达。在一些实施方案中，耗竭的T细胞表现出改变的敏感性细胞因子信号传导，诸如增加的对TGFβ信号传导的敏感性和/或降低的对IL-7和IL-15信号传导的敏感性。T细胞耗竭可以例如通过将T细胞与靶细胞群体共培养并测量T细胞增殖、细胞因子产量和/或靶细胞的裂解来确定。在一些实施方案中，将本文所述的修饰的免疫效应细胞与靶细胞群体(例如，自体肿瘤细胞或已经被工程化以表达靶肿瘤抗原的细胞系)共培养，并测量效应细胞增殖、细胞因子产量和/或靶细胞裂解。然后将这些结果与靶细胞和对照免疫细胞群体(诸如未修饰的免疫效应细胞或具有对照修饰的免疫效应细胞)共培养获得的结果进行比较。
在一些实施方案中，通过与从对照免疫细胞群体观察到的细胞因子产量相比，修饰的免疫效应细胞的一种或多种细胞因子(例如，IFNγ、TNFα或IL-2)的产量增加证明了对T细胞耗竭的抗性。在一些实施方案中，与来自对照免疫细胞群体的细胞因子产量相比，修饰的免疫效应细胞的细胞因子产量增加1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多倍，这表明对T细胞耗竭的抗性增加。在一些实施方案中，通过与从对照免疫细胞群体观察到的增殖相比，修饰的免疫效应细胞的增殖增加证明了对T细胞耗竭的抗性。在一些实施方案中，与对照免疫细胞群体的增殖相比，修饰的免疫效应细胞的增殖增加1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多倍，这表明对T细胞耗竭的抗性增加的。在一些实施方案中，通过与从对照免疫细胞群体观察到的靶细胞裂解相比，修饰的免疫效应细胞的靶细胞裂解增加证明了对T细胞耗竭的抗性。在一些实施方案中，与对照免疫细胞群体的靶细胞裂解相比，修饰的免疫效应细胞的靶细胞裂解增加1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多倍，这表明对T细胞耗竭的抗性增加。
在一些实施方案中，在体外或离体制造过程中，测量了与对照免疫细胞群体相比修饰的免疫效应细胞的耗竭。例如，在一些实施方案中，根据本文所述的方法修饰从肿瘤片段分离的TIL，并且然后将其在一轮或多轮扩增中扩增以产生修饰的TIL群体。在此类实施方案中，可以在收获之后并且在第一轮扩增之前，在第一轮扩增之后但是在第二轮扩增之前和/或在第一轮和第二轮扩增之后立即测定修饰的TIL的耗竭。在一些实施方案中，在将修饰的免疫效应细胞转移到受试者之后的一个或多个时间点测量与对照免疫细胞群体相比修饰的免疫效应细胞的耗竭。例如，在一些实施方案中，修饰的细胞根据本文所述的方法产生，并施用于受试者。然后可以在转移之后的多个时间点从受试者获取样品，以测定修饰的免疫效应细胞在体内随时间推移的耗竭。
在一些实施方案中，与未修饰的免疫效应细胞相比，本文所述的修饰的免疫效应细胞表现出增加的促炎免疫因子的表达或产量。促炎免疫因子的实例包括溶细胞因子，诸如粒酶B、穿孔素和颗粒溶素；和促炎细胞因子，诸如干扰素(IFNα、IFNβ、IFNγ)、TNFα、IL-1β、IL-12、IL-2、IL-17、CXCL8和/或IL-6。
在一些实施方案中，与未修饰的免疫效应细胞相比，本文所述的修饰的免疫效应细胞表现出增加的对靶细胞的细胞毒性。在一些实施方案中，与未修饰的免疫细胞相比，修饰的免疫效应细胞表现出1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多倍的对靶细胞的细胞毒性的增加。
用于测量免疫效应子功能的测定是本领域已知的。例如，肿瘤浸润可以通过从受试者分离肿瘤并通过流式细胞术、免疫组织化学和/或免疫荧光测定存在于肿瘤中的淋巴细胞的总数和/或表型来测量。细胞表面受体表达可以通过流式细胞术、免疫组织化学、免疫荧光、蛋白质印迹和/或qPCR测定。细胞因子和趋化因子的表达和产量可以通过流式细胞术、免疫组织化学、免疫荧光、蛋白质印迹、ELISA和/或qPCR来测量。对细胞外刺激(例如，细胞因子、抑制性配体或抗原)的应答性或敏感性可以通过测定响应于所述刺激的细胞增殖和/或下游信号传导途径的活化(例如下游信号传导中间体的磷酸化)来测量。细胞毒性可以通过本领域已知的靶细胞裂解测定来测量，包括修饰的免疫效应细胞与靶细胞的体外或离体共培养以及体内鼠肿瘤模型，诸如整个实施例中所述的那些。
B.内源途径和基因的调控
在一些实施方案中，本文所述的修饰的免疫效应细胞表现出降低的一种或多种内源靶基因的表达或功能，并且/或者包含能够降低一种或多种内源靶基因的表达和/或功能的基因调控系统(下文所述)。在一些实施方案中，一种或多种内源靶基因存在于与效应细胞应答的活化和调控相关的途径中。在此类实施方案中，降低的一种或多种内源靶基因的表达或功能增强了免疫细胞的一种或多种效应子功能。
表1中显示了适用于通过本文描述的方法进行调控的示例性途径。在一些实施方案中，在修饰的免疫效应细胞中，内源靶基因在特定途径中的表达降低。在一些实施方案中，在修饰的免疫效应细胞中，多种(例如，两种或更多种)内源靶基因在特定途径中的表达降低。例如，可以降低2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种内源靶基因在特定途径中的表达。在一些实施方案中，在修饰的免疫效应细胞中，内源靶基因在一种途径中的表达和内源靶基因在另一种途径中的表达降低。在一些实施方案中，在修饰的免疫效应细胞中，多种内源靶基因在一种途径中的表达和多种内源靶基因在另一种途径中的表达降低。例如，可以降低2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种内源靶基因在一种途径中的表达，并且可以降低2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种内源靶基因在另一种特定途径中的表达。
在一些实施方案中，多种内源靶基因在多种途径中的表达降低。例如，可以降低多种途径(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种途径)中的每一种中的一种内源基因。在其他方面，可以降低多种途径(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种途径)中的每一种中的多种内源基因(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种基因)。
表1：示例性内源途径
示例性内源靶基因在下表2和3中示出。
在一些实施方案中，修饰的效应细胞包含降低的IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1或BCOR(例如，一种或多种选自表2的内源靶基因)中的一种或多种的表达和/或功能。在一些实施方案中，修饰的效应细胞包含降低的TNFAIP3、CBLB或BCOR中的一种或多种的表达和/或功能。
在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含降低的选自IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR(例如，选自表2的至少两种基因)的至少两种基因的表达和/或功能。例如，在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含降低的选自组合编号1-600的至少两种基因的表达和/或功能，如图1A-图1B所示。在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含降低的BCOR的表达和/或功能以及降低的CBLB的表达和/或功能。虽然本文描述了用于修饰IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和/或BCOR的表达的示例性方法，但这些内源靶基因的表达也可以通过本领域已知的方法修饰。例如，针对PD1(由PDCD1编码)、NRP1、HACR2、LAG3、TIGIT和CTLA4的抑制性抗体在本领域中是已知的，并且一些被FDA批准用于肿瘤适应症(例如，针对PD1的纳武单抗和派姆单抗)。
在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含降低的BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3、GNAS、SOCS1和ANKRD11(例如，一种或多种选自表3的内源靶基因)中一种或多种的表达和/或功能。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的效应细胞包含降低的脑信号蛋白7A(SEMA7A)基因(也称为CD108)的表达和/或功能。在一些实施方案中，本文所述的修饰的效应细胞包含在SEMA7A基因中的失活突变。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的效应细胞包含降低的RNA结合蛋白39(RBM39)基因的表达和/或功能。RBM39蛋白存在于细胞核中，其在细胞核中与核剪接体蛋白共定位。对与此蛋白具有高度序列相似性的小鼠蛋白质的研究表明，此蛋白可用作JUN/AP-1和雌激素受体的转录辅激活物。在一些实施方案中，本文所述的修饰的效应细胞包含在RBM39基因中的失活突变。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的效应细胞包含降低的Bcl-2-样蛋白11(BCL2L11)基因(也通常称为BIM)的表达和/或功能。在一些实施方案中，本文所述的修饰的效应细胞包含在BCL2L11基因中的失活突变
在一些实施方案中，本文所述的修饰的效应细胞包含降低的Friend白血病整合1转录因子(FLI1)基因(也称为转录因子ERGB)的表达和/或功能。在一些实施方案中，本文所述的修饰的效应细胞包含在FLI1基因中的失活突变。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的效应细胞包含降低的钙调蛋白2(CALM2)基因的表达和/或功能。在一些实施方案中，本文所述的修饰的效应细胞包含在CALM2基因中的失活突变。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的效应细胞包含降低的二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)基因的表达和/或功能。DHODH蛋白是一种位于线粒体内膜的外表面上的线粒体蛋白，并且在从头嘧啶生物合成中催化泛醌介导的二氢乳清酸氧化为乳清酸。在一些实施方案中，本文所述的修饰的效应细胞包含在DHODH基因中的失活突变。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的效应细胞包含降低的尿苷单磷酸合酶(UMPS)基因(也称为乳清酸磷酸核糖基转移酶或乳清苷5'-脱羧酶)的表达和/或功能。UMPS蛋白催化尿苷单磷酸(UMP)的形成，尿苷单磷酸是许多重要生物合成途径中的能量携带分子。在一些实施方案中，本文所述的修饰的效应细胞包含在UMPS基因中的失活突变。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的效应细胞包含降低的富含半胱氨酸的疏水结构域2(CHIC2)基因的表达和/或功能。编码的CHIC2蛋白包含富含半胱氨酸的疏水(CHIC)基序，并定位于囊泡结构和质膜，并与某些急性髓性白血病病例相关联。在一些实施方案中，本文所述的修饰的效应细胞包含在CHIC2基因中的失活突变。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的效应细胞包含降低的Poly(rC)-结合蛋白1(PCBP1)基因的表达和/或功能。在一些实施方案中，本文所述的修饰的效应细胞包含在PCBP1基因中的失活突变。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的效应细胞包含降低的蛋白多溴-1(PBRM1)基因(也称为BRG1相关因子180(BAF180))的表达和/或功能。PBRM1是SWI/SNF-B染色质重塑复合物的组分，并且是许多癌症亚型中的肿瘤抑制基因。突变在透明细胞肾细胞癌中尤其普遍。在一些实施方案中，本文所述的修饰的效应细胞包含在PBRM1基因中的失活突变。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的效应细胞包含降低的含WD重复序列的蛋白6(WDR6)基因(在成人和胎儿组织中普遍表达的WD重复蛋白家族的成员)的表达和/或功能。WD重复序列是通常由gly-his和trp-asp(GH-WD)括起来的约40个氨基酸的最低保守区，其可促进异源三聚体或多蛋白复合物的形成。此家族成员参与多种细胞过程，包括细胞周期进程、信号转导、凋亡和基因调控。在一些实施方案中，本文所述的修饰的效应细胞包含在WDR6基因中的失活突变。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的效应细胞包含降低的E2F转录因子8(E2F8)基因的表达和/或功能。编码的E2F8蛋白通过确保细胞核在适当的时间分裂来调控从G1到S期的进程。在一些实施方案中，本文所述的修饰的效应细胞包含在E2F8基因中的失活突变。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的效应细胞包含降低的丝氨酸蛋白酶抑制剂家族A成员3(SERPINA3)基因的表达和/或功能。SERPINA3编码α1-抗胰凝乳蛋白酶(α1AC、A1AC或a1ACT)蛋白，其抑制某些蛋白酶(诸如组织蛋白酶G和糜蛋白酶)的活性。在一些实施方案中，本文所述的修饰的效应细胞包含在SERPINA3基因中的失活突变。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的效应细胞包含降低的GNAS复合基因座(GNAS)基因的表达和/或功能。它是刺激性G蛋白α亚基(Gs-α)，是许多信号转导途径的一种关键组分。在一些实施方案中，本文所述的修饰的效应细胞包含在GNAS基因中的失活突变。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的效应细胞包含降低的ANKRD11基因的表达。ANKRD11蛋白是一种锚蛋白重复结构域，其含有被认为通过未知机制抑制转录物的配体依赖性活化的蛋白质。ANKRD11蛋白被认为与KBG综合征有关。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的效应细胞包含降低的细胞因子信号传导抑制因子SOCS 1(SOCS1)基因的表达。SOCS1蛋白包含C末端SOCS盒基序、SH2结构域、ESS结构域和N末端KIR结构域。已发现称为激酶抑制区(KIR)的12个氨基酸残基对于SOCS1负调控JAK1、TYK2和JAK2酪氨酸激酶功能的能力至关重要。
在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含降低的选自以下的至少两种基因的表达和/或功能：BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3、GNAS、SOCS1和ANKRD11(例如，选自表3的两种或更多种基因)。例如，在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含降低的选自组合编号1001-1240的至少两种基因的表达和/或功能，如图3A-图3B所示。在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含降低的选自组合编号1001-1210的至少两种基因的表达和/或功能，如图3A所示。在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含降低的选自组合编号1211-1240的至少两种基因的表达和/或功能，如图3B所示。在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含降低的选自组合编号1211-1225的至少两种基因的表达和/或功能，如图3B所示。在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含降低的选自组合编号1226-1240的至少两种基因的表达和/或功能，如图3B所示。在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含降低的SOCS1和ANKRD11的表达和/或功能。
在一些实施方案中，修饰的效应细胞包含降低的以下基因的表达和/或功能：BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3、GNAS、SOCS1和ANKRD11中一种或多种(例如，选自表3的一种或多种基因)以及IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1或BCOR中一种或多种(例如，选自表2的一种或多种基因)。例如，修饰的免疫效应细胞可包含降低的选自组合编号601-1000的内源靶基因的组合的表达和/或功能。在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞可包含降低的选自组合编号601-950的两种内源靶基因的组合的表达和/或功能(如图2A所示)。在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞可包含降低的选自组合编号951-1000的两种内源靶基因的组合的表达和/或功能(如图2B所示)。在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞可包含降低的选自组合编号951-975的两种内源靶基因的组合的表达和/或功能(如图2B所示)。在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞可包含降低的选自组合编号951-1000的两种内源靶基因的组合的表达和/或功能(如图2B所示)。
在一些实施方案中，修饰的效应细胞包含降低的选自以下的至少一种基因的表达和/或功能：BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS，以及降低的选自TNFAIP3、CBLB或BCOR的至少一种基因的表达和/或功能。在一些实施方案中，修饰的效应细胞包含降低的SOCS1和选自TNFAIP3、CBLB或BCOR的至少一种基因的表达和/或功能。在一些实施方案中，修饰的效应细胞包含在SOCS1和选自TNFAIP3、CBLB或BCOR的至少一种基因中的失活突变。在一些实施方案中，修饰的效应细胞包含降低的ANKRD11和选自TNFAIP3、CBLB或BCOR的至少一种基因的表达和/或功能。在一些实施方案中，修饰的效应细胞包含在ANKRD11和选自TNFAIP3、CBLB或BCOR的至少一种基因中的失活突变。
在一些实施方案中，修饰的效应细胞包含降低的选自以下的至少一种基因的表达和/或功能：BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3、GNAS、SOCS1和ANKRD11的表达和/或功能，以及降低的CBLB的表达和/或功能。在一些实施方案中，修饰的效应细胞包含降低的选自以下的至少一种基因的表达和/或功能：BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS，以及降低的CBLB的表达和/或功能。在一些实施方案中，修饰的效应细胞包含降低的SOCS1和CBLB的表达和/或功能。在一些实施方案中，修饰的效应细胞包含在SOCS1和CBLB中的失活突变。在一些实施方案中，修饰的效应细胞包含降低的ANKRD11和CBLB的表达和/或功能。在一些实施方案中，修饰的效应细胞包含在ANKRD11和CBLB中的失活突变。
在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含降低的选自以下的一种基因的表达和/或功能：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1或BCOR(例如，选自表2的一种或多种基因)，以及降低的选自以下的两种基因的表达和/或功能：BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3、GNAS、SOCS1和ANKRD11(例如，选自表3的一种或多种基因)。例如，在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含降低的选自以下的一种基因的表达和/或功能：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR，以及降低的选自组合编号1176-1681的两种内源靶基因组合的表达和/或功能(如图3A-图3B所示)。
在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含降低的选自以下的一种基因的表达和/或功能：BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3、GNAS、SOCS1和ANKRD11(例如，选自表3的一种基因)，以及降低的选自以下的两种基因的表达和/或功能：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1或BCOR(例如，选自表2的一种或多种基因)。例如，在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含降低的以下的任一种基因的表达和/或功能：BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3、GNAS、SOCS1和ANKRD11，以及降低的选自图1A-图1B所示的组合编号1-600的两种内源靶基因组合的表达和/或功能。在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含降低的选自以下的一种基因的表达和/或功能：BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS，以及降低的选自图1A-图1B所示的组合编号1-600的两种内源靶基因组合的表达和/或功能。在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含降低的SOCS1的表达和/或功能，以及降低的选自图1A-图1B所示的组合编号1-600的两种内源靶基因组合的表达和/或功能。在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含降低的ANKRD11的表达和/或功能，以及降低的选自图1A-图1B所示的组合编号1-600的两种内源靶基因组合的表达和/或功能。
在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含降低的选自表2的多种基因的表达和/或功能，以及降低的选自表3的多种基因的表达和/或功能。在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含降低的选自表2的两种基因的表达和/或功能，以及降低的选自表3的两种基因的表达和/或功能。例如，在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞包含降低的选自图3A-图3B所示的组合编号1176-1681的两种基因的组合和选自图1A-图1B所示的组合编号1-600的两种基因的组合的表达和/或功能。在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞可包含降低的以下中的三种或更多种基因的表达和/或功能：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1或BCOR，以及降低的以下中的三种或更多种基因的表达和/或功能：BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3、GNAS、SOCS1和ANKRD11。
表2：示例性内源基因
表3：用于新型调控的示例性基因
III.基因调控系统
本文中，术语“基因调控系统”是指当引入细胞中时能够修饰内源靶DNA序列从而调控编码的基因产物的表达或功能的蛋白质、核酸或其组合。适用于本公开的方法的多种基因编辑系统是本领域已知的，包括但不限于shRNA、siRNA、锌指核酸酶系统、TALEN系统和CRISPR/Cas系统。
如本文所用，“调控”在提及基因调控系统对内源靶基因的作用时涵盖内源靶基因序列的任何变化，内源靶基因的表观遗传状态的任何变化，和/或由内源靶基因编码的蛋白质的表达或功能的任何变化。
在一些实施方案中，基因调控系统可介导内源靶基因序列的变化，例如，通过将一个或多个突变引入内源靶序列中，诸如通过在内源靶序列中插入或缺失一个或多个核酸。可以介导内源靶序列的改变的示例性机制包括但不限于非同源末端连接(NHEJ)(例如，经典或替代)、微同源性介导的末端连接(MMEJ)、同源性定向修复(例如，内源供体模板介导的)、SDSA(合成依赖性链退火)、单链退火或单链入侵。
在一些实施方案中，基因调控系统可以介导内源靶序列的表观遗传状态的变化。例如，在一些实施方案中，基因调控系统可介导内源靶基因DNA的共价修饰(例如胞嘧啶甲基化和羟甲基化)或相关组蛋白的共价修饰(例如赖氨酸乙酰化、赖氨酸和精氨酸甲基化、丝氨酸和苏氨酸磷酸化以及赖氨酸泛素化和类泛素化)。
在一些实施方案中，基因调控系统可以介导由内源靶基因编码的蛋白质的表达的变化。在此类实施方案中，基因调控系统可通过修饰内源靶DNA序列或通过作用于由DNA序列编码的mRNA产物来调控编码的蛋白质的表达。在一些实施方案中，基因调控系统可以导致修饰的内源蛋白的表达。在此类实施方案中，由基因调控系统介导的对内源DNA序列的修饰导致内源蛋白的表达，其与未修饰的免疫效应细胞中的对应内源蛋白相比，表现出降低的功能。在此类实施方案中，与未修饰的免疫细胞中对应的内源蛋白的表达水平相比，修饰的内源蛋白的表达水平可以增加、减少或者可以相同或基本上相似。
A.基于核酸的基因调控系统
如本文所用，基于核酸的基因调控系统是包含一种或多种核酸分子的系统，所述核酸分子能够调控内源靶基因的表达而无需外源蛋白。在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含与靶核酸序列互补的RNA干扰分子或反义RNA分子。
“反义RNA分子”是指与mRNA转录物互补的RNA分子，无论长度如何。反义RNA分子是指可以引入细胞、组织或受试者中并通过不依赖于内源基因沉默途径而是依赖于RNA酶H介导的靶mRNA转录物的降解的机制导致内源靶基因产物表达降低的单链RNA分子。在一些实施方案中，反义核酸包含修饰的骨架，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或本领域已知的其他骨架，或可以包含非天然的核苷间键联。在一些实施方案中，反义核酸可包含锁核酸(LNA)。
如本文所用，“RNA干扰分子”是指通过内源基因沉默途径(例如，Dicer和RNA诱导的沉默复合物(RISC))降解靶mRNA来介导内源靶基因产物的降低的表达的RNA多核苷酸。示例性RNA干扰剂包括微小RNA(在本文中也称为“miRNA”)、短发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)、RNA适体和吗啉代。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含一种或多种miRNA。miRNA是指长度约21-25个核苷酸的天然存在的小型非编码RNA分子。miRNA与一种或多种靶mRNA分子至少部分互补。miRNA可以通过翻译抑制、mRNA的切割和/或脱腺苷化来下调(例如降低)内源靶基因产物的表达。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含一种或多种shRNA。shRNA是长度约50-70个核苷酸的单链RNA分子，其形成茎环结构并导致互补mRNA序列的降解。可以将shRNA克隆到质粒或非复制型重组病毒载体中，以引入细胞内，并导致shRNA编码序列整合到基因组中。因此，shRNA可以提供对内源靶基因翻译和表达的稳定且一致的抑制。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含一种或多种siRNA。siRNA是指长度通常约21-23个核苷酸的双链RNA分子。siRNA与称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)的多蛋白复合物缔合，在此过程中，“过客”有义链被酶切割。然后，由于序列同源性，活化的RISC中包含的反义“指导”链将RISC指导至对应的mRNA，并且相同的核酸酶切割靶mRNA，从而导致特异性基因沉默。siRNA的长度最佳为18、19、20、21、22、23或24个核苷酸，并在其3'末端具有2个碱基的突出端。可以将siRNA引入单个细胞和/或培养系统，并导致靶mRNA序列的降解。siRNA和shRNA在Fire等人,Nature,391:19,1998和美国专利号7,732,417；8,202,846和8,383,599中进一步描述。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含一种或多种吗啉代。如本文所用，“吗啉代”是指修饰的核酸寡聚体，其中标准核酸碱基与吗啉环结合并通过二氨基磷酸酯键联连接。类似于siRNA和shRNA，吗啉代与互补mRNA序列结合。然而，吗啉代通过空间抑制mRNA翻译和改变mRNA剪接而不是靶向互补mRNA序列进行降解来发挥作用。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含与靶RNA序列结合的核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，所述靶RNA序列与由选自IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1或BCOR(即表2中列出的那些)的靶基因的DNA序列编码的RNA具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含与靶RNA序列结合的核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，所述靶RNA序列与由表5A或表5B中所示的一组基因组坐标所定义的DNA序列编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在整个本申请中，参考的基因组坐标基于来自可在国家生物技术信息中心网站获得的基因组参考联盟(Genome Reference Consortium)的人类基因组的GRCh38(也称为hg38)装配体中的基因组注释。用于在一个装配体与另一个装配体之间转换基因组坐标的工具和方法在本领域中是已知的，并且可以用于将本文提供的基因组坐标转换为人类基因组的另一个装配体中的对应坐标，包括转换为由相同机构或使用相同算法生成的较早期的装配体(例如，从GRCh38到GRCh37)，以及转换为由不同机构或算法生成的装配体(例如，从GRCh38到NCBI33，由国际人类基因组测序联盟(InternationalHuman Genome Sequencing Consortium)生成)。本领域已知的可用方法和工具包括但不限于，NCBI基因组重映射服务(可从国家生物技术信息中心网站获得)、UCSC LiftOver(可从UCSC Genome Brower网站获得)和Assembly Converter(可从Ensembl.org网站获得)。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含与靶RNA序列结合的核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，所述靶RNA序列与由SEQ ID NO:154-498或SEQ IDNO:499-813中的一种编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统能够降低CBLB的表达和/或功能，并包含与靶RNA序列结合的核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，所述靶RNA序列与由SEQ ID NO:499-524中的一种编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统能够降低BCOR的表达和/或功能，并包含与靶RNA序列结合的核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，所述靶RNA序列与由SEQ ID No:708-772或SEQ ID NO:708-764中的一种编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统能够降低TNFAIP3的表达和/或功能，并包含与靶RNA序列结合的核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，所述靶RNA序列与由SEQ ID No:348-396或SEQ ID NO:348-386中的一种编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含选自本领域已知的那些siRNA分子或shRNA分子，诸如可购自商业供应商诸如Sigma Aldrich、Dharmacon、ThermoFisher等的siRNA和shRNA构建体。
在一些实施方案中，内源靶基因是CBLB，并且核酸分子是由选自SEQ ID NO:41-44(参见国际PCT公开号2018156886)或选自SEQ ID NO:45-53(参见国际PCT公开号WO2017120998)的核酸序列编码的shRNA。在一些实施方案中，内源靶基因是CBLB，并且核酸分子是包含选自SEQ ID NO:54-63(参见国际PCT公开号WO 2018006880)或SEQ ID NO:64-73(参见国际PCT公开号WO 2018120998和WO 2018137293)的核酸序列的siRNA。
在一些实施方案中，内源靶基因是TNFAIP3，并且核酸分子是由选自SEQ ID NO:74-95(参见美国专利号8,324,369)的核酸序列编码的shRNA。在一些实施方案中，内源靶基因是TNFAIP3，并且核酸分子是包含选自SEQ ID NO:96-105(参见国际PCT公开号WO2018006880)的核酸序列的siRNA。
在一些实施方案中，内源靶基因是CTLA4，并且核酸分子是由选自SEQ ID NO:128-133(参见国际PCT公开号WO 2017120996)的核酸序列编码的shRNA。在一些实施方案中，内源靶基因是CTLA4，并且核酸分子是包含选自SEQ ID NO:134-143(参见国际PCT公开号WO2017120996、WO 2017120998、WO 2018137295和WO 2018137293)或SEQ ID NO:144-153(参见国际PCT公开号WO 2018006880)的核酸序列的siRNA。
在一些实施方案中，内源靶基因是PDCD1，并且核酸分子是由选自SEQ ID NO:106-107(参见国际PCT公开WO 2017120996)的核酸序列编码的shRNA。在一些实施方案中，内源靶基因是PDCD1，并且核酸分子是包含选自SEQ ID NO:108-117(参见国际PCT公开号WO2017120996、WO 201712998、WO 2018137295和WO 2018137293)或SEQ ID NO:118-127(参见国际PCT公开号WO 2018006880)的核酸序列的siRNA。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含与靶RNA序列结合的核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，所述靶RNA序列与由选自BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3、GNAS、SOCS1和ANKRD11(即表3中列出的那些)的靶基因的DNA序列编码的RNA具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含与靶RNA序列结合的核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，所述靶RNA序列与由表6A-表6F中所示的一组基因组坐标所定义的DNA序列编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含与靶RNA序列结合的核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，所述靶RNA序列与由SEQ ID NO:814-1232中的一种编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统能够降低选自以下的靶基因的表达和/或功能：BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS。在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含与靶RNA序列结合的核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，所述靶RNA序列与由表6A或表6B中的一者中所示的一组基因组坐标所定义的DNA序列编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含与靶RNA序列结合的核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，所述靶RNA序列与由SEQ ID NO:814-1064中的一种编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统能够降低SOCS1的表达和/或功能。在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含与靶RNA序列结合的核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，所述靶RNA序列与由表6C或表6D中的一者中所示的一组基因组坐标所定义的DNA序列编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含与靶RNA序列结合的核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，所述靶RNA序列与由SEQ IDNO:1088-1232中的一种编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含与靶RNA序列结合的核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，所述靶RNA序列与由SEQ ID NO:1088-1200中的一种编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含与靶RNA序列结合的核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，所述靶RNA序列与由SEQ ID NO:1088-1140中的一种编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含与靶RNA序列结合的核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，所述靶RNA序列与由SEQ ID NO:1088-1120中的一种编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含与靶RNA序列结合的核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，所述靶RNA序列与由SEQ ID NO:1088-1110中的一种编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含与靶RNA序列结合的核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，所述靶RNA序列与由SEQ ID NO:1102、1103、1105-1108、1115中的一种编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含与靶RNA序列结合的核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，所述靶RNA序列与由SEQ ID NO:1106、1110、1115、1116、1118、1126、1129、1141、1157、1174中的一种编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统能够降低ANKRD11的表达和/或功能。在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含与靶RNA序列结合的核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，所述靶RNA序列与由表6E或表6F中的一者中所示的一组基因组坐标所定义的DNA序列编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含与靶RNA序列结合的核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，所述靶RNA序列与由SEQ IDNO:1065-1087中的一种编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，内源靶基因是SOCS1，并且核酸分子是与选自SEQ ID NO:1236-1255(参见美国专利号9,944,931)的靶序列结合的shRNA。在一些实施方案中，内源靶基因是SOCS1，并且核酸分子是由选自SEQ ID NO:1258-1260(参见美国专利号8,324,369)的核酸序列编码的shRNA。在一些实施方案中，内源靶基因是SOCS1，并且核酸分子是包含选自SEQ ID NO:1261-1270(参见国际PCT公开号WO 2017120996；WO 2018137295；WO2017120998和WO 2018137293)的核酸序列的siRNA。
在一些实施方案中，内源靶基因是ANKRD11，并且核酸分子是与选自SEQ ID NO:1233-1235(参见Gallagher等人,Developmental Cell(2015),32(1)；31-42)的靶序列结合的shRNA。在一些实施方案中，内源靶基因是ANKRD11，并且核酸分子是由选自SEQ ID NO:1256-1257(参见hang等人,Biochem Biophys Res Commun(2007)358(4):1034-1040)的核酸序列编码的shRNA
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含选自本领域已知的那些siRNA分子或shRNA分子，诸如可购自商业供应商诸如Sigma Aldrich、Dharmacon、ThermoFisher等的那些。下文表4A和表4B中描述了示例性siRNA和shRNA构建体。在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含两种或更多种选自本领域已知的那些siRNA分子，诸如表4A中所述的siRNA构建体。在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含两种或更多种选自本领域已知的那些shRNA分子，诸如表4B中所述的shRNA构建体。
表4A：示例性siRNA构建体
表4B：示例性shRNA构建体
在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种核酸分子(例如，两种或更多种siRNA，两种或更多种shRNA，两种或更多种RNA适体或两种或更多种吗啉代)，其中核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列与由选自IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1或BCOR(例如选自表2的基因)的靶基因的DNA序列编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列与由选自BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3、GNAS、SOCS1和ANKRD11(例如选自表3的基因)的靶基因的DNA序列编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，两种或更多种核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列与由表5A或表5B中所示的一组基因组坐标所定义的DNA序列编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且两种或更多种核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列与由表6A-表6F中所示的一组基因组坐标所定义的DNA序列编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，两种或更多种核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列与由SEQ ID NO:814-1232中的一种编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且两种或更多种核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列与由SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813中的一种编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种核酸分子，其中核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列由选自IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1或BCOR的靶基因的DNA序列编码，并且核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列由选自BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS的靶基因的DNA序列编码。在一些实施方案中，两种或更多种核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列与由表5A或表5B中所示的一组基因组坐标所定义的DNA序列编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且两种或更多种核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列与由表6A或表6B中所示的一组基因组坐标所定义的DNA序列编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，两种或更多种核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列与由SEQ ID NO:814-1064中的一种编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且两种或更多种核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列与由SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813中的一种编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种核酸分子，其中核酸分子中的至少一种与由CBLB的DNA序列编码的靶RNA序列结合，并且其中核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列由选自BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS的靶基因的DNA序列编码。在一些实施方案中，两种或更多种核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列与由SEQ IDNO:499-524中的一种编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且两种或更多种核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列与由SEQ ID NO:814-1064中的一种编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种核酸分子，其中核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列由选自IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1或BCOR的靶基因的DNA序列编码，并且核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列由SOCS1基因的DNA序列编码。在一些实施方案中，两种或更多种核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列与由表5A或表5B中所示的一组基因组坐标所定义的DNA序列编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且两种或更多种核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列与由表6C或表6D中所示的一组基因组坐标所定义的DNA序列编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，两种或更多种核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列与由SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813中的一种编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且两种或更多种核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列与由SEQ ID NO:1088-1232中的一种编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种核酸分子，其中核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列由CBLB基因编码，并且核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列由SOCS1基因的DNA序列编码。在一些实施方案中，两种或更多种核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列与由SEQ ID NO:499-524中的一种编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且两种或更多种核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列与由SEQ ID NO:1088-1232、SEQ ID NO:1088-1200、SEQ ID NO:1088-1140或SEQ ID NO:1088-1120中的一种编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，两种或更多种核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列与由SEQ ID NO:499-524中的一种编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且两种或更多种核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列与由SEQ ID NO:1106、1110、1115、1116、1118、1126、1129、1141、1157、1174中的一种编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，两种或更多种核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列与由SEQ ID NO:499-524中的一种编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且两种或更多种核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列与由SEQ ID NO:1102、1103、1105-1108、1115中的一种编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种核酸分子，其中核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列由选自IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1或BCOR的靶基因的DNA序列编码，并且核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列由ANKRD11基因的DNA序列编码。在一些实施方案中，两种或更多种核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列与由表5A或表5B中所示的一组基因组坐标所定义的DNA序列编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且两种或更多种核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列与由表6E或表6F中所示的一组基因组坐标所定义的DNA序列编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，两种或更多种核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列与由SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813中的一种编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且两种或更多种核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列与由SEQ ID NO:1065-1087中的一种编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种核酸分子，其中核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列由CBLB基因编码，并且核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列由ANKRD11基因的DNA序列编码。在一些实施方案中，两种或更多种核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列与由SEQ ID NO:499-524中的一种编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且两种或更多种核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列与由SEQ ID NO:1065-1087中的一种编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种核酸分子，其中核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列由ANKRD11基因编码，并且核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列由SOCS1基因的DNA序列编码。在一些实施方案中，两种或更多种核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列与由SEQ ID NO:1065-1087中的一种编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且两种或更多种核酸分子中的至少一种与靶RNA序列结合，所述靶RNA序列与由SEQ ID NO:1088-1232中的一种编码的RNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
B.基于蛋白的基因调控系统
在一些实施方案中，基于蛋白的基因调控系统是包含一种或多种蛋白质的系统，所述蛋白质能够以序列特异性方式调控内源靶基因表达而无需核酸指导分子。在一些实施方案中，基于蛋白的基因调控系统包含含有一种或多种锌指结合结构域和酶结构域的蛋白质。在一些实施方案中，基于蛋白的基因调控系统包含含有转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)结构域和酶结构域的蛋白质。此类实施方案在本文中被称为“TALEN”。
1.锌指系统
基于锌指的系统包含融合蛋白，所述融合蛋白包含两种蛋白结构域：锌指DNA结合结构域和酶结构域。“锌指DNA结合结构域”、“锌指蛋白”或“ZFP”是通过一种或多种锌指以序列特异性方式结合DNA的蛋白质或较大蛋白质内的结构域，所述一种或多种锌指是其结构通过锌离子配位而稳定的结合结构域内的氨基酸序列区。锌指结构域通过与靶DNA序列结合，将酶结构域的活性导向序列的附近，并因此诱导靶序列附近的内源靶基因的修饰。锌指结构域可以被工程化以实际上与任何所需的序列结合。因此，在鉴定出包含需要切割或重组的靶DNA序列的靶遗传基因座(例如，表2或表3中提及的靶基因中的靶基因座)之后，可将一种或多种锌指结合结构域工程化以与靶遗传基因座中的一种或多种靶DNA序列结合。包含锌指结合结构域和酶结构域的融合蛋白在细胞中的表达影响靶遗传基因座的修饰。
在一些实施方案中，锌指结合结构域包含一个或多个锌指。Miller等人(1985)EMBO J.4:1609-1614；Rhodes(1993)Scientific American Febuary:56-65；美国专利号6,453,242。通常，单个锌指结构域的长度为约30个氨基酸。单个锌指与三核苷酸(即三联体)序列(或可以与相邻锌指的四核苷酸结合位点重叠一个核苷酸的四核苷酸序列)结合。因此，锌指结合结构域被工程化以结合的序列(例如靶序列)的长度将决定工程化锌指结合结构域中锌指的数目。例如，对于其中指基序不与重叠的亚位点结合的ZFP，六核苷酸靶序列被两指结合结构域结合；九核苷酸靶序列被三指结合结构域结合，诸如此类。靶位点中单个锌指的结合位点(即亚位点)不必是连续的，而是可以被一个或若干个核苷酸隔开，这取决于多指结合结构域中锌指之间氨基酸序列(即指间接头)的长度和性质。在一些实施方案中，单个ZFN的DNA结合结构域包含三与六个之间的单个锌指重复序列，并且每个可识别9与18个之间的碱基对。
锌指结合结构域可以被工程化以与选择的序列结合。参见，例如，Beerli等人(2002)Nature Biotechnol.20:135-141；Pabo等人(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313-340；Isalan等人(2001)Nature Biotechnol.19:656-660；Segal等人(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637；Choo等人(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416。与天然存在的锌指蛋白相比，工程化锌指结合结构域可以具有新颖的结合特异性。工程化方法包括但不限于合理的设计和各种类型的选择。
用于被锌指结构域结合的靶DNA序列的选择可以例如根据美国专利号6,453,242中公开的方法来完成。本领域技术人员将清楚，核苷酸序列的简单视觉检查也可用于选择靶DNA序列。因此，用于靶DNA序列选择的任何手段均可用于本文所述的方法。靶位点通常具有至少9个核苷酸的长度，并因此被包含至少三个锌指的锌指结合结构域结合。然而，例如4指结合结构域与12核苷酸靶位点的结合，5指结合结构域与15核苷酸靶位点的结合或6指结合结构域与18核苷酸靶位点的结合也是可以的。显而易见，较大的结合结构域(例如7、8、9指和更多指)与较长的靶位点的结合也是可以的。
在一些实施方案中，锌指结合结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与选自IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1或BCOR(例如选自表2的基因)的靶基因的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，锌指结合结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与由表5A或表5B中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，锌指结合结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，锌指结合结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与CBLB的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，锌指结合结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:499-524中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，锌指结合结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与BCOR的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，锌指结合结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:708-772或SEQ ID NO:708-764中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，锌指结合结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与TNFAIP3的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，锌指结合结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:348-396或SEQ ID NO:348-386中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，锌指结合结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与选自BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3、GNAS、SOCS1和ANKRD11(例如选自表3的基因)的靶基因的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，锌指结合结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与由表6A-表6F中的一者中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，锌指结合结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQID NO:814-1232中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，锌指结合结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与选自BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS的靶基因的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，锌指结合结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与由表6A或表6B中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，锌指结合结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:814-1064中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，锌指结合结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SOCS1基因的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，锌指结合结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与由表6C或表6D所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，锌指结合结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:1088-1232中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，锌指结合结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与ANKRD11基因的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，锌指结合结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与由表6E或表6F所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，锌指结合结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:1065-1087中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，锌指系统选自本领域已知的那些，诸如可购自商业供应商诸如Sigma Aldrich的那些。例如，在一些实施方案中，锌指系统选自本领域已知的那些，诸如在下表7中所述的那些。
表7：示例性锌指系统
在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种ZFP融合蛋白，每种ZFP融合蛋白包含锌指结合结构域，其中锌指结合结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与选自IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1或BCOR的靶基因的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且其中锌指结合结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与选自BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3、GNAS、SOCS1和ANKRD11的靶基因的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，锌指结合结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与由表5A或表5B中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且锌指结合结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与由表6A-表6F中的一者中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，锌指结合结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且锌指结合结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:814-1232中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种ZFP融合蛋白，每种ZFP融合蛋白包含锌指结合结构域，其中锌指结合结构域中的至少一种与选自以下的靶基因的靶DNA序列结合：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1或BCOR，并且锌指结合结构域中的至少一种与选自以下的靶基因的靶DNA序列结合：BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS。在一些实施方案中，两种或更多种锌指结合结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与由表5A或表5B中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且两种或更多种锌指结合结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与由表6A或表6B中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，两种或更多种锌指结合结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且两种或更多种锌指结合结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:814-1064中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种ZFP融合蛋白，每种ZFP融合蛋白包含锌指结合结构域，其中锌指结合结构域中的至少一种与CBLB基因的靶DNA序列结合，并且锌指结合结构域中的至少一种与选自以下的靶基因的靶DNA序列结合：BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS。在一些实施方案中，两种或更多种锌指结合结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:499-524中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且两种或更多种锌指结合结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:814-1064中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种ZFP融合蛋白，每种ZFP融合蛋白包含锌指结合结构域，其中锌指结合结构域中的至少一种与选自以下的靶基因的靶DNA序列结合：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1或BCOR，并且锌指结合结构域中的至少一种与SOCS1基因的靶DNA序列结合。在一些实施方案中，两种或更多种锌指结合结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与由表5A或表5B中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且两种或更多种锌指结合结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与由表6C或表6D中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，两种或更多种锌指结合结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且两种或更多种锌指结合结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:1088-1232中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种ZFP融合蛋白，每种ZFP融合蛋白包含锌指结合结构域，其中锌指结合结构域中的至少一种与CBLB基因的靶DNA序列靶基因结合，并且锌指结合结构域得至少一种与SOCS1基因的靶DNA序列结合。在一些实施方案中，两种或更多种锌指结合结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQID NO:499-524中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且两种或更多种锌指结合结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:1088-1232中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种ZFP融合蛋白，每种ZFP融合蛋白包含锌指结合结构域，其中锌指结合结构域中的至少一种与选自以下的靶基因的靶DNA序列结合：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1或BCOR，并且锌指结合结构域中的至少一种与ANKRD11基因的靶DNA序列结合。在一些实施方案中，两种或更多种锌指结合结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与由表5A或表5B中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且两种或更多种锌指结合结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与由表6D或表6E中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，两种或更多种锌指结合结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且两种或更多种锌指结合结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:1065-1087中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种ZFP融合蛋白，每种ZFP融合蛋白包含锌指结合结构域，其中锌指结合结构域中的至少一种与CBLB基因的靶DNA序列结合，并且锌指结合结构域中的至少一种与ANKRD11基因的靶DNA序列结合。在一些实施方案中，两种或更多种锌指结合结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQID NO:499-524中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且两种或更多种锌指结合结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:1065-1087中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
锌指融合蛋白的酶结构域部分可从任何核酸内切酶或核酸外切酶获得。可以衍生出酶结构域的示例性核酸内切酶包括但不限于限制性核酸内切酶和归巢核酸内切酶。参见，例如，2002-2003Catalogue,New England Biolabs,Beverly,Mass.；和Belfort等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3379-3388。切割DNA的其他酶是已知的(例如51核酸酶；绿豆核酸酶；胰腺DNA酶I；微球菌核酸酶；酵母HO核酸内切酶；也参见Linn等人(编著)Nucleases,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993)。这些酶(或其功能片段)中的一种或多种可以用作切割结构域的来源。
在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种ZFP融合蛋白，每种ZFP融合蛋白包含锌指结合结构域，其中锌指结合结构域中的至少一种与SOCS1的靶DNA序列结合，并且锌指结合结构域中的至少一种与ANKRD11的靶DNA序列结合。在一些实施方案中，两种或更多种锌指结合结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与由表6C或表6D中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且两种或更多种锌指结合结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与由表6E或表6F中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，两种或更多种锌指结合结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ IDNO:1088-1232中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且两种或更多种锌指结合结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:1065-1087中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
适合用作本文所述的ZFP的酶结构域的示例性限制性核酸内切酶(限制性酶)存在于许多物种中，并且能够与DNA进行序列特异性结合(在识别位点处)，并能够在结合位点处或附近切割DNA。某些限制性酶(例如，IIS型)在从识别位点去除的位点处切割DNA，并具有可分离的结合和切割结构域。例如，IIS型酶FokI在一条链上距其识别位点9个核苷酸处和在另一条链上距其识别位点13个核苷酸处催化DNA的双链切割。参见，例如，美国专利号5,356,802；5,436,150和5,487,994；以及Li等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4275-4279；Li等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2764-2768；Kim等人(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:883-887；Kim等人(1994b)J.Biol.Chem.269:31,978-31,982。因此，在一个实施方案中，融合蛋白包含来自至少一种IIS型限制性酶的酶结构域和一种或多种锌指结合结构域。
其切割结构域可与结合结构域分离的示例性IIS型限制性酶是FokI。这种特定的酶作为二聚体具有活性。Bitinaite等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:10,570-10,575。因此，对于使用锌指-FokI融合物的靶向双链DNA切割，可以使用两个融合蛋白(每个包含FokI酶结构域)来重构催化活性的切割结构域。可替代地，也可以使用包含锌指结合结构域和两个FokI酶结构域的单个多肽分子。在美国专利号9,782,437中描述了包含FokI酶结构域的示例性ZFP。
2.TALEN系统
基于TALEN的系统包含含有TAL效应子DNA结合结构域和酶结构域的蛋白质。它们是通过将TAL效应子DNA结合结构域与DNA切割结构域(切割DNA链的核酸酶)融合而制成的。上述的FokI限制性酶是适用于基于TALEN的基因调控系统的示例性酶结构域。
TAL效应子是黄单孢菌属(Xanthomonas)细菌在感染植物时通过其III型分泌系统分泌的蛋白质。DNA结合结构域包含重复的高度保守的33-34个氨基酸的序列，其中第12和第13个氨基酸不同。这两个位置(称为重复可变二残基(RVD))是高度可变的并且与特定性核苷酸识别高度相关。因此，TAL效应子结构域可以被工程化以通过选择包含适当RVD的重复区段的组合来结合特异性靶DNA序列。RVD组合的核酸特异性如下：HD靶向胞嘧啶，NI靶向腺嘌呤，NG靶向胸腺嘧啶，并且NN靶向鸟嘌呤(尽管在一些实施方案中，NN也可以以较低的特异性结合腺嘌呤)。
在一些实施方案中，TAL效应子结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与选自IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1或BCOR(例如，选自表2的基因)的靶基因的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，TAL效应子结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与由表5A或表5B中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，TAL效应子结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，TAL效应子结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与CBLB基因的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，TAL效应子结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:499-524中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，TAL效应子结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与BCOR基因的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:708-772或SEQ ID NO:708-764中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，TAL效应子结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与TNFAIP3的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:348-396或SEQ ID NO:348-386中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，TAL效应子结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与选自BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3、GNAS、SOCS1和ANKRD11(例如选自表3的基因)的靶基因的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，TAL效应子结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与由表6A-表6F中的一者中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，TAL效应子结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:814-1232中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，TAL效应子结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与选自BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS的靶基因的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，TAL效应子结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与由表6A或表6B中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，TAL效应子结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:814-1064中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，TAL效应子结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SOCS1基因的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，TAL效应子结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与由表6C或表6D中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，TAL效应子结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:1088-1232中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，TAL效应子结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与ANKRD11基因的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，TAL效应子结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与由表6E或表6F中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，TAL效应子结构域与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:1065-1087中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种TAL效应子融合蛋白，每种TAL效应子融合蛋白包含TAL效应子结构域，其中TAL效应子结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与选自IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1或BCOR的靶基因的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且TAL效应子结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与选自BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3、GNAS、SOCS1和ANKRD11的靶基因的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，TAL效应子结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与由表5A或表5B中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且TAL效应子结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与由表6A-表6F中的一者中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，TAL效应子结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且TAL效应子结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:814-1232中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种TAL效应子融合蛋白，每种TAL效应子融合蛋白包含TAL效应子结构域，其中TAL效应子结构域中的至少一种与选自IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1或BCOR的靶基因的靶DNA序列结合，并且TAL效应子结构域中的至少一种与选自BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS的靶基因的靶DNA序列结合。在一些实施方案中，两种或更多种TAL效应子结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与由表5A或表5B中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且两种或更多种TAL效应子结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与由表6A或表6B中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，两种或更多种TAL效应子结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且两种或更多种TAL效应子结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:814-1064中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种TAL效应子-融合蛋白，每种TAL效应子-融合蛋白包含TAL效应子结构域，其中TAL效应子结构域中的至少一种与CBLB基因的靶DNA序列结合，并且TAL效应子结构域中的至少一种与选自以下的靶基因的靶DNA序列结合：BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS。在一些实施方案中，两种或更多种TAL效应子结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:499-524中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且两种或更多种TAL效应子结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:814-1064中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种TAL效应子融合蛋白，每种TAL效应子融合蛋白包含TAL效应子结构域，其中TAL效应子结构域中的至少一种与选自IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1或BCOR的靶基因的靶DNA序列结合，并且TAL效应子结构域中的至少一种与SOCS1基因的靶DNA序列结合。在一些实施方案中，两种或更多种TAL效应子结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与由表5A或表5B中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且两种或更多种TAL效应子结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与由表6C或表6D中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，两种或更多种TAL效应子结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且两种或更多种TAL效应子结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:1088-1232中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种TAL效应子融合蛋白，每种TAL效应子融合蛋白包含TAL效应子结构域，其中TAL效应子结构域中的至少一种与CBLB的靶DNA序列结合，并且TAL效应子结构域中的至少一种与SOCS1基因的靶DNA序列结合。在一些实施方案中，两种或更多种TAL效应子结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:499-524中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且两种或更多种TAL效应子结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:1088-1232中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种TAL效应子融合蛋白，每种TAL效应子融合蛋白包含TAL效应子结构域，其中TAL效应子结构域中的至少一种与选自IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1或BCOR的靶基因的靶DNA序列结合，并且TAL效应子结构域中的至少一种与ANKRD11基因的靶DNA序列结合。在一些实施方案中，两种或更多种TAL效应子结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与由表5A或表5B中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且两种或更多种TAL效应子结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与由表6D或表6E中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，两种或更多种TAL效应子结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且两种或更多种TAL效应子结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:1065-1087中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种TAL效应子融合蛋白，每种TAL效应子融合蛋白包含TAL效应子结构域，其中TAL效应子结构域中的至少一种与选择的CBLB基因的靶DNA序列结合，并且TAL效应子结构域中的至少一种与ANKRD11基因的靶DNA序列结合。在一些实施方案中，两种或更多种TAL效应子结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:499-524中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且两种或更多种TAL效应子结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:1065-1087中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种TAL效应子融合蛋白，每种TAL效应子融合蛋白包含TAL效应子结构域，其中TAL效应子结构域中的至少一种与SOCS1基因的靶DNA序列结合，并且TAL效应子结构域中的至少一种与ANKRD11基因的靶DNA序列结合。在一些实施方案中，两种或更多种TAL效应子结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与由表6C或表6D中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且两种或更多种TAL效应子结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与由表6E或表6F中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，两种或更多种TAL效应子结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:1088-1232中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且两种或更多种TAL效应子结构域中的至少一种与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:1065-1087中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
用于装配TAL效应子重复序列的方法和组合物是本领域已知的。参见例如，Cermak等人,Nucleic Acids Research,39:12,2011,e82。用于构建TAL效应子重复序列的质粒可购自Addgene。
C.基于组合核酸/蛋白质的基因调控系统
组合基因调控系统包含定点修饰多肽和核酸指导分子。本文中，“定点修饰多肽”是指与核酸指导分子结合的多肽，其通过与其结合的核酸指导分子靶向靶核酸序列(例如，内源靶DNA或RNA序列)，并修饰靶核酸序列(例如，通过靶核酸序列的切割、突变或甲基化)。
定点修饰多肽包含两个部分，与核酸指导物结合的部分和活性部分。在一些实施方案中，定点修饰多肽包含表现出定点酶活性(例如，DNA甲基化、DNA或RNA切割、组蛋白乙酰化、组蛋白甲基化等)的活性部分，其中酶活性的位点由指导核酸确定。在一些情况下，定点修饰多肽包括具有修饰内源靶核酸序列的酶活性(例如，核酸酶活性、甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、DNA修复活性、DNA损伤活性、脱氨活性、歧化酶活性、烷基化活性、脱嘌呤活性、氧化活性、嘧啶二聚体形成活性、整合酶活性、转座酶活性、重组酶活性、聚合酶活性、连接酶活性、解旋酶活性、光解酶活性或糖基化酶活性)的活性部分。在其他情况下，定点修饰多肽包含具有修饰与内源靶核酸序列相关联的多肽(例如组蛋白)的酶活性(例如甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、乙酰转移酶活性、脱乙酰酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、泛素连接酶活性、脱泛素化活性、腺苷酰化活性、脱腺苷酰化活性、SUMO化活性、脱SUMO化活性、核糖基化活性、脱核糖基化活性、豆蔻酰化活性或脱豆蔻酰化活性)的活性部分。在一些实施方案中，定点修饰多肽包含调节靶DNA序列的转录(例如，增加或减少转录)的活性部分。在一些实施方案中，定点修饰多肽包含调节靶RNA序列的表达或翻译(例如，增加或减少转录)的活性部分。
核酸指导物包含两个部分：与内源靶核酸序列互补并能够与其结合的第一部分(本文中称为“核酸结合区段”)，以及能够与定点修饰多肽相互作用的第二部分(本文中称为“蛋白质结合区段”)。在一些实施方案中，核酸指导物的核酸结合区段和蛋白质结合区段包含在单个多核苷酸分子内。在一些实施方案中，核酸指导物的核酸结合区段和蛋白质结合区段各自包含在单独的多核苷酸分子内，使得核酸指导物包含两个彼此缔合以形成功能性指导物的多核苷酸分子。
