WO2003104788A1

WO2003104788A1 - 細胞外電位測定デバイスおよびその製造方法

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Publication number: WO2003104788A1
Application number: PCT/JP2003/006920
Authority: WO
Inventors: 中谷　将也; 岡　弘章; 江本　文昭
Original assignee: 松下電器産業株式会社
Priority date: 2002-06-05
Filing date: 2003-06-02
Publication date: 2003-12-18
Also published as: US8232084B2; EP1411351A4; US7501278B2; US20090035846A1; CN100487456C; EP2365325A1; CN1564942A; EP1411351A1; US20040197898A1

Abstract

被験体細胞の細胞外電位を測定するデバイスは、第１面に底面を有するウェルが形成され、第２面に向かってウェルの底面から形成された第１の開口部と、第１の開口部と第１の接続部で連結された第１の空洞部と、第１の空洞部と第２の接続部で連結された第２面に達する第２の開口部とを有する第１のトラップ孔が形成された基板を備える。第１の接続部の径は第１の空洞部の最大径より小さく、第２接続部の径より大きく、かつ被験体細胞の径より小さい。そのデバイスは確実に被験体細胞を保持でき、薬液と被験体細胞を投入しやすい。

Description

明細書細胞外電位測定デバィスおよびその製造方法技術分野

本発明は、生体試料、特に細胞が発する電気化学的変化を指標にして、簡易に高速に電気生理学的に評価する細胞外電位測定デバイスおよびその製造方法に関する。背景技術

従来、細胞の電気的活動を指標にして薬品はパッチクランプ法、蛍光色素または発光指示薬を用いる方法によりスクリーニングされている。

このパッチクランプ法では、マイクロピぺットの先端部分に付けた細胞膜のパッチと呼ばれる微小部分での、単一のチャネルタンパク質分子を介するイオンの輸送を微小電極プローブによって電気的に記録する。この方法は一個のタンパク質分子の機能をリアルタイムで調べることのできる数少ない方法の一つである（たとえば、「Mo l e c u 1 a r B i o l o g y o f t h e C e l l T h i r d E d i t i o ri」、 G a r l a n d P u b l i s h i n g I n c .、 N ew Y o r k, 1 9 94、 B r u c e A l b e r t s他、日本語版「細胞の分子生物学第三版」 1 8 1〜 1 8 2頁、 1 9 9 5年、教育社）。

また、特定のイオンの濃度変化に応じて光を発する蛍光色素または発光指示薬により、細胞内のイオンの移動をモニタすることで細胞の電気的活動を測定することができる。

しかし、パッチクランプ法は、マイクロピペットの作成及び操作に特殊な技術を必要とし、一つの試料の測定に多くの時間を要するので大量の薬品候補化合物を高速でスクリ一二ングするには適していない。また、蛍光色素などを利用する方法は大量の薬品候補化合物を高速でスクリーニングできるが、細胞を染色する工程が必要であり、測定においては色素の影響でバックグラウンドも変色する上に時間とともに脱色するため S / N比が悪い。発明の開示

被験体細胞の細胞外電位を測定するデバイスは、第 1面に底面を有するゥエルが形成され、第 2面に向かってゥエルの底面から形成された第 1の開口部と、第 1の開口部と第 1の接続部で連結された第 1の空洞部と、第 1の空洞部と第 2の接続部で連結された第 2面に達する第 2の開口部とを有する第 1のトラップ孔が形成された基板を備える。第 1の接続部の径は第 1の空洞部の最大径より小さく、第 2接続部の径より大きく、かつ被験体細胞の径より小さい。

そのデバイスは確実に被験体細胞を保持でき、薬液と被験体細胞を投入しやすい。図面の簡単な説明

図 1は本発明の実施の形態 1による細胞外電位測定用デバイスの斜視図である。

図 2は実施の形態 1による細胞外電位測定用デバイスの断面図である。

図 3は実施の形態 1による細胞外電位測定用デバイスの断面拡大図である。

図 4は実施の形態 1による細胞外電位測定用デバイスの使用方法を示す断面図である。

図 5は実施の形態 1による細胞外電位測定用デバイスの拡大断面図である。

図 6は実施の形態 1による細胞外電位測定用デバイスの拡大断面図である。図 7は実施の形態 1による細胞外電位測定用デバイスの拡大断面図である。

図 8は実施の形態 1による細胞外電位測定用デバイスの拡大断面図である。

図 9は実施の形態 1による細胞外電位測定用デバイスの拡大断面図である。

図 1 0は実施の形態 1による細胞外電位測定用デバイスの製造方法を示す断面図である。

図 1 1は実施の形態 1による細胞外電位測定用デバイスの製造方法を示す断面図である。

図 1 2は実施の形態 1による細胞外電位測定用デバイスの製造方法を示す断面図である。

図 1 3は実施の形態 1による細胞外電位測定用デバイスの製造方法. を示す拡大断面図である。

図 1 4は実施の形態 1による細胞外電位測定用デバイスの製造方法を示す拡大断面図である。

図 1 5は実施の形態 1による細胞外電位測定用デバイスの製造方法を示す拡大断面図である。

図 1 6は実施の形態 1による細胞外電位測定用デバイスの製造方法を示す拡大断面図である。

図 1 7は実施の形態 1による細胞外電位測定用デバイスの製造方法を示す拡大断面図である。

図 1 8は実施の形態 1による細胞外電位測定用デバイスの製造方法を示す拡大断面図である。

図 1 9は実施の形態 1による細胞外電位測定用デバイスの製造方法を示す拡大断面図である。

図 2 0は実施の形態 1による細胞外電位測定用デバイスの他の製造方法を示す拡大断面図である。

図 2 1は実施の形態 1による細胞外電位測定用デバイスの他の製造方法を示す拡大断面図である。

図 2 2は実施の形態 1による細胞外電位測定用デバイスの他の製造方法を示す拡大断面図である。

図 2 3は本発明の実施の形態 2による細胞外電位測定用デバイスの斜視図である。

図 2 4は実施の形態 2による細胞外電位測定用デバイスの断面図である。

図 2 5は実施の形態 2による細胞外電位測定用デバイスの拡大断面図である。

図 2 6は実施の形態 2による細胞外電位測定用デバイスの製造方法を示す断面図である。 · 図 2 7は実施の形態 2による細胞外電位測定用デバイスの製造方法を示す拡大断面図である。

図 2 8は実施の形態 2による細胞外電位測定用デバイスの製造方法を示す拡大断面図である。

図 2 9は実施の形態 1による他の細胞外電位測定デバイスの断面図である。

図 3 0は本発明の実施の形態 3における細胞外電位測定デバイスの斜視図である。

図 3 1 Aは実施の形態 3における細胞外電位測定デバイスの断面図である。

図 3 1 Bは実施の形態 3における細胞外電位測定デバイスの拡大断面図である。

図 3 2は実施の形態 3における細胞外電位測定デバイスの動作を示す断面図である。

図 3 3は実施の形態 3における細胞外電位測定デバイスの拡大断面図である。

図 3 4は実施の形態 3における細胞外電位測定デバイスの拡大断面図である。図 3 5は実施の形態 3における細胞外電位測定デバイスの製造方法を示す断面図である。

