BR112014009346B1 - Entrega intracelular - Google Patents

Abstract

entrega intracelular. a presente invenção refere-se a um sistema de microfluidos para ocasionar perturbações em uma membrana celular, em que o sistema inclui um canal de microfluidos que define um lúmen e está configurado de modo que uma célula suspensa em um tampão possa atravessar o mesmo, em que o canal de microfluidos inclui uma constrição deformadora de célula, em que um diâmetro da constrição é uma função do diâmetro da célula.

Description

PEDIDOS DE DEPÓSITO CORRELATOS

[001] Este pedido reivindica a prioridade sobre o Pedido Provisório de Patente US n° 61/548.013, depositado em 17 de Outubro de 2011 e o Pedido Provisório de Patente US n° 61/684,301, depositado em 17 de Agosto de 2012, os teores de cada um são por meio desta incorporados a título de referência.

DECLARAÇÃO QUANTO À PESQUISA PATROCINADA FEDERALMENTE

[002] Essa invenção foi feita, pelo menos em parte, com o suporte do Governo mediante Concessão 5 RC1 EB011187-02, outorgada pelo Instituto Nacional de Saúde (National Institute of Health). O Governo tem certos direitos nessa invenção.

ANTECEDENTES

[003] Muitos fármacos amplamente se focam no desenvolvimento de fármacos de pequena molécula.

[004] Esses fármacos são assim chamados devido a seu tamanho relativamente pequeno, o que habilita os mesmos a se difundirem livremente através do corpo para chegar a seu alvo. Essas moléculas também são capazes de deslizar através da membrana celular, normalmente impermeável, em grande parte desimpedidas. A próxima geração de terapias com base em proteína, DNA ou RNA, porém, não podem prontamente atravessar a membrana celular e, dessa forma, exigem modificação celular para facilitar a entrega.

[005] Os métodos estabelecidos usam produtos químicos ou pulsos elétricos para romper a membrana e entregar o material no interior do citoplasma. A entrega intracelular apropriada é uma etapa crítica na pesquisa, desenvolvimento e implantação da próxima geração de terapêuticas.

[006] Os métodos existentes são, com frequência, difíceis de serem desenvolvidos e altamente específicos para sua aplicação em particular. Além disso, muitos tipos de célula clinicamente importantes, como, por exemplo, as células tronco e as células imunológicas, não são apropriadamente endereçadas pelos métodos existentes. Há, dessa forma, uma necessidade de uma técnica mais robusta e precisa capaz de abordar as necessidades da pesquisa biológica/médica moderna.

SUMÁRIO

[007] A invenção tem como base a constatação surpreendente de que uma lesão controlada, por exemplo, que submete uma célula para uma constrição, estiramento rápido, rápida compressão ou pulso de taxa de alto cisalhamento, leva à retenção das moléculas no interior do citoplasma da célula a partir do meio de célula circundante. Dessa forma, a invenção apresenta uma plataforma microfluídica livre de vetor para entrega intracelular direta para citosol dos materiais, por e- xemplo, um composto ou uma composição, para uma célula eucarióti- ca. O dispositivo é útil como uma ferramenta de laboratório versátil e amplamente aplicável para entrega das moléculas desejadas no interior das células-alvo. A entrega das moléculas na célula com o uso dos métodos descritos no presente documento é proporcional, por exem-plo, linear ou monotonicamente com a velocidade de célula através de uma constrição e/ou uma pressão. Por exemplo, 50 íl de suspensão de célula passam através do dispositivo em poucos segundos. A vazão varia entre 1 célula/segundo por canal (ou ainda menos) para acima de 1,000 células/segundo por canal. As velocidades de célula típicas através da constrição incluem 10 mm/segundo a 500 mm/segundo, embora as velocidades de célula possam ser até 10 m/s (ou ainda mais alta). Os canais adicionais podem ser colocados em paralelo para aumentar a vazão total do sistema.

[008] A recepção da molécula é com base em difusão em vez de endocitose, isto é, a carga útil (composto(s) a ser(em) entregue(s) à célula) se apresenta no citoplasma em vez de nos endossemos que seguem a passagem através do dispositivo. Pouca ou nenhuma carga útil aparece nos endossomos que seguem o tratamento celular. Por exemplo, as moléculas grandes são tomadas mais vagarosamente que as moléculas menores. O estiramento de célula controlado e a velocidade do movimento das células através da constrição leva a entrega superior das moléculas alvos enquanto preserva a viabilidade e a integridade das células. Após o tratamento, a viabilidade de célula está entre 70 a 100%, por exemplo, a viabilidade típica é de 90% após o tratamento. Por comparação, os métodos de entrega anteriores que usam altas taxas de cisalhamento apenas por segundos ou milisse- gundos tem se mostrado levar à viabilidade insatisfatória das células após o tratamento. Em contrapartida, nas técnicas anteriores, os métodos da invenção submetem as células a um pulso de cisalhamento que varia de 100 a 1000 Pa por um período bastante curto de tempo (aproximadamente 100 microssegundos) conforme a célula passa a- través da constrição. As presentes técnicas, porém, são fundamentalmente diferentes das técnicas anteriores. Nas presentes técnicas, e- xiste preferencialmente uma deformação total mecânico da célula conforme a mesma passa através da constrição, que pode impor diferentes forças de cisalhamento que as técnicas anteriores. Em modalidades preferenciais, as células não são submetidas a uma corrente elétrica. Em outras modalidades, um tratamento de combinação é usado, por exemplo, usa-se a deformação mecânica do dispositivo descrito no presente documento seguido de ou precedido de eletroporação (um tipo de transfecção de osmótica na qual uma corrente elétrica é usada para produzir orifícios temporários nas membranas celulares, o que permite a entrada de ácidos nucleicos ou macromoléculas).

[009] Uma carga útil é um composto ou uma composição a ser entregue em uma célula. Por exemplo, uma carga útil pode incluir proteínas, corantes fluorescentes, pontos quânticos, nanotubos de carbono, moléculas de RNA, moléculas de DNA, antígenos e outras macro- moléculas, nanopartículas e composições da matéria.

[0010] A largura da constrição do dispositivo, o comprimento da porção constrita, a geometria da região de entrada e a profundidade de canal do dispositivo influenciam a entrega das moléculas no interior da célula. Preferencialmente, a largura da porção constrita do conduto é não mais que 4 pm em diâmetro e o comprimento da porção constrita do conduto é de preferência entre 40 a 50 pm. O comprimento da porção constrita de modo geral não excede 90 pm. O diâmetro da porção constrita está relacionado ao tipo de célula a ser tratada. Conforme é descrito a seguir, o diâmetro é menor que o diâmetro da célula (por exemplo, 20 a 99% do diâmetro da célula). Muitas células são entre 5 a 15 pm em diâmetro, por exemplo, as células dendríticas são 7 a 8 pm em diâmetro. Por exemplo, o diâmetro da porção de constrição é 4,5, 5, 5,5, 6 ou 6,5 pm para processamento de células sozinhas. Em um outro exemplo, o tamanho/diâmetro da porção constrita para pro-cessamento de um óvulo humano está entre 6,2 pm e 8,4 pm, embora as constrições maiores e menores sejam possíveis (o diâmetro de um óvulo humano é aproximadamente 12 pm). Em ainda outro exemplo, os embriões (por exemplo, agrupamentos de 2 a 3 células) são processados com o uso de um diâmetro de constrição de entre 12 pm e 17 pm.

[0011] O dispositivo e os métodos são úteis no desenvolvimento de vacina e na produção que usa células que apresentam antígenos experientes como, por exemplo, células dendríticas. Por exemplo, um método de apresentação de antígeno estimulante é executado subme- tendo-se uma célula dendrítica a uma lesão controlada como, por exemplo, constrição transitória ou pulso de alto cisalhamento e que entra em contato com a célula dendrítica com uma solução que compreende um antígeno alvo. O método rende células que apresentam antí- genos altamente ativados em comparação com os métodos anteriores de estimulação. A produção de vacina é executada propelindo-se as células dendríticas ou outras células que apresentam antígeno através do dispositivo que contém constrição (submetendo, desse modo, as células a um evento de estiramento rápido) e que incuba, então, as células em uma solução que contém a carga útil, por exemplo, antígeno. As células são banhadas em um meio de cultura de célula que contém um ou mais antígenos após a rápida deformação das células, mas as células podem ser colocadas em contato com o antígeno anterior a, durante e/ou após o evento/processo de deformação rápida.

[0012] Os tensoativos (por exemplo, 0,1 a 10% p/p) são opcionalmente usados (por exemplo, poloxâmero, soro derivado de animal, proteína de albumina) no tampão de fluxo. A entrega das moléculas no interior das células não é afetada pela presença de tensoativos; porém, os tensoativos são opcionalmente usados para reduzir a obstrução do dispositivo durante o funcionamento.

[0013] O dispositivo é feito a partir de silício, metal (por exemplo, aço inoxidável), plástico (por exemplo, poliestireno), cerâmicas ou qualquer outro material adequado para recursos em escala micron entalhados e inclui um ou mais canais ou condutos através dos quais as células passam. O silício é particularmente bem adequado, devido ao fato de que métodos e micro padronização são bem estabelecidos com essa material, dessa forma, é mais fácil fabricar novos dispositivos, alterar projetos, etc. Adicionalmente, a rigidez do silício pode fornecer vantagens em relação aos substratos mais flexíveis como poli- dimetilsiloxano (PDMS), por exemplo, taxas mais altas de entrega. Por exemplo, o dispositivo inclui 2, 10, 20, 25, 45, 50 75, 100 ou mais ca- nais. O dispositivo é microfabricado entalhando-se o silício. As células são movidas, por exemplo, empurradas, através dos canais ou condutos através da aplicação de pressão. Um acionador de célula pode a- plicar a pressão. Um acionador de célula pode incluir, por exemplo, uma bomba de pressão, um cilindro de gás, um compressor, uma bomba de vácuo, uma seringa, uma bomba de seringa, uma bomba peristáltica, uma seringa manual, uma pipeta, um pistão, um atuador capilar e gravidade. Como uma alternativa para os canais, as células podem ser passadas através de uma constrição na forma de uma rede ou de placas proximamente dispostas. Em tanto caso, a largura da constrição através da qual as células atravessam é 20 a 99% da largura ou do diâmetro da célula a ser tratado em seu natural, isto é, estado sem estresse. A temperatura pode afetar a recepção das composições e afeta a viabilidade. Os métodos são executados à temperatura ambiente (por exemplo, 20'0), temperatura fisiológica (por exemplo, 390), mais alta que a temperatura fisiológica ou temperatura reduzida (por exemplo, 40) ou as temperaturas entre esses e xemplos.

[0014] Após a lesão controlada na célula através de constrição, estiramento e/ou um pulso de alta taxa de cisalhamento, as células são incubadas em uma solução de entrega que contém o composto ou a molécula que um indivíduo deseja introduzir no interior da célula. A lesão controlada pode ser caracterizada como um pequeno, por e- xemplo, 200 nm em diâmetro, defeito na membrana celular. O período de recuperação para as células está na ordem de poucos minutos a próximo à lesão causada pela passagem da através da constrição. O período de entrega compreende 1 a 10 minutos ou mais longo, por e- xemplo, 15, 20, 30, 60 minutos ou mais, sendo que 2 a 5 minutos é ideal quando operado em temperatura ambiente. Os períodos de tempo mais longos de incubação na solução de entrega não necessariamente rendem retenção aumentada. Por exemplo, os dados indicam que após 5 minutos, pouco ou nenhum material adicional tomado pelas células.

[0015] Dessa forma, a invenção fornece uma solução para problemas consagrados no campo de entrega de medicamentos a células e para inconvenientes associado aos métodos mais precoces.

[0016] Com relação à entrega de material para uma célula eucari- onte, as células podem ser classificadas no interior de duas categorias principais:

[0017] 1) Células fáceis de entregar (ETD): A maioria dos métodos químicos e virais disponíveis cai nessa categoria. As células fáceis de entregar com frequência não têm relevância clínica direta.

[0018] 2) Células difíceis de entregar (DTD): Alta relevância clíni ca. Os avanças na tecnologia de entrega podem amplamente habili- tar/acelerar o desenvolvimento de terapias inovadoras. Essa categoria inclui células tronco, células primárias e células imunológicas. Espera- se que o mercado para entrega de DTD cresça dramaticamente conforme o RNA inovador, a célula tronco e a proteína com bases terapêuticas ganhem momento nos anos a seguir.

[0019] As técnicas descritas no presente documento se provaram especialmente úteis para as áreas de pesquisa DTD, embora as mesmas técnicas possam ser usadas com células ETD. Além disso, facili- tou-se a entrega de materiais (como, por exemplo, pontos quânticos, nanotubos de carbono e anticorpos) que não podem ser entregues E- fetivamente por qualquer outro método para tanto células ETD como DTD.

[0020] Em geral, em um aspecto, as implantações da invenção podem fornecer um sistema de microfluidos para ocasionar as perturbações em uma membrana celular, em que o sistema inclui um canal de microfluidos que define um lúmen e que é configurado de modo que uma célula suspensa em um tampão possa passar através do mesmo, em que o canal de microfluidos inclui uma constrição, em que um diâmetro da constrição é uma função do diâmetro da célula.

[0021] As implantações da invenção também podem fornecer um ou mais dos recursos a seguir. O diâmetro da constrição é substancialmente 20 a 99% do diâmetro da célula que atravessa isso. Uma seção transversal do canaleta é selecionada do grupo que consiste em uma fenda circular, elíptica, alongada, quadrada, hexagonal e triangular. A constrição inclui uma porção de entrada, um ponto central e uma porção de saída. A porção de entrada define um ângulo de constrição, em que o ângulo de constrição é otimizado para reduzir a obstrução do canaleta. O sistema de microfluidos inclui adicionalmente uma pluralidade dos canais de microfluidos dispostos em paralelo, por exemplo, 2, 5, 10, 20, 40, 45, 50, 75, 100, 500, 1.000 ou mais.

[0022] Em geral, em um outro aspecto, as implantações da invenção também podem fornecer um método para uma entrega de um composto em uma célula, em que o método inclui fornecer uma célula em suspensão ou suspender uma célula e uma carga útil em uma solução, que passa a solução através de um canal de microfluidos que inclui uma constrição, que dimensiona a constrição como uma função do diâmetro da célula, que passa a célula através da constrição de modo que uma pressão seja aplicada à célula que causam perturbações da célula grandes suficientes para a carga útil passar através e que incuba a célula na solução durante um período de tempo predeterminado após isso atravessar uma constrição.

[0023] As implantações da invenção também podem fornecer um ou mais dos recursos a seguir. Um diâmetro da constrição é substancialmente 20 a 99% do diâmetro da célula. Uma seção transversal do canal de microfluidos é selecionada do grupo que consiste em uma fenda circular, elíptica, alongada, quadrada, hexagonal e triangular. A passagem da solução inclui passar a solução através de uma porção de entrada, um ponto central e uma porção de saída da constrição. O método inclui adicionalmente reduzir a obstrução do canal de microfluidos ajustando-se um ângulo de constrição da porção de entrada. A solução inclui passar a solução através de uma pluralidade de canais de microfluidos dispostos em paralelo.

[0024] Em geral, em ainda um outro aspecto, as implantações da invenção também podem fornecer um método para uma entrega de um composto em uma célula, em que o método inclui fornecer uma célula em uma solução ou suspender uma célula em uma solução, que passa a solução através de um canal de microfluidos que inclui uma constrição, que dimensiona a constrição como uma função do diâmetro da célula, que passa a célula através da constrição de modo que uma pressão seja aplicada à célula que causa perturbações da célula e que incuba a célula na solução que contém uma carga útil durante um período de tempo predeterminado após isso atravessar uma constrição, em que as perturbações são grandes o suficiente para carga útil passar através.

[0025] As implantações da invenção também podem fornecer um ou mais dos recursos a seguir. Um diâmetro da constrição é substancialmente 20 a 99% do diâmetro da célula. Uma seção transversal do canal de microfluidos é selecionada do grupo que consiste em uma fenda circular, elíptica, alongada, quadrada, hexagonal e triangular. A passagem da solução inclui passar a solução através de uma porção de entrada, um ponto central e uma porção de saída da constrição. O método inclui adicionalmente reduzir a obstrução do canal de microfluidos ajustando-se um ângulo de constrição da porção de entrada. A passagem da solução inclui passar a solução através de uma pluralidade de canais de microfluidos dispostos ou em série ou em paralelo. A incubação inclui incubar a célula por 0,0001 segundos a 20 minutos (ou ainda mais longo). A pressão é uma de cisalhamento e de com- pressão.

[0026] Em geral, em ainda um outro aspecto, as implantações da invenção também podem fornecer um método para uma entrega de um composto em uma célula, em que o método inclui fornecer uma célula em uma solução ou suspender uma célula em uma solução, que deforma a célula de modo que perturbações sejam causadas em uma membrana da célula e que incuba a célula na solução com uma carga útil após uma célula ter sido deformada.

[0027] As implantações da invenção também podem fornecer um ou mais dos recursos a seguir. A definição da célula inclui deformar a célula por 1 ps a 10 ms, por exemplo, 10 ps, 50 ps, 100 ps, 500 ps e 750 ps. A incubação ocorre para 0,0001 segundos a 20 minutos, por exemplo, 1 segundo, 30 segundos, 90 segundos, 270 segundos e 900 segundos.

[0028] As várias implantações da invenção podem fornecer uma ou mais das seguintes capacidades. Maior precisão e escalabilidade da entrega podem ser alcançadas quando comparada com as técnicas anteriores. A entrega de um material a uma célula pode ser automatizado. O material como, por exemplo, proteínas, RNA, siRNA, peptí- deos, DNA e corante impermeável podem ser implantados em uma célula, como, por exemplo, células tronco embrionárias ou células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), células primárias ou linhagens de célula imortalizadas. O dispositivo e os métodos são sensíveis a qualquer tipo de célula e o tamanho da porção constrita é feito sob medida para a célula a ser tratada. Os dispositivos e os métodos podem fornecer vantagens significativas. Por exemplo, o ruído experimental nos sistemas atuais pode ser reduzido quando comparado com as técnicas anteriores.

[0029] As quantidades de entrega de um material podem ser consistentes através da população de célula. As células podem ser individualmente manuseadas em vez de serem manuseadas como um lote. A invenção também tem demonstrado uma oportunidade razoavelmente exclusiva para entregar uma variedade de nanopartículas e de proteínas ao citosol. Os métodos existentes são razoavelmente não confiáveis ou ineficientes em desempenhar tais funções.

[0030] Com relação à entrega das cargas úteis sensíveis, por e- xemplo, proteínas (especificamente proteínas grandes, por exemplo, maiores do que 30, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500 kDa ou mais), pontos quânticos ou outras cargas úteis que são sensíveis a ou danificadas pela exposição à eletricidade, são confiavelmente entregues no interior das células enquanto preservam a integridade e a atividade da carga útil sensível. Dessa forma, o dispositivo e os métodos têm vantagens significativas mediante as técnicas existentes como, por exemplo, eletroporação, com composições de carga útil submetidas à eletricidade (danificando, desse modo, a carga útil) e levadas à baixa viabi-lidade de célula (por exemplo, 505 ou mais das células tipicamente morrem após a eletroporação).

[0031] Uma outra vantagem do método de estiramento/deforma- ção rápido é que as células troncos ou precursoras se tornam receptivas para retenção da carga útil sem alterar o estado de diferenciação ou atividade da célula tratada. Em adição a entrega das composições no interior do citoplasma da célula para propósitos terapêuticos, por exemplo, produção de vacina, o método é usado para introduzir as moléculas, por exemplo, grandes moléculas que compreende um rótulo detectável, para rotular as estruturas intracelulares como, por exem-plo, organelas ou para identificar constituintes intracelulares para propósitos de diagnóstico ou imageamento.

[0032] As várias implantações da invenção podem também fornecer uma ou mais das seguintes capacidades. O DNA pode ser entregue no interior das células de dose para entrega como, por exemplo, células tronco, primárias e imunológicas. A entrega de plasmídeos muito grandes (até cromossomos inteiros) pode ser cumprida. A entrega quantitativa no interior das células de quantidade conhecida de um construto de gene para estudar o nível de expressão de um gene de interesse e sua sensibilidade à concentração também pode ser prontamente cumprida. A entrega de quantidades conhecidas de sequências de DNA juntas com quantidade conhecida de enzimas que acentuam a recombinação de DNA a fim de se obter entrega estável mais fácil/mais eficiente, recombinação homóloga e mutagênese específica em sítio pode ser cumprida. Os métodos e os dispositivos descritos no presente documento também podem ser úteis para entrega quantitativa de RNA para estudos de RNA mais eficientes/conclusivos.

[0033] A entrega de pequeno RNA de interferência (siRNA) no interior do citoplasma de uma célula também é prontamente cumprida.

[0034] As várias implantações da invenção podem também fornecer uma ou mais das seguintes capacidades. O RNA pode ser entregue em uma célula para silenciamento de RNA sem a necessidade de lipossomas. As quantidades conhecidas de moléculas de RNA juntas com as quantidades conhecidas de moléculas dicer podem ser entregues para alcançar RNA padronizado e eficaz através de múltiplas linhagens de célula em condições diferentes. O mRNA pode ser entregue no interior das células para estudar os aspectos das regulações de expressão gênica no nível pós-transcricional. As quantidades conhecidas de rótulo de RNA para estudar a meia-vida dos RNAs e das células podem ser possíveis. A entrega de proteína universal pode ser alcançada. As quantidades conhecidas de proteínas de rótulo podem ser entregues para estudar sua meia-vida em células. A entrega de proteínas de rótulo para estudar o local de proteína pode ser cumprida. As quantidades conhecidas de proteínas etiquetadas podem ser entregas para estudar as interações proteína-proteína no ambiente celu- lar. A entrega de anticorpos etiquetados no interior de células vivas para imuno-manchamento e Western blotting com base em fluorescência pode ser alcançada.

[0035] As várias implantações da invenção também podem ser fornecidas um ou mais das seguintes capacidades clínicas e de pesquisa. A entrega quantitativo de fármacos a modelos de célula para triagem e estudos de dosagem aprimorados pode ser alcançada. O método pode ser empregado como um método de alta vazão da atividade de proteína de triagem no citosol para ajuda a identificar os terapêuticos de proteína ou entender os mecanismos desejados. Tais aplicações são de maneira severamente atual limitadas pelos métodos de entrega de proteína atuais devido a suas ineficiências. Os dispositivos e as técnicas são úteis para a entrega intracelular de fármacos a um subconjunto específico de células sanguíneas em circulação (por e- xemplo, linfócitos), a entrega de alta vazão de açúcares no interior das células para aprimorar a criopreservação das células, especificamente oocistos, a diferenciação de célula alvejada através da introdução de proteínas, mRNA, DNA e/ou fatores de crescimento, a entrega de material genética ou de proteína para induzir a reprogramação de célula para produzir as células de iPS, a entrega de DNA e/ou enzimas de recombinação no interior das células tronco embrionária para o desenvolvimento de linhagens de célula tronco transgênica, a entrega de DNA e/ou enzimas de recombinação no interior de zigotos para o desenvolvimento de organismos transgênicos, a ativação célula DC, a geração de iPSC e a diferenciação de célula tronco, a entrega de na- nopartícula para diagnósticos e/ou estudos mecânicos assim como a introdução de pontos quânticos. As células de pela usadas em conjunto com cirurgia plástica também são modificadas com o uso dos dispositivos e do método descritos no presente documento.

[0036] Um método de apresentação de antígeno estimulante que usa o método para entregar antígeno e/ou moléculas imuno-estimula- tórias rendem células que apresentam antígeno, por exemplo, células dendríticas, com níveis aprimorados de atividade em comparação com os métodos convencionais de estimulação, levando, desse modo, aos níveis aumentados de imunidade mediada por células B e T a um antígeno alvo. Tal método pode, dessa forma, ser empregado como um meio de ativação do sistema imune em resposta ao câncer ou às infecções.

[0037] Para propósitos de triagem, de imageamento ou de diagnóstico, o dispositivo é usado em um método de células de rotulação. Um método de rotulação de uma célula é executado submetendo-se uma célula a uma lesão controlada e que entra em contato com a célula com uma solução que compreende um marcado detectável, em que a dita lesão compreende uma constrição transitória ou pulso de alto cisalhamento. O marcador detectável compreende uma molécula fluorescente, um radionuclídeo, pontos quânticos, nanopartículas de ouro ou microesferas magnéticas.

[0038] Anterior à invenção, a manipulação das células tronco para o propósito de introduzir as composições exógenas tem sido difícil. O dispositivo e os métodos descritos no presente documento, por exemplo, a passagem de células tronco ou de células progenitoras como, por exemplo, células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) através de um canal de constrição não induz a diferenciação, mas confiavelmente induz a retenção das composições no interior da célula. Por exemplo, os fatores de diferenciação são introduzidos no interior de tais células. Após a retenção dos fatores introduzidos, as células procedem em uma trajetória de diferenciação ditada pelo fator introduzido sem complicações associado ao método pelos quais o(s) fator(es) foi introduzido no interior da célula.