核酸指导物通过与靶核酸序列特异性杂交来介导组合的蛋白质/核酸基因调控系统的靶特异性。在一些实施方案中，靶核酸序列是RNA序列，诸如包含在靶基因的mRNA转录物中的RNA序列。在一些实施方案中，靶核酸序列是包含在靶基因的DNA序列中的DNA序列。本文提及靶基因涵盖所述特定基因的全长DNA序列，其包含多个靶遗传基因座(即，特定靶基因序列的部分(例如，外显子或内含子))。在每个靶遗传基因座内的是本文中称为“靶DNA序列”的DNA序列的较短片段，其可以通过本文所述的基因调控系统进行修饰。此外，每个靶遗传基因座包含“靶修饰位点”，其是指由基因调控系统诱导的修饰的精确位置(例如，插入、缺失或突变的位置，DNA断裂的位置或表观遗传修饰的位置)。
本文所述的基因调控系统可包含单个核酸指导物，或可包含多个核酸指导物(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核酸指导物)。
在一些实施方案中，组合的蛋白质/核酸基因调控系统包含衍生自Argonaute(Ago)蛋白(例如，T.thermophiles Ago或TtAgo)的定点修饰多肽。在此类实施方案中，定点修饰多肽是T.thermophiles Ago DNA核酸内切酶，并且核酸指导物是指导DNA(gDNA)(参见，Swarts等人,Nature 507(2014),258-261)。在一些实施方案中，本公开提供了编码gDNA的多核苷酸。在一些实施方案中，gDNA编码核酸包含在表达载体中，例如重组表达载体中。在一些实施方案中，本公开提供了编码TtAgo定点修饰多肽或其变体的多核苷酸。在一些实施方案中，编码TtAgo定点修饰多肽的多核苷酸包含在表达载体中，例如重组表达载体中。
在一些实施方案中，本文所述的基因编辑系统是CRISPR(成簇的规则间隔的短回文重复序列)/Cas(CRISPR相关)核酸酶系统。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统是2类系统。2类CRISPR/Cas系统分为三种类型：II型、V型和VI型系统。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统是利用Cas9蛋白的2类II型系统。在此类实施方案中，定点修饰多肽是Cas9 DNA核酸内切酶(或其变体)，并且核酸指导分子是指导RNA(gRNA)。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统是利用Cas12蛋白(例如，Cas12a(也称为Cpf1)、Cas12b(也称为C2c1)、Cas12c(也称为C2c3)、Cas12d(也称为CasY)和Cas12e(也称为CasX))的2类V型系统。在此类实施方案中，定点修饰多肽是Cas12 DNA核酸内切酶(或其变体)，并且核酸指导分子是gRNA。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统是利用Cas13蛋白(例如，Cas13a(也称为C2c2)、Cas13b和Cas13c)的2类VI型系统。(参见，Pyzocha等人,ACS Chemical Biology,13(2),347-356)。在此类实施方案中，定点修饰多肽是Cas13 RNA核糖核酸内切酶，并且核酸指导分子是gRNA。
Cas多肽是指可以与gRNA分子相互作用并且与gRNA分子一起归巢或定位于靶DNA或靶RNA序列的多肽。Cas多肽包括天然存在的Cas蛋白，以及与天然存在的Cas序列相差一个或多个氨基酸残基的工程化的、改变的或以其他方式修饰的Cas蛋白。
指导RNA(gRNA)包含两个区段，DNA结合区段和蛋白质结合区段。在一些实施方案中，gRNA的蛋白质结合区段包含在一个RNA分子中，而DNA结合区段包含在另一个单独的RNA分子中。此类实施方案在本文中称为“双分子gRNA”或“两分子gRNA”或“双gRNA”。在一些实施方案中，gRNA是单个RNA分子，并且在本文中被称为“单指导RNA”或“sgRNA”。术语“指导RNA”或“gRNA”是包含性的，是指两分子指导RNA和sgRNA两者。
gRNA的蛋白质结合区段部分地包含两个互补的核苷酸片段，它们彼此杂交以形成双链RNA双链体(dsRNA双链体)，其促进与Cas蛋白的结合。gRNA的核酸结合区段(或“核酸结合序列”)包含与特异性靶核酸序列互补并能够与其结合的核苷酸序列。gRNA的蛋白质结合区段与Cas多肽相互作用，并且gRNA分子与定点修饰多肽的相互作用导致Cas与内源核酸序列结合，并在靶核酸序列内或周围产生一个或多个修饰。靶修饰位点的精确位置由以下两者确定：(i)gRNA与靶核酸序列之间的碱基配对互补性；和(ii)短基序(称为前间隔序列邻近基序(PAM))在靶DNA序列中的位置(在靶RNA序列中称为前间隔序列侧翼序列(PFS))。PAM/PFS序列是Cas与靶核酸序列结合所必需的。多种PAM/PFS序列是本领域已知的，并适用于特定的Cas核酸内切酶(例如，Cas9核酸内切酶)(参见例如，Nat Methods.2013Nov；10(11):1116–1121和Sci Rep.2014；4:5405)。在一些实施方案中，PAM序列位于靶DNA序列中靶修饰位点的50个碱基对内。在一些实施方案中，PAM序列位于靶DNA序列中靶修饰位点的10个碱基对内。可以通过这种方法靶向的DNA序列仅受限于PAM序列与靶修饰位点的相对距离以及介导序列特异性的gRNA介导的Cas结合的独特20个碱基对序列的存在。在一些实施方案中，PFS序列位于靶RNA序列的3'末端。在一些实施方案中，靶修饰位点位于靶基因座的5'末端。在一些实施方案中，靶修饰位点位于靶基因座的3'末端。在一些实施方案中，靶修饰位点位于靶基因座的内含子或外显子内。
在一些实施方案中，本公开提供了编码gRNA的多核苷酸。在一些实施方案中，编码gRNA的核酸包含在表达载体中，例如重组表达载体中。在一些实施方案中，本公开提供了编码定点修饰多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，编码定点修饰多肽的多核苷酸包含在表达载体中，例如重组表达载体中。
1.Cas蛋白
在一些实施方案中，定点修饰多肽是Cas蛋白。多种物种的Cas分子可用于本文所述的方法和组合物中，包括来源于以下的Cas分子酿脓链球菌(S.pyogenes)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)、嗜热链球菌(S.thermophiles)、燕麦嗜酸菌(Acidovorax avenae)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、猪放线杆菌(Actinobacillus suis)、放线菌属物种(Actinomyces sp.)、Cycliphilus denitrificans、少食氨基单胞菌(Aminomonas paucivorans)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、史密斯芽孢杆菌(Bacillus smithii)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、拟杆菌属物种(Bacteroides sp.)、海洋芽小梨形菌(Blastopirellula marina)、慢生根瘤菌属物种(Bradyrhizobium sp.)、侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterospoxus)、大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、拉里弯曲杆菌(Campylobacter lari)、Candidatus puniceispirillum、解纤梭菌(Clostridiumcellulolyticum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、拥挤棒杆菌(Corynebacterium accolens)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)、马氏棒杆菌(Corynebacterium matruchotii)、恒雄芝氏沟鞭藻玫瑰杆菌(Dinoroseobactershibae)、细长真杆菌(Eubacterium dolichum)、伽马变形杆菌(Gammaproteobacterium)、重氮葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)、流感嗜血菌(Haemophilusparainfluenzae)、唾液嗜血菌(Haemophilus sputomm)、加拿大螺杆菌(Helicobactercanadensis)、同性恋螺杆菌(Helicobacter cinaedi)、雪貂螺杆菌(Helicobactermustelae)、多养型泥杆菌(Ilyobacter polytropus)、金氏金菌(Kingella kingae)、卷曲乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus)、伊氏李斯特氏菌(Listeria ivanovii)、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、李斯特菌科细菌(Listeriaceae bacterium)、甲基孢囊菌属物种(Methylocystis sp.)、发孢甲基弯曲菌(Methylosinus trichosporium)、羞怯动弯杆菌(Mobiluncus mulieris)、杆状奈瑟氏菌(Neisseria bacilliformis)、灰色奈瑟氏菌(Neisseria cinerea)、浅黄奈瑟氏菌(Neisseria flavescens)、乳糖奈瑟氏菌(Neisseria lactamica)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、奈瑟氏菌属物种(Neisseria sp.)、沃氏奈瑟氏菌(Neisseria wadsworthii)、亚硝化单胞菌属物种(Nitrosomonas sp.)、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、食琥珀酸考拉杆菌(Phascolarctobacteriumsuccinatutens)、蒲桃雷尔氏菌(Ralstonia syzygii)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、小红卵菌属物种(Rhodovulum sp.)、米氏西蒙斯氏菌(Simonsiella muelleri)、鞘氨醇单胞菌属物种(Sphingomonas sp.)、葡萄园芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus vineae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)、链球菌属物种(Streptococcus sp.)、罕见小球菌属物种(Subdoligranulum sp.)、运动替斯崔纳菌(Tistrella mobilis)、密螺旋体属物种(Treponema sp.)或Verminephrobacter eiseniae。
在一些实施方案中，Cas蛋白是天然存在的Cas蛋白。在一些实施方案中，Cas核酸内切酶选自由以下组成的组：C2C1、C2C3、Cpf1(也称为Cas12a)、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d、Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csnl和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3和Csf4。
在一些实施方案中，Cas蛋白是核糖核酸内切酶，诸如Cas13蛋白。在一些实施方案中，Cas13蛋白是Cas13a(Abudayyeh等人,Nature 550(2017),280-284)、Cas13b(Cox等人,Science(2017)358:6336,1019-1027)、Cas13c(Cox等人,Science(2017)358:6336,1019-1027)或Cas13d(Zhang等人,Cell 175(2018),212-223)蛋白。
在一些实施方案中，Cas蛋白是野生型或天然存在的Cas9蛋白或Cas9直系同源物。野生型Cas9是一种多结构域酶，其使用HNH核酸酶结构域来切割DNA的靶链，并使用RuvC样结构域来切割非靶链。野生型Cas9与DNA的基于gRNA特异性的结合导致双链DNA断裂，其可通过非同源末端连接(NHEJ)或同源性定向修复(HDR)进行修复。示例性的天然存在的Cas9分子在Chylinski等人,RNA Biology 2013 10:5,727-737中描述，并且另外的Cas9直系同源物在国际PCT公开号WO 2015/071474中描述。此类Cas9分子包括第1类群细菌科、第2类群细菌科、第3类群细菌科、第4类群细菌科、第5类群细菌科、第6类群细菌科、第7类群细菌科、第8类群细菌科、第9类群细菌科、第10类群细菌科、第11类群细菌科、第12类群细菌科、第13类群细菌科、第14类群细菌科、第15类群细菌科、第16类群细菌科、第17类群细菌科、第18类群细菌科、第19类群细菌科、第20类群细菌科、第21类群细菌科、第22类群细菌科、第23类群细菌科、第24类群细菌科、第25类群细菌科、第26类群细菌科、第27类群细菌科、第28类群细菌科、第29类群细菌科、第30类群细菌科、第31类群细菌科、第32类群细菌科、第33类群细菌科、第34类群细菌科、第35类群细菌科、第36类群细菌科、第37类群细菌科、第38类群细菌科、第39类群细菌科、第40类群细菌科、第41类群细菌科、第42类群细菌科、第43类群细菌科、第44类群细菌科、第45类群细菌科、第46类群细菌科、第47类群细菌科、第48类群细菌科、第49类群细菌科、第50类群细菌科、第51类群细菌科、第52类群细菌科、第53类群细菌科、第54类群细菌科、第55类群细菌科、第56类群细菌科、第57类群细菌科、第58类群细菌科、第59类群细菌科、第60类群细菌科、第61类群细菌科、第62类群细菌科、第63类群细菌科、第64类群细菌科、第65类群细菌科、第66类群细菌科、第67类群细菌科、第68类群细菌科、第69类群细菌科、第70类群细菌科、第71类群细菌科、第72类群细菌科、第73类群细菌科、第74类群细菌科、第75类群细菌科、第76类群细菌科、第77类群细菌科或第78类群细菌科的Cas9分子。
在一些实施方案中，天然存在的Cas9多肽选自由以下组成的组：SpCas9、SpCas9-HF1、SpCas9-HF2、SpCas9-HF3、SpCas9-HF4、SaCas9、FnCpf、FnCas9、eSpCas9和NmeCas9。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含与Chylinski等人,RNA Biology 2013 10:5,727-737；Hou等人,PNAS Early Edition 2013,1-6)中描述的Cas9氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Cas多肽包含以下活性中的一种或多种：
(a)切口酶活性，即切割核酸分子的单链，例如非互补链或互补链的能力；
(b)双链核酸酶活性，即切割双链核酸的两条链并产生双链断裂的能力，在一个实施方案中，这是存在两种切口酶活性；
(c)核酸内切酶活性；
(d)核酸外切酶活性；和/或
(e)解旋酶活性，即解旋双链核酸的螺旋结构的能力。
在一些实施方案中，将Cas多肽与募集DNA损伤信号传导蛋白、核酸外切酶或磷酸酶的异源蛋白融合，以进一步增加通过一种或另一种修复机制修复靶序列的可能性或速率。在一些实施方案中，野生型Cas多肽与核酸修复模板共表达以促进外源核酸序列通过同源性定向修复的引入。
在一些实施方案中，不同的Cas蛋白(即，来自各种物种的Cas9蛋白)可有利地用于各种提供的方法中，以便利用不同Cas蛋白的各种酶特征(例如，用于不同的PAM序列偏好；用于增加或减小的酶活性；用于增加或减小的细胞毒性水平；改变NHEJ、同源性定向修复、单链断裂、双链断裂等之间的平衡)。
在一些实施方案中，Cas蛋白是来源于酿脓链球菌的Cas9蛋白，并识别PAM序列基序NGG、NAG、NGA(Mali等人,Science 2013；339(6121):823-826)。在一些实施方案中，Cas蛋白是来源于嗜热链球菌的Cas9蛋白，并识别PAM序列基序NGGNG和/或NNAGAAW(W＝A或T)(参见，例如，Horvath等人,Science,2010；327(5962):167-170，和Deveau等人,JBacteriol2008；190(4):1390-1400)。在一些实施方案中，Cas蛋白是来源于变形链球菌(S.mutans)的Cas9蛋白，并识别PAM序列基序NGG和/或NAAR(R＝A或G)(参见，例如，Deveau等人,J BACTERIOL 2008；190(4):1390-1400)。在一些实施方案中，Cas蛋白是来源于金黄色葡萄球菌的Cas9蛋白，并识别PAM序列基序NNGRR(R＝A或G)。在一些实施方案中，Cas蛋白是来源于金黄色葡萄球菌的Cas9蛋白，并识别PAM序列基序N GRRT(R＝A或G)。在一些实施方案中，Cas蛋白是来源于金黄色葡萄球菌的Cas9蛋白，并识别PAM序列基序N GRRV(R＝A或G)。在一些实施方案中，Cas蛋白是来源于脑膜炎奈瑟氏菌的Cas9蛋白，并识别PAM序列基序N GATT或N GCTT(R＝A或G，V＝A，G或C)(参见，例如，Hou等人,PNAS 2013,1-6)。在上述实施方案中，N可以是任何核苷酸残基，例如，A、G、C或T中的任一种。在一些实施方案中，Cas蛋白是来源于沙氏纤毛菌(Leptotrichia shahii)的Cas13a蛋白，并识别单个3'A、U或C的PFS序列基序。
在一些实施方案中，提供了编码Cas蛋白的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸编码与国际PCT公开号WO 2015/071474或Chylinski等人,RNA Biology 2013 10:5,727-737中描述的Cas蛋白具有至少90％同一性的Cas蛋白。在一些实施方案中，多核苷酸编码与国际PCT公开号2015/071474或Chylinski等人,RNA Biology 2013 10:5,727-737中描述的Cas蛋白具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的Cas蛋白。在一些实施方案中，多核苷酸编码与国际PCT公开号WO 2015/071474或Chylinski等人,RNA Biology 2013 10:5,727-737中描述的Cas蛋白具有100％同一性的Cas蛋白。
2.Cas突变体
在一些实施方案中，Cas多肽被工程化以改变Cas多肽的一种或多种特性。例如，在一些实施方案中，Cas多肽包含改变的酶特性，例如改变的核酸酶活性(与天然存在的或其他参考Cas分子相比)或改变的解旋酶活性。在一些实施方案中，工程化的Cas多肽可具有改变其大小的改变，例如氨基酸序列的缺失，其减小序列大小，但对Cas多肽的另一种特性没有显著影响。在一些实施方案中，工程化的Cas多肽包含影响PAM识别的改变。例如，可以改变工程化的Cas多肽以识别除了被对应的野生型Cas蛋白识别的PAM序列以外的PAM序列。
具有所需特性的Cas多肽可以通过多种方式制备，包括改变天然存在的Cas多肽或亲本Cas多肽，以提供具有所需特性的突变体或改变的Cas多肽。例如，可以将一个或多个突变引入亲本Cas多肽(例如，天然存在或工程化的Cas多肽)的序列中。此类突变和差异可以包括取代(例如，保守取代或非必需氨基酸的取代)；插入；或缺失。在一些实施方案中，相对于亲本Cas多肽，突变体Cas多肽包含一个或多个突变(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、30、40或50个突变)。
在一个实施方案中，突变体Cas多肽包含与天然存在的Cas多肽不同的切割特性。在一些实施方案中，Cas是失活的Cas(dCas)突变体。在此类实施方案中，Cas多肽不包含任何内在的酶活性，并且不能介导靶核酸切割。在此类实施方案中，dCas可以与能够以基于非切割的方式修饰靶核酸的异源蛋白融合。例如，在一些实施方案中，dCas蛋白与转录激活物或转录阻遏物结构域(例如，Kruppel相关盒(KRAB或SKD)；Mad mSIN3相互作用结构域(SID或SID4X)；ERF阻遏物结构域(ERD)；MAX相互作用蛋白1(MXI1)；甲基CpG结合蛋白2(MECP2)等)融合。在一些此类情况下，dCas融合蛋白通过ggRNA靶向靶核酸中的具体位置(即序列)，并发挥基因座特异性调控，诸如阻断RNA聚合酶与启动子的结合(其选择性抑制转录激活物功能)，和/或修饰局部染色质状态(例如，当使用修饰靶DNA或修饰与靶DNA相关联的多肽的融合序列时)。在一些情况下，变化是瞬时的(例如，转录阻遏或活化)。在一些情况下，变化是可遗传的(例如，当对靶DNA或与靶DNA相关联的蛋白质例如核小体组蛋白进行表观遗传修饰时)。
在一些实施方案中，dCas是dCas13突变体(Konermann等人,Cell 173(2018),665-676)。然后可以将这些dCas13突变体与修饰RNA的酶融合，包括腺苷脱氨酶(例如ADAR1和ADAR2)。腺苷脱氨基酶将腺嘌呤转化为肌苷，翻译机制将其视为鸟嘌呤，从而在RNA序列中产生功能性A→G变化。在一些实施方案中，dCas是dCas9突变体。
在一些实施方案中，突变体Cas9是Cas9切口酶突变体。Cas9切口酶突变体仅包含一个催化活性结构域(HNH结构域或RuvC结构域)。Cas9切口酶突变体保留基于gRNA特异性的DNA结合，但仅能够切割一条DNA链，从而导致单链断裂(例如“切口”)。在一些实施方案中，两个互补的Cas9切口酶突变体(例如，一个具有失活的RuvC结构域的Cas9切口酶突变体，以及一个具有失活的HNH结构域的Cas9切口酶突变体)在同一细胞中用对应于两个各自靶序列的两个gRNA表达；一个在有义DNA链上的靶序列，以及一个在反义DNA链上的靶序列。这种双切口酶系统导致交错的双链断裂，并且可以增加靶特异性，因为它不太可能产生两个足够近的脱靶切口以产生双链断裂。在一些实施方案中，Cas9切口酶突变体与核酸修复模板共表达，以促进外源核酸序列通过同源性定向修复的引入。
在一些实施方案中，本文所述的Cas多肽可以被工程化以改变Cas多肽的PAM/PFS特异性。在一些实施方案中，突变体Cas多肽具有与亲本Cas多肽的PAM/PFS特异性不同的PAM/PFS特异性。例如，可以修饰天然存在的Cas蛋白，以改变突变体Cas多肽识别的PAM/PFS序列，来减少脱靶位点、提高特异性或消除PAM/PFS识别需求。在一些实施方案中，可以修饰Cas蛋白以增加PAM/PFS识别序列的长度。在一些实施方案中，PAM识别序列的长度为至少4、5、6、7、8、9、10或15个氨基酸。可以使用定向进化生成识别不同PAM/PFS序列和/或具有降低的脱靶活性的Cas多肽。可用于Cas多肽的定向进化的示例性方法和系统描述于例如Esvelt等人Nature 2011,472(7344):499-503。
示例性Cas突变体描述于国际PCT公开号WO 2015/161276和Konermann等人,Cell173(2018),665-676中，其以引用的方式整体并入本文。
3.gRNA
本公开提供了将定点修饰多肽定向至具体靶核酸序列的指导RNA(gRNA)。gRNA包含“核酸靶向结构域”或“靶向结构域”和蛋白质结合区段。靶向结构域也可以称为“间隔”序列，并且包含与靶核酸序列互补的核苷酸序列。因此，gRNA的靶向结构域区段通过杂交(即碱基配对)以序列特异性方式与靶核酸相互作用，并确定gRNA将结合的靶核酸内的位置。可以修饰gRNA的靶向结构域区段(例如，通过遗传工程)以与靶核酸序列内的所需序列杂交。在一些实施方案中，靶向结构域序列的长度在约13与约22个核苷酸之间。在一些实施方案中，靶向结构域序列的长度为约13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个核苷酸。在一些实施方案中，靶向结构域序列的长度为约20个核苷酸。
gRNA的蛋白质结合区段与定点修饰多肽(例如，Cas蛋白)相互作用以形成包含gRNA和定点修饰多肽的核糖核蛋白(RNP)复合物。然后，gRNA的靶向结构域区段通过上述间隔序列将结合的定点修饰多肽指导至靶核酸内的具体核苷酸序列。gRNA的蛋白质结合区段包含至少两个彼此互补并形成双链RNA双链体的核苷酸片段。gRNA的蛋白质结合区段也可以称为“支架”区段或“tracr RNA”。在一些实施方案中，tracr RNA序列的长度在约30与约180个核苷酸之间。在一些实施方案中，tracr RNA序列的长度在约40与约90个核苷酸、约50与约90个核苷酸、约60与约90个核苷酸、约65与约85个核苷酸、约70与约80个核苷酸、约65与约75个核苷酸、或约75与约85个核苷酸之间。在一些实施方案中，tracr RNA序列的长度为约70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88或约90个核苷酸。在一些实施方案中，tracr RNA包含由SEQ ID NO:34(参见Mali等人,Science(2013)339(6121):823-826)、SEQ ID NO:35-36(参见PCT公开号WO 2016/106236)、SEQ ID NO:37-39(参见Deltcheva等人,Nature.2011 Mar 31；471(7340):602-607)或SEQ ID NO:40(参见Chen等人,Cell 2013,155(7)；1479-1491)的DNA序列编码的核酸序列。前述tracr序列中的任一种均适合与本文所述的gRNA靶向结构域实施方案中的任一种组合使用。
在一些实施方案中，gRNA包含两个单独的RNA分子(即“双gRNA”)。在一些实施方案中，gRNA包含单个RNA分子(即“单个指导RNA”或“sgRNA”)。在本文中，术语“指导RNA”或“gRNA”的使用包括双gRNA和sgRNA。双gRNA包含两个单独的RNA分子：“crispr RNA”(或“crRNA”)和“tracr RNA”。crRNA分子包含与“tracr伴侣”序列共价连接的间隔序列。tracr伴侣序列包含一段与tracr RNA分子中的对应序列互补的核苷酸。crRNA分子和tracr RNA分子通过tracr和tracr伴侣序列的互补性彼此杂交。
在一些实施方案中，gRNA是sgRNA。在此类实施方案中，核酸靶向序列和蛋白质结合序列通过间隔序列与tracr RNA序列的融合而存在于单个RNA分子中。在一些实施方案中，sgRNA的长度为约50至约200个核苷酸。在一些实施方案中，sgRNA的长度为约75至约150或约100至约125个核苷酸。在一些实施方案中，sgRNA的长度为约100个核苷酸。
在一些实施方案中，本公开的gRNA包含与靶基因座内的靶核酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％互补或100％互补的靶向结构域序列。在一些实施方案中，靶核酸序列是RNA靶序列。在一些实施方案中，靶核酸序列是DNA靶序列。
在一些实施方案中，本文提供的gRNA包含与靶DNA序列结合的靶向结构域序列，所述靶DNA序列与选自IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1或BCOR(例如，选自表2的基因)的靶基因的序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，靶向结构域序列与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与表5A或表5B中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，靶向结构域序列与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:154-498或SEQ IDNO:499-813中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，靶向结构域序列由DNA序列编码，所述DNA序列与SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，本文提供的gRNA包含与靶DNA序列结合的靶向结构域序列，所述靶DNA序列与CBLB基因的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，gRNA序列的核酸结合区段与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:499-524中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，gRNA序列的核酸结合区段由DNA序列编码，所述DNA序列与SEQ ID NO:499-524中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。适用于靶向CBLB的其他gRNA描述于美国专利申请公开号2017/0175128中。
在一些实施方案中，本文提供的gRNA包含与靶DNA序列结合的靶向结构域序列，所述靶DNA序列与TNFAIP3基因的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，gRNA序列的核酸结合区段与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:348-396或SEQ ID NO:348-386中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，本文提供的gRNA包含与靶DNA序列结合的靶向结构域序列，所述靶DNA序列与BCOR基因的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，gRNA序列的核酸结合区段与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:708-772或SEQID NO:708-764中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，本文提供的gRNA包含与靶DNA序列结合的靶向结构域序列，所述靶DNA序列与选自BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3、GNAS、SOCS1和ANKRD11(例如，选自表3的基因)的靶基因的序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或具有100％同一性。在一些实施方案中，靶向结构域序列与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与表6A-表6F中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，靶向结构域序列与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ IDNO:814-1232中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，靶向结构域序列由DNA序列编码，所述DNA序列与SEQ ID NO:814-1232中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，本文提供的gRNA包含与靶DNA序列结合的靶向结构域序列，所述靶DNA序列与选自BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS的靶基因的序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，靶向结构域序列与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与表6A或表6B中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，靶向结构域序列与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:814-1064中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，靶向结构域序列由DNA序列编码，所述DNA序列与SEQ ID NO:814-1064中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，本文提供的gRNA包含与靶DNA序列结合的靶向结构域序列，所述靶DNA序列与SOCS1基因的序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，靶向结构域序列与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与表6C或表6D中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，靶向结构域序列与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:1088-1232中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，靶向结构域序列由DNA序列编码，所述DNA序列与SEQ ID NO:1088-1232中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，靶向结构域序列与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:1088-1200中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，靶向结构域序列由DNA序列编码，所述DNA序列与SEQ ID NO:1088-1200中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，本文提供的gRNA包含与SOCS1基因中的靶DNA序列结合的靶向结构域序列，其中所述靶向结构域序列与SEQ ID NO:1088-1140中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，靶向结构域序列由DNA序列编码，所述DNA序列与SEQ ID NO:1088-1140中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，靶向结构域序列与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:1088-1120中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，靶向结构域序列由DNA序列编码，所述DNA序列与SEQ ID NO:1088-1120中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，靶向结构域序列与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:1106、1110、1115、1116、1118、1126、1129、1141、1157、1174中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，靶向结构域序列由DNA序列编码，所述DNA序列与SEQ ID NO:1106、1110、1115、1116、1118、1126、1129、1141、1157、1174中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，靶向结构域序列与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:1102、1103、1105-1108、1115中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，靶向结构域序列由DNA序列编码，所述DNA序列与SEQ ID NO:1102、1103、1105-1108、1115中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，本文提供的gRNA包含与靶DNA序列结合的靶向结构域序列，所述靶DNA序列与ANKRD11基因的序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，靶向结构域序列与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与表6E或表6F中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，靶向结构域序列与靶DNA序列结合，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:1065-1087中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，靶向结构域序列由DNA序列编码，所述DNA序列与SEQ ID NO:1065-1087中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种gRNA分子，其中gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与选自IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、Pdcd1或BCOR(例如，选自表2的基因)的靶基因的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且其中gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与选自BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3、GNAS、SOCS1和ANKRD11(例如，选自表3的基因)的靶基因的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与表5A或表5B中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与表6A-6F中的一者中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:814-1232中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，gRNA中的至少一种包含由核酸序列编码的靶向结构域，所述核酸序列与SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且gRNA中的至少一种包含由核酸序列编码的靶向结构域，所述核酸序列与SEQ IDNO:814-1232中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种gRNA分子，其中gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与选自IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1或BCOR的靶基因的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且其中gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与选自BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS的靶基因的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与表5A或表5B中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与表6A或6B中的一者中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:814-1064中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，gRNA中的至少一种包含由核酸序列编码的靶向结构域，所述核酸序列与SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且gRNA中的至少一种包含由核酸序列编码的靶向结构域，所述核酸序列与SEQ IDNO:814-1064中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种gRNA分子，其中gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与CBLB的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或具有100％同一性，并且其中gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与选自BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS的靶基因的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:499-524中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:814-1064中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，gRNA中的至少一种包含由核酸序列编码的靶向结构域，所述核酸序列与SEQ ID NO:499-524中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且gRNA中的至少一种包含由核酸序列编码的靶向结构域，所述核酸序列与SEQ ID NO:814-1064中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种gRNA分子，其中gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与选自IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1或BCOR的靶基因的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且其中gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与SOCS1基因的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与表5A或表5B中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与表6C或表6D中的一者中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:1088-1232中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，gRNA中的至少一种包含由核酸序列编码的靶向结构域，所述核酸序列与SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且gRNA中的至少一种包含由核酸序列编码的靶向结构域，所述核酸序列与SEQ ID NO:1088-1232中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种gRNA分子，其中gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与CBLB基因的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且其中gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与SOCS1基因的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:499-524中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:1088-1232中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，gRNA中的至少一种包含由核酸序列编码的靶向结构域，所述核酸序列与SEQ ID NO:499-524中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且gRNA中的至少一种包含由核酸序列编码的靶向结构域，所述核酸序列与SEQ ID NO:1088-1232中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种gRNA分子，其中gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与选自IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1或BCOR的靶基因的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且其中gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与ANKRD11基因的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与表5A或表5B中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与表6E或表6F中的一者中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:1065-1087中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，gRNA中的至少一种包含由核酸序列编码的靶向结构域，所述核酸序列与SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且gRNA中的至少一种包含由核酸序列编码的靶向结构域，所述核酸序列与SEQ ID NO:1065-1087中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种gRNA分子，其中gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与CBLB基因的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且其中gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与ANKRD11基因的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:499-524中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与SEQ IDNO:1065-1087中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，gRNA中的至少一种包含由核酸序列编码的靶向结构域，所述核酸序列与SEQ ID NO:499-524中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且gRNA中的至少一种包含由核酸序列编码的靶向结构域，所述核酸序列与SEQ ID NO:1065-1087中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，基因调控系统包含两种或更多种gRNA分子，其中gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与SOCS1基因的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与ANKRD11基因的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与表6C或表6D中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与表6E或表6F中所示的一组基因组坐标所定义的靶DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。在一些实施方案中，gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:1088-1232中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性，并且gRNA中的至少一种包含与靶DNA序列结合的靶向结构域，所述靶DNA序列与SEQ ID NO:1065-1087中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或具有100％同一性。
在一些实施方案中，使用本领域已知的算法(例如Cas-OFF finder)设计本文所述的gRNA序列的核酸结合区段以使脱靶结合最小化，来鉴定特定靶基因座或靶基因所特有的靶序列。
在一些实施方案中，本文所述的gRNA可包含一种或多种引入对核酸酶的稳定性的修饰的核苷或核苷酸。在此类实施方案中，与未修饰的gRNA相比，这些修饰的gRNA可引发降低的先天免疫。术语“先天免疫应答”包括对通常病毒或细菌来源的外源核酸(包括单链核酸)的细胞应答，其涉及诱导细胞因子(特别是干扰素)表达和释放以及细胞死亡。
在一些实施方案中，本文所述的gRNA在5'末端处或附近(例如，在其5'末端的1-10、1-5或1-2个核苷酸内)被修饰。在一些实施方案中，通过包含真核mRNA帽结构或帽类似物(例如，G(5')ppp(5')G帽类似物、m7G(5')ppp(5')G帽类似物或3'-0-Me-m7G(5')ppp(5')G抗反向帽类似物(ARCA))来修饰gRNA的5'末端。在一些实施方案中，通过用磷酸酶(例如小牛肠碱性磷酸酶)处理以除去5'三磷酸基团来修饰体外转录的gRNA。在一些实施方案中，gRNA包含在其3'末端处或附近(例如，在其3'末端的1-10、1-5或1-2个核苷酸内)的修饰。例如，在一些实施方案中，通过添加一个或多个(例如25-200个)腺嘌呤(A)残基来修饰gRNA的3'末端。
在一些实施方案中，修饰的核苷和修饰的核苷酸可以存在于gRNA中，但是也可以存在于其他基因调控系统中，例如，基于mRNA、RNAi或siRNA的系统中。在一些实施方案中，修饰的核苷和核苷酸可包括以下中的一种或多种：
(a)磷酸二酯骨架键联中非连接的磷酸氧中的一个或两个和/或连接的磷酸氧中的一个或多个的改变，例如替换；
(b)核糖组分例如核糖上的2'羟基的改变，例如替换；
(c)用“脱磷”接头批量替换磷酸部分；
(d)天然存在的核碱基的修饰或替换；
(e)核糖磷酸骨架的替换或修饰；
(f)寡核苷酸的3'末端或5'末端的修饰，例如末端磷酸基团的去除、修饰或替换或部分的缀合；以及
(g)糖的修饰。
在一些实施方案中，以上列出的修饰可以组合以提供可以具有两个、三个、四个或更多个修饰的修饰的核苷和核苷酸。例如，在一些实施方案中，修饰的核苷或核苷酸可以具有修饰的糖和修饰的核碱基。在一些实施方案中，gRNA的每个碱基均被修饰。在一些实施方案中，gRNA分子的磷酸基团中的每一个均被硫代磷酸酯基团替换。
在一些实施方案中，可以使用软件工具来优化对用户靶序列内gRNA的选择，例如以使整个基因组的总脱靶活性最小化。脱靶活性可能与切割不同。例如，对于使用酿脓链球菌Cas9进行的每种可能的gRNA选择，软件工具可以鉴定整个基因组中所有的包含多达一定数量(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)的错配碱基对的潜在脱靶序列(在NAG或NGG PAM之前)。可以例如使用实验得出的加权方案来预测在每个脱靶序列处的切割效率。然后可以根据其总的预测的脱靶切割对每种可能的gRNA进行排序；排序最高的gRNA表示可能具有最大的在靶切割和最小的脱靶切割的那些gRNA。其他功能，例如用于gRNA载体构建的自动试剂设计、用于在靶Surveyor测定的引物设计以及用于通过下一代测序进行高通量检测和脱靶切割定量的引物设计，也可以包括在所述工具中。
IV.多核苷酸
在一些实施方案中，本公开提供了编码本文所述的基因调控系统的多核苷酸或核酸分子。如本文所用，术语“核苷酸”或“核酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)和DNA/RNA杂合体。多核苷酸可以是单链或双链的，并且可以是重组的、合成的或分离的。多核苷酸包括但不限于：前信使RNA(pre-mRNA)、信使RNA(mRNA)、RNA、基因组DNA(gDNA)、PCR扩增DNA、互补DNA(cDNA)、合成DNA或重组DNA。多核苷酸是指长度为至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个、至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少1000个、至少5000个、至少10000个或至少15000个或更多个核苷酸的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式，或任一类型的核苷酸以及所有中间长度的修饰形式。容易理解的是，在此上下文中，“中间长度”是指所引用值之间的任何长度，诸如6、7、8、9等；101、102、103等；151、152、153等；201、202、203等。
在特定实施方案中，可以对多核苷酸进行密码子优化。如本文所用，术语“密码子优化”是指在编码多肽的多核苷酸中取代密码子以便增加多肽的表达、稳定性和/或活性。影响密码子优化的因素包括但不限于以下中的一种或多种：(i)两个或更多个生物体或基因或合成构建的偏好表之间的密码子偏好的变化，(ii)生物体、基因或一组基因内的密码子偏好程度的变化，(iii)包括环境的密码子的系统性变化，(iv)密码子根据其解码tRNA的变化，(v)密码子根据GC％的变化，整体或在三联体的一个位置，(vi)与参考序列(例如天然存在的序列)的相似性程度的变化，(vii)密码子频率截止的变化，(viii)由DNA序列转录的mRNA的结构特性，(ix)密码子取代组的设计所依据的DNA序列的功能的先验知识，(x)每个氨基酸的密码子组的系统性变化，(xi)假翻译起始位点的分离去除和/或(xii)偶然的聚腺苷酸化位点的消除，否则其会导致截短的RNA转录物。
如本文所用所用，表述“序列同一性”或例如包含“具有50％同一性的序列”是指在比较窗内序列在逐个核苷酸的基础上或逐个氨基酸的基础上相同的程度。“比较窗”是指至少6个连续位置的概念性区段，通常约50至约100个，更通常约100至约150个，其中在两个序列最佳对齐后将序列与具有相同数目的连续位置的参考序列进行比较。因此，“序列同一性百分比”可以通过在比较窗内比较两个最佳对齐的序列，确定在这两个序列中出现相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中的位置总数(即窗口大小)，并将结果乘以100以得出序列同一性的百分比。
如本文所用，术语“多核苷酸变体”和“变体”等是指与参考多核苷酸序列显示大幅度序列同一性的多核苷酸或在下文定义的严格条件下与参考序列杂交的多核苷酸。这些术语包括与参考多核苷酸相比，其中一个或多个核苷酸已被添加或缺失或被不同核苷酸替换的多核苷酸。在这方面，本领域众所周知的是，可以对参考多核苷酸进行某些改变，包括突变、添加、缺失和取代，由此改变的多核苷酸保留参考多核苷酸的生物学功能或活性。
在特定实施方案中，多核苷酸或变体与参考序列具有至少或约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
而且，本领域普通技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，存在许多编码如本文所述的多肽或其变体片段的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因的核苷酸序列具有最小的同源性。尽管如此，在特定实施方案中特别考虑了由于密码子使用的差异而变化的多核苷酸，例如针对人和/或灵长类密码子选择进行了优化的多核苷酸。此外，也可以使用包含本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因。等位基因是由于一个或多个突变(诸如核苷酸的缺失、添加和/或取代)而改变的内源基因。
不管编码序列本身的长度如何，本文考虑的多核苷酸都可以与其他DNA序列组合，如本文其他地方所公开或如本领域中已知的那样，使得它们的总长度可以显著变化，所述其他DNA序列诸如启动子和/或增强子、非翻译区(UTR)、信号序列、Kozak序列、聚腺苷酸化信号、其他限制性酶位点、多个克隆位点、内部核糖体进入位点(IRES)、重组酶识别位点(例如LoxP、FRT和Att位点)、终止密码子、转录终止信号以及编码自切割多肽、表位标签的多核苷酸。因此，可以考虑的是，在特定的实施方案中可以使用几乎任何长度的多核苷酸片段，其中总长度优选地受限于制备的简易性和在预期的重组DNA方案中的使用。
多核苷酸可以使用本领域已知且可用的多种公知技术中的任一种来制备、操纵和/或表达。
载体
为了在细胞中表达本文所述的基因调控系统，可以将编码基因调控系统的表达盒插入合适的载体中。本文使用的术语“核酸载体”是指能够转移或转运另一种核酸分子的核酸分子。转移的核酸通常与载体核酸分子连接，例如插入其中。核酸载体可以包括指导细胞中的自主复制的序列，或者可以包括足以允许整合到宿主细胞DNA中的序列。
如本文所用，术语“表达盒”是指载体内的遗传序列，其可以表达RNA，并随后表达蛋白质。核酸盒包含目的基因，例如基因调控系统。将核酸盒在位置和顺序方面定向在载体内，使得盒中的核酸可以被转录成RNA，并且在必要时翻译成蛋白质或多肽，进行转化细胞中的活性所需的适当的翻译后修饰，并通过靶向适当的细胞内区室或分泌到细胞外区室内而被移位到适当的区室用于生物活性。优选地，盒具有适合于准备插入载体中的3'和5'末端，例如，其在每个末端具有限制性核酸内切酶位点。盒可被移除并作为单个单元插入质粒或病毒载体中。
在特定实施方案中，载体包括但不限于质粒、噬菌粒、粘粒、转座子、人工染色体(诸如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC))、噬菌体(诸如λ噬菌体或M13噬菌体)以及动物病毒。在特定实施方案中，可以将本文公开的基因调控系统的编码序列连接到此类载体中，以在哺乳动物细胞中表达基因调控系统。
在一些实施方案中，非病毒载体用于将本文考虑的一种或多种多核苷酸递送至免疫效应细胞，例如T细胞。在一些实施方案中，包含编码本文所述的基因调控系统的一种或多种组分的多核苷酸的重组载体是质粒。许多合适的质粒表达载体是本领域技术人员已知的，并且许多是可商购获得的。以举例的方式提供以下载体；对于真核宿主细胞：pXT1、pSG5(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVLSV40(Pharmacia)。然而，可以使用任何其他质粒载体，只要它与宿主细胞相容即可。根据所用的细胞类型和基因调控系统，许多合适的转录和翻译控制元件中的任一种(包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等)都可用于表达载体中(参见例如，Bitter等人(1987)Methods in Enzymology,153:516-544)。
在一些实施方案中，包含编码本文所述的基因调控系统的一种或多种组分的多核苷酸的重组载体是病毒载体。合适的病毒载体包括但不限于基于以下的病毒载体：痘苗病毒；脊髓灰质炎病毒；腺病毒(参见例如，Li等人,Invest Opthalmol Vis Sci 35:25432549,1994；Borras等人,Gene Ther 6:515 524,1999；Li和Davidson,PNAS 92:7700 7704,1995；Sakamoto等人,H Gene Ther 5:10881097,1999；WO 94/12649、WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)；腺相关病毒(参见例如，美国专利号7,078,387；Ali等人,Hum Gene Ther 9:81 86,1998，Flannery等人，，PNAS 94:6916 6921,1997；Bennett等人,Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863,1997；Jomary等人,GeneTher 4:683 690,1997，Rolling等人,Hum Gene Ther 10:641 648,1999；Ali等人,Hum MolGenet 5:591 594,1996；Srivastava的WO 93/09239，Samulski等人,J.Vir.(1989)63:3822-3828；Mendelson等人,Virol.(1988)166:154-165；和Flotte等人,PNAS(1993)90:10613-10617)；SV40；单纯疱疹病毒；人免疫缺陷病毒(参见例如，Miyoshi等人,PNAS 94:10319 23,1997；Takahashi等人,J Virol 73:78127816,1999)；逆转录病毒载体(例如鼠白血病病毒、脾坏死病毒和衍生自逆转录病毒的载体，所述逆转录病毒诸如劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、慢病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒)等。载体的实例是用于在哺乳动物细胞中表达的pClneo载体(Promega)；pLenti4/V5-DESTTM、pLenti6/V5-DESTTM以及用于慢病毒介导的基因转移和在哺乳动物细胞中表达的pLenti6.2/V5-GW/lacZ(Invitrogen)。
在一些实施方案中，载体是非整合型载体，包括但不限于附加型载体或染色体外维持的载体。如本文所用，术语“附加型”是指能够复制而不整合到宿主的染色体DNA中并且没有从分裂的宿主细胞中逐渐丢失的载体，也意味着所述载体在染色体外或附加地复制。所述载体被工程化以具有编码来自淋巴营养性疱疹病毒或γ疱疹病毒、腺病毒、SV40、牛乳头瘤病毒或酵母的DNA复制起点或“ori”的序列，特别是对应于EBV的oriP的淋巴营养性疱疹病毒或γ疱疹病毒的复制起点。在一个特定方面，淋巴营养性疱疹病毒可以是爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)、卡波西肉瘤疱疹病毒(KSHV)、赛米氏疱疹病毒(HS)或马立克氏病病毒(MDV)。爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)和卡波西肉瘤疱疹病毒(KSHV)也是γ疱疹病毒的实例。
在一些实施方案中，使用转座子载体系统将多核苷酸引入靶细胞或宿主细胞中。在某些实施方案中，转座子载体系统包含载体，所述载体包含可转座元件和本文考虑的多核苷酸；和转座酶。在一个实施方案中，转座子载体系统是单转座酶载体系统，参见例如WO2008/027384。示例性转座酶包括但不限于：piggyBac、Sleeping Beauty、Mos1、Tc1/mariner、Tol2、mini-Tol2、Tc3、MuA、Himar I、Frog Prince及其衍生物。piggyBac转座子和转座酶描述于例如美国专利6,962,810中，其以引用的方式整体并入本文。SleepingBeauty转座子和转座酶描述于例如Izsvak等人,J.Mol.Biol.302:93-102(2000)中，其以引用的方式整体并入本文。在Kawakami等人(2000)中描述了Tol2转座子，所述转座子首先是从青鳉鱼Oryzias latipes中分离出来的并属于转座子的hAT家族。Mini-Tol2是Tol2的变体并描述于Balciunas等人(2006)中。当与Tol2转座酶共同作用时，Tol2和Mini-Tol2转座子有助于将转基因整合到生物体的基因组中。Frog Prince转座子和转座酶描述于例如Miskey等人,Nucleic Acids Res.31:6873-6881(2003)中。
在一些实施方案中，编码本文描述的基因调控系统的一种或多种组分的多核苷酸序列可操作地连接到控制元件，例如转录控制元件，诸如启动子。“控制元件”是指载体的那些非翻译区(例如复制起点、选择盒、启动子、增强子、翻译起始信号(Shine Dalgarno序列或Kozak序列)内含子、聚腺苷酸化序列、5'和3'未翻译区)，其与宿主细胞蛋白相互作用以进行转录和翻译。此类元件的强度和特异性可能有所不同。转录控制元件在真核细胞(例如，哺乳动物细胞)或原核细胞(例如，细菌或古细菌细胞)中可以是功能性的。在一些实施方案中，编码本文所述的基因调控系统的一种或多种组分的多核苷酸序列可操作地连接到多个控制元件，其允许多核苷酸在原核和真核细胞中都表达。
根据所用的细胞类型和基因调控系统，许多合适的转录和翻译控制元件中的任一种(包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等)都可用于表达载体中(参见例如，Bitter等人(1987)Methods in Enzymology,153:516-544)。如本文所用，术语“启动子”是指RNA聚合酶结合的多核苷酸(DNA或RNA)的识别位点。RNA聚合酶起始并转录可操作地连接到启动子的多核苷酸。在特定实施方案中，在哺乳动物细胞中可操作的启动子包含位于转录起始位点上游约25至30个碱基的AT富集区和/或存在于转录起始上游70至80个碱基的另一序列，即其中N可以是任何核苷酸的CNCAAT区。术语“增强子”是指一个DNA区段，其包含能够提供增强的转录的序列，并且在一些情况下可以独立于其相对于另一个控制序列的取向而起作用。增强子可以与启动子和/或其他增强子元件协同或附加地起作用。
在一些实施方案中，编码本文描述的基因调控系统的一种或多种组分的多核苷酸可操作地连接到启动子。术语“可操作地连接”是指一种并置，其中所述组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系。在一个实施方案中，所述术语是指核酸表达控制序列(诸如启动子和/或增强子)与第二多核苷酸序列(例如编码基因调控系统的一种或多种组分的多核苷酸)之间的功能性连接，其中表达控制序列指导对应于第二序列的核酸的转录。
合适的真核启动子(在真核细胞中起作用的启动子)的非限制性实例包括来自以下的那些：巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子、单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶启动子、病毒性猿猴病毒40启动子(SV40)(例如早期和晚期SV40)、脾脏病灶形成病毒(SFFV)启动子、来自逆转录病毒的长末端重复序列(LTR)(例如莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)LTR启动子或劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR)、单纯疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子、来自痘苗病毒的H5、P7.5和P11启动子、延伸因子1-α(EF1α)启动子、早期生长应答因子1(EGR1)启动子、铁蛋白H(FerH)启动子、铁蛋白L(FerL)启动子、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子、真核翻译起始因子4A1(EIF4A1)启动子、热休克70kDa蛋白5(HSPA5)启动子、热休克蛋白90kDaβ成员1(HSP90B1)启动子、热休克蛋白70kDa(HSP70)启动子、β-驱动蛋白(β-KIN)启动子、人ROSA26基因座(Irions等人,Nature Biotechnology 25,1477-1482(2007))、泛素C(UBC)启动子、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子、β-肌动蛋白启动子和骨髓增生肉瘤病毒增强子、阴性对照区缺失、dl587rev引物结合位点取代(MND)启动子和小鼠金属硫蛋白-1。合适的载体和启动子的选择完全在本领域普通技术人员的能力范围内。表达载体还可包含用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体还可以包括用于扩增表达的适当序列。表达载体还可包含编码与定点修饰多肽融合的蛋白质标签(例如，6xHis标签、血凝素标签、绿色荧光蛋白等)的核苷酸序列，从而产生嵌合多肽。
在一些实施方案中，编码本文所述的基因调控系统的一种或多种组分的多核苷酸序列可操作地连接到组成型启动子。在此类实施方案中，编码本文所述的基因调控系统的一种或多种组分的多核苷酸在细胞中组成性和/或遍在性地表达。
在一些实施方案中，将编码本文所述的基因调控系统的一种或多种组分的多核苷酸序列可操作地连接到诱导型启动子。在此类实施方案中，编码本文所述的基因调控系统的一种或多种组分的多核苷酸被有条件地表达。如本文所用，“条件表达”可以指任何类型的条件表达，包括但不限于诱导型表达；阻遏型表达；在具有特定生理、生物学或疾病状态的细胞或组织中表达(例如，细胞类型或组织特异性表达)等。诱导型启动子/系统的说明性实例包括但不限于类固醇诱导型启动子诸如编码糖皮质激素或雌激素受体的基因的启动子(通过用对应的激素处理而诱导)、金属硫蛋白启动子(通过用各种重金属处理而诱导)、MX-1启动子(通过干扰素诱导)、“GeneSwitch”米非司酮可调控系统(Sirin等人,2003,Gene,323:67)、累积诱导型基因开关(WO 2002/088346)、四环素依赖性调控系统等。
在一些实施方案中，本文所述的载体还包含转录终止信号。指导异源核酸转录物的有效终止和聚腺苷酸化的元件增加异源基因表达。通常在聚腺苷酸化信号的下游发现转录终止信号。在特定的实施方案中，载体包含编码待表达的多肽的多核苷酸的聚腺苷酸化序列3'。如本文所用，术语“polyA位点”或“polyA序列”表示通过RNA聚合酶II指导新生RNA转录物的终止和聚腺苷酸化的DNA序列。聚腺苷酸化序列可通过在编码序列的3'末端添加polyA尾来提高mRNA稳定性，并因此有助于提高翻译效率。切割和聚腺苷酸化通过RNA中的poly(A)序列指导。哺乳动物pre-mRNA的核心poly(A)序列具有两个位于切割-聚腺苷酸化位点侧翼的识别元件。通常，几乎不变的AAUAAA六聚体位于富含U或GU残基的更可变元件上游20-50个核苷酸处。新生转录物的切割发生在这两个元件之间，并且与向5'切割产物中添加多达250个腺苷相结合。在特定实施方案中，核心poly(A)序列是理想的polyA序列(例如，AATAAA、ATTAAA、AGTAAA)。在特定实施方案中，poly(A)序列是SV40 polyA序列、牛生长激素polyA序列(BGHpA)、兔β-珠蛋白polyA序列(rβgpA)、其变体或本领域已知的另一种合适的异源或内源性polyA序列。
在一些实施方案中，载体还可以包含编码信号肽的序列(例如，用于核定位、核仁定位、线粒体定位)，所述序列与编码所述系统的一种或多种组分的多核苷酸融合。例如，载体可以包含与编码所述系统的一种或多种组分的多核苷酸融合的核定位序列(例如，来自SV40)。
将多核苷酸和重组载体引入宿主细胞的方法是本领域已知的，并且可以使用任何已知方法来将基因调控系统的组分引入细胞。合适的方法包括例如病毒或噬菌体感染、转染、缀合、原生质体融合、脂质转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射、纳米颗粒介导的核酸递送(参见例如，Panyam等人,Adv Drug Deliv Rev.2012年9月13日.pii:S0169-409X(12)00283-9)、微流体递送方法(参见例如，国际PCT公开号WO2013/059343)等。在一些实施方案中，经由电穿孔的递送包括将细胞与基因调控系统的组分在盒、室或试管中混合，并施加一个或多个限定持续时间和振幅的电脉冲。在一些实施方案中，将细胞与基因调控系统的组分在连接到装置(例如泵)的容器中混合，所述装置将混合物进料到盒、室或试管中，在其中施加一个或多个具有限定持续时间和振幅的电脉冲，之后将细胞递送到第二容器。适用于在特定实施方案中考虑的特定实施方案的多核苷酸递送系统的说明性实例包括但不限于由Amaxa Biosystems、Maxcyte,Inc.、BTX MolecularDelivery Systems、NeonTM Transfection Systems和Copernicus Therapeutics Inc提供的那些。脂质转染试剂是可商购的(例如TransfectamTM和LipofectinTM)。在文献中已经描述了适用于多核苷酸的有效脂质转染的阳离子和中性脂质。参见例如，Liu等人(2003)GeneTherapy.10:180–187；和Balazs等人(2011)Journal of Drug Delivery.2011:1-12。
在一些实施方案中，通过病毒递送方法，例如通过病毒转导，将包含编码本文所述的基因调控系统的一种或多种组分的多核苷酸的载体引入细胞中。在一些实施方案中，通过非病毒递送方法将包含编码本文所述的基因调控系统的一种或多种组分的多核苷酸的载体引入细胞中。在特定实施方案中考虑的多核苷酸的非病毒递送的说明性方法包括但不限于：电穿孔、声穿孔、脂质转染、显微注射、基因枪、病毒体、脂质体、免疫脂质体、纳米颗粒、聚阳离子或脂质:核酸缀合物、裸DNA、人工病毒粒子、DEAE-葡聚糖介导的转移、基因枪和热休克。
在一些实施方案中，将基因调控系统的一种或多种组分或编码本文所述的基因调控系统的一种或多种组分的多核苷酸序列在非病毒递送媒介物中引入细胞，所述非病毒递送媒介物诸如转座子、纳米颗粒(例如脂质纳米颗粒)、脂质体、外来体、减毒细菌或病毒样颗粒。在一些实施方案中，媒介物是减毒细菌(例如，天然或人工工程化成侵入性但减毒以防止致病性，包括单增李斯特菌、某些沙门氏菌属(Salmonella)菌株、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)和修饰的大肠杆菌(Escherichia coli))、对靶特异性细胞具有营养和组织特异性向性的细菌以及具有修饰的表面蛋白以改变靶细胞特异性的细菌。在一些实施方案中，媒介物是遗传修饰的噬菌体(例如，具有大包装能力、较低免疫原性、含有哺乳动物质粒维持序列并且掺入了靶向配体的工程化噬菌体)。在一些实施方案中，媒介物是哺乳动物病毒样颗粒。例如，可以生成修饰的病毒颗粒(例如，通过纯化“空”颗粒，然后将病毒与所需物质离体装配)。媒介物也可以被工程化以掺入靶向配体来改变靶组织特异性。在一些实施方案中，媒介物是生物脂质体。例如，生物脂质体是来源于人细胞的基于磷脂的颗粒(例如，红细胞血影，其是被分解成来源于受试者的球形结构的红细胞，并且其中可以通过附着各种组织或细胞特异性配体来实现组织靶向)、分泌性外来体或内吞来源的受试者衍生膜结合的纳米囊泡(30-100nm)(例如，可以由各种细胞类型产生，并因此可以被细胞吸收而无需靶向配体)。
IV.产生修饰的免疫效应细胞的方法
在一些实施方案中，本公开提供了用于产生修饰的免疫效应细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将基因调控系统引入免疫效应细胞群体中，其中所述基因调控系统能够降低一种或多种内源靶基因的表达和/或功能。
可以使用各种递送方法和制剂以各种形式将本文所述的基因调控系统(例如基于核酸、蛋白质或核酸/蛋白质的系统)的组分引入靶细胞中。在一些实施方案中，通过重组载体(例如，上文所述的病毒载体或质粒)递送编码所述系统的一种或多种组分的多核苷酸。在一些实施方案中，当系统包含多于一种单一组分时，载体可以包含多个多核苷酸，每个多核苷酸都编码所述系统的组分。在一些实施方案中，当系统包含多于一种单一组分时，可以使用多个载体，其中每个载体包含编码所述系统的特定组分的多核苷酸。在一些实施方案中，基因调控系统向细胞的引入在体外发生。在一些实施方案中，基因调控系统向细胞的引入在体内发生。在一些实施方案中，基因调控系统向细胞的引入离体发生。
在特定实施方案中，基因调控系统向细胞的引入在体外或离体发生。在一些实施方案中，免疫效应细胞在体外或离体被修饰，无需在培养物中进一步操纵。例如，在一些实施方案中，产生本文所述的修饰的免疫效应细胞的方法包括在体外或离体引入基因调控系统，无需另外的活化和/或扩增步骤。在一些实施方案中，免疫效应细胞被修饰并且在体外或离体被进一步操纵。例如，在一些实施方案中，在引入基因调控系统之前，免疫效应细胞在体外或离体被活化和/或扩增。在一些实施方案中，将基因调控系统引入免疫效应细胞，然后在体外或离体被活化和/或扩增。在一些实施方案中，可以从未成功修饰的细胞中分选和/或分离出成功修饰的细胞(例如，通过流式细胞术)，以产生纯化的修饰的免疫效应细胞群体。然后可以将这些成功修饰的细胞进一步增殖，以增加修饰细胞的数量和/或冷冻保存以备将来使用。
在一些实施方案中，本公开提供了产生修饰的免疫效应细胞的方法，其包括获得免疫效应细胞群体。可以将免疫效应细胞群体在支持生长所必需的各种培养条件下体外培养，例如在适当的温度(例如37℃)和大气(例如空气加5％CO2)下以及在适当的培养基中。培养基可以是液体或半固体，例如包含琼脂、甲基纤维素等。细胞培养基的说明性实例包括最低必需培养基(MEM)、Iscove改良的DMEM、RPMI 1640Clicks、AIM-V、F-12、X-Vivo 15、X-Vivo20和Optimizer，其中添加了氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充有适量的血清(或血浆)或一组确定的激素，和/或一定量的足以使免疫效应细胞生长和扩增的细胞因子。
培养基可以补充有一种或多种增殖和存活所必需的因子，包括但不限于生长因子，例如血清(例如约5％-10％的胎牛或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、IL-21、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α。用于T细胞扩增的其他添加剂的说明性实例包括但不限于表面活性剂，人血浆蛋白粉(piasmanate)，pH缓冲液诸如HEPES和还原剂诸如N-乙酰基半胱氨酸和2-巯基乙醇，或本领域技术人员已知的适用于细胞生长的任何其他添加剂诸如L-谷氨酰胺、硫醇(特别是2-巯基乙醇)和/或抗生素例如青霉素和链霉素。通常，抗生素仅包括在实验培养物中，而不包括在待注入受试者体内的细胞培养物中。
在一些实施方案中，免疫效应细胞群体从来源于受试者的样品中获得。在一些实施方案中，从第一受试者获得免疫效应细胞群体，并将通过本文所述的方法产生的修饰的免疫效应细胞群体施用于第二不同的受试者。在一些实施方案中，从受试者获得免疫效应细胞群体，并将通过本文所述的方法产生的修饰的免疫效应细胞群体施用于同一受试者。在一些实施方案中，样品是组织样品、流体样品、细胞样品、蛋白质样品或者DNA或RNA样品。在一些实施方案中，组织样品可以来源于任何组织类型，包括但不限于皮肤、毛发(包括根)、骨髓、骨骼、肌肉、唾液腺、食道、胃、小肠(例如，来自十二指肠、空肠或回肠的组织)、大肠、肝脏、胆囊、胰腺、肺、肾、膀胱、子宫、卵巢、阴道、胎盘、睾丸、甲状腺、肾上腺、心脏组织、胸腺、脾脏、淋巴结、脊髓、大脑、眼、耳、舌、软骨、白色脂肪组织或棕色脂肪组织。在一些实施方案中，组织样品可以来源于癌性、癌前性或非癌性肿瘤。在一些实施方案中，流体样品包含口腔拭子、血液、血浆、口腔粘液、阴道粘液、外周血、脐带血、唾液、精子、尿液、腹水、胸膜液、脊髓液、肺灌洗液、眼泪、汗液、精子、精液、精浆、前列腺液、射精前液(Cowper液)、排泄物、脑脊液、淋巴液、包含一种或多种细胞群体的细胞培养基、包含一种或多种细胞群体的缓冲溶液等。
在一些实施方案中，处理样品以从样品的其余部分富集或分离免疫效应细胞群体。在某些实施方案中，样品是外周血样品，然后对其进行白细胞去除术以分离红细胞和血小板并分离淋巴细胞。在一些实施方案中，样品是leukopak，可从中分离或富集免疫效应细胞。在一些实施方案中，样品是肿瘤样品，对其进一步处理以分离存在于肿瘤中的淋巴细胞(即，通过肿瘤的破碎和酶消化以获得肿瘤浸润淋巴细胞的细胞悬浮液)。
在一些实施方案中，用于制备本文考虑的修饰的免疫效应细胞的方法包括活化和/或扩增免疫效应细胞群体，例如，在美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公开号20060121005中所述。
在各种实施方案中，用于制备本文考虑的修饰的免疫效应细胞的方法包括活化包含免疫效应细胞的细胞群体。在特定实施方案中，免疫效应细胞是T细胞。T细胞活化可通过提供初级刺激信号(例如，通过T细胞TCR/CD3复合物或通过对CD2表面蛋白的刺激)和通过辅助分子提供次级共刺激信号来实现。
在一些实施方案中，可以通过使T细胞与合适的CD3结合剂例如CD3配体或抗CD3单克隆抗体接触来刺激TCR/CD3复合物。CD3抗体的说明性实例包括但不限于OKT3、G19-4、BC3、CRIS-7和64.1。在一些实施方案中，CD2结合剂可用于向T细胞提供初级刺激信号。CD2结合剂的说明性实例包括但不限于CD2配体和抗CD2抗体，例如T11.3抗体与T11.1或T11.2抗体组合(Meuer,S.C.等人(1984)Cell 36:897-906)以及9.6抗体(其识别与TI 1.1相同的表位)与9-1抗体组合(Yang,S.Y.等人(1986)J.Immunol.137:1097-1100)。
除了通过TCR/CD3复合物或CD2提供的刺激信号以外，诱导T细胞应答通常还需要由特异性结合T细胞上的共刺激分子的配体提供的第二共刺激信号，从而提供共刺激信号，除了通过例如TCR/CD3复合物的结合提供的初级信号以外，其还介导所需的T细胞应答。合适的共刺激配体包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、4-1BBL、OX40L、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、ILT3、ILT4、与Toll配体受体结合的激动剂或抗体以及与B7-H3特异性结合的配体。
在一些实施方案中，共刺激配体包含与存在于T细胞上的共刺激分子特异性结合的抗体或其抗原结合片段，所述共刺激分子包括但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。在特定实施方案中，CD28结合剂可用于提供共刺激信号。CD28结合剂的说明性实例包括但不限于：天然CD28配体，例如CD28的天然配体(例如蛋白质B7家族的成员，诸如B7-1(CD80)和B7-2(CD86)；以及能够交联CD28分子的抗CD28单克隆抗体或其片段，例如单克隆抗体9.3、B-T3、XR-CD28、KOLT-2、15E8、248.23.2和EX5.3D10。
在某些实施方案中，提供刺激和共刺激信号的结合剂位于细胞表面上。这可以通过用编码结合剂的核酸以适合其在细胞表面上表达的形式转染或转导细胞，或者通过将结合剂偶联至细胞表面来实现。在一些实施方案中，共刺激信号由在抗原呈递细胞(诸如人工APC(aAPC))上呈递的共刺激配体提供。人工APC可以通过工程化K562、U937、721.221、T2或C1R细胞以稳定表达和/或分泌多种共刺激分子和细胞因子从而支持遗传修饰的T细胞的离体生长和长期扩增来制备。在一个特定实施方案中，K32或U32 aAPC用于指导一种或多种基于抗体的刺激分子在aAPC细胞表面上的展示。T细胞群体可以通过表达多种共刺激分子的aAPC进行扩增，所述共刺激分子包括但不限于CD137L(4-1BBL)、CD134L(OX40L)和/或CD80或CD86。在WO 03/057171和US2003/0147869中提供了示例性aAPC，其以引用的方式整体并入。
在一些实施方案中，提供活化和共刺激信号的结合剂位于固体表面(例如珠或板)上。在一些实施方案中，提供活化和共刺激信号的结合剂均以可溶形式提供(在溶液中提供)。
在一些实施方案中，免疫效应细胞群体在一个或多个扩增期中在培养物中扩增。“扩增”是指在预定的时间段内培养免疫效应细胞群体以增加免疫效应细胞的数量。免疫效应细胞的扩增可包括添加一种或多种上述活化因子和/或添加一种或多种生长因子，诸如细胞因子(例如，IL-2、IL-15、IL-21和/或IL-7)以增强或促进细胞增殖和/或存活。在一些实施方案中，可以在一个或多个扩增期将IL-2、IL-15和/或IL-21的组合添加到培养物中。在一些实施方案中，在一个或多个扩增期中添加的IL-2的量小于6000U/mL。在一些实施方案中，在一个或多个扩增期中添加的IL-2的量为约5500U/mL、约5000U/mL、约4500U/mL、约4000U/mL、约3500U/mL、3000U/mL、约2500U/mL、约2000U/mL、约1500U/mL、约1000U/mL或约500U/mL。在一些实施方案中，在一个或多个扩增期中添加的IL-2的量在约500U/mL与约5500U/mL之间。在一些实施方案中，免疫效应细胞群体可以在扩增过程中与饲养细胞共培养。
在一些实施方案中，将免疫效应细胞群体在预定的时间段内扩增，其中预定的时间段小于约30天。在一些实施方案中，预定的时间段小于30天、小于25天、小于20天、小于18天、小于15天或小于10天。在一些实施方案中，预定的时间段小于4周、小于3周、小于2周或小于1周。在一些实施方案中，预定的时间段为约7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天或21天。在一些实施方案中，预定的时间段为约5天至约25天、约10至约28天、约10至约25天、约10至约21天、约10至约20天、约10至约19天、约11至约28天、约11至约25天、约11至约21天、约11至约20天、约11至约19天、约12至约28天、约12至约25天、约12至约21天、约12至约20天、约12至约19天、约15至约28天、约15至约25天、约15至约21天、约15至约20天或约15至约19天。在一些实施方案中，预定的时间段为约5天至约10天、约10天至约15天、约15天至约20天或约20天至约25天。
在一些实施方案中，扩增免疫效应细胞群体直到细胞数量达到预定阈值。例如，在一些实施方案中，扩增免疫效应细胞群体，直到培养物包含总计至少5x 106、1x 107、5x107、1x 108、5x 108、1x 109、5x 109、1x 1010、5x 1010、1x 1011、5x 1011、1x 1012、5x 1012、1x1013或至少5x 1013个细胞。在一些实施方案中，扩增免疫效应细胞的群体，直到培养物包含总计约1x 109个细胞与总计约1x 1011个细胞之间的细胞。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括至少两个扩增期。例如，在一些实施方案中，免疫效应细胞群体可以在从样品中分离后扩增，使其静置，然后再次扩增。在一些实施方案中，可以在一组扩增条件下扩增免疫效应细胞，接着在第二组不同的扩增条件下进行第二轮扩增。用于免疫细胞的离体扩增的方法是本领域已知的，例如，如美国专利申请公开号2018-0207201、20180282694和20170152478以及美国专利号8,383,099和8,034,334中所述，其以引用的方式并入本文。
在活化和/或扩增过程中的任何时间点，可以将本文所述的基因调控系统引入免疫效应细胞以产生修饰的免疫效应细胞群体。在一些实施方案中，在从样品中富集后立即将基因调控系统引入免疫效应细胞群体。在一些实施方案中，在一个或多个扩增过程之前、期间或之后，将基因调控系统引入免疫效应细胞群体。在一些实施方案中，在从样品中富集或从受试者中收获之后，并且在任何扩增回合之前，立即将基因调控系统引入免疫效应细胞群体。在一些实施方案中，在第一轮扩增之后并且第二轮扩增之前，将基因调控系统引入免疫效应细胞群体。在一些实施方案中，在第一轮和第二轮扩增之后，将基因调控系统引入免疫效应细胞群体。
在一些实施方案中，本公开提供了制造修饰的免疫效应细胞群体的方法，其包括获得免疫效应细胞群体，将本文所述的基因调控系统引入免疫效应细胞群体，以及在一轮或多轮扩增中扩增免疫效应细胞群体。在此实施方案的一些方面中，免疫效应细胞群体在引入基因调控系统之前在第一轮扩增中扩增，并在引入基因调控系统之后在第二轮扩增中扩增。在此实施方案的一些方面中，免疫效应细胞群体在引入基因调控系统之前在第一轮扩增和第二轮扩增中扩增。在此实施方案的一些方面中，在第一轮和第二轮扩增之前将基因调控系统引入免疫效应细胞群体。
在一些实施方案中，本文所述的方法包括从受试者中去除肿瘤并处理肿瘤样品以获得肿瘤浸润淋巴细胞群体(例如，通过肿瘤的破碎和酶消化以获得细胞悬浮液)，将本文所述的基因调控系统引入免疫效应细胞群体，以及在一轮或多轮扩增中扩增免疫效应细胞群体。在此实施方案的一些方面中，肿瘤浸润淋巴细胞群体在引入基因调控系统之前在第一轮扩增中扩增，并且在引入基因调控系统之后在第二轮扩增中扩增。在此实施方案的一些方面中，肿瘤浸润淋巴细胞群体在引入基因调控系统之前在第一轮扩增和第二轮扩增中扩增。在此实施方案的一些方面中，在第一轮和第二轮扩增之前，将基因调控系统引入肿瘤浸润淋巴细胞群体。
在一些实施方案中，通过本文描述的方法产生的修饰的免疫效应细胞可以立即使用。在一些实施方案中，本文考虑的制造方法还可以包括冷冻保存修饰的免疫细胞，用于储存和/或准备用于受试者。如本文所用，“冷冻保存”是指通过冷却至零下温度诸如(通常)77K或-196℃(液氮的沸点)来保存细胞。在一些实施方案中，储存修饰的免疫效应细胞的方法包括冷冻保存免疫效应细胞，使得所述细胞在解冻后保持存活。当需要时，可以将冷冻保存的修饰的免疫效应细胞解冻、生长和扩增更多此类细胞。冷冻保护剂通常在零下温度下使用，以保护保存的细胞因在低温下冷冻或升温至室温免受损伤。冷冻保护剂和最佳的冷却速度可以防止细胞损伤。可以使用的冷冻保护剂包括但不限于二甲亚砜(DMSO)(Lovelock和Bishop,Nature,1959；183:1394-1395；Ashwood-Smith,Nature,1961；190:1204-1205)、甘油、聚乙烯吡咯烷(Rinfret,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1960；85:576)和聚乙二醇(Sloviter和Ravdin,Nature,1962；196:48)。在一些实施方案中，将细胞在10％二甲亚砜(DMSO)、50％血清、40％缓冲培养基或本领域中通常用于在此类冷冻温度下保存细胞的某种其他这种溶液中冷冻，并以本领域公知的用于解冻冷冻的培养细胞的方式进行解冻。
A.使用CRISPR/Cas系统产生修饰的免疫效应细胞
在一些实施方案中，产生修饰的免疫效应细胞的方法包括使靶DNA序列与包含gRNA和Cas多肽的复合物接触。如上所述，gRNA和Cas多肽形成复合物，其中gRNA的DNA结合结构域将复合物靶向靶DNA序列，并且其中Cas蛋白(或与无酶活性的Cas蛋白融合的异源蛋白)修饰靶DNA序列。在一些实施方案中，在将gRNA和Cas蛋白(或编码gRNA和Cas蛋白的多核苷酸)引入细胞之后，在细胞内形成此复合物。在一些实施方案中，编码Cas蛋白的核酸是DNA核酸，并将其通过转导引入细胞。在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑系统的Cas9和gRNA组分由单个多核苷酸分子编码。在一些实施方案中，编码Cas蛋白和gRNA组分的多核苷酸包含在病毒载体中，并通过病毒转导引入细胞。在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑系统的Cas9和gRNA组分由不同的多核苷酸分子编码。在一些实施方案中，编码Cas蛋白的多核苷酸包含在第一病毒载体中，而编码gRNA的多核苷酸包含在第二病毒载体中。在此实施方案的一些方面中，将第一病毒载体在第二病毒载体之前引入细胞。在此实施方案的一些方面中，将第二病毒载体在第一病毒载体之前引入细胞。在此类实施方案中，载体的整合导致Cas9和gRNA组分的持续表达。然而，Cas9的持续表达可能会在一些细胞类型中导致增加的脱靶突变和切割。因此，在一些实施方案中，可以通过转染将编码Cas蛋白的mRNA核酸序列引入细胞群体。在此类实施方案中，Cas9的表达将随时间推移而降低，并且可以减少脱靶突变或切割位点的数目。
在一些实施方案中，通过将gRNA分子和Cas蛋白混合在一起并孵育足以允许复合物形成的一段时间，在无细胞系统中形成此复合物。然后可以将包含gRNA和Cas蛋白并且在本文中称为CRISPR-核糖核蛋白(CRISPR-RNP)的此预形成的复合物引入细胞中，以便修饰靶DNA序列。在一些实施方案中，通过电穿孔将CRISPR-RNP引入细胞。
在使用CRISPR/Cas系统产生修饰的免疫效应细胞的上述实施方案的任一个中，所述系统可包含一种或多种靶向单个内源靶基因的gRNA，例如以产生单一编辑的修饰的免疫效应细胞。可替代地，在使用CRISPR/Cas系统产生修饰的免疫效应细胞的上述实施方案的任一个中，所述系统可以包含两种或更多种靶向两种或更多种内源靶基因的gRNA，例如以产生双重编辑的修饰的免疫效应细胞。
B.使用shRNA系统产生修饰的免疫效应细胞
在一些实施方案中，本公开提供了一种产生修饰的免疫效应细胞的方法，其通过将编码一种或多种具有与靶基因的mRNA转录物互补的序列的shRNA分子的一种或多种DNA多核苷酸引入细胞中。可以经由小基因盒将具体的DNA序列引入细胞核中，从而修饰免疫效应细胞以产生shRNA。逆转录病毒和慢病毒均可用于将编码shRNA的DNA引入免疫效应细胞中。引入的DNA可以成为细胞自身DNA的一部分或保留在细胞核中，并指导细胞机制以产生shRNA。shRNA可以通过细胞内部的Dicer或AGO2介导的切割活性进行处理，以诱导RNAi介导的基因敲低。
C.使用SOCS1和/或CBLB抑制剂生产修饰的免疫效应细胞
在一些实施方案中，本公开提供了制造修饰的免疫效应细胞的方法，所述方法包括将本文所述的基因调控系统引入免疫效应细胞群体；将将SOCS1和/或CBLB的抑制剂引入免疫效应细胞群体；以及扩增免疫效应细胞的群体以产生修饰的免疫效应细胞群体。在此类实施方案中，在制造过程中引入SOCS1和/或CBLB抑制剂对淋巴细胞的体外或离体制造方法提供了一种或多种改进，例如通过增加由制造方法获得的细胞数量(诸如通过减少扩增淋巴细胞群体以产生足够数量的用于疗法的细胞所需的时间)，减少产生足够数量的用于疗法的细胞所需的外源活化和/或生长因子的量，和/或在制造过程中增加淋巴细胞对耗竭的抗性。尽管提供了在本文所述的修饰的免疫效应细胞的制造中利用SOCS1和/或CBLB抑制的示例性方法，但是这些方法适用于任何用于治疗用途的淋巴细胞群体的制造。
在一些实施方案中，SOCS1和/或CBLB抑制剂的添加减少了产生足够数量的用于下游治疗应用的免疫效应细胞所需的扩增时间的长度。在一些实施方案中，预定的时间段小于30天、小于25天、小于20天、小于18天、小于15天或小于10天。在一些实施方案中，预定的时间段小于4周、小于3周、小于2周或小于1周。在一些实施方案中，预定的时间段为约7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天或21天。在一些实施方案中，预定的时间段为约5天至约25天、约10至约28天、约10至约25天、约10至约21天、约10至约20天、约10至约19天、约11至约28天、约11至约25天、约11至约21天、约11至约20天、约11至约19天、约12至约28天、约12至约25天、约12至约21天、约12至约20天、约12至约19天、约15至约28天、约15至约25天、约15至约21天、约15至约20天或约15至约19天。在一些实施方案中，预定的时间段为约5天至约10天、约10天至约15天、约15天至约20天或约20天至约25天。
在一些实施方案中，通过包括添加SOCS1和/或CBLB抑制剂的制造方法产生的细胞总数比通过在没有SOCS1和/或CBLB抑制剂的情况下的制造方法产生的细胞总数大至少约1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5倍。在一些实施方案中，扩增的淋巴细胞群体中的细胞总数比在没有SOCS1和/或CBLB抑制剂的情况下产生的扩增的淋巴细胞群体中的细胞总数大约1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5倍。在一些实施方案中，通过包括添加SOCS1和/或CBLB抑制剂的制造方法产生的细胞总数比通过在没有除了SOCS1和/或CBLB之外的内源基因的抑制剂的情况下的制造方法产生的细胞总数大至少约1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5倍。不希望受理论的束缚，通过在SOCS1或CBLB抑制剂的存在下的制造方法产生的细胞数量增加可能是由多种机制引起的，诸如在抑制剂的存在下免疫效应细胞的增殖增加(即生长速率增加)或在抑制剂的存在下免疫效应细胞的存活增加。
在一些实施方案中，在制造过程期间和/或之后，SOCS1和/或CBLB抑制剂的引入增加了淋巴细胞群体对耗竭的抗性。在一些实施方案中，与在不存在SOCS1和/或CBLB抑制剂的情况下的制造相比，在制造过程中引入SOCS1和/或CBLB抑制剂可增加T细胞群体对T细胞耗竭的抗性。在一些实施方案中，通过增加一种或多种细胞因子(例如，IFNγ、TNFα或IL-2)的产量来证明对T细胞耗竭的抗性。在一些实施方案中，与在不存在SOCS1和/或CBLB抑制剂的情况下产生的淋巴细胞群体的细胞因子产量相比，在SOCS1和/或CBLB抑制剂的存在下产生的淋巴细胞群体的细胞因子产量增加1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多倍，这表明对T细胞耗竭的抗性增加。在一些实施方案中，通过与在不存在SOCS1和/或CBLB抑制剂的情况下产生的淋巴细胞群体的增殖相比，在SOCS1和/或CBLB抑制剂的存在下产生的淋巴细胞群体的增殖增加来证明对T细胞耗竭的抗性。在一些实施方案中，与在不存在SOCS1和/或CBLB抑制剂的情况下产生的淋巴细胞群体的增殖相比，在SOCS1和/或CBLB抑制剂的存在下产生的淋巴细胞群体的增殖增加1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多倍，这表明对T细胞耗竭的抗性增加。在一些实施方案中，通过与在不存在SOCS1和/或CBLB抑制剂的情况下产生的淋巴细胞群体中观察到的靶细胞裂解相比，在SOCS1和/或CBLB抑制剂的存在下产生的淋巴细胞群体的靶细胞裂解增加来证明对T细胞耗竭的抗性。在一些实施方案中，与在不存在SOCS1和/或CBLB抑制剂的情况下产生的淋巴细胞群体的靶细胞裂解相比，在SOCS1和/或CBLB抑制剂的存在下产生的淋巴细胞群体的靶细胞裂解增加1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多倍，这表明对T细胞耗竭的抗性增加。
在一些实施方案中，在体外或离体制造过程中的一个或多个时间点测量T细胞耗竭。例如，在一些实施方案中，淋巴细胞在一轮或多轮扩增中进行扩增以产生修饰的TIL群体。在此类实施方案中，可以在收获之后并且在第一轮扩增之前，在第一轮扩增之后但是在第二轮扩增之前和/或在第一轮和第二轮扩增之后立即测定修饰的TIL的耗竭。在一些实施方案中，在体外或离体制造过程完成之后的一个或多个时间点测量T细胞耗竭。
在一些实施方案中，在制造过程中添加SOCS1和/或CBLB抑制剂减少了产生扩增的淋巴细胞群体所需的细胞因子和/或活化因子的量。例如，在一些实施方案中，在制造过程的一个或多个步骤中添加SOCS1和/或CBLB抑制剂减少了培养物中产生扩增的淋巴细胞群体所需的IL-2、4-1BBL(CD137L)和/或抗CD3的量。在一些实施方案中，当在制造过程的一个或多个步骤中添加SOCS1和/或CBLB抑制剂时，产生扩增的淋巴细胞群体所需的IL-2的量小于6000U/mL。在一些实施方案中，根据本文所述方法产生扩增的淋巴细胞群体所需的IL-2的量为约5500U/mL、约5000U/mL、约4500U/mL、约4000U/mL、约3500U/mL、3000U/mL、约2500U/mL、约2000U/mL、约1500U/mL、约1000U/mL或约500U/mL。在一些实施方案中，根据本文所述的方法产生扩增的淋巴细胞群体所需的IL-2的量在约500U/mL与约5500U/mL之间。在一些实施方案中，在制造过程中添加SOCS1和/或CBLB抑制剂消除了为了产生扩增的淋巴细胞群体而添加一种或多种细胞因子和/或活化因子的需要。例如，在一些实施方案中，在制造过程的一个或多个步骤期间添加SOCS1和/或CBLB抑制剂消除了培养物中对外源IL-2和/或抗CD3抗体的需要。在一些实施方案中，对SOCS1和/或CBLB的抑制是暂时的。在此类实施方案中，SOCS1和/或CBLB抑制剂在淋巴细胞群体的培养过程中被去除或降解，使得SOCS1和/或CBLB基因的表达或SOCS1和/或CBLB蛋白的功能在最终的淋巴细胞群体中与在未暴露于SOCS1和/或CBLB抑制剂的细胞中所观察到的基本相同。
