JP4747852B2 - 細胞電気生理センサとその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞の電気生理的活動の測定に用いられる細胞電気生理センサとその製造方法に関するものである。

従来、電気生理学におけるパッチクランプ法は、細胞膜に存在するイオンチャンネルを測定する方法として知られており、このパッチクランプ法によってイオンチャンネルの様々な機能が解明されてきた。そして、イオンチャンネルの働きは細胞学において重要な関心ごとであり、これは薬剤の開発にも応用されている。

しかし、一方でパッチクランプ法は測定技術に微細なマイクロピペットを１個の細胞に高い精度で挿入するという極めて高い能力を必要としているため、熟練作業者が必要であり、高いスループットで測定を必要とする場合には適切な方法でない。

このため、微細加工技術を利用した基板型プローブの開発がなされており、これらは個々の細胞についてマイクロピペットの挿入を必要としない自動化システムに適している。例えば、基板の上に設けられた細胞保持手段を備えたウエルと、このウエルの電気信号を検出する測定用電極と、基準電極とを備えた細胞外電位測定用デバイスによって細胞外電位を測定する技術が知られている（例えば、特許文献１参照）。図８はこの従来の細胞電気生理センサのウエル構造を模式断面図で示したものであり、ウエル２０の内部に培養液２７が入れられ、被験体細胞２６は基板２３に設けられた細胞保持手段によって捕捉または保持されている。細胞保持手段は基板２３に形成された窪み２２および開口部を介してこの窪み２２に連絡する貫通孔２４を備えた構成となっている。

さらに、貫通孔２４の内部にはセンサ手段である測定電極２５が配置されており、この電極２５は配線を経て信号検出部に連結されている。

そして、測定の際には被験体細胞２６を貫通孔２４から吸引ポンプなどの手段により、この被験体細胞２６が窪み２２に密着保持される。このようにして被験体細胞２６の活動により発生する電気信号はウエル２０の内部の培養液２７に漏れることなく、貫通孔２４に設けた測定電極２５と参照電極２８によって電位の変化あるいは電流の変化を検出する。

このように、基板２３に形成された貫通孔２４はガラスピペットにおける先端穴と同様の役割を果たし、高精度な細胞の電気生理現象を記録できるとともに、基板２３の裏面側からの吸引によって被験体細胞２６が自動的に引きつけられ、被験体細胞２６を容易に保持できるという利点を有している。このとき、被験体細胞２６が高い密着性を持って保持されることは、低いバックグランドノイズでイオンチャンネル活動によって生じる細胞外電位、或いは細胞内電位を測定するためには重要な要素である。
国際公開第０２／０５５６５３号パンフレット

しかしながら前記従来の構成においては、細胞を固定するための吸引圧力を安定化させる貫通孔の形状について明示されていなかった。細胞の微小な電位変化を測定するには、細胞が安定して保持されることが非常に重要となる。

本発明は、安定化した流速分布と圧力を供給しながら細胞を安定して保持することができる細胞電気生理センサおよびその製造方法を実現することを目的とする。

前記従来の課題を解決するために、本発明は、第一の開口部と第二の開口部を有する貫通孔を設けたダイアフラムからなる細胞電気生理センサであって、ダイアフラムを少なくとも導電体層と絶縁体層の二層からなる積層体とし、前記貫通孔の中間部に貫通孔の開口径よりも大きな開口径を有する空洞部を設けるとともに、前記第一および第二の開口部の大きさを細胞の大きさよりも十分に小さくした構成とするものである。

本発明の細胞電気生理センサおよびその製造方法は、流体が空洞部に分散するため、流速分布が第一の開口部よりも均一となり安定化することから空洞部において圧力も安定化し、細胞保持が行われる第二の開口部に安定した流速分布かつ圧力を供給することができる。これによって、細胞を安定して確実に保持することができる細胞電気生理センサおよびその製造方法を実現することができる。

（実施の形態１）
以下、本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサについて、図面を参照しながら説明する。