図 3 6は実施の形態 3における細胞外電位測定デバイスの製造方法を示す拡大断面図である。

図 3 7は実施の形態 3における細胞外電位測定デバイスの製造方法を示す拡大断面図である。

図 3 8は実施の形態 3における細胞外電位測定デバイスの製造方法を示す断面図である。

図 3 9は実施の形態 3における細胞外電位測定デバイスの製造方法を示す断面図である。

図 4 0は実施の形態 3における細胞外電位測定デバイスの製造方法を示す断面図である。

図 4 1は実施の形態 3における細胞外電位測定デバイスの製造方法を示す断面図である。

図 4 2は実施の形態 3における細胞外電位測定デバイスの製造方法を示す断面図である。

図 4 3は本発明の実施の形態 4における細胞外電位測定デバイスの断面図である。

図 4 4は実施の形態 4における細胞外電位測定デバイスの製造方法を示す拡大断面図である。

図 4 5は実施の形態 4における細胞外電位測定デバイスの製造方法を示す拡大断面図である。

図 4 6は本発明の実施の形態 5における細胞外電位測定デバイスの製造方法を示す拡大断面図である。

図 4 7は本発明の実施の形態 5における細胞外電位測定デバイスの製造方法を示す拡大断面図である。

図 4 8は本発明の実施の形態 5における細胞外電位測定デバイスの製造方法を示す拡大断面図である。発明を実施するための最良の形態

(実施の形態 1 )

図 1は本発明の実施の形態 1における細胞外電位測定デバイスの斜視図であり、図 2はその断面図、図 3はその断面拡大図である。

その細胞外電位測定デバイスは、ゥエル 2が設けられたシリコンよりなる基板 1を備える。ゥエル 2の底面 3には複数の細胞トラップ孔 1 0 1が設けられ、それぞれのトラップ孔 1 0 1はこの順で一直線上に連結されている第 1の開口部 4と空洞部 6と第 2の開口部 5とで構成されている。第 1の開口部 4の径は空洞部 6の最大径より小さく、第 2の開口部 5の径より大きい。

これらの具体的な寸法は被験体細胞の大きさによって最適に決められる。たとえば、 2 5マイクロメ一トルの径の被験体細胞では、第 1 の開口部 4の径は 2 5マイクロメ一トルより小さい 2 0マイクロメ一トルとし、空洞部 6の最大径は被験体細胞の大きさより大きい 3 5マイク口メートルとし、第 2の開口部 5の径は被験体細胞より小さい 1 0マイクロメートル程度に設定される。一般的には、被験体細胞の径は数マイクロメ一トル〜数十マイクロメートルであるので、第 1の開口部 4の径はは 1 0〜5 0マイクロメートル、第 2の開口部 5の径は 1〜5マイクロメ一トル程度とし、空洞部 6の最大径はこれらに応じて 1 0〜 1 0 0マイクロメ一トルの間で最適な値とすることが望ましい。

図 3に示すように、少なくとも第 2の開口部 5の内壁面と空洞部 6 の下方には金よりなる検出電極 7が形成されている。基板 1の下面には金よりなる引き出し電極 8が設けられている。検出電極 7と引き出し電極 8は第 2の開口部 5で電気的に接続されている。空洞部 6の上方には導体は設けられていないので、検出電極 7はゥエル 2と電気的に絶縁されている。

この細胞外電位測定用デバイスの使用方法について説明する。図 4 は、被験体細胞 9と培養液 1 0をゥエル 2に投入した細胞外電位測定 06920

7 用デバイスの断面図である。図 5〜図 9は第 1の開口部 4、第 2の開口部 5、空洞部 6の拡大断面図である。

図 4および図 5に示すように、ゥエル 2内に培養液 1 0と被験体細胞 9を入れた当初では、被験体細胞 9は培養液 1 0中に浮遊している。培養液 1 0はゥエル 2内だけでなく、第 1の開口部 4、空洞部 6、第 2の開口部 5を満たした後、第 2の開口部 5側にも流れ出す。この状態では、浮遊している被験体細胞 9は、ゥエル 2内の培養液 1 0の圧力によって図 6に示すように第 1の開口部 4へ引き込まれる。圧力が小さい場合には、第 2の開口部 5側から吸引ポンプなどの手段により培養液 1 0を吸引すると、より確実に浮遊している被験体細胞 9は第 1の開口部 4側に吸引される。

第 1の開口部 4の径は被験体細胞 9の径より小さく設計されているので、図 7に示すように被験体細胞 9は第 1の開口部 4を通るときに抵抗を受ける。しかし圧力や吸引によって力を受けているので、被験体細胞 9は変形し、空洞部 6へ到達できる。図 8に示すように、空洞部 6内に到達した被験体細胞 9は、吸引を止めても、ゥエル 2側より培養液 1 0の圧力を受けている。かつ細胞 9は第 1の開口部 4の径ょり大きく、第 1の開口部 4はほぼ垂直なので、ゥエル 2側から吸引されるなどの外力がない限り簡単にはゥエル 2に戻ることができなくなり、空洞部 6内に保持される。

空洞部 6の形状を図のように縦径ょり横径が大きい楕円形状にし、縦径が被験体細胞 9より小さくなるようにしておけば、被験体細胞 9 は確実に空洞部 6内に保持される。このような状態で、ゥエル 2内の培養液 1 0に薬剤（図示せず）を投与すれば、薬剤は培養液 1 0内に浸透する。薬剤により図 9に示すように被験体細胞 9が活性化して第 2の開口部 5で発生した電気信号は、第 2の開口部 5に満たされている培養液 1 0の電位を変化きせる。この電位の変化は培養液 1 0に接している検出電極 7及び引き出し電極 8によって検出される。

このように、実施の形態 1による細胞外電位測定用デバイスでは、検出電極 7はゥエル 2とは電気的に絶縁されており、測定の際には被験体細胞 9は確実に空洞部 6内に保持されている。つまり、第 2の開口部 5側の培養液 1 0とゥエル 2側の培養液 1 0とは電気的に絶縁されているので、細胞の活動により発生する電気信号は、ゥエル 2側の培養液 1 0に漏れず、第 2の開口部 5側に設けた検出電極 7によって検出される。

いずれかの細胞トラップ孔に被験体細胞が保持されれば細胞外電位の測定が可能になる。

第 1の開口部 4は図 2 9に示すように、ゥエル 2に向かって穴径が広くなるテーパ形状であってもよい。この場合は、ゥエル 2側から被験体細胞 9は容易に進入できる。第 1の開口部 4の空洞部 6側の径を空洞部 6の最大径ょり小さくすれば、ゥエル 2側へ被験体細胞 9が戻ることを防げる。これにより、空洞部 6へ入った被験体細胞 9はゥェル 2へは戻らず保持されるので、より細胞の保持率の高い細胞外電位測定デバイスが得られる。この場合、大きいものから順に空洞部 6の径は第 1の開口部 4の空洞部側の径ょり大きく、第 1の開口部 4の空洞部側の径は第 2の開口部 5の径より大きい。

テーパ形状の第 1の開口部 4のゥエル側の径は被験体細胞の径の 2 倍より小さくすることで、複数の細胞がゥエルから同時に進入して第 1の開口部の内部で詰まることを防ぐことができる。