SOCS1和/或CBLB的抑制剂可以在整个生产过程中的任何点添加到培养物中。例如，在一些实施方案中，将SOCS1和/或CBLB的抑制剂在肿瘤样品处理之后并且在任何扩增阶段之前添加到培养物中，并且在整个制造过程的其余时间中保持存在。在一些实施方案中，将SOCS1和/或CBLB的抑制剂在第一扩增阶段之前或期间添加到培养物中，并在第二扩增阶段之前除去。在一些实施方案中，将SOCS1和/或CBLB的抑制剂在第一扩增阶段之前或期间添加到培养物中，并且在整个制造过程的其余时间中保持存在。在一些实施方案中，将SOCS1和/或CBLB的抑制剂在第一扩增阶段之后并且在第二扩增阶段之前或期间添加到培养物中，并且在整个制造过程的其余时间中保持存在。在一些实施方案中，将SOCS1和/或CBLB的抑制剂在第二扩增阶段之前或期间添加到培养物中，并在第二扩增阶段完成之后除去。在一些实施方案中，将SOCS1和/或CBLB的抑制剂在第一扩增阶段之前添加到培养物中，并且在整个制造过程的其余时间中保持存在。在一些实施方案中，将SOCS1和/或CBLB的抑制剂在第二扩增阶段期间添加到培养物中，并且在制造过程完成之后保持存在。在一些实施方案中，将SOCS1和/或CBLB的抑制剂在制造过程中的任何步骤之前、期间或之后添加到培养物中，并在将制造的群体输注到患者体内之前除去。
V.组合物和试剂盒
如本文所用，术语“组合物”是指本文所述的基因调控系统或修饰的免疫效应细胞的制剂，其能够施用或递送至受试者或细胞。通常，制剂包括所有生理上可接受的组合物，包括其衍生物和/或前药、溶剂化物、立体异构体、外消旋体或互变异构体，以及任何生理上可接受的载剂、稀释剂和/或赋形剂。“治疗性组合物”或“药物组合物”(在本文中可互换使用)是基因调控系统或修饰的免疫效应细胞的组合物，其能够施用于受试者以治疗特定的疾病或病症，或者与细胞接触以修饰一种或多种内源靶基因。
本文采用短语“药学上可接受的”指在合理医学判断范围内、适用于与人类和动物组织接触而没有过量毒性、刺激、过敏应答或其他问题或并发症、与合理的利益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
如文中所用，“药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂”包括但不限于已通过美国食品和药物管理局批准为可接受用于人和/或家养动物的任何佐剂、载剂、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂、表面活性剂和/或乳化剂。示例性药学上可接受的载剂包括但不限于：糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石粉；可可脂、蜡、动植物脂肪、石蜡、硅酮、膨润土、硅酸、氧化锌；油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；二醇，诸如丙二醇；多元醇，诸如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原质的水；等渗盐水；林格氏溶液(Ringer's solution)；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；和任何其他用于药物制剂中的相容物质。除非任何常规介质和/或药剂与本公开的药剂都不相容，否则考虑其在治疗组合物中的用途。补充的活性成分也可并入组合物中。
“药学上可接受的盐”包括酸加成盐和碱加成盐两者。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)，并且其与无机酸(例如像盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等)和有机酸(诸如但不限于乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、樟脑酸、樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环己氨磺酸、月桂基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、葡糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧代-戊二酸、甘油磷酸、乙醇酸、马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、双羟萘酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸、十一碳烯酸等)形成。与游离羧基形成的盐也可衍生自无机碱，例如像钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等。衍生自有机碱的盐包括但不限于：伯胺、仲胺和叔胺、取代胺(包括天然存在的取代胺)、环胺和碱性离子交换树脂，诸如氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、丹醇、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、二环己基胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因(procaine)、海巴明(hydrabamine)、胆碱、甜菜碱、苯乙苄胺、苄星青霉素、乙二胺、葡糖胺、甲葡糖胺、可可碱、三乙醇胺、氨丁三醇、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺树脂等。特别优选的有机碱为异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己基胺、胆碱和咖啡因。
润湿剂、乳化剂和润滑剂诸如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、矫味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于所述组合物中。
药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
关于适用于各种类型施用的制剂的进一步指导可见于Remington'sPharmaceutical Sciences,Mace Publishing Company,Philadelphia,Pa.,第17版(1985)中。对于药物递送的简评，参见Langer,Science 249:1527-1533(1990)。
在一些实施方案中，本公开提供用于实施本文所述方法的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒可包括：
(a)一种或多种核酸分子，其能够降低由一种或多种内源靶基因编码的基因产物的表达或修饰其功能；
(b)一种或多种多核苷酸，其编码能够降低由一种或多种内源靶基因编码的基因产物的表达或修饰其功能的核酸分子；
(c)一种或多种蛋白质，其能够降低由一种或多种内源靶基因编码的基因产物的表达或修饰其功能；
(d)一种或多种多核苷酸，其编码能够降低由一种或多种内源靶基因编码的基因产物的表达或修饰其功能的修饰蛋白质；
(e)一种或多种gRNA，其能够与内源基因中的靶DNA序列结合；
(f)一种或多种多核苷酸，其编码一种或多种能够与内源基因中的靶DNA序列结合的gRNA；
(g)一种或多种定点修饰多肽，其能够与gRNA相互作用并修饰内源基因中的靶DNA序列；
(h)一种或多种多核苷酸，其编码能够与gRNA相互作用并修饰内源基因中的靶DNA序列的定点修饰多肽；
(i)一种或多种指导DNA(gDNA)，其能够与内源基因中的靶DNA序列结合；
(j)一种或多种多核苷酸，其编码一种或多种能够与内源基因中的靶DNA序列结合的gDNA；
(k)一种或多种定点修饰多肽，其能够与gDNA相互作用并修饰内源基因中的靶DNA序列；
(l)一种或多种多核苷酸，其编码能够与gDNA相互作用并修饰内源基因中的靶DNA序列的定点修饰多肽；
(m)一种或多种gRNA，其能够与由内源基因编码的靶mRNA序列结合；
(n)一种或多种多核苷酸，其编码一种或多种能够与由内源基因编码的靶mRNA序列结合的gRNA；
(o)一种或多种定点修饰多肽，其能够与gRNA相互作用并修饰由内源基因编码的靶mRNA序列；
(p)一种或多种多核苷酸，其编码能够与gRNA相互作用并修饰由内源基因编码的靶mRNA序列的定点修饰多肽；
(q)本文所述的修饰的免疫效应细胞；或
(r)以上的任何组合。
在一些实施方案中，本文所述的试剂盒还包含一种或多种免疫检查点抑制剂。若干种免疫检查点抑制剂是本领域已知的，并已获得FDA批准用于治疗一种或多种癌症。例如，FDA批准的PD-L1抑制剂包括阿特珠单抗(
Genentech)、阿维鲁单抗(
Pfizer)、和德瓦鲁单抗(
AstraZeneca)；FDA批准的PD-1抑制剂包括派姆单抗(
Merck)和纳武单抗(
Bristol-Myers Squibb)；并且FDA批准的CTLA4抑制剂包括伊匹单抗(
Bristol-Myers Squibb)。可能成为未来治疗的靶标的其他抑制性免疫检查点分子包括A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、IDO、LAG3(例如BMS-986016，由BSM开发)、KIR(例如利丽单抗(Lirilumab)，由BSM开发)、TIM3、TIGIT和VISTA。
在一些实施方案中，本文所述的试剂盒包含基因调控系统的一种或多种组分(或编码一种或多种组分的一种或多种多核苷酸)和本领域已知的一种或多种免疫检查点抑制剂(例如，PD1抑制剂、CTLA4抑制剂、PDL1抑制剂等)。在一些实施方案中，本文所述的试剂盒包含基因调控系统的一种或多种组分(或编码一种或多种组分的一种或多种多核苷酸)和抗PD1抗体(例如，派姆单抗或纳武单抗)。在一些实施方案中，本文所述的试剂盒包含本文所述的修饰的免疫效应细胞(或其群体)和本领域已知的一种或多种免疫检查点抑制剂(例如，PD1抑制剂、CTLA4抑制剂、PDL1抑制剂等)。在一些实施方案中，本文所述的试剂盒包含本文所述的修饰的免疫效应细胞(或其群体)和抗PD1抗体(例如，派姆单抗或纳武单抗)。
在一些实施方案中，试剂盒包含基因调控系统的一种或多种组分(或编码一种或多种组分的一种或多种多核苷酸)和用于重构和/或稀释组分的试剂。在一些实施方案中，试剂盒包含基因调控系统的一种或多种组分(或编码一种或多种组分的一种或多种多核苷酸)，并且还包含一种或多种另外的试剂，其中此类另外的试剂可以选自：用于将基因调控系统引入细胞中的缓冲液；洗涤缓冲液；对照试剂；对照表达载体或RNA多核苷酸；用于由DNA体外产生基因调控系统的试剂等。试剂盒的组分可以在单独的容器中或可以组合在单个容器中。
除上述组分以外，在一些实施方案中，试剂盒还包括使用试剂盒的组分来实施本公开的方法的说明书。用于实施所述方法的说明书通常记录在合适的记录介质上。例如，说明书可以印刷在诸如纸或塑料等的基底上。因此，说明书可以作为包装插页存在于试剂盒中或存在于试剂盒或其组分的容器的标签中(即，与包装或子包装相关联)。在其他实施方案中，说明书作为存在于合适的计算机可读存储介质例如CD-ROM、磁盘、闪存驱动器等上的电子存储数据文件存在。在又其他实施方案中，试剂盒中不存在实际的说明书，但是提供了例如经由互联网从远程来源获得说明书的手段。此实施方案的一个实例是一种试剂盒，其包括网址，在所述网址上可以查看和/或可以从中下载说明书。与说明书一样，这种用于获得说明书的手段被记录在合适的基底上。
VI.治疗方法与应用
在一些实施方案中，本文所述的修饰的免疫效应细胞和基因调控系统可用于多种治疗应用。例如，在一些实施方案中，本文所述的修饰的免疫效应细胞和/或基因调控系统可出于诸如基因疗法的目的而施用于受试者，例如用于治疗疾病，用作抗病毒剂，用作抗病原体，用作抗癌治疗剂或用于生物学研究。
在一些实施方案中，受试者可以是新生儿、青少年或成人。特别感兴趣的是哺乳动物受试者。可以用本方法治疗的哺乳动物物种包括犬科动物和猫科动物；马；牛；羊等和灵长类动物，特别是人类。动物模型，特别是小型哺乳动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔等)可用于实验研究。
本文所述的修饰的免疫效应细胞，其群体及其组合物的施用可以通过注射、冲洗、吸入、食用、电渗、血液透析、离子电渗和本领域已知的其他方法进行。在一些实施方案中，施用途径是局部的或全身的。在一些实施方案中，施用途径是动脉内、颅内、皮内、十二指肠内、乳腺内、脑膜内、腹膜内、鞘内、肿瘤内、静脉内、玻璃体内、眼科、肠胃外、脊髓、皮下、输尿管、尿道、阴道或子宫内。
在一些实施方案中，施用途径是通过输注(例如连续或推注)。用于局部施用(即，递送至损伤或疾病部位)的方法的实例包括通过例如用于鞘内递送的Ommaya贮器(参见例如美国专利号5,222,982和5,385,582，其以引用的方式并入本文)；通过推注，例如通过注射器，例如注射到关节；通过连续输注，例如通过诸如具有对流的插管(参见例如，美国专利申请公开号2007-0254842，其以引用的方式并入本文)；或通过植入其上已经可逆地固定细胞的装置(参见例如美国专利申请公开号2008-0081064和2009-0196903，其以引用的方式并入本文)。在一些实施方案中，施用途径是通过局部施用或直接注射。在一些实施方案中，本文所述的修饰的免疫效应细胞可以单独地或与合适的底物或基质一起提供给受试者，例如以支持所述细胞在它们移植至其中的组织中生长和/或组织化。
在一些实施方案中，向受试者施用至少1x 103个细胞。在一些实施方案中，向受试者施用至少5x 103个细胞、1x 104个细胞、5x 104个细胞、1x 105个细胞、5x 105个细胞、1x106、2x 106、3x 106、4x 106、5x 106、1x 107、1x 108、5x 108、1x 109、5x 109、1x 1010、5x1010、1x 1011、5x 1011、1x 1012、5x 1012或更多个细胞。在一些实施方案中，向受试者施用约1x 107与约1x 1012个之间的细胞。在一些实施方案中，向受试者施用约1x 108与约1x 1012个之间的细胞。在一些实施方案中，向受试者施用约1x 109与约1x 1012个之间的细胞。在一些实施方案中，向受试者施用约1x 1010与约1x 1012个之间的细胞。在一些实施方案中，向受试者施用约1x 1011与约1x 1012个之间的细胞。在一些实施方案中，向受试者施用约1x107与约1x 1011个之间的细胞。在一些实施方案中，向受试者施用约1x 107与约1x 1010个之间的细胞。在一些实施方案中，向受试者施用约1x 107与约1x 109个之间的细胞。在一些实施方案中，向受试者施用约1x 107与约1x 108个之间的细胞。向受试者施用治疗的次数可以变化。在一些实施方案中，将修饰的免疫效应细胞引入受试者可以是一次性事件。在一些实施方案中，此类治疗可能需要持续的一系列重复治疗。在一些实施方案中，在观察到效果之前，可能需要多次施用修饰的免疫效应细胞。确切的方案取决于疾病或病状、疾病的阶段以及所治疗的个体受试者的参数。
在一些实施方案中，本文所述的基因调控系统用于在体内修饰细胞DNA或RNA，诸如用于基因疗法或生物学研究。在此类实施方案中，基因调控系统可以诸如通过上文所述的方法直接施用于受试者。在一些实施方案中，本文所述的基因调控系统用于离体或在体外修饰免疫效应细胞群体。在此类实施方案中，将本文所述的基因调控系统施用于包含免疫效应细胞的样品。
在一些实施方案中，将本文所述的修饰的免疫效应细胞施用于受试者。在一些实施方案中，施用于受试者的本文所述的修饰的免疫效应细胞是自体免疫效应细胞。在上下文中，术语“自体的”是指来源于它们所施用的同一受试者的细胞。例如，可以从受试者获得免疫效应细胞，将其根据本文所述的方法离体修饰，然后施用于同一受试者以便治疗疾病。在此类实施方案中，施用于受试者的细胞是自体免疫效应细胞。在一些实施方案中，施用于受试者的修饰的免疫效应细胞或其组合物是同种异体免疫效应细胞。在上下文中，术语“同种异体”是指来源于一个受试者但施用于另一个受试者的细胞。例如，可以从第一受试者获得免疫效应细胞，将其根据本文所述的方法离体修饰，然后施用于第二受试者以便治疗疾病。在此类实施方案中，施用于受试者的细胞是同种异体免疫效应细胞。
在一些实施方案中，将本文所述的修饰的免疫效应细胞施用于受试者以便治疗疾病。在一些实施方案中，治疗包括将有效量的细胞群体(例如，修饰的免疫效应细胞群体)或其组合物递送至有需要的受试者。在一些实施方案中，治疗是指治疗哺乳动物例如人的疾病，包括(a)抑制疾病，即，阻止疾病发展或预防疾病进展；(b)缓解疾病，即，使疾病状态消退或缓解疾病的一种或多种症状；以及(c)治愈疾病，即改善一种或多种疾病症状。在一些实施方案中，治疗可以指一种或多种疾病症状的短期(例如暂时和/或急性)和/或长期(例如持续)减轻。在一些实施方案中，治疗导致疾病症状的改善或补救。所述改善是可观察到的或可测量的改善，或者可以是受试者的总体健康感觉的改善。
施用于特定受试者的修饰的免疫效应细胞的有效量将取决于多种因素，其中若干个因素因患者而异，包括所治疗的病症和病症的严重性；所用具体药剂的活性；患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；施用时间、施用途径；治疗的持续时间；组合使用的药物；处方医师的判断；以及医学领域中已知的类似因素。
在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞的有效量可以是导致肿瘤质量或体积减少、肿瘤细胞数量减少或转移瘤数量减少至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100倍或更多倍所需的细胞数量。在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞的有效量可以是实现预期寿命的增加、无进展或无疾病存活的增加或与所治疗疾病相关联的各种生理症状的改善所需的细胞数量。在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞的有效量将是至少1x 103个细胞，例如5x 103个细胞、1x 104个细胞、5x 104个细胞、1x 105个细胞、5x105个细胞、1x 106、2x 106、3x 106、4x 106、5x 106、1x 107、1x 108、5x 108、1x 109、5x 109、1x 1010、5x 1010、1x 1011、5x 1011、1x 1012、5x 1012或更多个细胞。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的免疫效应细胞和基因调控系统可用于治疗细胞增殖性疾病，诸如癌症。可以使用本文公开的组合物和方法治疗的癌症包括血液癌症和实体瘤。例如，可以使用本文公开的组合物和方法治疗的癌症包括但不限于腺瘤、癌、肉瘤、白血病或淋巴瘤。在一些实施方案中，癌症是慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B细胞急性淋巴细胞性白血病(B-ALL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞性白血病(AML)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、弥散性大细胞淋巴瘤(DLCL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾细胞癌(RCC)、神经母细胞瘤、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、黑素瘤、肉瘤、前列腺癌、肺癌、食道癌、肝细胞癌、胰腺癌、星形细胞瘤、间皮瘤、头颈癌以及髓母细胞瘤和肝癌。在一些实施方案中，癌症选自黑素瘤、头颈癌、膀胱癌、肺癌、宫颈癌、胰腺癌、乳腺癌和结直肠癌。在一些实施方案中，癌症对用PD1抑制剂治疗不敏感或有抗性。在一些实施方案中，癌症对用PD1抑制剂治疗不敏感或具有抗性，并且选自黑素瘤、头颈癌、膀胱癌、肺癌、宫颈癌、胰腺癌、乳腺癌和结直肠癌。
如上所述，目前已批准将若干种免疫检查点抑制剂用于多种肿瘤适应症(例如CTLA4抑制剂、PD1抑制剂、PDL1抑制剂等)。在一些实施方案中，施用包含本文所述的降低的内源靶基因的表达和/或功能的修饰的免疫效应细胞导致与用免疫检查点抑制剂治疗之后观察到的治疗效果相比增强的治疗效果(例如，肿瘤生长的更显著减少、淋巴细胞对肿瘤浸润的增加、无进展存活的长度增加等)。
此外，一些肿瘤适应症对用免疫检查点抑制剂的治疗无应答(即不敏感)。更进一步，一些最初对用免疫检查点抑制剂的治疗有应答(即敏感)的肿瘤学适应症在治疗过程中会产生抑制剂抗性表型。因此，在一些实施方案中，施用本文所述的修饰的免疫效应细胞或其组合物以治疗对用一种或多种免疫检查点抑制剂的治疗具有抗性(或部分抗性)或不敏感(或部分不敏感)的癌症。在一些实施方案中，向患有对用一种或多种免疫检查点抑制剂的治疗有抗性(或部分抗性)或不敏感(或部分不敏感)的癌症的受试者施用修饰的免疫效应细胞或其组合物导致对癌症的治疗(例如，肿瘤生长的减少、无进展存活的长度增加等)。在一些实施方案中，癌症对用PD1抑制剂的治疗具有抗性(或部分抗性)或不敏感(或部分不敏感)。
在一些实施方案中，修饰的免疫效应细胞或其组合物与免疫检查点抑制剂组合施用。在一些实施方案中，与用单独的修饰的免疫效应细胞或免疫检查点抑制剂的治疗所观察到的治疗效果相比，修饰的免疫效应细胞与免疫检查点抑制剂的组合施用导致在对用免疫检查点抑制剂的治疗具有抗性、难治性或不敏感性的癌症中的增强的治疗效果。在一些实施方案中，与用单独的修饰的免疫效应细胞或免疫检查点抑制剂的治疗所观察到的治疗效果相比，修饰的免疫效应细胞与免疫检查点抑制剂的组合施用导致在对用免疫检查点抑制剂的治疗具有部分抗性、部分难治性或部分不敏感性的癌症中的增强的治疗效果。在一些实施方案中，癌症对用PD1抑制剂的治疗具有抗性(或部分抗性)、难治性(或部分难治性)或不敏感性(或部分不敏感性)。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的免疫效应细胞或其组合物与抗PD1抗体的组合施用导致在对用单独的抗PD1抗体的治疗具有抗性或不敏感性的癌症中的增强的治疗效果。在一些实施方案中，本文所述的修饰的免疫效应细胞或其组合物与抗PD1抗体的组合施用导致在对用单独的抗PD1抗体的治疗具有部分抗性或部分不敏感性的癌症中的增强的治疗效果。
表现出对免疫检查点抑制的抗性或敏感性的癌症是本领域已知的，并且可以在多种体内和体外模型中进行测试。例如，一些黑素瘤对用免疫检查点抑制剂诸如抗PD1抗体的治疗是敏感的，并且可以在体内B16-Ova肿瘤模型中建模(参见实施例6、14和17)。此外，已知一些结直肠癌对用免疫检查点抑制剂诸如抗PD1抗体的治疗具有抗性，并且可以在PMEL/MC38-gp100模型中建模(参见实施例7和15)。更进一步，已知一些淋巴瘤对用免疫检查点抑制剂诸如抗PD1抗体的治疗是不敏感的，并且可以通过过继转移或皮下施用淋巴瘤细胞系(诸如Raji细胞)在各种模型中进行建模(参见实施例10、12和13)。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的免疫效应细胞和基因调控系统可用于治疗病毒感染。在一些实施方案中，病毒选自腺病毒、疱疹病毒(包括例如单纯疱疹病毒和爱泼斯坦巴尔病毒、和带状疱疹病毒)、痘病毒、乳多空病毒、肝炎病毒(包括例如乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒)、乳头瘤病毒、正粘病毒(包括例如甲型流感、乙型流感和丙型流感)、副粘病毒、冠状病毒、小核糖核酸病毒、呼肠孤病毒、披膜病毒、黄病毒、布尼亚病毒科、弹状病毒、轮状病毒、呼吸道合胞病毒、人类免疫缺陷病毒或逆转录病毒中的一种。
以引用的方式并入
本文引用的所有参考文献、文章、出版物、专利、专利公开和专利申请出于所有目的以引用的方式整体并入本文。但是，本文中引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利公开和专利申请的提及均不是并且不应当被认为承认或以任何形式暗示它们构成了有效的现有技术或构成世界上任何国家的公知常识的一部分。
实施例
实施例1：材料和方法
本文所述的实验利用CRISPR/Cas9系统来调节不同T细胞群体中一种或多种内源靶基因的表达。
I.材料
gRNA：除非另有说明，否则所有实验均使用单分子gRNA(sgRNA)。双gRNA分子如所示使用，并通过在95℃下在无核酸酶的双链体缓冲液(IDT目录号11-01-03-01)中将200μMtracrRNA(IDT目录号1072534)与200μM靶特异性crRNA(IDT)双链化5分钟以形成100μMtracrRNA:crRNA双链体而形成，其中tracrRNA和crRNA以1:1比率存在。下表10中提供了用于以下实验的gRNA的靶向序列。
表10：实验性gRNA的靶向序列
Cas9：通过引入Cas9 mRNA或Cas9蛋白在靶细胞中表达Cas9。除非另有说明，否则在以下实验中使用包含来源于酿脓链球菌的核定位序列(Cas9-NLS mRNA)(Trilink L-7206)的编码Cas9的mRNA或来源于酿脓链球菌的Cas9蛋白(IDT目录号1074182)。
RNP：对于人核糖核蛋白(RNP)，gRNA-Cas9 RNP通过将1.2μL 100μM tracrRNA:crRNA双链体与1μL 20μM Cas9蛋白和0.8μL PBS组合而形成。将混合物在室温下孵育20分钟以形成RNP复合物。对于鼠RNP，gRNA-Cas9RNP通过将1体积44μM tracrRNA:crRNA双链体与1体积36μM Cas9蛋白组合而形成。将混合物在室温下孵育20分钟以形成RNP复合物。
小鼠：野生型CD8+ T细胞来源于C57BL/6J小鼠(The Jackson Laboratory,BarHarbor ME)。卵清蛋白(Ova)特异性CD8+T细胞来源于OT1小鼠(C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J；Jackson Laboratory)。OT1小鼠包含识别卵清蛋白(Ova)蛋白的残基257-264的转基因TCR。gp100特异性CD8+ T细胞来源于PMEL小鼠(B6.Cg-Thy1<a>/CyTg(TcraTcrb)8Rest/J；The Jackson Laboratory,Bar Harbor ME目录号005023)。组成性表达Cas9蛋白的小鼠从Jackson实验室获得(B6J.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J；The Jackson Laboratory,Bar Harbor ME Strain编号026179)，组成性表达Cas9的TCR转基因小鼠通过用Cas9小鼠繁殖OT1和PMEL小鼠获得。
siRNA：自递送Accell siRNA(Dharmacon)用于鼠CD8 T细胞中的基因沉默。根据制造商的说明书制备对照(目录号：K-005000-G1-02)或靶向Socs1(目录号E-043120-00-0005)或Ankrd11(目录号E-061462-00-0005)基因的Accell siRNA。纯化的鼠CD8 T细胞在siRNA递送培养基(Dharmacon目录号B-005000-500)中用抗CD3/抗CD28珠(用于T细胞扩增和活化的DynabeadsTM小鼠T活化剂CD3/CD28目录号11456D)活化，所述培养基含有2.5％热灭活的FBS，并补充有10ng/mL的重组小鼠IL-2(Biolegend目录号575406)。加入自递送Accell siRNA，最终浓度为1μM。72小时后，去除活化珠，通过流式细胞术评估细胞的STAT磷酸化，或将细胞沉淀用于RNA分离和通过qRT-PCR进行基因表达分析。
锌指：工程化的锌指核酸酶(ZFN)结构域由Sigma Aldrich在质粒对(CSTZFN-1KT
定制锌指核酸酶(ZFN)R-3257609)中生成。定制结构域以识别小鼠Ankrd11基因的位置Chr8:122899675-122899667和Chr8:122899614-122899608、小鼠Socs1基因的位置Chr16:10784576-10784562和Chr16:10784346-10784325以及对照小鼠基因Olfr455的位置Chr6:42538446-42538447。质粒按照制造商的方案使用商业NEB Monarch Miniprep系统(目录号T1010)来制备。将DNA模板使用10μg总输入量线性化，并使用NEB Monarch PCR和DNA清除试剂盒(目录号T1030)纯化。根据制造商的条件，使用6μg纯化的DNA模板和PromegaT7 RiboMAX大规模RNA生产系统(P1300和P1712)进行体外转录反应以生成5'-加帽的RNA转录物。转录物使用Qiagen RNeasy Mini纯化试剂盒(目录号74104)来纯化。使用Agilent4200TapeStation系统确认每个ZFN结构域转录物的完整性和浓度。使用NEB大肠杆菌Poly(A)聚合酶(M0276)，每个反应使用10个单位，对纯化的转录物进行聚腺苷酸化。使用Agilent 4200TapeStation系统通过大小转换来确认聚腺苷酸化尾巴的添加。将每个成熟的ZFN结构域mRNA转录物与其对应的对组合，并将10μg每对与5百万个小鼠CD8 T细胞混合，并根据下文所述的鼠T细胞电穿孔方法进行电穿孔。
CAR表达构建体：生成对人CD19、Her2/Erbb2和EGFR蛋白具有特异性的CAR。简而言之，将人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体亚基α(GMSCF-Rα)的22个氨基酸信号肽与特异性结合CD19、Her2/Erbb2或EGFR中的一种的抗原特异性scFv结构域融合。将人CD8α茎用作跨膜结构域。将CD3ξ链的细胞内信号传导结构域与CD8α茎的细胞质末端融合。对于抗CD19CAR，scFv来源于抗人CD19克隆FMC63。为了产生对人HER2/ERBB2具有特异性的CAR，使用来源于曲妥珠单抗的抗人HER2 scFv。类似地，为了生成对EGFR具有特异性的CAR，使用来源于西妥昔单抗的抗EGFR scFv。下面示出了示例性CAR构建体的总结，并且在SEQ ID NO:26、28和30中提供了全长CAR构建体的氨基酸序列，并且在SEQ ID NO:27、29和31中提供了全长CAR构建体的核酸序列。
表11：示例性CAR构建体
工程化的TCR表达构建体：生成了对NY-ESO1、MART-1和WT-1具有特异性的重组TCR。从文献中鉴定了配对的TCR-α:TCR-β可变区蛋白序列，其编码对NY-ESO-1肽SLLMWITQC(SEQ ID NO:2)具有特异性的1G4 TCR、对MART-1肽AAGIGILTV(SEQ ID NO:3)具有特异性的DMF4和DMF5 TCR以及对WT-1肽具有特异性的DLT和高亲和性DLT TCR，每种均由HLA-A*02:01呈现(Robbins等人,Journal of Immunology 2008 180:6116-6131)。TCRα链由V和J基因区段和CDR3α序列组成，而TCRβ链由V、D和J基因区段和CDR3-β序列组成。将天然TRAC(SEQID NO:22)和TRBC(SEQ ID NO:24)蛋白序列分别与α和β链可变区的C末端融合，以产生1G4-TCRα/β链(分别为SEQ ID NO:11和12)、95:LY 1G4-TCRα/β链(分别为SEQ ID NO:14和13)、DLT-TCRα/β链(分别为SEQ ID NO:5和4)、高亲和性DLT-TCRα/β链(分别为SEQ ID NO:8和7)、DMF4-TCRα/β链(分别为SEQ ID NO:17和16)和DMF5-TCRα/β链(分别为SEQ ID NO:20和19)。
生成编码工程化的TCRα和TCRβ链蛋白的密码子优化的DNA序列，其中将P2A序列(SEQ ID NO:1)插入在编码TCRβ和TCRα链的DNA序列之间，使得两条TCR链的表达以化学计量的方式从单个启动子中驱除。因此，编码工程化的TCR链的表达盒包含以下格式：TCRβ-P2A-TCRα。在SEQ ID NO:12(1G4)、SEQ ID NO:15(95:LY 1G4)、SEQ ID NO:6(DLT)、SEQ IDNO:9(高亲和性DLT)、SEQ ID NO:18(DMF4)和SEQ ID NO:21(DMF5)中提供了每种TCR构建体的最终蛋白质序列。
慢病毒表达构建体：然后将上述CAR和工程化的TCR表达构建体插入质粒中，所述质粒包含驱动工程化受体的表达的SFFV启动子、T2A序列和嘌呤霉素抗性盒。除非另有说明，否则这些质粒还包含驱动一种或多种sgRNA的表达的人或鼠(取决于T细胞来源的物种)U6启动子。包含工程化TCR表达构建体的慢病毒构建体还可以包含靶向内源TRAC基因的sgRNA，所述TRAC基因编码T细胞受体的α链的恒定区。
编码上述工程化受体的慢病毒如下生成。简而言之，在转染前24小时，将289x 106个LentiX-293T细胞铺在5层CellSTACK中。将无血清的OptiMEM和TransIT-293组合，并孵育5分钟，然后将辅助质粒(58μg VSVG和115μg PAX2-Gag-Pol)与231μg上述表达工程化的受体和sgRNA的质粒组合。20分钟后，将此混合物加入含有新鲜培养基的LentiX-293T细胞中。转染后18小时更换培养基，并且转染后48小时收集病毒上清液。上清液用
核酸酶处理，并通过0.45μm过滤器以分离病毒颗粒。然后将病毒颗粒通过切向流过滤(TFF)进行浓缩，等分，滴定并保存在-80℃下。
II.方法
人T细胞分离和活化：通过Ficoll梯度离心从新鲜leukopacks中分离出总人PBMC。然后使用CD8+ T细胞分离试剂盒(Stemcell Technologies目录号17953)从总PBMC中纯化CD8+ T细胞。对于T细胞活化，将CD8+ T细胞以2x 106个细胞/mL接种在T175烧瓶中的X-VIVO 15T细胞扩增培养基(Lonza，目录号04-418Q)中，所述培养基具有6.25μL/mLImmunoCult T细胞活化剂(抗CD3/CD28/CD2，StemCell Technologies,Vancouver BC,Canada)和10ng/mL人IL2。在用慢病毒构建体转导之前，活化T细胞18小时。
TIL分离和活化：肿瘤浸润淋巴细胞也可以通过本文所述的方法进行修饰。在此类情况下，从人类患者手术切除肿瘤，并用手术刀刀片将其切成1mm3小块，并将单块肿瘤放入24孔板的每个孔中。将补充有6000U/mL重组人IL-2的2mL完全TIL培养基(RPMI+10％热灭活的人雄性AB血清，1mM丙酮酸，20μg/mL庆大霉素，1X glutamax)添加到分离的TIL的每个孔中。从孔中取出1mL培养基，并用新鲜培养基和IL-2替换，根据需要每周多达3次。当孔达到汇合时，将它们在新培养基+IL-2中按1:1分开。培养4-5周后，收获细胞用于快速扩增。
TIL快速扩增：通过在20mL TIL培养基+20mL Aim-V培养基(Invitrogen)+30ng/mLOKT3 mAb中用26x 106个同种异体的辐射的(5000cGy)PBMC饲养细胞活化500,000个TIL来快速扩增TIL。48小时后(第2天)，将6000U/mL IL-2添加到培养物中。在第5天，取出20mL培养基，并添加20mL新鲜培养基(+30ng/ml OKT3)。在第7天，对细胞进行计数，并以60x 106个细胞/L重新接种在G-Rex6M孔板(Wilson Wolf，目录号80660M)或G-Rex100M(Wilson Wolf，目录号81100S)中，这取决于可用细胞数目。在第9天添加6000U/mL新鲜IL-2，并且在第12天添加3000U/mL新鲜IL-2。在第14天收获TIL。然后使用Coolcell冷冻容器(Corning)将扩增的细胞在Cryostor CS-10(Stemcell Technologies目录号07930)中缓慢冷冻，并长期保存在液氮中。
鼠T细胞分离和活化：根据制造商的建议，从野生型或转基因小鼠中收获脾脏并使用GentleMACS系统将其减小成单细胞悬浮液。使用EasySep小鼠CD8+ T细胞分离试剂盒(目录号19853)获得纯化的CD8+ T细胞。将CD8 T细胞以1x 106个细胞/mL在补充有2ng/mL重组小鼠IL-2(Biolegend目录号575406)的完全T细胞培养基(RPMI+10％热灭活FBS，20mMHEPES，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，50μMβ-巯基乙醇)中培养，并用抗CD3/抗CD28珠(用于T细胞扩增和活化的DynabeadsTM小鼠T-活化剂CD3/CD28，目录号11456D)活化。
T细胞的慢病毒转导：将18小时前活化的T细胞以每孔5x 106个细胞接种在6孔板中的1.5mL体积的X-VIVO 15培养基、10ng/mL人IL-2和12.5μL免疫培养人CD3/CD28/CD2 T细胞活化剂中。以能够感染所有细胞的80％的MOI加入表达工程化受体的慢病毒。向每个孔中添加25μL Retronectin(1mg/mL)。添加XVIVO-15培养基至最终体积为每孔2.0mL。除非另有说明，否则慢病毒也表达sgRNA。在室温下将板以600x g旋转1.5小时。18小时(第2天)后，洗涤细胞并将其以1x 106个细胞/mL接种在X-VIVO 15、10ng/mL IL2+T细胞活化剂中。
人T细胞的电穿孔：T细胞活化后3天，收获T细胞并以100x 106个细胞/mL的浓度重悬于核转染缓冲液(来自Amaxa P3原代细胞4D-Nuclefector X试剂盒S的18％补充剂1，82％P3缓冲液)中。每20μL细胞溶液中添加1.5μL sgRNA/Cas9 RNP复合物(包含120pmolcrRNA:tracrRNA双链体和20pmol Cas9核酸酶)和2.1μL(100pmol)电穿孔增强剂。然后向每个电穿孔孔中加入25μL细胞/RNP/增强剂混合物。使用具有“EO-115”程序的Lonza电穿孔仪对细胞进行电穿孔。电穿孔后，向每个孔加入80μL温热的X-VIVO 15培养基，并将细胞以2x106个细胞/mL的密度汇集到培养瓶中的含有IL-2(10ng/mL)的X-VIVO 15培养基中。在第4天，将细胞洗涤，计数并以50-100x 106个细胞/L的密度接种在G-Rex6M孔板或G-Rex100M中的含有IL-2(10ng/mL)的X-VIVO 15培养基中，这取决于可用细胞数目。在第6天和第8天，将10ng/mL新鲜的重组人IL-2添加到培养物中。
小鼠T细胞的电穿孔：收获48小时前活化的鼠T细胞，去除活化珠，并洗涤细胞并将其重悬在Neon核转染缓冲液T中。将多达2x 106个细胞重悬于9μL缓冲液T中，并将20x 106个细胞重悬在90μL缓冲液T中，可以分别使用NeonTM 10-μL尖端和NeonTM 100-μL尖端进行电穿孔。将gRNA/Cas9 RNP复合物或ZFN mRNA(每10μL尖端1μL或每100μL尖端10μL)和10.8μM电穿孔增强剂(每10μL尖端2μL或每100μL尖端20μL)添加到细胞中。将与gRNA/Cas9 RNP复合物或ZFN mRNA混合的T细胞吸移至NeonTM尖端，并使用Neon转染系统(1700V/20ms/1脉冲)进行电穿孔。电穿孔后，立即将细胞以1.6x 106个细胞/mL的密度转移到培养瓶中的补充有2ng/mL重组小鼠IL-2的温热的完全T细胞培养基中。将编辑的鼠CD8 T细胞以1x 106个细胞/mL在补充有IL-2的完全T细胞培养基中再进一步培养1-4天。
工程化T细胞的纯化和表征：T细胞活化后10天，从培养瓶中取出细胞，并纯化编辑的表达工程化受体的CD8+ T细胞。可以通过抗体染色来测定工程化受体的表达，例如，针对Vβ12的抗体用于DMF4 TCR，或针对Vβ13/13.1的抗体用于NY-ESO-1或1G4)。可以通过表面蛋白(例如，CD3)的FACS分析、靶蛋白的蛋白质印迹和/或基因组切割位点的TIDE/NGS分析来评估靶基因编辑的进一步确定。然后，可以使用Coolcell Freezing容器(Corning)将纯化的细胞在Cryostor CS-10(Stemcell Technologies目录号07930)中缓慢冷冻，并长期保存在液氮中以备将来使用。
实施例2：编辑的受体工程化T细胞的表征
进行了基于CD3的细胞表面表达纯化编辑的受体表达细胞的实验。在工程化之前，CD8+ T细胞在细胞表面表达CD3分子，作为包含TCRα/β链的复合物的一部分(图4A)。用表达CAR、靶向TRAC基因的指导RNA和靶向B2M基因的指导RNA的慢病毒转导T细胞，这被用于评估非TCR基因的编辑，作为靶基因编辑的代替。慢病毒转导和Cas9 mRNA电穿孔之后，成功转导和编辑的T细胞表现出由于TRAC基因的编辑而导致的表面CD3表达的丧失，以及由于B2M基因的编辑而导致的HLA-ABC表达的丧失(图4B)。使用EasySep人CD3阳性选择试剂盒(StemCell Tech目录号18051)从大量群体中取出表达CD3的细胞(图4B)。然后对细胞进行两轮针对CD3的阴性磁选择。这个过程产生高度纯化的CD3阴性T细胞表达(图4C)。用重组CD19-Fc试剂(其结合CD19 CAR)染色证明，编辑的细胞显示出CD19 CAR的表面表达，而未编辑的细胞则没有(图4D)。用靶向CD45和B2M的sgRNA进行了类似的实验。96小时后，通过流式细胞术评估CD45和B2M表达来证实T细胞中的Cas9编辑活性，并且通过FACS所测定的T细胞表面上CD45表达的丧失来表明有效的Cas9功能。与Cas9 mRNA和Cas9 RNP的共电穿孔导致CD45和B2M基因座的大幅度编辑，其中66.3％的细胞表现出双重编辑。
如以上实施例中所述进行靶标编辑，并且使用通过分解追踪插入缺失(TIDE)分析方法和蛋白质印迹分析两者来确认单个示例性基因CBLB的编辑。TIDE量化编辑功效，并鉴定靶向的细胞库的DNA中插入和缺失(indel)的主要类型。
使用Qiagen血液和细胞培养DNA Mini试剂盒(目录号：13323)按照供应商推荐的方案从编辑的T细胞中分离基因组DNA(gDNA)，并进行定量。gDNA分离之后，使用基因座特异性PCR引物(F:5’-CCACCTCCAGTTGTTGCATT-3’(SEQ ID NO:32)；R:5’-TGCTGCTTCAAAGGGAGGTA-3’(SEQ ID NO:33))进行PCR以扩增编辑的DNA的区域。将所得的PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，提取，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(目录号：28706)纯化。对提取的产物进行Sanger测序并且通过TIDE分析Sanger测序色谱图序列文件。在通过使用gRNA/Cas9 RNP复合物或与表达慢病毒的gRNA一起引入的Cas9mRNA的方法编辑的CBLB编辑的T细胞中，所得的TIDE分析证实了CBLB靶基因的编辑。除了TIDE以外，使用抗CBLB抗体(SCT目录号9498)通过蛋白质印迹证实CBLB蛋白水平的消耗。数据提供在图5A和5B以及图6中。
评估基因编辑的另一种方法是下一代测序。对于此方法，使用Qiagen血液和细胞培养DNA Mini试剂盒(目录号：13323)按照供应商推荐的方案从编辑的T细胞中分离基因组DNA(gDNA)，并进行定量。gDNA分离之后，使用基因座特异性PCR引物进行PCR以扩增编辑的基因组DNA的区域，所述引物包含添加Illumina下一代测序衔接子所需的突出端。将所得的PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，以确保发生了基因组基因座的特异性和充分扩增，然后根据供应商推荐的方案使用Monarch PCR&DNA清除试剂盒(目录号：T1030S)进行PCR清除。然后对纯化的PCR产物进行定量，并进行第二次PCR，以退火Illumina测序衔接子和多重测序所需的样品特异性索引序列。此后，将PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳以评估大小，然后使用AMPure XP珠(内部生产)进行纯化。然后使用Kapa Illumina文库定量试剂盒(目录号：KK4923)和Kapa Illumina文库定量DNA标准品(目录号：KK4903)经由qPCR对纯化的PCR产物进行定量。然后使用Illumina NextSeq 500/550中型输出试剂盒v2(目录号：FC-404-2003)将定量的产品加载到Illumina NextSeq 500系统上。对所产生的测序数据进行分析以评估在编辑的T细胞库的DNA中预期的切割位点处的插入和缺失。
实施例3：通过OT1/B16-OVACRISPR/CAS9功能基因组筛选鉴定过继性T细胞转移疗法靶标
进行实验以鉴定调控肿瘤中T细胞积累的靶标。进行合并的CRISPR筛选，其中将靶向单个基因的每个sgRNA池引入肿瘤特异性T细胞群体中，使得群体中的每个细胞均包含靶向单个基因的单个sgRNA。为了确定特定基因对肿瘤样品中T细胞积累的影响，在实验开始时测定T细胞群体中每个sgRNA的频率，并将其与实验中稍后时间点的同一sgRNA的频率进行比较。预期靶向正调控肿瘤样品中T细胞积累的基因(例如正调控T细胞增殖、存活力和/或肿瘤浸润的基因)的sgRNA的频率随时间推移而增加，而预期靶向负调控肿瘤样品中T细胞积累的基因(例如负调控T细胞增殖、存活力和/或肿瘤浸润的基因)的sgRNA的频率随时间推移而减少。
根据实施例1中所述的方法，用来源于表达Cas9的OT1小鼠的CD8+ T细胞进行合并的CRISPR筛选。将合并的sgRNA文库和Cas9 mRNA引入纯化的OTI CD8+ T细胞中并且将其体外培养以生成编辑的CD8+ T细胞群体。体外工程化之后，将编辑的OT1 CD8+ T细胞静脉内(iv)施用于B16-Ova荷瘤C56BL/6小鼠。体内扩增之后，收获器官并富集CD45+。使用QiagenDNA提取试剂盒从分离的CD45+细胞中分离基因组DNA。然后通过PCR扩增sgRNA文库，并使用Illumina下一代测序(NGS)对其进行测序。
分析从荷瘤小鼠收获的样品中每种sgRNA的分布和/或频率，并将其与初始T细胞群体中每种sgRNA的分布和/或频率进行比较。对每个单独的sgRNA进行统计分析，以鉴定在从荷瘤小鼠中收获的T细胞群体中显著富集的指导物，并为每个指导物分配富集得分。汇总对于靶向同一基因的单独的sgRNA的富集得分，以鉴定跨多个sgRNA和多个OT1供体小鼠的T细胞积累具有一致且可再现作用的靶基因。这些实验的结果在下表12中示出。表12中的百分位数使用以下等式计算：百分位数得分＝1-(基因富集排序/筛选的基因总数)。
表12：靶基因百分位数得分
实施例4：通过体外CAR-T和CRISPR/CAS9功能基因组筛选鉴定过继性T细胞转移疗法靶标
进行实验以鉴定调控CAR-T细胞肿瘤样品的积累的靶标。进行合并的全基因组CRISPR筛选，其中将靶向单个基因的每个sgRNA池引入肿瘤特异性人CAR-T细胞群体中，使得群体中的每个细胞均包含靶向单个基因的单个sgRNA。为了确定特定基因对肿瘤样品中CAR-T细胞积累的影响，在实验开始时测定CAR-T细胞群体中每个sgRNA的频率，并将其与实验中稍后时间点的同一sgRNA的频率进行比较。预期靶向正调控肿瘤样品中CAR-T细胞积累的基因(例如正调控T细胞增殖、存活力和/或肿瘤浸润的基因)的sgRNA的频率随时间推移而增加，而预期靶向负调控肿瘤样品中CAR-T细胞积累的基因(例如负调控T细胞增殖、存活力和/或肿瘤浸润的基因)的sgRNA的频率随时间推移而减少。
使用对人CD19具有特异性的CAR-T细胞进行体外筛选。如上所述，将合并的sgRNA文库引入CD19 CART中，并且如实施例1中所述，用Cas9mRNA对细胞进行电穿孔，以生成Cas9编辑的CD19 CART群体。然后将编辑的CD19 CART与工程化以表达CD19的粘附性结直肠癌(CRC)细胞系或表达内源CD19的伯基特淋巴瘤细胞系共培养。在整个共培养期间的不同时间点收获CART，并将细胞沉淀物冷冻。使用Qiagen DNA提取试剂盒从这些细胞沉淀物中分离基因组DNA(gDNA)，并使用Illumina下一代测序对其进行测序。
分析从CART/肿瘤细胞共培养物中取出的等分试样中每种sgRNA的分布和/或频率，并将其与初始编辑的CAR-T细胞群体中每种sgRNA的分布和/或频率进行比较。对每个单独的sgRNA进行统计分析，以鉴定在肿瘤细胞共培养后在CAR-T细胞群体中显著富集的sgRNA，并为每个指导物分配富集得分。汇总对于靶向同一基因的单独的sgRNA的富集得分，以鉴定跨多个sgRNA和CAR-T细胞群体的肿瘤样品中CAR-T细胞积累具有一致且可再现作用的靶基因。基于百分位数对靶标进行排序并要求进一步调查。这些实验的结果在下表13中示出。表13中的百分位数使用以下等式计算：百分位数得分＝1-(基因富集排序/筛选的基因总数)。
表13：靶基因百分位数得分
| 靶标名称 | 百分位数得分 |
| IKZF1 | 0.999 |
| IKZF3 | 0.962 |
| TGFBR1 | 0.778 |
| TNIP1 | 0.64 |
| TNFAIP3 | 0.791 |
| FOXP3 | 0.866 |
| IKZF2 | 0.907 |
| TANK | 0.93 |
| PTPN6 | 0.707 |
| BCOR | 0.999 |
| CBLB | 0.989 |
| BCL2L11 | 0.93 |
| CHIC2 | 0.71 |
| WDR6 | 0.962 |
| E2F8 | 0.971 |
| DHODH | 0.763 |
| SOCS1 | 0.673 |
| ANKRD11 | 0.716 |
实施例5：通过体内CAR-T/肿瘤CRISPR/CAS9功能基因组筛选鉴定过继性T细胞转移疗法靶标
进行实验以鉴定在肿瘤存在下调控CAR-T细胞积累的靶标。进行合并的CRISPR筛选，其中将靶向单个基因的每个sgRNA池引入肿瘤特异性人CAR-T细胞群体中，使得群体中的每个细胞均包含靶向单个基因的单个sgRNA。为了确定特定基因对肿瘤样品中CAR-T细胞积累的影响，在实验开始时测定CAR-T细胞群体中每个sgRNA的频率，并将其与实验中稍后时间点的同一sgRNA的频率进行比较。预期靶向正调控肿瘤样品中CAR-T细胞积累的基因(例如正调控T细胞增殖、存活力和/或肿瘤浸润的基因)的sgRNA的频率随时间推移而增加，而预期靶向负调控肿瘤样品中CAR-T细胞积累的基因(例如负调控T细胞增殖、存活力和/或肿瘤浸润的基因)的sgRNA的频率随时间推移而减少。
体内筛选在两个单独的皮下异种移植模型中进行：伯基特淋巴瘤模型和结直肠癌(CRC)模型。对于伯基特模型，将Matrigel中1x 106个伯基特淋巴瘤肿瘤细胞皮下注射到6-8周龄NOD/SCIDγ(NSG)小鼠的右侧腹中。当肿瘤达到约200mm3的体积时，在接种后13天对小鼠进行监测，随机化并纳入研究中。对于CRC模型，将CRC细胞工程化以表达CD19，并将Matrigel中的5x 106个肿瘤细胞皮下注射到6-8周龄NSG小鼠的右侧腹中。当肿瘤达到约200mm3的体积时，在接种后12天对小鼠进行监测，随机化并纳入研究中。经尾静脉以3x 106和10x 106/小鼠(3M和10M)静脉内施用Cas9工程化的CD19 CAR-T细胞。CAR-T注射后8至10天收集肿瘤，并在液氮中冷冻。随后分离这些组织并处理用于基因组DNA提取。
分析研究结束时取出的基因组DNA样品中每种sgRNA的分布和/或频率，并与初始编辑的CAR-T细胞群体中每种sgRNA的分布和/或频率进行比较。对每个单独的sgRNA进行统计分析，以鉴定在研究结束时取出的基因组DNA样品中显著富集的sgRNA，并为每个指导物分配富集得分。汇总对于靶向同一基因的单独的sgRNA的富集得分，以鉴定跨多个sgRNA和CAR-T细胞群体中的CAR-T细胞丰度具有一致且可再现作用的靶基因。基于百分位数对靶标进行排序并要求进一步调查。这些实验的结果在下表14中示出。表14中的百分位数使用以下等式计算：百分位数得分＝1-(基因富集排序/筛选的基因总数)。
表14：靶基因百分位数得分
实施例6：在鼠OT1/B16 OVA同基因肿瘤模型中验证单编辑的过继转移的T细胞
选择在实施例3-5中百分位数得分为0.6或更高的靶标，以单指导形式进行进一步评估，以确定在肿瘤特异性T细胞中编辑靶基因是否使抗肿瘤功效增加。本文描述了示例性靶标的评估，然而这些方法可用于评估上述任何潜在靶标。
使用对用抗PD1抗体治疗敏感的B16-Ova皮下同基因肿瘤模型在小鼠中评估单编辑的T细胞的抗肿瘤功效。简而言之，向来自Jackson实验室的6-8周龄雌性C57BL/6J小鼠皮下注射0.5x 106个B16-Ova肿瘤细胞。当肿瘤达到约100mm3的体积时，将小鼠随机分为10组，并经尾静脉静脉内注射编辑的小鼠OT1 CD8+ T细胞。在注射之前，通过用包含以下的gRNA/Cas9 RNP复合物进行电穿孔来编辑OT1 T细胞：(i)对照gRNA；(ii)单个靶向PD1的gRNA；(iii)单个靶向Cblb的gRNA；(iv)单个靶向Socs1的gRNA。为了生成具有编辑的靶基因的肿瘤特异性CD8+ T细胞群体，如实施例1所述从雌性OT1小鼠收获脾脏并分离CD8 T细胞。然后将编辑的OT1 CD8+ T细胞静脉内施用于B16-Ova荷瘤C56BL/6小鼠。每周测量体重和肿瘤体积至少两次。将肿瘤体积计算为每个治疗组的平均值和平均值的标准误差。根据下式，使用平均肿瘤体积(TV)计算肿瘤生长抑制百分比(TGI)：
％TGI＝(TV-靶标最终–TV-靶标初始)/(TV-对照最终–TV-对照初始)，
其中TV＝平均肿瘤体积，Cblb TGI的最终＝T细胞转移后第18天，Socs1TGI的最终＝T细胞转移后第17天，并且初始＝第0天(即T细胞转移那天)。
Cblb编辑的T细胞的结果在图7A中示出。这些数据证明在T细胞中对Cblb基因的编辑导致抗肿瘤功效在第18天的TGI为85％。Socs1编辑的T细胞的结果在图7B中示出。这些数据证明，在T细胞中对Socs1基因的编辑增强了T细胞的抗肿瘤功效，其中在第17天的TGI为62％。可以进行类似的实验以评估Ankrd11编辑的T细胞的抗肿瘤功效。
实施例7：在鼠MC38/GP100同基因肿瘤模型中验证单编辑的过继转移的T细胞
选择实施例3-5中百分位数得分为0.6或更高的靶标，以单指导形式进行进一步评估，以确定在肿瘤特异性T细胞中编辑靶基因是否在结直肠癌的鼠MC38gp100皮下同基因肿瘤模型(其对用抗PD1抗体的治疗不敏感)中使抗肿瘤功效增加。本文描述了示例性靶标的评估，然而这些方法可用于评估上述任何潜在靶标。
简而言之，向来自Jackson实验室的6-8周龄雌性C57BL/6J小鼠皮下注射1x 106个MC38gp100肿瘤细胞。在注射之前，通过用包含以下的gRNA/Cas9RNP复合物进行电穿孔来编辑T细胞：(i)对照gRNA；(ii)单个靶向Socs1的gRNA；或(iii)单个靶向Ankrd11的gRNA。当肿瘤达到约100mm3的体积时，将小鼠随机分为10组，并经尾静脉静脉内注射Socs1编辑或Ankrd11编辑的小鼠PMEL CD8+ T细胞。每周测量体重和肿瘤体积至少两次。将肿瘤体积计算为每个治疗组的平均值和平均值的标准误差。
Socs1编辑的T细胞的结果在图8A中示出，并且与对照相比，在第21天显示肿瘤生长显著减少。Ankrd11编辑的T细胞的结果在图8B中示出，并且与对照相比，在第21天类似地显示肿瘤生长显著减少。
实施例8：鼠OT1/EG7OVA皮下同基因肿瘤模型中验证单编辑的过继转移的T细胞
使用Eg7-Ova皮下同基因肿瘤模型在小鼠中进一步评估Socs1、Ankrd11和Cblb的抗肿瘤功效。向来自Jackson实验室的6-8周龄雌性C57BL/6J小鼠皮下注射1x 106个Eg7-Ova肿瘤细胞。当肿瘤达到约100mm3的体积时，将小鼠随机分为10组，并经尾静脉静脉内注射编辑的小鼠OT1 CD8+ T细胞。在注射之前，用对照指导物或者对Socs1、Ankrd11或Cblb基因进行编辑的单个指导物来编辑这些细胞。每周测量体重和肿瘤体积至少两次。将肿瘤体积计算为每个治疗组的平均值和平均值的标准误差。
预期这些数据证明与对照相比，T细胞中Socs1、Ankrd11或Cblb基因的编辑增强T细胞的抗肿瘤功效。
实施例9：在A375异种移植肿瘤模型中验证单编辑的过继转移的T细胞
选择实施例3-5中百分位数得分为0.6或更高的靶标，以单指导形式进行进一步评估，以确定在肿瘤特异性T细胞中编辑靶基因是否在A375异种移植肿瘤模型中使抗肿瘤功效增加。本文描述了示例性靶标的评估，然而这些方法可用于评估上述任何潜在靶标。
简而言之，向来自Jackson实验室的6-8周龄NSG小鼠皮下注射5x 106个A375细胞。当肿瘤达到约200mm3的体积时，将小鼠随机分成8组，并经尾静脉静脉内注射18.87x 106个编辑的Tg-TCR细胞。根据实施例1中所述的方法，编辑分离的CD8+ T细胞中的CBLB基因。然后将编辑的Tg-TCR CD8+ T细胞静脉内施用于A375荷瘤小鼠。每周测量体重和肿瘤体积至少两次。将肿瘤体积计算为每个治疗组的平均值和平均值的标准误差(图10)。进行类似的实验，以评估SOCS1编辑的和ANKRD11编辑的T细胞在A375异种移植模型中的抗肿瘤功效。预期这些实验显示编辑的T细胞与对照相比具有增强的抗肿瘤功效。
实施例10：在RAJI异种移植模型中验证单编辑的过继转移的CD19CAR-T细胞
进行实验以评估SOCS1编辑的、ANKRD11编辑的和CBLB编辑的第1代CD19 CAR-T细胞(人)在Raji细胞衍生的异种移植皮下肿瘤模型中的抗肿瘤功效。Raji细胞是已知对用抗PD1抗体的治疗不敏感的人淋巴瘤细胞系。简而言之，向来自Jackson实验室的6-8周龄雌性NSG小鼠皮下注射3x 106个Raji肿瘤细胞。当肿瘤达到约200mm3的体积时，将小鼠随机分成5组，并经尾静脉静脉内注射编辑的人CD19 CART细胞。在注射之前，通过用包含以下的gRNA/Cas9 RNP复合物进行电穿孔来编辑CAR-T细胞：(i)对照gRNA；(ii)单个靶向SOCS1基因的gRNA；(iii)单个靶向ANKRD11基因的gRNA；(iv)或单个靶向CBLB基因的gRNA。每周测量体重和肿瘤体积至少两次。将肿瘤体积计算为每个治疗组的平均值和平均值的标准误差。预期这些实验证明，与对照细胞相比，SOCS1编辑的和ANKRD11编辑的CAR-T细胞具有增强的抗肿瘤功效，如通过随时间推移而增强的肿瘤生长抑制和减小的肿瘤体积所表明的。
实施例11：双重编辑组合的筛选
在逆转录病毒骨架中构建双sgRNA文库。所述文库由两个U6启动子(一个人和一个小鼠启动子)组成，每个启动子驱动单个指导RNA(指导+tracr，sgRNA)的表达。将这些指导物克隆为池，以在这些指导之间提供随机配对，使得每个sgRNA将与每个其他sgRNA配对。将最终的双指导文库转染到Phoenix-Eco 293T细胞中，以生成鼠亲嗜性逆转录病毒。用表达sgRNA的病毒感染表达Cas9的TCR转基因OT1细胞，以编辑由每个sgRNA所靶向的两个基因座。然后将编辑的转基因T细胞转移到携带>400mm3 B16-Ova肿瘤同种异体移植物的小鼠中。两周后，切除肿瘤，并通过消化肿瘤并富集存在于肿瘤中的CD45+细胞来纯化浸润肿瘤的T细胞。使用Qiagen QUIAamp DNA血液试剂盒从CD45+细胞中提取基因组DNA，并使用对应于逆转录病毒骨架序列的引物通过PCR回收逆转录病毒插入片段。然后对所得的PCR产物进行测序，以鉴定转移后两周在肿瘤中存在的sgRNA。将最终分离的细胞群体中的指导物对的表示与初始质粒群体以及注射到小鼠中之前的被感染的转基因T细胞群体进行比较。预期改进T细胞适应性和/或肿瘤浸润的sgRNA对的频率随时间推移而增加，而预期损害适应性的组合随时间推移而减少。下表15显示与体内转移的初始细胞群体中sgRNA频率相比，最终细胞群体中sgRNA频率的中值倍数变化。
表15：组合筛选中的sgRNA频率
实施例12：在RAJI异种移植模型中验证双重编辑的CD19 CAR-T细胞
在组合研究中进一步评估了靶标，以确定在异种移植肿瘤模型中增加T细胞抗肿瘤功效的编辑的基因的组合。本文描述了示例性靶标的评估，然而这些方法可用于评估上述任何潜在靶标。
作为编辑的抗肿瘤功效的组合效果的实例，在第1代CD19 CAR-T细胞中单独或一起编辑了CBLB和BCOR，并使用Raji皮下细胞衍生的异种移植肿瘤模型在小鼠中对其进行了评估。Raji细胞是一种已知对用抗PD1抗体的治疗不敏感的淋巴瘤细胞系。向来自Jackson实验室的6-8周龄雌性NSG小鼠皮下注射3x 106个Raji肿瘤细胞。当肿瘤达到约200mm3的体积时，将小鼠随机分成5组，并经尾静脉静脉内注射编辑的人CD19 CART细胞。在注射之前，用对照指导物或者对CBLB和/或BCOR进行编辑的指导物来编辑过继转移细胞。每周测量体重和肿瘤体积至少两次。将肿瘤体积计算为每个治疗组的平均值和平均值的标准误差。
如图10所示，当与对照指导物相比时，其中靶基因如所示单独或一起编辑的BCOR和CBLB编辑的人CD19 CART细胞的过继转移，在皮下伯基特淋巴瘤Raji小鼠模型中引起抗肿瘤应答。与单独靶标相比或与对照指导物相比，当两个靶标组合编辑时，抗肿瘤功效更大。进行类似的实验以评估Socs1/Ankrd11双编辑T细胞在CD19 CAR-T Raji细胞异种移植模型中的功效。
实施例13：CAR-T中BCOR和CBLB的双编辑在肿瘤存在下导致增强的积累和细胞因子产量
从人CD8 T细胞中产生第1代CD19 CAR-T，并使用以RNP形式与Cas9复合的指导RNA通过电穿孔编辑阴性对照基因、BCOR、CBLB或BCOR和CBLB两者。将CD19 CAR-T与Raji伯基特淋巴瘤细胞以1:0、0.3:1、1:1、3:1和10:1的比例在体外共培养。24小时后，测定CAR-T细胞的总细胞计数，并保存上清液用于细胞因子分析。如图11所示，与对照或CBLB编辑的CART相比，BCOR和BCOR+CBLB编辑的CART表现出高出30％的积累，这表明BCOR的编辑使CAR-T细胞在肿瘤存在下积累的能力增强。此外，与任一对照编辑的CART相比，CBLB和CBLB+BCOR编辑的CART产生10倍或更多的IL-2(图12)和IFNγ(图13)，这表明CBLB的编辑导致CAR-T细胞细胞因子的产量增加，其已知增加总体T细胞适应性和功能能力。CD8 T细胞的IL-2产量的增加是令人惊讶的，因为这些细胞通常不产生IL-2。这些数据证明，在一些情况下，具有增强的效应子功能的CAR-T细胞的产生需要多个基因的编辑。例如，在本实施例中，表现出在肿瘤存在下增强的积累以及增加的IL-2和IFNγ细胞因子的产量的CAR-T细胞的产生需要对BCOR和CBLB基因两者进行编辑。
进行类似的实验，以评估SOCS1/CBLB双重编辑的CAR-T细胞和ANKRD11/CBLB双重编辑的CAR-T细胞对在肿瘤存在下的积累和细胞因子产量的影响。
实施例14：在鼠OT1/B16 OVA同基因肿瘤模型中验证双重编辑的过继转移的T细胞
在组合研究中进一步评估靶标，以确定在同基因肿瘤模型中增加T细胞抗肿瘤功效的编辑的基因的组合。本文描述了示例性靶标的评估，然而这些方法可用于评估上述任何潜在靶标。
使用B16Ova皮下同基因肿瘤模型在小鼠中评估Socs1/Cblb双重编辑的T细胞的抗肿瘤功效。简而言之，向来自Jackson实验室的6-8周龄雌性C57BL/6J小鼠皮下注射0.5x106个B16Ova肿瘤细胞。当整个小鼠队列中的肿瘤达到约485mm3的平均体积时，将小鼠随机分成10组，并经尾静脉静脉内注射编辑的鼠OT1 CD8+ T细胞。在注射之前，通过用包含以下的gRNA/Cas9 RNP复合物进行电穿孔来编辑这些细胞：(i)对照gRNA；(ii)单个靶向PD-1基因(SEQ ID NO:531)的gRNA；(iii)单个靶向Socs1基因(SEQ ID NO:738)的gRNA；或(iv)2个靶向Cblb(SEQ ID NO:310)和Socs1基因的gRNA。使用NGS方法评估，靶向Cblb和Socs1基因的gRNA/Cas9复合物的编辑效率分别为94％和92％。每周测量体重和肿瘤体积至少两次。将肿瘤体积计算为每个治疗组的平均值和平均值的标准误差。根据下式，使用平均肿瘤体积计算肿瘤生长抑制百分比(TGI)：
％TGI＝(TV-靶标最终–TV-靶标初始)/(TV-对照最终-TV-对照初始)*100，
其中TV＝平均肿瘤体积，最终＝T细胞转移后第7天，且初始＝第0天(即T细胞转移那天)。
如图14所示，与PD1单编辑的T细胞或Socs1单编辑的T细胞的转移相比Socs1/Cblb双重编辑的T细胞的转移导致增强的TGI(Socs1/CblbTGI＝77％，而PD1和Socs1单编辑分别为30％和44％)进行类似的实验以评估Ankrd11/Cblb双重编辑的T细胞的抗肿瘤效果。
实施例15：在鼠PMEL/MC38-GP100肿瘤模型中验证双重编辑的过继转移的T细胞
使用MC38gp100皮下同基因肿瘤模型在小鼠中评估Ankrd11/Socs1双重编辑的T细胞的抗肿瘤功效。简而言之，向来自Jackson实验室的6-8周龄雌性C57BL/6J小鼠皮下注射1x 106个MC38gp100肿瘤细胞。当肿瘤达到约100mm3的体积时，将小鼠随机分成10组，并经尾静脉静脉内注射编辑的鼠PMEL CD8+ T细胞。在注射之前，通过用包含以下的gRNA/Cas9RNP复合物进行电穿孔来编辑T细胞：(i)对照gRNA；(ii)单个靶向PD1基因的gRNA；(iii)单个靶向Ankrd11基因的gRNA；(iv)单个靶向Socs1基因的gRNA；或(v)2个靶向Ankrd11和Socs1基因两者的gRNA。每周测量体重和肿瘤体积至少两次。将肿瘤体积计算为每个治疗组的平均值和平均值的标准误差。根据下式，使用平均肿瘤体积计算肿瘤生长抑制百分比(TGI)：
(TV-靶标最终–TV-靶标初始)/(TV-对照最终-TV-对照初始)，
其中TV＝平均肿瘤体积，最终＝T细胞转移后第21天，且初始＝第0天(即T细胞转移那天)
与PD1单编辑的T细胞、Ankrd11单编辑的T细胞或Socs1单编辑的T细胞的转移相比，预期这些实验显示Ankrd11/Socs1双重编辑的T细胞转移后的TGI增强。
实施例16：在鼠B16-F10同基因肿瘤模型中验证双重编辑的过继转移的T细胞
使用患有表现为肺转移的疾病的侵袭性转移性B16-F10同基因肿瘤模型在小鼠中评估Socs1/Ankrd11双重编辑的T细胞的抗肿瘤功效。简而言之，向来自Jackson实验室的6-8周龄雌性C57BL/6J小鼠静脉注射0.5x 106个B16-F10肿瘤细胞。在接种之前，将小鼠称重并使用随机化程序分配到治疗组。在肿瘤接种后第3天，经尾静脉向小鼠静脉内注射编辑的鼠PMEL CD8+ T细胞。在注射之前，通过用包含以下的gRNA/Cas9 RNP复合物进行电穿孔来编辑这些细胞：(i)对照gRNA；(ii)单个靶向Socs1基因的gRNA；(iii)单个靶向Ankrd11基因的gRNA；或(iv)2个靶向Socs1和Ankrd11基因中每一个的gRNA。使用NGS方法评估，靶向Ankrd11和Socs1基因的gRNA/Cas9复合物的编辑效率分别为70％和72％。每周监测体重至少两次。在肿瘤接种后第15天(编辑的PMEL转移后第12天)，将小鼠肺部灌注并用10％对甲醛固定。固定过夜之后，将肺转移到70％EtOH中进一步保存。通过目测评估B16-F10肿瘤负荷来评估肿瘤功效，所述肿瘤负荷可以看作肺上的黑色的癌细胞集落。
在来自未治疗组或用对照编辑的PMEL CD8+ T细胞治疗的小鼠的所有肺部中均观察到大量转移性集落，这表明显著的疾病进展。在用Socs1单编辑的细胞治疗的小鼠中看到了部分功效，而Ankrd11单编辑的细胞表现出最小的功效。对Socs1和Ankrd11的双重编辑产生了与Socs1基因的单编辑类似的抗肿瘤功效。此实验的结果总结在下表16中。
表16：B16-F10肿瘤模型中Ankrd11和Socs1单编辑的和双重编辑的T细胞的功效
| 靶基因 | PD-1抗性-B16F10(肺部) |
| Ankrd11 | - |
| Socs1 | ++ |
| Socs1/Ankrd11 | ++ |
| 对照 | - |
(-)＝未观察到功效；(+)＝在大多数动物中温和应答；(++)＝在大多数动物中强烈应答；(+++)＝在所有接受治疗的动物中强烈应答，包括一些完全应答
根据上述方法，进行类似的实验，以评估Socs1/Cblb双重编辑的T细胞在B16-F10转移模型中的抗肿瘤功效。在注射之前，通过用包含以下的gRNA/Cas9 RNP复合物进行电穿孔来编辑T细胞：(i)对照gRNA；(ii)单个靶向Socs1基因(SEQ ID NO:738)的gRNA；(iii)单个靶向Cblb基因(SEQ ID NO:310)的gRNA；或(iv)2个靶向Socs1和Cblb基因中每一个的gRNA。使用NGS方法评估，靶向Cblb和Socs1基因的gRNA/Cas9复合物的双重编辑效率分别为74％和72％。在来自未治疗组或用对照编辑的PMEL CD8+ T细胞治疗的小鼠的所有肺部中均观察到大量转移性集落，这表明显著的疾病进展。在用Socs1单编辑的细胞治疗的小鼠中看到了部分功效，而Cblb单编辑的细胞表现出最小的功效。然而，用Socs1/Cblb双重编辑的细胞的治疗导致强抗肿瘤功效，伴随对肿瘤形成近乎完全的抑制。此实验的结果总结在下表17中。
表17：B16-F10肿瘤模型中Socs1和Cblb单编辑的和双重编辑的T细胞的功效
| 靶基因 | PD-1抗性-B16F10(肺部) |
| Cblb | + |
| Socs1 | ++ |
| Socs1/Cblb | +++ |
| 对照 | - |
(-)＝未观察到功效；(+)＝在大多数动物中温和应答；(++)＝在大多数动物中强烈应答；(+++)＝在所有接受治疗的动物中强烈应答，包括一些完全应答。
实施例17：PD1/LAG3双重编辑的转基因T细胞在B16-OVA鼠肿瘤模型中的功效
使用B16Ova皮下同基因肿瘤模型在小鼠中评估PD-1/Lag3双重编辑的T细胞的抗肿瘤功效。向来自Jackson实验室的6-8周龄雌性C57BL/6J小鼠皮下注射0.5x 10 6个B16Ova肿瘤细胞。当整个小鼠队列中的肿瘤达到约485mm3的平均体积时，将小鼠随机分成10组，并经尾静脉静脉内注射编辑的小鼠OT1 CD8+ T细胞。在注射之前，通过用包含以下的gRNA/Cas9 RNP复合物进行电穿孔来编辑这些细胞：(1)非靶向对照gRNA；(2)单个靶向PD1基因的gRNA；(3)单个靶向Lag3基因的gRNA；(4)2个gRNA，一个靶向PD1和Lag3基因中的每一个。每周测量体重和肿瘤体积至少两次。将肿瘤体积计算为每个治疗组的平均值和平均值的标准误差。使用下式计算肿瘤生长抑制百分比(TGI)：
％TGI＝(PD1/Lag3 TV最终)–PD1/Lag3 TV初始)/(对照TV最终–对照TV初始)，
其中TV＝平均肿瘤体积，最终＝第10天，且初始＝编码的小鼠OT1CD8+ T细胞转移那天。
图15中的数据显示PD1单编辑的T细胞的过继转移导致TGI为70％，而Lag3单编辑的T细胞的过继转移导致TGI为36％。出人意料的是，PD1和Lag3的组合编辑未导致增强的肿瘤生长抑制，并显示38％的TGI。
实施例18：肿瘤浸润淋巴细胞的过继性T细胞转移的靶标验证
使用B16Ova皮下同基因肿瘤模型在小鼠中评估Socs1、Ankrd11和Cblb单编辑的和双重编辑的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的抗肿瘤功效。此实验中使用了两个小鼠队列：CD45.1Pep Boy小鼠(B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ)的供体队列和CD45.2 C57BL/6J小鼠(Jackson实验室)的受体队列，每个队列包括6-8周龄的雌性小鼠。
为了生成TIL，向供体CD45.1 Pep Boy小鼠(B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ)皮下注射0.5x 106个B16-Ova细胞。在肿瘤细胞接种后的第14天，收获肿瘤以生成编辑的CD45.1肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)以注入到第二小鼠队列中。收获B16-OVA肿瘤(200-600mm3)，切片，并根据制造商的建议，使用GentleMACS系统和小鼠肿瘤解离试剂盒(Miltenyi Biotech目录号130-096-730)将其还原为单细胞悬浮液。经70μm细胞过滤器过滤肿瘤悬浮液，并使用CD4/CD8(TIL)微珠(Miltenyi Biotech目录号130-116-480)富集TIL。将分离的TIL以1.5x 106个细胞/mL在6孔板中的补充有3000U/mL重组人IL-2(Peprotech目录号200-02)的完全mTIL培养基(RPMI+10％热灭活的FBS，20mM HEPES，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，50μMβ-巯基乙醇，1X Glutamax)中培养。在第3天，收获细胞，将其洗涤并重悬于核转染缓冲液T中，并使用Neon转染系统用RNP进行电穿孔。电穿孔后，将TIL在补充有3000U/mL重组人IL-2的完全mTIL培养基中以1.5x 106细胞/mL的在6孔板中培养。在第5天和第7天，将细胞重悬于补充有3000U/mL重组人IL-2的新鲜的完全mTIL培养基中并以1x 106个细胞/mL的密度接种在烧瓶中。在第8天，收获细胞，计数并重悬于PBS中以用于体内注射。
通过用包含以下的gRNA/Cas9 RNP复合物进行电穿孔来编辑这些TIL细胞：(1)非靶向对照gRNA；(2)单个靶向Cblb基因的gRNA；(3)单个靶向Socs1基因的gRNA；(4)单个靶向Ankrd11的gRNA；(5)2个gRNA，一个靶向Cblb和Socs1基因中的每一个；(6)2个gRNA，一个靶向Cblb和Ankrd11基因中的每一个；或(7)2个gRNA，一个靶向Socs1和Ankrd11基因中的每一个。
向受体CD45.2 C57BL/6J小鼠皮下注射0.5x 106个B16-Ova肿瘤细胞。当肿瘤达到约100mm3的体积时，将小鼠随机分成10组，并经尾静脉静脉内注射编辑的CD45.1 TIL。任选地，在T细胞转移之前向小鼠腹膜内注射环磷酰胺(200mg/kg)以诱导淋巴消耗，并且编辑的TIL可以与重组人IL-2(720,000IU/Kg)的腹膜内治疗组合静脉内施用，每天两次，最多4天。
每周测量体重和肿瘤体积至少两次。将肿瘤体积计算为每个治疗组的平均值和平均值的标准误差，并且根据下式计算％TGI：
％TGI＝(TV-靶标最终)–TV-靶标初始)/(TV-对照最终–TV-对照初始)，
其中TV＝平均肿瘤体积，最终＝第17天，且初始＝编码的TIL转移那天。
预期这些结果显示，与对照指导物相比，单编辑的或双重编辑的小鼠TIL的过继性转移导致在B16Ova皮下小鼠模型中的抗肿瘤应答与对照编辑的细胞相比得到增强。
实施例19：工程化的T细胞疗法的靶标的验证
进行实验以验证编辑SOCS1、ANKRD11、BCL2L11、FL11、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3、GNAS和EGR2对CAR T细胞和工程化以表达人工TCR的T细胞的抗肿瘤功效的影响。如实施例1所述编辑工程化的T细胞以降低靶基因的表达。然后使用指定的细胞类型在皮下鼠异种移植模型中评估这些编辑的T细胞。例如，可以如上文实施例8中所述，在Raji细胞模型或表17中所示的任何其他细胞系中评估用CD19特异性CAR或人工TCR工程化的T细胞，用MART1特异性CAR或人工TCR工程化的T细胞可以在SKMEL5、WM2664或IGR1细胞模型等中进行评估。
表17：工程化受体特异性和靶细胞系
简而言之，向来自Jackson实验室的6-8周龄雌性NSG小鼠皮下注射3x106个靶细胞。当肿瘤达到约200mm3的体积时，将小鼠随机分成5组，并经尾静脉静脉内注射编辑的工程化T细胞。在注射之前，用对照指导物或对SOCS1、ANKRD11、BCL2L11、FL11、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3、GNAS和EGR2编辑的指导物对过继性转移的细胞进行编辑。每周测量体重和肿瘤体积至少两次。将肿瘤体积计算为每个治疗组的平均值和平均值的标准误差。预期这些实验的结果显示，SOCS1、ANKRD11、BCL2L11、FL11、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3、GNAS和EGR2编辑的工程化T细胞与对照指导物相比抗肿瘤功效增强，通过存活和或肿瘤大小的减少来测量。
实施例20：受体工程化T功能的靶标编辑的验证
进行实验以验证编辑SOCS1、ANKRD11、BCL2L11、FL11、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3、GNAS和EGR2对工程化T细胞细胞因子产量的影响。简而言之，由人CD8 T细胞生成上表17中描述的工程化T细胞，并且使用以RNP形式与Cas9复合的指导RNA通过电穿孔编辑SOCS1、ANKRD11、BCL2L11、FL11、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3、GNAS、和EGR2中的一种或多种。将CAR-T与表18中所示的对应细胞系以1:0、0.3:1、1:1、3:1和10:1的比例在体外共培养。24小时后，测定工程化T细胞的总细胞计数，并保存上清液用于细胞因子分析。预期这些实验的结果显示，与对照编辑的细胞相比，积累增加并且编辑的CAR T细胞的细胞因子产量的水平提高。
实施例21：双重编辑的肿瘤浸润淋巴细胞的制备
按照先前在FDA批准的用于TIL分离和扩增的临床试验中使用的已建立的方案制备编辑的TIL。去除肿瘤组织之后，将肿瘤切成2mm3碎片，并进行机械/酶均质化，并在6,000IU/mL重组人IL-2中培养长达6周，或直到细胞数达到或超过1x 108个；这被定义为TIL制备的快速扩增前阶段(pre-REP)。完成pre-REP阶段后，在cGMP条件下，将TIL用靶向SOCS1、ANKRD11、BCL2L11、FL11、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3、GNAS或EGR2基因的gRNA/Cas9RNP复合物进行电穿孔。细胞也可以在pre-REP过程之前或期间进行电穿孔。电穿孔之后，将50x 106个细胞以1:100的TIL:辐照的饲养细胞比例转移到1L G-RexTM培养瓶中，持续约2周。制备的这部分被定义为快速扩增阶段(REP)。REP阶段之后，收获TIL，洗涤并悬浮在溶液中，用于立即注入患者体内。
实施例22：编辑的免疫效应细胞的I期研究
进行1期，开放标签，单中心研究，其中用本文所述的修饰的细胞治疗复发性或抗PD-1疗法难治的转移性黑素瘤患者。患者将接受单次细胞输注，并将继续进行研究，直到他们发生疾病进展或疗法不耐受。放射学PD将在终止研究参与之前由当地放射科医生确定。
研究目的：所述研究的主要目的是(1)确定建议用于晚期实体瘤患者的未来研究的最大耐受剂量(MTD)、剂量限制性毒性(DLT)和细胞组合物剂量(以及所需的相关伴随药物)；以及(2)观察患者的转移的编辑细胞的抗癌活性的任何证据。所述研究的次要目的是：(1)确定细胞组合物的药代动力学；(2)评估细胞组合物的在靶活性，如通过生物样品中药效生物标记物的变化所确定；以及(3)评估修饰的细胞的增殖，如通过治疗后工程化的TIL持久性所确定。所述研究的探索性目的是(1)将任何潜在的遗传突变与临床应答相关联。
研究终点：所述研究的主要终点是：不良事件(AE)的发生率和严重程度，根据国家癌症研究所不良事件通用术语标准(NCI CTCAE)版本4.3进行分级；临床实验室异常；12导联心电图(ECG)参数的变化；根据RECIST v1.1的客观应答率(ORR)；CNS反应(具有活跃脑转移的患者，根据RECIST v1.1，ORR和无进展存活[PFS])。此研究的次要终点是：患者报告的症状和与健康相关的生活质量(HRQoL)得分；应答时间；应答持续时间；根据RECIST v1.1的疾病控制率(具有完全应答[CR]、PR或SD的最佳应答的患者的百分比)；治疗时间；免疫表型；遗传工程化的TIL的持久性、运输和功能；给药前和给药后样品中的药效生物标记物。此研究的探索性终点是：在给药前的肿瘤活检和/或外周血中，使用
癌症基因组或类似的替代品评估癌症相关突变和/或遗传改变。
治疗方案：治疗方案的概述如下：
(a)第7天和第6天：环磷酰胺60mg/kg，静脉内
(b)第5天至第1天：氟达拉滨25mg/m2，静脉内
(c)第1天：细胞输注
(d)第1天-第15天：IL-2(125,000IU/kg/天)，最多14次施用
首次施用的细胞剂量不得超过1x 109个细胞的总剂量。如果患者出现剂量限制性毒性(DLT)，将以此剂量水平治疗另外两名患者。如果第一名患者在未发生DLT的情况下完成了DLT监测期(21天)，则随后的患者将以不超过1x1011个TIL的剂量接受治疗。
伴随治疗：在研究期间允许姑息治疗和支持性护理，用于管理研究期间可能发展的症状和潜在的医学病症。
功效评估：肿瘤应答将根据RECIST v1.1由当地放射科医生和/或研究者确定。肿瘤评估将每6周进行一次，直到疾病进展为止；并且对于因疾病进展以外的原因而中断的患者将继续肿瘤评估，直到疾病进展或开始另一种抗癌疗法为止。在最后一名患者入选所述研究后，还将对存活情况进行长达3年的随访。
安全性评估：安全性评估将包括物理和实验室检查、生命体征和ECG。不良事件将根据NCI CTCAE v4.03进行分级。将对研究的每个队列描述不良事件发生率以及总毒性的发生频率(通过毒性等级(严重性)分类)。还将生成实验室测试结果的列表，并且将呈现总结实验室测试随时间推移的变化的描述性统计。
分子遗传学评估：肿瘤生物学中涉及的基因的突变状态将通过对肿瘤组织和血浆样品的分子分析来确定。这些测试的结果将在分析后按照测试程序立即提供给研究者和赞助者。分子分析方法包括但不限于直接测序和/或数字聚合酶链式反应(PCR)。
患者报告的症状和生活质量评估：将通过施用经验证的欧洲癌症研究和治疗组织(EORTC)生活质量问卷(QLQ)-C30(v.3.0)来收集患者报告的症状和HRQoL，所述问卷已经在全球临床研究中进行了广泛的研究。EORTC QLQ-C30将针对5个功能量表(身体、角色、认知、情感和社交功能)评分；3个症状量表(疲劳、疼痛和恶心/呕吐)；以及总体健康状况/QoL量表进行打分。还包括六个单项量表(呼吸困难、失眠、食欲不振、便秘、腹泻和经济困难)。
研究评估：这些研究的评估参数包括剂量施用之前和之后每个奇数周期的第1天的肿瘤放射成像、用于PK分析和药效学分析的血样采集(第1、2、3天，每周x 4，每月x 6)以及细胞因子组分析(第1、2、3天，每周x 4，每月x 6)。
实施例23：用于评估SOCS1编辑的T细胞的测定开发
为了评估SOCS1依赖性药理学，开发了定量SOCS1依赖性生物学的测定。这些测定还旨在用于评估双重编辑的TIL中的靶标依赖性药理学。在这些测定中评估了TIL中靶向SOCS1的sgRNA的活性。
SOCS1是JAK/STAT信号传导的负调控剂。因此，SOCS1依赖性药理学。
SOCS1部分地通过抑制JAK1来负调控T细胞中的细胞因子信号传导，JAK1是一种参与STAT5磷酸化和细胞因子信号转导的激酶。在通过IL-2受体复合物进行IL-2信号传导后，STAT5以JAK1依赖性方式被磷酸化。因此，可以通过IL-2刺激时JAK/STAT信号传导和pSTAT5水平的增加以及下游信号传导途径的活化来测量。实际上，响应于IL-2信号传导，SOCS1的缺失导致原代人CD8 T细胞中pSTAT5水平的增加(图16)。
为了确定SOCS1基因失活对体外细胞功能的影响，可以评估与T细胞功能相关的多个参数。这些包括细胞因子产量(例如，IL-6和IL-12)、基线细胞表面表型和活化细胞表面表型、T细胞分化状态和肿瘤杀伤能力。
实施例24：SOCS1平铺式筛选和验证测定
进行CRISPR-Cas9平铺式筛选，以确定跨越SOCS1基因的靶基因座内的候选抑制剂靶位置。如实施例1中所述分离原代人CD8+ T细胞，并用表达sgRNA的慢病毒文库转导，所述sgRNA被设计成靶向跨SOCS1基因全长上的基因组位置。用慢病毒文库转导后两天，用Cas9mRNA电穿孔转导的CD8+T细胞，并且再培养10天。在用Cas9 mRNA电穿孔后培养10天后，将筛选分为两组：增殖读数和磷酸STAT5读数。进行其他测定以验证在平铺式筛选中鉴定的gRNA。根据以下参数分析104种不同的靶向SOCS1的gRNA。
平铺式筛选
增殖读数：Cas9 mRNA电穿孔后第10天收获细胞。提取DNA，并通过聚合酶链式反应(PCR)扩增跨越文库中各种sgRNA的识别位点的扩增子，并通过下一代测序(NGS)对其进行测序。每种sgRNA的富集或消耗如图17所示，并表示为最终计数除以参考计数的对数比。选择那些引起T细胞的最大富集的sgRNA作为热门用于进一步研究。
用于指导验证的其他测定
开发了其他测定以进一步表征在上述平铺式筛选中鉴定的gRNA的功效和在靶活性。分离细胞并用包含在平铺式筛选中鉴定的SOCS1特异性gRNA的Cas9:gRNA RNP进行电穿孔。将细胞培养约10天，此时进行以下测定。
DNA编辑测定：开发了一种DNA编辑测定，以比较单个指导物在DNA水平上直接编辑其各自靶标的能力(参见例如，Tsai等人2015 Nature Biotechnology)。用Cas9:gRNA RNP电穿孔后，将细胞培养约10天，此时收获沉淀物并提取DNA。使用指导物特异性引物组通过PCR扩增跨越各种sgRNA的基因组靶基因座的扩增子，并通过NGS对其进行测序。将测序读长与预测的指导物切割位点对齐，并确定显示编辑的DNA序列的读长的百分比。将每个脱靶位点的切割百分比计算为与每个Socs1 gRNA的脱靶位点测序读长的数量相比的脱靶位点测序读长的数量。基于两个标准评估结果：1)脱靶编辑的总百分比，以及2)脱靶编辑的基因的同一性。鉴定了具有最低脱靶编辑水平百分比和/或最良性脱靶编辑基因谱的最佳指导物。例如，将基因内区域中的基因编辑视为良性效应，而将已知癌基因或肿瘤抑制基因中的编辑视为不期望的脱靶谱。
蛋白质印迹测定：蛋白质印迹测定用于比较单个指导物降低其各自靶标的蛋白表达的能力。用Cas9:gRNA RNP电穿孔后，将细胞培养约10天，然后收获细胞沉淀物，并将其在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液中裂解。提取的蛋白质通过Bradford测定进行定量，然后使用机器的标准12-230kD Wes分离模块方案将1μg加载到自动化蛋白质印迹仪器(Protein Simple的Wes分离模块)上。使用可商购获得的靶标特异性第一抗体，然后与HRP缀合的第二抗体一起孵育。将每个靶指导物检测到的信号归一化为阴性对照指导物样品中看到的相应信号。
验证结果：基于上述的DNA编辑活性和蛋白质生长测定，鉴定了100个靶向SOCS1的gRNA(SEQ ID NO:1101-1200)作为最佳指导物。在这100个指导物中，鉴定了前40个(SEQ IDNO:1101-1140)、前20个(SEQ ID NO:1101-1120)和前10个(SEQ ID NO:1101-1110)指导物。在这些子集中，将7个靶向SOCS1的指导物鉴定为特定目的候选物(SEQ ID NO:1102、1103、1105-1108、1115)。针对BCOR和TNFAIP3进行了类似的实验，其中将57种BCOR gRNA(SEQ IDNO:708-764)和39种TNFAIP3 gRNA(SEQ ID NO:348-386)鉴定为潜在的最佳指导物。
实施例25：SOCS1 SH2结构域作为SOCS1抑制剂的特异性靶标
进行CRISPR-Cas9平铺式筛选，以确定跨越SOCS1基因的靶基因座内的候选抑制剂靶位置。如实施例2中所述分离原代人CD8+ T细胞，并用表达sgRNA的慢病毒文库转导，所述sgRNA被设计成靶向跨SOCS1基因全长上的基因组位置。用慢病毒文库转导后两天，用Cas9mRNA电穿孔转导的CD8+T细胞，并且再培养14天。用Cas9 mRNA电穿孔后培养14天之后，从细胞中提取DNA，并通过聚合酶链式反应(PCR)扩增跨越文库中各种sgRNA的识别位点的扩增子，并通过下一代测序(NGS)对其进行测序。每种sgRNA的富集如图17所示，并表示为最终计数除以参考计数的对数比。如图所示，随时间推移富集的指导物靶向编码SH2结构域的DNA(SEQ ID NO:1106、1110、1115、1116、1118、1126、1129、1141、1157、1174)。此结果表明，通常靶向SOCS1基因的SOCS1抑制剂，特别是靶向SOCS1基因的SH2结构域的SOCS1抑制剂，增加细胞存活和/或细胞的增殖，所述细胞例如像原代CD8+ T细胞。
实施例27：T细胞活化标记物在编辑的鼠CD8 T细胞中的表达
如实施例1中所述，收获来自雌性PMEL小鼠的脾脏并分离CD8 T细胞。用包含Cas9蛋白的RNP和靶向Ankrd11、Socs1或对照基因的sgRNA电穿孔CD8 T细胞。在多个指导物中，测量的Ankrd11编辑效率为54％，并且测量的Socs1编辑效率为55％-75％。
通过RNA-seq测量Ifng和Gzma的表达。通过Wuxi NextCode从300万个编辑的细胞的沉淀物中提取RNA并进行测序(RNA-seq)。使用Salmon(版本0.11.2，Patro等人,Nat.Methods(2017)和Gencode小鼠基因注释(版本M15)将基因表达水平以TPM量化(Li等人,in Bioinformatics:The Impact of Accurate Quantification on Proteomic andGenetic Analysis and Research(2014))。使用R软件包limma3(版本3.38.0，Ritchie等人,Nucleic Acids Res.(2015))来分析差异表达基因(DEG)。当使用多个指导物抑制一个靶标时，所述分析并入了每个指导物的影响，并且认为仅受所有指导物影响的基因显著差异表达。
这些实验表明，Ankrd11编辑的和Socs1编辑的小鼠PMEL细胞表现出以下的显著增加的表达：Ifng mRNA(Ankrd11编辑de：相对于对照gRNA的2倍，p＝4.7x 10-27；Socs1编辑的：相对控制gRNA的1.8倍，p＝1.4x 10-18)和Gzma mRNA(Ankrd11编辑的：相对于对照gRNA的2.9倍，p＝1.9x 10-141；Socs1编辑的：相对于对照gRNA的1.6倍，p＝2.6x 10-29)。这些数据一起证明，用gRNA抑制Ankrd11和Socs1导致小鼠T细胞的稳健活化。这些数据一起证明，如通过mRNA表达所测量的，Ankrd11编辑和Socs1编辑的PMEL细胞表现出增加的T细胞活化标记物Ifng和Gzma的表达。
实施例28：SOCS1和CBL-B抑制驱动增加的人CD4+和CD8+ T细胞的体外扩增
进行实验以鉴定调控人CD4+和CD8+ T细胞的体外积累的靶标。在第0天，分别从三个独立的人类供体的leukopak中纯化出400x 106个人CD8+ T细胞或800x 106个CD4 T细胞。将T细胞以1x 106个细胞/mL在扩增培养基(ImmunoCult-XF T细胞扩增培养基，StemCellTech编号10981)+10ng/mL人IL2中接种到T-75烧瓶(15mL容积)中，并通过25μL/mL的抗CD3/CD28/CD2T细胞活化剂(ImmunoCult T细胞活化剂，StemCell Technologies,VancouverBC,Canada)活化24小时。在第1天，用表达全基因组范围的PrecisionOne指导物文库的慢病毒转导T细胞。在第4天，通过电穿孔引入Cas9 mRNA。在Cas9的电穿孔之后，将T细胞在具有10ng/mL人IL2的扩增培养基中培养，监测存活力，并每隔一天计数。在第10天，洗涤T细胞，并将其重悬于扩增培养基+10ng/mL人IL2和T细胞活化剂中。在第14天，再次洗涤细胞以去除活化剂，并重悬于扩增培养基+10ng/mL人IL2中。在第20天，从培养物中移出细胞，并从每个样品的50x 106个细胞中收获基因组DNA。通过PCR从100μg基因组DNA中扩增文库指导物序列，并将其在Illumina NextSeq 500仪器上进行测序，文库中每个独特的sgRNA的深度约为500个读长。
如图18所示，与靶向T细胞存活所需的基因的指导物(致死对照)或靶向非T细胞嗅觉基因的指导物(嗅觉)的积累相比，靶向SOCS1基因的指导物导致人CD4+和CD8+ T细胞在早期(第18天)和晚期(第37天)时间点的体外积累都得以增强。
使用靶向SOCS1和CBLB的gRNA以及已知的T细胞功能的调控剂：PPP2R2D、SOCS3和CBL进行类似的实验。如图19所示，靶向SOCS1和CBLB基因导致CD4+和CD8+ T细胞的积累增加。出人意料的是，靶向PPP2R2D、SOCS3和CBL基因不会导致CD4+T细胞的富集，并且靶向SOCS3和CBL基因的指导物在类似条件下不会导致CD8+ T细胞积累的增加(图19)。
实施例29：抑制SOCS1驱动增加的鼠CD8+ T细胞的体外扩增
进行实验以鉴定调控鼠CD8+ T细胞的体外积累的靶标。如实施例1中所述，从Cas9xOT1转基因小鼠脾脏中分离鼠CD8 T细胞并活化。活化后24小时，将T细胞以3x 106个细胞/孔在具有5μg/mL硫酸鱼精蛋白和2ng/mL的重组小鼠IL-2的2mL体积的完全RPMI中接种在涂覆有5μg/mL RetroNectin(Takara Clontech目录号T100B)的6孔板中。将表达sgRNA文库和Thy1.1的慢病毒添加到每个孔中。在室温下将板以600x g旋转1.5小时。感染后24小时，洗涤细胞，并在补充2ng/mL的重组小鼠IL-2的完全T细胞培养基中以1x 10 6个细胞/mL进行培养。在第3天，除去活化珠，并将细胞以1x 106个细胞/mL在补充有重组小鼠IL-2的完全T细胞培养基中进一步培养总共5天。使用EasySep小鼠CD90.1阳性选择试剂盒(StemCell目录号18958)通过阳性选择富集转导的细胞，并从5x 10 6个细胞中收获基因组DNA。通过PCR从100μg基因组DNA中扩增文库指导物序列，并将其在Illumina NextSeq 500仪器上进行测序。
图20中的数据证明，与用致死和嗅觉对照指导物所观察到的积累相比，编辑鼠Socs1基因导致更大的响应于非抗原特异性活化(例如，CD3/CD28+IL-2刺激)的鼠CD8+ T细胞的体外积累。
实施例30：通过单指导物编辑验证SOCS1作为驱动增加的小鼠CD8 T细胞的体外扩增的靶标
如实施例1中所述，收获雌性PMEL小鼠的脾脏，并分离CD8 T细胞。用包含靶向Ankrd11、Socs1、PD1或对照基因的gRNA的gRNA/Cas9 RNP复合物电穿孔CD8 T细胞。将PMELT细胞在体外扩增总共5天。
初始活化后5天，测定培养物中存在的活细胞总数。图21中的数据证明，与靶向对照、Pdcd1和Ankrd11基因的指导物相比，Socs1基因编辑导致更大的CD8+ T细胞的扩增。
实施例31：将SOCS1鉴定为在与肿瘤细胞系共培养期间驱动增加的人CAR-T细胞的扩增的靶标
使用对人CD19具有特异性的CAR-T细胞进行体外筛选。如上文实施例4中所述，将合并的sgRNA文库引入CD19 CAR-T中，并且用Cas9 mRNA电穿孔细胞以生成Cas9编辑的CD19CAR-T的群体。然后将编辑的CD19 CART与表达截短的CD19的DLD-1细胞共培养，DLD-1是经工程化以表达人CD19的跨膜结构域和胞外结构域的粘附性结直肠癌(CRC)细胞系。在第-1天，将编辑的CAR-T解冻，并且在扩增培养基(ImmunoCult-XF，StemCell Tech编号10981)+10ng/mL IL2和1X Pen/Strep中重悬至2x 10 6个细胞/mL，并且在37℃下孵育18小时。平行地，将DLD-1细胞用50μg/mL丝裂霉素(Sigma编号M4287)处理20分钟，洗涤，然后接种过夜。在第0天，将CAR-T以3:1的效应子与靶标比(E:T)添加到接种的DLD-1细胞中。在第3天，将CAR-T洗涤并重悬于扩增培养基中至1x 10 6个细胞/mL。在第6天，将DLD-1细胞如前所述用丝裂霉素处理并接种过夜。在第7天将CAR-T添加到DLD-1细胞，共进行两次共培养孵育。在整个共培养期间的不同时间点收获CAR-T，并将细胞沉淀物冷冻。使用Qiagen DNA提取试剂盒从这些细胞沉淀物中分离基因组DNA(gDNA)，并使用Illumina下一代测序对其进行测序。
分析从CART-T/饲养细胞共培养物中取出的等分试样中每种sgRNA的分布和/或频率，并将其与初始编辑的CAR-T细胞群体中每种sgRNA的分布和/或频率进行比较。对每个单独的sgRNA进行统计分析，以鉴定在肿瘤细胞共培养后在CAR-T细胞群体中显著富集的sgRNA。汇总对于靶向同一基因的单独的gRNA的富集得分，以鉴定对体外CAR-T细胞积累具有一致且可再现作用的靶基因。
此实验的结果证明，靶向SOCS1和CBLB基因的指导物导致体外CAR-T的积累增加(图22)。结果还证明，靶向PPP2R2D、CBL和SOCS3基因(即T细胞增殖的负调控剂)的指导物不驱动CAR-T的体外积累。靶向DGKA和DGKZ基因(其已知是T细胞增殖的负调控剂)的指导物也没有传达增强的积累(数据未示出)。
实施例32：SOCS1的抑制驱动增加的人TIL的体外扩增
从人类患者手术切除肿瘤，并用手术刀刀片将其切成1mm3小块，并将单块肿瘤放入24孔板的每个孔中，产生肿瘤浸润淋巴细胞。将补充有6000U/mL重组人IL-2的2mL完全TIL培养基(RPMI+10％热灭活的人雄性AB血清，1mM丙酮酸，20μg/mL庆大霉素，1Xglutamax)添加到分离的TIL的每个孔中。从孔中取出1mL培养基，并用新鲜培养基和IL-2替换，根据需要每周多达3次。当孔达到汇合时，将它们在新培养基+IL-2中按1:1分开。培养4-5周后，收获细胞用于工程化和快速扩增。
SOCS1和/或CBLB的活性受到多种方法的抑制，包括所述的gRNA/Cas9方法、shRNA、shMIR或者显性负SOCS1或CBLB构建体的表达。然后通过在20mL TIL培养基+20mL Aim-V培养基(Invitrogen)+30ng/mL OKT3 mAb中将500,000个TIL与26x 106个同种异体的辐射的(5000cGy)PBMC饲养细胞共培养来快速扩增TIL。48小时后(第2天)，将6000U/mL IL-2添加到培养物中。在第5天，取出20mL培养基，并添加20mL新鲜培养基(+30ng/ml OKT3)。在第7天，对细胞进行计数，并以60x 106个细胞/L重新接种在G-Rex6M孔板(Wilson Wolf，目录号80660M)或G-Rex100M(Wilson Wolf，目录号81100S)中，这取决于可用细胞数目。在第9天添加6000U/mL新鲜IL-2，并且在第12天添加3000U/mL新鲜IL-2。在第14天收获TIL。然后使用Coolcell冷冻容器(Corning)将扩增的细胞在Cryostor CS-10(Stemcell Technologies目录号07930)中缓慢冷冻，并长期保存在液氮中。预期这些实验显示，将TIL工程化为具有降低的SOCS1和/或CBLB功能导致增加的TIL的体外积累。
实施例33：SOCS1的抑制增加T细胞活化标记物的表面表达
进行实验以评估SOCS1抑制对肿瘤浸润淋巴细胞的表型的影响。如上文实施例32中所述，在高剂量IL-2中由酶消化的黑素瘤肿瘤的细胞悬浮液离体扩增来自三名患者的TIL。将这些TIL冷冻，随后解冻，并再次在高剂量IL-2中过夜。然后将约200,000至500,000个TIL用板结合的人抗CD3抗体(克隆OKT3)刺激48小时。CD3刺激之后，通过以RNP形式与Cas9复合的指导RNA的电穿孔编辑细胞的SOCS或阴性对照基因。如实施例32中所述，使编辑的TIL恢复过夜，然后快速扩增。这是在G-Rex烧瓶中在来自五个同种异体的健康供体的辐射的外周血单核细胞(PBMC)和高剂量IL-2的存在下完成的。每隔一天添加IL-2。第五天更换培养基。将细胞培养14天。在第14天，将细胞用针对CD3、CD8、CD25、CD137和PD1的荧光标记的抗体染色，并通过FACS分析以确定细胞表面标记物的表达。3个供体中有2个的结果在图23中示出。
如图23A和图23B所示，在两个供体中，SOCS1编辑的细胞相对于对照编辑的细胞表现出增加的CD25的表达(在供体1中从15.9％增加至58％并且在供体2中从52.6％增加至75.3％)以及增加的4-1BB的表达(供体1中从1％增加至23.3％并且在供体2中从0增加至14.2％)。通过对来自sgRNA切割位点的PCR扩增子进行NGS测序，评估每个供体中SOCS1基因的编辑效率。供体1的编辑效率为27％，并且供体2的编辑效率为67％。第三供体(未示出)的编辑效率为15％，并且CD25表达的增加不太明显，而4-1BB表达没有增加。SOCS1编辑的TIL中增加的CD25和4-1BB的表达表明，SOCS1的抑制增加了TIL活化和对IL-2的响应。这些结果还表明，SOCS1抑制可能减少或阻止TIL耗竭，因为来自供体1的SOCS1编辑的细胞也表达了较少的PD1，其是已知的TIL耗竭的标记物。
表5A：人基因组坐标
表5B：鼠基因组坐标
表6A：人基因组坐标
表6B：鼠基因组坐标
表6C：人基因组坐标
表6D：鼠基因组坐标
| Socs1 | chr16:10784479-10784498 |
| Socs1 | chr16:10784409-10784428 |
| Socs1 | chr16:10784456-10784475 |