図１は本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの構成を示す上面図であり、図２は図１のＡ−Ａ部における断面図である。また、図３は細胞の保持状態を説明するための断面図である。

図１〜図３において、１は積層基板からなるダイアフラムであり、このダイアフラム１はシリコン１ａと二酸化珪素層１ｂの積層構造としている。そして、このダイアフラム１の厚み方向に貫通孔２を形成している。そして、ダイアフラム１は第一面６と、第一面６に対向した第二面７を有し、貫通孔２は第一面６から第二面７にかけて貫通している。さらに、この貫通孔２はシリコン層１ａに形成した第一の開口部３と空洞部４を形成しており、二酸化珪素層１ｂの層には第二の開口部５を形成している。このような積層構成とすることによって簡単に貫通孔２を形成することができる。従って、ダイアフラム１には少なくとも一つの貫通孔２を有するとともに、第一面６から第二面７にかけて第一の開口部３、空洞部４、第二の開口部５の順に構成している。この空洞部４の最大開口径は第一の開口部３および第二の開口部５の最大開口径よりも大きくしており、少なくとも第二の開口部５の大きさは細胞の大きさよりも十分小さい形状としている。さらに、空洞部４は第一の開口部３から徐々に大きくなり、シリコン層１ａと二酸化珪素層１ｂの境界に到達するまで大きくなった後、第二の開口部５に連結した構造としている。本実施の形態１ではテーパ状の空洞部４の形状としているが、図２に示したような球状の曲面で構成しても構わない。

ここで、第二の開口部５の開口径は、測定する細胞８の大きさ、形状、性質によって決定されるが、細胞８が５〜５０μｍ程度の大きさの場合、細胞８が第二の開口部５を通り抜けずに確実に保持される開口径として３μｍ以下が望ましい。

また第二の開口部５の深さは細胞８の保持を行う時に第二の開口部５のエッジ部が破壊しない厚さとして０．５〜５μｍが望ましい。

次に、本発明の細胞電気生理センサの動作について図３を用いて説明する。

図３は第二面７から第二の開口部５において細胞８の保持を行った時の断面図である。まず第二面７に細胞８を培養液９ｂと共に満たした後、第一面６側の領域を減圧するか、第二面７側の領域を加圧すると、細胞８と第二面７側の培養液９ｂは貫通孔２に引き込まれ、細胞８は第二の開口部５を塞ぐように保持される。

一方、第一面６側の領域は第二面７側とは異なる、あるいは同じ培養液９ａによって満たしておく。

その後、細胞８への刺激となりうる行為を第二面７側から施す。この刺激の種類としては、例えば化学薬品、毒物、などの化学的な刺激に加え、機械的変位、光、熱、電気、電磁波などの物理的な刺激などがある。そして、この細胞８がこれらの刺激に対して活発に反応する場合、例えば細胞８は細胞膜が保持するチャネルを通じて各種イオンを放出あるいは吸収する。この結果として細胞外の電位が変化し、その変化を電圧あるいは電流の変化として検出することができる。

ここで、図３に示したように第一面６側の領域を矢印の方向に減圧した場合には、第一の開口部３付近の内部での流速は壁面が遅くなり、中心が速くなるという不均一な流速分布の状態となっている（図３のように流速をベクトルで図示し、ベクトルの長さは長いほいど流速が速く、短いほど流速が遅いことを表現している）。

その後、空洞部４の付近では、流体は空洞部４に分散するため、流速分布が第一の開口部３よりも均一となり安定化する。そして圧力も空洞部４において安定化し、細胞８の保持を行う第二の開口部５に安定化した流速分布と圧力を供給することができる。これにより、細胞８を安定して確実に保持することができる細胞電気生理センサを実現することができる。