[0039] Em adição as únicas células, mesmo células muito grandes, por exemplo, óvulos; aproximadamente 200 pm em diâmetro, os agrupamentos de células, por exemplo, 2 a 5 agrupamentos de célula como, por exemplo, um embrião que compreende 2 a 3 células, são tratadas para tomar composições alvo. O tamanho da abertura é ajustada consequentemente, isto é, de modo que a largura da constrição seja logo abaixo do tamanho do agrupamento. Por exemplo, a largura do canaleta é 20 a 99% da largura da célula agrupamento.

[0040] As células ou os agrupamentos de célula são purifica- dos/isolados ou enriquecidos para o tipo de célula desejado. As células dendríticas ou outras células, por exemplo, as células imunológicas como, por exemplo, macrófagos, células B, células T ou células tronco como, por exemplo, células tronco embrionárias ou iPS, usadas nos métodos são purificadas ou enriquecidas. Por exemplo, as células são isoladas ou enriquecidas em virtude de sua expressão de marcadores de superfície de célula ou outras características de identificação. As células dendríticas são identificadas e isoladas em virtude de sua expressão de â-integrina, CDI lc ou outros marcadores de superfície de célula de identificação. Com relação às células, o termo "isolada" significa que a célula é substancialmente livre de outros tipos de célula ou material celular com o qual a mesma ocorre naturalmente.

[0041] Por exemplo, uma amostra das células de um tipo ou fenó- tipo de tecido específico é "substancialmente pura" quando a mesma é pelo menos 60% da população de célula. Preferencialmente, a preparação é pelo menos 75%, com mais preferência pelo menos 90% e com a máxima preferência pelo menos 99% ou 100%, da população de célula. A pureza é medida através de qualquer método padrão a- propriado, por exemplo, através da classificação de célula ativada por fluorescência (FACS).

[0042] As composições de carga útil como, por exemplo, polinu- cleotídeos, polipeptídeos ou outros agentes são purificadas e/ou isoladas. Especificamente, conforme usada no presente documento, uma molécula de ácido nucleico "isolada" ou "purificada", um polinucleotí- deo, um polipetídeo ou uma proteína, é substancialmente livre de outro material celular ou meio de cultura quando produzida através de técnicas recombinante ou precursores químicos ou outros produtos químicos quando quimicamente sintetizados. Os compostos purificados são pelo menos 60%, em peso (peso seco) do composto de interesse. Preferencialmente, a preparação é pelo menos 75%, com mais preferência pelo menos 90% e com a máxima preferência pelo menos 99%, em peso do composto de interesse. Por exemplo, um composto purificado é um que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 98%, 99% ou 100% (p/p) do composto desejado em peso. A pureza é medida a- través de método padrão apropriado, por exemplo, através de análise de cromatografia em coluna, de cromatografia de camada fina ou de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Um polinucleotídeo purificado ou isolado (ácido ribonucleico (RNA) ou ácido desoxirribo- nucleico (DNA)) é livre dos genes ou sequências que flanqueiam o mesmo em seu estado de ocorrência natural. Os exemplos de uma molécula ácido nucleico isolada ou purificada incluem: (a) um DNA que é parte de uma molécula de DNA genômico de ocorrência natural, mas não é flanqueado por ambos das sequências ácido nucleico que flan-queiam aquela parte da molécula no genoma do organismo no qual isso ocorre naturalmente; (b) um ácido nucleico incorporado no interior de um vetor ou no interior do DNA genômico de um procarionte ou eu- carionte de uma maneira, de modo que a molécula resultante não seja idêntica a qualquer vetor ou DNA genômico de ocorrência natural; (c) uma molécula separada como, por exemplo, um cDNA, um fragmento genômico, um fragmento produzido através de reação em cadeia de polimerase (PCR) ou um fragmento de restrição; e (d) uma sequência de nucleotídeo recombinante que é parte de um gene híbrido, isto é, um gene que codifica uma proteína de fusão. As moléculas ácido nu-cleico isoladas de acordo com a presente invenção incluem, ainda, as moléculas produzidas sinteticamente, assim como quaisquer ácidos nucleicos que tenham sido alterados quimicamente e/ou que tenham cadeias principais modificadas.

[0043] Uma solução de suspensão é qualquer tampão ou solução fisiológica ou compatível com célula. Por exemplo, uma solução de suspensão é o meio de cultura de célula ou solução salina tamponada em fosfato. Uma carga útil é a mesma ou uma solução de suspensão diferente, que também contém a composição destinada a ser entregue no interior da célula.

[0044] As vantagens do dispositivo incluem evitar a modificação da carga útil desejada e não necessariamente expõe a carga útil a quaisquer campos eletromagnéticos ou outras formas de estresse. Com relação à eletroporação, esse método mostrou-se danificar as proteínas e ser ineficiente na entrega. A desvantagem significativa não é um problema com o método descrito no presente documento; o presente método é particularmente adequado para entrega de cargas úteis sensíveis, por exemplo, proteínas, particularmente proteínas grandes (por exemplo, 40 kDa -70 kDa e até 120, 130, 150, 200 kDa ou mais), construtos de ácido nucleico grande (por exemplo, plasmídeos e outros construtos que contêm 1 kb, 2 kb, 5 kb ou mais de polímeros de ácido nucleico e até cromossomos inteiros), grandes compostos, assim como pontos quânticos (por exemplo, 12 nm em diâmetro) e outros materiais que sabe-se serem sensíveis e facilmente danificados mediante exposição à eletricidade. Por exemplo, os ligantes de superfície em uma nanopartícula ou ponto quântico podem ser danificados ou se tornarem carregados em resposta a um campo elétrico, dessa forma, resultando na agregação das partículas, limitando/eliminando, desse modo, suas funcionalidades. Ainda outra vantagem do método de lesão controlada é a temporização do contato das células com a composição de liberação. Particularmente relevante para proteínas, que são sensíveis à protease, a temperatura, assim como a eletricidade, as células são colocadas em contato com a solução de carga útil após o tratamento e por um período relativamente curto de tempo em comparação com métodos mais precoces. A natureza microfluídica do dispositivo também exige volumes de trabalho muito menores, conservando, desse modo, preciosos materiais em bruto e/ou células. O dispositivo também pode ser acoplado aos métodos de entrega existentes como, por exemplo, eletroporação ou lipossomas para produzir uma entrega amplamente acentuada em relação a cada método individualmente.

[0045] A atividade funciona da carga útil entregue é inversamente correlacionada ao estresse de cisalhamento de fluido, isto é, o esforço físico à membrana celular como, por exemplo, estiramento da membrana celular mediante recepção da carga útil em vez de cisalhamento. Os métodos de entrega de nanopartículas de convencionais pode resultar em quantidades maiores de material que ganham acesso ao ambiente intracelular da célula; porém, esses métodos levam a menos atividade da material entregue em comparação com os métodos descritos no presente documento devido ao fato de que os métodos anteriores resultam em sequestro do material entregue nos endossemos. Os métodos descritos no presente documento levam a entrega direta para citosol de compostos/composições de modo que uma quantidade inferior de carga útil entregue no interior da célula leva a uma quantidade maior de atividade funcional das moléculas entregues devido a sua acessibilidade a outros componentes citosólicos. Por exemplo, os métodos anteriores para a entrega de nanopartículas têm resultado em 2 a 10 vezes a quantidade de material entregue no interior da célula, mas com pouco ou nenhuma atividade funcional do material entregue devido a sequestro nos endossemos. Os dispositivos e os métodos da invenção superaram esse inconveniente dos métodos intracelulares de entrega anteriores evitando-se o compartimento endossomal.

[0046] As vantagens e recursos adicionais incluem tempo-escala do tratamento e das velocidades de célula que são muitos mais rápidos que abordagens anteriores. Além disso, os outros métodos não apertam as células tão duramente como os presentes métodos, por exemplo, conforme determinado pelo tamanho (diâmetro) da célula em relação ao tamanho (diâmetro) da constrição (como uma% do diâmetro da célula). Essa compressão ou deformação rápida, forçosa, mas abaixo do nível do couro, leva a resultados superiores na retenção de carga útil direta para citosol pelas células. A deformação da célula é repentina, isto é, ocorre através substancialmente de 1is a 1ms. Em geral, estresse de célula indutor de deformação em excesso pode ser letal para a célula, enquanto ao mesmo tempo, muito pouco estresse não induz as perturbações de célula.

[0047] Portanto, a matéria atual fornece métodos e sistemas que fazem com que estresse suficiente induza as perturbações temporárias, mas não tanto estresse que as perturbações sejam permanentes e letais para a célula.

[0048] Qualquer um dos métodos descritos acima é executado in vitro, ex vivo ou in vivo. Para as aplicações in vivo, o dispositivo pode ser implantado em um lúmen vascular, por exemplo, um stent em linha. Essas e outras capacidades da invenção, junto com a própria invenção, serão mais bem entendidas em sua plenitude após uma análise das Figuras a seguir, da descrição detalhada e das reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0049] A FIG. 1a é um diagrama esquemático de um sistema de microfluidos. As células são expostas ao material de entrega (carga útil) após passar através da constrição.

[0050] A FIG. 1b é um diagrama esquemático de um sistema de microfluidos. As células são expostas à aplicação de material (carga útil) por todo o processo suspendendo-se as células em uma solução que inclui o material de entrega (carga útil) (por exemplo, as células são expostas ao material de entrega antes e depois de passar através da constrição).

[0051] A FIG. 2A é um diagrama esquemático de uma modalidade de um sistema de microfluidos.

[0052] A FIG. 2B é um diagrama ilustrativo de um sistema de microfluidos que retrata a profundidade, a largura e o comprimento.

[0053] A FIG. 3 é um diagrama esquemático de um sistema de microfluidos.

[0054] A FIG. 4 é um diagrama esquemático que mostra as perturbações em uma parede celular.

[0055] A FIG. 5 é uma fotografia de um sistema de microfluidos.

[0056] A FIG. 6 é uma fotografia de um sistema de microfluidos.

[0057] A FIG. 7 é uma fotografia de um sistema de microfluidos.

[0058] As FIGS. 8a a 8b são gráficos que mostras resultados e- xemplificativos obtidos a partir de um sistema de microfluidos.

[0059] A FIG. 9 é um gráfico que mostra os resultados exemplifica- tivos obtidos a partir de células que foram processadas com o uso de um sistema de microfluidos.

[0060] A FIG. 10 é um gráfico que mostra os resultados exemplifi- cativos obtidos a partir de células que foram processadas com o uso de um sistema de microfluidos.

[0061] A FIG. 11 é um gráfico que mostra os resultados exemplifi- cativos obtidos a partir de células que foram processadas com o uso de um sistema de microfluidos.

[0062] A FIG. 12 é um diagrama esquemático de um sistema de microfluidos.

[0063] A FIG. 13 é um gráfico que mostra os resultados exemplifi- cativos obtidos a partir de células que foram processadas com o uso de um sistema de microfluidos.

[0064] A FIG. 14 é um gráfico que mostra os resultados exemplifi- cativos obtidos a partir de células que foram processadas com o uso de um sistema de microfluidos.

[0065] A FIG. 15 é um gráfico que mostra os resultados exemplifi- cativos obtidos a partir de células que foram processadas com o uso de um sistema de microfluidos.

[0066] As FIGS. 16a a 16f são diagramas esquemáticos exemplifi- cativos do sistema de microfluidos.

[0067] A FIG. 17 é um fluxograma relacionado a um método de uso de um sistema de microfluidos.

[0068] As FIGS. 18a a 18b são gráficos que mostra os resultados exemplificativos obtidos a partir de células que foram processadas com o uso de um sistema de microfluidos.

[0069] A FIG. 19 é uma sobreposição das imagens de fluorescência de entrega e confocal, seguidas de imagens de fluorescência confocal de seção z das células tratadas entregues com pontos quânticos (QDs) com o uso da matéria atual.

[0070] A FIG. 20A ilustra a eficiência de aplicação no interior da citosol de célula de HeLa mediante o tratamento da matéria atual com QDs revestidos com ligante de poli-imidazol (PIL). A viabilidade da célula foi >80% conforme medida pela citometria de fluxo.

[0071] A FIG. 20B ilustra a viabilidade das células de HeLa mediante a entrega de QD535 puro pela matéria atual, conforme mensurado pelo manchamento de iodeto propídio e pela medição de citometria de fluxo.

[0072] A FIG. 21 ilustra o projeto de construto, absorbância e estabilidade em vários meios.

[0073] A FIG. 22A ilustra as imagens de microscopia confocal de célula viva de células tratadas e controlas.

[0074] A FIG. 22B ilustra uma alteração na intensidade das células tratadas como uma função de tempo nos canais verdes e vermelhos.

[0075] A FIG. 23 ilustra as medições de citometria de fluxo da fluorescência e viabilidade de célula média.

[0076] A FIG. 24 ilustra o imageamento fluorescência dos pontos quânticos únicos não agregados dentro do citosol de célula após o tratamento do dispositivo com uma solução de ponto quântico 10 nM e traços intermitentes dos três pontos quânticos com autofluorescência.

[0077] A FIG. 25 ilustra os resultados experimentais que mostram que o desempenho de entrega depende da velocidade de célula e do projeto de constrição.

[0078] A FIG. 26 ilustra varreduras de planos horizontais diferentes de uma célula HeLa após a entrega do dextrano 3kDa pacific blue conjugado, conforme medido pela microscopia confocal.

[0079] A FIG. 27 ilustra um modelo de difusão 2D simplificado que simula a difusão passiva do material em uma célula através de uma membrana porosa.

[0080] A FIG. 28 ilustra os resultados de uma entrega em duas fileiras do material.

[0081] A FIG. 29 ilustra dados relacionados à SiRNA, a proteína e a entrega de nanopartícula. A FIG. 30 ilustra a aplicabilidade da matéria atual através dos tipos de célula. A FIG. 31 ilustra dados da entrega de nanomaterial e de anticorpo.

[0082] A FIG. 32 ilustra as aplicações de entrega de proteína.

[0083] A FIG. 33 é uma tabela de tipos de célula exemplicativos, que se entregou a carga útil com sucesso.

[0084] A FIG. 34 é uma ilustração que retrata um sistema no qual um sangue do paciente é tratado através de um dispositivo microfluídi- ca para a aplicação de carga útil como, por exemplo, macromoléculas.

[0085] A FIG. 35 ilustra a eficiência de entrega e a viabilidade das células tronco embrionárias de humano tratadas com um dispositivo 10im a 6im para entregar a carga útil.

[0086] A FIG. 36 retrata a geração e a caracterização de linha de iPSC de camundongo e de humano pela entrega direta das proteínas de reprogramação fundidas com uso da matéria atual.

[0087] A FIG. 37 retrata os resultados de programação de proteína preliminares e retrata a expressão do marcador de célula tronco embrionária humana Oct4, SSEA-4, Tra-60, Tra-80, Fosfatase Alcalina (AP) em colônias de iPSC.

[0088] A FIG. 38 retrata os micrográficos que ilustram um dispositivo modificado pelos eletrodos incorporados em qualquer um dos lados da constrição pela padronagem foto litográfica e a deposição de Au introduz um campo elétrico localizado no interior do canaleta, combinando, desse modo, a deformação de célula com a eletroporação.

[0089] A FIG. 39 retrata uma outra modalidade do sistema de microfluidos em que a porção de entrada tem um ângulo de constrição de 90 graus.

[0090] A FIG. 40A e 40B são diagramas que mostram uma comparação de viabilidade e eficiência de entrega entre um dispositivo de acordo com uma modalidade de exemplo retratada na FIG. 2 A e um dispositivo de acordo com uma modalidade de exemplo retratada na FIG. 39.

[0091] A FIG. 41 é um histograma de expressão CD45 de células T ativadas conforme medido através de um anticorpo Alexa 488 para CD45. As células que são tratadas pelo dispositivo na presença de RNA de silenciamento de CD45 exibem um pico de intensidade de fluorescência inferior, indicando, desse modo, o derrubamento da expressão gênica CD45.

[0092] A FIG. 42 é uma ilustração que retrata vários campos de exemplo da aplicação como, por exemplo, medicina regenerativa; imu- nologia; imageamento e sensoriamento; e vacinas de câncer e pesquisa de câncer.

[0093] A FIG. 43A e 43B são histogramas de intensidade de citometria de fluxo de uma população de controle que é exposta a dextra- no 3kDa cascade blue conjugado e uma população de células que foi submetida a um 30im a 6im dispositivo e, então, exposta ao dextrano 3kDa.

[0094] A FIG. 44 é um gráfico em barra que ilustra o derrubamento de GFP em células tronco embrionárias humanas após o tratamento com o uso do dispositivo microfluídico e dos métodos relacionados.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0095] Modalidades da invenção fornecem técnicas para aplicar deformação controlada a uma célula por uma quantidade de tempo predeterminada a fim de causar perturbações na membrana celular de modo que materiais possam ser transmitidos para o interior da célula. A deformação pode ser ocasionada por, por exemplo, pressão induzida por uma tensão mecânica ou forças de cisalhamento. Em um e- xemplo, um sistema de microfluidos inclui uma estrutura que controla e/ou manipula fluidos confinando-se geometricamente os fluidos em uma escala pequena (por exemplo, volumes de sub mililitro tal como microlitros, nanolitros, ou picolitros). O sistema de microfluidos é capaz de transmitir de modo intracelular virtualmente qualquer carga útil em uma célula. O sistema consiste em um ou mais canais de microfluidos com uma constrição pela qual as células passam através. Preferencialmente, as células fluem através do canal de microfluidos suspenso em um meio líquido que é conduzido por pressão através do sistema. Quando uma célula passa através da constrição, a membrana da mesma é perturbada, que causa rupturas temporárias na membrana e resulta na retenção da carga útil que está presente nos meios circundantes. A constrição é uma função do tamanho da célula-alvo, mas preferencialmente na mesma ordem ou menor d que o diâmetro da célula. Múltiplas constrições podem ser colocadas em paralelo e/ou em série. A perturbação da célula é uma brecha na célula que permite ao material do exterior da célula se mover para dentro da célula (por exemplo, uma fenda, um rasgo, uma cavidade, um orifício, um poro, um intervalo, uma lacuna, uma perfuração). As perturbações (por e- xemplo, poros ou fendas) criadas por métodos descritos no presente documento não são formadas como um resultado de conjunto de su- bunidades de proteína para formar uma estrutura de poro multimérica tal como a criada por complemento ou hemolisinas bacterianas. Outras modalidades estão dentro do escopo da matéria descrita.

[0096] Em referência às FIGS. 1 a 3, um sistema de microfluidos 5 inclui um canal 10 que define um lúmen tubular. O canal de microfluidos 10 inclui uma constrição 15 que é preferencialmente configurada de modo que apenas uma única célula-alvo 20 possa passar através da constrição 15 de uma só vez. Preferencialmente, as células 20 passam através do canal 10 suspenso em um tampão de solução 25 que também inclui materiais de entrega 30, embora os materiais de entrega possam ser adicionados ao tampão de solução 25 após as células 20 passarem através da constrição 15. Enquanto a célula 20 se aproxima e passa através da constrição 15, a constrição 15 aplica pressão (por exemplo, compressão mecânica) na célula 20, que espreme a célula 20 (por exemplo, mostrada como célula 20i). A pressão aplicada na célula pela constrição 15 causa perturbações (por exemplo, fendas mostradas na FIG. 4) na membrana celular (por exemplo, célula 202). Uma vez que a célula passa através da constrição 15, a célula 20 começa a reter o material no tampão de solução 25 através das fendas, que inclui o material de entrega 30 (por exemplo, célula 203). A membrana celular se recupera ao longo do tempo e pelo menos uma por- ção do material de entrega 30 permanece preferencialmente presa dentro da célula.

[0097] A configuração da constrição 15 pode ser customizada para controlar a constrição da célula 20, controlando-se dessa forma a pressão aplicada à célula 20. Preferencialmente, a constrição 15 inclui uma porção de entrada 35, um ponto central 40 e uma porção de saída 45. Por exemplo, o(s) diâmetro(s) da constrição 15 pode ser variado para ajustar a pressão aplicada na célula (e o quão rápido essa pressão é aplicada/liberada) e o comprimento da constrição 15 pode ser variado para ajustar a quantidade de tempo que pressão é aplicada na célula. Em certas configurações, constrição física da célula não é requerida, ao invés, submeter a célula muito brevemente a uma taxa de cisalhamento e/ou uma taxa de compressão excepcionalmente alta pode causar as perturbações desejadas. Em geral, não há requerimento em relação ao diâmetro exterior do sistema de microfluidos e a proporção do diâmetro interno ao diâmetro externo pode ser variada (por exemplo, maior do que 5).

[0098] O diâmetro do ponto central 40 pode ser uma função do diâmetro da célula 20. Preferencialmente, o ponto central 40 está na mesma ordem que ou é menor do que o diâmetro da célula 20 (por exemplo, 20 a 99% do diâmetro da célula). Preferencialmente, o diâmetro do ponto central 40 está entre 60% e 70% do diâmetro da célula, embora um diâmetro de ponto central óptimo possa variar com base na aplicação e/ou no tipo de célula. Diâmetros exemplificativos do ponto central 40 que foram usados em experimentos antecedentes são 5 a 6pm, e 7 a 8 pm. O ponto central 40 pode também ser mais extenso do que o diâmetro da célula 20, mas ser configurado para causar um pulso de pressão (por exemplo, cisalhamento) que é aplicado à célula 20. Tal pressão pode ser aplicada à célula 20 sem tocar as paredes do canal 10. O cisalhamento pode ser mensurado por técnicas conhecidas (por exemplo, Journal of Applied Physics 27, 1097 (1956); Murphey et al.).

[0099] O ângulo de constrição (por exemplo, a na FIG. 2A) da porção de entrada 35 pode variar (por exemplo, o quão rápido o diâmetro diminui). O ângulo de constrição é preferencialmente um ângulo que minimiza o entupimento do sistema 5 enquanto células passam através do mesmo. O ângulo da porção de saída 45 pode variar da mesma forma. Por exemplo, o ângulo da porção de saída 45 é configurado para reduzir a probabilidade de turbulência/turbilhões que podem resultar em fluxo não-laminar (por exemplo, uma faixa de 1 a 80 graus). As paredes da porção de entrada 35 e/ou da porção de saída 45 são preferencialmente lineares, embora outras configurações sejam possíveis (por exemplo, as paredes podem ser curvadas).

[00100] A seção transversal do canal 10, a porção de entrada 35, o ponto central 40, e a porção de saída 45 podem variar. Por exemplo, as várias seções transversais podem ser circulares, elípticas, uma fenda alongada, quadradas, hexagonais, triangulares, etc. O comprimento do ponto central 40 pode também variar, e também pode ser ajustado para variar por quanto tempo pressão é aplicada na célula 20 enquanto a mesma passa através da constrição 15. Em uma dada taxa de fluxo, uma constrição 15 mais longa (por exemplo, um ponto central 40 mais longo) irá aplicar pressão na célula 20 por um período de tempo mais longo. A profundidade do canal 10, da porção de entrada 35, do ponto central 40 e da porção de saída 45 pode variar. Por exemplo, a profundidade pode ser ajustada para fornecer uma constrição mais apertada e dessa forma realçar a entrega de uma maneira similar a mudanças na largura da constrição. A largura e o comprimento variam entre projetos de dispositivos e podem ser determinados durante a fabricação do dispositivo, tal como por uma máscara de cromo usada em uma etapa de litografia (quando o dispositivo é com base em silício). A profundidade pode ser uniforme ao longo de todo o canal e pode ser determinada durante a fabricação do dispositivo, tal como por uma etapa de gravura iônica reativa profunda. A profundidade pode ser, por exemplo, 15pm a 20pm. Como usado no presente documento, as dimensões de dispositivo são indicadas por uma série de números que indicam comprimento, largura e numero de constrições (por exemplo, 30pm a 6mx5 indica um dispositivo com um comprimento de 30pm, uma largura de 6pm, e 5 constrições).

[00101] A velocidade na qual as células 20 passam através do canal 10 pode também variar para controlar a entrega do material de entrega 30 para as células 20. Por exemplo, ajustar a velocidade das células 20 através do canal 10 pode variar a quantidade de tempo que pressão é aplicada nas células e pode variar o quão rápido a pressão é aplicada à célula (por exemplo, lentamente ou em forma de choque). As células 20 passam através do sistema 5 a uma taxa de pelo menos 0,1 mm/s tal como 0,1 mm/s para 5 m/s, e preferencialmente entre 10 mm/s a 500 mm/s, embora outras velocidades sejam possíveis. Em algumas modalidades, as células 20 podem passar através do sistema 5 a uma taxa maior do que 5 m/s.

[00102] O canal 10 pode ser fabricado a partir de vários materiais tais como silício, vidro, cerâmica, substratos cristalinos, substratos amórficos e polímeros (por exemplo, Metacrilato de poli-metila (PM- MA), PDMS, Copolímero de Olefina Cíclica (COC), etc.). A fabricação é preferencialmente com base em sala limpa e pode usar, por exemplo, gravura a seco, gravura úmida, fotolitografia, moldagem por injeção, ablação a laser, máscaras SU-8, etc. Um canal exemplificative 10 tem aproximadamente 40 a 50 pm, que tem um diâmetro sem constrição de aproximadamente 50 pm, que tem um diâmetro de constrição de aproximadamente 4 a 8 pm. Preferencialmente, o comprimento do canal 10 é mantido curto para evitar entupimentos. Outras dimensões são possíveis.