なお、実施の形態 1による細胞外電位測定デバイスでは、被験体細胞 9が細胞トラップ孔 1 0 1の中に進入すると、ゥエル 2側に戻ることはできない。したがって、一度、被験体細胞 9の測定を行うとゥェル 2および細胞トラップ孔 1 0 1内部が汚染される。よって、デバイスは再利用せず使い捨てになるので被験体細胞 9を取り出す必要はない。

次に実施の形態 1による細胞外電位測定用デバイスを製造する手順について説明する。図 1 0〜図 1 9はこの手順を説明するための細胞外電位測定用デバイスの断面図である。まず、図 1 0に示すように、シリコン基板 1にフォトリソグラフィ一によつてゥエル 2を形成するためのレジストマスク 1 1が形成され、次に図 1 1に示すように所定の深さになるまで基板 1 をゥエツトエツチングまたはドライエッチングでエッチングしてゥエル 2を形成する。ゥエツトエッチングでは K O Hや水酸化テトラ · メチル · アンモニゥム液（T M A H ) などのエッチング液が使用され、ドライエッチングでは S F ₆ , C F ₄などのエッチングガスが用いられる。

次に図 1 2に示すように、第 1の開口部 4を形成するためのレジストマスク 1 2と、第 2の開口部を形成するためのレジストマスク 1 3 とがそれぞれ、ゥエル 2の底面およびシリコン基板 1の下面に形成される。被験体細胞 9の大きさに応じて第 1の開口部 4と第 2の開口部 5の大きさが決定される。第 1の開口部 4の径が第 2の開口部 5の径より大きい。

次に図 1 3に示すように、ゥエル 2側から基板 1を所定の深さまでエッチングして第 1の開口部 4を形成する。このときエッチングはドライエツチングが望ましく、かつエッチングガスとしてエッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスが用いられる。エッチングを促進するガスには S F ₆、 C F ₄などが用いられるが、これはシリコンのエッチングを深さ方向だけではなく横方向へも促進する。そこで、 C H F ₃ , C ₄ F ₈等のエッチングを抑制するガスが混入されたガスは開口部の壁面に C F ₂のポリマ一である保護膜を作成するので、エツチングをエッチングマスクの下方のみに進行させることが可能である。

エッチングをさらに垂直な方向に促進させる場合には、エッチングを促進するガスによつて基板を少しエッチングした後、エッチングを抑制するガスによって保護膜を形成する工程を繰り返すことで、ほぼ垂直な開口部の形状が得られる。実験では、大きさ 2 0マイクロメ一トルの第 1の開口部 4を形成するのに、 S F ₆を 1 3 0 s c c m流して 1 3秒間プラズマを発生させることで約 1マイクロメ一トルだけ基板 1をエッチングし、その後 C ₄ F ₈を 8 5 s c c m流して 7秒間プラズマを発生させて厚さ約 0 . 0 1マイクロメ一トルの保護膜を形成する。このエッチングと保護膜の形成を約 6 0回繰り返した結果、 6 0マイクロメートルの深さのほぼ垂直な開口部が得られた。

なお、エッチングを抑制するガスによって保護膜は第 1の開口部 4 の壁面だけでなく底面にも形成される。底面に形成された保護膜は壁面に形成された保護膜に比べてエッチングを促進するガスによって容易に除去されるので、エッチングは下方のみに進む。

エツチングを抑制するガスによつて保護膜を形成して、この開口部を形成する工程を終了すれば、第 1の開口部 4の壁面には確実に保護膜が形成される。したがって、後の工程において、空洞部 6を形成する際にも第 1の開口部 4の壁面が侵されない。

次に、図 1 4に示すように、基板 1 の下面側から第 2の開口部 5を形成するために基板 1をエッチングする。第 1の開口部 4と同様に、エッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスを切り替えて基板 1をエッチングしてその壁面をほぼ垂直に形成する。

さらに、第 1の開口部 4と同様、エッチングを抑制するガスによつて保護膜を形成して第 2の開口部 5を形成する工程を終了する。これにより、第 2の開口部 5の壁面にも保護膜が確実に形成されるので、後の工程において空洞部 6を形成する際に第 2の開口部 5の壁面が侵されない。

次に、図 1 5に示すように第 1の開口部 4側から、エッチングを促進するガスのみを用いて基板 1をエッチングする。先ほどの工程で、第 1の開口部 4の壁面には保護膜が形成されているので、壁面はエツチングによって侵されずに下方にエッチングが進むが、新しくエッチングされた部分には保護膜が形成されないので、横方向にもエツチングが進む。結果的に図 1 5に示すように、第 1の開口部 4と第 2の開口部 5の間に第 1の開口部 4より広がった空洞部 6が形成される。この際、基板 1を適切な量だけエッチングすることで、空洞部 6の形状は横径の方が大きい楕円形状となる。第 2の開口部 5側に貫通された後にも開口部 5の壁面にも保護膜が形成されているので、空洞部 6の大きさが所望の大きさとなるまでしばらくエッチングを続けても、第 2の開口部 5の壁面は侵されない。エッチングを過度に続けると、空洞部 6は横方向のみではなく、図 1 5の点線に示すように全体に広がった形状となるので、適切にエッチングを終了する必要がある。

この工程におけるエッチングを促進するガスは S F ₆ , C F ₄が用いられるが、望ましくは X e ₂が用いられる。 X e F ₂は保護膜をほとんどエッチングしないので、壁面をほとんど侵すことなく空洞部 6を形成できる。ただし、このガスは、前工程で形成された開口部の底面の保護膜をエッチングする速度も遅いので、これを回避するため、 X e F ₂によるエッチングの前に S F ₆、 C F ₄、 A rガスなどを用いて底面の保護膜のみをエッチングすればよい。

なお、実施の形態 1では第 1の開口部 4、第 2の開口部 5、空洞部 6の順番で形成したが、第 2の開口部 5、第 1の開口部 4、空洞部 6 の順番で形成しても、あるいは第 1の開口部 4、空洞部 6、第 2の開口部 5の順番で形成してもよい。また、空洞部 6は第 2の開口部 5側からエッチングできるが、この場合は、空洞部 6が第 1の開口部 4より大きくなるようにエッチング量に注意する必要がある。

次に、図 1 6に示すように、すべてのレジストマスクを除去した後、第 1の開口部 4側から夕一ゲットより放出された金粒子 1 4を蒸着法により付着させ検出電極 7を形成する。夕一ゲットより放出された金粒子 1 4は直進するので第 1の開口部 4を通って、図 1 7に示すように第 1の開口部 4の内壁、空洞部 6部の下方及び第 2の開口部 5の内壁のみに蒸着される。つまり、検出電極 7は第 2の開口部 5の内壁と空洞部 6の下方にしか形成されない。

次に図 1 8に示すように、第 2の開口部 5側より金よりなる引き出し電極 8を蒸着によって形成する。第 2の開口部 5の径は第 1の開口部 4より小さいので、金粒子 1 5が直進することで同様に、第 2の開口部 5の内壁と第 1の開口部 4の内壁の一部にのみ金が付着する。図 1 9に示すように、空洞部 6の下方と第 2の開口部 5に形成された検出電極 7と第 1の開口部 4の内壁に形成された金は電気的に絶縁されている。金を基板 1に確実に付着させるために、基板 1上にクロム、チタンなどをバッファ層として形成し、その上に金を付着させてもよい。ゥエル 2の底面へ金が蒸着されることを防ぐ場合には、第 1の開口部 4を形成するために設けたレジストマスク 1 1を除去する前に金を蒸着する。これにより、レジストマスク 1 1を除去した後には金はゥエル 2の底部には形成されない。なお、ここでは金は蒸着法で付着されるが、スパッ夕法でも同様に金は付着される。