なお、細胞８の保持は第二面７側の領域を加圧することでも行うことができる。

また、第一面６に対して平行方向に流体を流すことによっても第一の開口部３を減圧させることができるが、この場合は第一の開口部３付近の内部での流速分布はより大きく乱れた状態になっている。このような状態に対しても、空洞部４を設けることによって流速分布を安定化させ、細胞８の保持を行う第二の開口部５に安定した流速分布と圧力を供給することができ、同様の効果を得ることができる。

また、図１に示したように第二の開口部５の孔形状を円形状とすることによって、エッジ部を有しないことから流体の流れのロスをより少なくすることができる。さらにまた、円の中心に対して同心円状の均一な流速分布となることから、細胞８の保持を行う第二の開口部５に安定化した流速分布と圧力を供給することができ、同様の効果を得ることができる。

また、細胞８を保持する面を絶縁体層である二酸化珪素層１ｂとすることによって第二面７の表面を親水性にすることが容易となり、且つ親水性を長時間維持することができることから好ましい。しかしながら、細胞８の種類によっては疎水性を有するものであり、このような性質を有する細胞８に対しては第一の開口部３を有した第一面６側に保持しても良い。これらは細胞８の性質によって適宜選択して用いることができる。

以上のように構成した細胞電気生理センサについて、以下にその製造方法を図面を用いて説明する。

図４〜図７は本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの製造法を説明するための断面図である。

まず始めに、図４に示すように、シリコン１ａと二酸化珪素１ｂとが積層されたダイアフラム１となる積層基板を準備する。このような積層基板はＳＯＩ基板として一般的に市販されているものであり、ここでの詳細な説明は省略する。

このとき、二酸化珪素１ｂの厚みは５μｍであり、シリコン１ａの厚みは１５μｍのＳＯＩ基板を用いた。二酸化珪素１ｂの厚みとしては０．５〜１０μｍ、二酸化珪素１ｂの厚みは１００μｍ以下のＳＯＩ基板が好ましい。

次に、前記ＳＯＩ基板に第一の開口部３を形成するためのレジストマスク１３を形成する。このとき、レジストマスク１３のエッチングホールの形状は必要とする第一の開口部３または第二の開口部５の形状とほぼ同じになるように設計しておく。即ち、本発明の細胞電気生理センサにおいては、例えば第二の開口部５の最小開口径が３μｍの場合、エッチングホールの開口径も３μｍとする。

その後、図５に示すように第一面６側からドライエッチングを行い第一の開口部３を形成する。このときエッチングの方法としては、ドライエッチングが望ましく、なおかつエッチングガスとしてエッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスを用いることが好ましい。例えば、ＣＦ₄、ＳＦ₆またはＸｅＦ₂のようなエッチングを促進するガスと、ＣＨＦ₃またはＣ₄Ｆ₈のようなエッチングを抑制するガスを混合して使用する。その後、第一面６側から第一の開口部３のエッチングを所定の深さになるまで行う。このエッチングを促進するガスにはＳＦ₆、ＣＦ₄などを用いるが、これらはシリコンのエッチングを深さ方向だけではなく、横方向へも促進する作用がある。そこで、ＣＨＦ₃，Ｃ₄Ｆ₈等のエッチングを抑制するガスを混合させておくことで、エッチングの壁面にＣＦ₂のポリマーである保持膜を作製することから、エッチングをレジストマスク１３の下方のみに直進して進行させることが可能となる。

また、別の方法として、エッチング形状をさらに垂直なものにしたい場合には、エッチングを促進するガスによってエッチングを少しだけ行った後、エッチングを抑制するガスによって保護膜を少しだけ形成する工程を繰り返すことで、ほぼ垂直なエッチング形状とすることができる。実験では、大きさ２０μｍの第一の開口部３を形成するのに、ＳＦ₆を１３０ｓｃｃｍ流して１３秒間プラズマ発生させることで約１μｍのエッチングを行い、その後Ｃ₄Ｆ₈を８５ｓｃｃｍ流して７秒間プラズマ発生させて約０．０１μｍの保護膜を形成し、またエッチングを行うということを約１５回繰り返した結果、１５μｍの深さのほぼ垂直なエッチング形状とすることができた。

なお、エッチングを抑制するガスによって保護膜は第一の開口部３の壁面だけでなく、底面にも形成されるが、底面に形成された保護膜は壁面に形成された保護膜に比べてエッチングを促進するガスによって容易に除去されるので、エッチングは下方のみに進めることができる。

さらに、このときのエッチング工程においては、エッチングを終了する直前はエッチングを抑制するガスによって保護膜を形成することで終了しておけば、第一の開口部３の壁面には確実に保護膜が形成されるので、後のエッチング工程において、第一の開口部３の壁面が侵されることがない。

以上説明してきたように、エッチングを促進するガスとしてＣＦ₄や、ＳＦ₆、ＸｅＦ₂のうちいずれか一つまたは混合ガス、エッチングを抑制するガスとしてＣＨＦ₃やＣ₄Ｆ₈のうちいずれか一つまたは混合ガスを使用することで、効率の良いエッチングと確実な保護膜形成を行うことができ、第一の開口部３を効率良く形成することが容易にできるようになる。

その後、エッチングの深さ方向への進行は二酸化珪素層１ｂの表出面でストップする。さらに続けてエッチングを行うと、表出した二酸化珪素層１ｂの表面にエッチングイオンが蓄積されていくことになり、さらに続けて過剰にエッチングを行うと、エッチングイオンと二酸化珪素１ｂの表面に蓄積したエッチングイオンとが反発し、エッチングイオンが横方向へと進行し始める。そのため第一の開口部３側から二酸化珪素層１ｂの表面に向かって徐々にテーパ状に大きくなった空洞部４を形成することができる。

このように、エッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスの２種類を用いたエッチングを、二酸化珪素層１ｂの表面に到達した後も過剰に行うことによって、第一の開口部３からテーパ状に広がった形状の空洞部１３を確実に形成することができる。これはダイアフラム１の積層構造を二種類の導電体であるシリコン層１ａと絶縁体である二酸化珪素層１ｂとした構造とすることによって、エッチングイオンは二酸化珪素層１ｂの絶縁層の表面に蓄積されやすくなり、また蓄積したエッチングイオンと進入してきたエッチングイオンが反発しやすくなり、その結果としてエッチングが横方向へと進行しやすい状態となり、そのため空洞部４を効率よく形成することができるものである。

次に、図６に示すように第一面６側から二酸化珪素層１ｂをドライエッチングすることによって第二の開口部５を形成する。このときのドライエッチングに用いるエッチングガスとしては、例えばＣＦ₄とＡｒの混合ガスを用いてエッチングを行う。このＣＦ₄とＡｒの混合ガスはプラズマ励起されたＡｒガスが直進性の高いエッチングガスとなり、Ａｒイオンのようなスパッタを行うエッチング成分を多く使用することによって第一の開口部３より直進して進入して絶縁体である二酸化珪素層１ｂのみをエッチングすることができることから、第一の開口部３の最小開口径の大きさと同等の孔形状を有する第二の開口部５を形成することができる。

このとき、導電体であるシリコン層１ａは若干エッチングされるが、保護膜が形成されていることから開口形状はほぼそのままとすることができる。

以上説明してきたように、ダイアフラム１の積層体の二種類の材料が同一のガスに対してそれぞれ異なったエッチングレートを持つことによって、導電体であるシリコン層１ａをエッチングする際には絶縁体である二酸化珪素層１ｂがエッチングされず、絶縁体である二酸化珪素層１ｂをエッチングする際には導電体であるシリコン層１ａがエッチングされないという性質を利用してエッチングすることによって、図６に示したような所望の形状を容易に形成することができる。

なお、二酸化珪素層１ｂが二酸化珪素もしくは二酸化珪素を含むガラス材料であることによって、製造上効率よくそれぞれの材料をエッチングすることができ、また第一の開口部３から広がった空洞部４の形状を形成することができる。