| Socs1 | chr16:10784322-10784341 |
| Socs1 | chr16:10784548-10784567 |
| Socs1 | chr16:10784596-10784615 |
| Socs1 | chr16:10784264-10784283 |
| Socs1 | chr16:10784628-10784647 |
| Socs1 | chr16:10784526-10784545 |
| Socs1 | chr16:10784508-10784527 |
| Socs1 | chr16:10784565-10784584 |
| Socs1 | chr16:10784474-10784493 |
| Socs1 | chr16:10784293-10784312 |
表6E：人基因组坐标
| 靶标 | 坐标 |
| ANKRD11 | chr16:89288541-89288560 |
| ANKRD11 | chr16:89290691-89290710 |
| ANKRD11 | chr16:89288526-89288545 |
| ANKRD11 | chr16:89313561-89313580 |
| ANKRD11 | chr16:89288584-89288603 |
| ANKRD11 | chr16:89288496-89288515 |
| ANKRD11 | chr16:89288665-89288684 |
| ANKRD11 | chr16:89317012-89317031 |
| ANKRD11 | chr16:89291739-89291758 |
| ANKRD11 | chr16:89284853-89284872 |
| ANKRD11 | chr16:89288497-89288516 |
| ANKRD11 | chr16:89288541-89288560 |
| ANKRD11 | chr16:89291754-89291773 |
| ANKRD11 | chr16:89305261-89305280 |
| ANKRD11 | chr16:89286074-89286093 |
表6F：鼠基因组坐标
序列表
<110> KSQ治疗公司
M·本森
J·莫金
G·V·克留科夫
S·M·申克
M·施拉巴赫
N·吐蕃
J·M·卡贝纳二世
<120> 用于改进的免疫疗法的基因调控组合物和方法
<130> KSQT-006/05WO 326818-2024
<150> 62/643,578
<151> 2018-03-15
<150> 62/692,010
<151> 2018-06-29
<150> 62/768,428
<151> 2018-11-16
<150> 62/643,584
<151> 2018-03-15
<150> 62/692,016
<151> 2018-06-29
<150> 62/768,441
<151> 2018-11-16
<150> 62/790,179
<151> 2019-01-09
<150> 62/804,261
<151> 2019-02-12
<150> 62/736,185
<151> 2018-09-25
<150> 62/790,192
<151> 2019-01-09
<160> 1270
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P2A接头序列
<400> 1
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人(Human)
<400> 2
Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人(Human)
<400> 3
Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val
1 5
<210> 4
<211> 310
<212> PRT
<213> 人(Human)
<400> 4
Met Ser Asn Gln Val Leu Cys Cys Val Val Leu Cys Phe Leu Gly Ala
1 5 10 15
Asn Thr Val Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg
20 25 30
Lys Glu Gly Gln Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His
35 40 45
Asp Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu
50 55 60
Ile Tyr Tyr Ser Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala
65 70 75 80
Glu Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr
85 90 95
Val Thr Ser Ala Gln Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Pro Gly Ala Leu Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu
115 120 125
Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val
130 135 140
Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu
145 150 155 160
Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp
165 170 175
Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln
180 185 190
Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser
195 200 205
Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His
210 215 220
Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp
225 230 235 240
Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala
245 250 255
Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly
260 265 270
Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr
275 280 285
Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys
290 295 300
Arg Lys Asp Ser Arg Gly
305 310
<210> 5
<211> 270
<212> PRT
<213> 人(Human)
<400> 5
Met Thr Ser Ile Arg Ala Val Phe Ile Phe Leu Trp Leu Gln Leu Asp
1 5 10 15
Leu Val Asn Gly Glu Asn Val Glu Gln His Pro Ser Thr Leu Ser Val
20 25 30
Gln Glu Gly Asp Ser Ala Val Ile Lys Cys Thr Tyr Ser Asp Ser Ala
35 40 45
Ser Asn Tyr Phe Pro Trp Tyr Lys Gln Glu Leu Gly Lys Arg Pro Gln
50 55 60
Leu Ile Ile Asp Ile Arg Ser Asn Val Gly Glu Lys Lys Asp Gln Arg
65 70 75 80
Ile Ala Val Thr Leu Asn Lys Thr Ala Lys His Phe Ser Leu His Ile
85 90 95
Thr Glu Thr Gln Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ala Thr
100 105 110
Glu Asp Tyr Gln Leu Ile Trp Gly Ala Gly Thr Lys Leu Ile Ile Lys
115 120 125
Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
130 135 140
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
145 150 155 160
Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
165 170 175
Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
180 185 190
Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn
195 200 205
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys
210 215 220
Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn
225 230 235 240
Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val
245 250 255
Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
260 265 270
<210> 6
<211> 602
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DLT TCR
<400> 6
Met Ser Asn Gln Val Leu Cys Cys Val Val Leu Cys Phe Leu Gly Ala
1 5 10 15
Asn Thr Val Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg
20 25 30
Lys Glu Gly Gln Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His
35 40 45
Asp Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu
50 55 60
Ile Tyr Tyr Ser Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala
65 70 75 80
Glu Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr
85 90 95
Val Thr Ser Ala Gln Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Pro Gly Ala Leu Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu
115 120 125
Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val
130 135 140
Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu
145 150 155 160
Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp
165 170 175
Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln
180 185 190
Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser
195 200 205
Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His
210 215 220
Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp
225 230 235 240
Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala
245 250 255
Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly
260 265 270
Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr
275 280 285
Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys
290 295 300
Arg Lys Asp Ser Arg Gly Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu
305 310 315 320
Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Thr Ser Ile
325 330 335
Arg Ala Val Phe Ile Phe Leu Trp Leu Gln Leu Asp Leu Val Asn Gly
340 345 350
Glu Asn Val Glu Gln His Pro Ser Thr Leu Ser Val Gln Glu Gly Asp
355 360 365
Ser Ala Val Ile Lys Cys Thr Tyr Ser Asp Ser Ala Ser Asn Tyr Phe
370 375 380
Pro Trp Tyr Lys Gln Glu Leu Gly Lys Arg Pro Gln Leu Ile Ile Asp
385 390 395 400
Ile Arg Ser Asn Val Gly Glu Lys Lys Asp Gln Arg Ile Ala Val Thr
405 410 415
Leu Asn Lys Thr Ala Lys His Phe Ser Leu His Ile Thr Glu Thr Gln
420 425 430
Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ala Thr Glu Asp Tyr Gln
435 440 445
Leu Ile Trp Gly Ala Gly Thr Lys Leu Ile Ile Lys Pro Asp Ile Gln
450 455 460
Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp
465 470 475 480
Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser
485 490 495
Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp
500 505 510
Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn
515 520 525
Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro
530 535 540
Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu
545 550 555 560
Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu
565 570 575
Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn
580 585 590
Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
595 600
<210> 7
<211> 310
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
Met Ser Asn Gln Val Leu Cys Cys Val Val Leu Cys Phe Leu Gly Ala
1 5 10 15
Asn Thr Val Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg
20 25 30
Lys Glu Gly Gln Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His
35 40 45
Asp Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu
50 55 60
Ile Tyr Tyr Ser Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala
65 70 75 80
Glu Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr
85 90 95
Val Thr Ser Ala Gln Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Pro Gly Ala Leu Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu
115 120 125
Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val
130 135 140
Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu
145 150 155 160
Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp
165 170 175
Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln
180 185 190
Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser
195 200 205
Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His
210 215 220
Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp
225 230 235 240
Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala
245 250 255
Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly
260 265 270
Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr
275 280 285
Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys
290 295 300
Arg Lys Asp Ser Arg Gly
305 310
<210> 8
<211> 270
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 8
Met Thr Ser Ile Arg Ala Val Phe Ile Phe Leu Trp Leu Gln Leu Asp
1 5 10 15
Leu Val Asn Gly Glu Asn Val Glu Gln His Pro Ser Thr Leu Ser Val
20 25 30
Gln Glu Gly Asp Ser Ala Val Ile Lys Cys Thr Tyr Ser Asp Ser Ala
35 40 45
Ser Asn Tyr Phe Pro Trp Tyr Lys Gln Glu Leu Gly Lys Arg Pro Gln
50 55 60
Leu Ile Ile Asp Ile Arg Ser Asn Val Gly Glu Lys Lys Asp Gln Arg
65 70 75 80
Ile Ala Val Thr Leu Asn Lys Thr Ala Lys His Phe Ser Leu His Ile
85 90 95
Thr Glu Thr Gln Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ala Thr
100 105 110
Glu Asp Leu Thr Leu Ile Trp Gly Ala Gly Thr Lys Leu Ile Ile Lys
115 120 125
Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
130 135 140
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
145 150 155 160
Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
165 170 175
Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
180 185 190
Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn
195 200 205
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys
210 215 220
Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn
225 230 235 240
Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val
245 250 255
Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
260 265 270
<210> 9
<211> 602
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 高亲和力DLT TCR
<400> 9
Met Ser Asn Gln Val Leu Cys Cys Val Val Leu Cys Phe Leu Gly Ala
1 5 10 15
Asn Thr Val Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg
20 25 30
Lys Glu Gly Gln Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His
35 40 45
Asp Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu
50 55 60
Ile Tyr Tyr Ser Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala
65 70 75 80
Glu Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr
85 90 95
Val Thr Ser Ala Gln Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Pro Gly Ala Leu Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu
115 120 125
Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val
130 135 140
Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu
145 150 155 160
Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp
165 170 175
Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln
180 185 190
Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser
195 200 205
Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His
210 215 220
Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp
225 230 235 240
Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala
245 250 255
Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly
260 265 270
Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr
275 280 285
Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys
290 295 300
Arg Lys Asp Ser Arg Gly Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu
305 310 315 320
Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Thr Ser Ile
325 330 335
Arg Ala Val Phe Ile Phe Leu Trp Leu Gln Leu Asp Leu Val Asn Gly
340 345 350
Glu Asn Val Glu Gln His Pro Ser Thr Leu Ser Val Gln Glu Gly Asp
355 360 365
Ser Ala Val Ile Lys Cys Thr Tyr Ser Asp Ser Ala Ser Asn Tyr Phe
370 375 380
Pro Trp Tyr Lys Gln Glu Leu Gly Lys Arg Pro Gln Leu Ile Ile Asp
385 390 395 400
Ile Arg Ser Asn Val Gly Glu Lys Lys Asp Gln Arg Ile Ala Val Thr
405 410 415
Leu Asn Lys Thr Ala Lys His Phe Ser Leu His Ile Thr Glu Thr Gln
420 425 430
Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ala Thr Glu Asp Leu Thr
435 440 445
Leu Ile Trp Gly Ala Gly Thr Lys Leu Ile Ile Lys Pro Asp Ile Gln
450 455 460
Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp
465 470 475 480
Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser
485 490 495
Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp
500 505 510
Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn
515 520 525
Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro
530 535 540
Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu
545 550 555 560
Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu
565 570 575
Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn
580 585 590
Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
595 600
<210> 10
<211> 311
<212> PRT
<213> 人(Human)
<400> 10
Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp Ala
1 5 10 15
Gly Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu
20 25 30
Lys Thr Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His
35 40 45
Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu
50 55 60
Ile His Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro
65 70 75 80
Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg
85 90 95
Leu Leu Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Tyr Val Gly Asn Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg
115 120 125
Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala
130 135 140
Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr
145 150 155 160
Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser
165 170 175
Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro
180 185 190
Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu
195 200 205
Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn
210 215 220
His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu
225 230 235 240
Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu
245 250 255
Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln
260 265 270
Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala
275 280 285
Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val
290 295 300
Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly
305 310
<210> 11
<211> 274
<212> PRT
<213> 人(Human)
<400> 11
Met Glu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln Trp
1 5 10 15
Val Ser Ser Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val
20 25 30
Pro Glu Gly Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala
35 40 45
Ile Tyr Asn Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr
50 55 60
Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg
65 70 75 80
Leu Asn Ala Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile
85 90 95
Ala Ala Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Arg
100 105 110
Pro Thr Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Pro Thr Phe Gly Arg Gly Thr Ser
115 120 125
Leu Ile Val His Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln
130 135 140
Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp
145 150 155 160
Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr
165 170 175
Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser
180 185 190
Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn
195 200 205
Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro
210 215 220
Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp
225 230 235 240
Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu
245 250 255
Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp
260 265 270
Ser Ser
<210> 12
<211> 607
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IG4 TCR
<400> 12
Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp Ala
1 5 10 15
Gly Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu
20 25 30
Lys Thr Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His
35 40 45
Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu
50 55 60
Ile His Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro
65 70 75 80
Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg
85 90 95
Leu Leu Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Tyr Val Gly Asn Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg
115 120 125
Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala
130 135 140
Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr
145 150 155 160
Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser
165 170 175
Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro
180 185 190
Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu
195 200 205
Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn
210 215 220
His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu
225 230 235 240
Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu
245 250 255
Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln
260 265 270
Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala
275 280 285
Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val
290 295 300
Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu
305 310 315 320
Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Glu Thr
325 330 335
Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln Trp Val Ser Ser
340 345 350
Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val Pro Glu Gly
355 360 365
Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala Ile Tyr Asn
370 375 380
Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr Ser Leu Leu
385 390 395 400
Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg Leu Asn Ala
405 410 415
Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile Ala Ala Ser
420 425 430
Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Arg Pro Thr Ser
435 440 445
Gly Gly Ser Tyr Ile Pro Thr Phe Gly Arg Gly Thr Ser Leu Ile Val
450 455 460
His Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp
465 470 475 480
Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser
485 490 495
Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp
500 505 510
Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala
515 520 525
Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn
530 535 540
Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
545 550 555 560
Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu
565 570 575
Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys
580 585 590
Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
595 600 605
<210> 13
<211> 311
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 95L TCRb
<400> 13
Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp Ala
1 5 10 15
Gly Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu
20 25 30
Lys Thr Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His
35 40 45
Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu
50 55 60
Ile His Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro
65 70 75 80
Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg
85 90 95
Leu Leu Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Tyr Val Gly Asn Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg
115 120 125
Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala
130 135 140
Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr
145 150 155 160
Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser
165 170 175
Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro
180 185 190
Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu
195 200 205
Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn
210 215 220
His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu
225 230 235 240
Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu
245 250 255
Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln
260 265 270
Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala
275 280 285
Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val
290 295 300
Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly
305 310
<210> 14
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 95L TCRa
<400> 14
Met Glu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln Trp
1 5 10 15
Val Ser Ser Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val
20 25 30
Pro Glu Gly Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala
35 40 45
Ile Tyr Asn Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr
50 55 60
Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg
65 70 75 80
Leu Asn Ala Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile
85 90 95
Ala Ala Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Arg
100 105 110
Pro Leu Tyr Gly Gly Ser Tyr Ile Pro Thr Phe Gly Arg Gly Thr Ser
115 120 125
Leu Ile Val His Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln
130 135 140
Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp
145 150 155 160
Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr
165 170 175
Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser
180 185 190
Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn
195 200 205
Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro
210 215 220
Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp
225 230 235 240
Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu
245 250 255
Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp
260 265 270
Ser Ser
<210> 15
<211> 607
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 95L IG4 TCR
<400> 15
Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp Ala
1 5 10 15
Gly Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu
20 25 30
Lys Thr Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His
35 40 45
Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu
50 55 60
Ile His Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro
65 70 75 80
Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg
85 90 95
Leu Leu Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Tyr Val Gly Asn Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg
115 120 125
Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala
130 135 140
Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr
145 150 155 160
Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser
165 170 175
Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro
180 185 190
Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu
195 200 205
Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn
210 215 220
His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu
225 230 235 240
Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu
245 250 255
Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln
260 265 270
Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala
275 280 285
Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val
290 295 300
Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu
305 310 315 320
Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Glu Thr
325 330 335
Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln Trp Val Ser Ser
340 345 350
Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val Pro Glu Gly
355 360 365
Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala Ile Tyr Asn
370 375 380
Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr Ser Leu Leu
385 390 395 400
Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg Leu Asn Ala
405 410 415
Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile Ala Ala Ser
420 425 430
Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Arg Pro Leu Tyr
435 440 445
Gly Gly Ser Tyr Ile Pro Thr Phe Gly Arg Gly Thr Ser Leu Ile Val
450 455 460
His Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp
465 470 475 480
Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser
485 490 495
Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp
500 505 510
Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala
515 520 525
Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn
530 535 540
Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
545 550 555 560
Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu
565 570 575
Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys
580 585 590
Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
595 600 605
<210> 16
<211> 311
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 16
Met Gly Thr Arg Leu Phe Phe Tyr Val Ala Leu Cys Leu Leu Trp Thr
1 5 10 15
Gly His Met Asp Ala Gly Ile Thr Gln Ser Pro Arg His Lys Val Thr
20 25 30
Glu Thr Gly Thr Pro Val Thr Leu Arg Cys His Gln Thr Glu Asn His
35 40 45
Arg Tyr Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly His Gly Leu Arg Leu
50 55 60
Ile His Tyr Ser Tyr Gly Val Lys Asp Thr Asp Lys Gly Glu Val Ser
65 70 75 80
Asp Gly Tyr Ser Val Ser Arg Ser Lys Thr Glu Asp Phe Leu Leu Thr
85 90 95
Leu Glu Ser Ala Thr Ser Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ile
100 105 110
Ser Glu Val Gly Val Gly Gln Pro Gln His Phe Gly Asp Gly Thr Arg
115 120 125
Leu Ser Ile Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala
130 135 140
Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr
145 150 155 160
Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser
165 170 175
Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro
180 185 190
Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu
195 200 205
Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn
210 215 220
His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu
225 230 235 240
Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu
245 250 255
Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln
260 265 270
Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala
275 280 285
Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val
290 295 300
Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly
305 310
<210> 17
<211> 268
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 17
Met Leu Leu Glu His Leu Leu Ile Ile Leu Trp Met Gln Leu Thr Trp
1 5 10 15
Val Ser Gly Gln Gln Leu Asn Gln Ser Pro Gln Ser Met Phe Ile Gln
20 25 30
Glu Gly Glu Asp Val Ser Met Asn Cys Thr Ser Ser Ser Ile Phe Asn
35 40 45
Thr Trp Leu Trp Tyr Lys Gln Glu Pro Gly Glu Gly Pro Val Leu Leu
50 55 60
Ile Ala Leu Tyr Lys Ala Gly Glu Leu Thr Ser Asn Gly Arg Leu Thr
65 70 75 80
Ala Gln Phe Gly Ile Thr Arg Lys Asp Ser Phe Leu Asn Ile Ser Ala
85 90 95
Ser Ile Pro Ser Asp Val Gly Ile Tyr Phe Cys Ala Gly Gly Thr Gly
100 105 110
Asn Gln Phe Tyr Phe Gly Thr Gly Thr Ser Leu Thr Val Ile Pro Asn
115 120 125
Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser
130 135 140
Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn
145 150 155 160
Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val
165 170 175
Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp
180 185 190
Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile
195 200 205
Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val
210 215 220
Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln
225 230 235 240
Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly
245 250 255
Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
260 265
<210> 18
<211> 601
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DMF4 TCR
<400> 18
Met Gly Thr Arg Leu Phe Phe Tyr Val Ala Leu Cys Leu Leu Trp Thr
1 5 10 15
Gly His Met Asp Ala Gly Ile Thr Gln Ser Pro Arg His Lys Val Thr
20 25 30
Glu Thr Gly Thr Pro Val Thr Leu Arg Cys His Gln Thr Glu Asn His
35 40 45
Arg Tyr Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly His Gly Leu Arg Leu
50 55 60
Ile His Tyr Ser Tyr Gly Val Lys Asp Thr Asp Lys Gly Glu Val Ser
65 70 75 80
Asp Gly Tyr Ser Val Ser Arg Ser Lys Thr Glu Asp Phe Leu Leu Thr
85 90 95
Leu Glu Ser Ala Thr Ser Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ile
100 105 110
Ser Glu Val Gly Val Gly Gln Pro Gln His Phe Gly Asp Gly Thr Arg
115 120 125
Leu Ser Ile Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala
130 135 140
Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr
145 150 155 160
Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser
165 170 175
Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro
180 185 190
Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu
195 200 205
Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn
210 215 220
His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu
225 230 235 240
Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu
245 250 255
Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln
260 265 270
Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala
275 280 285
Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val
290 295 300
Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu
305 310 315 320
Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Leu Leu
325 330 335
Glu His Leu Leu Ile Ile Leu Trp Met Gln Leu Thr Trp Val Ser Gly
340 345 350
Gln Gln Leu Asn Gln Ser Pro Gln Ser Met Phe Ile Gln Glu Gly Glu
355 360 365
Asp Val Ser Met Asn Cys Thr Ser Ser Ser Ile Phe Asn Thr Trp Leu
370 375 380
Trp Tyr Lys Gln Glu Pro Gly Glu Gly Pro Val Leu Leu Ile Ala Leu
385 390 395 400
Tyr Lys Ala Gly Glu Leu Thr Ser Asn Gly Arg Leu Thr Ala Gln Phe
405 410 415
Gly Ile Thr Arg Lys Asp Ser Phe Leu Asn Ile Ser Ala Ser Ile Pro
420 425 430
Ser Asp Val Gly Ile Tyr Phe Cys Ala Gly Gly Thr Gly Asn Gln Phe
435 440 445
Tyr Phe Gly Thr Gly Thr Ser Leu Thr Val Ile Pro Asn Ile Gln Asn
450 455 460
Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys
465 470 475 480
Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln
485 490 495
Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met
500 505 510
Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys
515 520 525
Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu
530 535 540
Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val
545 550 555 560
Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser
565 570 575
Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu
580 585 590
Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
595 600
<210> 19
<211> 310
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 19
Met Arg Ile Arg Leu Leu Cys Cys Val Ala Phe Ser Leu Leu Trp Ala
1 5 10 15
Gly Pro Val Ile Ala Gly Ile Thr Gln Ala Pro Thr Ser Gln Ile Leu
20 25 30
Ala Ala Gly Arg Arg Met Thr Leu Arg Cys Thr Gln Asp Met Arg His
35 40 45
Asn Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Leu Gly Leu Gly Leu Arg Leu
50 55 60
Ile His Tyr Ser Asn Thr Ala Gly Thr Thr Gly Lys Gly Glu Val Pro
65 70 75 80
Asp Gly Tyr Ser Val Ser Arg Ala Asn Thr Asp Asp Phe Pro Leu Thr
85 90 95
Leu Ala Ser Ala Val Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Leu Ser Phe Gly Thr Glu Ala Phe Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu
115 120 125
Thr Val Val Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val
130 135 140
Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu
145 150 155 160
Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp
165 170 175
Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln
180 185 190
Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser
195 200 205
Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His
210 215 220
Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp
225 230 235 240
Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala
245 250 255
Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly
260 265 270
Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr
275 280 285
Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys
290 295 300
Arg Lys Asp Ser Arg Gly
305 310
<210> 20
<211> 272
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 20
Met Lys Ser Leu Arg Val Leu Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu Ser
1 5 10 15
Trp Val Trp Ser Gln Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu
20 25 30
Ser Val Pro Glu Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp
35 40 45
Arg Gly Ser Gln Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser
50 55 60
Pro Glu Leu Ile Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly
65 70 75 80
Arg Phe Thr Ala Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu
85 90 95
Ile Arg Asp Ser Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val
100 105 110
Asn Phe Gly Gly Gly Lys Leu Ile Phe Gly Gln Gly Thr Glu Leu Ser
115 120 125
Val Lys Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg
130 135 140
Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp
145 150 155 160
Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr
165 170 175
Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser
180 185 190
Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe
195 200 205
Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser
210 215 220
Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn
225 230 235 240
Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu
245 250 255
Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
260 265 270
<210> 21
<211> 604
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DMF5 TCR
<400> 21
Met Arg Ile Arg Leu Leu Cys Cys Val Ala Phe Ser Leu Leu Trp Ala
1 5 10 15
Gly Pro Val Ile Ala Gly Ile Thr Gln Ala Pro Thr Ser Gln Ile Leu
20 25 30
Ala Ala Gly Arg Arg Met Thr Leu Arg Cys Thr Gln Asp Met Arg His
35 40 45
Asn Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Leu Gly Leu Gly Leu Arg Leu
50 55 60
Ile His Tyr Ser Asn Thr Ala Gly Thr Thr Gly Lys Gly Glu Val Pro
65 70 75 80
Asp Gly Tyr Ser Val Ser Arg Ala Asn Thr Asp Asp Phe Pro Leu Thr
85 90 95
Leu Ala Ser Ala Val Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Leu Ser Phe Gly Thr Glu Ala Phe Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu
115 120 125
Thr Val Val Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val
130 135 140
Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu
145 150 155 160
Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp
165 170 175
Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln
180 185 190
Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser
195 200 205
Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His
210 215 220
Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp
225 230 235 240
Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala
245 250 255
Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly
260 265 270
Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr
275 280 285
Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys
290 295 300
Arg Lys Asp Ser Arg Gly Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu
305 310 315 320
Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Lys Ser Leu
325 330 335
Arg Val Leu Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu Ser Trp Val Trp Ser
340 345 350
Gln Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu
355 360 365
Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln
370 375 380
Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile
385 390 395 400
Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala
405 410 415
Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser
420 425 430
Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Phe Gly Gly
435 440 445
Gly Lys Leu Ile Phe Gly Gln Gly Thr Glu Leu Ser Val Lys Pro Asn
450 455 460
Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser
465 470 475 480
Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn
485 490 495
Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val
500 505 510
Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp
515 520 525
Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile
530 535 540
Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val
545 550 555 560
Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln
565 570 575
Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly
580 585 590
Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
595 600
<210> 22
<211> 142
<212> PRT
<213> 人(Human)
<400> 22
Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
1 5 10 15
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
20 25 30
Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
35 40 45
Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
50 55 60
Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn
65 70 75 80
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys
85 90 95
Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn
100 105 110
Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val
115 120 125
Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135 140
<210> 23
<211> 142
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> cys修饰的TRAC
<400> 23
Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
1 5 10 15
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
20 25 30
Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
35 40 45
Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
50 55 60
Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn
65 70 75 80
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys
85 90 95
Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn
100 105 110
Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val
115 120 125
Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135 140
<210> 24
<211> 178
<212> PRT
<213> 人(Human)
<400> 24
Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser
1 5 10 15
Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala
20 25 30
Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly
35 40 45
Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu
50 55 60
Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg
65 70 75 80
Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln
85 90 95
Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg
100 105 110
Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala
115 120 125
Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala
130 135 140
Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val
145 150 155 160
Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Ser
165 170 175
Arg Gly
<210> 25
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> cys修饰的TRBC
<400> 25
Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser
1 5 10 15
Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala
20 25 30
Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly
35 40 45
Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu
50 55 60
Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg
65 70 75 80
Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln
85 90 95
Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg
100 105 110
Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala
115 120 125
Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala
130 135 140
Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val
145 150 155 160
Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Ser
165 170 175
Arg Gly
<210> 26
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> KSQ CAR017
<400> 26
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile
20 25 30
Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly
50 55 60
Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser
85 90 95
Ile Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln
100 105 110
Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
115 120 125
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
145 150 155 160
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
165 170 175
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
180 185 190
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr
195 200 205
Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
210 215 220
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
225 230 235 240
Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
275 280 285
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
290 295 300
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
305 310 315 320
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Val Lys Phe
325 330 335
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
340 345 350
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
355 360 365
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
370 375 380
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
385 390 395 400
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
405 410 415
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
420 425 430
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
435 440
<210> 27
<211> 1328
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> KSQ CAR017
<400> 27
atgctcctcc tggttactag cttgcttttg tgcgaactgc cgcatcctgc cttccttctc 60
atcccagata tacttctgac acaatctccg gtaatacttt ccgtctcacc gggggagcga 120
gtgtcatttt catgccgggc gagtcaatcc atcgggacga atattcactg gtatcagcaa 180
aggactaacg gctcaccacg ccttctcatc aagtatgcca gtgagtccat aagtggcatt 240
ccctctagat tctcaggatc aggcagtggc acggacttca cattgtcaat taatagcgta 300
gaaagtgagg acatagcaga ttattattgc caacaaaaca ataactggcc taccacattc 360
ggtgcaggca ccaagcttga gttgaagggg ggtggtggtt ctggaggcgg tgggagcggt 420
ggtggtgggt cacaagtgca gcttaagcaa agcggaccag gtctggtcca acctagccag 480
tcactgtcaa tcacatgtac ggtatccggc tttagtctga caaattatgg cgtccactgg 540
gtaaggcaat cccctggaaa gggcctcgag tggttggggg tgatttggag cggaggaaac 600
accgactata ataccccttt cacctccaga ctgtccataa acaaggacaa ctctaaaagt 660
caggtattct tcaaaatgaa cagtctgcaa agtaatgaca cagcgatata ttattgcgcg 720
agagccctta catactacga ttacgagttc gcttattggg gacaaggaac gttggtgacg 780
gtgtctgcca caaccactcc tgctcccagg ccaccaacac cggcgcctac catagcgtca 840
cagccgctta gtctcaggcc ggaagcgtgt cgccccgcag ccggtggggc ggtccacaca 900
cgcgggctgg atttcgcatg cgatatatac atctgggcac cccttgccgg gacctgcggt 960
gttttgctct tgtctctcgt aatcacgctg tactgtcggg ttaagttttc aagatctgcg 1020
gatgccccgg cataccaaca agggcagaat cagttgtaca acgaactgaa cttgggcaga 1080
cgcgaggagt atgatgtctt ggacaagagg cgggggcgcg acccggaaat gggtggcaaa 1140
ccacggcgca agaacccaca agaggggctt tacaacgaat tgcagaaaga caagatggcc 1200
gaggcataca gcgagattgg catgaaagga gagaggagga ggggaaaggg gcatgatggc 1260
ctttatcagg gcctttctac tgccaccaag gacacatacg acgcactgca catgcaggca 1320
ttgccacc 1328
<210> 28
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> KSQ CAR1909
<400> 28
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly
50 55 60
Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln
100 105 110
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
145 150 155 160
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
165 170 175
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
180 185 190
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
195 200 205
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
210 215 220
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
225 230 235 240
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
245 250 255
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
260 265 270
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
275 280 285
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
290 295 300
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
305 310 315 320
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Leu Arg Val
325 330 335
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
340 345 350
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
355 360 365
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
370 375 380
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
385 390 395 400
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
405 410 415
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
420 425 430
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
435 440 445
<210> 29
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> KSQ CAR1909
<400> 29
atgctccttc ttgtgacgtc actcctgctt tgtgagctgc cgcacccggc ctttctgctc 60
atacccgaca tacaaatgac acagacgaca agttcccttt ccgcctcctt gggcgaccga 120
gtgacaatca gttgccgagc ttcccaggac atatctaaat atttgaattg gtatcagcaa 180
aagccagatg gtacggttaa acttcttatc taccacacct ccaggctcca ttctggggtt 240
ccgagccgat tctctggatc tggctcaggg accgattatt ctttgactat ttccaatttg 300
gagcaggaag acatcgcaac ctatttctgc caacaaggaa atacgctgcc atacaccttc 360
ggcgggggca ccaaactcga gattactggg ggtgggggga gtggaggagg gggttccggt 420
ggaggtgggt cagaagtcaa gctgcaagag agtgggcccg ggttggttgc tcctagccaa 480
tccttgagtg taacatgcac cgttagcgga gtttcacttc ctgactacgg tgttagctgg 540
ataagacagc ccccgaggaa gggtctggaa tggctggggg tcatttgggg cagtgagacg 600
acatattaca acagtgcctt gaaatccagg cttacgatca taaaagacaa tagtaaaagc 660
caagtgttcc tcaagatgaa ctctcttcag accgacgaca cagccatcta ctattgcgca 720
aaacattatt attatggagg tagttacgct atggactatt ggggccaggg gacttcagtg 780
acggtgagta gtaccacgac tccggcaccg agaccaccaa caccagcccc aacaattgcc 840
tcacagccct tgagccttag acccgaggcc tgtaggcccg ccgcaggagg ggcagttcat 900
acgcgaggat tggactttgc atgtgacatc tatatctggg cgccacttgc gggaacttgc 960
ggtgtccttt tgctctcatt ggtcattacc ctctattgtt tgagagtaaa attttcccgc 1020
tccgctgatg cgcctgcata ccagcaaggt cagaaccaac tctacaatga gcttaacctc 1080
ggtagaagag aggaatatga cgtcttggat aagaggagag gccgagaccc agaaatgggg 1140
ggaaagccgc gccgcaagaa tccacaagaa ggtctttaca atgaactgca gaaggacaaa 1200
atggccgaag cgtatagcga gataggaatg aaaggcgaac ggagacgggg caaggggcat 1260
gacgggcttt accaaggact tagcacagcg acgaaggata catacgacgc actgcatatg 1320