細胞トラップ孔の第 2の開口部の壁面に形成された導体がゥエルの下面において互いに短絡されている。これにより、細胞トラップ孔にそれぞれ被験体細胞が保持されている場合に、これらの被験体細胞外の電位変化が並列に接続され、一つ一つの被験体細胞の電位変化が少なくても確実に電位を検出できる。

上述のように、実施の形態 1による製造方法によれば、シリコンよりなる基板 1に、ゥエル 2と、ゥエル 2内の第 1の開口部 4と第 2の開口部 5と空洞部 6を有し、被験体細胞を確実に空洞部 6内に保持できる信頼性の高い細胞外電位測定用デバイスが得られる。

なお、実施の形態 1では基板 1はシリコンよりなるが、ドライエツチングが可能で、ガスの切り替えによって直進性エッチングと横方向エッチングが実現できる材料に実施の形態 1による方法が適用できる。たとえばガラスや石英は S F ₆、 C F ₄などのガスにより深さ方向のェッチングが可能で、 H Fガスによつて横方向のエツチングが可能である。

なお、実施の形態 1では、第 1の開口部 4はゥエル 2の底面とほぼ垂直な穴である。第 1の開口部 4を空洞部 6側の径ょりゥエル 2側の径の方が大きいテーパ形状にする場合には、第 1の開口部 4をエッチングする工程において、エッチングを抑制するガスとエッチングを促進するガスのと混合ガスで、エッチングがゥエル 2から空洞部 6に進むに従って、エッチングを促進するガスの割合を減らす。これによつて、図 2 0のように第 1の開口部 4の壁面がテ一パ形状となり、図 2 1のように被験体細胞 9が進入しやすく、空洞部 6に入った被験体細胞 9はゥエル 2側へ戻りにくい。

なお、第 1の開口部 4の壁面がテーパ形状となるようにするには、その他、エッチングを促進するガスのみで基板 1をエッチングしてもよい。この場合は、図 2 2のようにレジストマスク 1 2で作成した径よりゥエル 2側の第 1の開口部 4の径が広がるので、最適なテーパ形状を得るよう、あらかじめレジストマスク 1 2の大きさを決めておく必要がある。

なお、実施の形態 1では、開口部 4、 7の径と空洞部 6の径との関係を述べた。図 3に示すように、開口部 4と空洞部 6との境界の接続部 1 0 2との径が空洞部 6の最大径ょり小さく、かつ開口部 7と空洞部 6との境界の接続部 1 0 3の径は接続部 1 0 2の径より小さければ実施の形態 1と同様の効果が得られる。

(実施の形態 2 )

図 2 3は本発明の実施の形態 2における細胞外電位測定用デバイスの斜視図であり、図 2 4はその断面図、図 2 5はその拡大断面図である。実施の形態 1 と異なり、基板 1 6は第 1のシリコン層 1 7と二酸化珪素層 1 8と第 2のシリコン層 1 9の積層体である。第 1の開口部 2 1は第 1のシリコン層 1 7に、第 2の開口部 2 2は第 2のシリコン層 1 9に、空洞部 2 3は二酸化珪素層 1 8にそれぞれ形成されている。検出電極 2 4は第 2の開口部 2 2の内壁と、空洞部 2 3の下方のみに形成されており、引き出し電極 2 5は基板 1 6の下面に形成されている。検出電極 2 4と引き出し電極 2 5は第 2の開口部 2 2付近で電気的に接続されている。

この細胞外電位測定デバイスの動作は、実施の形態 1による測定デ 03 06920

14 バイスと同じなので説明を省略する。第 1のシリコン層 1 7と第 2のシリコン層 1 9の間の二酸化珪素層 1 8はシリコン層 1 7、 1 9間の電気的絶縁を高め、これにより第 2の開口部 2 2側で発生する細胞活動による電気的信号は、第 1の開口部 2 1側に漏れることなく確実に、検出電極 2 4によって検出できる。

次に実施の形態 2の細胞外電位測定用デバイスを製造するための手順について説明する。実施の形態 1と工程は説明を省略し、第 1の開口部 2 1、第 2の開口部 2 2、空洞部 2 3を形成する工程のみについて説明する。また、基板の材料はシリコン層、二酸化珪素層、シリコン層の順番で積層されているが、これは S O I基板として一般に販売されているものであり、特に説明しない。

まず、ゥエル 2 0を第 1のシリコン層 1 7に形成した後に、図 2 6 に示すように、第 1の開口部 2 1、第 2の開口部 2 2を形成するためのレジストマスク 2 6 , 2 7を形成する。次に、図 2 7に示すように、ゥエル 2 0の底面および下面側よりドライエッチングによって壁面がゥエル 2 0の底面に垂直になるように、二酸化珪素層 1 8に達するまで層 1 7、 1 9をエッチングする。このとき、実施の形態 1と同様、エッチングを促進するガスと抑制するガスとを用いて基板をエツチングする。二酸化珪素層 1 8により、第 1の開口部 2 1と第 2の開口部 2 2の形成時に、二酸化珪素層 1 8に到達するまで層 1 7、 1 9をェツチングすればよい。したがって、所定の深さになるようエッチング時間を管理する必要が無い。

次に、基板を H F溶液に浸けると、 H F溶液はシリコン層 1 7、 1 9をそれほど多くエッチングせず、二酸化珪素層 1 8のみをエツチングするので、図 2 8に示すように空洞部 2 3が形成される。このときエッチング時間は、空洞部 2 3が必要な横方向の径を有するまで二酸化珪素層 1 8をエッチングすればよい。この後、実施の形態 1と同様、検出電極 2 4と引き出し電極 2 5をが形成される。二酸化珪素 1 8は、 H Fガスを用いてプラズマでエツチングしてもよい。 H Fガスは H F 溶液と同様、シリコン層を多くエッチングせず、二酸化珪素層 1 8のみをエッチングできる。したがって、実施の形態 1のように長く基板をエッチングしすぎると空洞部が楕円形状にならない、ということを防ぐことができる。

以上のように、シリコンと二酸化珪素の 2種類の層を積層した基板 1 6では、第 2の開口部 2 2深さと、空洞部 2 3の高さがあらかじめ決まっているので、測定デバイスが容易に製造できる。さらに、第 1 の開口部 2 1 と第 2の開口部 2 2は二酸化珪素層 1 8によって電気的に完全に分離されているので、より信頼性の高い細胞外電位測定用デバイスが得られる。

なお、実施の形態 2では、基板 1 6は第 1のシリコン層 1 7、二酸化珪素層 1 8、第 2のシリコン層 1 9の 3層構造を有するが、たとえば基板はシリコン層、二酸化珪素層、シリコン層、二酸化珪素層の 4 層構造、または 4つ以上の層を有していてもよい。