[00103] A FIG. 39 retrata outra modalidade do sistema de microfluidos. Nessa modalidade, o canal 10 inclui uma porção de entrada preliminar 50 que não constringe a célula 20. Uma porção de canal expandida 55 fornece para a porção de entrada 35 ter um ângulo de constrição de 90 graus (por exemplo, alpha na FIG. 2A).

[00104] As FIGS. 40A e 40B são duas ações que mostram uma comparação de viabilidade e eficiência de entrega entre dois exemplos de modalidades. O rótulo 4000 designa medidas tiradas durante o uso de uma modalidade em concordância com a FIG. 2A enquanto 4010 designa medidas tiradas durante o uso de uma modalidade em concordância com a FIG. 39. Pela mesma velocidade e pressão de operação da célula, a FIG. 39 mostrou ter alta eficiência de entrega e viabilidade. Isso se dá apesar de ter taxas de cisalhamento, velocidade de célula e tempo gasto sob compressão similares aos da modalidade da FIG. 2A.

[00105] Diversos parâmetros podem influenciar a entrega do material de entrega 30 para a célula 20. Por exemplo, as dimensões da constrição 15, as velocidades de fluxo de operação (por exemplo, tempo de trânsito de para a constrição 15), concentração do material de entrega 30 no tampão de solução 25 e a quantidade de tempo que a célula 20 se recupera/incuba no tampão de solução 25 após a constrição poder afetar a absorção do material de entrega 30 dentro da célula 20. Parâmetros adicionais que influenciam a entrega do material 30 para a célula 20 podem incluir a velocidade da célula 20 na constri-ção 15, a taxa de cisalhamento na constrição 20, o componente de velocidade que é perpendicular à velocidade de fluxo, uma taxa de compressão de célula e tempo em constrição. Tais parâmetros podem ser designados para controlar a entrega do material de entrega 30. A composição do tampão de solução 25 (por exemplo, concentração de sal, conteúdo de soro, etc.) também pode impactar a entrega do material de entrega 30. Enquanto a célula 20 passa através da constrição 15, a deformação/stress induzida pela constrição 15 temporariamente fere a célula que causa difusão passiva de material através da perturbação. Em algumas modalidades, a célula 20 é deformada apenas por um breve período de tempo, na ordem de 100 ps para minimizar a chance de ativar caminhos apoptóticos através de mecanismos de sinalização da célula, embora outras durações sejam possíveis (por e- xemplo, que varia de nanosegundos a horas). Observações iniciais indicaram que absorção do material de entrega 30 pela célula 20 ocorre na ordem de minutos após a célula 20 passar através da constrição 15.

[00106] As células 20 podem ser conduzidas através do canal 10 por vários métodos. Por exemplo, uma pressão pode ser aplicada por uma bomba no lado da entrada (por exemplo, cilindro de gás, ou compressor), um vácuo pode ser aplicado por uma bomba de vácuo no lado da saída, ação capilar através de um tubo e/ou do sistema 5 pode ser alimentada por gravidade. Um deslocamento com base em sistemas de fluxo também pode ser usado (por exemplo, bomba de seringa, bomba peristáltica, seringa manual ou pipete, pistões, etc.). Taxas de fluxo exemplificativas através de um único canal 10 estão na ordem de 1 pí em alguns segundos. Adicionalmente, o tampão de solução 25 pode incluir um ou mais lubrificantes (plurônicos ou outros surfactan- tes) que podem ser designados para reduzir ou eliminar o entupimento do canal 10 e melhorar a viabilidade.

[00107] O sistema 5 pode ser controlado para assegurar que quantidades de entrega do material de entrega 30 sejam consistentes por toda a população de célula. Por exemplo, o sistema 5 pode incluir o uso de um mecanismo de entrega convectiva de pós-constrição que colide o material de entrega 30 na membrana celular permeabilizada da célula 20. Controlando-se a taxa de fluxo da corrente secundária, a quantidade de material de entrega 30 fornecida para a célula pode preferencialmente ser controlada. Adicionalmente, controlar a concentração de material de entrega 30 no tampão de solução 25 durante a re-cuperação de membrana pode também melhorar a consistência da entrega do material de entrega 30 para a população de células. Preferencialmente, o sistema 5 opera puramente como um sistema mecânico sem aplicar quaisquer campos elétricos e/ou agentes químicos, embora outras configurações sejam possíveis (por exemplo, sensores elétricos e/ou ópticos podem ser usados para medir propriedades de célula tal como fluorescência). Adicionalmente, o sistema 5 preferencialmente opera independente do tipo de material que é transmitido. Por exemplo, proteínas, RNA, e DNA podem ser transmitidos através do mesmo sistema sem quaisquer modificações adicionais.

[00108] Em algumas configurações com certos tipos de células 20, as células 20 podem ser incubadas em uma ou mais soluções que auxiliam na absorção do material de entrega para o interior da célula. Por exemplo, as células 20 podem ser incubadas em uma solução de des- polimerização tal como Latrunculina A (O.Ag/ml) por 1 hora antes da entrega para despolimerizar o citoesqueleto de actina. Como um e- xemplo adicional, as células podem ser incubadas em 10pM de Col- quicina (Sigma) por 2 horas antes de transmitir para despolimerizar a rede de microtúbulo. Esses métodos podem ajudar a obter expressão de gene quando se transmite DNA.

[00109] Em referência também à FIG. 5, uma fotografia de uma configuração paralela do sistema 5 é mostrada. O sistema 5 pode incluir qualquer número de canais paralelos. Preferencialmente, como canais paralelos adicionais são adicionados ao sistema 5, o rendimento geral do sistema 5 pode ser aumentado. A FIG. 6 mostra uma configuração da constrição 15 que inclui uma porção de entrada 35 que in- clui múltiplas etapas. Em referência também à FIG. 7, uma fotografia adicional de um protótipo do sistema 5 é mostrada. Como evidente na FIG. 7, o protótipo, que inclui um poço de incubação, tem dimensões de aproximadamente 2,5400 centímetros (1 polegada) x 0,63500 centímetros (0,25 polegadas) x 0,63500 centímetros (0,25 polegadas). Outras configurações do sistema 5 podem também incluir include classificadores, módulos de pré-tratamento/pós-tratamento, e/ou módulos de sensor (por exemplo, óptico, elétrico e magnético).

[00110] Como descrito em mais detalhe abaixo em relação aos e- xemplos, o sistema de microfluidos e métodos relacionados têm uma faixa ampla de aplicações. A FIG. 42 é uma ilustração que retrata diversos exemplos de campos de aplicação. Por exemplo, a matéria a- tual pode ser aplicada a medicina regenerativa tal como para habilitar reprogramação de célula e diferenciação de célula-tronco. A matéria atual pode ser aplicada a imunologia tal como para apresentação de antígenos e realce/supressão de atividade imune através de entrega para células dendríticas, monócitos, células T, células B e outros linfó- citos. Ademais, imageamento e sensoriamento podem se beneficiar de entrega melhorada para células-alvo de pontos quânticos, nanotubos de carbono e anticorpos. Adicionalmente, a matéria atual tem aplica-ção em vacinas de câncer e pesquisa, tal como para isolamento de célula tumoral circulante (CTC) e tratamento de Linfoma. O método também fornece uma plataforma robusta para procurar por siRNA ativo e compostos de molécula pequena capazes de tratar uma doença ou manipular comportamento de célula.

[00111] Esse conceito foi demonstrado com sucesso em um protótipo onde as células 20 foram induzidas para assumir de outro modo um corante de membrana impermeável (por exemplo, corantes fluorescentes de 3kDA a 2MDA) em massa molecular, DNA, proteína, RNA, nanotubos ou nano partículas presentes no tampão de solução 25. As células 20 mostraram se recuperar e proliferar após o processo enquanto retêm o material transmitido por mais de 72 horas. Onze tipos diferentes de células foram testados com esse sistema, incluindo- se as listadas na FIG. 33, que consequentemente demonstra que o sistema fornece um desempenho robusto em tipos de célula diferentes. A FIG. 33 é uma tabela que inclui tipos de células que a matéria atual foi aplicada com sucesso. O rendimento médio de célula foi medido na ordem de 5,000 a 20,000 células/segundo, a eficiência de entrega padrão foi medida em 96% e a viabilidade de célula foi medida em 95% usando-se um único canal 10. Todos os testes foram desempenhados em temperatura ambiente. A temperatura, no entanto, pode ter variado em algumas técnicas. Por exemplo, os métodos podem ser executados em temperatura ambiente (por exemplo, 20G), em temperatura fisiológica (por exemplo, 39G), em temperat ura maior do que a fisiológica, ou em temperatura reduzida (por exemplo, 4G), ou em temperaturas entre estas temperaturas exemplificativas. Desempenhar os métodos em uma temperatura reduzida (isto é, substancialmente próximo a 4G que pode ser alcançada, por exemplo, usando-se refrigeração, banho de gelo ou outras técnicas conhecidas) produziu uma melhora surpreendente em eficiência de entrega e viabilidade de célula. Desse modo, a temperatura pode ser ajustada para afetar a entrega de composição e viabilidade de célula.

[00112] Como mostrado nas FIGS. 8a-b, aumentar a velocidade da célula através da constrição 15 pode aumentar a porcentagem de entrega e a eficiência de entrega do material de entrega 30. Foi descoberto que a eficiência de entrega varia de modo linear com a velocidade da célula e que havia uma resposta dependente de dosagem.

[00113] Como mostrado na FIG. 9, o tempo de incubação de uma célula no tampão de solução 25 após a célula passar para a constrição 15 pode ter um efeito na porcentagem de entrega geral do material de entrega 30 para a célula 20. Foi observado, no entanto, que após uma certa quantidade de tempo de incubação (aproximadamente 2 a 3 minutos), a porcentagem de entrega estava substancialmente inalterada. Com base nesses dados, acredita-se que as perturbações ocasionadas na célula 20 após a mesma atravessar a constrição 15 são corrigidas dentro da ordem de cerca de cinco minutos após a célula 20 passar para a constrição 15. Adicionalmente e por referência, -1 minuto corresponde ao grupo de controle.

[00114] Como mostrado na FIG. 10, foi observado que passar as células 20 através da constrição 15 múltiplas vezes pode ter um efeito na porcentagem de entrega geral, mas que afetou negativamente a viabilidade geral das células 20. Para gerar esses dados, células foram passadas através da constrição 15, coletadas e passadas através do dispositivo novamente dentro de aproximadamente 1 minuto.

[00115] Foi observado que durante o tempo que as células 20 são perturbadas (por exemplo, após passar através da constrição 15), o material de dentro da célula pode ser extraído através das perturbações. Desse modo, foi descoberto que quando as células 20 são perturbadas, que um material pode fluir para dentro e para fora da célula 20. Isso significa propriamente que o sistema 5 pode ser usado como um método de tirar amostras de material intracelular sem causar lise celular na célula. As perturbações na membrana celular irão resultar preferencialmente em um escoamento de macromoléculas do citoplasma e, desse modo, podem ser usadas para sondar a composição do citoplasma.

[00116] Como mostrado na FIG. 11, proteínas fluorescentes verdes estáveis (GFP) que expressam células HeLa foram tratadas na presença de siRNA que silencia GFP (Ambion, U.S. A) e analisadas pela FACS (FACS Canto II, BD Biosciences, U.S.A.) em 48 horas para der- rubamento de fluorescência. Os resultados na FIG. 11 indicam um der- rubamento >40% de expressão de gene — um resultado comparativo ao de agentes comerciais tal como Lipofectamina 2000 (Invitrogen, U.S. A). Controles de siRNA misturados, também na FIG. 11, indicam que esse derrubamento não é causado pelo próprio processo defor-mação.

[00117] Como mostrado nas FIGS. 13-14 e, as dimensões de es- premedura podem ter um efeito na eficiência de entrega geral do material de entrega 30. Por exemplo, as FIGS. 13-14 mostram que enquanto a pressão de operação é variada (por exemplo, variando-se o comprimento e/ou a largura da constrição 15) a eficiência de entrega geral varia um pouco (a FIG. 14 se relaciona à entrega de pontos quânticos (nano partículas) sob diferentes condições). Além disso, como mostrado nas FIGS. 18a-18b, a velocidade estimada das células pode ter um efeito na viabilidade e eficiência de entrega geral do material de entrega 30. Por exemplo, a FIG. 18a mostra que enquanto a velocidade de operação é variada, a eficiência de entrega geral varia um pouco. Adicionalmente, a FIG. 18b mostra que enquanto a velocidade de operação é variada, a viabilidade das células pode variar um pouco. Essas FIGS, mostram que uma mudança em comprimento de constrição pode realçar a entrega enquanto impacta minimamente a viabilidade. Adicionalmente, moléculas maiores entram na célula a uma taxa inferior após a constrição do que moléculas menores. Esse método de entrega descrito no presente documento é “universal” em que funciona para muitos tipos diferentes de materiais e células. Ademais, a as rupturas de membrana induzidas por esse dispositivo podem ter tipicamente pelo menos -100 nm em tamanho, embora outras rupturas de tamanho sejam possíveis.

[00118] Em referência à FIG. 12, em uma implementação, o gradiente de concentração entre o tampão de solução 25 e o citosol pode ser controlado para controlar de modo previsível a quantidade de material transmitido. Métodos de entrega localizada que expõem as células 20 a uma nuvem concentrada de macromoléculas após as células 20 terem sido poradas pela constrição podem ser usados. Qualquer tal método de entrega localizada , no entanto, deve contabilizar o tempo estimado de vedar novamente a perturbação para assegurar função apropriada. Isso pode ser implementado incorporando-se um “micro bocal” perpendicular ao canal que transmite uma alta concentração da carga útil para a proximidade da membrana celular (ilustrado em Figure 6A). Preferencialmente, o micro bocal pode estar localizado em e/ou próximo à constrição 15. Tal abordagem poderia permitir suplementa- ção do mecanismo de entrega difuso com um componente convectivo que desse modo habilita um carregamento de célula mais preciso com concentrações mais altas. Preferencialmente a injeção ocorre enquanto a célula 20 está em uma área de alta concentração da constrição 15. Uma técnica localizada tem a vantagem adicional de conservar materiais de entrega valiosos porque então não é necessário manter uma alta concentração ao longo de todo o tampão.

[00119] Em referência à FIG. 16a, uma série de micropilares 100 pode ser usada para aplicar pressão nas células 20 de modo que uma perturbação seja ocasionada. Nessa implementação, as células 20 são forçadas através de um arranjo de pilares constringentes de tal maneira que pressão seja aplicada nas células 20.

[00120] Em referência à FIG. 16b, chapas de compressão 105 podem ser usadas para aplicar pressão nas células 20 de modo que uma perturbação seja ocasionada. Nessa implementação, as chapas de compressão 105 podem ser controladas de modo que pressão seja aplicada nas células 20 por uma quantidade de tempo predefinida. As chapas de compressão 105 podem ser configuradas de modo que uma ou ambas as chapas se movam para aplicar pressão nas células 20. Um conjunto adicional de chapas de compressão 105 pode tam- bém ser provido de modo que as células 20 sejam substancialmente circundadas.

[00121] Em referência à FIG. 16c, aditivos de tampão 115 (ou materiais volumosos ligados à superfície da célula) podem ser usados para simular espremedura enquanto a célula 20 passa através de uma constrição 15 que é maior do que o diâmetro da célula 20. Por exemplo, constrição simulada devido à interferência dos aditivos de tampão 115 é possível. Exemplos de aditivos de tampão 115 inclui micro ou nano partículas (por exemplo, com base em polímero, com base em lipídico, com base em cerâmica, metálicas, etc.). Essas partículas são rotuladas com um ligante de ligação de célula tal como um anticorpo, uma sequência de DNA, um peptídeo ou uma molécula pequena, embora o mesmo não seja requerido.

[00122] Em referência à FIG. 16d, contas 120 podem ser usadas para comprimir a célula 20. Por exemplo, força magnética e/ou eletrostática pode ser usada para aplicar pressão na célula 20, ou no caso da FIG. 16e, para puxar a célula 20. Preferencialmente, a força aplicada na célula 20 é suficiente para causar uma perturbação.

[00123] Em referência à FIG. 16f, múltiplas correntes de fluido 125 podem ser direcionadas de tal maneira que a compressão (ou cisalhamento transitório rápido) da célula 20 seja ocasionada. Por exemplo, as múltiplas correntes de fluido 125 podem ser acionadas de tal maneira que se aproximam ou colidem uma com a outra. Enquanto as células 20 passam através das múltiplas correntes de fluido 125, uma força pode ser aplicada às células 20 de modo que uma perturbação na membrana da célula 20 seja ocasionada. Alternativamente, as células podem ser acionadas através de um bocal tipo racha estreito para facilitar a entrega.

[00124] O sistema 5 pode ser um sistema independente, tal como o mostrado na FIG. 7, embora outras configurações sejam possíveis. Por exemplo, o sistema 5 pode ser implantado in vivo em um paciente para entrega intracelular local e ou ser incorporado ex vivo em uma máquina para tratamento de células antes de retornar as células para o paciente.

[00125] Além das vantagens de entrega descritas no presente documento, a natureza microfluídica do sistema permite que um indivíduo exerça controle preciso sobre as condições de entrega, pré- tratamento e caracterização subsequente de células. Por exemplo, o sistema pode ser implementado em série com um módulo de Classificação de Célula Ativada por Fluorescência (FACS). Isso pode habilitar a entrega e a classificação das células desejadas no mesmo sistema, em tempo real. Vários pré-tratamentos e técnicas de avaliação pós- classificar podem também ser empregados, que desse modo habilita o desenvolvimento de avaliações de rendimento alto contínuas para triagem de drogas e diagnósticos.

[00126] A eficiência de entrega de uma carga útil entregue às células-alvo é determinada submetendo-se uma população de controle de células-alvo a uma carga útil assim como uma população que teve tratamento por um dispositivo microfluídico. A amostra de controle é exposta à mesma solução de entrega, na mesma concentração, para pelo menos a mesma quantidade de time que as células tratadas pelo dispositivo. Para compensar a ligação de superfície, endocitose, e outros efeitos tais como autofluorescência, uma região entregue é definida de modo que somente o topo 1 a 5% de células de controle vivas estão nessa região. A eficiência de entrega de uma amostra corresponde desse modo à porcentagem de células vivas que estão na região entregue. Por exemplo, a FIG. 43A é um histograma de intensidade da citometria de fluxo de uma população de controle que é exposta à dextrano 3KDa conjugado de cascata azul. A FIG. 43B é um histograma de intensidade de citometria de fluxo de células que foram submetidas a um dispositivo de 30pm a 6 pm. A região entregue definida é a região não sombreada tanto em 43 A quanto em 43B.

[00127] Em operação, em referência à FIG. 17, em referência adicional às FIGS. 1-3, um processo 1000 para realizar entrega intracelular o sistema 5 inclui os estágios mostrados. O processo 1000, no entanto, é exemplificador somente e não limitativo. O processo 1000 pode ser alterado, por exemplo, tendo estágios adicionados, removidos, alterados, ou redispostos.

[00128] No estágio 1005, as células 20 são solução tampão 25 suspensas junto a materiais de entrega 30. Concentrações de célula típicas podem estar na faixa de 104 a 109 células/ml. Concentrações de material de entrega podem estar na faixa de 10 mg/ml a 0,1 mg/ml. O material de entrega pode ser adicionado à célula tampão antes ou i- mediatamente após a entrega dependendo da configuração desejada dado que as lesões/poros permanecem abertas por 1 a 5 minutos. As soluções tampão podem ser compostas de uma série de sais, açúcares, fatores de crescimento, produtos derivados de animais ou qualquer outro componente necessário para proliferação de célula apropriada, mantendo saúde de célula ou indução de trajetórias de sinalização celular. Materiais adicionais também podem ser adicionados à solução tampão 25. Por exemplo, tensoativos (por exemplo, plurônicos) e/ou materiais volumosos podem ser adicionados à solução tampão 25.

[00129] No estágio 1010, a solução tampão 25 que inclui as células 20 e os materiais de entrega 30 são passados através do canal 10 do sistema 5. A solução tampão 25 pode passar através do canal 10 com o uso de gravidade, ou pode ser assistida por outros métodos. Por e- xemplo, a pressão pode ser aplicada à solução tampão 25 no lado de entrada do canal 10 (por exemplo, com o uso de um cilindro de gás e/ou compressor), e/ou um vácuo pode ser aplicado por uma bomba de vácuo no lado de saída. Adicionalmente, sistemas de fluxo baseado em deslocamento também podem ser usados.

[00130] À medida que as células individuais 20 passam através da constrição 15, uma pressão é momentaneamente aplicada à célula 20 pela construção sólida da constrição 15 causando perturbações tais como orifícios a se desenvolverem na membrana celular de modo que os materiais de entrega 30 possam ser entregues ao interior da célula 20. A quantidade e/ou duração da pressão aplicada à célula 20 pode ser variada ajustando-se as dimensões da constrição 15, a velocidade na qual a célula 20 passa através da constrição 15, e/ou ajustando-se o formato da constrição 15. Em uma configuração, aproximadamente 5.000 a 20.000 células/segundo passam através da constrição 15, e cada célula é constrita para aproximadamente 100 ps.

[00131] O sistema 5 pode incluir um ou mais dos canais 10. Por e- xemplo, o sistema 5 pode incluir 50 a 100 dos canais 10 que são dispostos em uma configuração paralela. O uso de uma configuração paralela pode reduzir as consequências de um desenvolvimento de obstrução em um ou mais dos canais 10, e pode aumentar a vazão geral do sistema 5. Adicionalmente, o sistema 5 pode incluir um ou mais dos canais em série um com o outro.

[00132] No estágio 1015, depois que as células 20 passam através da constrição 15, as células são permitidas à incubação/recuperação assentando-se na solução tampão 25. Durante esse tempo, as células 20 irão captar alguns dos materiais de entrega 30 está presente na solução tampão 25 através das perturbações na membrana celular. Um mecanismo de captação é baseado em difusão, devido ao fato de que moléculas maiores parecem ser absorvidas em uma taxa menor do que moléculas menores. Preferencialmente, as células 20 são permitidas à incubação/recuperação na solução tampão 25 na ordem de 2 a 5 minutos, embora outras durações sejam possíveis. Durante o tempo que as células 20 estão em incubação/recuperação na solução tampão 25, o material do interior da célula 20 também pode ser liberado da célula à solução tampão 25. Durante o período de incubação/recuperação, determinadas condições podem ser controladas para garantir que as quantidades de entrega dos materiais de entrega 30 são consistentes através da população celular. Por exemplo, pós- constrição, mecanismos de entrega convectiva que colidem material de entrega com a célula de incubação/recuperação podem ser usados.

[00133] Opcionalmente, no estágio 1020, depois que as células foram incubadas/recuperadas, as células podem ser lavadas para remover a solução tampão. Preferencialmente, a lavagem ocorre depois do período de tempo exigido para as perturbações a serem reparadas, embora a lavagem possa ocorrer em outros tempos de modo a controlar a quantidade de materiais de entrega 30 absorvida pelas células.

Exemplo 1 - Entrega de Nanopartículas manipuladas funcionais

[00134] Os nanomateriais manipulados têm imenso potencial como ferramenta de imageamento de célula viva, agentes terapêuticos de entrega molecular, ou mesmo como formas para manipular células vivas com meios externos tais como luz ou campos magnéticos. (Howarth, M., et al. Monovalent, reduced-size quantum dots for imaging receptors on living cells. Nature Methods 5, 397 a 399 (2008)). No entanto, muitas dessas aplicações potenciais exigem que nanomateriais sejam entregues à citosol de célula. A maioria das nanopartículas, tais como QDs, precisam ser passivadas com um polímero que torne as nanopartículas solúveis em meios aquosos, e isso geralmente evita que os mesmos se difusem de forma passiva através da membrana celular. A micro-injeção de nanopartículas é considerada impraticável devido à exigência de equipamento especializado e baixa vazão enquanto a eletroporação causa a agregação de QD dentro da célula. Portanto, a maioria das tentativas de entrega de QDs ao citoplasma celular se baseou em QDs sendo endocitosados pela célula e esca- pamento do endosoma. Antes da atual matéria, não era possível entregar QDs ao citoplasma celular de maneira satisfatória e escalável. Seu sistema fornece uma solução a esse sistema de entrega de abordagens anteriores.

[00135] O dispositivo microfluídico é combinado com uma nova geração de QDs biologicamente compatíveis recentemente descritos. (Liu, W., et al. Compact biocompatible quantum dots por meio de RAFT- mediated synthesis of imidazole-based random copolymer ligand. JACS 132, 472 a 483 (2010)). Os QDs usados em todo o exemplo 1 foram revestidos com urn ligante de poli-imidazol compreendido de múltiplos grupos de imidazol quelantes de metal e múltiplos po- li(etileno) glicol (PEG) de passivação de solubilização em água.