caagcgctgc caccgcgc 1338
<210> 30
<211> 496
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> KSQ CAR010
<400> 30
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Gly Ala Thr Gly Gly Ala Thr Thr Thr Thr Cys
20 25 30
Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Ala Thr Thr Thr Thr Cys Ala Gly
35 40 45
Cys Thr Thr Cys Cys Thr Gly Cys Thr Ala Ala Thr Cys Ala Gly Thr
50 55 60
Gly Cys Cys Thr Cys Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
65 70 75 80
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
85 90 95
Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
100 105 110
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val
115 120 125
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
130 135 140
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
145 150 155 160
His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
165 170 175
Lys Arg Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu
180 185 190
Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
195 200 205
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys
210 215 220
Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
225 230 235 240
Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp
245 250 255
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr
260 265 270
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
275 280 285
Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Val Trp
290 295 300
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro
305 310 315 320
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
325 330 335
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
340 345 350
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
355 360 365
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Leu
370 375 380
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
385 390 395 400
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
405 410 415
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
420 425 430
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
435 440 445
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
450 455 460
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
465 470 475 480
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490 495
<210> 31
<211> 1488
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> KSQ CAR010
<400> 31
atggactttc aggtgcagat cttctcattc ctccttatca gtgcgagtgt aattatgtca 60
agaggtgcta caggcggtgc taccacgacg acatgcgcag ggggtaccgg ttgtgcagga 120
gcgaccacga ctacctgcgc aggttgtacc acctgttgta ctggatgtac tgctgcgaca 180
tgtgcgggga cgggttgttg cacttgtgcg gacatacaaa tgacgcaaag cccgtccagc 240
ctgtctgcat cagttgggga tagagtgacg attacatgta gagcaagcca ggatgttaac 300
accgccgtag cgtggtacca acaaaaacca ggtaaagccc cgaagctgct catatactcc 360
gccagctttc tgtattcagg cgttcccagt cggttcagcg gcagcagatc agggacggat 420
tttacgctca ctatctcttc ccttcagcct gaagattttg ctacctatta ttgtcagcag 480
cattacacga ctcccccaac ttttggtcag gggactaaag ttgaaatcaa acgaacgggc 540
tccacctcag gtagcggtaa gccaggcagc ggagaagggt ctgaagtcca gttggttgag 600
agtggaggcg gtcttgtgca acccggtggc agcttgcgac tgagctgtgc agcgtctggc 660
ttcaacataa aagatactta tattcattgg gtaagacagg ctcctggtaa agggctggaa 720
tgggtggcac gaatatatcc gactaacggt tataccagat acgccgattc tgttaagggc 780
aggttcacaa taagcgccga cacaagtaag aatacggcgt atctgcagat gaattcactt 840
cgagctgaag acacagcggt atactactgc tccaggtggg gtggggatgg tttttatgcg 900
atggacgttt ggggtcaagg aacactggta actgttagtt ctaccacgac acctgctcct 960
aggcccccca caccggcacc tacgatcgct tcccagccgc ttagcctccg cccggaggca 1020
tgccggcccg ctgcgggggg agcggtacat actcgcgggt tggacttcgc ttgcgacatc 1080
tacatttggg caccactggc aggcacatgt ggcgttctgt tgcttagtct ggttattaca 1140
ctgtattgcc tgcgagttaa attctcccgc agcgctgatg cgcccgccta tcagcaaggt 1200
caaaaccagc tgtataatga gcttaatttg ggacgccgag aagagtatga cgtccttgac 1260
aagaggcgcg ggcgcgatcc ggagatgggt ggtaaaccgc gccggaaaaa cccccaggaa 1320
ggcctttaca atgagctcca aaaagataaa atggcagagg catactctga aataggaatg 1380
aagggcgaga gacgccgggg taagggacac gatggccttt atcaagggct tagtacagcc 1440
acgaaggata cgtatgacgc tctgcacatg caggctcttc ccccgaga 1488
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 32
ccacctccag ttgttgcatt 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 33
tgctgcttca aagggaggta 20
<210> 34
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> tracrRNA
<400> 34
gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60
ggcaccgagt cggtgctttt ttt 83
<210> 35
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> tracrRNA
<400> 35
gggcttcatg ccgaaatcaa caccctgtca ttttatggca gggtgttttc gttatttaat 60
ttttt 65
<210> 36
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> tracrRNA
<400> 36
aaatcaacac cctgtcattt tatggcaggg tgttttttt 39
<210> 37
<211> 170
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> tracrRNA
<400> 37
gtattaagta ttgttttatg gctgataaat ttctttgaat ttctccttga ttatttgtta 60
taaaagttat aaaataatct tgttggaacc attcaaaaca gcatagcaag ttaaaataag 120
gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttt 170
<210> 38
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> tracrRNA
<400> 38
gttggaacca ttcaaaacag catagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga 60
aaaagtggca ccgagtcggt gcttttttt 89
<210> 39
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> tracrRNA
<400> 39
aaaacagcat agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg 60
agtcggtgct tttttt 76
<210> 40
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> tracrRNA
<400> 40
gtttaagagc tatgctggaa acagcatagc aagtttaaat aaggctagtc cgttatcaac 60
ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttt 93
<210> 41
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CBLB shRNA
<400> 41
gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac agtgagcgat cagtgagaat gagtacttta 60
tagtgaagcc acagatgtat aaagtactca ttctcactga gtgcctactg cctcggactt 120
caaggggcta gaattcgagc a 141
<210> 42
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CBLB shRNA
<400> 42
gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac agtgagcgaa ggtgaaaatg tcaaaactaa 60
tagtgaagcc acagatgtat tagttttgac attttcacct gtgcctactg cctcggactt 120
caaggggcta gaattcgagc a 141
<210> 43
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CBLB shRNA
<400> 43
gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac agtgagcgcc cagaaattca ccacagaaaa 60
tagtgaagcc acagatgtat tttctgtggt gaatttctgg ttgcctactg cctcggactt 120
caaggggcta gaattcgagc a 141
<210> 44
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CBLB shRNA
<400> 44
gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac agtgagcgac cagaactgta gacaccaaaa 60
tagtgaagcc acagatgtat tttggtgtct acagttctgg ctgcctactg cctcggactt 120
caaggggcta gaattcgagc a 141
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CBLB shRNA
<400> 45
gtcaattcca gggagataac t 21
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CBLB shRNA
<400> 46
gcctggaagc aatggctcta a 21
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CBLB shRNA
<400> 47
gcaccaaacc cggaagctat a 21
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CBLB shRNA
<400> 48
gttgcactcg attgggacag t 21
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CBLB shRNA
<400> 49
ggattatgtg aacctacacc t 21
<210> 50
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CBLB shRNA
<400> 50
ggaatcacag cgagttcaaa t 21
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CBLB shRNA
<400> 51
gcaaggcata gtctcattga a 21
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CBLB shRNA
<400> 52
ggtgaagaga gccttagaga t 21
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CBLB shRNA
<400> 53
gtgaagagag ccttagagat a 21
<210> 54
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CBLB siRNA
<400> 54
aggagcuaag gucuuuucca aug 23
<210> 55
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CBLB siRNA
<400> 55
augucgaugc aaaaauugca aaa 23
<210> 56
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CBLB siRNA
<400> 56
gucacaugcu ggcagaaauc aaa 23
<210> 57
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CBLB siRNA
<400> 57
uccagguuac auggcauuuc uca 23
<210> 58
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CBLB siRNA
<400> 58
uugaacuuug aaccugugaa aug 23
<210> 59
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CBLB siRNA
<400> 59
uccacaucaa cagcuaaauc auu 23
<210> 60
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CBLB siRNA
<400> 60
augcuggcag aaaucaaagc aau 23
<210> 61
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CBLB siRNA
<400> 61
ugcagagaau gacaaagaug uca 23
<210> 62
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CBLB siRNA
<400> 62
ggcagaacuc accagucaca uca 23
<210> 63
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CBLB siRNA
<400> 63
ucgguccugu gauaaugguc acu 23
<210> 64
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CBLB siRNA
<400> 64
aggagcuaag gucuuuucca aug 23
<210> 65
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CBLB siRNA
<400> 65
augucgaugc aaaaauugca aaa 23
<210> 66
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CBLB siRNA
<400> 66
gucacaugcu ggcagaaauc aaa 23
<210> 67
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CBLB siRNA
<400> 67
uccagguuac auggcauuuc uca 23
<210> 68
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CBLB siRNA
<400> 68
uugaacuuug aaccugugaa aug 23
<210> 69
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CBLB siRNA
<400> 69
uccacaucaa cagcuaaauc auu 23
<210> 70
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CBLB siRNA
<400> 70
augcuggcag aaaucaaagc aau 23
<210> 71
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CBLB siRNA
<400> 71
ugcagagaau gacaaagaug uca 23
<210> 72
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CBLB siRNA
<400> 72
ggcagaacuc accagucaca uca 23
<210> 73
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CBLB siRNA
<400> 73
ucgguccugu gauaaugguc acu 23
<210> 74
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TNFAIP3 shRNA
<400> 74
agacacacgc aactttaaa 19
<210> 75
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TNFAIP3 shRNA
<400> 75
cagacacacg caactttaa 19
<210> 76
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TNFAIP3 shRNA
<400> 76
acacacgcaa ctttaaatt 19
<210> 77
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TNFAIP3 shRNA
<400> 77
acgaatgctt tcagttcaa 19
<210> 78
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TNFAIP3 shRNA
<400> 78
atactcggaa ctggaatga 19
<210> 79
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TNFAIP3 shRNA
<400> 79
gaagcttgtg gcgctgaaa 19
<210> 80
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TNFAIP3 shRNA
<400> 80
aaagccggct gcgtgtattt t 21
<210> 81
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TNFAIP3 shRNA
<400> 81
aaagggagct ctagtccttt t 21
<210> 82
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TNFAIP3 shRNA
<400> 82
aagggagctc tagtcctttt t 21
<210> 83
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TNFAIP3 shRNA
<400> 83
aagccctcat cgacagaaac a 21
<210> 84
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TNFAIP3 shRNA
<400> 84
aaacgaacgg tgacggcaat t 21
<210> 85
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TNFAIP3 shRNA
<400> 85
aaacagacac acgcaacttt a 21
<210> 86
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TNFAIP3 shRNA
<400> 86
aacagacaca cgcaacttta a 21
<210> 87
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TNFAIP3 shRNA
<400> 87
aatgtgcagc acaacggatt t 21
<210> 88
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TNFAIP3 shRNA
<400> 88
aaaagccggc tgcgtgtatt t 21
<210> 89
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TNFAIP3 shRNA
<400> 89
aaactcaacc agctgccttt t 21
<210> 90
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TNFAIP3 shRNA
<400> 90
aaactcaacc agctgccttt 20
<210> 91
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TNFAIP3 shRNA
<400> 91
aagtccttcc tcaggctttg t 21
<210> 92
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TNFAIP3 shRNA
<400> 92
aaagccagaa gaaactcaac t 21
<210> 93
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TNFAIP3 shRNA
<400> 93
aatccgagct gttccacttg t 21
<210> 94
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TNFAIP3 shRNA
<400> 94
aaggctggga ccatggcaca a 21
<210> 95
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TNFAIP3 shRNA
<400> 95
aatgccgcaa agttggatga a 21
<210> 96
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TNFAIP3 siRNA
<400> 96
uccucaguuu cgggagauca ucc 23
<210> 97
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TNFAIP3 siRNA
<400> 97
gagucucuca aaucucagga auu 23
<210> 98
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TNFAIP3 siRNA
<400> 98
agcucuaguc cuuuuugugu aau 23
<210> 99
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TNFAIP3 siRNA
<400> 99
cacuggaaau guucagaacu ugc 23
<210> 100
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TNFAIP3 siRNA
<400> 100
augaugaaug ggacaaucuu auc 23
<210> 101
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TNFAIP3 siRNA
<400> 101
cacacugugu uucaucgagu aca 23
<210> 102
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TNFAIP3 siRNA
<400> 102
gcagaaccau ccauggacug uga 23
<210> 103
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TNFAIP3 siRNA
<400> 103
aaagaugugg ccuuuuguga ugg 23
<210> 104
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TNFAIP3 siRNA
<400> 104
uucagaacuu gccaguuuug ucc 23
<210> 105
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TNFAIP3 siRNA
<400> 105
augagacugg caauggucac agg 23
<210> 106
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PDCD1 shRNA
<400> 106
ggccaggatg gttcttagac t 21
<210> 107
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PDCD1 shRNA
<400> 107
ggatttccag tggcgagaga a 21
<210> 108
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PDCD1 siRNA
<400> 108
gccuguguuc ucuguggacu aug 23
<210> 109
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PDCD1 siRNA
<400> 109
ggugcugcua gucugggucc ugg 23
<210> 110
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PDCD1 siRNA
<400> 110
gacagagaga agggcagaag ugc 23
<210> 111
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PDCD1 siRNA
<400> 111
cagcuucucc aacacaucgg aga 23
<210> 112
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PDCD1 siRNA
<400> 112
ccgugucaca caacugccca acg 23
<210> 113
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PDCD1 siRNA
<400> 113
uaugccacca uugucuuucc uag 23
<210> 114
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PDCD1 siRNA
<400> 114
ugcuaaacug guaccgcaug agc 23
<210> 115
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PDCD1 siRNA
<400> 115
gugacagaga gaagggcaga agu 23
<210> 116
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PDCD1 siRNA
<400> 116
cugaggaugg acacugcucu ugg 23
<210> 117
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PDCD1 siRNA
<400> 117
aucggagagc uucgugcuaa acu 23
<210> 118
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PDCD1 siRNA
<400> 118
gccuguguuc ucuguggacu aug 23
<210> 119
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PDCD1 siRNA
<400> 119
ggugcugcua gucugggucc ugg 23
<210> 120
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PDCD1 siRNA
<400> 120
gacagagaga agggcagaag ugc 23
<210> 121
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PDCD1 siRNA
<400> 121
cagcuucucc aacacaucgg aga 23
<210> 122
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PDCD1 siRNA
<400> 122
ccgugucaca caacugccca acg 23
<210> 123
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PDCD1 siRNA
<400> 123
uaugccacca uugucuuucc uag 23
<210> 124
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PDCD1 siRNA
<400> 124
ugcuaaacug guaccgcaug agc 23
<210> 125
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PDCD1 siRNA
<400> 125
gugacagaga gaagggcaga agu 23
<210> 126
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PDCD1 siRNA
<400> 126
cugaggaugg acacugcucu ugg 23
<210> 127
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PDCD1 siRNA
<400> 127
aucggagagc uucgugcuaa acu 23
<210> 128
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CTLA4 shRNA
<400> 128
ggcaacggaa cccagattta t 21
<210> 129
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CTLA4 shRNA
<400> 129
ggaacccaaa ttacgtgtac t 21
<210> 130
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CTLA4 shRNA
<400> 130
gaacccaaat tacgtgtact a 21
<210> 131
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CTLA4 shRNA
<400> 131
gggagaagac tatattgtac a 21
<210> 132
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CTLA4 shRNA
<400> 132
gacgtttata gccgaaatga t 21
<210> 133
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CTLA4 shRNA
<400> 133
gacactaata caccaggtag a 21
<210> 134
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CTLA4 siRNA
<400> 134
accucacuau ccaaggacug agg 23
<210> 135
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CTLA4 siRNA
<400> 135
augaguugac cuuccuagau gau 23
<210> 136
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CTLA4 siRNA
<400> 136
ggggaaugag uugaccuucc uag 23
<210> 137
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CTLA4 siRNA
<400> 137
cucuggaucc uugcagcagu uag 23
<210> 138
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CTLA4 siRNA
<400> 138
cuccucugga uccuugcagc agu 23
<210> 139
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CTLA4 siRNA
<400> 139
uuugugugug aguaugcauc ucc 23
<210> 140
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CTLA4 siRNA
<400> 140
caccuccagu ggaaaucaag uga 23
<210> 141
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CTLA4 siRNA
<400> 141
cacgggacuc uacaucugca agg 23
<210> 142
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CTLA4 siRNA
<400> 142
uucugacuuc cuccucugga ucc 23
<210> 143
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CTLA4 siRNA
<400> 143
aagucugugc ggcaaccuac aug 23
<210> 144
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CTLA4 siRNA
<400> 144
accucacuau ccaaggacug agg 23
<210> 145
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CTLA4 siRNA
<400> 145
augaguugac cuuccuagau gau 23
<210> 146
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CTLA4 siRNA
<400> 146
ggggaaugag uugaccuucc uag 23
<210> 147
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CTLA4 siRNA
<400> 147
cucuggaucc uugcagcagu uag 23
<210> 148
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CTLA4 siRNA
<400> 148
cuccucugga uccuugcagc agu 23
<210> 149
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CTLA4 siRNA
<400> 149
uuugugugug aguaugcauc ucc 23
<210> 150
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CTLA4 siRNA
<400> 150
caccuccagu ggaaaucaag uga 23
<210> 151
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CTLA4 siRNA
<400> 151
cacgggacuc uacaucugca agg 23
<210> 152
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CTLA4 siRNA
<400> 152
uucugacuuc cuccucugga ucc 23
<210> 153
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CTLA4 siRNA
<400> 153
aagucugugc ggcaaccuac aug 23
<210> 154
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 154
gccgcaggag gttgcctttc 20
<210> 155
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 155
tccaagagtg atcgaggcat 20
<210> 156
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 156
agtgcagctt gatgtgccgc 20
<210> 157
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 157
cggtgagggc gtccctccgg 20
<210> 158
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 158
ggccacctga ggacgcactc 20
<210> 159
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 159
gttgcaaaga tggcatttga 20
<210> 160
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 160
cctttccagt gcaaccagtg 20
<210> 161
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 161
caactatgcc tgccgccgga 20
<210> 162
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 162
gttggtaaac ctcacaaatg 20
<210> 163
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 163
cgtgatccag gaagagcacc 20
<210> 164
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 164
tctggagtat cgcttacagg 20
<210> 165
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 165
ggaagccgtg gcagcccatg 20
<210> 166
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 166
gcgtgcctgt gaaatgaatg 20
<210> 167
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 167
cgcgtgcggg gcgatgtggt 20
<210> 168
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 168
tgagcccatg ccgatccccg 20
<210> 169
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 169
ctcttaccaa gaaatttctg 20
<210> 170
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 170
catatggggc tgatgacttt 20
<210> 171
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 171
ggggcctcat tcacccagaa 20
<210> 172
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 172
gcctcgggag agaaaatgaa 20
<210> 173
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 173
cgcgcagcag gtcgtaggcg 20
<210> 174
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 174
tctctgatcc tatcttgcac 20
<210> 175
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 175
ggacaggccc ttgtcccctg 20
<210> 176
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 176
ccgcgtggtc agcaccagcg 20
<210> 177
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 177
aagatttggg aattattgca 20
<210> 178
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 178
cttccagtgc aatcagtgcg 20
<210> 179
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 179
cctcacaaat gtggatattg 20
<210> 180
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 180
cctcgaaagt ctcggagctc 20
<210> 181
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 181
ctgcgtcaag actgctacac 20
<210> 182
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 182
tgctcacagg caagatgtag 20
<210> 183
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 183
ccggacagcc ctccaccttg 20
<210> 184
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 184
agacctacca ttgtagttgg 20
<210> 185
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 185
ccaagtgctc cacgatggcc 20
<210> 186
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 186
agcctctatc cacggctacc 20
<210> 187
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 187
gccccaggta agctggtagg 20
<210> 188
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 188
gcaagcagcg cacctgctgc 20
<210> 189
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 189
tcaagactgc tacactggcc 20
<210> 190
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 190
gcaggttgtt ctggaagttg 20
<210> 191
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 191
gggtgctgat gtcaacgctc 20
<210> 192
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 192
ccacgatggc caggtagccg 20
<210> 193
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 193
tggtcagcgg cttctcttcg 20
<210> 194
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 194
aatgtggggc tgatgtcaac 20
<210> 195
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 195
atttcaacaa gagcgaaacc 20
<210> 196
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 196
cacctgacca atgacttcca 20
<210> 197
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 197
gccctggaag cagcagctca 20
<210> 198
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 198
gctcacaggc aagatgtaga 20
<210> 199
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 199
cgtccgcgcc atgttccagg 20
<210> 200
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 200
tggtttcagg agccctgtaa 20
<210> 201
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 201
acccggatac agcagcagct 20
<210> 202
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 202
ttccagggct ccgagccgcg 20
<210> 203
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 203
ctgaaggcta ccaactacaa 20
<210> 204
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 204
gggtatttcc tcgaaagtct 20
<210> 205
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 205
gagccgcagg aggtgccgcg 20
<210> 206
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 206
ctgagtcagg actcccacgc 20
<210> 207
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 207
cacttacgag tccccgtcct 20
<210> 208
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 208
ctcaaattcc ttttggtttc 20
<210> 209
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 209
ggttggtgat cacagccaag 20
<210> 210
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 210
gcaggttgtt ctggaagttg 20
<210> 211
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 211
cacaggtcat tgatatctta 20
<210> 212
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 212
catggtgcaa ctcctgctgc 20
<210> 213
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 213
gtgaacgctc agatgtattc 20
<210> 214
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 214
atacatctga gcgttcacgt 20
<210> 215
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 215
gtgcgcagcg gggctgacag 20
<210> 216
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 216
tcacaatgac acacctctca 20
<210> 217
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 217
tagacgtcca taacaacctg 20
<210> 218
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 218
acgatccagg gccatggggc 20
<210> 219
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 219
gctggaccgc catggccaga 20
<210> 220
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 220
gttcactgcc acgtgcaggg 20
<210> 221
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 221
gctggtcaac ctcttccagc 20
<210> 222
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 222
acaaggcccg cagcgccgcg 20
<210> 223
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 223
caggcctctc catattgctg 20
<210> 224
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 224
gccacccgtg cagatgagga 20
<210> 225
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 225
tcgacatcta caacaaccta 20
<210> 226
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 226
atgtggtgat cacagccagg 20
<210> 227
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 227
gcgcttgcgg agcggcagcg 20
<210> 228
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 228
acaggtcatc gacatcctga 20
<210> 229
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 229
gaccgagcct cacctgccgt 20
<210> 230
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 230
ataccccatg atgtgcccca 20
<210> 231
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 231
gtgaacgcgc aaatgtactc 20
<210> 232
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 232
ttttctatct catgaggttt 20
<210> 233
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 233
aggcatccca ttgcgggcct 20
<210> 234
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 234
tcggcccgag taagtgctat 20
<210> 235
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 235
gcgatcctcg tggttgctgt 20
<210> 236
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 236
ttctttgttg atcactttga 20
<210> 237
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 237
ttcttccaaa ccagcaagtg 20
<210> 238
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 238
gacagatgct cacttcaaca 20
<210> 239
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 239
tgatgttcac catccacatg 20
<210> 240
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 240
catagtccag gaagaggacg 20
<210> 241
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 241
gataactgga accatctccg 20
<210> 242
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 242
caagcagaga agttcccttg 20
<210> 243
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 243
aaagacctga tgttacctgc 20
<210> 244
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 244
ttcggcgcca agatagctga 20
<210> 245
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 245
gctcatacag acccgcatga 20
<210> 246
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 246
agtgatcaac aaggaagggg 20
<210> 247
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 247
acccgggctg agatgtcaaa 20
<210> 248
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 248
tgtgattctg gcgttcttca 20
<210> 249
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 249
ggtcagtgaa gccgacacca 20
<210> 250
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 250
cttgcagtct tatgccgaga 20
<210> 251
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 251
atgccccaca ctgattacac 20
<210> 252
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 252
attccagtgt aatcagtgtg 20
<210> 253
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 253
aagttccctt gaggagcaca 20
<210> 254
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 254
ggacagatta gcaagcaatg 20
<210> 255
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 255
cttcccaaca ggtctcttga 20
<210> 256
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 256
agcagtctct tcacaactgg 20
<210> 257
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 257
tcacagtcat catgaactca 20
<210> 258
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 258
caactctctg atagtggtaa 20
<210> 259
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 259
aatcggcaat atataacatg 20
<210> 260
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 260
agcacttgct ctgaaatttg 20
<210> 261
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 261
ctaaatgtgt taccatacca 20
<210> 262
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 262
attattgaat ccatacctgg 20
<210> 263
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 263
agaatgggca ggaagaaaag 20
<210> 264
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 264
aaggtcggtt tggagaagtt 20
<210> 265
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 265
attgttcttt gaacaagcag 20
<210> 266
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 266
tggccttggt cctgtggagc 20
<210> 267
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 267
acaacatcag ggtctggatc 20
<210> 268
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 268
atttatgata tgacaacatc 20
<210> 269
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 269
tttatagcag cagacaacaa 20
<210> 270
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 270
gcaatgcaga cgaagcagac 20
<210> 271
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 271
agtttggcga ggcaaatggc 20
<210> 272
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 272
gagctggcag ctgtcattgc 20
<210> 273
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 273
tctgataaat ctctgcctct 20
<210> 274
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 274
gaatagatac actgttactg 20
<210> 275
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 275
gttacgccat gaaaatatcc 20
<210> 276
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 276
gtcagctggc cttggtcctg 20
<210> 277
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 277
aatgctttct tgtaacacaa 20
<210> 278
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 278
gatatgacaa catcagggtc 20
<210> 279
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 279
tggcagaaac actgtaacgc 20
<210> 280
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 280
attgttctct gaacaagcaa 20
<210> 281
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 281
catacaaacg gcctatctcg 20
<210> 282
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 282
gagatgcaga cgaagcacac 20
<210> 283
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 283
attgtgttac aagaaagcat 20
<210> 284
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 284
agaacgttcg tggttccgtg 20
<210> 285
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 285
gtttggagag gaaagtggcg 20
<210> 286
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 286
atttatgata tgacaacgtc 20
<210> 287
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 287
gttgtgtata actttgtctg 20
<210> 288
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 288
gtgcaccctc ttcaaaaact 20
<210> 289
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 289
gaccccaagc tcacctacca 20
<210> 290
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 290
ttctcccaag tgtgtcatga 20
<210> 291
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 291
ttccagagtg aagccgtggt 20
<210> 292
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 292
acggccacgc agacttcatg 20
<210> 293
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 293
ttcatgcggc ttctcacaga 20
<210> 294
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 294
ggacttctgg ttgtcgcaag 20
<210> 295
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 295
catgagcaac tgcagcatca 20
<210> 296
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 296
ccagaggccc ccttaccaca 20
<210> 297
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 297
caacaacagg tcgggactgc 20
<210> 298
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 298
cagcttggcc ttgtagacct 20
<210> 299
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 299
catgacacac ttgggagaag 20
<210> 300
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 300
gttcttgtcg ttcttcctcc 20
<210> 301
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 301
gctggacacg ctggtgggga 20
<210> 302
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 302
ccagaataaa gtcatggtag 20
<210> 303
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 303
cacatgaaga aagtctcacc 20
<210> 304
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 304
ttgagctgga caccctggtg 20
<210> 305
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 305
gcttctgctg ccggttaacg 20
<210> 306
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 306
gaacatactc cagttcctga 20
<210> 307
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 307
gggcagtcct attacagctg 20
<210> 308
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 308
ttctccaaag tgcattatga 20
<210> 309
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 309
tggatgacct ggctaacagt 20
<210> 310
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 310
cctgggaaac cggcaagacg 20
<210> 311
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 311
gaagccacag gaagtctgtg 20
<210> 312
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 312
acagatatgg caactcccag 20
<210> 313
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 313
gcagaagctg agttcaacct 20
<210> 314
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 314
tcatctgccc cagctgtaat 20
<210> 315
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 315
ggggaaaggt cgctttgctg 20
<210> 316
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 316
gcaggatttc tggttgtcac 20
<210> 317
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 317
ccagctcctc tgccttctgc 20
<210> 318
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 318
cagccagatc ccgctgttcc 20
<210> 319
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 319
ggccctcgag ttcaacaggt 20
<210> 320
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 320
gtgaagagct ggctgtggtc 20
<210> 321
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 321
ggccaagctg gacaagggcc 20
<210> 322
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 322
ccaggagaat gaagccctga 20
<210> 323
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 323
tgctggcctc acctgcagga 20
<210> 324
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 324
ccagagggtg ctggcaagaa 20
<210> 325
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 325
gatccagcgg ctcaacaagg 20
<210> 326
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 326
ccaaaaggtc aagtacctgc 20
<210> 327
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 327
acttaacctt cctctctgga 20
<210> 328
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 328
gcagcttcgg aaggagaacg 20
<210> 329
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 329
cacgcgcctc acctgcagaa 20
<210> 330
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 330
gaaggcagag gagctagtga 20
<210> 331
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 331
cctcacttaa ccttcctctc 20
<210> 332
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 332
tgtgcacctt ggatgccagt 20
<210> 333
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 333
ctcaggagag cgttaccatg 20
<210> 334
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 334
cgagaagaag gtgaagatgc 20
<210> 335
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 335
tatacctgtg agctcagcca 20
<210> 336
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 336
ccaggtgaag atcttcgagg 20
<210> 337
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 337
cttcacccac ctgggccgca 20
<210> 338
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 338
gccgggaatt ctccttcact 20
<210> 339
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 339
cccgcagaga tgttctgggt 20
<210> 340
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 340
aaaagagcaa gccttaccat 20
<210> 341
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 341
tgctgcagag ggccttcctc 20
<210> 342
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 342
ctccttctgt cctcaggtga 20
<210> 343
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 343
tacagatatc ccatcgtcct 20
<210> 344
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 344
tgcagcttgt cagtacatgt 20
<210> 345
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 345
tctccttaag ggtgctgcag 20
<210> 346
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 346
agtgatcaca agcaggggcc 20
<210> 347
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 347
cactttcaaa ggagcaaaat 20
<210> 348
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 348
ctcctcaggg ttccacgcca 20
<210> 349
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 349
gccccacatg tactgagaag 20
<210> 350
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 350
cttaccaaaa gaaatcaatc 20
<210> 351
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 351
acactgaatg tgcagcacaa 20
<210> 352
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 352
aagtcagtcc cacagcgtcc 20
<210> 353
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 353
actccaagcc gggccctgag 20
<210> 354
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 354
gctcttaaaa gagtacttaa 20
<210> 355
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 355
atggcaggaa aacagcgagc 20
<210> 356
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 356
gaagtgccaa gcctgcctcc 20
<210> 357
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 357
gacaccagtt gagtttcttc 20
<210> 358
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 358
gaggcaggct tggcacttcc 20
<210> 359
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 359
tcgggccatg ggtgtgtctg 20
<210> 360
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 360
tcacctgaaa tgacaatgat 20
<210> 361
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 361
ccgcattccc tccccaggca 20
<210> 362
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 362
ggccccccag tggactcctc 20
<210> 363
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 363
gtgatagaaa tccccgtcca 20
<210> 364
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 364
ttctggaacc tggacgctgt 20
<210> 365
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 365
agttgtactg aagtccactt 20
<210> 366
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 366
cacacaaggc acttggatcc 20
<210> 367
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 367
agaacaccat tccgtgcctg 20
<210> 368
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 368
catggcgctc ggggcctctc 20
<210> 369
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 369
gccccccagt ggactcctca 20
<210> 370
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 370
gctgtcggtg gggccgaatg 20
<210> 371
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 371
caagtgcctt gtgtggtctg 20
<210> 372
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 372
gccacttctc agtacatgtg 20
<210> 373
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 373
tacagatacc ccattgttct 20
<210> 374
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 374
tagaaatccc cgtccaaggc 20
<210> 375
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 375
aaagccggct gcgtgtattt 20
<210> 376
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 376
tggtctcact gaacagaaaa 20
<210> 377
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 377
tggtgaccct gaaggacagt 20
<210> 378
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 378
agagaaagct ggggcacgga 20
<210> 379
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 379
cgtgccccag ctttctctca 20
<210> 380
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 380
tatgccatga gtgctcagag 20
<210> 381
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 381
agggctgggt gctgtcggtg 20
<210> 382
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 382
ccatgccagg gagcccctca 20
<210> 383
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 383
gagtttcttc tggctttcca 20
<210> 384
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 384
gctgtcatag ccgagaacaa 20
<210> 385
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 385
gggagaagcc tatgagccct 20
<210> 386
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 386
ggggtatctg tagcattcct 20
<210> 387
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 387
tggatgatct cccgaaactg 20
<210> 388
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 388
cttgtggcgc tgaaaacgaa 20
<210> 389
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 389
actgagaagt ggcatgcatg 20
<210> 390
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 390
tgaacatttc cagtgtgtat 20
<210> 391
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 391
ttgctcaaat acaaagcctg 20
<210> 392
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 392
tgagagactc cagttgccag 20
<210> 393
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 393
gcatgagtac aagaaatggc 20
<210> 394
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 394
gaggcaattg ccgtcacctg 20
<210> 395
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 395
ctgtccttca gggtcaccaa 20
<210> 396
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 396
cagaaacatc caggccaccc 20
<210> 397
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 397
gtattcagct taaaaaattc 20
<210> 398
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 398
atccatgcat gcctgccgga 20
<210> 399
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 399
aatataccag acactgcaac 20
<210> 400
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 400
tgtcttgcag ataacaatta 20
<210> 401
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 401
ttgggtgtgt attccaaccg 20
<210> 402
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 402
tttagaaagt gattcaaaag 20
<210> 403
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 403
agtaaaagaa ttacagcaaa 20
<210> 404
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 404
actacagcaa gggaaacagc 20
<210> 405
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 405
ttgctttcta tactacagca 20
<210> 406
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 406
gcagtccttt gctccatgaa 20
<210> 407
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 407
gcagagaata cgtgaacaac 20
<210> 408
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 408
taacatgaac ataccttgag 20
<210> 409
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 409
cctgaaatca ctttatcttg 20
<210> 410
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 410
ataaagcgta tgaagccttc 20
<210> 411
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 411
gtattccaac cgcggtaaga 20
<210> 412
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 412
ccgggccccc agcaggtctg 20
<210> 413
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 413
cctacttagg cactgccagg 20
<210> 414
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 414
gcttacccag cggatgagcg 20
<210> 415
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 415
cttctctgga gcctccagga 20
<210> 416
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 416
tccactgacc tgtccttcct 20
<210> 417
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 417
acccaggcat catccgacaa 20
<210> 418
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 418
catggggttc aaggaagaag 20
<210> 419
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 419
aaaccatcct gccacctgga 20
<210> 420
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 420
tcatggctgg gctctccagg 20
<210> 421
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 421
cagggccgag atcttcgagg 20
<210> 422
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 422
agagtgatga agagtgtgac 20
<210> 423
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 423
tcacatttca gtttaccatt 20
<210> 424
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 424
gctgatgcag tctcatatga 20
<210> 425
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 425
tgacattctg gagatagttg 20
<210> 426
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 426
cactttgact atggaaacag 20
<210> 427
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 427
aagctccaca ctggttacag 20
<210> 428
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 428
tagctacgcc tgtagaagaa 20
<210> 429
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 429
gctgtcatag agaagctcac 20
<210> 430
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 430
ttactgcttg tcatgtgact 20
<210> 431
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 431
aatcacctac cttggagctg 20
<210> 432