基板 1 6はシリコン層、二酸化珪素層、シリコン層の順で積層されているが、二酸化珪素層、シリコン層、二酸化珪素層の順番に積層された基板でも測定デバイスは製造できる。さらに、基板 1 6の材料ははシリコンと二酸化珪素の組み合わせの他に、シリコンとガラス、ァルミとアルミナ、ガラスと樹脂など多数の組み合わせを用いることができる。また、基板 1 6は 2種類の材料ではなく 3種類の材料で、それぞれの層が全て異なっても同様の効果が得られる。

なお、実施の形態 1と同様、第 1の開口部 2 1の壁面をテ一パ形状にできるが、効果、方法は実施の形態 1で述べたものと同じであるので説明を省略する。

なお、実施の形態 1と同様に、図 3に示すように、第 1の開口部と空洞部との境界の接続部の径が空洞部の最大径ょり小さく、かつ第 2 の開口部と空洞部との境界の接続部の径は第 1の開口部と空洞部との境界の接続部の径より小さければ実施の形態 2と同様の効果が得られる。 (実施の形態 3 )

図 3 0は本発明の実施の形態 3における細胞外電位測定デバイスの斜視図であり、図 3 1 A、図 3 1 B及び図 3 2はその断面図である。また図 3 3〜図 3 4は測定デバイスの拡大断面図である。図 3 5〜図 4 2は測定デバイスの製造方法を説明するための断面図である。

図 3 0〜図 3 2において、基板 2 8はシリコンからなるベース 2 9、二酸化珪素からなる中間層 3 0及びシリコンからなる薄板 3 1の積層構造で構成されている。ベース 2 9には被験体細胞を含むサンプル溶液を貯め、被験体細胞 3 7とこれの培養液 3 8と薬剤を混ぜ合わせるためのゥエル 3 2が設けられており、さらにゥエル 3 2の底部を形成する薄板 3 1には貫通口 3 3が設けられている。貫通口 3 3のゥエル 3 2側に窪み 3 4が設けられており、ゥエル 3 2側の開口部の径は基板 2 8の下面の開口部の径より大きい。

貫通口 3 3、窪み 3 4の径は被験体細胞 3 7の大きさ ·性質によつて決めることができる。例えば被験体細胞 3 7の大きさが 1 0 mであれば、窪み 3 4の径は 1 0 m以上、 2 0 m以下とし、貫通口 3 3の径は 5 ii m以下とすることが好ましい。

また、実施の形態 3においては窪み 3 4の内壁部はゥエル 3 2側を底面とする円錐形をしている。

次に、少なくともゥエル 3 2の内壁および底面、貫通ロ 3 3の内壁および窪み 3 4の内壁、薄板 3 1の下面には二酸化シリコンによる絶縁体 3 6が設けられている。貫通口 3 2の内壁、薄板 3 1の外方側には絶縁体 3 6の上に金を主体とする検出電極 3 5が設けられている。一般に細胞の径は 5〜 2 0 2 mであるので、窪み 3 4の開口部の径は 1 0〜 1 0 O mとし、貫通口 3 3の開口部の径は 1〜 1 O mの範囲とすることが好ましい。

上記のような細胞外電位測定デバイスは次のような動作によって細胞外電位あるいは細胞が発する物理化学的変化を測定することができる。この動作について図面を用いて説明する。

図 3 2は細胞外電位測定デバイスに被験体細胞 3 7と培養液 3 8を投入したゥエル 3 2の断面図である。図 3 3〜図 3 4は貫通口 3 3および窪み 3 4の要部拡大断面図である。

図 3 2に示すように、ゥエル 3 2内に培養液 3 8と被験体細胞 3 7 を入れると、しばらく被験体細胞 3 7は培養液 3 8中に浮遊している。また培養液 3 8はゥエル 3 2内だけでなく窪み 3 4、貫通口 3 3を満たした後、ゥエル 3 2の下面側にも流れ出す。この流れにより、浮遊している被験体細胞 3 7はゥエル 3 2内の培養液 3 8の圧力によって、図 3 3に示すように、窪み 3 4へ引き込まれる。引き込みの圧力が小さい場合には、貫通口 3 3側から吸引ポンプなどの手段により培養液を吸引すると、浮遊している被験体細胞 3 7はより確実に窪み 3 4側に吸引できる。

次に、窪み 3 4へ到達した被験体細胞 3 7は、貫通口 3 3側からの吸引またはゥエル 3 2側からの培養液 3 8によって圧力を受けているので、図 3 3に示すように窪み 3 4に保持される。このような状態でゥエル 3 2内の培養液 3 8に薬剤（図示せず）を投与すれば、薬剤は培養液 3 8内に浸透する。図 3 4に示すように被験体細胞 3 7が薬剤とイオンの交換による反応が発生して活性化された場合に、貫通口 3 3内で発生した電気信号は貫通口 3 3に満たされている培養液 3 8の電位を変化させる。この電位の変化は培養液 3 8に接している検出電極 3 5によって検出される。

このように、実施の形態 3の細胞外電位測定デバイスではゥエル 3 2の底面に設けられた窪み 3 4により、別のゥエルを設ける必要がなく、ゥエル 3 2内で被験体細胞 3 7と培養液 3 8および薬剤を直接混合できる。ゥエル 3 2と底面に設けられた窪み 3 4および貫通口 3 3 は一体化されているので、培養液 3 8が不用意にゥエル 3 2外に漏れ出さずに確実に貫通口 3 3側へ流れる。

さらに、窪み 3 4の内壁、貫通口 3 3の内壁、薄板 3 1の下面、ゥ 0

18 エル 3 2の底面および内壁に設けられた二酸化シリコンからなる絶縁体 3 6により、検出電極 3 5はゥエル 3 2側とは電気的に絶縁されている。さらに、窪み 3 4の内壁はゥエル 3 2側を底面とする円錐形をしているので、被験体細胞 3 7が貫通口 3 3側に滞ることなく引き込まれて安定に保持できる。例えば、 1 0 の径の被験体細胞 3 7では、窪み 3 4のゥエル側の径、つまり円錐形の底面の径を 2 0 以下とすることにより、 2つ以上の被験体細胞 3 7が同時に窪み 3 4の中に進入しない。また、貫通口 3 3の径を 5 m以下とすることにより、被験体細胞 3 7は貫通口 3 3を通り抜けない。

このように、測定の際には被験体細胞 3 7は窪み 3 4に確実に保持できる。貫通口 3 3側の培養液 3 8と、ゥエル 3 2側の培養液 3 8とは電気的に絶縁されている、被験体細胞 3 7の活動により発生する電気信号はゥエル 3 2側の培養液 3 ' 8に漏れることなく、貫通口 3 3側に設けた検出電極 3 5によって検出できる。なお、絶縁層 3 6はシリコンの表層の表面抵抗率が低い、または貫通口 3 3付近で発生する信号が微小であることで、わずかでもゥエル 3 2側に電気信号がリークすると測定できない場合にのみ必要である。

したがって、シリコン自体の表面抵抗率が十分高ければ被験体細胞 3 7が保持されるだけで十分電気的な絶縁を確保できるので、わずかな信号のリークが影響しないほどに細胞外電位が大きい場合には絶縁体 3 6は必ずしも必要ではない。