最後に、図７に示すようにレジストマスク１３を除去して完成となる。

なお、本実施の形態１では第一の開口部３、空洞部４、第二の開口部５の順番でエッチングを行ったが、この順番は、第二の開口部５、第一の開口部３、空洞部４の順番でも可能である。

本発明の細胞電気生理センサおよびその製造方法は、細胞を固定する際、貫通孔の内部の形状を変えることによって流速分布と圧力を均一化することによって安定した細胞測定を実現できることから、細胞の電気生理反応を測定するシステムに有用である。

本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの上面図 同断面図 同動作を説明するための断面図 同製造方法を示すための断面図 同断面図 同断面図 同断面図 従来の細胞電気生理センサの断面図

符号の説明

１ ダイアフラム
１ａ シリコン層
１ｂ 二酸化珪素層
２ 貫通孔
３ 第一の開口部
４ 空洞部
５ 第二の開口部
６ 第一面
７ 第二面
８ 細胞
９ａ，９ｂ 培養液
１３ レジストマスク

Claims (12)

1. 第一の開口部と第二の開口部を有する貫通孔を設けたダイアフラムからなる細胞電気生理センサであって、ダイアフラムを少なくとも導電体層と絶縁体層の二層からなる積層体とし、前記貫通孔の中間部に貫通孔の開口径よりも大きな開口径を有する空洞部を設けるとともに、前記第一の開口部および第二の開口部の開口径を細胞の大きさの０．６倍以下とした細胞電気生理センサ。
2. 細胞を保持する層を絶縁体層とし、空洞部を形成する層を導電体層とした請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
3. 導電体層をシリコンとし、絶縁体層を二酸化珪素もしくは二酸化珪素を含むガラスとした請求項２に記載の細胞電気生理センサ。
4. 二層からなる積層体を同一のガスに対してそれぞれ異なるエッチングレートを有する材料とした請求項２に記載の細胞電気生理センサ。
5. 空洞部を導電体層に設けた第一の開口部から絶縁体層の境界面に到達するまでテーパ状に大きくした請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
6. 第一の開口部および第二の開口部の開口径を３μｍ以下とした請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
7. 第二の開口部からの貫通孔の深さを０．５〜５．０μｍとした請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
8. 第二の開口部の孔形状を円形状とした請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
9. 第一の開口部と第二の開口部を有する貫通孔を設けたダイアフラムからなる細胞電気生理センサであって、ダイアフラムを少なくとも導電体層と絶縁体層の二層からなる積層体とし、前記貫通孔の中間部に貫通孔の開口径よりも大きな開口径を有する空洞部を設けるとともに、前記第一および第二の開口部の大きさを細胞の大きさよりも十分に小さくした細胞電気生理センサの製造方法であって、
   前記ダイアフラムの導電体層の一面にレジストマスクを形成する工程と、
   前記レジストマスクの上から導電体層のエッチングを抑制するガスとエッチングを促進するガスの二種類を用いてドライエッチングによって導電体層に第一の開口部と空洞部を形成する工程と、
   その後、前記絶縁体層のエッチングを促進するガスのみを用いて前記レジストマスクの上からドライエッチングによって前記第二の開口部を形成する工程からなる細胞電気生理センサの製造方法。
10. 導電層のエッチングを促進するガスはＳＦ₆、ＣＦ₄、ＸｅＦ₂のうちいずれか一つまたは混合ガスであり、エッチングを抑制するガスはＣＨＦ₃、Ｃ₄Ｆ₈のうちいずれか一つまたは混合ガスとした請求項９に記載の細胞電気生理センサの製造方法。
11. エッチングを抑制するガスとエッチングを促進するガスの二種類を用いたドライエッチングを絶縁体層の表面に到達した後も過剰に行うことによって空洞部を形成する請求項９に記載の細胞電気生理センサの製造方法。
12. 絶縁層のエッチングを促進するガスはＡｒとＣＦ₄の混合ガスとした請求項９に記載の細胞電気生理センサの製造方法。

Images