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 432
gtaactttat gtgtctcaga 20
<210> 433
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 433
cctcacaagt gcaactactg 20
<210> 434
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 434
tccttacaat cttccatagg 20
<210> 435
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 435
ggaggaatcc ggcttccgaa 20
<210> 436
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 436
acaatgagct ttcacccgaa 20
<210> 437
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 437
acttaccaga atgggtcctg 20
<210> 438
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 438
gccatctcgc cgccacagtg 20
<210> 439
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 439
gggctctatc acaaaatgaa 20
<210> 440
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 440
cccctgacta tgaagaagga 20
<210> 441
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 441
acctgtgctg gaccgggcct 20
<210> 442
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 442
gtagacggag aggggccccg 20
<210> 443
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 443
aagcttgtag tagagcccac 20
<210> 444
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 444
ctggaggagg aatgccaatg 20
<210> 445
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 445
cagccactcc tacatggacg 20
<210> 446
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 446
gaaggggctg agattccagg 20
<210> 447
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 447
ggagctgtac tcgggcacgt 20
<210> 448
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 448
gctttgccgc cgtccagcca 20
<210> 449
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 449
aggcccggtc cagcacaggt 20
<210> 450
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 450
gaggtggcgc ttacctgtgc 20
<210> 451
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 451
gctagacatc ttccggtttc 20
<210> 452
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 452
ggaagctcag tatccgctga 20
<210> 453
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 453
tgtctgggtg ctgaccgttg 20
<210> 454
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 454
aaggcatcca gacccgaaac 20
<210> 455
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 455
caaggtggac tcaccgtggt 20
<210> 456
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 456
agcccacagg cattgcagac 20
<210> 457
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 457
cccctgacta tgaagaaaga 20
<210> 458
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 458
agtccatatg gaacccacgg 20
<210> 459
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 459
agtctgagtg caaattgggc 20
<210> 460
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 460
tacgaattgc accggaccag 20
<210> 461
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 461
ttagaggctt gaggaaaccg 20
<210> 462
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 462
ttagaaccta tgaagctctg 20
<210> 463
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 463
cctgaataaa ctccaccgca 20
<210> 464
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 464
aattcgaaag cccatcagtt 20
<210> 465
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 465
tggccacaac ccaaactgat 20
<210> 466
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 466
cagcatactc tgaggtacga 20
<210> 467
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 467
ttacctctag cactgctgag 20
<210> 468
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 468
tatgcagtcc attattgaca 20
<210> 469
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 469
gtaacacagc ttattccgcg 20
<210> 470
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 470
actttcccta gcaatgcagg 20
<210> 471
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 471
caaatgggca agccttacgg 20
<210> 472
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 472
ctcaatgtcc gtattgatag 20
<210> 473
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 473
agtctgagtg caaattgggc 20
<210> 474
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 474
ccagatagtg caaattgcta 20
<210> 475
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 475
tgatagtggt ctggtcaaat 20
<210> 476
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 476
aattcgaaag cccatcagtt 20
<210> 477
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 477
gcccattact ttgtgtagtg 20
<210> 478
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 478
tggccacagc ccaaactgat 20
<210> 479
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 479
gcattcatac ttgctttcca 20
<210> 480
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 480
ttagatgcag aggaatcact 20
<210> 481
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 481
atggtgaaat gtccaaatga 20
<210> 482
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 482
ttggttgcca tgaaaaggta 20
<210> 483
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 483
tcatttatgg aggagatcca 20
<210> 484
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 484
tgttacagcg ctacaggagc 20
<210> 485
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 485
ctaaactgtg aaaacagctg 20
<210> 486
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 486
aggcgtattg taccctggaa 20
<210> 487
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 487
acgtgagatt ctttctctga 20
<210> 488
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 488
ccagtcacac atgagaatgt 20
<210> 489
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 489
gaagcagtgc aaacgccatg 20
<210> 490
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 490
acattctgaa ggattgtcca 20
<210> 491
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 491
agttgacaat gaaatactgc 20
<210> 492
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 492
aatatcatct gtgaatactg 20
<210> 493
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 493
taaaggctgt ttgcaaaaga 20
<210> 494
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 494
tgcaaacacc atgtggccac 20
<210> 495
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 495
gcgagagatt ctttccctga 20
<210> 496
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 496
atcctcatca gagaacaggt 20
<210> 497
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 497
acggtaaagt gcccaaataa 20
<210> 498
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 498
ttaaactgtg agaacagctg 20
<210> 499
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 499
tctttgttgc aggagtctga 20
<210> 500
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 500
caggggcttg ttatgaggta 20
<210> 501
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 501
ctgattgatg gtagcaggga 20
<210> 502
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 502
ccttatcttc agtcacatgc 20
<210> 503
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 503
tcacatgctg gcagaaatca 20
<210> 504
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 504
ttctgtcgct gtgagataaa 20
<210> 505
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 505
acaaggcagt acctgccacg 20
<210> 506
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 506
tgtgactcac ccgggataca 20
<210> 507
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 507
gaggtccatc agatcagctc 20
<210> 508
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 508
atctccctgg aactggccat 20
<210> 509
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 509
tgcaaaaatt gcaaaactca 20
<210> 510
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 510
tgcacagaac tattgtacca 20
<210> 511
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 511
cagattagtg cttaccttcc 20
<210> 512
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 512
attccgtaaa atagagcccc 20
<210> 513
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 513
ctgcactcgg ctgggacaat 20
<210> 514
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 514
ccttatgaaa aagtcaaaac 20
<210> 515
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 515
aaaatatcaa gtatatatgg 20
<210> 516
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 516
tctagcatcg gcatgccaaa 20
<210> 517
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 517
ttggaagctc atggacaaag 20
<210> 518
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 518
gatttcctcc tcgaccacca 20
<210> 519
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 519
cttcatctct tggatcaaag 20
<210> 520
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 520
aatgtatgaa gaacagtcac 20
<210> 521
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 521
taaacttacc tgaaacagcc 20
<210> 522
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 522
aagaatatga tgttcctccc 20
<210> 523
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 523
agcaagctgc cgcagatcgc 20
<210> 524
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 524
agtactcatt ctcactgagt 20
<210> 525
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 525
gatgaccaga gactatctgt 20
<210> 526
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 526
cctaaacagt gccattatga 20
<210> 527
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 527
ctatctgtcg gtgaaggtct 20
<210> 528
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 528
gaatatatac aagttattgg 20
<210> 529
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 529
tggggtgcca ggctgtgtgg 20
<210> 530
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 530
catgtttcct tgcagaataa 20
<210> 531
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 531
aagttcgagt gctgctggaa 20
<210> 532
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 532
catcaagcca gctaatatgg 20
<210> 533
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 533
aaatgagcag cattctgttg 20
<210> 534
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 534
cttcttgcaa caggagacaa 20
<210> 535
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 535
tggaacggtt cggataggta 20
<210> 536
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 536
catcaagcct gctaacatgg 20
<210> 537
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 537
ggcgtggaga ggagagctcg 20
<210> 538
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 538
atgatcacta tttactgaaa 20
<210> 539
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 539
tcgtctacag cagtagcaaa 20
<210> 540
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 540
cagagactac ctgtcggtga 20
<210> 541
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 541
gtgcttctcg caggtcaagg 20
<210> 542
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 542
tggcggctca gcatgatctg 20
<210> 543
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 543
caacccacat ttcgatttgg 20
<210> 544
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 544
agccattcac acttctcact 20
<210> 545
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 545
ccggctgtca cttaccgctg 20
<210> 546
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 546
tttgtttcac agtcgttcga 20
<210> 547
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 547
tggtaagaat gagggtaacc 20
<210> 548
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 548
gctgcggaaa gcgcccgcca 20
<210> 549
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 549
gttgatcatg attctctggt 20
<210> 550
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 550
ttgttgcaga caaatgtggc 20
<210> 551
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 551
ctatgaccgg ctggagatct 20
<210> 552
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 552
cacatgtccg gctctcatgt 20
<210> 553
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 553
gaggtgtcat cattcagggt 20
<210> 554
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 554
ccagggtacc tcacatctcc 20
<210> 555
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 555
aaacctgtat cctgggaaac 20
<210> 556
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 556
agaccagttg gtgctatact 20
<210> 557
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 557
agtggagtga taaagtcccc 20
<210> 558
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 558
gaccggctag aaatctggga 20
<210> 559
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 559
cctcacattg ggcgttactg 20
<210> 560
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 560
ggatgttctg tcgctacgac 20
<210> 561
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 561
cctgactcaa atcctccagg 20
<210> 562
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 562
agagaatgcc cgatgaggat 20
<210> 563
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 563
tacctgtatc cactctcggt 20
<210> 564
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 564
tgtcctccaa atcgaagtga 20
<210> 565
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 565
cattctcagg gtagttcagg 20
<210> 566
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 566
tactgtggac agaaaacacc 20
<210> 567
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 567
gccctttagc tggtatctgc 20
<210> 568
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 568
atcagaactg ctatccacat 20
<210> 569
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 569
catggcagag acacagacac 20
<210> 570
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 570
cgaggagaac gtatatgaag 20
<210> 571
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 571
aatgtgactc tggatgacca 20
<210> 572
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 572
ggaaaatatc tacaccatcg 20
<210> 573
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 573
gtagtagttg cagcagcagc 20
<210> 574
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 574
ttggagtggg agtctctgct 20
<210> 575
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 575
tccttacttt atagggtcat 20
<210> 576
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 576
caacttgcct ccaggagggt 20
<210> 577
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 577
atgtgactct ggatgaccat 20
<210> 578
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 578
ggggcaaggg attctgtcct 20
<210> 579
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 579
actgctatcc acattggagt 20
<210> 580
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 580
aaccatttct ctccgtggtt 20
<210> 581
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 581
agtgtaactg cagggcagat 20
<210> 582
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 582
agaagtggaa tacagagcgg 20
<210> 583
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 583
atcagaatag gcatctacat 20
<210> 584
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 584
ggtgtagaag cagggcagat 20
<210> 585
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 585
aacctcgtgc ccgtctgctg 20
<210> 586
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 586
aagagaagat acagaattta 20
<210> 587
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 587
atgtgactct agcagacagt 20
<210> 588
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 588
tctacacccc agccgcccca 20
<210> 589
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 589
acatccagat actggctaaa 20
<210> 590
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 590
tgtgtttgaa tgtggcaacg 20
<210> 591
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 591
agtcacattc tctatggtca 20
<210> 592
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 592
agtcggtgca ggggtgacct 20
<210> 593
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 593
tggccaaaga gatgaggctg 20
<210> 594
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 594
actcctgggg gcaaatgaca 20
<210> 595
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 595
tgaagccatc tctgtaggtg 20
<210> 596
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 596
ggctgaagga gcagttcaaa 20
<210> 597
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 597
tgccactctt tccagccacg 20
<210> 598
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 598
aagtcagccc cctggactct 20
<210> 599
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 599
acagtgattg ctagtccctc 20
<210> 600
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 600
agccccaggt cccagagtcc 20
<210> 601
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 601
ctgtgggtct ggcacaggct 20
<210> 602
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 602
gccaagtgga ctcctcctgg 20
<210> 603
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 603
gtaggtgagg acacagcccc 20
<210> 604
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 604
tgcacagaga ctgggcggtc 20
<210> 605
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 605
acgtacaacc tcaaggttct 20
<210> 606
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 606
gctcaatgcc actgtcacgt 20
<210> 607
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 607
agtctctgtg cactggttcc 20
<210> 608
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 608
tgggcggtca ggacggctga 20
<210> 609
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 609
gttccggaac caatgcacag 20
<210> 610
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 610
tgcgaagagc aggggtcact 20
<210> 611
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 611
gcggtccctg aggtgcaccg 20
<210> 612
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 612
tccccacacc agcaggcagg 20
<210> 613
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 613
ccgctacacg gtgctgagcg 20
<210> 614
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 614
ccggtggtgt gggcccagga 20
<210> 615
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 615
gtttggggtg catacctgtc 20
<210> 616
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 616
aggctctgag agatcctggg 20
<210> 617
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 617
gctcaatgcc actgtcacat 20
<210> 618
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 618
gtcccggagg cctgcgcagc 20
<210> 619
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 619
gcagaaggct gagatcctgg 20
<210> 620
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 620
taggtgagga tgcagcccca 20
<210> 621
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 621
ttcagtgatc gggtggtccc 20
<210> 622
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 622
gtctctgaca atgaatgaca 20
<210> 623
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 623
ctgagctttc ttggaccttc 20
<210> 624
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 624
aacatctctg cagaggaagg 20
<210> 625
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 625
caaggggaga atattcctga 20
<210> 626
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 626
cactataaat ggccagaagc 20
<210> 627
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 627
caggcacgat agatacaaag 20
<210> 628
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 628
gtatcctggt gggatttaca 20
<210> 629
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 629
aggcagcctg tatcagcccc 20
<210> 630
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 630
gctgctcctg gtctgggtcc 20
<210> 631
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 631
tctctaggct tctgtagctc 20
<210> 632
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 632
ctgaagcgac atgccacccc 20
<210> 633
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 633
tctctgacaa tgaatgacac 20
<210> 634
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 634
ccatttatag tgttgacctg 20
<210> 635
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 635
tgccttcctc gctacaggta 20
<210> 636
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 636
ttccacagaa tggattctga 20
<210> 637
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 637
gctgaccgtg aacgatacag 20
<210> 638
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 638
cccatccttc aaggatcgag 20
<210> 639
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 639
caccacggca caagtgaccc 20
<210> 640
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 640
atgtcacctc tcctccacca 20
<210> 641
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 641
agtgtacgtc ccatcagggt 20
<210> 642
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 642
gttcacggtc agcgactgga 20
<210> 643
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 643
gcagatgacc accagcgtcg 20
<210> 644
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 644
aacatttctg cagagaaagg 20
<210> 645
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 645
ctgctgctcc cagttgacct 20
<210> 646
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 646
aggccacatc tgcttcctgt 20
<210> 647
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 647
ggtggtcgcg ttgactagaa 20
<210> 648
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 648
aagaagtcct cttacaacag 20
<210> 649
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 649
tccaagacaa gccatggctg 20
<210> 650
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 650
tgctccttct tcttcataaa 20
<210> 651
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 651
acaaaaggcc aagtcctaga 20
<210> 652
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 652
tgaaattgct tttcacattc 20
<210> 653
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 653
cacacaacac tgatgaggtc 20
<210> 654
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 654
gtggtgttgg ctagcagcca 20
<210> 655
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 655
cccatgccca caaagtatgg 20
<210> 656
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 656
aggtccgggt gactgtgctg 20
<210> 657
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 657
aggactgaga gctgttgaca 20
<210> 658
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 658
tgaatattca catggaaagc 20
<210> 659
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 659
attaaaggta ccactgcaga 20
<210> 660
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 660
cacgggactg tacctctgca 20
<210> 661
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 661
acatgagttc caccttgcag 20
<210> 662
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 662
ctagattacc ccttctgcag 20
<210> 663
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 663
gacccaacct tcagtggtgt 20
<210> 664
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 664
ctcaactgca gctgccttct 20
<210> 665
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 665
ccaagacaag ccatggctgg 20
<210> 666
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 666
aaaagaagtc ctcttacaac 20
<210> 667
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 667
gatgaaaaga agagtgagca 20
<210> 668
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 668
atggactctc ttcttcataa 20
<210> 669
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 669
tccttgcagc agttagttcg 20
<210> 670
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 670
ccgccatact acctgggcat 20
<210> 671
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 671
ctgaaatcca aggcaagcca 20
<210> 672
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 672
accccgaact aactgctgca 20
<210> 673
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 673
ttttcacatt ctggctctgt 20
<210> 674
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 674
tggcttgcct tggatttcag 20
<210> 675
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 675
tgcatactca cacacaaagc 20
<210> 676
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 676
cctagatgat tccatctgca 20
<210> 677
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 677
aaacaggaga gtgcagggcc 20
<210> 678
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 678
ctgctggcca gtaccacagc 20
<210> 679
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 679
aagaagccct cttacaacag 20
<210> 680
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 680
cgtcatgact accagagagg 20
<210> 681
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 681
atgatcaggt gactcatatt 20
<210> 682
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 682
gcctcgcagg gtggatgatc 20
<210> 683
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 683
ccggcctttc tccacctctc 20
<210> 684
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 684
ccagtacaag tttatttacg 20
<210> 685
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 685
gtgcccacct cgggccagta 20
<210> 686
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 686
cttctatgac ctgtacggag 20
<210> 687
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 687
tattcggatc cagaactcag 20
<210> 688
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 688
tgggtactta aggtggatga 20
<210> 689
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 689
atgtgtccca tactggcccg 20
<210> 690
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 690
tggtgccatc tcggtcctgc 20
<210> 691
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 691
gtggggtccg agcagttcag 20
<210> 692
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 692
catcgtcatg actaccagag 20
<210> 693
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 693
ggggacttct atgacctgta 20
<210> 694
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 694
ccagggtgga cgctacacag 20
<210> 695
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 695
cattgatgta gtcggacccg 20
<210> 696
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 696
ggtgtcctgc aggaccgcga 20
<210> 697
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 697
gcaggcagag acgctgctgc 20
<210> 698
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 698
gcccccagga tggtgaggta 20
<210> 699
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 699
gatgcagaga ccctgctcaa 20
<210> 700
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 700
ctgagttctg gatccgaata 20
<210> 701
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 701
gatgtgggtg accctgagcg 20
<210> 702
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 702
aacttaagga cacctgcaag 20
<210> 703
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 703
gctccgatcc cactagtgag 20
<210> 704
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 704
cggcccagtc gcaagaacca 20
<210> 705
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 705
gtttgcgact ctgacagagc 20
<210> 706
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 706
tattcggatc cagaactcag 20
<210> 707
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 707
tcacgcacaa gaaacgtcca 20
<210> 708
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 708
agccagtgcc cgggcatgcc 20
<210> 709
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 709
tcttcgttag gacttggccc 20
<210> 710
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 710
cagctggatg aacagcgaga 20
<210> 711
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 711
gaaaattgca gcgaaatatg 20
<210> 712
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 712
actgggcgat accacagcag 20
<210> 713
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 713
agtggcactt gggacttcta 20
<210> 714
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 714
tcttggtagg tcacaaactc 20
<210> 715
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 715
gtgcagactg gagaatacag 20
<210> 716
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 716
tgatccctca ggagtccagg 20
<210> 717
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 717
gatggccctg ctgtaacttt 20
<210> 718
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 718
aacgttagtg atgacagcat 20
<210> 719
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 719
ccatgagaga gcccgttacg 20
<210> 720
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 720
ggataggcgt gggaatcaac 20
<210> 721
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 721
tatcccaagg ctccggaagg 20
<210> 722
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 722
tgggtaaggg aggtaactcc 20
<210> 723
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 723
tttccaacac tatactcgcc 20
<210> 724
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 724
acgtagtatt cccctgtcag 20
<210> 725
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 725
actgcccaca caaaatggtt 20
<210> 726
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 726
gctttaggtt cttgtcggtg 20
<210> 727
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 727
tgcaaaggtg gatgcgagca 20
<210> 728
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 728
taactcctgg ggtagggaat 20
<210> 729
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 729
ggctttggcg cccttgctgc 20
<210> 730
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 730
ggtaccaaca aagagaacct 20
<210> 731
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 731
gagttcatca tgcccgcgca 20
<210> 732
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 732
tttgccagct tagatggctt 20
<210> 733
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 733
tagatagcac aaccatttcc 20
<210> 734
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 734
agtttcaaag caaacgagaa 20
<210> 735
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 735
ctgccctatg ggcttcccac 20
<210> 736
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 736
gtcaactgta gtgcccagga 20
<210> 737
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 737
tcagtgatgt tagtcccctg 20
<210> 738
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 738
ctaaagagga gaaaccagag 20
<210> 739
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 739
cagcagatgg caaacctggc 20
<210> 740
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 740
cagggcaact gaaggagagg 20
<210> 741
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 741
acgatgggag cagcaggtgt 20
<210> 742
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 742
cccacgtgct gaataacgga 20
<210> 743
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 743
taccaaagat ggagctgatg 20
<210> 744
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 744
caggccactg gtgaccgcct 20
<210> 745
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 745
ctgctgtttg gcaggcggcc 20
<210> 746
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 746
gccgactggg aaaggttgaa 20
<210> 747
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 747
gctgtcatca ctaacgtttc 20
<210> 748
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 748
tccatgtaag gattgaccca 20
<210> 749
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 749
accgaataca cccgagacag 20
<210> 750
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 750
acctggccgg caaagcagga 20
<210> 751
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 751
tactacgtgg agaatgccga 20
<210> 752
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 752
gaaaaccgat tccggagggt 20
<210> 753
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 753
gcactgagca tggaccgcac 20
<210> 754
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 754
gttctctaag gtgcagcaag 20
<210> 755
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 755
agttagcagc gagttccccg 20
<210> 756
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 756
cagaagcgct gggcttggac 20
<210> 757
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 757
cagcggctgg gccaagctgt 20
<210> 758
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 758
actttcgttc tgttctgcaa 20
<210> 759
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 759
cgccttggca gagggaaccc 20
<210> 760
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 760
gatgaggctg aatcaaatga 20
<210> 761
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 761
gcggttcaag acagaaaaga 20
<210> 762
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 762
tcttgttctc taagcagtac 20
<210> 763
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 763
ggtgccatct gcattggcat 20
<210> 764
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 764
tggcaagtat cccaaggctc 20
<210> 765
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 765
gctgccacaa gcactctagg 20
<210> 766
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 766
atagcactga agccatttgg 20
<210> 767
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 767
gaatacaccc gagacagtgg 20
<210> 768
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 768
tccaagtatc tgtggctcag 20
<210> 769
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 769
tcaatggtgc tagttatctg 20
<210> 770
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 770
gtgaacgttc ccatacaggg 20
<210> 771
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 771
gaatcccttg aaccacaacg 20
<210> 772
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 772
gctgtgtgca gacgaagaag 20
<210> 773
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 773
gacacacggc gcaatgacag 20
<210> 774
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 774
cagctgtatg atctggaagc 20
<210> 775
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 775
cagcaaccag actgaaaaac 20
<210> 776
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 776
gcagggagat ggccccacag 20
<210> 777
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 777
acagtggcat ctacctctgt 20
<210> 778
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 778
cggaggatct tatgctgaac 20
<210> 779
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 779
gagccctgga gcagagctcg 20
<210> 780
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 780
gcaaaaatcg aggagagccc 20
<210> 781
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 781
gccaggctgg gtagaaggtg 20
<210> 782
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 782
gctcaaacca ttacagaagg 20
<210> 783
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 783
ggacaagctg caggtgaagg 20
<210> 784
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 784
gagccctgga gcagagctcg 20
<210> 785
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 785
ggacaagctg caggtgaagg 20
<210> 786
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 786
gctcaaacca ttacagaagg 20
<210> 787
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 787
gccaggctgg gtagaaggtg 20
<210> 788
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 788
gacacacggc gcaatgacag 20
<210> 789
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 789
cagctgtatg atctggaagc 20
<210> 790
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 790
cagcaaccag actgaaaaac 20
<210> 791
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 791
gcagggagat ggccccacag 20
<210> 792
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 792
acagtggcat ctacctctgt 20
<210> 793
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 793
cggaggatct tatgctgaac 20
<210> 794
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 794
gcaaaaatcg aggagagccc 20
<210> 795
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 795
cgaccagttg gacaagctgc 20
<210> 796
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 796
catgtggaag tcatgcctgt 20
<210> 797
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 797
agcgggcatc ctggacgggt 20
<210> 798
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 798
ccaggctggg tagaaggtga 20
<210> 799
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 799
gcaccccaag gcaaaaatcg 20
<210> 800
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 800
gctcaaacca ttacagaagg 20
<210> 801
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 801
gacacacggc gcaatgacag 20
<210> 802
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 802
cagctgtatg atctggaagc 20
<210> 803
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 803
cggccagttc caaaccctgg 20
<210> 804
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 804
cagttccaaa ccctggtggt 20
<210> 805
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 805
ctgcagcttc tccaacacat 20
<210> 806
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 806
cgtgtcacac aactgcccaa 20
<210> 807
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 807
agagctcagg gtgacaggtg 20
<210> 808
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 808
gcgtgacttc cacatgagcg 20
<210> 809
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 809
cagcggcacc tacctctgtg 20
<210> 810
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 810
gctgcggtcc tcggggaagg 20
<210> 811
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 811
gcagggctgg ggagaaggtg 20
<210> 812
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 812
catgagcccc agcaaccaga 20
<210> 813
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 813
gccctgtgtc cctgagcaga 20
<210> 814
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 814
taggggcccc aggcctgagc 20
<210> 815
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 815
aagatctgcg cccggagata 20
<210> 816
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 816
gttctgtctg tagggaggta 20
<210> 817
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 817
caacgaaact tacacaagga 20
<210> 818
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 818
cactcagaac ttacatcaga 20
<210> 819
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 819
tctgagtgtg acagagaagg 20
<210> 820
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 820
ttcctcctga gactgtcgta 20
<210> 821
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 821
gacaattgca gcctgctgag 20
<210> 822
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 822
acttacatca gaaggttgct 20
<210> 823
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 823
gcacaggagc tgcggcggat 20
<210> 824
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 824
gttgtaagat aaccatttga 20
<210> 825
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 825
gtttgcaaat gattaccgcg 20
<210> 826
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 826
tcctgtgcaa tccgtatctc 20
<210> 827
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 827
tcgccgtcgg gattaccttg 20
<210> 828
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 828
tcttccgtct ggtatggaga 20
<210> 829
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 829
ttccatacga cagtctcagg 20
<210> 830
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 830
ttctgtctgt agggaggtag 20
<210> 831
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 831
caaccactat ctcagtgcaa 20
<210> 832
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 832
agctggggag gcctctccgc 20
<210> 833
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 833
ccactgaact tccctatgaa 20
<210> 834
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 834
ttaacgctta ctatgcaagg 20
<210> 835
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 835
aaccattcgt gggtggtctt 20
<210> 836
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 836
aggcaatcac ggaggtgaag 20
<210> 837
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 837
tggcttgcag atgactccgc 20
<210> 838
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 838
aaagatcacc tatatcctct 20
<210> 839
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 839
gttgatttgt cacaactcat 20
<210> 840
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 840
gttctgatgc agcttccatg 20
<210> 841
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 841
ttttccagtt agagaaatag 20
<210> 842
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 842
tagtggttga aggcctggca 20
<210> 843
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 843
ttgccttcag gattaccttg 20
<210> 844
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 844
acagtctcac tctgtcaccc 20
<210> 845
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 845
cactcagaac ttacatcaga 20
<210> 846
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 846
cttgggcgat ccatatctct 20
<210> 847
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 847
aggtagacaa ttgcagcctg 20
<210> 848
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 848
acttcctcta tttctctaac 20
<210> 849
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 849
actggaggat cgagacagca 20
<210> 850
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 850
tccctacaga cagagccaca 20
<210> 851
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 851
ttgtggctct gtctgtaggg 20
<210> 852
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 852
gctgttaact ctgttgatgc 20
<210> 853
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 853
ggctcgccgg ctcgggatgg 20
<210> 854
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 854
ccggagccgc ggaccaccac 20
<210> 855
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 855
cgattgagaa gttattagaa 20
<210> 856
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 856
gctcaagtac tcgcccgacc 20
<210> 857
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 857
tccccgcagg actcaccttg 20
<210> 858
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 858
ctgtgctgct gctgcacgtt 20
<210> 859
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 859
ggacgaggag cgggccctgg 20
<210> 860
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 860
cgaaatctat gaggaagagg 20
<210> 861
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 861
actgttaact ctgttgatgc 20
<210> 862
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 862
gcacattagg ttgcagtatg 20
<210> 863
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 863
ggatttcgac gaaatctatg 20
<210> 864
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 864
tctcaatcga tcttcgtgtc 20
<210> 865
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 865
tgcattggag actgagcaaa 20
<210> 866
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 866
gccaacgtac attaacagga 20
<210> 867
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 867
gaattccctt cttcattaac 20
<210> 868
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 868
ccggacccgg tggtcgtccg 20
<210> 869
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 869
gcagctgctc aagtactcgc 20
<210> 870
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 870
aaacaatagg ttataccaca 20
<210> 871
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 871
cggtgacgtg accggagccg 20
<210> 872
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 872
ccactgcaga ccccacactg 20
<210> 873
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 873
tataaaggaa tacggattga 20
<210> 874
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 874
gtggctggag tgggctataa 20
<210> 875
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 875
cggagagtca ttgtgcctgc 20
<210> 876
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 876
cacaggagca cgttcgacag 20
<210> 877
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 877
aatgacggac cctgatgagg 20
<210> 878
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 878
catggtactt actttccctg 20
<210> 879
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 879
ccaacgccag ctgtatcacc 20
<210> 880
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 880
cagcacttcc gtgttgtaga 20
<210> 881
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 881
caaaatgacg gaccccgatg 20
<210> 882
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 882
tggttctcga attacctgcg 20
<210> 883
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 883
tgtgaggcaa tggctggagt 20
<210> 884
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 884
gatcgtttgt gcccctccaa 20
<210> 885
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 885
tcgttggtgg tcatgttggg 20
<210> 886
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 886
tcagtaagaa tacagagcaa 20
<210> 887
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 887
ccagctgtat cacctgggag 20
<210> 888
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 888
tgtcggagag cagctccagg 20
<210> 889
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 889
aacattatga ccaaagtgca 20
<210> 890
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 890
ggcggcactt actttccctg 20
<210> 891
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 891
actgtgtaaa atgaacaagg 20
<210> 892
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 892
atcccccgcc acctggacct 20
<210> 893
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 893
ggaaggcagg tcactattac 20
<210> 894
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 894
ctgatgcacg gaaaggaagt 20
<210> 895
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 895
cctgggcccc ggtgctctcg 20
<210> 896
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 896
accagccgaa gtgtgaccgg 20
<210> 897
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 897
gtcagcgtga tgatcctctc 20
<210> 898
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 898
ctccagcttg tcgatgatca 20
<210> 899
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 899
tcccgtcccg ccgtgcatca 20
<210> 900
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 900
tggcgcgcgg atcaacatct 20
<210> 901
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 901
gagagaatca tcactctgac 20
<210> 902
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 902
tccgtgcata agaagccgaa 20
<210> 903
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 903
aagcatcatt gggaagaaag 20
<210> 904
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 904
ctccatgacc aacagtaccg 20
<210> 905
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 905
atttggaatg gtgagttcat 20
<210> 906
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 906
agagatccgc gagagtacgg 20
<210> 907
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 907
gaaagcctta aagatggcat 20
<210> 908
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 908
cagctcccca gtcatctgcg 20
<210> 909
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 909
acacactcgg tgacagactg 20
<210> 910
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 910
aatcagggag ccgcactggg 20
<210> 911
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 911
gtcggttaag aggatccgcg 20
<210> 912
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 912
ccaaaacata caatgagcct 20
<210> 913
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 913