次に実施の形態 3の細胞外電位測定デバイスの製造方法について図 3 5〜図 4 2を用いて説明する。

まず、図 3 5に示すようにシリコンからなるベース 2 9と、二酸化シリコンからなる中間層 3 0と、シリコンからなる薄板 3 1で構成される基板 2 8を用意し、薄板 3 1側にレジストマスク 3 9を形成する。なお、基板 2 8は実施の形態 2でも述べたように Sひ I基板と呼ばれ、半導体デバイスを作製する際に良く用いられ、容易に入手できるので、この基板の製造方法については説明を省略する。 03 06920

19 次に、ドライエッチングによって貫通口 3 3を薄板 3 1の所定の深さに達するまで形成する。図 3 6は図 3 5の A部の要部拡大図である。このときのエッチング法はドライエツチングが最適であり、実施の形態 1と同様に、ドライエッチングの際にはエッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスを用いることが重要である。実施の形態 1と同様に、これらガスを用いるとこれらガスのそれぞれの作用によつて、図 3 6に示すようにドライエッチングによる貫通口 3 3をレジストマスク 3 9の下方のみに形成させることが可能となる。

さらにエツチングを抑制するガスとエツチングを促進するガスによにより基板を交互にエッチングする方法において、実施の形態 3ではエツチングを促進するガスによるドライエッチングの際に、外部コィルによる誘導結合法で高周波を基板 2 8に加えて基板 2 8をエツチングする。これにより基板 2 8にマイナスのバイアス電圧が発生して、プラズマ中のプラスイオンである S F ₅ +や C F ₃ +が基板 2 8に向かつて衝突するので、基板 2 8は底面に垂直な方向にドライエッチングされる。

また、ドライエッチングを抑制するためには、基板 2 8に高周波を加えなければ基板 2 8にはバイアス電圧が全く発生しないので、保護膜の材料となる C F +が偏向されず、基板 2 8の穴の壁面へ均一な保護膜を形成できる。

なお、上記の方法は実施の形態 1および 2における方法においても開口部を基板の底面に垂直にするために有効である。

次に、図 3 7に示すように、ドライエッチングによって中間層 3 0 に達するまで薄板 3 1をドライエッチングする。本工程においては、薄板 3 1をゥエル 3 2の底面に向かってドライエッチングする際に、エッチングが進むにつれてエッチングを促進するガスの割合を徐々に増やしていく、あるいはエツチングを促進するガスによるエッチング時間を徐々に増やす。つまり、ドライエッチングが促進される工程とドライエツチングが抑制される工程が繰り返される過程において、ドライエツチングが促進される工程の割合をドライエツチングが進むにつれて徐々に増やす。

これにより、図 3 7に示すように、ゥエル 3 2側が広くなるようなテ一パ形状が得られ、貫通口 3 3は薄板 3 1の下面側の開口部よりゥエル 3 2側の開口部の方が大きくなつた窪み 3 4が形成される。

このドライエッチングの工程において、二酸化シリコンによる中間層 3 0により、貫通口 3 3のドライエツチングが完了して中間層 3 0 に達したときに、ドライエッチングをすぐに止めなくても支障はない。それは実施の形態 2と同様に、エッチングガスがすぐには中間層 3 0 をエッチングすることはないからである。

特に、エッチングを促進するガスに S F ₆を用いた場合には、このェツチングガスはシリコンとニ酸化シリコンのエッチングレートの比が 1 0以上であるので、貫通口 3 3のドライエッチングが二酸化シリコンまで到達した後しばらくエッチングしても、二酸化シリコンの中間層 3 0を簡単には除去しない。したがって、高精度で窪み 3 4を容易に形成することができる。

次に、図 3 8に示すようにべ一ス 2 9側にフォトリソグラフィ一によってレジストマスク 4 0を形成した後、図 3 9に示すようにエッチングによって中間層 3 0に達するまでべ一ス 2 9をエッチングし、ゥエル 3 2を形成する。このときのエッチング方法としては前述のようなエッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスを用いたドライエッチングがゥエル 5を高密度に配置するためには有利であるが、それほど高密度に配置する必要がないのであれば T M A Hや K O Hを用いたウエットエッチングでも可能である。

次に図 4 0に示すように、ゥエル 3 2の底面に露出した二酸化シリコンの中間層 3 0を、 H Fによるウエットエツチングゃ C F ₄ガスによるドライエッチングにより除去する。

その後、図 4 1に示すように、レジストマスク 4 0を除去した後に、熱酸化法によってベース 2 9及び薄板 3 1を構成しているシリコンの基板の表面に二酸化シリコンを形成する。これによつて、ゥエル 3 2 の内壁および底面、窪み 3 4の内壁、貫通口 3 3の内壁、薄板 3 1の下面に二酸化シリコンによる絶縁層 3 6が形成される。

次に、図 4 2に示すように、薄板 3 1の下面側から金を蒸着ゃスパッ夕により検出電極 3 5を形成する。これにより、検出電極 3 5は薄板 3 1の下面だけではなく、実施の形態 1で述べたと同様に貫通口 3 3の内壁にも形成される。なお、検出電極 3 5は培養液 3 8と反応しない材料で形成されるが、材料は特に金、白金、銀、塩化銀、アルミニゥムなどがより好ましい。どの材料を用いるかはサンプル溶液の種類によって適切に選ばれる。

このように、実施の形態 3の製造方法により、薄板 3 1に形成される貫通口 3 3と、それとゥエル 3 4側で連結される円錐形の窪み 3 4 を有する細胞外電位測定デバイスが一度のエッチングで容易に且つ高精度に形成することができる。

実施の形態 3による製造方法では、 2種類のマスクで基板をゥエル側からフォトリソグラフィ一により加工する必要がない。ゥエルを設けた基板のように凸凹がある基板でも、凸凹の面にも均一にレジストをコーティングするスプレーコーティング装置ゃフォトマスクと基板が非接触で高精度なパ夕一ンが露光できるプロジェクションゃステツパなど高価な装置を必要とせずに、極めて高精度に貫通口および窪みがゥエル底面に設けられる。

(実施の形態 4 )

図 4 3は本発明の実施の形態 4における細胞外電位測定デバイスの断面図であり、図 4 4及び図 4 5はその要部拡大断面図である。

実施の形態 4における測定デバイスは実施の形態 3の測定デバイスと基本的な構成は同じであり、したがって同じ構成についての説明は省略する。

図 4 3は実施の形態 4における細胞外電位測定デバイスの断面図で 06920

22 ある。薄板 4 4に形成された窪み 4 7の形状は図 4 3に示すように半球形である。半球形の窪み 4 7により、被験体細胞 3 7はより密着して窪み 4 7に保持できるので、貫通口 4 6の培養液 3 8の電位変化がより検出しやすい。

次に、この細胞外電位測定デバイスの製造方法を説明する。

実施の形態 4における細胞外電位測定デバイスの製造方法は実施の形態 3の製造方法とほぼ同じであるが、薄板 4 4に貫通口 4 6及び窪み 4 7を形成する方法が異なる。その異なる方法について図面を用いて説明する。

図 4 4に示すように、中間層 4 3と薄板 4 4が積層された状態で薄板 4 4側にレジストマスク 5 0を形成する。その後、貫通口 4 6を形成するためにエッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスで薄板 4 4を所定の深さまでドライエッチングする。この所定の深さとは貫通口が二酸化珪素からなる中間層 4 3に達しない深さであり、窪み 4 7の寸法形状に応じて最適な深さを適宜選択することができる。

このエッチングの際、エッチングを促進するガスによって薄板 4 4 をエッチングした後、エッチングを抑制するガスによって保護膜（図示せず）を形成する。これらの工程を繰り返すドライエッチングによつて、レジストマスク 5 0の開口部に対して垂直な方向にのみ薄板 4 4をエッチングできる。そしてこの工程は、薄板 4 4がエッチングを促進するガスでドライエッチングされて終了する。これは、エツチングを抑制するガスによって形成される保護膜をエッチングの底面から除去するためである。

次に、図 4 5に示すように窪み 4 7を X e F ₂ガスのドライエツチングにより形成する。これにより、ドライエッチングはシリコンが露出している底面から進み、エッチングがゥエル 4 5側に進むに従って侵食される部分が広がる。

貫通口 4 6の側壁には前の工程でエッチングを抑制するガスによつて形成された保護膜（図示せず）が形成されているので、 X e F ₂によつて貫通口 4 6の側壁はドライエッチングされない。このように、窪み 4 7は図 4 5のように半球形をした形状に形成することができる。その後、実施の形態 3と同じように図 3 8〜図 4 2に示すの工程を経て細胞外電位測定デバイスを作製することができる。

(実施の形態 5 )

実施の形態 5では実施の形態 3、実施の形態 4による貫通口 3 3，

4 6と窪み 3 4， 4 7を形成する別の製造方法について説明する。薄板に貫通口を形成する方法が実施の形態 3及び 4による方法と異なるので、この方法について図面を用いて説明する。

図 4 6は本発明の実施の形態 5における細胞外電位測定デバイスの製造工程を示す断面図である。二酸化珪素よりなる中間層 5 1 とシリコンよりなる薄板 5 2が積層され、薄板 5 2側にレジストマスク 5 3 を形成した後、エッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスによるドライエッチングにより貫通口 5 6が形成される。貫通口 5 6が中間層 5 1に達するまで薄板 4 4はエッチングされる。

そして、貫通口 5 6が中間層 5 1に達した後もさらにエッチングを続ける。中間層 5 1は絶縁体であり、シリコンなどからなる薄板 5 2 は中間層 5 1より抵抗が低い。したがって、エッチングを過剰に続けると、中間層 5 1の面にはエッチングを促進するガスによるドライエツチングの際に、図 4 7に示すように S F ₅ +などのエッチングイオン

5 4が滞留し、プラズマ中から供給されるエッチングイオン 5 5は図 4 7に示す矢印の方向にはじかれる。

その結果、中間層 5 1の側壁近傍が集中的にドライエッチングされ、図 4 8に示すように貫通口 5 6のゥエル側が広がった窪み 5 7を形成することができる。

実験では直径 3 の貫通口 5 6が中間層 5 1に達した後も薄板 4 4をドライエッチングすることで、最大径 l O i mの窪み 5 7を形成することができた。産業上の利用可能性

本発明による細胞外電位を測定するデバイスでは、被験体細胞は空洞部内に進入可能で、進入後は確実に被験体細胞を空洞部の中に閉じこめることができる。したがって、このデバイスは、細胞の活動によつて発生する電気的信号を確実に検出できる。

Claims

請求の範囲

1 . 被験体細胞の細胞外電位を測定するデバイスであって、

第 1面に底面を有するゥエルが形成され、第 2面に向かって前記ゥエルの前記底面から形成された第 1の開口部と、前記第 1の開口部と第 1の接続部で連結された第 1の空洞部と、前記第 1の空洞部と第 2の接続部で連結された前記第 2面に達する第 2の開口部とを有する第 1のトラップ孔が形成された基板を備え、

前記第 1の接続部の径は前記第 1の空洞部の最大径より小さく、前記第 2接続部の径ょり大きく、かつ前記被験体細胞の径より小さい

2 . 前記第 1の開口部と前記第 2の開口部は一直線上に配置される、請求の範囲第 1項に記載のデバイス。

3 . 前記基板はシリコンを含む、請求の範囲第 1項に記載のデバイス。

4 . 前記基板は、エッチングレートの異なる材料で形成され、積層された第 1と第 2の層を備えた、請求の範囲第 1項に記載のデバイス。

5 . 前記第 1の層はシリコンを含み、前記第 2の層は二酸化珪素を含むガラスを含む、請求の範囲第 4項に記載のデバイス。

6 . 前記第 1と第 2の開口部のうちの 1つは前記第 1の層に形成され、前記第 1の空洞部は前記第 2の層に形成された、請求の範囲第 4項に記載のデパイス。

7 . 前記第 2の開口部の壁面と前記第 2の接続部に繋がる前記第 1の空洞部の壁面の一部とに形成され、前記第 1の接続部に達しない第 1 の導体層をさらに備えた、請求の範囲第 1項に記載のデバイス。

8 . 前記第 1の導体層は前記第 1の接続部に達しない、請求の範囲第 7項に記載のデバイス。

9 . 前記第 1の開口部は前記第 1の接続部から前記ゥエルに向かって内径が大きくなる、請求の範囲第 1項に記載のデバイス。

1 0 . 前記第 1の開口部の前記ゥエルの前記底面での開口径は前記被験体細胞の前記径の 2倍より小さい、請求の範囲第 9項に記載のデバイス。

1 1 . 前記第 1の空洞部は、前記第 1と第 2の接続部とを結ぶ方向の第 1の径より前記第 1の径と直角な方向の第 2の径が大きい形状を有し、かつ前記前記第 1の径は前記被験体細胞の前記径より小さい、請求の範囲第 1項に記載のデバイス。

1 2 . 前記第 1の接続部の前記径は 1 0〜 5 0マイクロメ一トルであり、前記第 2の接続部の前記径は 1〜 5マイクロメ一トルであり、前記第 1の空洞部の前記第 2の径は 1 0〜 1 0 0マイク口メートルであり、前記第 1の空洞部の前記第 1の径は 5 0マイクロメ一トル以下である、請求の範囲第 1 1項に記載の細胞外電位測定デバイス。

1 3 . 前記基板は、前記基板の前記第 2面に向かって前記ゥエルの前記底面から形成された第 3の開口部と、前記第 3の開口部と第 3の接続部で連結された第 2の空洞部と、前記第 2の空洞部と第 4の接続部で連結された前記基板の前記第 2面に達する第 4の開口部とを有する第 2 トラップ孔が形成され、

前記第 3の接続部の径は前記第 2の空洞部の最大径より小さく、前記第 3接続部の径ょり大きく、かつ前記被験体細胞の前記径ょり小さい、請求の範囲第 1項に記載のデバイス。

1 4 . 前記第 4の開口部の壁面と前記第 4の接続部に繋がる前記第 2 の空洞部の壁面の一部とに形成され、前記第 3の接続部に達しない第 2の導体層をさらに備えた、請求の範囲第 1 3項に記載のデバイス。

1 5 . 前記第 1 と第 2の導電層を接続する、前記基板の前記第 2面上に設けられた第 3の導体層をさらに備えた、請求の範囲第 1 4項に記載のデバイス。

1 6 . 基板の第 1面に底面を有するゥエルを形成する工程と、

前記ゥエルの前記底面上に第 1の穴を有する第 1のマスクを形成する工程と、

前記第 1マスクの前記第 1の穴を通して、エッチングを抑制する第 1のガスとエッチングを促進する第 2のガスを用いてドライエツチングによって第 1の開口部を形成する工程と、

前記基板の第 2面に第 2の穴を有する第 2のマスクを形成する工程と、

前記第 2のマスクの前記第 2の穴を通して、前記第 1のガスと前記第 2のガスを用いてドライエッチングによって前記第 1の開口部に繋がる第 2の開口部を形成する工程と、

前記第 2のガスを用いたエッチングによって前記第 1の開口部と前記第 2の開口部の連結部に空洞部を形成する工程と、

を備えた、被験体細胞の細胞外電位を測定するデバイスの製造方法。

1 7 . 前記第 1の開口部を形成する工程の後に、前記第 2のマスクを形成する工程が行われる、請求の範囲第 1 6項に記載の製造方法。

1 8 . 前記空洞部を形成する工程は、前記形成された第 2の開口部から前記第 2のガスを用いたエッチングによって前記空洞部を形成する工程を含む、請求の範囲第 1 7項に記載の製造方法。

1 9. 前記第 2のガスは S F ₆, C F ₄, X e F ₂のうちいずれか一つまたは混合であり、前記第 1のガスは CHF ₃, C₄F₈のうちいずれか一つまたは混合である、請求の範囲第 1 6項に記載の製造方法。

2 0. 前記第 1の開口部を形成する工程は、前記第 1 と第 2のガスの割合を、エッチングが前記ゥエルから前記空洞部に進むに従って前記第 2のガスの割合を減らしていく工程を含む、請求の範囲第 1 6項に記載の製造方法。

2 1. 前記第 1の開口部を形成する工程は、前記第 1のガスと前記第 2のガスとを交互に用いたドライエッチングにより前記第 1の開口部を形成する工程を含む、請求の範囲第 1 6項に記載の製造方法。

2 2. 前記第 1の開口部を形成する工程は、前記第 1のガスによるドライエッチングで終了する、請求の範囲第 1 6項に記載の製造方法。

2 3. 前記第 1の開口部を形成する工程は、前記第 1のガスによるドライエッチングでの生成物を前記第 1の開口部の壁面に形成する工程を含む、請求の範囲第 1 6項に記載の製造方法。

24. 前記第 2の開口部を形成する工程の後に、前記第 1のマスクを形成する工程が行われる、請求の範囲第 1 6項に記載の製造方法。

2 5. 前記空洞部を形成する工程は、前記形成された第 1の開口部から前記第 2のガスを用いたエッチングによって前記空洞部を形成する工程を含む、請求の範囲第 24項に記載の製造方法。

2 6 . 前記空洞部の一部と前記第 2の開口部とに導体層を形成するェ程をさらに備えた、請求の範囲第 1 6項に記載の製造方法。

2 7 . 前記導体層を形成する工程は、前記第 1の開口部から導体粒子を入れて蒸着法またはスパッ夕法によって前記導体層を形成する工程を含む、請求の範囲第 2 6項に記載の製造方法。

2 8 . ベースと、前記ベース上に積層された前記ベースとは異なる材料による中間層と、前記中間層上に積層された、前記ベースと同じ材料による薄板を有する基板を備え、

前記ベースから前記中間層は、前記ベースから前記中間層に至つて設けられた、底面を有するゥエルを有し、

前記薄板は前記ゥエルと前記基板の外方に通じる貫通口を有する、被験体細胞の細胞外電位を測定するデバイス。

2 9 . 前記貫通口は前記ゥエル側に窪みを有し、前記窪みの開口部の径は前記貫通口の開口部の径より大きい、請求の範囲第 2 8項に記載のデバイス。

3 0 . 前記窪みの前記開口部の前記径が 1 0〜 1 0 0 であり、前記貫通口の前記開口部の前記径が 1〜 1 0 mである、請求の範囲第 2 9項に記載のデバイス。

3 1 . 前記窪みの内壁は円錐形である、請求の範囲第 2 9項に記載の

3 2 . 前記窪みの内壁を半球形である、請求の範囲第 2 9項に記載の

3 3 . 前記中間層の電気抵抗率は前記薄板の電気抵抗率よりも高い、請求の範囲第 2 8項に記載のデバイス。

3 4 . 前記中間層と前記薄板はエッチングレートが異なる材料で構成された、請求の範囲第 2 8項に記載のデバイス。

3 5 . 前記べ一スはシリコンからなり、前記中間層が二酸化シリコンからなる、請求の範囲第 2 8項に記載のデバイス。

3 6 . ベースと、前記べ一スに積層された、前記ベースとは異なる材料による中間層と、前記中間層に積層された、前記ベースと同じ材料による薄板とを備えた基板を準備する工程と、

前記ベースにエッチングによって前記中間層の一部を露出するようにゥエルを設ける工程と、

前記マスクを用いたドライエッチングによつて前記中間層までの貫通口を設ける工程と、

前記中間層の前記露出する一部を除去する工程と、

前記中間層と反対側から前記貫通口の壁面に検出電極を形成する工程と、

を含む、細胞外電位を測定するデバイスの製造方法。

3 7 . 前記貫通口を設ける工程は、前記中間層と反対側よりドライエツチングによって前記貫通口を形成する工程を含む、請求の範囲第 3 6項に記載の製造方法。

3 8 . 前記中間層は二酸化珪素からなる、請求の範囲第 3 6項に記載の製造方法。

3 9 . 前記貫通口を設ける工程は、エッチングを抑制する第 1のガスとエッチングを促進する第 2のガスを用いたドライエッチングによつて前記貫通口を設ける工程を含む、請求の範囲第 3 6項に記載の製造方法。

4 0 . 前記貫通口を設ける工程は、エッチングが進むに従って前記第 1のガスを用いたドライエッチングを前記第 2のガスによるドライエツチングより長く行う工程を含む、請求の範囲第 3 9項に記載の製造方法。

4 1 . 前記貫通口を設ける工程は、前記第 1のガスと前記第 2のガスを交互に用いたドライエッチングによって前記貫通口を設ける工程を含む、請求の範囲第 3 9項に記載の製造方法。

4 2 . 前記貫通口を設ける工程は、前記第 1のガスと前記第 2のガスを交互に用いたドライエッチングによって前記貫通口を設ける工程を前記貫通口が前記中間層に達する前に止め、次に前記第 1のガスを用いたドライエッチングで前記貫通口を設ける工程を含む、請求の範囲第 4 1項に記載の製造方法。

4 3 . 前記貫通口を設ける工程は、前記第 1のガスを用いたドライエツチングの際に前記基板に高周波を印加する工程を含む、請求の範囲第 3 9項に記載の細胞外電位測定デバイスの製造方法。

4 4 . 前記貫通口が前記中間層に達した後に、さらに前記薄板をドラィエッチングする工程をさらに備えた、請求の範囲第 3 9項に記載の製造方法。

4 5 . 前記第 1のガスは S F ₆ , C F ₄ , X e F。のうち少なくとも一つを含む、請求の範囲第 3 9項に記載の製造方法。

46. 前記第 2のガスは C₄F₈， CHF₃のうち少なくとも 1つを含む、請求の範囲第 3 9項に記載の製造方法。