[00136] Para entrega de QDs citosólicos, as células foram aliquota- das em uma solução de PBS que contém QD. A solução de QD celular foi pipetada no dispositivo microfluídico e a solução foi acionada através dos canais em pressão constante, seguida por um período de incubação de 5 min. Após esse período de incubação, QDs em excesso foram separados por centrifugação. Para a população de controle, a solução de QD celular foi colocada no dispositivo microfluídico e as células foram expostas à QD solução por uma quantidade de tempo equivalente ao protocolo de entrega citosólica.

[00137] A FIG. 19 é uma camada de entrega e imagens fluorescente confocais, seguidas por imagens fluorescentes confocais de seção Z de células tratadas entregues com QDs com o uso da atual matéria. A FIG. 19 ilustra (topo) imediatamente após o tratamento (isto é entrega) e (fundo) após 48 h de incubação a 37CC e 5% de C02. O padrão de mancha difusa é restrito ao citoplasma e as nanopartículas parecem não entrar no núcleo (região escura dentro da célula). A barra de escala é de 10 pm. O ligante de poli-imidazol livre particular que reves- tiu os QDs imageados na FIG. 19 não teve funcionalidade exceto por fornecer biocompatibilidade através de grupos PEG. Imagens microscópicas confocais mostram que células HeLa, destacadas e arredondadas depois de fluir através do dispositivo microfluídico, têm mancha de QD citoplásmica difusa em todas as diferentes seções Z da célula (FIG. 19, topo). A mancha difusa persiste mesmo após 48 horas, seguindo a incubação e aderência das células a 37^ e 5% de CO2 (FIG. 19, fundo). A fluorescência de QD difusa é turva a 48hrs, provavelmente devido à Divisão celular (FIG. 19). Os QDs entregues por dispositivos (diâmetro hidrodinâmico de -13 nm) em -40% da população de células vivas em uma taxa de vazão de -10.000 células/s. A FIG. 20A ilustra a eficiência de entrega em célula HeLo citosol mediante tratamento de atual matéria com os QDs revestidos com PIL. A viabilidade de célula foi >80% conforme medido por citometria de fluxo. A FIG. 20B ilustra a viabilidade de células HeLa mediante entrega de QD535 plano pela atual matéria, conforme medido por mancha de iodeto de propídio e medição de citometria de fluxo. A viabilidade de células tratadas conforme medido por citometria de fluxo, a mancha difusa nas imagens confocais, e a capacidade de aderência da célula são consistentes com a entrega de QDs ao citoplasma de uma célula viva.

[00138] Para confirmar que a fluorescência de fato aparece do QDs entregues ao citosol como opostos aos QDs sequestrados em endo- somas, a nanopartícula foi projetada para mudar seu perfil de emissão mediante interação com o ambiente de redução do citosol. O potencial de redução dentro do citoplasma celular é de -260 a -220 mV e é primeiramente ditada pela manutenção de altas concentrações (5 a 10 mM) da glutationa de tripeptideo. Portanto, medindo-se a fluorescência de um construto de corante de QD cuja emissão muda quando exposto ao ambiente citosólico, a localização e acessibilidade química das nanopartículas entregues podem ser determinadas. Um corante de QD foi construído compreendendo um QD de emissão verde (Remissão = 541 nm) que atua como um doador de energia a um corante de carbo- xi-X-rodamina (Rox) (Remissão = 610 nm), conjugado através de uma ligação de disulfato redutível.

[00139] A FIG. 21 ilustra projeto de construção, absorção, e estabilidade em vários meios. Em 2100 é um esquema do PIL antes da conjugação com o corante e revestimento dos QDs (esquerda), e o cons- truto resultante de QD-disulfeto-Rox (direita) (imagem fora de escala). Em 2110 é o espectro de absorção do construto de QD-disulfeto- corante. A excitação a 488 nm e a 405 nm forneceu absorção exclusiva pelo QDs em todo o experimento. Em 2120 é a estabilidade de transferência de energia de fluorescência de QD para Rox para o construto nos meios de cultivo total a 3713 e 5% de CO2, que demons-tram que a ligação de disulfeto não é clivada no ambiente extracelular. O diagrama 2130 ilustra clivagem da ligação de disulfeto pela glutatio- na redutora citosólica, conforme mostrado pela recuperação de fluorescência de QD. Em 2140, a recuperação de fluorescência de QD mediante tratamento pelo tris(2-carboxietil) fosfina redutora de não tiol é mostrada, auxiliando adicionalmente a clivagem da ligação de disulfeto.

[00140] Os grupos de tiol que foram incorporados às ligações de disulfeto formados de PIL com corantes de Rox tiolado. O espectro de absorção do construto purificado tem recursos de absorção tanto em QD e Rox (2120) em uma média de 13 corantes de Rox por QD, arrefecendo de forma brusca e eficiente a fluorescência de QD (2130). Esse construto serve como um sensor irreversível do ambiente de redução específica no citosol. Quando o QD é seletivamente excitado por um laser a 488 nm (microscópio) ou 405nm (citometria de fluxo) enquanto as pontes de disulfeto estão intactas, o construto sofre transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) de modo que a emissão de Rox no vermelho seja dominante. Em um ensaio de solução, a glutationa redutora celular cliva as pontes de disulfeto, que liberam corantes de Rox e permitem a fluorescência de QD para recu-peração (2140). A tris-(2carboxietil) fosfina redutora baseada em não tiol também permite recuperação de fluorescência de QD, que indica que a liberação de Rox da superfície de QD não se dá por meio de deslocamento de PIL por glutationa (2140). A fluorescência de Rox pode não desaparecer completamente devido à soma das pontes de disulfeto que são estericamente inibidas por grandes grupos PEG no PIL, e devido a uma pequena quantidade de interação não específica entre o corante e a superfície de QD.

[00141] Mudanças no perfil de fluorescência do construto, conforme medido por citometria de fluxo e microscópio confocal, confirmam a entrega de construtos de QD-disulfeto-Rox à citoplasma celular. Quando expostos ao ambiente citosólico de redução, a clivagem das ligações de disulfeto rompe o processo de FRET do QD ao corante. Portanto, mediante excitação exclusiva do QD, a fluorescência de canal de QD aumenta enquanto a fluorescência de canal Rox diminui com o tempo. As células HeLa vivas foram tratadas pelo dispositivo microfluídico em uma solução com uma alta concentração de QD- disulfeto-Rox, incubado por 5 minutos, e lavadas para remover QDs em excesso antes da adição dos meios de cultivo celular (isto é, as células tratadas). As células de controle foram incubadas com QD- disulfeto-Rox por 5 minutos ao invés de serem tratadas pelo dispositivo microfluídico, e lavadas antes de serem colocadas em meios de cultivo celular. A fluorescência de canal de Rox e QD dessas células tratadas e controle foram observados tanto por microscópio confocal por citometria de fluxo.

[00142] As FIGS. 22A e 22B ilustram imagens confocais de microscópio de célula viva e análise de intensidade de fluorescência que de- monstra mancha citoplásmica e acessibilidade química de superfície de QD. A FIG. 22A ilustra imagens de células tratadas (topo) e células de controle (fundo). A aparição de fluorescência verde difusa está presente somente em células tratadas. A barra de escala é de 10 pm. A FIG. 22B ilustra uma mudança de intensidade como uma função de tempo nos canais verde e vermelho. Devido ao fato de que n<20 em cada ponto de tempo, flutuações na fluorescência média total foram corrigidas normalizando-se ao ponto de tempo de 0 h.

[00143] Sob o microscópio confocal, a fluorescência difusa que aparece através do citoplasma de células tratadas progride do vermelho forte ao verde forte (conforme mostrado na FIG. 22A). Imagens de célula de controle mostram alguma ligação não específica na membrana externa conforme demonstrado pela fluorescência em formato de anel, e não há aumento de sinais de canal verde. Esses efeitos são consistentes com a clivagem esperada de ligações citosólicas de disulfeto que reduzem o efeito de FRET. Na FIG. 22B, o gráfico de linha aponta a intensidade média de canal de QD e Rox por célula após a correção das diferenças de célula-célula no material fluorescente entregue nor- malizando-se para fluorescência total, para células tratadas e controle e autofluorescência. Para células tratadas, o gráfico mostra um cruzamento entre 2 a 4 horas de incubação em que a fluorescência de QD aparece acima da fluorescência de Rox. de modo interessante, o sinal de Rox de célula tratada é mostrado para se estabelecer acima dos níveis de autofluorescência depois de 9 horas. Isso é consistente com os resultados dos ensaios de solução, em que algum FRET permaneceu após a redução. A mancha difusa observada e aumento de sinal de QD e redução de sinal de Rox auxilia amplamente a entrega citosó- lica e subsequente divagem de ligação de disulfeto. A fluorescência de QD em células de controle, arrefecida bruscamente por FRET ao Rox, aparece indistinguível da autofluorescência. As células de controle exibem alguma fluorescência de Rox acima da autofluorescência em pontos precoces de tempo, que então diminuem imediatamente. Isso pode ser atribuído às interações não específicas entre QD-S-S-Rox e a superfície da célula, seguida por ressolvatação dos construtos ao meio.

[00144] A FIG. 23 ilustra a medição de citometrias de fluxo de fluorescência média de célula e viabilidade. Em 2300 é fluorescência média de QD (esquerda) e Rox (direita) por célula, que mostra um aumento de fluorescência de QD somente em células tratadas. A fluorescência de Rox em ambas as células tratadas e controle estão em níveis de autofluorescência pelo ponto de tempo de 24 h. Em 2310 é um histograma da distribuição de intensidades de fluorescência entre as células tratadas e controle na seleção de pontos de tempo, no canal de QD (esquerda) e canal de Rox (direita). Estima-se que a entrega de QD tenha ocorrido em pelo menos 35% da população celular. As áreas verdes são destinadas a orientar o olho no movimento de picos de his-tograma de intensidade de fluorescência. Em 2320 ilustra a viabilidade de células de controle e tratadas conforme medido por iodeto de pro- pídio.

[00145] As medições de citometria de fluxo ilustradas na FIG. 23 confirmam que os construtos de QD-disulfeto-Rox podem interagir com o ambiente citosólico. medições de citometria de fluxo foram registradas em todas as células vivas, que abrangem células tanto entregues (-35% da população de célula tratada) quanto as células não entregues. Em 2100 a fluorescência média por célula das populações tratadas e de controle é ilustrada. A fluorescência média de QD aparece inicialmente para as células tratadas, atingindo o ápice em -9 horas e caindo gradualmente em seguida, em contraste à fluorescência de QD da população de célula de controle, que permanece comparável a níveis de autofluorescência. Isso é consistente com a redução citosólica de pontes de disulfeto entre o QD e o corante dentro das células tratadas seguido pela diluição de construtos de fluorescência por divisão celular. A fluorescência de Rox para ambas as células tratadas e con-trole começa alta e cai dentro das 2 horas. Essa queda é atribuída à ressolvatação no meio de partículas que se ligaram à superfície da célula durante a incubação. A fluorescência média de Rox na população de célula tratada parece similar às células de controle devido à presença de células não entregues dentro da população tratada. A presença tanto de células entregues quanto de células não entregues dentro da população tratada pode ser distinguida nos histogramas de intensidade de QD e Rox mostrados em 2310. Com tempo crescente, os histogramas de fluorescência se tornam bimodais para as células tratadas, mas permanecem unimodais para células de controle. A fluorescência de QD aparece com o tempo em um subconjunto da população de célula tratada (2100), auxiliando adicionalmente a ruptura do processo de FRET no citosol de células tratadas e entregues. A fluorescência de Rox diminui de forma geral à medida que os construtos ligados à membrana são ressolvatados ao meio, mas um subconjunto da população de célula tratada retém a fluorescência de Rox. Isso é consistente com a redução incompleta de ligações de QD-S-S-Rox observadas em microscópio confocal. A viabilidade da população de célula tratada, conforme medido pela mancha de iodeto de propídio, está dentro de 10% da população de controle em todos os pontos de tempo (2130). A viabilidade de célula de >90% em relação ao grupo de controle se compara de forma favorável aos métodos alternativos tais como eletroporação e métodos baseados em polímero, que renderam viabilidades de pós-tratamento tão baixas quanto 40 a 60%.

[00146] A FIG. 24 ilustra imageamento de epifluorescência de QDs únicos não agregados dentro do citosol de célula após o tratamento de dispositivo com uma solução de 10 nM QD (topo), e traços intermiten- tes dos três QDs rotulados 2400, 2410, e 2420 com autofluorescência. Os traços intermitentes de QD parecem ser não binários devido à grandes tempos de distância de aquisição (500 ms). As Barras de escala são de 10 pm.

[00147] A plataforma de distribuição de QD também permitiu ima- geamento de célula única entregando-se construtos não agregados de QD-disulfeto-Rox, conforme a intermitência de emissão observada é consistente com QDs únicos. Para esses experimentos, construtos de QD-disulfeto-Rox foram entregues ao citosol seguido por uma incubação de 10 horas e imageadas em um microscópio de epifluorescência. A incubação de 10 horas garantiu que a fluorescência de QD de dentro ao citosol se recuperou por meio de ligação de redução de disulfeto; o microscópio de epifluorescência foi usado para garantir que fótons suficientes fossem coletados. Diversos QDs intermitentes foram observados quando células foram tratadas pela atual matéria em baixas concentrações de QD (FIG. 24). Os traços de intensidade de QDs in-termitentes no citosol, mostrados em 2400, 2410, e 2420, parecem não binários conforme um resultado de grandes tempos de distância de aquisição (500 ms). Movimentos de célula translacionais foram avaliados mínimos durante o quadro de tempo da aquisição (~1 min). Esses dados demonstram a capacidade de observar eventos de molécula única dentro do citosol de célula entregando-se QDs com rotulações fluorescentes com o uso da atual matéria.

[00148] O exemplo 1 demonstra entrega de nanopartícula em citosol de célula de acordo com uma modalidade da atual matéria. Obser- vando-se a clivagem de QD-disulfeto-Rox por redutores citosólicos, foi demonstrado que a superfície de nanopartícula interage com componentes citosólicos. As modalidades da atual matéria permite a entrega de QDs em citoplasma celular em alta vazão sem nenhuma penetração de célula ou ligantes de escapamento de endosoma, ao conservar a viabilidade de célula e integridade de QD. A eficiência de entrega de 35% pode ser ainda aumentada aumentando-se o número de constrições microfluídicas, mudando-se dimensões de constrição, ou aumen- tando-se o número de ciclos de tratamento. Diferente da maioria dos peptídeos que penetra a célula atual ou métodos de entrega auxiliada por carga positiva, a atual matéria não exige dupla conjugação de um manuseio de entrega intracelular e um manuseio de alvo de proteína citosólica na mesma nanopartícula. Dispensando-se a necessidade do formador, a mitigação das questões de sensitividade cruzada, eficiências de reatividade não iguais de estratégias de conjugação, e conjugação estequiometria podem ser alcançadas. Portanto, flexibilidade significativa de projeto de construção de QD é obtida, abrindo caminho para rotulação e rastreamento de proteína intracelular. Os métodos são úteis para a entrega de muitos nanomateriais fluorescentes com projetos complexos que almejam em proteínas intracelulares e organe- las através de estratégias provadas de almejamento de proteína tais como, porém sem limitação, estreptavidina-biotina, HaloTag- cloroalcano, e marcação de sorteio.

[00149] No exemplo 1, todos os produtos químicos foram obtidos de Sigma Aldrich e usados conforme recebidos a menos que indicados de outro modo, materiais sensíveis ao ar foram manuseados em uma caixa de luvas Omni-Lab VAC sob atmosfera de nitrogênio seco com níveis de oxigênio <0,2ppm. Todos os solventes foram espectroscópicos ou reagentes. Os compostos que têm anel aromático foram visualizados em TLC com o uso de uma lâmpada de UV portátil e KMnO4. compostos que têm amina foram visualizados em TLC com o uso de uma mancha Ninhydrin. A cromatografia em coluna Flash foi realizada em um Teledyne Isco Combi Flash Companion. As células HeLa foram adquiridas de ATCC e todos os materiais de meio celular foram adquiridos junto à Mediatech a menos que indicados de outro modo.

[00150] No exemplo 1, Os espectros 1H NMR foram registrados em um espectrômetro Bruker DRX 401 NMR. MS-ESI foi realizado em uma máquina Bruker Daltonics APEXIV 4.7 FT-ICR-MS. Espectros de absorção de UV-Vis foram tomados com o uso de um espectrofotôme- tro de arranjo de diodo HP 8453. Os espectros de fotoluminescência e absorção foram registrados com um leitor BioTek Synergy 4 Microplate. Os pesos moleculares de polímero foram determinados em solução de DMF em um sistema HPLC/GPC de série Agilent 1100 com três volumes de PLgel (103, 104, 105 A) em série em padrões de poliestireno estreito. Derivados de corante foram purificados com o uso de sistema HPLC Varian ProStar Prep. O polímero modificado foi purifi-cado com o uso de colunas GE Healthcare's PD-10 empacotadas com SefadexTM G-25M. QDs de ligantes trocados foram purificados por diálise de centrifugação com filtros centrífugos cortados Millipore Ami- con Ultra 30K e por GFC em sistema de cromatografia AKTAprime Plus (Amersham Biosciences) equipados com uma coluna de vidro au- to-empacotada Superdex 200 10/100. Medições de citometria de fluxo foram feitas em LSR Fortessa (BD Biosciences).

[00151] No exemplo 1, núcleos de CdSe com primeiro pico de absorção 478nm foram sintetizados com o uso de um método anteriormente relatado (1). Para resumir, 0,4 mmol (54,1 mg) de CdO, 0,8 mmol (0,2232g) de TDPA, 9,6mmol (3,72g) de TOPO foram colocados em frasco de fundo arredondado de 25ml. A solução foi degaseificada por 1 hora a 1600 e aquecida a 3000 sob argônio a té que o CdO ter dissolvido e formou uma solução homogênea clara. Isso foi seguido colocando a solução sob vácuo a 1600 para remover água evoluída. A solução foi pré-aquecida a 3600 sob argônio e uma solução de TOP-Se (1,5ml de 1,5M TOP-Se em 1,5ml de TOP) foi rapidamente adicionada para gerar núcleos de CdS e com o primeiro recurso de absorção a 478nm.

[00152] Conchas de CdS foram depositadas em núcleos de CdSe por meio de modificação de procedimentos anteriormente relatados (2). Núcleos isolados por precipitações repetidas de hexano com acetona foram trazidos a IδO'C em uma mistura de solve nte de oleilamina (3 ml) e octadeceno (6 ml), soluções precursoras de Cd e S foram então introduzidas continuamente em uma taxa de 4 ml/hr. O Cd precursor consistiu em Cd-oleato com 0,33 mmol e oleilamina com 0,66 mmol em uma mistura de solvente de octadeceno (1,5 ml) e TOP (3 ml). O precursor S consistiu em hexametildisilatiano com 0,3 mmol [(TMS)2S ] em 6 ml TOP.A adição de um total de 3 monocamadas cada uma de Cd e S rendeu QDs com emissão em 541 nm e um rendimento quântico de 60% quando diluído em octano. O coeficiente de extinção de CdSe(CdS) foi calculado com o uso do coeficiente de extinção de núcleos de CdSe da literatura (3) e assumindo que 95% dos núcleos de CdSe foram retidos durante a etapa de sobrerevestimento.

[00153] No exemplo 1, o chip de silício foi fabricado com o uso de foto litografia e técnicas de entalhe de íon reativo profundo. A lâmina de silício entalhado resultante foi limpa (com H202 e H2S04) para remover detritos, oxidada para produzir uma superfície de vidro, e ligada a uma lâmina de Pyrex antes de ser cortada em cubo em dispositivos individualmente empacotados. Cada dispositivo foi então individualmente inspecionado para defeito antes do uso.

Exemplo 2 - Entrega de Macromoléculas

[00154] Entrega de macromoléculas intracelulares é uma etapa crucial de aplicações terapêuticas e de pesquisa. A entrega mediada por nanopartícula de DNA e RNA, por exemplo, é útil para terapia de genes, enquanto a entrega de proteína é usada para afetar a função celular tanto em definição clínica quanto laboratorial, outros materiais, tais como moléculas pequenas, pontos quânticos, ou nanopartículas de ouro, são entregues ao citosol para propósitos que variam de terapias de câncer à rotulação intracelular e rastreamento de molécula ú- nica.

[00155] Para demonstrar a versatilidade da técnica, moléculas de dextrano de modelo foram entregues a diversos tipos de célula: células dendríticas DC2,4, fibroblastos de prepúcio humano recém nascido (NuFF) e células tronco embriônicas de rato (mESC) obtiveram eficácias de entrega de até 55%, 65% e 30% respectivamente. Experimentos iniciais também mostraram entrega bem sucedida de linfócitos primários, macrófagos e células dendríticas derivadas de ratos. Ademais, a técnica não causou citotoxidade excessiva ou induziu diferenciação de célula tronco. De fato, todos os tipos de célula eram acima de 60% viáveis mesmo nas maiores velocidades testadas. O projeto de dispo-sitivo e condições de operação não foi anteriormente otimizado por nenhum dos tipos de célula mencionados anteriormente.

[00156] A FIG. 25 ilustra resultados experimentais que mostram que o desempenho de entrega depende da velocidade da célula e projeto de constrição. As dimensões de constrição são indicados por números (por exemplo, 10pm-6pmx5) de modo que o primeiro número corresponde ao comprimento de constrição, o segundo à largura de constrição e o terceiro (se presente) ao número de constrições em série per canal. Em 2500, a eficiência de entrega é mostrada e em 2510 a viabilidade de célula 18 horas pós-tratamento (medido por citometria de fluxo) é mostrada como uma função de velocidade da célula para projetos de dispositivo de 40pm a 6pm (o), 20pm a 6pm (□) e 10pm- 6pmx5 (Δ). Em 2520, eficiência de entrega e 2530 viabilidade de célula (medido por citometria de fluxo) é mostrada como uma função de velocidade em fibroblastos humanos primários (□), DC2.4 células dendríticas (o), e células tronco embriônicas de rato (mESC) (Δ) tratadas por um dispositivo de 30pm a 6pm dispositivo. Os fibroblastos humanos e células dendríticas foram analisados 18 horas pós-entrega. MESCs foram analisados 1 hora pós-entrega. Todos os pontos de dados foram executados em triplicado e barras de erro representam dois desvios de padrão.

[00157] A FIG. 26 ilustra varreduras 2600 de diferentes planos horizontais de uma célula HeLa após a entrega de dextrano 3kDa conjugado de azul pacífico, conforme medido pelo microscópio confocal. Varreduras leem do topo ao fundo, então esquerda à direita em que a esquerda superior está em <=6.98pm e direita inferior está em <=- 6.7pm. Barra de escala representa 6pm. Em 2610, eficiência de entrega de célula viva de dispositivos de 10pm a 6pm (□), 20pm a 6pm (o), 30pm a 6pm (Δ), e 40pm a 6pm (0) é mostrada. O eixo geométrico de tempo indica a quantidade de tempo transcorrido de tratamentos iniciais de célula antes que os mesmos fossem expostos à solução de entrega alvo. Todos os resultados foram medidos por citometria de fluxo 18 horas pós-tratamento. Em 2620, intensidade média da população de célula entregue normalizada por células não tratadas para controlar a autofluorescência. dextrano 70kDa conjugado de fluoresceína (linhas horizontais) e dextrano 3kDa conjugado de azul pacífico (linhas diagonais) são entregues à célula (ciclos 1 e 3) e removidos da célula (ciclo 2) em ciclos consecutivos de tratamento. O controle representa células que foram somente expostas à entrega solução e não tratadas pelo dispositivo. Todos os pontos de dados foram executados em triplicado e barras de erro representam dois desvios de padrão.

[00158] Como as técnicas anteriores de entrega baseadas em na- nopartícula e peptídeo que penetra em célula (CPP) explicam trajetórias endocitóticas, é apresentada evidencia de que regras fora da influência da endocitose no mecanismo de entrega de matéria real. A FIG. 26 ilustra em 2600 microscópio confocal de células tratadas com dextrano 3kDa conjugado de azul pacífico demonstram mancha citosó- lica difusa como opostas à característica pontuada, se esperaria de métodos endocitóticos. Ademais, quando os experimentos de entrega são conduzidos a 4CC, uma temperatura na qual a end ocitose é minimizada, eficiência de entrega é minimamente afetada pela temperatura de ambos os materiais de carga útil de teste, 3kDa e 70kDa dextrano. Esses dados indicam que a endocitose é improvável de ser responsável pela entrega nesses sistema.

[00159] Cinética de entrega ao longo do tempo foi caracterizada. As células foram tratadas pela matéria atual na ausência de material de entrega e subsequentemente exposto ao dextrano 3kDa de azul pacífico em intervalos de tempo definidos pós-tratamento. nessa abordagem, que as células passam através da constrição, sua membrana é rompida; no entanto, nenhuma entrega mensurável ocorre até que as mesmas sejam expostas ao dextrano rotulado. Desse modo, a eficiência de entrega em cada ponto de tempo refletiria na proporção de células que permaneceram porosas por essa quantidade de tempo pós- tratamento. Esse método captura a cinética de formação/fechamento de poro. Os resultados indicam que quase 90% de entrega ocorre dentro do primeiro minuto após o tratamento independente do projeto de dispositivo (2610). A escala de tempo observada auxilia a hipótese de formação de poro conforme anteriormente, funciona na cinética de reparo de membrana relataram vedação de membrana que ocorre cerca de 30s depois que uma lesão é induzida. Em contraste, a escala de tempo recomendada para métodos endocitóticos tais como mecanismo de entrega mediada de nanopartícula e CPP está na ordem de horas.

[00160] Visto que a entrega de material através dos poros de membrana é difusa, o material poderia ser trocado na célula e fora da mesma em todo o tempo de vida do poro. Mecanismos endocitóticos ou convectivos, por outro lado, precisam ser unidirecionais, isto é, facilitam somente o transporte de material à célula. Para demonstrar transporte bidirecional de material através da membrana celular, foi conduzido um experimento que consiste em 3 ciclos de entrega. No primeiro ciclo, células foram tratadas na presença de 3kDa e 70kDa dextrano, incubadas por 5 min na solução de dextrano e lavadas duas vezes com PBS. Uma terceira da amostra foi retida e laminada para acompanhamento. No segundo ciclo, as células lavadas remanescentes foram tratadas pelo dispositivo novamente, mas na ausência de qualquer material de entrega e incubadas por mais 5 min. Metade dessa amostra foi laminadas para acompanhamento. No terceiro ciclo, as células remanescentes do segundo ciclo foram executadas através do dispositivo sob as mesmas condições que o primeiro ciclo (isto é na presença de dextrano), incubadas por 5 minutos e lavadas duas vezes in PBS. As células foram analisadas por citometria de fluxo 18 horas após o experimento. As mudanças na intensidade de fluorescência normalizada demonstraram uma difusão líquida de dextrano às células durante o primeiro ciclo, fora das células durante o segundo, e de volta durante o terceiro (2620). Esses resultados são desse modo consistentes com o mecanismo de entrega difuso.

[00161] A FIG. 27 ilustra um modelo de difusão 2D simplificado desenvolvido em um pacote de software conhecido como COMSOL Mul- tifysics que simula difusão passiva de material em uma célula através de uma membrana porosa. COMSOL Multifysics é uma software de análise de elemento finito, resolvedor e de simulação / Pacote de software FEA desenvolvido por COMSOL para vários físicos e aplicações de engenharia, fenômenos especialmente acoplados, ou multifísicos. Em 2700, a entrega/perda de material é mostrada como uma função de capacidade de difusão da membrana. Os resultados de simulação que indicam a porcentagem de material entregue/perdido da célula como uma função de difusividade da membrana quando o material de interesse está no tampão (□) ou na célula (o) no tempo de poração. Em 2710 está uma representação gráfica do sistema simulado e o gradiente de concentração que se forma através da membrana se o material for entregue do tampão à célula.

[00162] Com o uso dos valores de literatura para difusividades de partícula dentro e fora do citoplasma celular, os experimen- tos/resultados da FIG. 26 foram qualitativamente recriados com difusão como o único modo de transferência de massa. Ademais, adap- tando-se os dados experimentais a esse modelo, essa técnica entrega 10 a 40% do material de entrega no tampão ao citosol de célula. Por comparação, os métodos CPP para entrega de proteína são estimados para entregar somente 0,1% do material de tampão ao citosol.

[00163] Um tamanho de partícula (ou raio hidrodinâmico) afeta sua difusividade e sua capacidade de entrar nos poros de membrana de um tamanho particular. Desse modo, esse parâmetro afeta a eficiência de entrega no mecanismo de formação/difusão de poro. Em uma série de experimentos, cargas úteis de teste de dextranos 3kDa, 10kDa, 70kDa, 500kDa, e 2MDa conjugados de fluoresceína ou azul pacífico foram entregue. Plasmídeos rotulados de Fluoresceína estimados em 3.1 MDa também foram entregues. Essas moléculas modelo foram selecionadas com base em sua similaridade de peso molecular para materiais de entrega de interesse. 3kDa-10kDa dextrano, por exemplo, são de tamanho similar a alguns peptídeos curtos ou siRNA, enquanto a faixa de 70kDa a 2MDa simula o tamanho da maioria das proteínas e algumas pequenas nanopartículas.

[00164] A FIG. 28 ilustra resultados de uma entrega de material em duas escalas. Em 2800, a eficiência de entrega de célula viva, como uma função de velocidade, para células HeLa tratadas com dextrano 3kDa (□) conjugado com Azul pacífico, 70kDa (o) conjugado para fluoresceína e 2MDa (Δ) é mostrada. Esse experimento foi conduzido com um 10pm-6pmx5 chip. Todos os pontos de dados foram executados em triplicado e barras de erro representam dois desvios de padrão. 2810 e 2820, ilustram camadas histograma de dados de citometria de fluxo para células HeLa que são não tratadas (vermelhas), tratadas a 700mm/s (verde), tratadas a 500mm/s(alaranjada), tratadas a 300mm/s (azul claro), ou somente expostas ao material de entrega (controle, azul escuro). O material de entrega consistido em dextrano 3kDa conjugado de azul pacífico (2810) e dextrano 70kDa conjugados de fluoresceína (2820).

[00165] Os experimentos mostraram que as moléculas maiores do que 70kDa têm um perfil de entrega diferente em relação ao dextrano 3kDa (2800). O dispositivo produziu uma entrega em duas escalas em que um 10pm-6pmx5 dispositivo operado a 500mm/s, por exemplo, permite acima de 90% de células vivas para receber as moléculas de 3kDa, enquanto cerca de 50% recebe as moléculas maiores de 70kDa e 2MDa.

[00166] Os histogramas correspondentes a esses dados de citometria de fluxo indicam que a entrega de dextrano 3kDa produz dois picos distintos (2810). Na primeira subpopulação, células exibem níveis brandos de entrega conforme observado por uma mudança de pico em relação aos controles (conta de controles para endocitose e ligação de superfície conforme descrito anteriormente para os pontos de dados 0 mm/s) com um aumento de 2-6x de intensidade de fluorescência média. Na segunda população, as células exibem níveis acentuados de entrega correspondente a um aumento de 20 a 100x de intensidade de fluorescência média em relação aos controles. Esse efeito pode indicar que última subpopulação de células foi porada mais severamente do que o formador, permitindo então um aumento de quase 10x de influxo de material. De fato, conforme ilustrado pelas curvas de 300mm/s, 500mm/s e 700mm/s, aumentar a severidade de tratamento, aumentando-se as velocidades operacionais, parece aumentar a proporção de células com entrega acentuada. Observa-se uma característica similar para a entrega de moléculas maiores de dextrano 70kDa (2820). O efeito é menos pronunciado, no entanto, à medida que difusividade menor de partícula e possíveis efeitos de exclusão de tamanho reduzem a quantidade geral entregue. A população de entrega branda (primeiro pico) mostra somente um aumento de 1,5 a 2x de intensidade fluorescente média conforme comparado ao de 2 a 6x observado no caso de 3kDa. Esse efeito poderia considerar a discrepância nos dados de entrega em 2800 como no caso de moléculas maiores a população de entrega branda poderia ser difícil de distinguir dos controles com base na definição presente de entrega. Como um resultado, para moléculas maiores, tais como o dextrano 70kDa e 2MDa, mede- se amplamente a segunda população de entrega acentuada

[00167] Para verificar se o material entregue por deformação mecânica rápida está ativo e biologicamente estável no citosol celular, uma série de experimentos foram conduzidos entregando siRNA de silenci- amento de GFP de carga útil de teste (Ambion, EUA) a células HeLa que expressam GFP desestabilizado. O silenciamento de GFP específico de sequência e dependente de dose (até 80%) em 18 horas após o tratamento foi observado. A resposta de silenciamento de gene à velocidade celular e projeto de dispositivo foi consistente com os experimentos de entrega de dextrano de modo que velocidades mais altas e múltiplos projetos de constrição rendam silenciamento de gene maior. Lipofectamina 2000 foi usada como um controle positivo nesses experimentos. O projeto de dispositivo e parâmetros de operação não foram otimizados para entrega de siRNA antes de realizar esses experimentos.

[00168] A FIG. 29 ilustrar dados relacionados à entrega de SiRNA, proteína e nanopartícula. Em 2900, o silenciamento de gene é ilustrado como uma função de tipo de dispositivo e velocidade celular, em células HeLa que expressam GFP desestabilizado 18 horas após a entrega de um siRNA anti-eGFP com o uso de um fragmento de 10 pm-6 pm x 5 a uma concentração de entrega de 5 pM. Lipofectamina 2000 foi usada como um controle positivo. Em 2910, a eficácia de entrega de dextrano de 70 kDa identificado com fluoresceína e de 3 kDa identificado com azul pacífico por deformação mecânica rápida e ele- troporação é mostrada. Cada tipo de dextrano estava a uma concentração de 0,1 mg/ml na solução de entrega. Em 2920, a eficácia de entrega de albumina sérica bovina identificada com fluoresceína (o), eficácia de entrega de dextrano 3 kDa conjugado por azul pacífico (□) e viabilidade de célula (Δ) são mostradas como uma função de velocidade, com o uso de um dispositivo de 30pm-6pm. Em 2930, micrográ- ficos fluorescentes de células HeLa imediatamente após a entrega de anticorpos à tubulina com uma etiqueta Fluor 488 são mostrados. Barras de escala a 5 pm. Em 2940 e 2950 são mostradas imagens de microscópio eletrônico de tunelamento (TEM) de nanopartículas de ouro (algumas indicadas por setas) em células fixadas aproximadamente 1 segundo após o tratamento por um dispositivo de 10 pm-6 pmx5. Barras de escala a 500 nm. Todos os pontos de dados foram executados em triplicada e as barras de erro representam dois desvios padrão.

[00169] Em experimentos adicionais, o potencial de entrega citosó- lica é explorado para aplicações previamente desafiadoras, tal como entrega de proteína e nanopartícula. Para comparar o desempenho da presente matéria a métodos comercialmente disponíveis, dextrano 3 kDa e 70 kDa foi entregue, como um modelo de proteína, a fibroblas- tos humanos com o uso da presente matéria e um sistema de eletro- poração Neon (Invitrogen). Os resultados indicam que a deformação mecânica rápida fornece um aumento de 7 vezes ou maior em eficácia de entrega para tais macromoléculas (2910). Para traduzir o método em entrega de proteína, um dispositivo de diâmetro de canal de 30pm- 6pm foi usado para entregar albumina sérica bovina identificada com fluoresceína (BSA) a células HeLa em até 44% de eficácia enquanto mantém viabilidades acima de 90% (2920). Os anticorpos identificados com Alexa Fluor 488 a tubulina (Bio Legend) foram também entregues a células HeLa após o tratamento com um dispositivo 30pm-6pm com o uso de uma concentração de anticorpo de 0,25mg/ml (2930). O manchamento difuso indica que o material não está preso em endossemos e, portanto, é adequado para manchamento de anticorpo em célula viva de estruturas celulares no citosol. Apolipoproteína E foi também entregue com sucesso com o uso dessa técnica.

[00170] Para entrega de nanopartícula, imagens TEM de células fixadas aproximadamente 1 segundo após a deformação (2940 e 2950) demonstram a entrega de PEG 1000 revestido, nanopartículas de ouro de 15 nm. As nanopartículas de ouro parecem estar em sua maioria não agregadas e não foram visivelmente sequestradas em endossemos. Nessas imagens, a evidência para vários defeitos no citoplasma celular responsável pela entrega foi observada. Rendimento alto foi demonstrado, entrega não citotóxica de pontos quânticos diretamente ao citosol celular - um objetivo que as técnicas anteriores têm dificuldade de atingir. Nesses experimentos, os pontos quânticos com um corante Rox ligado a sua superfície foram entregues por deformação mecânica rápida e observados pelo tempo. Esses dados renderam uma eficácia de entrega estimada mínima de 35% e confirmaram que os pontos quânticos entregues estavam no citosol e quimicamente a- cessível ao ambiente intracelular.

[00171] Poros transientes são formados por deformação mecânica rápida de uma célula conforme a mesma passa através de uma constrição de microfluido. Os dados suportam esse mecanismo demonstrando manchamento citosólico difuso (FIG. 26 em 2600), funcionalidade de siRNA (FIG. 29 em 2900) e o movimento bidirecional de mate- rial através da membrana com poros (FIG. 26 em 2920). Diversos parâmetros foram identificados, tal como dimensões de constrição, número de constrições em série e velocidade celular que afetam a viabilidade e eficácia de entrega (FIG. 25). Esses parâmetros podem ser, portanto, usados para otimizar o projeto de dispositivo para aplicações individuais com base no tipo celular e no tamanho do material de entrega.

[00172] No exemplo 2, essa técnica se baseia nos sistemas de mi- crofluido, que podem ser incorporados em um sistema integrado maior que consiste em múltiplas etapas de pré-tratamento antes da entrega e etapas de análise de classificação pós-tratamento. Em uma taxa de rendimento médio de 10.000 células/segundo, o dispositivo de entrega pode ser, por exemplo, colocado em linha com uma máquina de citometria de fluxo para classificar células ou realizar outras tarefas analíticas imediatamente após a entrega.

[00173] Os dispositivos, sistemas e métodos descritos no presente documento fornecem diversas vantagens potenciais sobre os métodos existentes. Similarmente à eletroporação e microinjeção, é um método baseado em formação de poros e, portanto, não contam com materiais exógenos, modificação química de cargas úteis ou trajetórias endocitó- ticas. Em contraste à eletroporação, no entanto, o mesmo não conta com campos elétricos que tiveram sucesso limitado na entrega de proteína, pode danificar parte da carga útil ou causar citotoxicidade. De fato, os resultados atuais demonstraram viabilidade relatividade alta na maioria das aplicações e cargas úteis sensíveis, tais como pontos quânticos, parecem não ser danificados. A presente matéria assim fornece vantagens significativas em áreas tais como a identificação e ras- treamento de material citosólico em que dano de ponto quântico devido à eletroporação pode ser um problema e o uso de métodos de entrega química pode restringir a faixa de produtos químicos de superfí- cie disponíveis.

[00174] O Exemplo 2 também demonstrou a capacidade do dispositivo de entregar proteínas ao citosol celular. Os dados e estimativas de modelação indicam que a presente matéria poderia entregar 10 a 100x mais material por célula em relação às práticas anteriores, tal como o uso de peptídeos de penetração celular ou eletroporação. Esse aprimoramento em taxas de entrega fornece um método potente para uso em reprogramação celular baseada em proteína, por exemplo, em que a entrega de fatores de transcrição ao citosol celular é um obstáculo principal ao desenvolvimento de métodos confiáveis de geração de iPSC. Pode-se também usar a presente matéria para estudar um mecanismo de doença por entrega de várias proteínas/peptídeos de interesse. De fato, a presente matéria pode ser usada para triagem de rendimento alto de bibliotecas de peptídeos devido ao fato de que, diferente da maioria das técnicas baseadas em nanopartícula ou CPP, a presente matéria é insensível à estrutura e química da proteína, não contam com trajetórias endocitóticas e não afetam a funcionalidade da proteína.

[00175] Devido ao fato de que a presente matéria demonstrou o potencial para entrega a células primárias, a entrega citosólica por deformação mecânica rápida pode ser implantada como um mecanismo de tratamento ex vivo. Nessa abordagem, células-alvos do paciente, isoladas do sangue ou outro tecido, são tratadas pelo dispositivo fora do corpo do paciente e então reintroduzidas no corpo. Tal abordagem tira vantagem da eficácia de entrega aumentada de terapêuticos de proteína ou nanopartícula e é mais segura que as técnicas existentes devido ao fato de que obvia a necessidade de partículas de vetor potencialmente tóxico e mitiga quaisquer efeitos colaterais potenciais com limpeza reticuloendotelial e entrega fora de alvo.

[00176] No exemplo 2, os dispositivos à base de silício foram fabricados em uma instalação de microfabricação com o uso de fotolitogra- fia e técnicas de entalhe por íon reativo profunda. Nesse processo, lâminas de silício de 15,24 cm (6 polegadas) com uma espessura de 450 pm são tratadas com Hexametildissilazano (HMDS), revestidas por giro com resina fotossensível (OCG934, FujiFilm) por 60 segundos a 3.000 rpm, expostas à luz UV (EV1- EVG) através de uma máscara de cromo com o projeto de canal de constrição e desenvolvidas em solução AZ405 (AZ Electronic Materials) por 100 segundos. Após 20 minutos de cozimento a θO'C, a lâmina foi entalhada por entalhe profundo com íon reativo (SPTS Technologies) à profundidade desejada (tipicamente, nesse exemplo, 15 pm). Tratamentos Piranha (H202 e H2S04) foram usados para remover qualquer resina fotossensível remanescentes após o processo de entalhe ser concluído. Para gravar os furos de acesso (isto é, entrada e saída), o processo foi repetido no lado oposto da lâmina (isto é, aquele que não contém os canais entalhados) com o uso de uma máscara diferente, que contém os padrões de orifício de acesso e uma resina fotossensível mais espessa AZ9260 (AZ Electronic Materials).

[00177] Plasma de oxigênio e limpeza de RCA foram usadas para remover quaisquer impurezas remanescentes. Oxidação a molhado foi usada para produzir 100 a 200 nm de óxido de silício antes de a lâmina ser ligada de modo anódico a uma lâmina Pyrex e colocada em dispositivos individuais. Cada dispositivo individualmente inspecionado por defeitos antes do uso.

[00178] Antes de cada experimento, os dispositivos foram montados em um retentor com reservatórios de entrada e saída todos projetados sob medida e produzidos pela Firstcut. Esses reservatórios realizaram a interface com o dispositivo com o uso de anéis em O Buna-N (McMaster-Carr) para fornecer vedação apropriada. O reservatório de entrada é conectado a um sistema regulador de pressão com o uso de tubulação Teflon para fornecer a força de acionamento necessária para empurrar material através do dispositivo.

[00179] O Exemplo 2 pode acomodar pressões de até 0,48 MPa (70 psi). A cultura celular do Exemplo 2 incluiu células HeLa (ATCC), HeLa que expressam GFP e DC2.4 (ATCC) que foram cultivadas em meio essencial modificado de Dubelco com alto teor de glicose (DMEM, Mediatech) suplementado com soro bovino fetal a 10% (FBS) (Atlanta Biologies) e Penicilina Estreptomicina a 1% (Mediatech). Células de fibroblasto humanas primárias (NuFF) (Globalstem) foram cultivadas em DMEM com alto teor de glicose suplementado com FBS a 15%. As células foram mantidas em um incubador a 37^ e 5% de CO2. Quando aplicável, células aderentes foram suspensas por tratamento com 0,05% de Tripsina/EDCTA (Mediatech) por 5 a 10 minutos.

[00180] Células tronco embrionárias de camundongo (mESC) foram cultivadas em fibroblastos embrionários de camundongo (Chemicon) em meio que consiste em DMEM de silenciamento a 85%, soro bovino fetal a 15%, glutamina a 1 mM, beta mercaptoetanol a 0,1 mM e ami- noácidos não essenciais a 1% suplantado com 1.000 unidades/ml de LIF (Millipore, EUA). As células foram cultivadas a cada 2 a 3 dias com o uso de 0,25% de Tripsina/EDTA. Quando tratadas com o dispositivo, as mESCs foram capazes de formar novamente colônias e mantiveram morfologia normal mesmo 2 semanas após o tratamento.

[00181] Para realizar um experimento para o exemplo 2, as células foram primeiramente suspensas no tampão de entrega desejado (meio de crescimento, salina tamponada por fosfato (PBS) ou PBS suplementado com FBS a 3% e F-68 Pluronics a 1% (Sigma)), misturadas com o material de entregas desejado e colocadas no reservatório de entrada do dispositivo. Esse reservatório é conectado a uma linha de ar comprimido controlada por um regulador e a pressão selecionada (0 a 0,48 MPa (0 a 70 psi)) foi usada para acionar o fluido através do dispositivo. As células tratadas são então coletadas do reservatório de saída. As células foram incubadas à temperatura ambiente na solução de entrega por 5 a 20 minutos após o tratamento para garantir o fe-chamento de poro antes de serem submetidas a qualquer tratamento adicional.

[00182] No exemplo 2, os experimentos que comparam a entrega de dextranos de tamanhos diferentes ou proteína vs. dextrano, as moléculas de interesse foram coentregues, isto é, foram usadas no mesmo experimento, com a mesma população celular, no mesmo dispositivo e diferenciadas com base em suas identificações fluorescentes. Todas as condições experimentais foram executadas em triplicata e as barras de erro representam dois desvios padrão.

[00183] Para entregar moléculas de dextrano identificadas por fluorescência (Invitrogen) ou Apolioproteína E (Apolioprotein), os experimentos do exemplo 2 foram conduzidos conforme descrito acima de modo que o tampão de entrega contivesse 0,1 a 0,3 mg/ml de dextrano ou 1 mg/ml de Apolioproteína E, respectivamente.

[00184] Para entregar BSA conjugado a fluoresceína (Invitrogen), as células foram primeiramente incubadas em meio de cultura contendo 5 mg/ml de BSA não identificado (Sigma) por 2 horas a 37^ e então tratadas com o dispositivo do exemplo 2 com o uso de um tampão de entrega contendo 1 mg/ml do BSA conjugado a fluoresceína. A etapa de pré-incubação pretendeu minimizar a ligação não específica de BSA identificado com fluorescência da superfície celular.

[00185] O silenciamento de GFP para o exemplo 2 foi medido como a redução porcentual em uma intensidade de fluorescência média da população em relação aos controles não tratados. Lipofectamina 2000 + partículas de siRNA foram preparados por combinação de 1 pg de siRNA com 1 pl de reagente Lipofectamina 2000 em 100 pl de PBS. Após 20 minutos de incubação à temperatura ambiente, 20 pl dessa mistura foram adicionados a cada poço experimental contendo aproximadamente 20.000 células e 100 pl de meio. Permitiu-se que as células fossem incubadas com as partículas por 18 horas antes da análise.

[00186] No exemplo 2, nanopartículas de ouro foram preparadas por conjugação de 1000 MW de polietileno glicol (PEG) terminado em tiol à superfície das nanopartículas, PEG em excesso foi então lavado quatro vezes por centrifugação (10.000 rcf por 30 minutos) e o material resultante suspenso em PBS a uma concentração final de 100 nM. Para imagear a entrega de GNP às células HeLa, as células foram suspensas em PBS suplementado com 3% de FBS, 1% de F-68 Pluronics e 47 nM de GNP; tratadas por um dispositivo 10 pm-6 pmx5 e fixadas em 2,5% (p/v) de glutaraldeído, 3% de (p/v) paraformaldeído e 5,0% (p/v) de sacarose em tampão de cacodulato de sódio a 0,1 M (pH 7,4). Após uma fixação de um dia para o outro, as células foram pós-fixadas em 1% de (p/v) OsO4 em tampão de veronal-acetato por 1 hora. As mesmas foram manchadas em bloc de um dia para o outro com 0,5% de acetato de uranila em tampão veronal-acetato (pH 6,0), desidratado e incorporado em resina de Spurr. As seções foram cortadas em um Reichert Ultracut E (Leica) a uma espessura de 70 nm com uma faca de diamante. As seções foram examinadas com um microscópio eletrônico EM410 (Phillips).

[00187] No exemplo 2, um sistema de eletroporação Neon (Invitro- gen) foi usado para transfectar células NuFF com dextranos de 70 kDa identificados com fluoresceína e de 3 kDa identificados com azul pacífico. O procedimento do fabricante foi seguido na lavagem de células e suspensão das mesmas nos tampões apropriados. As células foram tratadas com o uso de uma ponta de 10 pl a uma densidade de 10 cé- lulas/ml com concentração de dextrano de 0,1 mg/ml. As três condições usadas foram conforme segue: 1) Um pulso de 20 ms de 1.700 V 2) Três pulsos de 10 ms de 1.600 V 3) Dois pulsos de 20 ms de 1.400 V. As condições 1 e 3 foram ambas recomendadas pelo fabricante como as condições ideais para transfecção de células fibroblasto humanas com eficácias de entrega de plasmídeo eGFP de 84% e 82%, respectivamente.

[00188] Nas imagens confocais do exemplo 2, as amostras foram centrifugadas a 800 rcf por 4 minutos e lavadas 2 a 3 vezes com PBS antes do imageamento. As imagens confocais foram tomadas em células vivas com o uso da unidade de complemento confocal C1 em um microscópio invertido Nikon TE2000-U com uma lente de imersão em água 60x. As amostras de fluorescência foram excitadas por um laser de 405 nm e detectadas com o uso de um filtro DAPI padrão (Nikon).

[00189] No microscópio de fluorescência do exemplo 2, as amostras foram centrifugadas a 800 rcf por 4 minutos e lavadas 2 a 3 vezes com PBS antes do imageamento. As imagens foram obtidas com o uso de um microscópio invertido Axiovert 200 (Zeiss) equipado com lentes Neofluar (Zeiss). A excitação de fluorescência foi fornecida por uma lâmpada de mercúrio X-cite 120Q (Lumen Dynamics). O microscópio é ajustado com uma câmera Hamamatsu C4742-95 (Hamamatsu) e as imagens foram analisadas por Imaged (NIH).