agactattat gcaataatta 20
<210> 914
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 914
aagactttgc gatctattta 20
<210> 915
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 915
gagcacatca cttaccactt 20
<210> 916
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 916
gtaccaagac atagattcta 20
<210> 917
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 917
cctctgtgag ctgttcatta 20
<210> 918
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 918
aacgggcaag aaggatgaac 20
<210> 919
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 919
gaaaccactt cataatagtc 20
<210> 920
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 920
cacacctggc ggaagatggt 20
<210> 921
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 921
tggagagatt cttctttcac 20
<210> 922
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 922
ggagttgtcg gaataaccaa 20
<210> 923
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 923
caaatcccag agtttgcaag 20
<210> 924
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 924
tcaggcaact cagatctaga 20
<210> 925
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 925
ttacccggtg gtgggatgcc 20
<210> 926
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 926
tcaaccagac tattatgaag 20
<210> 927
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 927
cccttccagc agtgtcagcg 20
<210> 928
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 928
gccaggcact ataatgagga 20
<210> 929
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 929
tcattagggc accaaagcga 20
<210> 930
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 930
ttgagcatcc ccattggtgt 20
<210> 931
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 931
ttgcattgtt aaaaagaagc 20
<210> 932
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 932
aggctgcctt tactgtgtga 20
<210> 933
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 933
tgctgattga gcatccccat 20
<210> 934
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 934
ccagctgcac gctatgaaga 20
<210> 935
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 935
aaaacatttg cataatgatg 20
<210> 936
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 936
ggataggact ccatccaact 20
<210> 937
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 937
atctcaagac cattgcccag 20
<210> 938
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 938
gctcatactc ctcccggtta 20
<210> 939
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 939
aggcgagggg cctgatttac 20
<210> 940
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 940
gttacgggtc tggagtgtgt 20
<210> 941
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 941
tgttggggac aggctgctgg 20
<210> 942
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 942
tctggactct cttcaccatt 20
<210> 943
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 943
gagaatcact tgaacctggg 20
<210> 944
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 944
gcaggatgca ccctactaca 20
<210> 945
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 945
cattaggctc tggccgtacc 20
<210> 946
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 946
ccgtgagggc caccatctcg 20
<210> 947
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 947
agcgttcgta tctggaaggt 20
<210> 948
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 948
ataagctccg aggttgcccg 20
<210> 949
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 949
gctggcagtg actgatacag 20
<210> 950
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 950
acaaagatgg ccttgccaga 20
<210> 951
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 951
aagaagtaaa ctacctcaca 20
<210> 952
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 952
gctacgttct tcatggccgt 20
<210> 953
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 953
aagaattcga ccaagggatt 20
<210> 954
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 954
ttaatggcaa gacttgcaga 20
<210> 955
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 955
tgaaagtatc cagctgatga 20
<210> 956
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 956
ggcgagatgt gtgacagagg 20
<210> 957
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 957
agatgtagag ctttccaagg 20
<210> 958
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 958
tagatcttct tacatggaag 20
<210> 959
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 959
ctttctaggt tcgagatgtg 20
<210> 960
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 960
caacccaatc tttcctcgga 20
<210> 961
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 961
gtagaagcaa agagaggcga 20
<210> 962
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 962
ttcgatctcg acttcttgag 20
<210> 963
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 963
gcttgaggct ccttacaaga 20
<210> 964
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 964
ctgatgatgg acagtgaaac 20
<210> 965
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 965
cataataaca aacaaagcta 20
<210> 966
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 966
aggagatgta gagctttcca 20
<210> 967
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 967
ttggtcagat aatatgatta 20
<210> 968
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 968
gaggcaaccc aatctttcct 20
<210> 969
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 969
aggtgaattc atgggagtag 20
<210> 970
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 970
tacttactat gaagcattta 20
<210> 971
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 971
cagggcgaga tgtgtgacag 20
<210> 972
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 972
agcgaagtag aagcaaagag 20
<210> 973
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 973
agtgatgaac tggaaaggac 20
<210> 974
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 974
atgaagcatt tagggatctt 20
<210> 975
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 975
cttggcacct tgaagagcat 20
<210> 976
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 976
tttaattggg gaggaccatg 20
<210> 977
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 977
gtcattattc acagcagggt 20
<210> 978
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 978
cgtcctagag agtttacata 20
<210> 979
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 979
ctgcagggtg aagtttacaa 20
<210> 980
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 980
tgacatctgc cttgacgaag 20
<210> 981
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 981
aaaacaggta cacttggcac 20
<210> 982
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 982
acttctaggc ttactatctg 20
<210> 983
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 983
cgcaacagag atcagaaaag 20
<210> 984
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 984
aaggctctca gggagagccg 20
<210> 985
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 985
gttcatgtta cagaggaaag 20
<210> 986
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 986
gcaagcatgc tcgaggacag 20
<210> 987
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 987
tgcttgaagt tggacagcaa 20
<210> 988
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 988
cactaaacca tttcaggtaa 20
<210> 989
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 989
ctatttgaca aagatggtga 20
<210> 990
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 990
aagaagttga tgaaatgatc 20
<210> 991
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 991
cgccatgtga tgacaaacct 20
<210> 992
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 992
gtcctgtaac tctgcttctg 20
<210> 993
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 993
tcagcagttc aagaccagcc 20
<210> 994
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 994
tgatggaact ataacaacaa 20
<210> 995
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 995
ccatcattgt cagaaattca 20
<210> 996
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 996
gacgtacctt atcaaacaca 20
<210> 997
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 997
ctttgcacaa caaccctgca 20
<210> 998
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 998
aaggcggtgg agatgctcag 20
<210> 999
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 999
aggtgatgca aactcatcat 20
<210> 1000
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1000
cggattagcc tccgccaacg 20
<210> 1001
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1001
tgctcccaga gaccctgaag 20
<210> 1002
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1002
tgacgaggag aatctgaccc 20
<210> 1003
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1003
gctgaaagcg aagtccacgt 20
<210> 1004
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1004
aggcctcaag ttcaacctca 20
<210> 1005
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1005
agctgagtcc tgaaagtcag 20
<210> 1006
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1006
tctgctggac aggttcacgg 20
<210> 1007
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1007
ccccagagac aggaaggcca 20
<210> 1008
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1008
cctaccttca aacagaacca 20
<210> 1009
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1009
atggtggctt tgatgaactg 20
<210> 1010
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1010
attgtattcc tgcttccgga 20
<210> 1011
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1011
gatctactac ttcttccgag 20
<210> 1012
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1012
gttcactgtc agtctccaag 20
<210> 1013
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1013
tagacctcac acaggtccag 20
<210> 1014
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1014
ggaatacacc tcgtcccctg 20
<210> 1015
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1015
actcaagcct tcccaacccg 20
<210> 1016
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1016
aatacaatgg gaagatccct 20
<210> 1017
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1017
gtgtccagtc ccaacactgc 20
<210> 1018
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1018
agcggtggaa cacaggctac 20
<210> 1019
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1019
aatccagtag ggattgctgc 20
<210> 1020
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1020
ttaataacag cttggtcctc 20
<210> 1021
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1021
aagtgtgact ccccagcctc 20
<210> 1022
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1022
gggtttcctt cctgaggctg 20
<210> 1023
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1023
ggggaagaat aagacttcgg 20
<210> 1024
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1024
gggtttatgt gcaccaggta 20
<210> 1025
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1025
ttcccaggaa gtgagagttc 20
<210> 1026
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1026
cactcgcggg actcactttc 20
<210> 1027
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1027
atagaaacgc tcatctcccg 20
<210> 1028
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1028
ggatgctgtg atcatcctgg 20
<210> 1029
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1029
cctcaccagc caggataagg 20
<210> 1030
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1030
aatccagtag gaattgctgc 20
<210> 1031
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1031
tgacaagcat ggggaagccg 20
<210> 1032
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1032
tctcttcgcc tcctacctga 20
<210> 1033
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1033
acctgatgcc gactctgcag 20
<210> 1034
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1034
cagtcacggg ctttcagtgg 20
<210> 1035
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1035
cactcgcggg actcacttgc 20
<210> 1036
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1036
ccgtggaagg agccccaggg 20
<210> 1037
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1037
cataaattcc gaaatccagt 20
<210> 1038
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1038
cactcgcggg actcactttc 20
<210> 1039
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1039
gtggacggac tttataagat 20
<210> 1040
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1040
gatgaaggag ttgataactc 20
<210> 1041
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1041
cccatctaca tcgatctgcg 20
<210> 1042
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1042
gttgaggttc ttcagaagga 20
<210> 1043
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1043
gcacccaaag aactcagctt 20
<210> 1044
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1044
gaacagataa ctgtagccaa 20
<210> 1045
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1045
cactttcctt tctcaggtgc 20
<210> 1046
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1046
cagctacaac atggtcattc 20
<210> 1047
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1047
cccgggccaa gtacttcatt 20
<210> 1048
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1048
gaatgtagtc cactctgaac 20
<210> 1049
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1049
gaccgtacca tcctcaggag 20
<210> 1050
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1050
gtggtgtagc gagcgaactc 20
<210> 1051
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1051
tgaagcactg gatccacttg 20
<210> 1052
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1052
tgaggatcct gcatgttaat 20
<210> 1053
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1053
cattaaaccc attaacatgc 20
<210> 1054
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1054
gggcaccagg ttgctcatgg 20
<210> 1055
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1055
actgggcaca gtcaatcagc 20
<210> 1056
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1056
ggaatctgac cacgagcacg 20
<210> 1057
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1057
tgcctaagag gatggatcgg 20
<210> 1058
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1058
cgcccgtgcc cagcagcgcg 20
<210> 1059
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1059
gaaggacaag caggtctacc 20
<210> 1060
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1060
ggaccagcgc aacgaggaga 20
<210> 1061
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1061
cgaggagaag gcgcagcgtg 20
<210> 1062
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1062
ggagagccag aggagcgcgg 20
<210> 1063
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1063
actgttcccg aggcagccca 20
<210> 1064
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1064
gcaggagagc cagaggagcg 20
<210> 1065
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1065
ggcgaattgg ctactttcaa 20
<210> 1066
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1066
acgtcaagga ctttgcaggt 20
<210> 1067
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1067
gccaagcaac tgttagccgc 20
<210> 1068
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1068
gtgaacctcc tgttaggcaa 20
<210> 1069
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1069
tttgccggac tttgagactg 20
<210> 1070
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1070
gttcaccatc gttggcgaat 20
<210> 1071
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1071
gggcgcggac gtgaacgtca 20
<210> 1072
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1072
tgtggcaggt gagggagaaa 20
<210> 1073
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1073
ttgttggcag cgtcgtgcaa 20
<210> 1074
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1074
gcaccgagcc gccatccgcg 20
<210> 1075
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1075
aacaacgggc actacaaggt 20
<210> 1076
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1076
cactgagatc acgattcttt 20
<210> 1077
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1077
aggtgcggag gtgaacacca 20
<210> 1078
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1078
gccggatgtg tgaagaacgg 20
<210> 1079
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1079
gtgtctgttt ccaggctgga 20
<210> 1080
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1080
aggagcagga cgatgcccaa 20
<210> 1081
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1081
agccttgcag caccacaaca 20
<210> 1082
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1082
actgacctct gaccaagccg 20
<210> 1083
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1083
ccggatgtgt gaagaacggg 20
<210> 1084
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1084
ttgcacgacg ctgccaacaa 20
<210> 1085
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1085
ctccagccca gtccctgttg 20
<210> 1086
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1086
tgagggagcg agccagcaag 20
<210> 1087
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1087
gtgaacctcc tgttaggcaa 20
<210> 1088
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1088
gaagtgcacg cggatgctcg 20
<210> 1089
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1089
agtgctccag cagctcgaaa 20
<210> 1090
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1090
gccggccgct tccacttgga 20
<210> 1091
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1091
gctgtgtcgc cagcgcatcg 20
<210> 1092
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1092
gcgactgtcg cgcaccaaga 20
<210> 1093
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1093
gcgtgcacgg ggcgcacgag 20
<210> 1094
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1094
tcacggagta ccgggttaag 20
<210> 1095
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1095
ggacgcctgc ggcttctatt 20
<210> 1096
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1096
gcgcgaagaa gcagttccgt 20
<210> 1097
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1097
gctcagcgtg aagatggctt 20
<210> 1098
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1098
cgagcccgtg ggcaccttct 20
<210> 1099
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1099
atccgcgtgc acttccaggc 20
<210> 1100
<211> 20
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1100
cgccaggttc tcgcgaccca 20
<210> 1101
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1101
gcggctgcgc gccgagcccg 20
<210> 1102
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1102
ggacgcctgc ggattctact 20
<210> 1103
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1103
ggctgccatc caggtgaaag 20
<210> 1104
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1104
gcggctgtcg cgcaccagga 20
<210> 1105
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1105
tggacgcctg cggattctac 20
<210> 1106
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1106
gacgcctgcg gattctactg 20
<210> 1107
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1107
agtgctccag cagctcgaag 20
<210> 1108
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1108
gccggccgct ttcacctgga 20
<210> 1109
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1109
agtagaatcc gcaggcgtcc 20
<210> 1110
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1110
cgcaccagga aggtgcccac 20
<210> 1111
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1111
ggccggcctg aaagtgcacg 20
<210> 1112
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1112
tccgttcgca cgccgattac 20
<210> 1113
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1113
agcgcgctcc tggacgcctg 20
<210> 1114
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1114
cggctgcgcg ccgagcccgt 20
<210> 1115
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1115
acgcctgcgg attctactgg 20
<210> 1116
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1116
cgaggccatc ttcacgctaa 20
<210> 1117
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1117
tcaggccggc cgctttcacc 20
<210> 1118
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1118
cttagcgtga agatggcctc 20
<210> 1119
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1119
gccggtaatc ggcgtgcgaa 20
<210> 1120
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1120
ctgcattgtc ggctgccacc 20
<210> 1121
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1121
gtgcgccccg tgcacgctca 20
<210> 1122
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1122
gctgtgccgc cagcgcatcg 20
<210> 1123
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1123
cacgcggcgc tggcgcagcg 20
<210> 1124
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1124
gctcctgcag cggccgcacg 20
<210> 1125
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1125
agctctcgcg gctgccatcc 20
<210> 1126
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1126
tggtgcgcga cagccgccag 20
<210> 1127
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1127
gatggtagca cacaaccagg 20
<210> 1128
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1128
agaggcagtc gaagctctcg 20
<210> 1129
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1129
gctggcggct gtcgcgcacc 20
<210> 1130
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1130
ccgaggccat cttcacgcta 20
<210> 1131
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1131
ggggccccca gcatgcggcg 20
<210> 1132
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1132
gctgctggag cactacgtgg 20
<210> 1133
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1133
cgagctgctg gagcactacg 20
<210> 1134
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1134
cgaaaaagca gttccgctgg 20
<210> 1135
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1135
gcaggcgtcc aggagcgcgc 20
<210> 1136
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1136
ggggcccctg agcgtgcacg 20
<210> 1137
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1137
gcggcgccgc gccgcatgct 20
<210> 1138
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1138
gcacgcggcg ctggcgcagc 20
<210> 1139
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1139
tgggggcccc tgagcgtgca 20
<210> 1140
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1140
caggaaggtg cccacgggct 20
<210> 1141
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1141
tgcgccccgt gcacgctcag 20
<210> 1142
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1142
gccatccagg tgaaagcggc 20
<210> 1143
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1143
cacgcgcgcc agcgcgctcc 20
<210> 1144
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1144
gggcccccag tagaatccgc 20
<210> 1145
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1145
atccgcgtgc actttcaggc 20
<210> 1146
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1146
cgagcccgtg ggcaccttcc 20
<210> 1147
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1147
ccacagcagc agagccccga 20
<210> 1148
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1148
agccaggttc tcgcggccca 20
<210> 1149
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1149
aaagtgcacg cggatgctcg 20
<210> 1150
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1150
ctcttcctcc tcctcgcccg 20
<210> 1151
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1151
gcgtgcacgg ggcgcacgag 20
<210> 1152
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1152
aagtgcacgc ggatgctcgt 20
<210> 1153
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1153
cgtgcgcccc gtgcacgctc 20
<210> 1154
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1154
gcagcggccg cacgcggcgc 20
<210> 1155
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1155
ccttagcgtg aagatggcct 20
<210> 1156
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1156
caggttctcg cggcccacgg 20
<210> 1157
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1157
gcgcaccagg aaggtgccca 20
<210> 1158
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1158
gctgccggtc aaatctggaa 20
<210> 1159
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1159
cggcgtgcga acggaatgtg 20
<210> 1160
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1160
cagcagcaga gccccgacgg 20
<210> 1161
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1161
gggcgaaaaa gcagttccgc 20
<210> 1162
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1162
cgcacgcggc gctggcgcag 20
<210> 1163
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1163
ggatgcgagc caggttctcg 20
<210> 1164
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1164
tggcggcaca gctcctgcag 20
<210> 1165
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1165
gcgcccgcgg ccgtgccccg 20
<210> 1166
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1166
ggcgccgcgc cgcatgctgg 20
<210> 1167
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1167
cggtggccac gatgcgctgg 20
<210> 1168
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1168
tgctgtggag actgcattgt 20
<210> 1169
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1169
taggatggta gcacacaacc 20
<210> 1170
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1170
gcggccgtgc cccgcggtcc 20
<210> 1171
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1171
gagcatccgc gtgcactttc 20
<210> 1172
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1172
cgctgccggt caaatctgga 20
<210> 1173
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1173
cagcgcatcg tggccaccgt 20
<210> 1174
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1174
gcggatgctc gtgggtcccg 20
<210> 1175
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1175
cggcgccgcg ccgcatgctg 20
<210> 1176
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1176
cggtcaaatc tggaagggga 20
<210> 1177
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1177
aggaaggttc tggccgccgt 20
<210> 1178
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1178
ccacggtggc cacgatgcgc 20
<210> 1179
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1179
cgctgcgcca gcgccgcgtg 20
<210> 1180
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1180
aggagctcag gtagtcgcgg 20
<210> 1181
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1181
gcagcggggc ccccagcatg 20
<210> 1182
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1182
ggaaggagct caggtagtcg 20
<210> 1183
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1183
tcgcggagga cggggttgag 20
<210> 1184
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1184
cgactgcctc ttcgagctgc 20
<210> 1185
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1185
gcgccgcgtg cggccgctgc 20
<210> 1186
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1186
caccgtgggc cgcgagaacc 20
<210> 1187
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1187
gtgccccgcg gtcccggccc 20
<210> 1188
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1188
ctgccggtca aatctggaag 20
<210> 1189
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1189
cttccccttc cagatttgac 20
<210> 1190
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1190
ctcaggtagt cgcggaggac 20
<210> 1191
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1191
cgggcgctgc cggtcaaatc 20
<210> 1192
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1192
ggaaggttct ggccgccgtc 20
<210> 1193
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1193
gctcaggtag tcgcggagga 20
<210> 1194
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1194
gcggaagtgc gtgtcgccgg 20
<210> 1195
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1195
ggaccgcggg gcacggccgc 20
<210> 1196
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1196
gggaccgcgg ggcacggccg 20
<210> 1197
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1197
gcgcgtgatg cgccggtaat 20
<210> 1198
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1198
tcaggtagtc gcggaggacg 20
<210> 1199
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1199
tgcggaagtg cgtgtcgccg 20
<210> 1200
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1200
ggggccggga ccgcggggca 20
<210> 1201
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1201
ccgtcggggc tctgctgctg 20
<210> 1202
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1202
gaaggttctg gccgccgtcg 20
<210> 1203
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1203
gtgtgctacc atcctacaga 20
<210> 1204
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1204
gtcgcggagg acggggttga 20
<210> 1205
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1205
cgctggcgcg cgtgatgcgc 20
<210> 1206
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1206
gcgtgcacgg cgggcgctgc 20
<210> 1207
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1207
tctggaaggg gaaggagctc 20
<210> 1208
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1208
gtgcgtgtcg ccgggggccg 20
<210> 1209
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1209
gggcacggcc gcgggcgcgc 20
<210> 1210
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1210
gttaatgctg cgtgcacggc 20
<210> 1211
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1211
gcacggccgc gggcgcgcgg 20
<210> 1212
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1212
ggggcacggc cgcgggcgcg 20
<210> 1213
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1213
gtgcggaagt gcgtgtcgcc 20
<210> 1214
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1214
gaggaagagg aggaaggttc 20
<210> 1215
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1215
ggctggcccc ttctgtagga 20
<210> 1216
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1216
ggggccgggg ccgggaccgc 20
<210> 1217
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1217
cgcggaggac ggggttgagg 20
<210> 1218
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1218
tttcgccctt agcgtgaaga 20
<210> 1219
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1219
ggcacggccg cgggcgcgcg 20
<210> 1220
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1220
agtcgcggag gacggggttg 20
<210> 1221
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1221
gggccggggc cgggaccgcg 20
<210> 1222
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1222
aagtgcgtgt cgccgggggc 20
<210> 1223
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1223
ctccggctgg ccccttctgt 20
<210> 1224
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1224
ggcggcgccg cgccgcatgc 20
<210> 1225
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1225
agtgcgtgtc gccgggggcc 20
<210> 1226
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1226
tgtgcggaag tgcgtgtcgc 20
<210> 1227
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1227
gtgtcgccgg gggccggggc 20
<210> 1228
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1228
tgtcgccggg ggccggggcc 20
<210> 1229
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1229
gcggtcccgg ccccggcccc 20
<210> 1230
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1230
cgcgggggcc gcgggcgagg 20
<210> 1231
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1231
cgcgggcgag gaggaggaag 20
<210> 1232
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1232
gggcgaggag gaggaagagg 20
<210> 1233
<211> 21
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 1233
ccgtattgaa atggagtcaa a 21
<210> 1234
<211> 19
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1234
ggacgtgagt gtttccata 19
<210> 1235
<211> 19
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1235
ggaagcagga acaccgaaa 19
<210> 1236
<211> 21
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1236
tttcgagctg ctggagcact a 21
<210> 1237
<211> 21
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1237
tcgagctgct ggagcactac g 21
<210> 1238
<211> 21
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1238
tcgccaacgg aactgcttct t 21
<210> 1239
<211> 21
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1239
acttctggct ggagacctca t 21
<210> 1240
<211> 21
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1240
gcgagacctt cgactgcctt t 21
<210> 1241
<211> 21
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1241
cgacactcac ttccgcacct t 21
<210> 1242
<211> 21
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1242
ctacctgagt tccttcccct t 21
<210> 1243
<211> 21
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1243
ttccgctccc actccgatta c 21
<210> 1244
<211> 21
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1244
taacccggta ctccgtgact a 21
<210> 1245
<211> 21
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1245
tactccgtga ctacctgagt t 21
<210> 1246
<211> 21
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1246
cttccgctcc cactccgatt a 21
<210> 1247
<211> 21
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1247
gcgcgacagt cgccaacgga a 21
<210> 1248
<211> 21
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1248
tggacgcctg cggcttctat t 21
<210> 1249
<211> 21
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1249
cgcatccctc ttaacccggt a 21
<210> 1250
<211> 21
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1250
tacatattcc cagtatcttt g 21
<210> 1251
<211> 21
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1251
gcgccttatt atttcttatt a 21
<210> 1252
<211> 21
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1252
ccgtgactac ctgagttcct t 21
<210> 1253
<211> 21
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1253
ggagggtctc tggcttcatt t 21
<210> 1254
<211> 21
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1254
ttcgcgctca gcgtgaagat g 21
<210> 1255
<211> 21
<212> DNA
<213> 鼠(Murine)
<400> 1255
atccctctta acccggtact c 21
<210> 1256
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ankrd11 shRNA
<400> 1256
gatccccgcg gaagctgccc ttcaccttca agagaggtga agggcagctt ccgctttttg 60
gaaa 64
<210> 1257
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Ankrd11 shRNA
<400> 1257
agcttttcca aaaagcggaa gctgcccttc acctctcttg aaggtgaagg gcagcttccg 60
cggg 64
<210> 1258
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Socs shRNA
<400> 1258
cacgcacttc cgcacattc 19
<210> 1259
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Socs shRNA
<400> 1259
ttccgttcgc acgccgatt 19
<210> 1260
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Socs shRNA
<400> 1260
gagcttcgac tgcctcttc 19
<210> 1261
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Socs siRNA
<400> 1261
cgcacuuccg cacauuccgu ucg 23
<210> 1262
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Socs siRNA
<400> 1262
ggggaggguc ucuggcuuua uuu 23
<210> 1263
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Socs siRNA
<400> 1263
cagcauuaac ugggaugccg ugu 23
<210> 1264
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Socs siRNA
<400> 1264
ccaggaccug aacucgcacc ucc 23
<210> 1265
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Socs siRNA
<400> 1265
uacauauacc caguaucuuu gca 23
<210> 1266
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Socs siRNA
<400> 1266
gccgacaaug cagucuccac agc 23
<210> 1267
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Socs siRNA
<400> 1267
ccccugguug uuguagcagc uua 23
<210> 1268
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Socs siRNA
<400> 1268
cugcugugca gaauccuauu uua 23
<210> 1269
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Socs siRNA
<400> 1269
ugggaugccg uguuauuuug uua 23
<210> 1270
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Socs siRNA
<400> 1270
ucgcaccucc uaccucuuca ugu 23
Claims (288)
1.一种修饰的免疫效应细胞，其包含能够降低选自以下的一种或多种内源靶基因的表达和/或功能的基因调控系统：(a)由BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS组成的组；或(b)由SOCS1和ANKRD11组成的组；
其中所述降低的一种或多种内源基因的表达和/或功能增强所述免疫效应细胞的效应子功能。
2.如权利要求1所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述基因调控系统能够降低选自以下的两种或更多种内源靶基因的表达和/或功能：(a)由BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS组成的组；(b)由SOCS1和ANKRD11组成的组。
3.一种修饰的免疫效应细胞，其包含能够降低选自由以下组成的组的一种或多种内源靶基因的表达和/或功能的基因调控系统：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR，其中所述降低的一种或多种内源基因的表达和/或功能增强所述免疫效应细胞的效应子功能。
4.如权利要求3所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述基因调控系统能够降低选自由以下组成的组的两种或更多种内源靶基因的表达和/或功能：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR。
5.如权利要求4所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6和IKZF2，并且所述内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR。
6.如权利要求1或权利要求2所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述基因调控系统还能够降低选自以下的一种或多种内源靶基因的表达和/或功能：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR。
7.如权利要求6所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述基因调控系统能够降低以下的表达和/或功能：选自由BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS组成的组的至少一种内源靶基因以及选自由IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR组成的组的至少一种内源靶基因。
8.如权利要求6所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述基因调控系统能够降低以下的表达和/或功能：选自由SOCS1和ANKRD11组成的组的至少一种内源靶基因以及选自由IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR组成的组的至少一种内源靶基因。
9.如权利要求8所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述基因调控系统能够降低SOCS1和CBLB的表达和/或功能。
10.如权利要求8所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述基因调控系统能够降低SOCS1和BCOR的表达和/或功能。
11.如权利要求8所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述基因调控系统能够降低SOCS1和TNFAIP3的表达和/或功能。
12.如权利要求8所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述基因调控系统能够降低ANKRD11和CBLB的表达和/或功能。
13.如权利要求8所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述基因调控系统能够降低ANKRD11和BCOR的表达和/或功能。
14.如权利要求8所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述基因调控系统能够降低ANKRD11和TNFAIP3的表达和/或功能。
15.如权利要求1或权利要求2所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述基因调控系统能够降低ANKRD11和SOCS1的表达和/或功能。
16.如权利要求1-15中任一项所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述基因调控系统包含(i)一种或多种核酸分子；(ii)一种或多种酶蛋白；或(iii)一种或多种指导核酸分子和酶蛋白。
17.如权利要求16所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述一种或多种核酸分子选自siRNA、shRNA、微小RNA(miR)、微小RNA拮抗剂或反义RNA。
18.如权利要求16所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述基因调控系统包含siRNA或shRNA核酸分子。
19.如权利要求18所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述一种或多种内源靶基因选自由以下组成的组：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR，并且其中所述siRNA或shRNA分子包含与由表5A和表5B中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
20.如权利要求19所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述siRNA或shRNA包含与由选自由SEQ ID NO:154-813组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
21.如权利要求18所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述一种或多种内源靶基因选自由以下组成的组：BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS，并且其中所述siRNA或shRNA分子包含与由表6A和表6B中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
22.如权利要求21所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述siRNA或shRNA包含与由选自由SEQ ID NO:814-1064组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
23.如权利要求18所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述一种或多种内源靶基因是SOCS1，并且其中所述siRNA或shRNA分子包含与由表6C和表6D中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
24.如权利要求23所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述siRNA或shRNA包含与由选自由SEQ ID NO:1088-1232组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
25.如权利要求18所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述一种或多种内源靶基因是ANKRD11，并且其中所述siRNA或shRNA分子包含与由表6E和表6F中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
26.如权利要求25所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述siRNA或shRNA包含与由选自由SEQ ID NO:1065-1087组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
27.如权利要求16所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述基因调控系统包含多种siRNA或shRNA分子并能够降低两种或更多种内源靶基因的表达和/或功能。
28.如权利要求27所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS，并且所述内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR。
29.如权利要求28所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由表6A和表6B中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由表5A和表5B中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
30.如权利要求28或29所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:814-1064组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQID NO:154-813组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
31.如权利要求27所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS，并且其中所述内源靶基因中的至少一种是CBLB。
32.如权利要求31所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:814-1064组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ IDNO:499-524组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
33.如权利要求27所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS，并且其中所述内源靶基因中的至少一种是CBLB、TNFAIP3或BCOR。
34.如权利要求27所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述内源靶基因中的至少一种是SOCS1，并且所述内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR。
35.如权利要求34所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由表6C和表6D中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由表5A和表5B中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
36.如权利要求35或权利要求35所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:1088-1232组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:154-813组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
37.如权利要求27所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述内源靶基因中的至少一种是SOCS1，并且所述内源靶基因中的至少一种是CBLB。
38.如权利要求37所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:1088-1232组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ IDNO:499-524组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
39.如权利要求27所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述内源靶基因中的至少一种是SOCS1，并且所述内源靶基因中的至少一种是CBLB、TNFAIP3或BCOR。
40.如权利要求27所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述内源靶基因中的至少一种是ANKRD11，并且所述内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR。
41.如权利要求40所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由表6E和表6F中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由表5A和表5B中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
42.如权利要求40或权利要求41所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:1065-1087组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:154-813组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
43.如权利要求27所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述内源靶基因中的至少一种是ANKRD11，并且所述内源靶基因中的至少一种是CBLB。
44.如权利要求42所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:1065-1087组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ IDNO:499-524组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
45.如权利要求27所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述内源靶基因中的至少一种是ANKRD11，并且所述内源靶基因中的至少一种是CBLB、TNFAIP3或BCOR。
46.如权利要求27所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述内源靶基因中的至少一种是SOCS1，并且所述内源靶基因中的至少一种是ANKRD11。
47.如权利要求46所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由表6C和表6D中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由表6E和表6F中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
48.如权利要求46所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:1065-1087组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ IDNO:1088-1232组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
49.如权利要求16所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述基因调控系统包含酶蛋白，并且其中所述酶蛋白已经被工程化以与所述内源基因中的一种或多种中的靶序列特异性结合。
50.如权利要求49所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述蛋白质是转录激活物样效应核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶或大范围核酸酶。
51.如权利要求16所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述基因调控系统包含指导核酸分子和酶蛋白，其中所述核酸分子是指导RNA(gRNA)分子并且所述酶蛋白是Cas蛋白或Cas直系同源物。
52.如权利要求51所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述一种或多种内源靶基因选自由以下组成的组：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR，并且其中所述gRNA分子包含与由表5A和表5B中所示的一组基因组坐标定义的核酸序列结合的靶向结构域序列。
53.如权利要求52所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述gRNA分子包含与选自由SEQID NO:154-813组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。
54.如权利要求52所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述gRNA分子包含由选自由SEQID NO：154-813组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列。
55.如权利要求51所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述一种或多种内源靶基因选自由以下组成的组：BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS，并且其中所述gRNA分子包含与由表6A和表6B中所示的一组基因组坐标定义的核酸序列结合的靶向结构域序列。
56.如权利要求55所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述gRNA分子包含与选自由SEQID NO:814-1064组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。
57.如权利要求55所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述gRNA分子包含由选自由SEQID NO：814-1064组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列。
58.如权利要求51所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述一种或多种内源靶基因是SOCS1，并且其中所述gRNA分子包含与由表6C和6D中所示的一组基因组坐标定义的核酸序列结合的靶向结构域序列。
59.如权利要求58所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述gRNA分子包含与选自由SEQID NO:1088-1232组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。
60.如权利要求58所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述gRNA分子包含由选自由SEQID NO：1088-1232组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列。
61.如权利要求51所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述一种或多种内源靶基因是ANKRD11，并且其中所述gRNA分子包含与由表6E和6F中所示的一组基因组坐标定义的核酸序列结合的靶向结构域序列。
62.如权利要求61所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述gRNA分子包含与选自由SEQID NO:1065-1087组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。
63.如权利要求61所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述gRNA分子包含由选自由SEQID NO：1065-1087组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列。
64.如权利要求51所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述基因调控系统包含多种gRNA分子并且能够降低两种或更多种内源靶基因的表达和/或功能。
65.如权利要求64所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS，并且所述内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR。
66.如权利要求65所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含与由表6A和6B中所示的一组基因组坐标定义的核酸序列结合的靶向结构域序列，并且所述多种gRNA分子中的至少一种包含与由表5A和表5B中所示的一组基因组坐标定义的核酸序列结合的靶向结构域序列。
67.如权利要求66所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:814-1064组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列，并且所述多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:154-813组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。
68.如权利要求66所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ ID NO:814-1064组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列，并且所述多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ ID NO:154-813组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列。
69.如权利要求64所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS，并且其中所述内源靶基因中的至少一种是CBLB。