[00190] Na citometria de fluxo do exemplo 2, para análise de células após um experimento de entrega, as células foram lavadas 2 a 3 vezes com PBS (> 100 pl por poço em uma placa de 96 poços). Essas foram então suspensas novamente em PBS suplementado com 3% de FBS, 1% de F-68 Pluronics e 10 ug/ml de iodeto de porpídio (Sigma). As células foram analisadas em um LSR Fortessa (BD Biosciences) ou FACSCanto (BD Biosciences) equipado com um robô de amostragem de alto rendimento. Os lasers de 405 nm e 488 nm foram usados para a excitação dos fluóforos desejados. Sinais de iodeto de proídio (mancha vivo/morto), fluoresceína e azul pacífico foram detectados com o uso de filtros passa-longas de 695 nm, 530/30 e 450/50, respectivamente. A análise de dados foi conduzida com o uso de software FACS Diva (BD Biosciences) e FlowJo (FlowJo).

Exemplo 3 - Células Tronco e Células Imunológicas

[00191] Proteínas, nanopartículas, siRNA, DNA e nanotubos de carbono foram entregues com sucesso a onze tipos celulares diferentes, incluindo células tronco embrionárias e células imunológicas. De fato, a capacidade de entregar materiais estruturalmente diversos e sua aplicabilidade para dificultar a transfecção de células primárias indicam que o dispositivo e métodos têm aplicabilidade ampla em aplicações clínicas e de pesquisa.

[00192] No exemplo 3, cada dispositivo consiste em 45 canais de microfluidos paralelos e idênticos, contendo uma ou mais constrições, entalhados em um chip de silício e vedados por uma camada Pyrex. A largura e comprimento de cada faixa de constrição (descrita em mais detalhes abaixo) de 4 a 8 upm e 10 a 40 pm respectivamente. O dispositivo do exemplo 3 foi tipicamente operado a uma taxa de rendimento de 20.000 células/s, rendendo quase um milhão de células tratadas por dispositivo antes da falha, devido à obstrução. O projeto de canal paralelo foi escolhido para aumentar o rendimento, enquanto garante tratamento uniforme de células, devido ao fato de que qualquer obstrução ou defeito em um canal não pode afetar a velocidade de fluxo nos canais próximos (o dispositivo pode ser operado em pressão constante). Antes do uso, o dispositivo pode ser primeiramente conectado a uma interface de aço que conecta os reservatórios de entrada e saída ao dispositivo de silício. Uma mistura de células e o material de entrega desejada pode ser então colocada no reservatório de entrada e a tubulação Teflon é fixada na entrada. Um regulador de pressão pode ser então usado para ajustar a pressão no reservatório de entrada e acionar as células através do dispositivo. As células tratadas po- dem coletadas do reservatório de saída.

[00193] Os parâmetros que influenciam a eficácia de entrega que foram identificados (consulte, por exemplo, exemplo 2 acima) podem incluir velocidade de célula, dimensões de constrição e número de constrições (assim alterando as taxas de cisalhamento e compressão sofrida pelas). Por exemplo, a eficácia de entrega de membrana impermeável, moléculas de dextrano de 3 kDa identificado por azul pacífico a células HeLa vivas aumenta monotonicamente com velocidade de célula através de diferentes projetos de constrição (por exemplo, FIG. 25 em 2500). As dimensões de constrição também impactam a entrega; aumentar o comprimento de constrição de 20 pm a 40 pm quase dobou a eficácia de entrega em todas as velocidades de opera-ção (por exemplo, FIG. 25 em 2500), com efeito mínimo sobre a viabilidade (por exemplo, FIG. 25 em 2510). Diminuir a largura de constrição teve um efeito similar. Aumentar o número de constrições em série também aumentou a eficácia de entrega de modo que um dispositivo com cinco constrições de 10 pm de comprimento em série apresentou um projeto único de 10 pm, 20 pm ou 40 pm de comprimento através de todas as velocidades de célula (por exemplo, FIG. 25 em 2500 e 2510).Nesses dados, os pontos de dados de 0 mm/s correspondem ao caso de controle assim as células passam pelo mesmo tratamento como as outras amostras, mas não são passadas através do dispositivo assim refletindo quaisquer efeitos de ligação endocíticos ou superficiais.

[00194] Para investigar a versatilidade da técnica, sua capacidade para entregar moléculas de dextrano de modelo a diversos tipos celulares que são tradicionalmente difíceis de transfectar foi avaliada, especialmente células imunológicas e células tronco. Dextranos de 70 kDa e 3 kDa identificadas por fluorescência foram usados para esses experimentos devido ao fato de que são similares em tamanho a muitas moléculas de proteína e siRNA, respectivamente, fáceis de detectar por citometria de fluxo e têm efeitos de ligação superficial mínima já que são carregados negativamente.

[00195] A FIG. 30 ilustra a aplicabilidade da presente matéria por todos os tipos celulares. Em 3000 é mostrada a eficácia de entrega e viabilidade de células NuFF tratadas com um dispositivo 30 pm-6 pm para entregar dextrano de 3 kDa e 70 kDa. Em 3010 é mostrada a eficácia de entrega e viabilidade de células dendríticas murinas isoladas do baço tratadas com um dispositivo 10 pm-4 pm para entregar dextrano de 3 kDa e 70 kDa. Em 3020 é mostrada a eficácia de entrega e viabilidade de células tronco embrionárias murinas tratadas com um dispositivo 30 pm-6 pm para entregar dextrano de 3 kDa e 70 kDa. Em 3030 é mostrada a eficácia de entrega de dextrano de 3 kDa e em 3040 é mostrado dextrano de 70 kDa a células B (CD19+), células T (TCR-B+) e Macrófagos (CDI lb) isolados de sangue inteiro de camundongo e tratadas por dispositivos 30 pm-5 pm e 30pm-5pmx5 a 1.000 mm/s. Os dextranos de 3 kDa e 70 kDa foram identificados com azul pacífico e fluoresceína respectivamente. Todos os pontos de dados foram executados em triplicada e as barras de erro representam dois desvios padrão.

[00196] Com o uso de vários projetos de dispositivo, moléculas de dextrano foram entregues a fibroblastos prepúcio humano recém- nascido (NuFF) (3000), células dendríticas murinas primárias (3010) e células tronco embrionárias (3020). Esses experimentos renderam perda mínima (<25%) em viabilidade de célula (3000, 3010 e 3020) e os resultados em células tronco embrionárias murinas indicam que o método não induz diferenciação. Em estudos adicionais, glóbulos brancos (camada de células brancas) foram isolados de sangue muri- nho por centrifugação e tratados com o dispositivo. Células B, células T e Macrófagos, conforme diferenciados por manchamento de anticor- po, indicaram entrega bem sucedida de ambos os dextranos de 3 kDa e 70 kDa (3030 e 3040).

[00197] A fim de ilustrar o potencial da presente matéria em lidar com os obstáculos de entrega atuais, diversos experimentos foram conduzidos em possíveis aplicações na faixa de reprogramação celular para detecção baseada em nanotubo de carbono. Adicionalmente aos materiais específicos de aplicação detalhados abaixo, a presente matéria demonstrou a entrega bem sucedida de uma variedade de cargas úteis de teste tal como Apolioproteína E, albumina de soro bovino e plasmídeo GFP.

[00198] A FIG. 31 ilustra dados de entrada de nanomaterial e anticorpo. Em 3100 é mostrada a eficácia de entrega e viabilidade de células HeLa tratadas com um dispositivo 10 pm-6 pmx5 para entregar dextrano de 3 kDa identificado com azul pacífico e nanotubos de carbono envolvidos em DNA identificados com Cy5. Em 3110 são mostradas células de campo claro sobrepostas com difusão de Raman na banda G (vermelha) para indicar entrega de nanotubos de carbono em células tratadas (esquerda) vs. endocitose (direita). Barras de escala a 2 pm. Em 3120 é mostrado um micrográfico fluorescente de uma célula HeLa 18 horas após a entrega de dextrano de 3 kDa identificado com azul pacífico (painel do meio) e anticorpos a tubulina com uma etiqueta Alexa Fluor 488 (painel da direita). Barras de escala a 3 pm. Em 3130 é mostrada a eficácia de entrega e viabilidade de células HeLa tratadas com um dispositivo 10 pm-6 pmx5, a 500mm/s, para en-tregar anticorpo anti-tubilina identificados com Alexa Fluor 488. A eficácia de entrega em concentrações de anticorpo diferentes é comparada a um controle de endocitose a 10 pg/ml e células não tratadas.

[00199] A verificação de entrega bem sucedida de nanotubos de carbono (encapsulado por um oligonucleotídeo de DNA) por citometria de fluxo (3100) e espectroscopia Raman (3110). Os anticorpos para tubulina foram também entregues (3120 e 3130) com o uso dessas técnicas, rendendo uma distribuição difusa por toda a célula que poderia ser consistente com entrega citosólica. Os materiais mencionados acima são atualmente difíceis de entregar ao citosol celular e cada material normalmente exige uma modificação especializada para facilitar a entrega. No exemplo 3, todos os quatro materiais foram entregues às células HeLa com o uso do mesmo conjunto de condições em um dispositivo 10 pm-6 pmx5.

[00200] A entrega eficaz de proteínas a células primárias pode possibilitar diversas aplicações terapêuticas. Um obstáculo na reprogramação celular, por exemplo, é a ineficácia de métodos de entrega de proteína baseados em CPP anteriores. A FIG. 32 ilustra aplicações de entrega de proteína. Em 3200 é mostrada uma análise de transferência por western de entrega de c-Myc, Klf-4, Oct-4 e Sox-2 por peptí- deos de penetração celular versus um dispositivo 10pm-6pm a células NuFF. Cada uma das quatro proteínas tem 9 grupos arginina adicionais (9R) para facilitar a retenção. As colunas de lisato (Ly) correspondem ao teor de proteína das células que são lavadas e lisadas en-quanto as colunas de caldo correspondem ao teor de proteína do ambiente de meio. Em 3210 é mostrada a eficácia de entrega e viabilidade de células dendríticas murinas isoladas do baço tratadas com um dispositivo 10 pm-4 pm para entregar dextrano de 3 kDa identificado com azul pacífico e ovalbumina identificada com Alexa Fluor 488. Todos os pontos de dados foram executados em triplicada e as barras de erro representam dois desvios padrão.

[00201] A capacidade de entregar quatro fatores de transcrição e- xemplificativos (Oct4, Sox2, c-Myc e Klf-4) a células fibroblasto humanas foi examinada e comparada a um método CPP (3200). Os resultados mostram que adicionalmente a não contar com endocitose, que pode deixar muito material preso em endossomos, a entrega por deformação mecânica rápida produz eficácia de entrega significativamente mais alta para todas as 4 proteínas. Esse resultado está em linha com o trabalho de simulação mencionado anteriormente que indicou que a presente matéria pode ter um aprimoramento de 10 a 100x na entrega de proteína em relação a CPPs.

[00202] A apresentação de antígeno em células dendríticas (DCs) é outra área em que a presente matéria oferece uma vantagem. Os pesquisadores têm explorado métodos para expressar antígenos nos receptores MHC classe I de DCs de modo a induzir uma resposta de célula T citotóxica potente. A presente matéria, que tem implicações clínicas diretas na preparação de uma vacina contra câncer, por exemplo, conta com a entrega citosólica de proteínas antigênicas, devido ao fato de que a apresentação de MHC classe I é quase exclusiva para proteínas citosólicas. Facilitando-se a entrega citosólica direta de material, a presente matéria serve como uma plataforma para gerar uma resposta de célula T citotóxica in vivo contra um antígeno específico. Para ilustrar essa capacidade, ovalbumina identificada com Alexa 488, uma proteína de antígeno modelo, foi entregue com sucesso a células dendríticas murinas derivadas do baço (3210). A despeito da taxa mais alta de endocitose nesse tipo celular, o dispositivo produziu um aumento significativo nas taxas de entrega em relação aos controles de endocitose (0 mm/s). Além disso, o material entregue está presente no citoplasma em virtude do mecanismo de deformação celular. Esse recurso é particularmente importante para entrega de antígeno, devido ao fato de que a pressão citoplásmica é um requisito crítico para apresentação de antígeno MHC de classe I.

[00203] O sistema do exemplo 3 é uma ferramenta de pesquisa habilitada para entregar nanotubos de carbono, nanopartículas de ouro e anticorpos (FIG. 31) - três materiais que são difíceis de entrega com técnicas atuais. A presente matéria expande significativamente a ca- pacidade de sondar processos intracelulares facilitando o manchamen- to de anticorpo e ponto quântico de estruturas/proteínas de células vivas e possibilitando o uso de nanotubos de carbono como uma sonda molecular citosólica ou sensor químico. Como um método robusto de entrega de proteína, o mesmo pode ser usado para triagem de rendimento alto de bibliotecas de peptídeo/proteína devido ao fato de que, diferente da maioria das técnicas baseadas em CPP ou nanopartícula, esse método é insensível à química e estrutura proteicas, não conta com trajetórias endocíticas e não afeta a funcionalidade da proteína.

[00204] Adicionalmente, a presente matéria é útil para terapia (FIG. 32). Por exemplo, células-alvo de um paciente são isoladas do sangue ou outro tecido, tratadas pelo dispositivo para entregar o terapêutico desejado e reintroduzidas no corpo. Tal abordagem capitaliza em eficácia de entrega aumentada de macromoléculas terapêuticas e é mais segura que as técnicas existentes devido ao fato de que obvia a necessidade de partículas de vetor potencialmente tóxico e mitiga quaisquer efeitos colaterais potenciais com limpeza reticuloendotelial e entrega fora de alvo.

Exemplo 4 - Vacinações Personalizadas Contra Câncer

[00205] Os obstáculos atuais na entrega intracelular de macromoléculas são uma barreira significativa para entender melhor mecanismos de doença e a implantação de abordagens terapêuticas novas. A despeito dos avanços recentes na tecnologia de entrega, o tratamento de células derivadas de paciente permanece um obstáculo e os métodos atuais normalmente contam com campos elétricos tóxicos ou materiais exógenos. A plataforma de microfluido e sistemas e métodos relacionados contam com a deformação mecânica das células para facilitar a entrega. Essa abordagem física controlada produz resultados em á- reas anteriormente desafiadoras, tal como reprogramação de célula baseada em proteína e entrega de ponto quântico.

[00206] A forma mais eficaz e direta de influenciar o comportamento de uma célula e entregando agentes ativos ao citoplasma da célula. A entrega intracelular de macromoléculas assim exerce um papel crítico na pesquisa e desenvolvimento (R&D), com aplicações na faixa de revelação de fármaco ao estudo de processos bioquímicos às aplicações terapêuticas. Os métodos atuais, no entanto, têm limitações. Os mesmos normalmente têm eficácia baixa em células derivadas de paciente (primárias), contam com campos elétricos tóxicos ou material exógeno e são mal adaptados para entrega de materiais estruturalmente diversos, tal como proteínas.

[00207] Uma plataforma de entrega robusta capaz de tratas esses problemas possibilita avanços significativos na pesquisa biológicas e serve como a base para uma nova geração de terapias tal como vacinação personalizada contra câncer. Um método de entrega de proteína eficaz para células imunológicas, por exemplo, pode servir como uma plataforma de vacinação contra câncer.

[00208] Conforme descrito acima, os dispositivos de microfluido, sistemas e métodos relacionados descritos no presente documento facilitam a entrega intracelular de material por deformação rápida de uma célula conforme passa através de uma constrição. O processo de deformação causa rompimento transiente da membrana celular e assim possibilita a difusão passiva de material do tampão circundante no citosol celular. Eliminando-se a necessidade de materiais exógenos e campos elétricos com os quais os métodos atuais contam, essa abordagem fornece uma abordagem robusta e simplificada para entrega com toxicidade reduzida. Portanto, esse método pode servir como uma plataforma ampla para entrega intracelular de macromoléculas com vantagens em algumas aplicações de pesquisa e clínicas, tal como vacinação contra câncer.

[00209] A FIG. 34 é uma ilustração que representa um sistema em que o sangue de um paciente é tratado por um dispositivo de micro- fluido para a entrega de macromoléculas. Uma modalidade da presente matéria inclui um sistema em que as células dendríticas (DCs), isoladas do sangue de um paciente, são tratadas pelo dispositivo, ex vivo, para ativar as mesmas contra um antígeno de câncer particular e então reintroduzidas na corrente sanguínea do paciente. Por exemplo, o antígeno entregue é uma proteína comumente expressa conhecida por estar associada a uma doença particular ou um específico de paciente obtido a partir de uma biopsia. Entregando-se antígenos de câncer diretamente ao citoplasma DC, pode-se explorar a trajetória de apresentação de antígeno MHC-I e induzir uma resposta de linfócito T citotóxi- co potente (CTL) no paciente. Essas células T ativadas então buscam e destroem quaisquer células cancerosas que expressam o antígeno alvo. A flexibilidade da plataforma em uso estabelecido, antígenos específico por doença ou aquele derivados diretamente do tumor de um paciente permitem tratar pacientes que são resistentes a outras terapias. De fato, fornece uma resposta de doença alvejada e personalizada com efeitos colaterais mínimos. Essa modalidade pode ser implantada em um laboratório hospitalar típico (< 1 hora por tratamento) com um técnico treinado. Devido a seu tamanho pequeno e simplicidade relativa, um sistema de tratamento operado por paciente também pode ser usado.

[00210] O método de vacina contra câncer foi demonstrado em um modelo de camundongo. O sistema foi usado para a entrega e processamento bem sucedido de ovalbumina, um antígeno modelo, a células dendríticas murinas e, conforme indicado por apresentação aumentada do antígeno, peptídeo SIINFEKL, em receptores MHC classe I. Essas células dendríticas tratadas promovem uma resposta de linfócito T citotóxico proliferative (CTL) in vitro. DCs tratadas são reintroduzidas no animal para gerar uma resposta CTL in vivo. Os dispositivos são úteis para entregar antígenos a DCs isoladas de sangue humano.

[00211] Os dados indicam que o dispositivo é capaz de entregar material a células primárias sensíveis (incluindo DCs) sem causar morte celular excessiva. Assim, dano celular não é um problema sério. A resposta imunológica pode ser aprimorada por aumento do número de células tratadas, aumentando a quantidade e diversidade de antígeno entregue e/ou fatores de ativação de coentrega, tal como lipopolissa- carídeo. Pouca ou nenhuma toxicidade foi observada com células tratadas com o dispositivo, assim tornando os métodos não apenas possíveis, mas vantajosos para aplicações veterinárias e humanas terapêuticas.

Exemplo 5 - Tratamento de Câncer no Sangue

[00212] Conforme descrito no exemplo 4, a deformação mecânica rápida de células pode fornecer um meio robusto de entregar antígenos a células dendríticas (DCs) e assim pode ser uma plataforma para terapias celulares. Esse sistema é baseado na revelação de que a deformação mecânica rápida de células pode causar a formação de poros transientes na membrana que possibilitar a entrega difusa de material a partir do meio circundante. Diferente das terapias existentes discutidas anteriormente, esse método não conta com proteínas de fusão adaptadas, apresentação cruzada de antígeno, vetores virais, nanopartículas ou mecanismos de endocitose; portanto, fornece gran-des aprimoramento em eficácia in vivo entanto reduz custos terapêuticos. A flexibilidade e simplicidade dessa abordagem fundamentalmente diferente possibilitam uma plataforma ampla para ativação de célula dendrítica que pode induzir uma resposta de CD8 contra uma variedade de antígenos de câncer. O sistema pode alvejar cânceres no sangue, tal como linfoma de célula B, que são mais receptivos a terapias imunológicas, assim como diversos tipos de câncer adicionais (por e- xemplo, melanoma, câncer pancreático, etc.) e fornece uma nova a- bordagem personalizada para combater a doença.

[00213] A terapia celular contra câncer é uma opção atrativa devido a sua capacidade de ativar o sistema imunológico do paciente e acionar uma resposta de célula T CD8 com especificidade para antígeno de longa duração contra a doença. Essas terapias, tal como o Proven- ge® recentemente aprovado para câncer de próstata, têm efeitos colaterais mínimos em relação às quimioterapias e tratamento por radiação. No entanto, uma das maiores barreiras para desenvolver terapias celulares tem sido atingir apresentação de antígeno apropriada por entrega de antígenos no citoplasma celular. Tradicionalmente, a ativação de uma resposta efetora de CD8 se diferencia de uma resposta de CD4 pelo local em que a proteína estranha entra na célula que apresenta antígeno (por exemplo, célula dendrítica). As proteínas encon-tradas no citoplasma induzem uma resposta de CD8 enquanto as proteínas extracelulares capturadas por endocitose induzem uma resposta de CD4. Como o mecanismo de apresentação cruzada dentro das células que apresentam antígeno permanece elusivo, pode-se desenvolver um método confiável para entregar antígeno diretamente ao citoplasma celular para terapias avançadas que utilizam a resposta de CD8 efetora citotóxica potente. Um método eficaz e robusto de entrega citoplásmica a células dendríticas é usado como uma plataforma para induzir as respostas imunológicas contra uma variedade de tipos de câncer.

[00214] Os experimentos em células HeLa, ilustrados na FIG. 8A e na FIG. 11, indicaram que a deformação mecânica rápida das células resulta na formação de lesões/poros transientes na membrana celular, que possibilitam a difusão passiva de material do tampão circundante no citoplasma celular. Esse fenômeno previamente não relatado produz células que são viáveis e proliferam normalmente após o tratamento. Os experimentos indicaram que moléculas maiores exibem ta- xas de entrega mais baixas que aquelas menores, assim indicando um mecanismo difuso. A entrega de siRNA bem sucedida e manchamento de citosol difuso, conforme medido por microscopia confocal, também indicam que os materiais entregues estão no citosol e em um estado ativo/acessível. Tradicionalmente, os métodos de entrega de antígeno normalmente mostram potencial em linhagens celulares, mas falham em traduzir em células imunológicas primárias. O método de entrega descrito no presente documento, no entanto, é independente de trajetórias endocitóticas ou resposta celular a materiais exógenos, que pode variar significativamente por tipos celulares e conta primariamente com propriedades de bicamada de membrana. Portanto, devido a sua simplicidade e trajetória inovadora, essa tecnologia é mais receptiva à transição de linhagem celular para entrega de célula imunológica primária e assim fornece um aprimoramento maior na apresentação de antígeno.

[00215] A apresentação MHC classe I de antígenos e a maturação de célula dendrítica podem ser analisadas por manchamento de anticorpo em resposta à entrega de proteína ovalbumina. As células T colhidas de camundongos transgênicos OT-I e OT-II TCR podem também ser usadas para medir a proliferação de CD8 e CD4 em resposta ao carregamento de ovalbumina e/ou antígeno SIINFEKL. O sistema pode ser otimizado para proliferação de CD8 em comparação a células dendríticas iniciadas por endocitose sozinha.

[00216] As células dendríticas murinas primárias são purificadas por separação de MACS CD11lc+ (Miltenyi Biotec, Alemana) dos baços de camundongos B6. Um dispositivo que contém constrições com uma largura de canal de 6 pm capazes de produzir poros de 13 na membrana da célula HeLa pode ser usado. Devido ao tamanho menor dessas células dendríticas, dispositivos de microfabricação e teste com larguras de canal de 3 a 5 pm podem ser utilizados para desempenho. Os protocolos existentes para foto litografia e entalhe profundo por íon reativo podem ser modificados para possibilitar a fabricação eficaz desses dispositivos. Moléculas de dextrano identificadas por fluorescência podem ser usadas como moléculas modelo para avaliar a eficácia de entrega por FACS. Subsequentemente, a proteína ovalbumi- na pode ser entregue às células e avaliada por uma transferência por western blot para confirmar a retenção de proteínas nas células primárias.

[00217] A maturação de células dendríticas pode ser examinada por manchamento de anticorpo CD80 e CD86 para mostrar que o método de deformação rápida induz a maturação celular. O uso de agonistas TLR extracelulares, tal como lipopolissacarídeo (LPS), pode ser considerado se for considerado necessário induzir manualmente a maturação de DC após a entrega. A proteína ovalbumina pode ser entregue às células dendríticas e a apresentação de antígeno pode ser quantificada por anticorpos MHC-T SIINFEKL. Adicionalmente, a eficácia de apresentação de antígeno em resposta à entrega de peptídeos específicos de TCR pode ser avaliada para mostrar a capacidade do sistema de entregar/apresentar proteínas vs. peptídeos antigênicos. Subsequentemente, as células T CD8 e CD4 podem ser colhidas de camundongos OT-I e OT-II transgênicos TCR, respectivamente, manchadas por CFSE e cocultivados com células dendríticas tratadas com ovalbumina por 5 dias. A proliferação de células T de ambos os subconjuntos pode ser medida por FACS. O projeto do dispositivo pode ser otimizado para produzir níveis aumentados de populações de célula T CD8 em comparação a métodos in vitro convencionais (por exemplo, endocitose).

[00218] Uma capacidade versátil de induzir respostas de CD8 com especificidade para antígeno tem sido um objetivo de terapias celulares contra câncer que se provaram elusivas até o momento devido à apresentação de antígeno ineficiente ou flexibilidade inadequada do método de entrega. Os métodos existentes têm diversas desvantagens incluindo sua dependência de campos elétricos danosos, o uso de materiais exógenos, modificação de sequência de proteínas e/ou trajetórias endocitóticas para facilitar a entrega de antígeno. A presente matéria, no entanto, fornece uma abordagem fundamentalmente diferente para entrega citosólica que não sobre por qualquer um dos problemas mencionados anteriormente. Além disso, pela natureza de seu mecanismo de difusão por formação de poros, esse método é amplamente aplicável por tipos de antígeno e poderia assim tratar uma faixa de cânceres alvo. O mesmo mecanismo pode ainda ser usado para introduzir moléculas de sinalização adicionais para aprimorar a muta- ção/ativação de DC para produzir uma resposta de célula T mais potente. Tal plataforma de base ampla é mais versátil e robusta que quaisquer mecanismos de entrega/apresentação de antígeno existentes sob investigação para vacinas contra câncer.

[00219] O Exemplo 5 pode ter um impacto amplo. Dada a imensa carga social de câncer pelo país (570.000 mortes estimadas nos EUA em 2011); o câncer provavelmente afligirá uma proporção significativa da população. A população afligida se beneficiará do desenvolvimento de terapias celulares inovadoras que conferem o poder ao sistema i- munológico do paciente para combater a doença. A presente matéria é uma plataforma de tratamento personalizada e mais eficaz para uma variedade de tipos de câncer, tal como cânceres no sangue, por e- xemplo, leucemias, linfomas e múltiplos mielomas, assim como neo- plasmas mieloproliferativos e síndromes mielodisplásticas. Os métodos são também particularmente úteis para o tratamento de cânceres metastáticos, por exemplo, devido a sua propensão a disseminação por meio da circulação sanguínea. Os cânceres com epítopo de antígeno desconhecido, por exemplo, podem ser tratados por digestão de uma amostra de biopsia de tumor, entrega do lisato às DCs do paciente no corpo. Isso pode possibilitar a ativação das células T do hospedeiro contra uma faixa ampla de antígenos de câncer, assim garantindo tratamento eficaz de múltiplos alvos. Esse aspecto personalizado pode ser de interesse particular para pessoas que poderiam desenvolver formas raras de câncer, normalmente mal atendidas pelos tratamentos atuais, devido à exposição em ambientes hostis. Adaptando-se o tratamento à doença do indivíduo, esse método pode fornecer oportunamente cuidado eficaz mesmo nos casos mais agressivos, tal como cânceres resistentes a múltiplos fármacos. Essa terapia com base i- munológica pode também ser particularmente eficaz na prevenção de metástase (responsável por aproximadamente 90% de mortes relacionadas a câncer) já que as células CD8 T podem facilmente localizar e destruir células metastáticas enquanto a memória imunológica fornecida através desses tratamentos poderia impedir recaída futura. Adicionalmente, como uma ferramenta de pesquisa, esse método pode possibilitar estudos mecanicistas sem precedentes de processamento de antígeno para entender melhor o processo de apresentação cruzada de antígeno e, portanto, aprimorar a eficácia de métodos de ativação i m u n o I óg i ca exi stentes/a Item ativos.

Exemplo 6 - Reprogramação Celular

[00220] As células tronco exercem um papel crítico na pesquisa a- tual em medicina regenerativa, especialmente dentro do campo em rápida expansão de manipulação de tecidos. iPSCs são de interesse particular devido à sua capacidade de auto-renovação , demonstraram a capacidade de diferenciação em qualquer tipo de célula e características autólogas (específicas por paciente). Assim, iPSCs fornecem uma oportunidade para derivar células progenitoras de múltiplas linhagens a partir de uma fonte pluripotente comum, que pode ser combinada em compartimentos de tecido interativo já distintos. Além disso, essas células poderiam eventualmente obviar a necessidade por células tronco embrionárias humanas (hESCs) em aplicações clínicas assim evitando muitos dos debates morais e éticos induzidos por esses tipos celulares. Além disso, iPSCs derivados de paciente evitam ou minimizam os problemas de rejeição imunológica de células derivadas de hESC. Assim, a pesquisa atual é amplamente focada em desenvolver protocolos livres de vírus eficazes para produzir números grandes de iPSCs.

[00221] iPSCs foram originalmente gerados por reprogramação de fibroblastos murinos e humanos adultos (HFs) para um estado pluripo- tente baseado em superexpressão retroviral dos 4 fatores de transcrição outubro 3/4, Sox2, c-Myc e Klf4. Esses iPSCs não são amplamente idênticos às células ES em expressão de gene global, metilação de DNA e modificação de histona, mas são também capazes de se diferenciar em tipos celulares que representam todas as 3 camadas ger- minativas. Apesar de a tecnologia de iPSC ter potencial enorme para pesquisa biomédica e terapia baseada em célula, os obstáculos principais devem ser superados para realizar seu potencial completo. Por exemplo, a maioria das linhagens de iPSC foi derivada de várias células somáticas por introdução retroviral ou lenti viral de genes de codificam fator de reprogramação, resultando em múltiplas interrupções cromossômicas por integração de vetor virai, qualquer um dos quais pode causar disfunção genética e/ou tumor. Adicionalmente, os trans- genes de reprogramação (particularmente, c-Myc e Klf4) estão proximamente associados à oncogênese que eleva a possibilidade de que sua expressão residual e/ou reativação possa causar formação de tumor. Assim, muitos laboratório recentemente exploraram abordagens não integrantes de genoma diferentes, tal como adenovirus, vetores epissomais, mRNAs e microRNAs. Notavelmente, foi mostrado que iPSCs podem ser gerados por entrega direta dos quatro fatores de reprogramação (Oct 3/4, Sox2, c-Myc e Klf4) fundidos aos peptídeos de penetração de célula (CPP). Apesar de ter sido relatado que a geração de iPSCs de camundongo pode ocorrer por entrega de quatro fatores fundidos por CPP em E.Coli, pode ser mostrado que iPSCs humanos podem ser gerados por quatro fatores fundidos por CPP expressos em células mamíferas. No entanto, ambos os estudos relataram que as eficácias de reprogramação de reprogramação baseada em proteína é muito baixa (<0,01 %). Como a reprogramação baseada em proteína não envolve qualquer tipo de material genético (DNA ou RNA) e veículo de vetor (vírus ou plasmídeo), a entrega direta de proteínas fornece um dos procedimentos de reprogramação mais seguros. Foi mostrado que iPSCs humanos baseados em proteína geraram eficazmente neurônios de dopamina funcionais sem propriedades anormais associadas à integração de genoma virai. Como a eficácia de reprogramação baseada em proteína pode ser aprimorada pela presente matéria com o uso da tecnologia de plataforma de entrega, abre-se amplamente a possibilidade de gerar células iPS clinicamente viáveis. Além disso, essa abordagem possibilita um nível mais fino de controle sobre a função celular por evasão de processos estocásticos que controlam a tradução e/ou transcrição em reprogramação de mRNA, plasmídeo e vírus. A entrega direta de proteína assim fornece duas vantagens fundamentais sobre os métodos alternativos por obviar o risco de inserção mutagênica e possibilitar controle mais preciso do processo de reprogramação altamente sensível. A tecnologia de entrega descrita no presente documento demonstrou sua capacidade de entregar pro-teínas em eficácias altas a HFs e células tronco. Experimentos que comparam as capacidades de entrega dessa técnica a metodologias de peptídeo de penetração de célula existente mostraram um aumento significativo na entrega com o uso dessa abordagem (potencialmente 100x maior com base em simulações). Além disso, seu mecanismo de formação de poros físicos elimina a necessidade de modificação química ou do uso de compostos exógenos que estão envolvidos em métodos de entrega de proteína alternativos. Moléculas pequenas, siRNA e outros fatores podem ser também coentregues durante a reprogramação já que o método é agnóstico ao tipo de material que é entre-gue. Esse sistema, portanto, fornece uma ferramenta única para induzir reprogramação celular através de entrega direta de proteína. Esse mecanismo simples de ação (isto é, difusão através de poros) também possibilita que se preveja e controle potencialmente as quantidades de entrega com alta precisão, portanto, facilitando os estudos de otimização para aprimorar o entendimento da dinâmica de reprogramação e assim aumentar grandemente as eficácias. Finalmente, pode empregar essa técnica de microfluido como um dispositivo médico para gerar iPSCs para manipulação de tecido clínico e aplicações de terapia celular.

[00222] Além disso, as aplicações desse sistema não são restritas à entrega de proteína. Essa técnica pode ser incluída em um método de entrega universal capaz de entregar uma faixa de macromoléculas (DNA, RNA, proteínas, açúcares e peptídeos) a quase qualquer tipo celular. Isso possibilita ao hospedeiro aplicações que são mal atendidas pelas tecnologias atuais. Os métodos baseados em eletroporação, nanopartícula e lipossomo atuais, por exemplo, normalmente têm dificuldade em transfectar determinadas células primárias (tal como células imunológicas ou células tronco) e podem ser ineficazes na entrega de proteínas e nanoproteínas (tal como pontos quânticos). A entrega de peptídeo para aplicações de mecanismo de doença e triagem terapêutica pode ser também tratada por esse método inovador enquanto as práticas contemporâneas normalmente exigem modificação ou en- capsulação química. Pode-se também usar esse método para aplicações de detecção baseada em nanopartícula para entregar pontos quânticos modificadas para identificação de organela e estudos de doença mecanicista.

[00223] A entrega intracelular é um fundamento de muitas aplicações de pesquisa biológica na faixa de estudos fundamentais de expressão genética a mecanismos de doença e, como tratado neste pedido, geração de iPSCs. Os métodos de entrega estabelecidos, tal como lipossomos, nanopartículas poliméricas e eletroporação normalmente envolvem o uso de compostos exógenos como um veículo de entrega (ou campos elétricos no caso de eletroporação) e são específicos para material e/ou célula. Por exemplo, lipofectamina (Invitrogen) pode entregar moléculas de DNA e RNA (a subconjuntos de linhagens celulares ou células primárias), mas não pode formar o complexo a- propriado para entregar proteínas ou outras macromoléculas. A eletroporação, por outro lado, embora potencial em sua capacidade de alvejar uma variedade de tipos celulares, causa danos à célula devido aos campos elétricos altos e tem limitado o sucesso na entrega de proteína. Isso torna a mesma particularmente não adequada para as múltiplas transfecções exigidas na geração de iPSC, por exemplo. Os pep- tídeos de penetração de membrana são outra técnica de entrega que é amplamente específica para proteínas. Esses métodos baseados em peptídeo, no entanto, têm efeitos imprevisíveis sobre a funcionalidade da proteína e sofrem de degradação significativa de proteína no en- dossomo. Portanto, a presente matéria que descreve um método universal capaz de entregar uma faixa de macromoléculas (DNA, RNA, proteínas, peptídeos, moléculas pequenas), com morte celular mínima, possibilita um controle sem precedentes sobre a função celular em uma plataforma de tecnologia única, assim possibilitando estudos de mecanismo de doença, identificação de candidatos terapêuticos ma- cromoleculares, diferenciação ou reprogramação guiada de células tronco e o desenvolvimento de técnicas de diagnóstico com linhagens de célula repórter.

[00224] O dispositivo microfluídico descrito no presente documento pode servir como uma plataforma de entrega universal com base ampla. Como um dispositivo microfluídico, o mesmo desfruta de benefícios de controle preciso em condições de tratamento em um nível de uma única célula. A combinação única de controle em nível de uma única célula e produtividade em macroescala coloca esse dispositivo em uma posição única em relação a métodos de entrega existentes. Os dados até o momento demonstraram a capacidade do sistema de entregar material a cerca de 11 tipos de células diferentes incluindo linhagens celulares de câncer, células tronco embriônicas, fibroblastos primários linfócitos primários. Seu mecanismo mecânico também habilitou a entrega de materiais previamente desafiadores tais como nanotubos de carbono e pontos quânticos.

[00225] O trabalho anterior com uso de proteínas recombinantes para produzir iPSCs demonstrou eficiências proibitivamente baixas (<0,01 %) e são, dessa forma, inadequadas para aplicação clínica de distribuição ampla. O dispositivo, os sistemas e métodos mencionados no presente documento, no entanto, demonstraram sua capacidade de entregar proteínas diretamente ao citoplasma com alta eficiência e morte celular mínima fornecendo, assim, uma oportunidade convincente para produzir ganhos substanciais em eficiência de reprogramação através de entrega mais eficaz. Determinando-se diretamente a quantidade de proteína disponível, pode-se exercer controle preciso sobre a cinética intracelular. Outros métodos de reprogramação (por exemplo, virai, expressão de mRNA e plasmídeo), por outro lado, contam com efeitos estocástico para determinar o nível de disponibilidade de proteína e são, assim, inadequados para estudos de cinética. A eficiência baixa de metodologias de reprogramação atuais indica que o processo é altamente sensível a variações estocásticas e somente uma faixa estreita de níveis de expressão de fator de transcrição irá resultar em reprogramação. Entregando-se diretamente proteínas ao citoplasma, pode-se exercer controle sem precedentes sobre a disponibilidade de proteína e, assim, impor mais consistentemente as condições exatas necessárias para reprogramação. Essas condições, uma vez identificadas e otimizadas, podem ser reproduzidas precisamente para cada célula em tratamento e aprimoram, assim, dramaticamente a eficiência de reprogramação.

[00226] Esse conjunto de procedimentos habilita/aprimora mediante uma variedade de aplicações de entrega intracelular. Além disso, a natureza estritamente mecânica do conjunto de procedimentos elimina qualquer complicação potencial que surge do uso de agentes químicos ou campos elétricos. Os dados não revelaram nenhuma mudança substancial em comportamento celular como um resultado do tratamento. Assim, esse sistema é um mecanismo de entrega intracelular universal de eficiência alta com utilidade particular em aplicações de reprogramação.

[00227] Evidência indica que a deformação rápida que ocorre conforme uma célula passa através da constrição induz a formação de poros transientes na membrana celular, habilitando a difusão de ma- cromoléculas a partir do tampão circundante no citosil. Esse conjunto de procedimentos foi demonstrado em 11 tipos celulares diferentes que incluem linhagens celulares de câncer, fibroblastos primários, lin- fócitos primários e células tronco embriônicas (sem causar diferenciação). Um protótipo tem a capacidade de tratar aproximadamente 20.000 células/s e opera em uma faixa de concentrações celulares (104 a 108 células/ml). Questões pertinentes à obstrução foram mitigadas, em grande parte, aprimorando-se protocolos e projeto de chip de modo que cada dispositivo tenha a capacidade de tratar aproximadamente 1 milhão de células antes da obstrução, com a opção de ser limpo e reciclado. Além disso, o projeto de múltiplos canais fornece redundância significativa de modo que a obstrução de um canal não afete o desempenho dos outros. O fluxo acionado por pressão (em pressão constante controlada) e o projeto paralelo dos canais garantem um fluxo consistente por canal independentemente da porcentagem de canais obstruídos no chip.

[00228] A capacidade de dispositivo para entregar moléculas de dextrano a fibroblastos humanos e células tronco embriônicas foi demonstrado. A FIG. 35 ilustra as vantagens potenciais de reprogramação celular. Em 3500, a viabilidade e eficiência de entrega de células tronco embriônicas humanas tratadas com um dispositivo de 10 pm a 6 pm entregar 3 kDa de dextrano. Em 3510, uma análise de western blot de entrega de c-Myc, Klf-4, Oct-4 e Sox-2 por peptídeo que penetra célula versus um dispositivo de 10pm a 6pm para células. As colunas de lisado (Ly) correspondem ao teor de proteína de células que são lavadas e lisadas enquanto as colunas de sopa correspondem ao teor de proteína do ambiente dos meios. Em 3520, imagens microscópicas confocais de células NuFF fixas após a entrega dos fatores de reprogramação. As proteínas são etiquetadas com uso de um anticorpo anti-FLAG conjugado Alexa 488 e o núcleo é manchado por DAPI.

[00229] Ademais, a eficiência de entrega de dispositivos foi comparada àquela de um método de 9 arginina (CPP) atualmente utilizado para reprogramação com base em proteína. Os resultados (3510) demonstraram um aumento significativo na quantidade de c-Myc, Klf4, Oct4 e Sox2 entregue conforme medido por western blot. A microsco- pia confocal confirmou, então, a localização bem sucedida desses fatores de transcrição para o núcleo celular (3520). Um modelo de difusão 2-D simples foi desenvolvido em COMSOL para simular o mecanismo de entrega com base em valores da literatura para difusividades de partícula dentro e fora do citoplasma celular. Encaixando-se esse modelo nos dados experimentais, pode ser estimado que o conjunto de procedimentos entregue 10 a 40% do material de entrega presente no tampão no citosil celular. Em comparação, os métodos CPP para entrega de proteína são estimados entregarem somente 0,1% do material de tampão ao citosil. Essa abordagem fornece, assim, um aumento robusto em quantidade de material de reprogramação entregue (10 a 100 vezes). Ademais, garante maior biodisponibilidade dos fatores de transcrição entregues.

[00230] A FIG. 36 retrata a geração e caracterização de linhagens de iPSC humanas e de camundongos por entrega direta de proteínas de reprogramação fundidas. Em 3600, iniciar cultura de hepatócito de camundongos (primeira imagem); morfologia após 6 tratamentos de proteína de ciclo (segunda imagem); colônias de iPS estabelecidas (terceira imagem); e manchamento de AP colônias de iPS estabelecidas (quarta imagem). Em 3610 manchamento imunológico de marcadores ESC (Nanog, Oct4 e SSEA1) em p-miPSC. Os núcleos foram manchados com DAPI (azul). Em 3620, análise de sequenciamento de bissulfito do promotor Oct4 revela reprogramação epigenética quase completa em linhagens de p-miPSC-1 e p-miPSC-2. Círculos abertos e fechados indicam CpG não metilado e metilado, respectivamente. Em 3630, o potencial de diferenciação in vivo foi analisado injetando-se p- miPSCs em camundongos com imunodeficiência e por manchamento com H&E de teratomas. Os teratomas resultantes continham tecidos que representam todas as três camadas germinativas; células de li-nhagem de ectoderme (tubo neural ou epiderme), mesoderme (cartilagem ou músculo) e endoderme (epitélio respiratório ou epitélio similar ao intestino). Em 3640, quimeras derivadas de p-miPSC-1 (painel esquerdo) e p-miPSC-2 (painel direito) em fetos E13.5 mostram um nível alto de GFP a partir de p-miPSCs injetados. Em 3650 a 3670, as linhagens de iPSC humanas, p-hiPSC-01 (3660) e p-hiPSC-02 (3670), são geradas por entrega direta de quatro fatores de reprogramação fundidos por CPP a partir dos fibroblastos humanos adultos submetidos à biopsia (3650).

[00231] A FIG. 37 retrata resultados de reprogramação de proteína preliminares. Em 3700, uma progressão de mudanças morfológicas de fibroblastos em colônias. Setas brancas indicam células reprogramadas potenciais. A flecha vermelha aponta na direção de iPSCs coales- centes que formam uma colônia. Em 3710 a 3760, a expressão do marcador de células-tronco embriônicas humanas Oct4, SSEA-4, Tra- 60, Tra-80, fosfatase alclina (AP) em colônias de iPSC. Quando apropriado, a pequena caixa representa uma mancha de contador de DA- Pl. Barras de escala em 100 pm.

[00232] Visto que iPSCs humanas com base em proteína foram geradas e caracterizadas, iPSCs humanas e de camundongos adicionais e completamente reprogramados foram geradas pelo método de entrega anterior de fatores reprogramação fundidos por CPP, conforme examinado por todos os critérios, incluindo analises epigenéticas, plu- ripotência in vivo e formação de quimera (FIG. 36). No entanto, apesar do uso de proteínas parcialmente purificadas, a eficiência de reprogramação ainda estava baixa (<0,1 %) e demorou mais que métodos de reprogramação virai. Assim, tentou-se utilizar o dispositivo para entregar 4 proteínas de reprogramação Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc a fibroblastos humanos em uma concentração de tampão de 80 pg/ml. As células foram tratadas 4 vezes com um intervalo de 48 horas entre cada entrega. Após 14 a 20 dias em cultura, as primeiras colônias similares a hiPSC reprogramadas. Durante esse tempo, observou-se que a transição em morfologia de fibroblasto conforme os mesmos formaram colônias de iPSC e os mesmos expressam vários marcadores de hESC (FIG. 37).

[00233] Clatrina, cavéolas e macropinocitose são os três mecanis- mos mais comumente propostos para internalização endocitótica. Para examinar se a endocitose está evolvida em entrega macromolecular seguindo deformação celular rápida, é possível utilizar substâncias químicas conhecidas para bloquear esses mecanismos. Especificamente, clorpromazina pode ser utilizada para inibir endocitose mediada por clatrina; genisteinna para inibir endocitose mediada por cavéo- las; e 5-(N-etil-N-isopropil) amirolida (EIPA) para inibir macropinocitose (todos podem ser obtidos junto a Sigma Aldrich). As células HeLa podem ser incubadas com clorpromazina (10 pg/ml), genisteinna (200 pM) e EIPA (25 pM) por 2 horas antes do tratamento. Dextrano, as proteínas dsRED e dsRED-9R pode ser, então, entregues por deformação rápida das células tratadas. As eficiências de entrega respectivas, conforme medido por FACS, podem ilustrar a eficiência de inibição de endocitose tanto em mecanismos de entrega com base em dispositivo e CPP. Experimentos de colocalização com marcadores de endossomo (Invitrogen) com uso de microscopia confocal podem ajudar, também, a determinar a porcentagem de material que é sequestrada em endossomos.

[00234] É possível acoplar o sistema de deformação celular rápida com outros métodos estabelecidos de entrega, tal como eletroporação, para mitigar mecanismos endocitóticos. Incorporar eletrodos próximo à constrição pode acoplar a deformação e eletroporação para habilitar efeitos de entrega para render desempenho de sistema melhorado em relação ao qualquer um dos métodos individuais. Além disso, a coen- trega de agentes químicos tal como Cloroquina (Sigma), vários polímeros ou peptídeos de escape endossomal pode ser utilizada para assistir escape endossomal de materiais entregues no sistema de deformação celular rápida.

[00235] Conforme uma célula passa através da constrição, a mesma experimenta um cisalhamento e compactação breve (aproximada- mente 10 a 100 us) porém rápido. O cisalhamento tangencial mostrou previamente induzir formação de poros. No entanto, o sistema também induz compressão mecânica. Para avaliar esses parâmetros, as células HeLa e HF podem ser incubadas em 0,1 pg/ml de Lantrunculina A (Invitrogen) por 1 hora antes da entrega para despolimerizar o citoes- queleto actina. O dextrano (Invitrogen) rotulado de modo fluorescente pode ser entregue, então, para a população de célula tratada com uso do dispositivo de deformação rápida. Esses experimentos podem ser repetidos, também, com células que foram incubadas em 10 pM de Colchicina (Sigma) por 2 horas antes da entrega para despolimerizar a rede de microtúbulos. A análise de FACS pode ser utilizada para medir eficiências de entrega de células tratadas com toxina em relação a controles não tratados. Acredita-se que a formação de poros seja cor-relacionada à taxa de deformação de uma célula em resposta a uma dada geometria. O papel do citoesqueleto na resistência à deformação foi previamente investigado com uso de um dispositivo que sonda a deformabilidade da célula para fornecer medições quantitativas de taxas de deformação. Nesse método, os eletrodos são colocados em qualquer um dos lados de uma constrição e a mudança na capacitân- cia entre os dois eletrodos é medida conforme uma célula passa através da mesma. As mudanças na capacitância ao longo da constrição são correlacionadas, então, ao tempo de trânsito celular, isto é, sua taxa de deformação. O desempenho de entrega do dispositivo, nos experimentos mencionados acima, pode ser correlacionado a esses estudos de deformação anteriores para produzir uma relação quantita-tiva entre a taxa de deformação e eficiência de poração.

[00236] De modo similar a estudos publicados que caracterizam a sonoporação, conjuntos de procedimentos de microscopia eletrônica de varredura (SEM) e microscopia eletrônica de entrega (TEM) podem ser empregados em amostras fixadas em intervalos de tempo definidos após o tratamento para medir diretamente o tamanho e distribuição dos poros propostos com o tempo. A fixação celular pode ser feita em temperatura ambiente com uso de uma solução de 25% de Glute- raldeído (Sigma). As amostras de célula podem ser, então, desidratadas através de lavagens com etanol sucessivas antes do imageamento. Conjuntos de procedimentos de SEM Ambientais (ESEM) podem ser utilizados para gerar imagem diretamente de amostras fixas. Devido à sua resolução relativamente baixa (aproximadamente 200 nm), no entanto, esse conjunto de procedimentos é adequado para detectar 1 a 0,5 pm de mudanças morfológicas de escala ou lesões. Caso a ESEM falhe ao detectar qualquer mudança morfológica, as células podem ser revestidas com uma camada de 1 a 10 nm de ouro com uso de um evaporador a vácuo para melhorar a resolução para a escala de nanômetro necessária para observar diretamente estruturas de poros mais finos com uso de SEM. A TEM pode ser utilizada, também, como um conjunto de procedimentos de imageamento alternativo caso SEM falhe ao produzir os resultados desejados. Esses conjuntos de procedimentos permitem que um indivíduo distinga entre um mecanismo de poração uniforme e lesão local de entrega e meça a distribuição e tamanho de poro médio. A distribuição e tamanho de poro em células que passaram por deformação celular rápida podem ser comparados com células não tratadas. Uma distribuição de poro localizado na superfície de membrana indica um modelo de lesão enquanto uma distribuição mais uniforme suporta o modelo de poração uniforme.

[00237] O software COMSOL pode ser utilizado para construir um modelo em 3D da célula submetida à formação de poro. O uso de dados publicados em difusividades de citoplasma e tampão, combinado com os modelos de poro apropriados a partir de estudos de mecânica, é possível produzir um modelo preditivo de entregue. O modele emula uma membrana porosa que separa um citoplasma de difusividade bai- xa de uma região de tampão de difusividade ala. De acordo com as pressuposições do modelo, os poros têm um tamanho fixo para uma quantidade fixa de tempo antes de revedação instantânea. O comportamento de poro dinâmico, tal como mudanças em formato e diâmetro, pode ser incorporado em modelos complexos através de acoplamento com MatLab ou outro software. As predições simuladas de quantidade de entrega podem ser verificadas com uso de dados experimentais com base em FACS e eletroforese de gel (por exemplo, western blots). Essas comparações podem ser utilizadas para ajustar o modelo e, portanto, habilitar o mesmo a prever a quantidade de material entregue. As capacidades preditivas desse modelo podem simular os efeitos de tempo de abertura de poro, concentrações de tampão e tamanho de poro variante e serem utilizadas, portanto, como um guia para estudos futuros.

[00238] As simulações de Multi-physics (por exemplo, COMSOL ou CFD-ACE) também podem ser utilizadas para modelar o fluxo fluido por todo o dispositivo. Esses modelos podem ser utilizados para prever de modo mais preciso velocidades de fluxo e tensões de cisalhamento nas regiões de entrada, saída e constrição. Esses dados podem ser utilizados para elucida ligações entre a velocidade de fluxo e tensão de cisalhamento em projetos de constrição. Ademais, construindo- se um modelo amplo do dispositivo, é possível estudar a consistência de quedas de pressão entre canais diferentes e ajustar os projetos de entrada e saída para garantir que todos os canais operem em condições quase idênticas de modo a aprimorar a uniformidade do tratamento ao longo da população celular.

[00239] O fenômeno de entrega pode ser otimizado primariamente para aumentar a eficiência de entrega e viabilidade de célula. A uniformidade de população (isto é, entregar uma quantidade similar de material para cada célula) pode ser utilizada como um parâmetro de otimização secundário. Os resultados iniciais identificaram a velocidade celular, comprimento de constrição, largura de constrição e formato de região de entrada como parâmetros sensíveis. A composição dos meios, por ouro lado, não parece ser um fator maior. É possível construir uma série de dispositivos, que sistematicamente varia em largura e constrição de constrição entre 5 a 50 pm e 4 8 pm, respectivamente. Ângulos cônicos diferentes conforme o canal fica mais estreito para formar a constrição são possíveis. Os dados de eficiência e viabilidade desses dispositivos, conforme medido por FACS, pode ser correlacionado aos dados de modelamento mencionados anteriormente para melhor compreender os efeitos de tensão de cisalhamento e dimensões de constrição. Esse processo pode ser repetido para diferentes linhagens celulares, que podem responder diferentemente ao tratamento. Esses dados podem ser utilizados para desenvolver dispositivos com geometrias otimizadas e parâmetros de operação para tipos específicos (ou subconjuntos específicos) de célula.

[00240] A FIG. 38 retrata micrográficos que ilustram estruturas de dispositivo alternativas. Micrográfico de campo claro de trabalho preliminar que combina uma constrição e eletrodos (barra de escala 30 pm). Conforme ilustrado na FIG. 38, o dispositivo pode ser modificado acoplando-se o fenômeno de deformação rápida com eletroporação. Eletrodos de ouro podem ser incorporados em qualquer um dos lados da constrição por padronização foto litográfica e deposição Au para introduzir no canal um campo elétrico localizado. Experimentos subsequentes podem identificar valores de parâmetro de operação (velocidade de operação, frequência e força de campo elétrico) que demonstram um desempenho aprimorado em relação a métodos atuais. Aco- plando-se dois mecanismos de poração independentes, pode-se exercer um controle melhor sobre o sistema e manipular múltiplos parâmetros para otimizar o desempenho do sistema para cada tipo de célula. Adicionalmente, campos elétricos podem ser utilizados como uma força de acionamento para entregar moléculas carregadas maiores, tal como DNA, que sofrem de taxas de difusão baixas.

[00241] Uma versão descartável e simplificada do sistema, adequada para uso de colaboradores, é possível. A moldagem por injeção ou gravação a quente de PMMA e policarbonato pode ser utilizada para implantar uma versão com base em polímero do dispositivo. A redução subsequente em custos permitiria que esses dispositivos fossem utilizados como uma ferramenta descartável, aprimorando, portanto, a esterilidade e a facilidade de uso. Além disso, simplificando-se as conexões de tubagem, sistema de montagem e ajustes de regulador de pressão, é viável suprir um sistema de fácil utilização.

[00242] A reprogramação com base em proteína de fibroblastos em células iPS e estudos de otimização do espaço de parâmetro de reprogramação é possível. Estudos anteriores mostraram que iPSCs podem ser geradas por entrega direta de fatores de reprogramação fundidos por CPP tanto de tecidos humanos quanto de camundongos (FIG. 36) e que essas iPSCs de proteína podem se diferenciar em células funcionais (por exemplo, neurônios dopamina) sem fenótipos a- normais associados a iPSCs virais. No entanto, devido a muitos fatores, incluindo degradação de proteína em cultura, ineficiências de entrega e degradação dentro dos endossemos celulares, as eficiências de reprogramação por entrega de proteína direta são muito baixas (<0,01 %) para qualquer uso prático. Os dispositivos microfluídicos descritos no presente documento podem aumentar significativamente a eficiência de reprogramação com base em proteína permitindo-se entrega de proteína ao citoplasma, evitando, assim, ambiente endos- somal áspero e o processo endossomal complicado geralmente encontrado em métodos de entrega de proteína livre ou encapsulada.

[00243] A geração de iPSCs humanas é facilitada por entrega com base microfluídica. O dispositivo é utilizado para entregar uma ou mais, por exemplo, 4 proteínas de reprogramação (c-Myc (proteína, Número de Acesso no Genbank NP_002458.2; DNA, Número de A- cesso no Genbank NMJD02467.4), Klf4 (proteína, Número de Acesso no Genbank AAH30811.1; DNA, Número de Acesso no Genbank NMJD04235.4), Oct4 (proteína, Número de Acesso no Genbank ADW77326.1; DNA, Número de Acesso no Genbank HQ122675.1), e Sox2 (proteína, Número de Acesso no Genbank NP_003097.1; DNA, Número de Acesso no Genbank NM_003106.3);) para fibroblastos humanos embriônicos (HFs). Além do fator quatro Yamanaka (em que MKOS é c-Myc-Klf4-Oct4-Sox2), vários fatores de adição (por exemplo, Lin28 (proteína, Número de Acesso no Genbank AAH28566.1; DNA, Número de Acesso no Genbank NM_024674.4) e Nanog (proteína, Número de Acesso no Genbank AAP49529.1; DNA, Número de Acesso no Genbank NMJD24865.2), Esrrb (proteína, Número de A- cesso no Genbank AAI31518.1; DNA, Número de Acesso no Genbank NMJD04452.3), Glisl (proteína, Número de Acesso no Genbank NP_671726.2; DNA, Número de Acesso no Genbank NM_147193.2), e PRDM14 (proteína, Número de Acesso no Genbank NP_078780.1; DNA, Número de Acesso no Genbank NMJD24504.3)) foram identifi-cados para melhorar a eficiência de reprogramação. Foi completamente estabelecido que a purificação e expressão mamífera de 6 fatores (MKOS + Lin28 e Nanog; MKOSLN) e estabeleceu a bioatividade de cada fator com uso de ensaios repórter. Esses fatores podem ser expressados ou em E.coli ou em células mamíferas. Visto que proteínas expressadas em E.coli não têm modificações pós-translacionais tais como fosforilação, acetilação e ubiquitinação, proteínas purificadas podem ser utilizadas seguindo a expressão em células mamíferas (HEK293 e CHO). As proteínas expressadas em E.coli (comercialmente disponíveis pela Stemgent, Cambridge, MA) podem ser utilizados para comparação. Primeiramente, os fatores de reprogramação etiquetados com FLAG expressados em células HEK293 por transfecção podem ser ressuspensos em um tampão de lise de célula NP40 que contém Tris-HCI a 50 mM, pH 7,4, NaCI a250 mM, EDTA a5 mM, 1% de NP-40 e inibidores de protease. Seguindo centrifugação, a fração solúvel coleada pode ser adicionada com gel de afinidade de agarose anti-FLAG M2 equilibrado. Após lavar com PBS duas vezes, proteínas retidas etiquetados com FLAG podem ser submetidas à eluição adi- cionando-se 0,1 mg/ml de peptídeo de FLAG (Sigma). A solução suspense de fibroblastos humanos e 4 ou 6 proteínas purificadas podem ser aplicados no dispositivo e as células tratadas podem ser transferidas para placas revestidas com 0,1% de gelatina com meios de hESC condicionados para 1, 2, ou 3 dias antes do próximo ciclo de entrega. Após repetir ciclos de entrega de proteína (6 a 16) com o dispositivo microfluídico, as células tratadas serão transferidas para placa em fi- broblasto de camundongo (MEF) tratado com mitomicina e cultivadas por 3 a 4 semanas com meios de hESC normais. As colônias de IPSC podem se tornar visíveis em 3 semanas após a semeadura no MEF. A eficiência de geração de iPSC pode ser comparada com aquela por entrega de proteína com uso de nossas proteínas recombinantes fundidas por CPP. Esses candidatos de iPSC podem ser examinados e- xaustivamente para todos os critérios de iPSCs autênticas, incluindo propriedades moleculares e celulares bem como pluripotência in vivo, conforme descrito acima. O uso de 4 ou 6 fatores ira gerar linhagens de iPSC com eficiência muito aprimorada. É possível, também, expressar adicionalmente fatores adicionais tais como Esrrb, Glisl e PRDM14 e utilizar esses fatores em experimentos de reprogramação.

[00244] Os microRNAs e/ou mRNAs e as proteínas de reprogramação e podem ser entregues em combinação. O dispositivo microfluídico pode ser utilizado para entregar não só proteínas, porém qualquer outra macromolécula. Para tirar vantagem dessa propriedade única para reprogramação de integração de não genoma ideal, é possível combinar o uso de mRNAs e/ou microRNAs e fatores de reprogramação fatores. Em particular, é de grande interesse que as linhagens de iPSC possam ser geradas de modo bem sucedido com uso somente de microRNAs. De fato, a transfecção com base em lipofetamina de microRNAs pode gerar colônias similares a iPSC. Visto que microRNAs provavelmente induzem reprogramação em um mecanismo diferente dos fatores de reprogramação, a combinação apropriada tanto de proteínas de reprogramação quanto de microRNAs por meio do dispositivo microfluídico pode melhorar adicionalmente a eficiência de reprogramação. A entrega combinada de proteínas e mRNAs pode facilitar significativamente as eficiências de reprogramação. Assim, um tratamento combinado ideal de proteínas, mRNAs e/ou microRNAs pode ser entregue com uso do dispositivo microfluídico. Apesar de mi- croRNA/mRNA poder não oferecer o nível equivalente de controle como as proteínas, a capacidade de dispositivo para estudos de otimização de produtividade alta ainda fornece ganhos significativos em relação a abordagens anteriores.

[00245] Os recursos únicos do dispositivo microfluídico podem permitir a entrega de várias quantidades quantificadas de cada fator, de uma maneira controlada e repetível. A otimização do atual assunto facilita o desenvolvimento de uma ferramenta de eficiência alta e confiável para entrega de proteína a HFs. É possível elucidar as frequências e as quantidades de entrega ideais de cada fator de reprogramação. Diferente de mRNA, métodos de plasmídeo e vírus, o sistema não conta com a natureza estocástica de translação e/ou expressão de gene para determinar a concentração intracelular eficaz de fatores de transcrição. Assim, a capacidade do dispositivo de entregar proteína diretamente ao citosil coloca o mesmo em uma posição única para exercer o controle preciso sobre o ambiente intracelular. Uma série de programações de entrega são possíveis que variam a frequência de tratamento (uma vez a cada 1, 2, ou 3 dias) e concentração de proteína de cada um dos quatro fatores independentemente. Em particular, com base em vários relatos que indicam que níveis mais altos de Oct4 sejam críticos para reprogramação eficiente, é possível testar o efeito de diferentes concentrações de Oct4 enquanto mantém-se as concentrações de outros fatores as mesmas. Diferentes concentrações de c- Myc podem ser avaliadas para um dado tipo de célula devido ao fato de que se observou que seus níveis altos geram colônias em grande parte transformadas ao invés de iPSCs em algumas situações. Adicio-nalmente, é possível testar o efeito de tratamento mais frequente de c- Myc devido à sua meia-vida extremamente curta (aproximadamente 30 minutos).

[00246] A otimização de tratamento temporário de fatores de reprogramação é facilitada com uso dos métodos descritos. Cada fator tem um papel funcional e participa no processo de reprogramação. Pelo menos um e, em alguns casos, combinações de fatores são necessários para alcançar o resultado de reprogramação desejado. Por exemplo, c-Myc é conhecido por suprimir a expressão de genes de diferenciação. Além disso, Klf4 é conhecido por reprimir o microRNA let-7, que é relacionado a vias de diferenciação e inibição de pluripotência. Assim, a reprogramação temporariamente regulada pode ser possível tratando-se c-Myc e/ou Klf4 para período inicial, com base em uma condição subideal. Além disso, apesar de Nanog não ser necessário para geração de iPSC, sabe-se que o mesmo é crucial para o estabelecimento final e manutenção de pluripotência. Assim, o efeito de adição de Nanog no estágio posterior do processo de reprogramação pode ser testado. Adicionalmente, o tratamento sequencial de microR- NAs e proteínas pode ser testado e pode-se comparar a eficiência de reprogramação com aqueles a cada tratamento ou tratamento simultâneo. Essa reprogramação temporariamente regulada é viável devido a um recurso único do dispositivo microfluídico e pode ser importante otimizar adicionalmente a reprogramação de proteína. A eficiência de reprogramação pode ser calculada dividindo-se o número de colônias no dia 28 pelo número de células HF tratadas. Uma vez concluída, a análise de regressão pode ser utilizada para deduzir a importância relativa de cada fator de reprogramação, sua concentração ideal, fre- quência/temporização de entrega ideal e, como um resultado, o protocolo ideal para gerar iPSCs. A capacidade de controlar a quantidade e temporização de proteína entregue em cada célula pode ajudar a compreender a significância funcional de cada fator no processo de reprogramação, melhorando, dessa forma, adicionalmente a compreensão do processo de reprogramação celular e estabelecimento de pluripotência. Além disso, os resultados desse trabalho podem ser utilizados para aprimorar adicionalmente o projeto do dispositivo para satisfazer as demandas especificas de reprogramação e permitir o desenvolvimento eventual de versões clinicamente aplicáveis.

[00247] Com o uso de procedimento de reprogramação de proteína otimizado conforme descrito acima, o protocolo pode ser geralmente aplicado a células fibroblastos humanos adultas específicas ao paciente células. Visto que a diferenciação eficiente de ESCs e iPSCs em neurônios de dopamina funcionais e os feitos de transplante foram estudados, é possível gerar linhagens de iPSCs ou iPSC a partir de fibroblastos humanos derivados dos pacientes com Parkinson. Uma vez que linhagens de iPSC são geradas e caracterizadas, as mesmas são induzidas para se diferenciarem em neurônios de dopamina e caracterizarem suas propriedades celulares, moleculares, fisiológicas e eletro- fisiológicas. Os neurônios de dopamina são testados para funcionalidade in vivo seguido de transplante em modelos de animal de doença de Parkinson tal como o modelo de PD genético, camundongos afacia.

[00248] A entrega de proteína com base microfluidica pode ser utilizada para conversão direta de célula, por exemplo, a conversão direta de fibroblastos em outros tipos de célula tais como neurônios, hepató- cito e células sanguíneas funcionais. No passado, as manipulações utilizaram expressão virai de fatores de transcrição chave, causando interrupções significativas de cromossomo e mutações de gene, destacando, dessa forma, a necessidade de desenvolver métodos de conversão que integram genoma e não virai como entrega de proteína direta com uso dos métodos descritos acima. Assim, o dispositivo pode ser utilizado para entrega de proteína com base microfluidica para conversão direta de célula. Visto que a expressão mamífera de certos fatores de transcrição são às vezes desafiadores, pode ser mais viável testar a conversão por um ou dois fatores proteína. No entanto, é possível converter fibroblastos em outro destino celular com uso de um único fator, por exemplo, Oct4 ou Sox2 para gerar precursores de sangue ou neurais, respectivamente. Essas proteínas estão prontamente disponíveis em uma forma purificada, para conversões celulares com uso de entrega de proteína com base microfluidica.

[00249] A FIG. 44 é um gráfico com barras que ilustra o silenciamento de GFP em HESCs conforme medido por intensidade de GFP 48 horas após o tratamento com sequências de siRNA ativo e controles codificados com uso do dispositivo microfluídico e métodos relacionados. As FIGS. 45A e 45B são dois diagramas que ilustram intensidade de corante e viabilidade de células-troncos embriônicas humanas após a entrega de 3kDa de corante azul.

[00250] Outras modalidades estão dentro do escopo e do espírito da invenção. Por exemplo, devido à natureza de software, as funções descritas acima podem ser implantadas com uso de software, hardware, firmware, fiação ou combinações dos mesmos. Os recursos que implantam funções podem, também, se localizar fisicamente em várias posições, incluindo serem distribuídos de modo que porções de funções sejam implantadas em diferentes localizações físicas.

[00251] Deve-se observar que uma ou mais referências são incorporadas no presente documento. Ao ponto em que qualquer material incorporado é inconsistente com a presente revelação, a presente revelação deve controlar. Adicionalmente, ao ponto necessário, o material incorporado a título de referência no presente documento deve ser desconsiderado se necessário para preservar a validade das reivindicações.

[00252] Adicionalmente, embora a descrição acima se refira à invenção, a descrição pode incluir mais que uma invenção.

Claims (29)

1. Sistema de microfluidos para ocasionar perturbações em uma membrana celular para liberação intracelular de uma carga útil, caracterizado pelo fato de que compreende: um canal de microfluidos (10) que define um lúmen permitindo que uma célula (20) suspensa em um tampão (25) atravesse o mesmo, em que o canal de microfluidos (10) inclui uma constrição deformadora de célula (15) causando perturbações, em que um diâmetro da constrição é 20 a 99% do diâmetro da célula (20), e em que o diâmetro das constrições (15) induzem perturbações da membrana da célula grandes o suficiente para que uma carga útil atravesse.

2. Sistema de microfluidos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o diâmetro da constrição (15) é 20% a 60% do diâmetro da célula (20).

3. Sistema de microfluidos, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a constrição inclui uma porção de entrada (35), um ponto central (40) e uma porção de saída (45), opcionalmente, em que a porção de entrada (35) define um ângulo de constrição de 90 graus.

4. Sistema de microfluidos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma pluralidade dos canais de microfluidos (10) dispostos ou em série ou em paralelo.

5. Sistema de microfluidos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um acionador de célula, opcionalmente, em que o acionador de célula é selecionado de um grupo que consiste em: uma bomba de pressão, um cilindro de gás, um compressor, uma bomba de vácuo, uma seringa, uma bomba de seringa, uma bomba peristáltica, uma seringa manual, uma pipeta, um pistão, um atuador capilar, um coração humano, músculo humano e gravidade.

6. Método para a entrega de uma carga útil em uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer a célula em uma solução de suspensão; atravessar uma solução por um canal de microfluidos que inclui uma constrição deformadora de célula, em que o diâmetro de constrição é 20-99% do diâmetro da célula, em que, conforme a célula atravessa pela constrição, uma força de deformação é aplicada à célula, ocasionando perturbações da célula grandes o suficiente para fazer com que uma carga útil atravesse a mesma; e incubar a célula em uma solução contendo carga útil durante um período de tempo predeterminado após a mesma atravessar a constrição.

7. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a solução em suspensão compreende uma célula e a carga útil antes, durante e/ou depois de atravessar a constrição.

8. Método de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que o diâmetro da constrição é de 20% a 60% do diâmetro da célula.

9. Sistema de microfluidos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou método como definido na reivindicação 6 a 8, caracterizado pelo fato de que uma seção transversal do canal de microfluidos (10) é selecionada do grupo que consiste em circular, elíptica, uma fenda alongada, quadrada, hexagonal e triangular.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizado pelo fato de atravessar a solução inclui atravessar a solução por uma porção de entrada, um ponto central e uma porção de saída da constrição, em que a porção de entrada define o ângulo de constrição.

11. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a porção de entrada define um ângulo de constrição em 90 graus.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 11, caracterizado pelo fato de que atravessar a solução inclui atravessar a solução por uma pluralidade de canais de microfluidos dispostos ou em série e/ou em paralelo.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 12, caracterizado pelo fato de que a incubação a célula na solução contendo a carga útil inclui incubar a célula por 0,0001 segundo a 60 minutos.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 13, caracterizado pelo fato de que a força de deformação é uma dentre compressão, ou cisalhamento e compactação.

15. Método para a entrega de um composto em uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer uma célula em uma solução suspensa; passar a solução através de uma constrição de deformação de célula, em que o diâmetro da constrição é 20-99% do diâmetro da célula, tal que a força de deformação seja aplicada à célula conforme ela passa através da constrição, causando assim perturbações na membrana da célula grandes o suficiente para que a carga útil atravesse; e incubar a célula na solução com uma carga útil após a célula ter sido deformada.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a solução em suspensão compreende uma célula e a carga útil antes, durante e/ou depois de atravessar a constrição.

17. Método de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que o diâmetro da constrição é de 20% a 60% do diâmetro da célula.

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, caracterizado pelo fato de que a passagem da solução inclui a passagem da solução através de uma pluralidade de constrições posicionadas em série e/ou em paralelo.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 18, caracterizado pelo fato de que a deformação da célula inclui deformara a célula por 1 ps a 1 ms e/ou em que a incubação ocorre por 0,0001 segundo a 20 minutos.

20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 119, caracterizado pelo fato de que a força de deformação é uma dentre compressão, ou cisalhamento e compactação.

21. Método para a entrega de um composto em uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer uma suspensão de uma célula e uma carga útil; fluir a suspensão através de uma constrição de deformação de célula, e que o diâmetro da constrição é de 20-99% do diâmetro da célula, para deformar repentina e temporariamente a célula; e incubar a célula na suspensão durante um período de tempo predeterminado após a deformação repentina e temporária.

22. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a constrição está em um canal de microfluidos.

23. Método de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que o diâmetro da constrição é de 20% a 60% do diâmetro da célula.

24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 23, caracterizado pelo fato de que o fluxo da suspensão através da constrição no canal de microfluidos inclui deformar a célula por 1 ps a 1 ms.

25. Sistema de microfluidos para o uso com uma célula (20) suspensa em uma solução (25) e para ocasionar perturbações em uma membrana da célula, caracterizado pelo fato de que compreende: uma constrição de deformação de célula (15), em que o diâmetro de constrição (15) é 20 a 99% do diâmetro da célula (20) para deformar repentina e temporariamente a célula (20), em que as constrições (15) causam perturbações na membrana da célula (20), em que as perturbações são grandes o suficiente para que uma carga útil atravesse a mesma.

26. Sistema de microfluidos, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a constrição (15) é 20% a 60% do diâmetro da célula.

27. Sistema de microfluidos, de acordo com a reivindicação 25 ou 26, caracterizado pelo fato de que o sistema está configurado para ocasionar deformação repentina e temporária à célula (20) com o uso de: (i) um canal de microfluidos (10); (ii) uma pluralidade de micropilares (100), opcionalmente, em que os micropilares (100) estão configurados em um arranjo; (iii) uma ou mais placas móveis (105); ou (iv) materiais volumosos (110).

28. Sistema de microfluidos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 27, caracterizado pelo fato de que a célula é deformada por 1 ps a 1 ms.

29. Métodos, de acordo com as reivindicações 6 a 24, caracterizado pelo fato de que o método é usado para liberar: (i) DNA, RNA, siRNA ou proteína para fibroblastos primários e células tronco para reprogramação de célula; (ii) antígeno, macromoléculas marcadas, peptídeos ou RNA para células imunológicas primárias ou (iii) pelo menos um dentre pontos quânticos, componentes fluorescentes e nanotubos de carbono à célula-alvo para auxiliar no imageamento da célula-alvo ou (iv) fármacos para a célula-alvo e em que a célula-alvo é uma célula tumoral.

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