70.如权利要求69所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:814-1064组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列，并且所述多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:499-524组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。
71.如权利要求69所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ ID NO:814-1064组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列，并且所述多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ ID NO:499-524组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列。
72.如权利要求64所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS，并且其中所述内源靶基因中的至少一种是CBLB、TNFAIP3或BCOR。
73.如权利要求64所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述内源靶基因中的至少一种是SOCS1，并且所述内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR。
74.如权利要求73所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含与由表6C和表6D中所示的一组基因组坐标定义的核酸序列结合的靶向结构域序列，并且所述多种gRNA分子中的至少一种包含与由表5A和表5B中所示的一组基因组坐标定义的核酸序列结合的靶向结构域序列。
75.如权利要求74所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:1088-1232组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列，并且所述多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:154-813组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。
76.如权利要求74所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ ID NO:1088-1232组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列，并且所述多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ ID NO:154-813组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列。
77.如权利要求64所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述内源靶基因中的至少一种是SOCS1，并且所述内源靶基因中的至少一种是CBLB。
78.如权利要求77所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:1088-1232组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列，并且所述多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:499-524组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。
79.如权利要求77所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ ID NO:1088-1232组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列，并且所述多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ ID NO:499-524组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列。
80.如权利要求64所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述内源靶基因中的至少一种是SOCS1，并且所述内源靶基因中的至少一种是CBLB、TNFAIP3或BCOR。
81.如权利要求64所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述内源靶基因中的至少一种是ANKRD11，并且所述内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR。
82.如权利要求81所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含与由表6E和表6F中所示的一组基因组坐标定义的核酸序列结合的靶向结构域序列，并且所述多种gRNA分子中的至少一种包含与由表5A和表5B中所示的一组基因组坐标定义的核酸序列结合的靶向结构域序列。
83.如权利要求82所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:1065-1087组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列，并且所述多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:154-813组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。
84.如权利要求82所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ ID NO:1065-1087组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列，并且所述多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:154-813组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。
85.如权利要求64所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述内源靶基因中的至少一种是ANKRD11，并且所述内源靶基因中的至少一种是CBLB。
86.如权利要求85所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:1065-1087组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列，并且所述多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:499-524组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。
87.如权利要求85所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ ID NO:1065-1087组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列，并且所述多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ ID NO:499-524组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列。
88.如权利要求64所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述内源靶基因中的至少一种是ANKRD11，并且所述内源靶基因中的至少一种是CBLB、TNFAIP3或BCOR。
89.如权利要求64所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述内源靶基因中的至少一种是SOCS1，并且所述内源靶基因中的至少一种是ANKRD11。
90.如权利要求46所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含与由表6E和表6F中所示的一组基因组坐标定义的核酸序列结合的靶向结构域序列，并且所述多种gRNA分子中的至少一种包含与由表6C和表6D中所示的一组基因组坐标定义的核酸序列结合的靶向结构域序列。
91.如权利要求46所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:1065-1087组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列，并且所述多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:1088-1232组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。
92.如权利要求46所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ ID NO:1065-1087组成的组的DNA序列编码的靶向结构域序列，并且所述多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ ID NO:1088-1232组成的组的DNA序列编码的靶向结构域序列。
93.如权利要求51-92中任一项所述的修饰的免疫效应细胞，其中：
a.所述Cas蛋白是包含两个酶活性结构域的野生型Cas蛋白并且能够诱导双链DNA断裂；
b.所述Cas蛋白是包含一个酶活性结构域的Cas切口酶突变体并且能够诱导单链DNA断裂；或者
c.所述Cas蛋白是失活的Cas蛋白(dCas)并且与能够调节所述一种或多种内源靶基因的表达的异源蛋白相关联。
94.如权利要求51-93中任一项所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述Cas蛋白是Cas9蛋白。
95.如权利要求93所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述异源蛋白选自由以下组成的组：MAX相互作用蛋白1(MXI1)、Krüppel相关盒(KRAB)结构域、甲基-CpG结合蛋白2(MECP2)和四个串联的mSin3结构域(SID4X)。
96.如权利要求49-95中任一项所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述基因调控系统将失活突变引入所述一种或多种内源靶基因中。
97.如权利要求96所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述失活突变包括在所述两种或更多种内源基因的基因组序列中缺失、取代或插入一个或多个核苷酸。
98.如权利要求97所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述缺失是所述两种或更多种内源靶基因的部分或完全缺失。
99.如权利要求97所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述失活突变是移码突变。
100.如权利要求96-99中任一项所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述失活突变降低所述两种或更多种内源靶基因的表达和/或功能。
101.如权利要求1-100中任一项所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述基因调控系统通过微流体装置通过细胞膜的转染、转导、电穿孔或物理破坏引入所述免疫效应细胞中。
102.如权利要求101所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述基因调控系统以编码所述系统的一种或多种组分的多核苷酸、蛋白质或核糖核蛋白(RNP)复合物的形式引入。
103.一种修饰的免疫效应细胞，其包含降低的选自由以下组成的组的一种或多种内源基因的表达和/或功能：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR，其中所述降低的一种或多种内源基因的表达和/或功能增强所述免疫效应细胞的效应子功能
104.一种修饰的免疫效应细胞，其包含降低的选自以下的一种或多种内源基因的表达和/或功能：(a)由IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6和IKZF2组成的组；或(b)由CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR组成的组，
其中所述降低的一种或多种内源基因的表达和/或功能增强所述免疫效应细胞的效应子功能。
105.一种修饰的免疫效应细胞，其包含降低的选自以下的一种或多种内源基因的表达和/或功能：(a)由BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS组成的组；(b)SOCS1；或(c)ANKRD11；
其中所述降低的一种或多种内源基因的表达和/或功能增强所述修饰的免疫效应细胞的效应子功能。
106.如权利要求105所述的修饰的免疫效应细胞，其包含降低的SOCS和ANKRD11的表达和/或功能。
107.一种修饰的免疫效应细胞，其包含降低的选自以下的两种或更多种靶基因的表达和/或功能：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR，其中所述降低的两种或更多种内源基因的表达和/或功能增强所述修饰的免疫效应细胞的效应子功能。
108.如权利要求107所述的修饰的免疫效应细胞，其包含降低的CBLB和BCOR的表达和/或功能。
109.一种修饰的免疫效应细胞，其包含降低的两种或更多种靶基因的表达和/或功能，其中至少一种靶基因选自由以下组成的组：BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS，并且其中至少一种靶基因选自由以下组成的组：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR，其中所述降低的两种或更多种内源基因的表达和/或功能增强所述修饰的免疫效应细胞的效应子功能。
110.一种修饰的免疫效应细胞，其包含降低的两种或更多种靶基因的表达和/或功能，其中至少一种靶基因选自由以下组成的组：BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS，并且其中至少一种靶基因是CBLB。
111.一种修饰的免疫效应细胞，其包含降低的两种或更多种靶基因的表达和/或功能，其中至少一种靶基因是SOCS1，并且其中至少一种靶基因选自由以下组成的组：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR，其中所述降低的两种或更多种内源基因的表达和/或功能增强所述修饰的免疫效应细胞的效应子功能。
112.如权利要求111所述的修饰的免疫效应细胞，其包含降低的SOCS1和CBLB的表达和/或功能。
113.如权利要求111所述的修饰的免疫效应细胞，其包含降低的SOCS1和TNFAIP3的表达和/或功能。
114.如权利要求111所述的修饰的免疫效应细胞，其包含降低的SOCS1和BCOR的表达和/或功能。
115.一种修饰的免疫效应细胞，其包含降低的两种或更多种靶基因的表达和/或功能，其中至少一种靶基因是ANKRD11，并且其中至少一种靶基因选自由以下组成的组：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR，其中所述降低的两种或更多种内源基因的表达和/或功能增强所述修饰的免疫效应细胞的效应子功能。
116.如权利要求115所述的修饰的免疫效应细胞，其包含降低的ANKRD11和CBLB的表达和/或功能。
117.如权利要求115所述的修饰的免疫效应细胞，其包含降低的ANKRD11和TNFAIP3的表达和/或功能。
118.如权利要求115所述的修饰的免疫效应细胞，其包含降低的ANKRD11和BCOR的表达和/或功能。
119.一种修饰的免疫效应细胞，其包含在选自由以下组成的组的一种或多种内源基因中的失活突变：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR。
120.一种修饰的免疫效应细胞，其包含在选自以下的一种或多种内源基因中的失活突变：(a)由IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6和IKZF2组成的组；或(b)由CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR组成的组。
121.一种修饰的免疫效应细胞，其包含在选自以下的一种或多种内源基因中的失活突变：(a)由BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS组成的组；或(b)SOCS1；或(c)ANKRD11。
122.如权利要求121所述的修饰的免疫效应细胞，其包含在SOCS1和ANKRD11中的失活突变。
123.一种修饰的免疫效应细胞，其包含在选自以下的两种或更多种靶基因中的失活突变：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR。
124.如权利要求123所述的修饰的免疫效应细胞，其包含在所述CBLB和BCOR基因中的失活突变。
125.一种修饰的免疫效应细胞，其包含在两种或更多种靶基因中的失活突变，其中至少一种靶基因选自由以下组成的组：BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS，并且至少一种靶基因选自由以下组成的组：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR。
126.一种修饰的免疫效应细胞，其包含在两种或更多种靶基因中的失活突变，其中至少一种靶基因选自由以下组成的组：BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS，并且至少一种靶基因是CBLB。
127.一种修饰的免疫效应细胞，其包含在两种或更多种靶基因中的失活突变，其中至少一种靶基因是SOCS1，并且至少一种靶基因选自由以下组成的组：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR。
128.如权利要求127所述的修饰的免疫效应细胞，其包含在所述SOCS1和TNFAIP3基因中的失活突变。
129.如权利要求127所述的修饰的免疫效应细胞，其包含在所述SOCS1和BCOR基因中的失活突变。
130.如权利要求127所述的修饰的免疫效应细胞，其包含在所述SOCS1和CBLB基因中的失活突变。
131.一种修饰的免疫效应细胞，其包含在两种或更多种靶基因中的失活突变，其中至少一种靶基因是ANKRD11，并且至少一种靶基因选自由以下组成的组：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR。
132.如权利要求131所述的修饰的免疫效应细胞，其包含在所述ANKRD11和TNFAIP3基因中的失活突变。
133.如权利要求131所述的修饰的免疫效应细胞，其包含在所述ANKRD11和BCOR基因中的失活突变。
134.如权利要求131所述的修饰的免疫效应细胞，其包含在所述ANKRD11和CBLB基因中的失活突变。
135.如权利要求119-132中任一项所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述失活突变包括在所述两种或更多种内源基因的基因组序列中缺失、取代或插入一个或多个核苷酸。
136.如权利要求135所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述缺失是所述两种或更多种内源靶基因的部分或完全缺失。
137.如权利要求135所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述失活突变是移码突变。
138.如权利要求119-137中任一项所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述失活突变降低所述两种或更多种内源靶基因的表达和/或功能。
139.如权利要求1-138中任一项所述的修饰的免疫效应细胞，其中与未修饰或对照免疫效应细胞相比，所述一种或多种内源靶基因的表达降低了至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
140.如权利要求1-138中任一项所述的修饰的免疫效应细胞，其中与未修饰或对照免疫效应细胞相比，所述一种或多种内源靶基因的功能降低了至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
141.如权利要求1-140中任一项所述的修饰的免疫效应细胞，其还包含展示在细胞表面上的工程化免疫受体。
142.如权利要求141所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述工程化免疫受体是包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域的CAR
143.如权利要求141所述的修饰的免疫效应细胞，或其中所述工程化免疫受体是工程化TCR。
144.如权利要求141-143中任一项所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述工程化免疫受体与靶细胞上表达的抗原特异性结合，其中所述抗原是肿瘤相关抗原。
145.如权利要求1-144中任一项所述的修饰的免疫效应细胞，其还包含表达免疫活化分子的外源转基因。
146.如权利要求145所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述免疫活化分子选自由以下组成的组：细胞因子、趋化因子、共刺激分子、活化肽、抗体或其抗原结合片段。
147.如权利要求146所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述抗体或其结合片段与由NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4或PDCD1编码的蛋白质特异性结合并抑制其功能。
148.如权利要求1-147中任一项所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述免疫效应细胞是其中所述免疫效应细胞是选自T细胞、天然杀伤(NK)细胞、NKT细胞的淋巴细胞。
149.如权利要求148所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述淋巴细胞是肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
150.如权利要求1-149中任一项所述的修饰的免疫效应细胞，其中所述效应子功能选自细胞增殖、细胞存活力、肿瘤浸润、细胞毒性、抗肿瘤免疫应答和/或对耗竭的抗性。
151.一种组合物，其包含如权利要求1-150中任一项所述的修饰的免疫效应细胞。
152.如权利要求151所述的组合物，其还包含药学上可接受的载剂或稀释剂。
153.如权利要求151或152所述的组合物，其中所述组合物包含至少1x104、1x105或1x106个修饰的免疫效应细胞。
154.如权利要求151-153中任一项所述的组合物，其适合施用于有需要的受试者。
155.如权利要求151-154中任一项所述的组合物，其包含来源于所述有需要的受试者的自体免疫效应细胞。
156.如权利要求151-154中任一项所述的组合物，其包含来源于供体受试者的同种异体免疫效应细胞。
157.一种基因调控系统，其能够降低选自以下的细胞中的一种或多种内源靶基因的表达和/或功能：(a)由IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6和IKZF2组成的组；或(b)由CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR组成的组，
其中所述系统包含(i)核酸分子；(ii)酶；或(iii)指导核酸分子和酶蛋白
158.一种基因调控系统，其能够降低选自以下的细胞中的一种或多种内源靶基因的表达：(a)由BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS组成的组；(b)SOCS1；或(b)ANKRD11，
其中所述系统包含(i)核酸分子；(ii)酶；或(iii)指导核酸分子和酶蛋白。
159.如权利要求157或权利要求158所述的基因调控系统，其中所述系统包含指导RNA(gRNA)核酸分子和Cas核酸内切酶。
160.如权利要求159所述的基因调控系统，其中所述一种或多种内源靶基因选自IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6和IKZF2，或选自CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR，并且其中所述gRNA分子包含与由表5A和表5B中所示的一组基因组坐标定义的靶DNA序列互补的靶向结构域序列。
161.如权利要求160所述的基因调控系统，其中所述一种或多种内源靶基因选自IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6和IKZF2，并且其中所述gRNA分子包含与选自由SEQ ID NO:154-498组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。
162.如权利要求160或权利要求161所述的基因调控系统，其中所述gRNA分子包含由选自由SEQ ID NO:154-498组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列。
163.如权利要求160所述的基因调控系统，其中所述一种或多种内源靶基因选自CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR，并且所述gRNA分子包含与选自由SEQ ID NO:499-813组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。
164.如权利要求160或权利要求163所述的基因调控系统，其中所述gRNA分子包含由选自由SEQ ID NO:499-813组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列。
165.如权利要求159所述的基因调控系统，其中所述一种或多种内源靶基因选自BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS，并且其中所述gRNA分子包含与表6A和表6B中所示的一组基因组坐标定义的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。
166.如权利要求165所述的基因调控系统，其中所述gRNA分子包含与选自由SEQ IDNO:814-1064组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。
167.如权利要求165或权利要求166所述的基因调控系统，其中所述gRNA分子包含由选自由SEQ ID NO:814-1064组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列。
168.如权利要求159所述的基因调控系统，其中所述一种或多种内源靶基因包括SOCS1，其中所述gRNA分子包含与由表6C和表6D中所示的一组基因组坐标定义的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。
169.如权利要求168所述的基因调控系统，其中所述gRNA分子包含与选自由SEQ IDNO:1088-1232组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。
170.如权利要求168或权利要求169所述的基因调控系统，其中所述gRNA分子包含由选自由SEQ ID NO:1088-1232组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列。
171.如权利要求159所述的基因调控系统，其中所述一种或多种内源靶基因包括ANKRD11，其中所述gRNA分子包含与由表6E和表6F中所示的一组基因组坐标定义的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。
172.如权利要求171所述的基因调控系统，其中所述gRNA分子包含与选自由SEQ IDNO:1065-1087组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。
173.如权利要求171或权利要求172所述的基因调控系统，其中所述gRNA分子包含由选自由SEQ ID NO:1065-1087组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列。
174.如权利要求157或权利要求158所述的基因调控系统，其中所述基因调控系统包含siRNA或shRNA核酸分子。
175.如权利要求174所述的基因调控系统，其中所述一种或多种内源靶基因选自IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6和IKZF2，或选自CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR，并且其中所述siRNA或shRNA分子包含与由表5A和表5B中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
176.如权利要求175所述的基因调控系统，其中所述一种或多种内源靶基因选自IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6和IKZF2，并且其中所述siRNA或shRNA分子包含与由选自SEQ ID NO:154-498的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
177.如权利要求175所述的基因调控系统，其中所述一种或多种内源靶基因选自CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR，并且其中所述siRNA或shRNA分子包含与由选自SEQ ID NO:499-813的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
178.如权利要求174所述的基因调控系统，其中所述一种或多种内源靶基因选自BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS，并且其中所述siRNA或shRNA分子包含与由表6A和表6B中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
179.如权利要求178所述的基因调控系统，其中所述siRNA或shRNA分子包含与由选自SEQ ID NO:814-1064的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
180.如权利要求174所述的基因调控系统，其中所述一种或多种内源靶基因包括SOCS1，并且其中所述siRNA或shRNA分子包含与由表6C和表6D中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
181.如权利要求180所述的基因调控系统，其中所述siRNA或shRNA分子包含与由选自SEQ ID NO:1088-1232的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
182.如权利要求174所述的基因调控系统，其中所述一种或多种内源靶基因包括ANKRD11，并且其中所述siRNA或shRNA分子包含与由表6E和表6F中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
183.如权利要求182所述的基因调控系统，其中所述siRNA或shRNA分子包含与由选自SEQ ID NO:1065-1087的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
184.一种基因调控系统，其能够降低细胞中的两种或更多种内源靶基因的表达和/或功能，
其中所述内源靶基因中的至少一种选自：(a)由BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS组成的组；(b)SOCS1；或(b)ANKRD11；
并且其中所述内源靶基因中的至少一种选自：(a)由IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6和IKZF2组成的组；或(b)由CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR组成的组，
其中所述系统包含(i)核酸分子；(ii)酶；或(iii)指导核酸分子和酶蛋白
185.如权利要求184所述的基因调控系统，其中所述系统包含多种指导RNA(gRNA)核酸分子和Cas核酸内切酶。
186.如权利要求185所述的基因调控系统，其中所述内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS，并且所述内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR。
187.如权利要求186所述的基因调控系统，其中所述多种gRNA中的至少一种与由表6A和表6B中所示的一组基因组坐标定义的靶DNA序列结合，并且其中所述多种gRNA中的至少一种与由表5A和表5B中所示的一组基因组坐标定义的靶DNA序列结合。
188.如权利要求186或权利要求187所述的基因调控系统，其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:814-1064组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列，并且其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:154-498或SEQID NO:499-813组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。
189.如权利要求186或权利要求187所述的基因调控系统，其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ ID NO:814-1064组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列，并且其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含由选自SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813的核酸序列编码的靶向结构域序列。
190.如权利要求185所述的基因调控系统，其中所述内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS，并且其中所述内源靶基因中的至少一种是CBLB。
191.如权利要求190所述的基因调控系统，其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:814-1064组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列，并且其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:499-524组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。
192.如权利要求190所述的基因调控系统，其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ ID NO:814-1064组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列，并且其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含由选自SEQ ID NO:499-524的核酸序列编码的靶向结构域序列。
193.如权利要求185所述的基因调控系统，其中所述内源靶基因中的至少一种是SOCS1，并且所述内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR。
194.如权利要求193所述的基因调控系统，其中所述多种gRNA中的至少一种与由表6C和表6D中所示的一组基因组坐标定义的靶DNA序列结合，并且其中所述多种gRNA中的至少一种与由表5A和表5B中所示的一组基因组坐标定义的靶DNA序列结合。
195.如权利要求193或权利要求194所述的基因调控系统，其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:1088-1232组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列，并且其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:154-498或SEQID NO:499-813组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。
196.如权利要求193或权利要求194所述的基因调控系统，其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ ID NO:1088-1232组成的组的DNA序列编码的靶向结构域序列，并且其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813组成的组的DNA序列编码的靶向结构域序列。
197.如权利要求185所述的基因调控系统，其中所述内源靶基因中的至少一种是SOCS1，并且所述内源靶基因中的至少一种是CBLB。
198.如权利要求185所述的基因调控系统，其中所述内源靶基因中的至少一种是SOCS1，并且所述内源靶基因中的至少一种是TNFAIP3。
199.如权利要求185所述的基因调控系统，其中所述内源靶基因中的至少一种是SOCS1，并且所述内源靶基因中的至少一种是BCOR。
200.如权利要求197所述的基因调控系统，其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:1088-1232组成的组的靶核酸序列结合的靶向结构域序列，并且其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自SEQ ID NO:499-524的靶核酸序列结合的靶向结构域序列。
201.如权利要求197所述的基因调控系统，其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ ID NO:1088-1232组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列，并且其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含由选自SEQ ID NO:499-524的核酸序列编码的靶向结构域序列。
202.如权利要求185所述的基因调控系统，其中所述内源靶基因中的至少一种是ANKRD11，并且所述内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR。
203.如权利要求202所述的基因调控系统，其中所述多种gRNA中的至少一种与由表6E和表6F中所示的一组基因组坐标定义的靶DNA序列结合，并且其中所述多种gRNA中的至少一种与由表5A和表5B中所示的一组基因组坐标定义的靶DNA序列结合。
204.如权利要求202或权利要求203所述的基因调控系统，其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:1065-1087组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列，并且其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:154-498或SEQID NO:499-813组成的组的靶DNA序列结合的靶向结构域序列。
205.如权利要求202或权利要求203所述的基因调控系统，其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ ID NO:1065-1087组成的组的DNA序列编码的靶向结构域序列，并且其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813组成的组的DNA序列编码的靶向结构域序列。
206.如权利要求185所述的基因调控系统，其中所述内源靶基因中的至少一种是ANKRD11，并且所述内源靶基因中的至少一种是CBLB。
207.如权利要求185所述的基因调控系统，其中所述内源靶基因中的至少一种是ANKRD11，并且所述内源靶基因中的至少一种是TNFAIP3。
208.如权利要求185所述的基因调控系统，其中所述内源靶基因中的至少一种是ANKRD11，并且所述内源靶基因中的至少一种是BCOR。
209.如权利要求206所述的基因调控系统，其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:1065-1087组成的组的靶核酸序列结合的靶向结构域序列，并且其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自SEQ ID NO:499-524的靶核酸序列结合的靶向结构域序列。
210.如权利要求206所述的基因调控系统，其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ ID NO:1065-1087组成的组的核酸序列编码的靶向结构域序列，并且其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含由选自SEQ ID NO:499-524的核酸序列编码的靶向结构域序列。
211.如权利要求185所述的基因调控系统，其中所述内源靶基因中的至少一种是ANKRD11，并且所述内源靶基因中的至少一种是SOCS1。
212.如权利要求211所述的基因调控系统，其中所述多种gRNA中的至少一种与由表6E和表6F中所示的一组基因组坐标定义的靶DNA序列结合，并且其中所述多种gRNA中的至少一种与由表6C和表6D中所示的一组基因组坐标定义的靶DNA序列结合。
213.如权利要求211所述的基因调控系统，其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:1065-1087组成的组的靶核酸序列结合的靶向结构域序列，并且其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含与由选自SEQ ID NO:1088-1232的靶核酸序列结合的靶向结构域序列。
214.如权利要求211所述的基因调控系统，其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含由选自由SEQ ID NO:1065-1087组成的组的DNA序列编码的靶向结构域序列，并且其中所述多种gRNA分子中的至少一种包含由选自SEQ ID NO:1088-1232的DNA序列编码的靶向结构域序列。
215.如权利要求157-214中任一项所述的基因调控系统，其中所述Cas蛋白是：
a.包含两个酶活性结构域的野生型Cas蛋白并且能够诱导双链DNA断裂；
b.包含一个酶活性结构域的Cas切口酶突变体并且能够诱导单链DNA断裂；
c.失活的Cas蛋白(dCas)并且与能够调节所述一种或多种内源靶基因的表达的异源蛋白相关联。
216.如权利要求215所述的基因调控系统，其中所述异源蛋白选自由以下组成的组：MAX相互作用蛋白1(MXI1)、Krüppel相关盒(KRAB)结构域和四个串联的mSin3结构域(SID4X)。
217.如权利要求215或权利要求216所述的基因调控系统，其中所述Cas蛋白是Cas9蛋白。
218.如权利要求184所述的基因调控系统，其中所述系统包含核酸分子，并且其中所述核酸分子是siRNA、shRNA、微小RNA(miR)、微小RNA拮抗剂或反义RNA。
219.如权利要求218所述的基因调控系统，其中所述系统包含多种shRNA或siRNA分子。
220.如权利要求219所述的基因调控系统，其中所述内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS，并且所述内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR。
221.如权利要求220所述的基因调控系统，其中所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由表6A和表6B中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由表5A和表5B中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
222.如权利要求220或权利要求221所述的基因调控系统，其中所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:814-1064组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且其中所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
223.如权利要求219所述的基因调控系统，其中所述内源靶基因中的至少一种选自由由以下组成的组：BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS，并且其中所述内源靶基因中的至少一种是CBLB。
224.如权利要求223所述的基因调控系统，其中所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:814-1064组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且其中所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ IDNO:499-524组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
225.如权利要求219所述的基因调控系统，其中所述内源靶基因中的至少一种是SOCS1，并且所述内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR。
226.如权利要求225所述的基因调控系统，其中所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由表6C和表6D中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由表5A和表5B中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
227.如权利要求225或权利要求226所述的基因调控系统，其中所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:1088-1232组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
228.如权利要求219所述的基因调控系统，其中所述内源靶基因中的至少一种是SOCS1，并且所述内源靶基因中的至少一种是CBLB。
229.如权利要求228所述的基因调控系统，其中所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:1088-1232组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ IDNO:499-524组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
230.如权利要求219所述的基因调控系统，其中所述内源靶基因中的至少一种是ANKRD11，并且所述内源靶基因中的至少一种选自由以下组成的组：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR。
231.如权利要求230所述的基因调控系统，其中所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由表6E和表6F中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由表5A和表5B中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸
232.如权利要求230或权利要求231所述的基因调控系统，其中所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:1065-1087组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
233.如权利要求219所述的基因调控系统，其中所述内源靶基因中的至少一种是ANKRD11，并且所述内源靶基因中的至少一种是CBLB。
234.如权利要求219所述的基因调控系统，其中所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:1065-1087组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ IDNO:499-524组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
235.如权利要求219所述的基因调控系统，其中所述内源靶基因中的至少一种是ANKRD11，并且所述内源靶基因中的至少一种是SOCS1。
236.如权利要求235所述的基因调控系统，其中所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由表6C和表6D中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由表6E和表6F中所示的一组基因组坐标定义的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
237.如权利要求235所述的基因调控系统，其中所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ ID NO:1088-1232组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸，并且所述多种siRNA或shRNA分子中的至少一种包含与由选自由SEQ IDNO:1065-1087组成的组的DNA序列编码的RNA序列结合的约19-30个核苷酸。
238.如权利要求157、158或184所述的基因调控系统，其中所述系统包含蛋白质，所述蛋白质含有DNA结合结构域和酶结构域，并且选自锌指核酸酶和转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)。
239.一种基因调控系统，其包含编码一种或多种gRNA的载体和编码Cas核酸内切酶蛋白的载体，其中所述一种或多种gRNA包含由选自以下的核酸序列编码的靶向结构域序列：SEQ ID NO:814-1064、SEQ ID NO:1065-1087、SEQ ID NO:1088-1232、SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813。
240.一种基因调控系统，其包含编码多种gRNA的载体以及编码Cas核酸内切酶蛋白的载体，
其中所述多种gRNA中的至少一种包含由选自SEQ ID NO:814-1064、SEQ ID NO:1065-1087和SEQ ID NO:1088-1232的核酸序列编码的靶向结构域序列，并且
其中所述多种gRNA中的至少一种包含由选自SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813的核酸序列编码的靶向结构域序列。
241.一种基因调控系统，其包含编码一种或多种gRNA的载体和编码Cas核酸内切酶蛋白的mRNA分子，其中所述一种或多种gRNA包含由选自以下的核酸序列编码的靶向结构域序列：SEQ ID NO:814-1064、SEQ ID NO:1065-1087、SEQ ID NO:1088-1232、SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813。
242.一种基因调控系统，其包含编码多种gRNA的载体以及编码Cas核酸内切酶蛋白的mRNA分子，
其中所述多种gRNA中的至少一种包含由选自SEQ ID NO:814-1064、SEQ ID NO:1065-1087和SEQ ID NO:1088-1232的核酸序列编码的靶向结构域序列，并且
其中所述多种gRNA中的至少一种包含由选自SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813的核酸序列编码的靶向结构域序列。
243.一种基因调控系统，其包含一种或多种gRNA和Cas核酸内切酶蛋白，
其中所述一种或多种gRNA包含由选自以下的核酸序列编码的靶向结构域序列：SEQ IDNO:814-1064、SEQ ID NO:1065-1087、SEQ ID NO:1088-1232、SEQ ID NO:154-498或SEQ IDNO:499-813，并且
其中所述一种或多种gRNA和所述Cas核酸内切酶蛋白复合以形成核糖核蛋白(RNP)复合物。
244.一种基因调控系统，其包含多种gRNA和Cas核酸内切酶蛋白：
其中所述多种gRNA中的至少一种包含由选自SEQ ID NO:814-1064、SEQ ID NO:1065-1087和SEQ ID NO:1088-1232的核酸序列编码的靶向结构域序列，
其中所述多种gRNA中的至少一种包含由选自SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813的核酸序列编码的靶向结构域序列，并且
其中所述一种或多种gRNA和所述Cas核酸内切酶蛋白复合以形成核糖核蛋白(RNP)复合物。
245.一种试剂盒，其包含如权利要求157-244中任一项所述的基因调控系统。
246.一种gRNA核酸分子，其包含与内源靶基因中的靶序列互补的靶向域核酸序列，所述内源靶基因选自：(a)由BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS组成的组；(b)SOCS1；(c)ANKRD11；(d)由IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6和IKZF2组成的组；或(e)由CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR组成的组。
247.如权利要求246所述的gRNA分子，其中：
a.所述内源基因选自由以下组成的组：BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3和GNAS，并且所述gRNA包含与位于选自表6A和6B所示的基因组坐标处的靶DNA序列互补的靶向结构域序列；
b.所述内源基因是SOCS1，并且所述gRNA包含与位于选自表6C和表6D所示的基因组坐标处的靶DNA序列互补的靶向结构域序列；
c.所述内源基因是ANKRD11，并且所述gRNA包含与位于选自表6E和表6F所示的基因组坐标处的靶DNA序列互补的靶向结构域序列；
d.所述内源基因选自由以下组成的组：IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6和IKZF2，并且所述gRNA包含与位于选自表5A和表5B所示的基因组坐标处的靶DNA序列互补的靶向结构域序列；或者
e.所述内源基因选自由以下组成的组：CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1和BCOR，并且所述gRNA包含与位于选自表5A和表5B所示的基因组坐标处的靶DNA序列互补的靶向结构域序列。
248.如权利要求246-252中任一项所述的gRNA分子，其中所述gRNA包含与选自以下的靶DNA序列结合的靶向结构域序列：SEQ ID NO:814-1064、SEQ ID NO:1088-1232、SEQ IDNO:1065-1087、SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813。
249.如权利要求246-252中任一项所述的gRNA分子，其中所述gRNA包含由选自以下的序列编码的靶向结构域序列：SEQ ID NO:814-1064、SEQ ID NO:1088-1232、SEQ ID NO:1065-1087、SEQ ID NO:154-498或SEQ ID NO:499-813。
250.如权利要求246-249中任一项所述的gRNA分子，其中所述靶序列包含PAM序列。
251.如权利要求246-250中任一项所述的gRNA分子，其中所述gRNA是模块化gRNA分子。
252.如权利要求246-250中任一项所述的gRNA分子，其中所述gRNA是双gRNA分子。
253.如权利要求246-252中任一项所述的gRNA分子，其中所述靶向结构域的长度为16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或更多个核苷酸。
254.如权利要求246-253中任一项所述的gRNA分子，其包含在其5'末端处或附近(例如，在其5'末端的1-10、1-5或1-2个核苷酸内)的修饰和/或在其3'末端处或附近(例如，在其3'末端的1-10、1-5或1-2个核苷酸内)的修饰。
255.如权利要求254所述的gRNA分子，其中所述修饰的gRNA在引入T细胞中时表现出增加的对核酸酶的稳定性。
256.如权利要求254或权利要求255所述的gRNA分子，其中所述修饰的gRNA在引入T细胞中时表现出降低的先天性免疫应答。
257.一种多核苷酸分子，其编码如权利要求246-256中任一项所述的gRNA分子。
258.一种组合物，其包含一种或多种根据权利要求246-256中任一项所述的gRNA分子或如权利要求257所述的多核苷酸。
259.一种试剂盒，其包含如权利要求246-256中任一项所述的gRNA分子或如权利要求257所述的多核苷酸。
260.一种产生修饰的免疫效应细胞的方法，其包括：
a.从受试者获得免疫效应细胞；
b.将如权利要求157-244中任一项所述的基因调控系统引入所述免疫效应细胞中；以及
c.培养所述免疫效应细胞，使得一种或多种内源靶基因的表达和/或功能与未修饰的免疫效应细胞相比降低。
261.一种产生修饰的免疫效应细胞的方法，其包括将如权利要求157-244中任一项所述的基因调控系统引入所述免疫效应细胞中。
262.如权利要求260或261所述的方法，其还包括引入编码选自CAR和TCR的工程化免疫受体的多核苷酸序列。
263.如权利要求262所述的方法，其中所述基因调控系统和/或编码所述工程化免疫受体的所述多核苷酸通过微流体装置通过细胞膜的转染、转导、电穿孔或物理破坏引入所述免疫效应细胞中。
264.如权利要求260-263中任一项所述的方法，其中所述基因调控系统以编码所述系统的一种或多种组分的多核苷酸序列、蛋白质或核糖核蛋白(RNP)复合物的形式引入。
265.一种产生修饰的免疫效应细胞的方法，其包括：
a.扩增培养中的免疫效应细胞群体；以及
b.将如权利要求157-244中任一项所述的基因调控系统引入所述免疫效应细胞群体中。
266.如权利要求265所述的方法，其还包括从受试者获得所述免疫效应细胞群体。
267.如权利要求265或权利要求266所述的方法，其中在扩增之前、期间或之后将所述基因调控系统引入所述免疫效应细胞群体中。
268.如权利要求265或权利要求266所述的方法，其中所述免疫效应细胞群体的扩增包括第一轮扩增和第二轮扩增。
269.如权利要求268所述的方法，其中在所述第一轮扩增之前、期间或之后，将所述基因调控系统引入所述免疫效应细胞群体中。
270.如权利要求268所述的方法，其中在所述第二轮扩增之前、期间或之后，将所述基因调控系统引入所述免疫效应细胞群体中。
271.如权利要求268所述的方法，其中在所述第一轮和第二轮扩增之前，将所述基因调控系统引入所述免疫效应细胞群体中。
272.如权利要求268所述的方法，其中在所述第一轮和第二轮扩增之后，将所述基因调控系统引入所述免疫效应细胞群体中。
273.如权利要求268所述的方法，其中在所述第一轮扩增之后和所述第二轮扩增之前，将所述基因调控系统引入所述免疫效应细胞群体中。
274.一种治疗有需要的受试者中的疾病或病症的方法，其包括施用有效量的如权利要求1-150中任一项所述的修饰的免疫效应细胞或如权利要求151-156中任一项所述的组合物。
275.如权利要求274所述的方法，其中所述疾病或病症是细胞增殖性病症、炎性病症或感染性疾病。
276.如权利要求274所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症或病毒感染。
277.如权利要求276所述的方法，其中所述癌症选自白血病、淋巴瘤或实体瘤。
278.如权利要求277所述的方法，其中所述实体瘤是黑素瘤、胰腺肿瘤、膀胱肿瘤、肺肿瘤或转移、结直肠癌或头颈癌。
279.如权利要求276-278中任一项所述的方法，其中所述癌症是PD1抗性或不敏感性癌症。
280.如权利要求276-279中任一项所述的方法，其中所述受试者先前已经用PD1抑制剂或PDL1抑制剂进行治疗。
281.如权利要求276-280中任一项所述的方法，其还包括向所述受试者施用与由NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4或PDCD1编码的蛋白质特异性结合并抑制其功能的抗体或其结合片段。
282.如权利要求274-281中任一项所述的方法，其中所述修饰的免疫效应细胞对于所述受试者是自体的。
283.如权利要求274-281中任一项所述的方法，其中所述修饰的免疫效应细胞对于所述受试者是同种异体的。
284.一种杀伤癌性细胞的方法，其包括将所述癌性细胞暴露于根据权利要求1-150中任一项所述的修饰的免疫效应细胞或如权利要求151-156中任一项所述的组合物。
285.如权利要求284所述的方法，其中所述暴露是在体外、在体内或离体的。
286.一种增强免疫效应细胞的一种或多种效应子功能的方法，其包括将如权利要求157-244中任一项所述的基因调控系统引入所述免疫效应细胞中。
287.一种增强免疫效应细胞的一种或多种效应子功能的方法，其包括将如权利要求157-244中任一项所述的基因调控系统引入所述免疫效应细胞中，其中与未修饰的免疫效应细胞相比，所述修饰的免疫效应细胞表现出一种或多种增强的效应子功能。
288.如权利要求287所述的方法，其中所述一种或多种效应子功能选自细胞增殖、细胞存活力、细胞毒性、肿瘤浸润、增加的细胞因子产量、抗肿瘤免疫应答和/或对耗竭的抗性。
Applications Claiming Priority (21)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201862643578P | 2018-03-15 | 2018-03-15 | |
| US201862643584P | 2018-03-15 | 2018-03-15 | |
| US62/643,578 | 2018-03-15 | ||
| US62/643,584 | 2018-03-15 | ||
| US201862692016P | 2018-06-29 | 2018-06-29 | |
| US201862692010P | 2018-06-29 | 2018-06-29 | |
| US62/692,016 | 2018-06-29 | ||
| US62/692,010 | 2018-06-29 | ||
| US201862736185P | 2018-09-25 | 2018-09-25 | |
| US62/736,185 | 2018-09-25 | ||
| US201862768428P | 2018-11-16 | 2018-11-16 | |
| US201862768441P | 2018-11-16 | 2018-11-16 | |
| US62/768,428 | 2018-11-16 | ||
| US62/768,441 | 2018-11-16 | ||
| US201962790192P | 2019-01-09 | 2019-01-09 | |
| US201962790179P | 2019-01-09 | 2019-01-09 | |
| US62/790,192 | 2019-01-09 | ||
| US62/790,179 | 2019-01-09 | ||
| US201962804261P | 2019-02-12 | 2019-02-12 | |
| US62/804,261 | 2019-02-12 | ||
| PCT/US2019/022364 WO2019178420A1 (en) | 2018-03-15 | 2019-03-14 | Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112040986A true CN112040986A (zh) | 2020-12-04 |
Family
ID=67903889
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201980019397.XA Pending CN112040986A (zh) | 2018-03-15 | 2019-03-14 | 用于改进的免疫疗法的基因调控组合物和方法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US11261428B2 (zh) |
| EP (1) | EP3765092A4 (zh) |
| JP (1) | JP2021518160A (zh) |
| KR (1) | KR20200133219A (zh) |
| CN (1) | CN112040986A (zh) |
| AU (1) | AU2019234926A1 (zh) |
| BR (1) | BR112020018620A2 (zh) |
| CA (1) | CA3093915A1 (zh) |
| WO (1) | WO2019178420A1 (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023011433A1 (zh) * | 2021-08-03 | 2023-02-09 | 苏州沙砾生物科技有限公司 | 一种修饰的肿瘤浸润淋巴细胞及其用途 |
| WO2023143515A1 (zh) * | 2022-01-29 | 2023-08-03 | 苏州沙砾生物科技有限公司 | 一种修饰的肿瘤浸润淋巴细胞及其用途 |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11332713B2 (en) | 2016-11-16 | 2022-05-17 | KSQ Therapeutics, Inc. | Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy |
| BR112020018620A2 (pt) | 2018-03-15 | 2020-12-29 | KSQ Therapeutics, Inc. | Composições de regulação gênica e métodos para imunoterapia aprimorada |
| CA3155727A1 (en) | 2019-10-25 | 2021-04-29 | Cecile Chartier-Courtaud | Gene editing of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy |
| AU2020388690A1 (en) * | 2019-11-20 | 2022-06-09 | Cartherics Pty. Ltd. | Method for providing immune cells with enhanced function |
| CA3163209A1 (en) * | 2019-11-27 | 2021-06-03 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Large-scale combined car transduction and crispr gene editing of t cells |
| CN113151178B (zh) * | 2020-01-07 | 2022-09-09 | 清华大学 | 敲除Rc3h1基因和/或Zc3h12a基因的重组T细胞及其应用 |
| JP2023535501A (ja) * | 2020-07-30 | 2023-08-17 | アンスティテュ・クリー | Ｓｏｃｓ１に欠陥のある免疫細胞 |
| WO2022038264A1 (en) * | 2020-08-21 | 2022-02-24 | Julius-Maximilians-Universität Würzburg | Modified lymphocytes |
| WO2022183056A1 (en) * | 2021-02-26 | 2022-09-01 | Salk Institute For Biological Studies | Modulating regulatory t cell function in autoimmune disease and cancer |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006112869A2 (en) * | 2004-07-19 | 2006-10-26 | Baylor College Of Medicine | Modulation of cytokine signaling regulators and applications for immunotherapy |
| AU2017308473A1 (en) * | 2016-08-12 | 2019-02-28 | Toolgen Incorporated | Manipulated immunoregulatory element and immunity altered thereby |
Family Cites Families (75)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6534055B1 (en) | 1988-11-23 | 2003-03-18 | Genetics Institute, Inc. | Methods for selectively stimulating proliferation of T cells |
| US6905680B2 (en) | 1988-11-23 | 2005-06-14 | Genetics Institute, Inc. | Methods of treating HIV infected subjects |
| US6352694B1 (en) | 1994-06-03 | 2002-03-05 | Genetics Institute, Inc. | Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells |
| US5858358A (en) | 1992-04-07 | 1999-01-12 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Methods for selectively stimulating proliferation of T cells |
| US5585362A (en) | 1989-08-22 | 1996-12-17 | The Regents Of The University Of Michigan | Adenovirus vectors for gene therapy |
| US5222982A (en) | 1991-02-11 | 1993-06-29 | Ommaya Ayub K | Spinal fluid driven artificial organ |
| JPH06505186A (ja) | 1991-02-11 | 1994-06-16 | オマーヤ，アユブ ケー． | 脊髄液駆動式人工器官 |
| EP0648271B1 (en) | 1991-08-20 | 2003-04-16 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | Adenovirus mediated transfer of genes to the gastrointestinal tract |
| US5252479A (en) | 1991-11-08 | 1993-10-12 | Research Corporation Technologies, Inc. | Safe vector for gene therapy |
| FR2688514A1 (fr) | 1992-03-16 | 1993-09-17 | Centre Nat Rech Scient | Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines et medicaments antitumoraux les contenant. |
| US5487994A (en) | 1992-04-03 | 1996-01-30 | The Johns Hopkins University | Insertion and deletion mutants of FokI restriction endonuclease |
| US5436150A (en) | 1992-04-03 | 1995-07-25 | The Johns Hopkins University | Functional domains in flavobacterium okeanokoities (foki) restriction endonuclease |
| US5356802A (en) | 1992-04-03 | 1994-10-18 | The Johns Hopkins University | Functional domains in flavobacterium okeanokoites (FokI) restriction endonuclease |
| AU680459B2 (en) | 1992-12-03 | 1997-07-31 | Genzyme Corporation | Gene therapy for cystic fibrosis |
| EP0705344B8 (en) | 1993-06-24 | 2006-05-10 | Advec Inc. | Adenovirus vectors for gene therapy |
| JP3875990B2 (ja) | 1993-10-25 | 2007-01-31 | カンジ，インコーポレイテッド | 組換えアデノウイルスベクターおよび使用方法 |
| US7175843B2 (en) | 1994-06-03 | 2007-02-13 | Genetics Institute, Llc | Methods for selectively stimulating proliferation of T cells |
| US7067318B2 (en) | 1995-06-07 | 2006-06-27 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods for transfecting T cells |
| US6692964B1 (en) | 1995-05-04 | 2004-02-17 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Methods for transfecting T cells |
| US7064193B1 (en) * | 1997-09-17 | 2006-06-20 | The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research | Therapeutic molecules |
| US7078387B1 (en) | 1998-12-28 | 2006-07-18 | Arch Development Corp. | Efficient and stable in vivo gene transfer to cardiomyocytes using recombinant adeno-associated virus vectors |
| US6453242B1 (en) | 1999-01-12 | 2002-09-17 | Sangamo Biosciences, Inc. | Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites |
| ATE373078T1 (de) | 2000-02-24 | 2007-09-15 | Xcyte Therapies Inc | Gleichzeitige stimulation und konzentration von zellen |
| US6867041B2 (en) | 2000-02-24 | 2005-03-15 | Xcyte Therapies, Inc. | Simultaneous stimulation and concentration of cells |
| US6797514B2 (en) | 2000-02-24 | 2004-09-28 | Xcyte Therapies, Inc. | Simultaneous stimulation and concentration of cells |
| US7572631B2 (en) | 2000-02-24 | 2009-08-11 | Invitrogen Corporation | Activation and expansion of T cells |
| US6962810B2 (en) | 2000-10-31 | 2005-11-08 | University Of Notre Dame Du Lac | Methods and compositions for transposition using minimal segments of the eukaryotic transformation vector piggyBac |
| WO2002088346A2 (en) | 2001-05-01 | 2002-11-07 | National Research Council Of Canada | A system for inducible expression in eukaryotic cells |
| AU2003202908A1 (en) | 2002-01-03 | 2003-07-24 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Activation and expansion of t-cells using an engineered multivalent signaling platform |
| US20050137251A1 (en) | 2002-03-18 | 2005-06-23 | Aaron Garzon | Dexanabinol and dexanabinol analogs regulate inflammation related genes |
| DK1545204T3 (en) | 2002-09-06 | 2016-11-14 | The Government Of The Us Secretary Dept Of Health And Human Services | Immunotherapy with in vitro selected antigen-specific lymphocytes following non-myeloablative lymphodepletive chemotherapy |
| US7888121B2 (en) | 2003-08-08 | 2011-02-15 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for targeted cleavage and recombination |
| BRPI0710800A2 (pt) | 2006-04-25 | 2012-01-17 | Univ California | administração de fatores de crescimento para o tratamento de distúrbios de snc |
| WO2008060360A2 (en) | 2006-09-28 | 2008-05-22 | Surmodics, Inc. | Implantable medical device with apertures for delivery of bioactive agents |
| WO2009046104A1 (en) | 2007-10-01 | 2009-04-09 | University Of Miami | Aptamer-targeted sirna to prevent attenuation or suppression of t cell function |
| US8324369B2 (en) | 2007-11-30 | 2012-12-04 | Baylor College Of Medicine | Dendritic cell vaccine compositions and uses of same |
| WO2009091826A2 (en) | 2008-01-14 | 2009-07-23 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Compositions and methods related to a human cd19-specific chimeric antigen receptor (h-car) |
| US8521273B2 (en) | 2008-01-29 | 2013-08-27 | Gilbert H. KLIMAN | Drug delivery devices, kits and methods therefor |
| US8383099B2 (en) | 2009-08-28 | 2013-02-26 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Adoptive cell therapy with young T cells |
| JP5947311B2 (ja) | 2010-12-09 | 2016-07-06 | ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア | 癌を治療するためのキメラ抗原受容体改変ｔ細胞の使用 |
| CA2821080C (en) | 2010-12-14 | 2021-02-02 | University Of Maryland, Baltimore | Universal anti-tag chimeric antigen receptor-expressing t cells and methods of treating cancer |
| WO2012129201A1 (en) | 2011-03-22 | 2012-09-27 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Methods of growing tumor infiltrating lymphocytes in gas-permeable containers |
| WO2012142480A1 (en) | 2011-04-14 | 2012-10-18 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Chimeric rna oligonucleotides and uses thereof |
| BR112014009346B1 (pt) | 2011-10-17 | 2020-09-15 | Massachusetts Institute Of Technology | Entrega intracelular |
| WO2013073219A1 (ja) | 2011-11-18 | 2013-05-23 | 公益財団法人 東京都医学総合研究所 | 神経変性疾患関連タンパク質の不溶性凝集体の製造方法 |
| WO2013173635A1 (en) * | 2012-05-16 | 2013-11-21 | Rana Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for modulating gene expression |
| US10117896B2 (en) | 2012-10-05 | 2018-11-06 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Use of a trans-signaling approach in chimeric antigen receptors |
| AU2014278323B2 (en) | 2013-06-10 | 2020-05-28 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Methods and compositions for reducing immunosupression by tumor cells |
| EP3057991B8 (en) | 2013-10-15 | 2019-09-04 | The Scripps Research Institute | Chimeric antigen receptor t cell switches and uses thereof |
| WO2015071474A2 (en) | 2013-11-18 | 2015-05-21 | Crispr Therapeutics Ag | Crispr-cas system materials and methods |
| JP6621409B2 (ja) | 2013-11-22 | 2019-12-18 | ミナ セラピューティクス リミテッド | Ｃ／ＥＢＰα小分子活性化ＲＮＡ組成物 |
| WO2015084897A2 (en) | 2013-12-02 | 2015-06-11 | Mirimmune, Llc | Immunotherapy of cancer |
| JP6793902B2 (ja) | 2013-12-20 | 2020-12-02 | ノバルティス アーゲー | 調節可能キメラ抗原受容体 |
| ES2939760T3 (es) | 2014-03-15 | 2023-04-26 | Novartis Ag | Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico para antígenos |
| US10016421B2 (en) * | 2014-04-05 | 2018-07-10 | H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. | Histone deacetylase 6 inhibition for enhancing T-cell function during anti-tumor response and tumor-peptide vaccination |
| KR20230152175A (ko) | 2014-04-18 | 2023-11-02 | 에디타스 메디신, 인코포레이티드 | 암 면역요법을 위한 crispr-cas-관련 방법, 조성물 및 구성성분 |
| CN107074970B (zh) | 2014-08-04 | 2021-07-30 | 弗雷德哈钦森癌症研究中心 | 特异性针对wt-1的t细胞免疫疗法 |
| WO2016106236A1 (en) | 2014-12-23 | 2016-06-30 | The Broad Institute Inc. | Rna-targeting system |
| WO2017048995A1 (en) * | 2015-09-15 | 2017-03-23 | Mirimus, Inc. | Inducible crispr/cas9 and rnai systems and methods of use |
| WO2017075465A1 (en) | 2015-10-28 | 2017-05-04 | The Broad Institute Inc. | Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses by detecting and targeting gata3 |
| WO2017079622A1 (en) | 2015-11-04 | 2017-05-11 | Emory University | Immune cells with dnmt3a gene modifications and methods related thereto |
| WO2017082562A1 (ko) | 2015-11-09 | 2017-05-18 | 사회복지법인 삼성생명공익재단 | Socs가 억제된 면역억제능이 향상된 줄기세포 및 그의 이용 |
| CN106967681B (zh) | 2016-01-13 | 2020-06-05 | 北京马力喏生物科技有限公司 | 治疗脑胶质母细胞瘤的治疗组合物 |
| CN106967685B (zh) | 2016-01-13 | 2020-06-02 | 北京马力喏生物科技有限公司 | 共表达抗EGFRvIII嵌合抗原受体和免疫检查点抑制分子的转基因淋巴细胞及其用途 |
| US11111505B2 (en) | 2016-03-19 | 2021-09-07 | Exuma Biotech, Corp. | Methods and compositions for transducing lymphocytes and regulating the activity thereof |
| US10596274B2 (en) | 2016-03-19 | 2020-03-24 | Exuma Biotech Corp. | Methods and compositions for transducing lymphocytes and regulated expansion thereof |
| AU2017292772A1 (en) * | 2016-07-05 | 2019-02-21 | The Johns Hopkins University | CRISPR-Cas9-based compositions and methods for treating cancer |
| CN107586341A (zh) | 2016-07-08 | 2018-01-16 | 生命序有限公司 | 重组免疫检查点受体及免疫检查点抑制分子的共表达及应用 |
| US11332713B2 (en) | 2016-11-16 | 2022-05-17 | KSQ Therapeutics, Inc. | Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy |
| CN108342361B (zh) | 2017-01-25 | 2020-12-22 | 北京马力喏生物科技有限公司 | 治疗间质素阳性肿瘤的治疗组合物 |
| CN108342363B (zh) | 2017-01-25 | 2021-02-12 | 北京马力喏生物科技有限公司 | 共表达抗msln嵌合抗原受体和免疫检查点抑制分子的转基因淋巴细胞及其用途 |
| WO2018148378A1 (en) | 2017-02-08 | 2018-08-16 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Modulating biomarkers to increase tumor immunity and improve the efficiacy of cancer immunotherapy |
| US20190374578A1 (en) | 2017-02-23 | 2019-12-12 | Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Compositions and methods for treating cancer |
| JOP20190224A1 (ar) | 2017-03-29 | 2019-09-26 | Iovance Biotherapeutics Inc | عمليات من أجل إنتاج الخلايا اللمفاوية المرتشحة للأورام واستخداماتها في العلاج المناعي |
| BR112020018620A2 (pt) | 2018-03-15 | 2020-12-29 | KSQ Therapeutics, Inc. | Composições de regulação gênica e métodos para imunoterapia aprimorada |
-
2019
- 2019-03-14 BR BR112020018620-1A patent/BR112020018620A2/pt unknown
- 2019-03-14 WO PCT/US2019/022364 patent/WO2019178420A1/en unknown
- 2019-03-14 US US16/354,100 patent/US11261428B2/en active Active
- 2019-03-14 CA CA3093915A patent/CA3093915A1/en active Pending
- 2019-03-14 JP JP2020573080A patent/JP2021518160A/ja active Pending
- 2019-03-14 KR KR1020207026517A patent/KR20200133219A/ko unknown
- 2019-03-14 CN CN201980019397.XA patent/CN112040986A/zh active Pending
- 2019-03-14 EP EP19767231.4A patent/EP3765092A4/en active Pending
- 2019-03-14 AU AU2019234926A patent/AU2019234926A1/en active Pending
-
2022
- 2022-03-29 US US17/707,725 patent/US20220220442A1/en active Pending
- 2022-03-29 US US17/707,789 patent/US11459544B2/en active Active
- 2022-12-13 US US18/065,580 patent/US20230340411A1/en active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006112869A2 (en) * | 2004-07-19 | 2006-10-26 | Baylor College Of Medicine | Modulation of cytokine signaling regulators and applications for immunotherapy |
| AU2017308473A1 (en) * | 2016-08-12 | 2019-02-28 | Toolgen Incorporated | Manipulated immunoregulatory element and immunity altered thereby |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023011433A1 (zh) * | 2021-08-03 | 2023-02-09 | 苏州沙砾生物科技有限公司 | 一种修饰的肿瘤浸润淋巴细胞及其用途 |
| WO2023143515A1 (zh) * | 2022-01-29 | 2023-08-03 | 苏州沙砾生物科技有限公司 | 一种修饰的肿瘤浸润淋巴细胞及其用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20230340411A1 (en) | 2023-10-26 |
| CA3093915A1 (en) | 2019-09-19 |
| US20190284530A1 (en) | 2019-09-19 |
| US11261428B2 (en) | 2022-03-01 |
| BR112020018620A2 (pt) | 2020-12-29 |
| KR20200133219A (ko) | 2020-11-26 |
| US11459544B2 (en) | 2022-10-04 |
| WO2019178420A1 (en) | 2019-09-19 |
| US20220267727A1 (en) | 2022-08-25 |
| EP3765092A4 (en) | 2022-01-12 |
| EP3765092A1 (en) | 2021-01-20 |
| AU2019234926A1 (en) | 2020-10-08 |
| JP2021518160A (ja) | 2021-08-02 |
| US20220220442A1 (en) | 2022-07-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20230088186A1 (en) | Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy | |
| US11421228B2 (en) | Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy | |
| US11459544B2 (en) | Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy | |
| CN112040987A (zh) | 用于改进的免疫疗法的基因调控组合物和方法 | |
| US20200347386A1 (en) | Combination gene targets for improved immunotherapy | |
| JP2021518161A6 (ja) | 免疫療法の改善のための遺伝子調節組成物及び遺伝子調節方法 | |
| US11332713B2 (en) | Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |