KR20020086625A - 세포외 전위 측정용 디바이스, 그것을 사용한 세포외 전위측정 방법 및 그것을 구비한 고속 약품 스크리닝 장치 - Google Patents

세포외 전위 측정용 디바이스, 그것을 사용한 세포외 전위측정 방법 및 그것을 구비한 고속 약품 스크리닝 장치 Download PDF

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KR20020086625A KR1020027011809A KR20027011809A KR20020086625A KR 20020086625 A KR20020086625 A KR 20020086625A KR 1020027011809 A KR1020027011809 A KR 1020027011809A KR 20027011809 A KR20027011809 A KR 20027011809A KR 20020086625 A KR20020086625 A KR 20020086625A
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오자키노부히코
에모토후미아키
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마쯔시다덴기산교 가부시키가이샤
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Abstract

생체 시료가 발생하는 미세한 전기적 신호의 변화를 용이하고 또한 높은 신뢰성으로 검출할 수 있는 세포외 전위 측정용 디바이스, 그것을 사용한 세포외 전위 측정 방법, 및 그것을 구비한 장치를 제공한다. 이 세포외 전위 측정용 디바이스는 높은 정밀도로 또한 고출력으로 세포외 전위를 측정하여, 기판 상에 설치된, 세포 보유 수단을 구비한 적어도 하나의 웰과, 이 적어도 1개의 웰의 각각의 전기 신호를 검출하는 측정용 전극과, 기준 전극을 구비한다. 상기 세포 보유 수단은 상기 웰 내에 설치된 적어도 1개의 오목부이고, 그 저면에 세포 흡인 수단에 연결되는 관통 구멍을 갖는다.

Description

세포외 전위 측정용 디바이스, 그것을 사용한 세포외 전위 측정 방법 및 그것을 구비한 고속 약품 스크리닝 장치{Device for measuring extracellular potential, method of measuring extracellular potential by using the same and apparatus for quickly screening drug provided therewith}
세포의 전기적 활동을 지표로 하여 약품을 스크리닝하는 것이 행해지고 있다. 종래, 세포의 전기적 활동은 패치 클램프법(patch clamp method), 형광 색소 또는 발광 지시약을 사용하는 방법 등에 의해 측정되어 있다.
패치 클램프법은 마이크로 피펫의 선단 부분에 붙은 세포막의 미소 부분(패치)을 사용하여, 단일한 채널 단백질 분자를 개재하는 이온의 수송을 미소 전극 프로브에 의해서 전기적으로 기록하는 방법이다. 패치 클램프법은 세포 생물학의 기술 중에서, 1개의 단백질 분자의 기능을 실시간으로 조사할 수 있는 적은 수의 방법의 하나이다(세포의 분자 생물학, 제 3 판, Garland Publishing, Inc., NewYork, 1994, 일본어판, 나카무라 케이코 등 감역, 181 내지 182페이지, 1995년, 교육사). 또한, 특정한 이온의 농도 변화에 따라서 빛을 발생하는 발광 지시약 또는 형광 색소와, 최신의 화상 처리법을 조합하여(예를 들면, 세포의 형광 화상을 CCD 카메라 등으로 촬영하여, 세포 내의 이온의 이동을 모니터한다), 세포의 전기적 활동을 측정하는 방법도 있다.
패치 클램프 등의 미소 전극 프로브를 사용하는 방법(세포 내 기록법)은 미소 전극 프로브와 전용의 제어 장치를 조합한 전기 생리 측정 장치에 의해서 측정되는 세포의 이온 채널을 통과하는 전기량으로부터, 세포의 이온 채널의 개폐 시간, 타이밍, 그 회수 등의, 이온 채널의 활성도를 측정하여, 단일의 이온 채널 레벨에서의 해석을 가능하게 한다.
또한, 형광 색소를 사용하는 방법에서는 세포 전체의 이온 채널 활성은 대표적으로는 세포 내에 유입되는 이온의 전체량을 형광 측정법에 의해서 측정한다.
패치 클램프법은 마이크로 피펫(micro pipette)의 제작 및 그 조작 등에 특수한 기술을 필요로 하고, 1개의 시료의 측정에 많은 시간을 요하기 때문에, 대량의 약품 후보 화합물을 고속으로 스크리닝하는 데에는 적합하지 않다. 또한, 형광 색소 등을 이용하는 방법은 대량의 약품 후보 화합물을 고속으로 스크리닝할 수 있지만, 세포를 염색하는 공정이 필요하고, 측정에 있어서, 색소의 영향에 의한 백그라운드가 높은 데다가, 시간과 동시에 탈색하기 때문에 S/N 비가 나쁘다는 결점이 있었다.
그 외에, 생체 시료의 전기 화학적 변화를 관찰하는 방법으로서, 특허 제2949845호, 미국 특허 제5810725호, 미국 특허 제5563067호, 특개평9-827318호, WO01/25769 A2, 미국 특허 제5187069호, WO98/54294, WO99/66329, WO99/31503 등에 기재되는 멀티 전극을 배치한 기판을 사용하는 방법이 있다.
특허 제2949845호, 미국 특허 제5810725호, 미국 특허 제5563067호, 및 특개평9-827318호는 유리 기판 상에 포토리소그래피 기술을 사용하여 미소 전극을 구성하고, 세포의 전기적 변화를 다점(多占)으로 세포외 측정할 수 있는 것을 특징으로 하는 일체화 복합 전극과 그것을 사용한 계측 시스템을 기재한다.
WO01/25769 A2는 절연 기판 상에 관통 구멍을 구비하고, 이 관통 구멍에 이온 채널을 포함하는 세포 등의 측정 대상을 배치함으로써 세포 등과 절연 기판 표면 상에 기가 시일드(giga-shield)를 구성하여, 이 기가 시일드에 의해 막힌 2개의 영역에 설치된 기준 전극과 측정 전극을 사용하여, 이온 채널을 이온이 통과할 때에 발생하는 전류를 측정할 수 있는 기판을 기재한다.
미국 특허 제5187069호는 전극 상에서 세포를 배양하여, 임피던스 변화를 측정함으로써, 세포의 증식을 모니터할 수 있는 디바이스를 기재한다.
WO98/54294는 평판 전극 상에 세포를 접착시켜, 그 전기적 신호를 측정하는 디바이스를 기재한다.
WO99/66329는 다공성의 재료 상에 있는 세포의 활동 상태를, 저항 또는 임피던스 변화에 의해 관찰하는 디바이스, 및 그것을 사용한 분석법(assay method)을 기재한다.
WO99/31503은 관통 구멍을 구비한 기판을 사용하여, 이 관통 구멍에 세포를 트랩함으로써 패치 클램프를 형성하여, 전류 변화를 측정하는 방법을 기재한다.
상기 종래 기술은 평판 전극을 사용하여 세포의 전기적 활동을 하는 것, 및 절연 기판 상에 미소한 관통 구멍을 개방하여 세포와 기판으로 패치 클램프를 형성하고, 이온 채널을 통과하는 이온에 의해 발생하는 전류를 모니터하는 것을 특징으로 하고 있다. 그러나, 평판 전극의 경우, 세포막의 전위 변화를 검출하는 것은 가능하지만, 액 중으로의 신호 누설이 있기 때문에 감도 좋게 측정할 수 없다. 또한 절연 기판 상에 미소한 관통 구멍을 형성하여, 세포와 패치 클램프를 형성하는 방법은 패치 클램프 형성의 확립이 낮고, 더구나 세포막을 파괴하여 물리적 손상을 주기 때문에, 상처가 없는 세포의 활동 상태를 측정할 수 없다. 더욱이, 패치 클램프계의 형성 시는 흡인을 행하는 압력 조절이 곤란하고, 더구나 다채널에서 실행하기 위해서는 조절 기구를 구비할 필요가 있어, 이것은 실용적이지 않다. 이러한 관점에서, 평판 전극은 고속 약품 스크리닝에 적합하지만 감도가 나쁘다. 게다가 미소한 관통 구멍을 구비한 절연 기판은 고속 약품 스크리닝에는 적합하지 않다. 같은 관점에서, 패치 클램프 자동화 로봇은 샘플 처리에 시간을 요하고, 역시, 고속 약품 스크리닝에는 적합하지 않다.
이와 같이, 고속 약품 스크리닝에는 많은 과제가 남겨져 있다.
세포외 전위 측정에 있어서, 패치 클램프법으로 얻어지는 데이터와 동등한 질의 데이터가 얻어지고, 더구나 형광 색소법 처럼 간이하게 더욱이 고속, 자동으로 행할 수 있는 장치가 요망되고 있다. 특수한 색소를 사용하지 않고서, 세포의 활동을 직접 고속으로 모니터할 수 있는 디바이스 및 장치가 요망되고 있다.
본 발명은 약품 스크리닝에서 사용되는 생체 시료, 특히 세포의 전기 생리학적 평가를 간이하고 고속으로 행하는 세포외 전위 측정 디바이스에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 생체 시료, 특히 세포가 발생하는 물리 화학적 변화, 특히 전기 화학적 변화를 측정하는 방법, 이 방법에 사용하는 반응계, 및 이 반응계를 구비한 장치에 관한 것이다. 보다 상세하게는 세포 전체의 매크로(macro)인 이온 채널 활성도에 관련된, 세포가 발생하는 전기 화학적 변화를 평가하는(특히, 전압 변화를 지표에 노이즈 비교한다) 방법, 및 이 방법을 사용한 고속 약품 스크리닝 장치에 관한 것이다.
도 1a 및 도 1b는 본 발명의 세포외 전위 측정용 디바이스의 웰의 구조를, 종래의 미소 전극을 사용한 디바이스의 웰과 비교하여 도시하는 도면이다. 도 1a는 본 발명의 세포외 전위 측정용 디바이스의 웰의 구조이고, 도 1b는 종래의 미소 평판 전극을 사용한 디바이스의 웰을 도시하는 도면.
도 2a 내지 도 2g는 본 발명의 세포외 전위 측정용 디바이스의 기판의 제조 방법의 일 예를 도시하는 도면.
도 3은 본 발명의 세포외 전위 측정용 디바이스의 기판에 배치된 오목부 및 관통 구멍의 전자 현미경 사진.
도 4는 본 발명의 세포외 전위 측정용 디바이스의 개략을 도시하는 도면.
도 5a 및 도 5b는 본 발명의 세포외 전위 측정용 디바이스의 개변예를 도시하는 도면.
도 6은 본 발명의 고속 약품 스크리닝 장치의 개략도.
도 7은 본 발명의 고속 약품 스크리닝 장치의 검출부의 개략도.
도 8a 및 도 8b는 본 발명의 세포외 전위 측정용 디바이스를 사용하여 행한 시험 결과를 도시하는 도면
도 9는 본 발명의 세포외 전위 측정용 디바이스를 사용하여 행한 시험 결과를 도시하는 도면.
도 10은 본 발명의 세포외 전위 측정용 디바이스의 개변예의 개략을 도시하는 도면.
도 11은 본 발명의 세포외 전위 측정용 디바이스의 개변예의 개략을 도시하는 도면.
도 12는 본 발명의 세포외 전위 측정용 디바이스의 개변예의 개략을 도시하는 도면.
도 13은 본 발명의 장치의 구성의 개략을 도시하는 도면.
도 14는 본 발명의 장치의 구성의 개략을 도시하는 도면.
도 15는 본 발명의 장치의 구성의 개략을 도시하는 도면.
도 16은 본 발명의 장치의 구성의 개략을 도시하는 도면.
도 17은 본 발명의 장치를 사용하여 측정한, 림나에아 스타그날리스(Lymnaea Stagnalis)의 신경 세포의, Carbachol에 대한 반응의 농도 의존성을 도시하는 도면.
도 18은 본 발명의 장치를 사용하여 측정한, 림나에아 스타그날리스의 신경 세포의, Carbachol 투여 전후의 측정 결과를 도시하는 도면.
도 19는 종래의 세포 내 기록법을 사용하여 측정한, 림나에아 스타그날리스의 신경 세포의, Carbachol 투여 전후의 측정 결과를 도시하는 도면.
도 20은 본 발명의, 약제의 작용 효과를 분류하는 방법을 도시하는 도면.
본 발명은 종래의 전기 생리학적 측정 장치를 개량하여, 상술한 바와 같은 문제점을 제거하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 기판 상에 설치된, 세포 보유 수단을 구비한 적어도 1개의 웰(well)과, 상기 적어도 1개의 웰의 각각의 전기 신호를 검출하는 측정용 전극과, 기준 전극을 구비하는 세포외 전위 측정용 디바이스에 관한 것이다.
바람직하게는, 상기 세포 보유 수단은 상기 웰 내에 된 적어도 1개의 오목부이고, 그 저면에 세포 흡인 수단에 연결되는 관통 구멍을 갖는 오목부이다.
바람직하게는, 상기 측정용 전극은 상기 관통 구멍을 통하여 상기 웰에 연결되는 공간 내에 배치된다.
바람직하게는, 상기 오목부의 개구부에 의해서 세포가 밀착되어 보유된다.
바람직하게는, 상기 오목부의 개구부는 10 내지 50μm의 직경을 갖고, 그리고 상기 관통 구멍의 직경은 약 2 내지 10μm 이다.
바람직하게는, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 테플론, 폴리스티렌 및 폴리카보네이트로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 재료로 형성된다.
바람직하게는, 상기 기판은 절연 기판으로서, 상기 디바이스는 세포 흡인 수단을 더 구비한다.
바람직하게는, 상기 세포를 배양하기 위한 웰은 실리콘, 플라스틱, SiO2, 고무로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 재료로 형성된다.
바람직하게는, 상기 기준 전극은 링형이다.
바람직하게는, 상기 기준 전극은 도전성 재료로 형성된다.
바람직하게는, 상기 절연 기판은 직경 6μm의 관통 구멍을 구비한다.
바람직하게는, 상기 절연 기판은 지지층을 구비하고, 이 지지층은 적어도 10μm의 두께의 SOI 기판이다.
바람직하게는, 상기 지지층은 실리콘, 플라스틱, 또는 SiO2로 형성된다.
바람직하게는, 상기 지지층의 두께는 1μm 이상이다.
바람직하게는, 상기 세포 흡인 수단에 있어서, 상기 세포 흡인부의 두께는 lOμm 이상의 실리콘, 플라스틱, SiO2, 또는 고무로 형성된다.
바람직하게는, 상기 오목부의 내면은 친수성 처리되어 있다.
하나의 국면에서, 본 발명은 세포외의 전위를 측정하는 방법에 관하여, 이 방법은 생체 시료의 전기적 특성을 측정하는 반응계를 제공하는 공정, 이 반응계에 상처가 없는 목적 세포를 배치하는 공정, 및 상기 목적 세포의 전기적 특성을 검출하는 공정을 포함하고, 여기서, 상기 반응계는 기판 상에 설치된, 세포 보유 수단을 구비한 적어도 1개의 웰과, 적어도 1개의 웰의 각각의 전기 신호를 검출하는 측정용 전극과, 기준 전극을 구비하는 세포외 전위 측정용 디바이스일 수 있다.
바람직하게는, 상기 전기적 특성을 검출하는 공정은 상기 목적 세포의 상태를 전기적 특성으로서 적어도 2회 검출하는 것, 및 검출된 상기 전기적 특성 중 적어도 2개를 비교하는 것을 포함한다.
바람직하게는, 상기 측정용 전극이 배치되는 영역의 용적은 상기 기준 전극에 배치되는 영역의 용적보다도 작다.
바람직하게는, 상기 기준 전극의 표면적은 상기 측정용 전극의 표면적보다 작다.
바람직하게는, 상기 측정용 전극의 임피던스는 상기 기준 전극의 임피던스보다도 낮다.
바람직하게는, 상기 측정용 전극의 10Hz로부터 10kHz에서의 임피던스는 상기 기준 전극의 10Hz로부터 10kHz에서의 임피던스보다 작다.
바람직하게는, 상기 기판은 절연 기판으로서, 상기 세포 보유 수단은 전해액에 침지되는 상기 절연 기판에 배치된 관통 구멍이고, 이 관통 구멍 상에 목적 세포가 배치될 때, 상기 기준 전극은 상기 목적 세포가 배치되는 상기 절연 기판의 측면 근방에 배치되며, 상기 측정용 전극은 상기 절연 기판이 대향하는 측면 근방에 배치되고, 그리고 상기 기준 전극이 침지되는 전해액의 양과 상기 측정용 전극이 침지되는 전해액의 양이 다르다.
바람직하게는, 상기 기준 전극이 침지되는 전해액의 양은 상기 측정용 전극이 침지되는 전해액의 양의 5배 이상이다.
바람직하게는, 상기 기판은 절연 기판으로서, 상기 세포 보유 수단은 상기절연 기판에 배치된 관통 구멍이고, 이 관통 구멍 상에 목적 세포가 배치될 때, 상기 기준 전극은 상기 목적 세포가 배치되는 상기 절연 기판의 측면 근방에 배치되며, 상기 측정용 전극은 상기 절연 기판의 대향하는 측면 근방에 배치되고, 그리고 상기 기준 전극의 전극 면적과 상기 측정용 전극의 전극 면적이 다르다.
바람직하게는, 상기 기준 전극의 전극 면적은 상기 측정용 전극의 면적의 1/5 이하이다.
바람직하게는, 상기 기판은 절연 기판으로서, 상기 세포 보유 수단은 상기 절연 기판에 배치된 관통 구멍이고, 이 관통 구멍 상에 목적 세포가 배치될 때, 상기 기준 전극은 상기 목적 세포가 배치되는 상기 절연 기판의 측면 근방에 배치되고, 상기 측정용 전극은 상기 절연 기판의 대향하는 측면 근방에 배치되며, 그리고 상기 기준 전극의 임피던스와 상기 측정용 전극의 임피던스가 다르다.
바람직하게는, 상기 기준 전극의 임피던스는 상기 측정용 전극의 임피던스의 5배 이상이다.
바람직하게는, 상기 기준 전극의 목적 세포로부터의 거리는 상기 측정용 전극의 목적 세포로부터의 거리보다 길다.
바람직하게는, 상기 세포외 전위 측정용 디바이스는 기준 전극 면적:측정용 전극 면적=1:5, 기준 전극 임피던스:측정용 전극 임피던스=5:1, 또는 기준 전극이 침지되는 전해액의 용적:측정용 전극이 침지되는 용적=5:1이도록 구성된다.
바람직하게는, 상기 세포외의 전위는 세포의 이온 채널 또는 수용체의 활성화, 또는 세포 내 신호 전달계의 작동에 따르는 신호이다.
바람직하게는, 상기 전기적 특성을 검출하는 공정은 상기 목적 세포에 대한 작용이 이미 알고 있는 표준 화학 물질의 존재 하에서 행하는 것, 및 피험체 화학 물질의 존재 하에서 행하는 것을 포함하고, 상기 방법은 화학 물질의 존재 하 및 피험체 화학 물질의 존재 하에서 얻어진 전기적 특성을 비교하여, 상기 피험체 화학 물질의 상기 생체 시료에 대한 작용을 특징짓는 공정을 더 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 목적 세포를 배치하는 공정은 상기 웰에 측정 용액을 도입하는 것, 상기 웰과, 이 웰에 연결되는 관통 구멍의 웰과 대향하는 개구부와의 사이에 압력차를 생성하는 것, 및 이 압력차를 10분의 1 이하의 크기로 하는 것을 포함한다.
바람직하게는, 상기 압력차를 생성하는 것은 상기 개구부를 통하여 감압함으로써 달성된다.
바람직하게는, 상기 압력차를 생성하는 것은 상기 웰을 가압함으로써 달성된다.
바람직하게는, 상기 압력차를 생성하는 것은 상기 개구부를 통하여 감압하는 것, 및 상기 웰을 가압함으로써 달성된다.
바람직하게는, 상기 압력차는 0.01 내지 0.5atm 이다.
하나의 국면에서, 본 발명은 상기 세포외 전위 측정용 디바이스, 이 세포외 전위 측정용 디바이스의 측정용 전극에 연결되는 전기 신호 검출부, 및 신호 처리 수단을 구비하고, 이 신호 처리 수단이 상기 전기 신호 검출부로부터의 복수의 전기 신호를 처리하여 세포의 활동 상태를 표시하는 고속 약품 스크리닝 장치에 관한것이다.
바람직하게는, 이 고속 약품 스크리닝 장치는 피험 약액을 주입 또는 배출하는 수단, 세포외 전위 측정용 디바이스를 이동하는 수단을 더 구비할 수 있다.
바람직하게는, 상기 목적 세포의 전기적 특성의 변화를 검출하는 공정은 (a)상기 목적 세포가 발생한 전기적 신호를 시계열 신호치로서 기록하는 것, (b) 이 시계열 신호치를 샘플링하여, 복수 값으로 이루어지는 추출 데이터의 복수의 그룹을 취득하여, 이 복수의 그룹의 각각의 표준 편차를 계산하는 것, (c) 이 각각의 표준 편차의 평균치를 계산하는 것, 및 (f) 이 평균치에 기초하여 상기 목적 세포의 전기적 특성의 변화를 검출하는 것을 포함한다.
바람직하게는, 상기 목적 세포의 전기적 특성의 변화를 검출하는 공정은 (a)목적 세포가 발생한 전기적 신호를 시계열 신호치로서 기록하는 것, (b) 이 시계열 신호치를 샘플링하여, 복수의 값으로 이루어지는 추출 데이터의 복수의 그룹을 취득하고, 이 추출 데이터의 복수의 그룹의 각각의 표준 편차를 계산하는 것, (c) 이 각각의 표준 편차를, 소정의 크기의 표준 편차를 단위로 하는 복수의 계급으로 분류하고, 이 계급에 속하는 상기 추출 데이터의 복수의 그룹의 전기적 특성을 나타내는 분포를 얻는 것, (d) 이 분포를 정규 분포에 근사시키는 것, (e) 얻어진 정규분포의 평균치 및 하프치 폭(half width)을 계산하는 것, (f) 필요에 따라서 상기 (b) 부터 (e)를 반복하는 것, 및 (g) 상기 평균치 및 하프치 폭에 기초하여 상기 목적 세포의 전기적 특성의 변화를 검출하는 것을 포함한다.
바람직하게는, 상기 (b)로부터 (e)는 반복되고, 각 반복에 있어서 샘플링하는 상기 시계열 신호치의 수를 바꿔 실시될 수 있다.
바람직하게는, 상기 반응계는 복수로서, 상기 (b)의 앞에, 이 반응계의 각각에 배치된 복수의 목적 세포가 발생하는 시계열 신호치를 가산하는 것이 더 포함된다.
바람직하게는, 상기 (a)의 앞에, 상기 복수의 목적 세포에 자격(刺激)을 동시에 주는 것이 더 포함된다.
바람직하게는, 상기 목적 세포의 전기적 특성의 변화를 검출하는 공정은 (a)목적 세포가 발생한 전기적 신호를 시계열 신호치로서 기록하는 것, (b) 이 시계열 신호치를 샘플링하여, 복수의 값으로 이루어지는 추출 데이터의 복수의 그룹을 취득하여, 이 추출 데이터의 복수의 그룹의 각각의 표준 편차를 계산하는 것, (c) 이 각각의 표준 편차를, 소정의 크기의 표준 편차를 단위로 하는 복수의 계급으로 분류하여, 이 계급에 속하는 상기 추출 데이터의 복수의 그룹의 전기적 특성을 나타내는 분포를 얻는 것, (d) 상기 분포를 지수 감소, 지수 증가, 가우스, 로렌쯔(Lorentz), 시그마, 다중피크 및 비선형으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 곡선 근사 해석에 의해 근사하는 것, (e) 상기 (d)에 의해 얻어진 근사 곡선의 꼭지점의 전후에서의 기울기에 기초하여 상기 생체 시료의 전기적 특성의 변화를 검출하는 것을 포함한다.
상기 (b)에 있어서의 상기 샘플링은 시계열적 또는 무작위로 행해질 수 있다. 바람직하게는, 상기 (b)에 있어서의 상기 샘플링은 1개의 개시 데이터(a)로부터 시계열적으로 복수회, 이어서 이 개시 데이터(a)로부터 일정 시간 후의데이터(b)에서 시계열적으로 복수회 행해진다.
바람직하게는, 상기 (b)에 있어서의 상기 샘플링은 1개의 개시 데이터(a)로부터 시계열적으로 복수회, 이어서 이 개시 데이터(a)로부터 일정 시간 후의 데이터(b)로부터 시계열적으로 복수회 행해진다.
바람직하게는, 상기 목적 세포의 전기적 특성의 변화를 검출하는 공정은 (a)목적 세포가 발생한 전기적 신호를 시계열 신호치로서 기록하는 것, (b) 이 시계열 신호치를 샘플링하여, 복수의 값으로 이루어지는 추출 데이터의 복수의 그룹을 취득하고, 이 추출 데이터의 복수의 그룹의 각각의 표준 편차를 계산하는 것, (c) 얻어진 표준 편차를 샘플링하여, 복수의 값으로 이루어지는 추출 표준 편차의 복수의 그룹을 취득하고, 이 추출 표준 편차의 복수의 그룹의 각각의 평균치를 계산하는 것, (e) 이 평균치가, 미리 설정된 임계치에 도달할 때의 상기 시계열 신호치가 발생하는 시간에 기초하여, 상기 목적 세포의 전기적 특성의 변화를 검출하는 지표치를 얻는 것을 포함한다.
상기 전기적 신호는 세포의 이온 채널 또는 수용체의 활성화 또는 세포 내 신호 전달계의 작동에 따른 신호일 수 있다.
하나의 국면에서, 본 발명은 피험체 화학 물질의 목적 세포에 대한 작용을 측정하는 장치에 관하여, 이 장치는 목적 세포의 전기적 특성을 측정하는 반응계, 목적 세포가 발생한 전기적 신호를 시계열 신호치로서 기록하는 수단, 이 시계열 신호치를 샘플링하여, 복수의 값으로 이루어지는 추출 데이터의 복수의 그룹을 취득하고, 이 복수의 그룹의 각각의 표준 편차를 계산하는 수단, 이 표준 편차의 평균치를 계산하는 수단, 및 이 평균치에 기초하여 상기 목적 세포의 전기적 특성의 변화를 검출하는 수단을 구비한다.
하나의 국면에서, 본 발명은 피험체 화학 물질의 목적 세포에 대한 작용을 측정하는 장치에 관하여, 이 장치는 목적 세포의 전기적 특성을 측정하는 반응계, 목적 세포가 발생한 전기적 신호를 시계열 신호치로서 기록하는 수단, 이 시계열 신호치를 샘플링하여, 복수의 값으로 이루어지는 추출 데이터의 복수의 그룹을 취득하여, 이 추출 데이터의 복수의 그룹의 각각의 표준 편차를 계산하는 수단, 이 각각의 표준 편차를, 소정의 크기의 표준 편차를 단위로 하는 복수의 계급으로 분류하여, 이 계급에 속하는 상기 추출 데이터의 복수의 그룹의 전기적 특성을 나타내는 분포를 얻는 수단, 상기 분포를 정규 분포에 근사시키는 수단,
얻어진 정규 분포의 평균치 및 하프치 폭을 계산하는 수단, 이 평균치 및 하프치 폭에 기초하여 목적 세포의 전기적 특성의 변화를 검출하는 수단을 구비한다.
하나의 국면에서, 본 발명은 피험체 화학 물질의 목적 세포에 대한 작용을 측정하는 장치에 관하여, 이 장치는 목적 세포의 전기적 특성을 측정하는 반응계, 목적의 생체 시료가 발생한 전기적 신호를 시계열 신호치로서 기록하는 수단, 이 시계열 신호치를 샘플링하고, 복수의 값으로 이루어지는 추출 데이터의 복수의 그룹을 취득하며, 이 추출 데이터의 복수의 그룹의 각각의 표준 편차를 계산하는 수단, 이 각각의 표준 편차를, 소정의 크기의 표준 편차를 단위로 하는 복수의 계급으로 분류하고, 이 계급에 속하는 상기 추출 데이터의 복수의 그룹의 전기적 특성을 나타내는 분포를 얻는 수단, 이 분포를, 지수 감소, 지수 증가, 가우스, 로렌쯔, 시그마, 다중피크 및 비선형으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 곡선 근사 해석에 의해 근사하는 수단, 얻어진 근사 곡선의 꼭지점의 전후에 있어서의 기울기에 기초하여 상기 목적 세포의 전기적 특성의 변화를 검출하는 수단을 구비한다.
하나의 국면에서, 본 발명은 피험체 화학 물질의 목적 세포에 대한 작용을 측정하는 장치에 관하여, 이 장치는 목적 세포의 전기적 특성을 측정하는 반응계, 목적 세포가 발생한 전기적 신호를 시계열 신호치로서 기록하는 수단, 이 시계열 신호치를 샘플링하여, 복수의 값으로 이루어지는 추출 데이터의 복수의 그룹을 취득하고, 이 추출 데이터의 복수의 그룹의 각각의 표준 편차를 계산하는 수단, 얻어진 표준 편차를 샘플링하여, 복수의 값으로 이루어지는 추출 표준 편차의 복수의 그룹을 취득하고, 이 추출 표준 편차의 복수의 그룹의 각각의 평균치를 계산하는 수단, 이 평균치가, 미리 설정된 임계치에 도달할 때의 상기 시계열 신호치가 발생하는 시간에 기초하여, 상기 목적 세포의 전기적 특성의 변화를 검출하는 지표치를 얻는 수단을 포함한다.
본 발명자들은 마이크로 머신 기술을 사용하여, 고속 약품 스크리닝 방법에 있어서 범용되고 있는 멀티 타입 플레이트(96,384,1536웰 등)의 형상의 디바이스에 있어서, 각각의 웰의 저면에 미소한 오목부를 복수 형성하고, 이 오목부에 세포를 보유함으로써, 종래의 패치 클램프법에 가까운 질의 데이터를 얻을 수 있는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 상기 종래 기술의 문제점을 해결하는 것으로, 종래의 세포외 기록방법으로서는 검출하는 것이 불가능한, 생체 시료가 발생하는 미세한 전기적 신호의 변화를 용이하고 또한 높은 신뢰성으로 검출할 수 있는 센서 기판을 구비한 세포외 전위 측정용 디바이스, 및 그것을 사용하는 생체 시료의 전기 화학적 변화를 측정하는 방법 및 장치를 제공한다. 특히 전용의 제어 장치를 필요로 하지 않는간이한 센서 기판에 의해, 세포를 챔버 상의 웰에 배치하는 것만으로 세포와 절연 기판에 기가 시일드를 형성하지 않고서 용이하게 단시간으로 측정이 가능하고, 또한 화학물질을 이용하지 않기 때문에, 부작용이나 형광 감도의 경시 변화를 고려할 필요가 없다, 세포 전체에 걸친 매크로인 채널 활성도의 측정, 결국 세포가 발생하는 물리 화학적 변화 계측 방법과, 본 방법을 사용한 고속 약품 스크리닝 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1a에, 본 발명의 세포외 전위 측정용 디바이스의 1개의 웰의 구조를 모식적으로 도시한다. 웰(2)에는 배양액이 들어가고, 도 1a의 중앙에 타원으로 도시되는 피험 체세포는 기판(1)에 설치된 세포 보유 수단에 의해서 포착 또는 보유된다. 세포 보유 수단은 기판(1)에 형성된 오목부(3), 및 개구부(5)를 개재하여 이 오목부(3)에 연락하는 관통 구멍(7)을 구비한다.
도 1a에서는 관통 구멍(7)의 세포와 접하는 반대측에, 센서 수단인 측정용 전극(9)이 배치되어 도시된다. 측정용 전극(9)은 배선(8)을 지나서 신호 검출부에 연결된다. 관통 구멍(7)은 흡인 펌프 등의 흡인 수단에 연락하는 흡인 부분의 일부를 형성하고, 세포 흡인 수단(도시하지 않음)과 연결되며, 이 세포 흡인 수단은 상기 오목부(3)에 보유된 세포의 세포막과 기판(1)을, 이 오목부(3)내에 있는 세포막을 개재하여 얻어지는 전기적 신호가, 도면 중의 화살표로 도시되는 바와 같이, 웰 중의 배양액에 새지 않도록 밀착하여 보유하도록 흡인된다.
도 1a에서는 오목부(3)의 개구부에 세포의 일부가 빠져 도시된, 이 세포막과 기판(1)과의 밀착성은 세포외 전위의 측정에 있어서 유효한 전기적 시일을 형성하고, 그것에 의해서 검출되는 전기적 신호의 질을 향상시킨다.
본 발명에서는 기준 전극이 배치되는 제 1 영역, 상처가 없는 세포인 제 2 영역, 및 측정용 전극이 배치되는 제 3 영역으로 구성되는 분석계에서, 상처가 없는 세포의 세포막 전위 또는 상처가 없는 세포에 있어서 생기는 세포막 전위의 변화를, 세포외 전위 변화에 의한 전압의 변화로서 측정한다.
비교를 위해, 도 1b에, 종래의 평면 미소 전극을 사용하여 세포외 전위 측정을 한 경우를 모식적으로 도시한다. 이 경우, 세포로부터 발생한 전기적 신호는 거의 배양액 중에 새어버려, 신호 검출 감도가 현저하게 낮아진다.
도 1a에 도시하는 웰에는 기준 전극(10)이 설치되고, 측정용 전극(9)은 이 기준 전극에 부여되는 기준 전위를 대조로 하여, 세포의 전기 신호를 측정한다. 통상, 이 기준 전극은 그 단면이 약 10Oμm 내지 약 1000μm의 직경의 금, 백금, 은-염화은 등의 재료의 선재이지만, 필요에 따라서 임의의 크기 및 형상일 수 있다. 또한, 이 기준 전극은 필요에 따라서 웰당 1개 이상 설치되고, 그것에 의해서 세포외 전위의 측정 정밀도를 향상할 수 있다.
이러한, 웰을 1개 이상 구비한 세포 활동 측정용 디바이스는 종래의 마이크로 머신 기술에 의해 형성된다. 도 2에, 제조 공정의 일 예를 도시한다.
우선, SiO2층(10)을 끼운 2개의 Si 층(11, 12)으로 이루어지는 SOI 층(20)의 양면을 열산화하여 SiO2층(13, 14)을 형성한다. 이어서 SiO2층(13)의 표면에 증착에 의해 Al층(15)을 형성하여 보호막(31; 포토레지스트:PR)으로 덮은 후, 포토리소그래피에 의해 보호막(31)을 패터닝하여, 보호막(31)을 마스크로 하여 Al층(15)을 패터닝한다(도 2a).
다음에, 기판의 이면에 형성된 SiO2층(14)을 보호막(32)으로 덮은 후, 포토리소그래피에 의해 보호막(32)을 패터닝하고, 보호막(32)을 마스크로 하여 SiO2층(14)을 그 일부를 남기고 제거한다(도 2b). 보호막(31 및 32)을 제거한 후, SiO2층(14)을 마스크로 하여, 기판의 이면측의 Si 층(12)을 수산화테트라메틸암모늄(TMAH)을 사용한 웨트 에칭에 의해 에칭하고(도 2c), 또한 표면측의 SiO2층(13) 및 Si 층(11)을 Al층(15)을 마스크로 하여, 반응성 이온 에칭(RIE)을 사용한 드라이 에칭에 의해 에칭한다(도 2d). 다음에 표면의 Al층(15)을 제거한 후(도 2e), 표면측으로부터 기판(20) 중앙의 SiO2층(10)을 Si 층(11)을 마스크로서 RIE를 사용한 드라이 에칭에 의해 에칭하고, 표면과 이면을 관통한다(도 2f). 기판(20) 전체를 열산화하여, 표면 및 디바이스의 최표면에 SiO2층(33)을 퇴적시킨다(도 2g). 그 후, 이면 SiO2층(14)의 위에, 진공 증착법 혹은 스퍼터법을 사용하여, 전극을 패터닝한다. 적합하게 사용하는 재료는 금, 백금, 백금흑, 팔라듐, 은이다. 또한, 상기 재료를 최표면에 퇴적시키기 위해서, 다른 금속의 층을 SiO2층(14)과의 사이에 퇴적시켜도 좋다. 이 목적으로 바람직하게 사용되는 재료는 니켈, 크롬, ITO, 텅스텐, 티타늄, 주석, 망간, 납 및 이들의 합금을 포함하고, 또한 기판(20)은 전극의 패터닝 후, 전극부를 제외하고, 그 밖의 전극층의 위에 절연층을 형성하여도 좋다. 적합하게 사용되는 재료의 예로서, 폴리이미드 수지, PMMA(폴리메틸메타크릴레이트), 아크릴 수지, PDMS(폴리디메틸사이클록산), 에폭시 수지, 이들 재료를 감광성으로 한 재료, 및 감광성 포토레지스트를 들 수 있다.
또한, 도 2에서는 기판 상에 1개의 오목부를 제작하는 경우를 도시하였지만, 도 2의 공정(a) 및 공정(b)에 있어서, 소망의 패터닝을 선택함으로써, 1개 이상의 오목부를 제작할 수 있다.
도 3의 (a)에, 웰당 합계 25개의 오목부를 1 세트로서 별표 모양으로 배치하여 제작한 예를 도시한다.
도 3의 (b)는 이렇게 하여 형성된 1개의 오목부의 전자 현미경 사진이다. 사진 오른쪽 아래의 막대는 5μm의 스케일을 나타낸다. 이 예에서는 오목부(3)의 개구부는 거의 원형이고 약 20μm의 직경을 갖고, 그리고 오목부의 저면의 거의 중앙에 직경 약 7μm의 구멍이 관찰된다. 또, 사진에 도시되는 점선은 세포가 배치되는 위치를 나타낸다. 도 3의 (c)는 기판을 뒷편에서 촬영한 전자 현미경 사진이다. 사진 오른쪽 아래의 막대는 250μm의 스케일을 나타낸다. 이 예에서는 사진의 한복판에 도시된, 에칭에 의해 형성된 약 100μm×약 150μm의 직사각형 영역이 관찰된다. 이 영역에, 상기의 관통 구멍이 25개 관통한다.
상기 기판 상의 1 세트의 오목부는 고속 약품 스크리닝 방법에 있어서 범용되고 있는 멀티 타입 플레이트(96,384,1536웰 등)의 형상에 맞추어서 제작된 복수의 구멍을 갖는 플레이트(도 4의 (a)에 도시한다. 이하 플레이트라고 부른다)와접착 또는 밀착되어 일체화될 때, 이 플레이트의 복수의 구멍의 각각에, 1세트의 오목부(도 4의 (b))가 수용되도록 기판 상에 형성될 수 있다. 도 4에 도시하는 예에서는 플레이트에 맞추어서, 24×16=384 세트의 오목부가 형성된다. 그리고 상기 플레이트의 구멍은 범용되는 마이크로타입 플레이트의 웰과 거의 같은 크기를 가지기 때문에, 이 1 세트의 오목부(도 4의 (b))는 대략 4mm2의 영역 내에 형성된다. 통상, 개개의 오목부는 10 내지 100μm의 간격을 두고 배치될 수 있다.
얻어진 기판 상에, 상기 플레이트를 겹쳐 밀착 또는 접착함으로써, 복수의 웰을 갖는 세포외 전위 측정 디바이스가 얻어진다. 웰은 상기 플레이트의 구멍의 측벽과, 저면을 구성하는 기판으로 구성된다. 상기 플레이트와 기판의 접착은 일액형 RTV 고무(신에츠(信越) 실리콘 KE42T) 등을 사용하여 행해진다.
또한, 상기 멀티 타입 플레이트의 형상에 맞추어서 제작되는 복수의 구멍을 갖는 플레이트는 세포 독성이 낮은 재료, 예를 들면, 테플론, 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리에틸렌테레프탈레이트 등의 재료로 제작되고, 당업자에게 주지인 압출 성형 등 방법으로 형성될 수 있다.
혹은 기판 재료로서 미세 가공을 하기 쉬운 실리콘 웨이퍼를 사용하는 경우, 상기와 같은 멀티 타입 플레이트를 모방한 플레이트를 사용하지 않고서, 도 1a에 도시한 바와 같은 웰 형상을 실리콘 웨이퍼 기판에 직접 형성하는 것도 가능하다.
도 5는 웰의 측벽(22)에 링형의 기준 전극(20)을 구비한, 본 발명 개변예의 세포외 전위 측정 디바이스를 도시한다. 도 5a는 디바이스의 평면도, 그리고 도5b는 도 5a에 도시하는 직선(5′)에 따른 디바이스의 단면도이다. 이 개변예에서는 기준 전극이 링형이기 때문에, 웰 내에 한결같이 기준 전위가 제공되어, 측정 정밀도를 향상시킨다. 이 링형 전극(20)은 예를 들면, 선폭 약 1μm 내지 약 1000μm의 금, 백금, 은-염화은 등의 선재로 형성된다. 24는 기준 전극과 전원을 잇는 배선이다. 측정용 전극(29)은 도 1에서 도시되는 디바이스와 같이, 배선(도시하지 않음)을 지나서 신호 검출부에 연결된다.
본 발명의 세포외 전위 측정 디바이스를 장착한 고속 약품 스크리닝 장치의 구성예를 모식적으로 도 6에 도시한다. 도 6 중의 구성은 이하와 같다. A:세포외 전위 측정용 디바이스를 수용하는 배양장치이다. 피험대상인 세포에 따라서, 세포 배양에 적합한 환경을 유지한다. B:배양 장치로부터 세포외 전위 측정용 디바이스를 이동하는 수단으로서, 이 디바이스를 신호 검출장치(C)에 반입한다. 예를 들면, 로봇 아암을 채용할 수 있다. C:신호 검출장치로서 도 7에 그 구성의 상세를 도시한다. D:신호 도출 케이블. E:신호 처리 장치(컴퓨터).
도 7에, 도 6c에서 도시하는 신호 검출 치의 구성예를 모식적으로 도시한다. 도 7의 구성은 이하와 같다. A:피험 약액을 주입 또는 배출하는 수단. 예를 들면, 시약 분주 멀티 피펫. B:상기 세포외 전위 측정용 디바이스. C:흡인부. D:흡인 펌프. E 내지 H:시약. I:신호 도출선. J:프리 앰프. K:메인 앰프. L:신호 도출선이고, 신호 처리 수단(컴퓨터)에 접속된다.
또, 상기의 각 구성 요소간의 연결은 해당 분야에서 공지된 수단을 사용하여 행할 수 있고, 특히 상세한 것은 설명하지 않는다.
다음에 도 10 및 도 11을 사용하여 본 발명의 개변예를 설명한다. 도 10은 본 발명의 세포외 전위 측정용 디바이스의 개변예의 개략을 도시하는 도면이다. 센서 기판(51)은 SOI 기판(52)을 끼워 상면에 세포를 배치하는 웰(53), 하면에 신호를 검출하기 위한 대표적으로는 금인 측정용 전극(54)을 배치하고 있다. 웰(53)내에는 약 50μl의 배양액(55), SOI 기판 상에 도시되는 관통 구멍(57)에는 약 1μl 이하의 배양액이 존재한다. 상기 웰 내의 오목부(56)는 세포를 보유하는 데 최적인 구조로 형성되고, 대표적으로는 개구부의 직경은 약 1Oμm이다. 상기 웰 내에는 기준 전극(58; 대표적으로는 Ag-AgCl)이 배양액(55)에 침지되도록 배치하고 있다.
여기서 본 명세서에서는, 기준 전극(58)을 수용하는 웰(53), 침지하는 배양액(55), 및 오목부(56)를 총칭하여 기준 전극 배치 환경, 그리고 측정용 전극(54) 근방에 있는, 관통 구멍(57) 및 거기에 포함되는 배양액을 총칭하여 측정용 전극 배치 환경이라고 정의한다.
오목부의 사이스는 목적의 생물 시료에 의존하여 변화할 수 있고, 목적의 생물 시료가 보유되는 크기라면 특히 제한되지 않지만, 대표적으로는 오목부(56)의 개구부의 직경은 10 내지 500μm의 범위, 깊이는 1 내지 500μm의 범위에 있다. 통상 오목부(6)의 개구부의 직경은 10 내지 100μm의 범위, 깊이는 2 내지 100μm의 범위에 있다. 적합한 예시의 오목부로서, 예를 들면, 개구부의 직경이 20μm 및 깊이 10μm의 오목부, 개구부의 직경이 20μm 및 깊이 20μm의 오목부를 들 수 있다. 또한, n 관통 구멍의 사이즈도 또한, 목적의 생물 시료가 통과하지 않고서,오목부와 협동하여 목적의 생물 시료가 보유되는 한 특히 제한되지 않지만, 대표적으로는 개구부의 직경은 5 내지 100μm의 범위, 깊이는 10nm 내지 10Oμm의 범위에 있다. 예시의 관통 구멍으로서, 예를 들면, 직경 5μm, 및 깊이 1.5μm의 사이즈의 관통 구멍을 들 수 있다.
도 10의 아래에 도시되는 것은 오목부의 확대 평면도이다.
도 11은 본 발명의 세포외 전위 측정용 디바이스의 별도의 개변예의 개략을 도시하는 도면이다. 도 11에 도시하는 센서 기판(60)에서는 도 10에 도시하는 센서 기판(51)과는 오목부(56) 및 관통 구멍(57)이 복수 설치되어 있는 점에서 다르다. 그리고 도 11에서는 각 오목부(56)에 도면 중 타원형으로 세포가 보유되어 도시되어 있다. 절연 기판(62 내지 64)은 SOI로 제작되고, Si 층(62)의 밑에는 SiO2층(63)이 배치되고, 또한 SiO2층(63)의 아래에는 지지 기판(64)이 배치된다. 지지 기판(64)의 표면 및 SiO2층(63)의 표면의 일부에 따라, 측정용 전극(54)이, 세포(69)에 접촉하거나, 세포(69)의 근방, 바람직하게는 세포(69)와의 거리가 10μm 이내이도록 센서 기판의 이면에 배치된다.
본 발명의 세포외 전위 측정용 디바이스에 있어서, 측정용 전극의 근방의 공간에는 세포 흡인 수단에 의해서 흡인되는 전해액만이 존재한다. 따라서, 본 발명의 세포외 전위 측정용 디바이스에 있어서, 목적의 생체 시료가 설치되는 기판의 측면과 대향하는 측면 근방, 즉 센서 기판의 이면에 존재 하는 전해질 용액은 관통 구멍을 채우고 있는 전해질 용액에 더하여, 많아도 1 내지 10μl정도이다. 더욱이, 측정용 전극으로 세포의 전기적 변화를 검출할 수 있는 한, 특히 세포 흡인계 전체를 전해액으로 채울 필요는 없다.
도 10 및 도 11에 도시하는 바와 같이, 1개의 측정용 전극당, 오목부(56) 및 관통 구멍(57)을 1개 구비하고 있어도 좋고, 1개의 측정용 전극당 복수의 오목부(56) 및 관통 구멍(57)을 구비하고 있어도 좋다.
도 12는 도 11에 도시하는 센서 기판(60)을 사용하여 세포의 전기적 변화를 측정할 때, 필요에 따라서 사용되는 흡인 라인 어태치먼트(85)의 개략을 도시하는 도면이다. 도 12에서는 센서 기판의 이면에 배치되어 세포 흡인 수단의 일부를 구성하는 흡인라인 어태치먼트(85)가 도시된다. 이 흡인라인 어태치먼트(85)는 아크릴, PMDS, 실리콘 고무 등의 재료로 제작되고, 센서 기판에 설치된 복수의 관통 구멍(57)에 대응한다, 흡인라인에 연락하는 공간(81)을 형성하도록 성형되고, 센서 기판의 이면에 실리콘 고무 등을 매체로서 설치된다. 더욱이 센서 기판에 접착하고 일체화하는 것도 가능하다. 도 12에 도시되는 바와 같이, 세포의 전기적 변화를 측정할 때는 바람직하게는 세포 흡인계 라인(87)으로부터의 인압(引壓)에 의해서 세포를 절연 기판에 밀착시킨다. 또, 도 12에서는 피험체인 세포는 생략하고, 그리고 오목부 및 관통 구멍의 구조는 간략화하여 도시하고 있다.
도 13은 본 발명의 센서 기판을 구비하고, 피험체 화학 물질의 생체 시료에 대한 작용을 측정하는 장치의 구성의 개념도이다. 본 장치는 본 발명의 센서 기판을 구비한 측정부(신호원; 101), 측정부(101)로부터의 신호를 샘플링하여, 표준 편차를 계산하는 단위 표준 편차 계산부(102), 얻어진 표준 편차의 평균치를 계산하는 평균치 계산부(105), 및 평균치 계산부(105)로부터 출력된 표준 편차의 평균치로부터, 세포의 이온 채널 활성도를 계산하는 활성도 계산부(108), 및 얻어진 활성도를 표시하는 데이터 표시부(110)를 구비한다. 각 부의 연락은 도 4 중, 점선 또는 실선으로 도시된다. 또, 대표적으로는 상기 단위 표준 편차 계산부(102), 평균치 계산부(105), 및 활성도 계산부(108)는 이들의 계산을 실행하기 위한 프로그램이 기록된 하드 디스크를 내장하는 컴퓨터이다. 그리고 상기 데이터 표시부(110) 는 CRT이다.
또한, 도 13 중, 참조 번호(103, 104, 106, 109)는 각각 이하에 설명한, 정규 분포 근사부, 자격 발생부, 평균치·하프치 폭 계산부, 활성도 분류부이다.
실시예에 따라 본 발명을 설명한다. 이하의 실시예는 본 발명의 예시이고, 본 발명을 제한하는 의도가 아니다.
(실시예 1)
개구부의 직경 20 마이크론, 깊이 10 마이크론의 오목부와, 그 오목부의 중심부에 또한 직경 3 마이크론의 관통 구멍을 도 3에 도시하는 바와 같이 별표 모양으로 100μm 간격(구멍의 중심간의 거리)으로 실리콘 기판 상에 25개 천공하였다. 이들의 오목부를 포함하는 사이즈의 구멍을 갖는 플레이트(폭×길이×두께= 12.7×8.1×7mm)를 기판 상에 접착하고, 세포외 전위 측정용 디바이스로서 도 6에 도시하는 장치에 장착하였다.
태생 17일의 SD 쥐의 대뇌피질로부터 신경 세포를 조제하고,달베코(Dullbecco) 변법 배지에 현탁하여, 1×105cells/ml의 농도로 이 웰에 분주하였다. 각 오목부에 세포를 포착하여, 흡인 주사기로 가볍게 흡인함으로써, 세포와 실리콘 기판과의 밀착을 향상시켰다. 이 상태에서 3O분간 세포를 CO2인큐베이터 속에서 배양한다(34℃, 5% CO2). 계속하여 웰에 10nM 농도가 되도록 Ca 길항약(ω-코노톡신 GVIA)을 첨가하여, 세포를 5분간 처리하고, 이어서, 글루타민산을 20μm가 되도록 투여함으로써 발생하는 노이즈를 Ca 길항약 비존재 하의 것과 비교하였다. 결과를 도 8에 도시한다.
도 8a는 Ca 길항약 비존재 하에서 측정되는 컨트롤의 세포로 관찰된 노이즈를 나타내는 챠트(횡축은 시간, 그리고 종축은 전압(세포의 활동을 나타내는 전위의 강도)), 및 그것을 FFT(고속 푸리에) 변환한 노이즈의 주파수 특성인(횡축은 노이즈의 주파수, 그리고 종축은 노이즈의 진폭의 자승치(소위 파워 스펙트럼)이다). 도 8b는 Ca 길항약 존재 하에서 측정된 동일 노이즈를 도시하는 챠트이고, 및 주파수 특성이다.
도 8에 도시하는 바와 같이, Ca 길항약 존재 하에서는 노이즈는 약 4Hz로 극대치를 갖는 것에 대하여, Ca 길항약 비존재 하에서는 약 10Hz에 극대치를 갖고, 강도에 있어서도 Ca 길항약 비존재 하에서는 Ca 길항약 존재 하의 약 1.5배의 노이즈가 관찰되어, Ca 길항약의 세포에 대한 영향을 유의하게 검출할 수 있었다.
(실시예 2)
실시예 1에 기재된 웰과 동일한 구성을 갖는 웰을 96개 갖는 세포외 전위 측정 디바이스를 제작하였다. 즉, 실리콘 웨이퍼 기판에, 개구부의 직경이 20 마이크론의 별표 모양으로 천공된 오목부 25개를 1개의 세트로서, 오목부의 세트가, 각 세트를 약 10mm의 간격을 두고 8×12의 매트릭스형으로 배치되도록 천공하였다. 그리고 그 위에 폴리스티렌제의 96의 구멍을 구비한 플레이트(폭×길이×두께= 12.7×8.1×7mm)를, 플레이트의 구멍의 각각이, 1 세트의 오목부를 포함하도록 접착하여 96웰의 세포외 전위 측정 디바이스를 구성하고, 도 6에 도시하는 장치에 장착하였다. 단, 각 오목부의 중심부에는 직경 3 마이크론의 관통 구멍이 구비되어 있다.
실시예 1과 마찬가지로, 조제한 태생 17일의 쥐의 신경 세포를, 각 웰에, 1×105cells/ml의 농도로 분주하였다. 그리고, 본 디바이스의 웰 상부와 관통 구멍 하면에서 단계적으로 가압 및 흡인을 반복함으로써, 세포와 실리콘 웨이퍼 기판과의 밀착을 향상시켰다. 이 상태에서 3O분간 세포를 CO2인큐베이터속에서 배양하였다. 계속해서, 세포를, 2종류의 Ca 길항제(ω-코노톡신 및 ω-아가톡신)를, 각각 최종 농도 1, 3, 10, 30nM이 되도록 첨가하여 5분간 처리하고, 글루타민산을 20μm가 되도록 투여함으로써 발생하는 노이즈를 Ca 길항약 비존재 하의 것과 비교하여 신호 처리 소프트에 의해 Ca 길항제의 세포에 대한 효과의 유무를 검정하였다.
도 9는 컴퓨터 화면에 표시된 결과이다. 매트릭스형의 화면 표시는 세포외 전위 측정 디바이스의 웰 매트릭스와 1대 1로 대응한다. 도 9의 좌측의 숫자는 매트릭스의 각 행의 웰에 첨가한 Ca 길항제의 농도를 나타낸다. 도 9에 있어서 백또는 흑색의 농담으로 표시되는 웰의 표시는 검출 신호를 신호 처리 소프트에 의해 처리하여, 컨트롤 웰로 관찰된 노이즈 신호에 대한 각 측정 웰의 노이즈 신호의 차를 대응하는 농담으로 표시하고 있다.
도 9에 도시되는 바와 같이, 본 발명의 세포외 전위 측정 디바이스를 사용함으로써, Ca 길항제의 농도에 의존하는 반응이 각 웰로 얻어지고, Ca 길항제의 효과를 멀티웰로 검정할 수 있는 것이 나타났다.
(실시예 3)
도 12에 도시하는 센서 기판을 측정부(신호부; 101)에 구비한 도 13에 도시하는 구성의 장치를 사용하여, 림나에아 스타그날리스로부터 조제한 신경세포를 재료로, 화학물질 Carbachol의 신경 세포에 대한 작용을 측정하였다. Carbachol는 신경 전달 물질인 아세틸콜린의 아날로그인 것이 알려지는 화학물질이다. Carbachol(Sigma사 제조)를 인공뇌-척수액에 용해하고, 0, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 및 100μm의 농도로 작용시켰을 때의 전기적 신호를 각각 측정하였다. 각 Carbachol 농도에 관해서, 센서 기판을 구비한 측정부(신호원; 101)로부터 얻은 10초간의 시계열 데이터로부터, 100 밀리초마다의 시계열 데이터를 샘플링하여 표준 편차를 계산하였다. 얻어진 표준 편차의 평균치를 플롯한(plot)한 결과를 도 17에 도시한다.
도 17에 도시하는 바와 같이, Carbachol 농도가 지나치게 크면, 100 밀리마리초마다의 표준 편차치의 평균치가 큰 것을 확인하였다. 이것은 Carbachl 농도에 의존하여, 림나에아 스타그날리스의 신경 세포의 이온 채널이 활성화된 것을 나타낸다.
(실시예 4)
도 14도 또한, 본 발명의 피험체 화학 물질의 생체 시료에 대한 작용을 측정하는 장치의 구성의 개념도이다. 본 장치는 도 13에 도시하는 장치의 평균치 계산부(105) 및 활성도 계산부(108)의 대신에, 정규 분포 근사부(103), 평균치·하프치 폭 계산부(106), 및 활성도 분류부(109)를 사용한다. 각 부의 연락은 도 13 중, 점선 또는 실선으로 도시된다.
정규 분포 근사부(103)는 단위 편차치 계산부에서 얻어진 복수의 표준 편차의 값을, 일정 폭의 표준 편차를 단위로 한다, 복수의 계급으로 분류하여, 이 계급을 X축으로 하고, 각 계급에 존재 하는 표준 편차의 개수를 Y축으로 하는 좌표 상에 계산된 표준 편차치를 플롯하여, 얻어진 그래프를 정규 분포에 근사한다. 평균치·하프치 폭 계산부(106)는 얻어진 정규 분포의 평균치 및 하프치 폭을 계산한다. 활성도를 분류하는 활성도 분류부(109)는, 얻어진 평균치 및 하프치 폭으로부터 이온 채널 활성도를 분류한다. 또, 대표적으로는 도 13에 도시되는 장치와 마찬가지로, 상기 단위 표준 편차 계산부(102), 정규 분포 근사부(103), 평균치·하프치 폭 계산부(106) 및 활성도 분류부(109)는 이들의 계산을 실행하기 위한 프로그램이 기록된 하드 디스크를 내장하는 컴퓨터이다. 그리고 상기 데이터 표시부(110)는 CRT이다.
도 12에 도시하는 센서 기판을 구비한 도 14에 도시하는 구성의 장치를 사용하여, 림나에아 스타그날리스로부터 조제한 신경 세포를 재료에, 화학물질Carbachol의 신경 세포에 대한 작용을 측정하였다.
림나에아 스타그날리스의 신경 세포에 대하여, 50μm 농도의 Carbachol를 투여하는 전후에, 센서 기판을 구비한 측정부(신호원; 101)로부터 얻은 신호로부터, 실시예 1과 거의 동일하게 하여 표준 편차를 계산하였다. 정규 분포부(103)로 플롯된 표준 편차의 그래프를 도 18에 도시한다.
도 18의 (a)는 Carbachol을 투여하기 전의 10초간의 전기 신호의 시계열 데이터를 5 밀리초마다 계산하여 얻은 표준 편차의 값의 히스토그램이고, 그리고 도 18의 (b)는 Carbachol 투여 후의 10초간의 전기 신호의 시계열 데이터를 5 밀리초마다 계산하여 얻은 표준 편차의 값의 히스토그램이다. 도 18의 (a) 및 도 18의 (b)에서 도시되는 바와 같이, Carbachol 투여 전후의 히스토그램을 정규 분포에 의해 근사하여 구한 그래프의 평균치 및 하프치 폭은 투여전에는 각각 0.478 및 0.109이고, 투여 후에는 각각 0.703 및 0.175이었다. 이와 같이, Carbachol 투여 전후에, 5 밀리초마다의 표준 편차치의 평균치가 증가하고 있는 것이 확인되었다. 이것은 Carbanchol을 투여함으로써 사용하여, 림나에아 스타그날리스 신경 세포의 이온 채널이 활성화되어, 그 활성화된 채널의 개폐에 의한 활동 전위의 변동이 나타나 있기 때문이다.
도 19에, 종래의 세포 내 기록법을 사용할 수 있는 데이터에 동일한 신호 처리를 가하였을 때의 5 밀리초마다의 표준 편차치의 히스토그램을 도시한다. 도 19로부터, 세포외 기록법에 의한 측정 결과는 세포 내 기록법에 의한 것과 동일한 결과인 것을 알 수 있다.
이와 같이, 본 발명 방법에 의해, 종래의 세포 내 기록법을 행하지 않더라도, 간편하게 이온 채널의 개폐에 따른 세포 활동, 및 그 변화를 측정할 수 있는 것이 나타났다. 따라서, 본 발명에 의해, 이온 채널 활성도의 측정, 및 세포로의 약품 투여의 전후 또는 그 투여량에 대한 이온 채널 활성도의 절대치나 채널 활성도의 증감을 비교함으로써 사용하고, 약품의 작용 효과의 정성적 또는 정량적인 분류를 하는 것이 가능하다.
(실시예 5)
평활근 세포의 Ca 이온 채널의 활성은 노레피네프린 10μm 자격 시에, 니페디핀에 의해 농도 의존적으로 저해되는 것이, 세포 내 기록법 등에 의해서 확인되어 있다. 세포 내 기록 데이터에 의한 니페디핀의 저해 효과는 표준 편차 그룹의 정규분포의 평균치의 기준치로부터의 변화량(상대적 이동치)과, 하프치 폭의 기준치로부터의 변화량(상대적 넓어짐)의 2개의 변수에 의해 표시되어 플롯된다. 도 20에 그 플롯을 도시한다. 도 20의 원이 변화하는 농도(0.03 내지 30μm)의 니페디핀의 플롯이다.
이 세포 내 기록에 의한 니페디핀의 Ca 이온 채널에 대한 효과를 데이터 베이스로 하여, 상기 실시예 4와 마찬가지로, 세포외 기록으로 측정한 2종류의 Ca 채널 저해약(A 및 B)의 작용 효과의 분류를 시도하였다. A 및 B의 농도를 0.03 내지 30μM의 범위에서 변화시켜, 실시예 4와 동일한 방법으로, 세포의 이온 채널 활성도를 측정하였다. 얻어진 결과를, 니페디핀과 동일하게, 표준 편차 그룹의 정규 분포의 평균치의 기준치로부터의 변화량(상대적 이동치)과, 하프치 폭의 기준치로부터의 변화량(상대적 확장치)의 2개의 변수에 의해 표시되어 플롯하였다. 도 20에 도시하는 삼각이 화합물(A)에 대한, 그리고 도 20에 도시하는 사각이 화합물(B)에 대한 측정결과의 플롯이다. 도 20에 도시되는 바와 같이, 화합물(A; 삼각)은 니페디핀(원)과, 측정된 농도 범위에 있어서, 농도 의존적이고 거의 동일한 거동을 나타내고, 니페디핀과 동일한 Ca 이온 채널 조해제라고 추정되었다. 이것에 대하여, 화합물(B)은 상기 상대적 이동치 및 상대적 확장치는 거의 변화가 없기 때문에, 평활근 세포에는 존재 하지 않는 타입의 Ca 이온 채널 블로커일 가능성이 높다.
이와 같이, 본 방법에 의해, 미지의 약제 효과를 추정하는 것이 가능하다. 더욱이, 예를 들면 도 20에서 도시하는 바와 같이, 상기 상대적 이동치 및 상대적 확장치에 대하여, 각각의 변화량이 5% 이내를 나타내는 원을 임계치(결국, 이 원의 속에 플롯되는 측정치를 주는 농도, 또는 약제 효과가 없다고 판정된다)로서 약제평가를 하면, 효율적으로 약품 스크리닝을 행할 수 있다.
상기 예에서는 정규 분포의 평균치의 기준치로부터의 변화량 및 하프치 폭의 기준치로부터의 변화량을 이용하였지만, 표준 편차와 분산이 대응하는 파라미터를 이용하여 약제의 작용 효과를 추정하여도 좋다.
이상과 같이, 본 발명에 있어서는 기준 전극 및 측정용 전극의 배치 환경 또는 특성이, 생체 시료의 전기적 특성의 변화를 특징짓도록 적합되어 있기 때문에, 세포 및 조직과 측정용 디바이스 사이에 고저항의 시일드(기가 시일드)를 형성하지 않더라도, 생체 시료의 전기적 변화를 계측할 수 있다. 더욱이, 본 발명에 있어서는 생체 시료의 전기적 특성의 변화를 검출하는 공정, 대표적으로는 일정한 샘플링 속도로 들어간 디지탈 신호(소정의 시계열 데이터)를 처리하기 때문에, 노이즈 중에서 이온 채널의 개폐를 대표하는 유의 신호를 추출, 측정 및 분류할 수 있다.
또, 상기 실시예에서는 도 13 또는 도 14에 개략을 도시하는 장치를 사용하였지만, 이것 대신에, 도 15 또는 도 16에 개략을 도시하는 구성의 장치를 사용하여도 좋다.
도 15에 도시하는 장치는 도 14에 도시하는 장치에 더하여, 참조 번호(111)로 도시되는 샘플수 배분부를 구비한다.
도 16에 도시하는 장치는 도 14에 도시하는 장치에 있어서, 본 발명의 센서 기판을 구비한 신호원(101)을 복수 구비하고, 또한 이들의 신호부에 자격(刺激)을 주는 신호 발생부(104)를 구비한다.
또한, 상기 각 실시예 1 내지 실시예 5는 본 발명의 장치 및 방법의 유용성을 증명하기 위해서 이루어진 일 예에 지나지 않고, 주는 화합물 및 산소 농도 등은 특히 한정되는 것은 아니다.
이상, 본 발명을 실시예를 참조하여 설명하였지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 취지를 일탈하지 않는 범위 내에서, 당업자의 지식에 기초하여 잡다한 개량, 수정, 변형을 가한 예로 실시할 수 있다.
본 발명의 디바이스를 이용함으로써, 세포의 전기 생리학적 평가를 간이하고 고속으로 게다가 자동적으로 행하는 장치가 제공된다. 그 장치는 약품 스크리닝등에 적용 가능하다.
본 발명의 디바이스는 종래의 고도한 기술을 요하는 패치 클램프법이나 시험공정이 많고 S/N 비가 나쁜 형광 색소법의 결점을 극복한다. 본 발명의 디바이스를 이용함으로써, 간단하게 고속으로 약품 후보 화합물을 스크리닝할 수 있는 장치를 제공하여, 종래의 약품 스크리닝에 요하는 시간을 극적으로 단축할 수 있다. 더욱이, 고도한 특수 기술을 필요로 하지 않고, 본 장치가 자동적으로 데이터 수집과 신호 처리를 하기 때문에, 누구나 간단하게 세포외 전위 측정을 할 수 있다.
종래, 검출하는 것이 불가능한 세포외 기록에 의한 신호로부터, 세포의 이온 채널의 개폐에 동반하는 전기적 변화를, 유의한 신호로서 추출하는 측정 방법 및 장치가 제공된다. 전용의 제어 장치를 필요로 하지 않는 간이한 측정 프로브(센서 기판)에 의해, 다량의 생물 시료를 한번에 단시간에 측정할 수 있는 방법, 및 장치가 제공된다. 이들의 장치 및 방법으로서는 측정에 화학 물질 및 형광 물질을 이용하지 않기 때문에, 화학 물질의 부작용, 형광 감도가 경시 변화를 고려할 필요가 없다. 측정되는 세포외 기록은 세포 전체에 걸친 매크로인 채널 활성도의 지표가 되고, 고속으로 약품을 스크리닝하는 데 적용 가능하다.

Claims (38)

  1. 기판 상에 설치된, 세포 보유 수단을 구비한 적어도 1개의 웰과, 상기 적어도 1개의 웰의 각각의 전기 신호를 검출하는 측정용 전극과, 기준 전극을 구비하는, 세포외 전위 측정용 디바이스.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포 보유 수단이 상기 웰 내에 설치된 적어도 1개의 오목부로서, 그 저면에 세포 흡인 수단에 연결되는 관통 구멍을 갖는 오목부인, 세포외 전위 측정용 디바이스.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 측정용 전극이 상기 관통 구멍을 통하여 상기 웰에 연결되는 공간 내에 배치된, 세포외 전위 측정용 디바이스.
  4. 제 2 항에 있어서,
    상기 오목부의 개구부에 의해서 세포를 밀착하여 보유하는, 세포외 전위 측정용 디바이스.
  5. 제 3 항에 있어서,
    상기 오목부의 개구부가 10 내지 50 μm의 직경을 갖고, 상기 관통 구멍의 직경이 약 2 내지 10 μm인, 세포외 전위 측정용 디바이스.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 기판이 실리콘 웨이퍼, 테플론, 폴리스틸렌 및 폴리카보네이트로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 재료로 형성된, 세포외 전위 측정용 디바이스.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 기판이 절연 기판으로서, 세포 흡인 수단을 더 구비하는, 세포외 전위 측정용 디바이스.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포를 배양하기 위한 웰이 실리콘, 플라스틱, SiO2, 고무로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 재료로 형성되는, 세포외 전위 측정용 디바이스.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 기준 전극이 링형인, 세포외 전위 측정용 디바이스.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 기준 전극이 도전성 재료로 형성되는, 세포외 전위 측정용 디바이스.
  11. 제 7 항에 있어서,
    상기 절연 기판이 직경 6 μm의 관통 구멍을 구비하는, 세포외 전위 측정용 디바이스.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 절연 기판이 지지층을 구비하고, 상기 지지층이 적어도 10 μm의 두께의 SOI 기판인, 세포외 전위 측정용 디바이스.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 지지층이 실리콘, 플라스틱, 또는 SiO2로 형성되는, 세포외 전위 측정용 디바이스.
  14. 제 11 항에 있어서,
    상기 지지층의 두께가 1 μm 이상인, 세포외 전위 측정용 디바이스.
  15. 제 7 항에 있어서,
    상기 세포 흡인 수단이, 상기 세포 흡인부의 두께가 10 μm 이상의 실리콘,플라스틱, SiO2, 또는 고무로 형성되는, 세포외 전위 측정용 디바이스.
  16. 제 1 항에 있어서,
    상기 오목부의 내면이 친수성 처리된, 세포외 전위 측정용 디바이스.
  17. 세포외의 전위를 측정하는 방법으로서,
    생체 시료의 전기적 특성을 측정하는 반응계를 제공하는 공정,
    상기 반응계에 상처가 없는 목적 세포를 배치하는 공정, 및
    상기 목적 세포의 전기적 특성을 검출하는 공정을 포함하고;
    상기 반응계가, 기판 상에 설치된 세포 보유 수단을 구비한 적어도 1개의 웰과, 상기 적어도 1개의 웰의 각각의 전기 신호를 검출하는 측정용 전극과, 기준 전극을 구비하는 세포외 전위 측정용 디바이스인, 세포외 전위 측정 방법.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 전기적 특성을 검출하는 공정이 상기 목적 세포의 상태를 전기적 특성으로서 적어도 2회 검출하는 공정, 및 검출된 상기 전기적 특성 중 적어도 2개를 비교하는 공정을 포함하는, 세포외 전위 측정 방법.
  19. 제 17 항에 있어서,
    상기 측정용 전극이 배치되는 영역의 용적이 상기 기준 전극에 배치되는 영역의 용적보다도 작은, 세포외 전위 측정 방법.
  20. 제 17 항에 있어서,
    상기 기준 전극의 표면적이 상기 측정용 전극의 표면적보다 작은, 세포외 전위 측정 방법.
  21. 제 17 항에 있어서,
    상기 측정용 전극의 임피던스가 상기 기준 전극의 임피던스보다 낮은, 세포외 전위 측정 방법.
  22. 제 17 항에 있어서,
    상기 측정용 전극의 10Hz로부터 10kHz에서의 임피던스가 상기 기준 전극의 10Hz로부터 10kHz에서의 임피던스보다 작은, 세포외 전위 측정 방법.
  23. 제 17 항에 있어서,
    상기 기판이 절연 기판이고, 상기 세포 보유 수단이 전해액에 침지되는 상기 절연 기판에 배치된 관통 구멍이고, 상기 관통 구멍 상에 목적 세포가 배치될 때, 상기 기준 전극이 상기 목적 세포가 배치되는 상기 절연 기판의 측면 근방에 배치되며, 상기 측정용 전극이 상기 절연 기판의 대향하는 측면 근방에 배치되고, 상기기준 전극이 침지되는 전해액의 양과 상기 측정용 전극이 침지되는 전해액의 양이 다른, 세포외 전위 측정 방법.
  24. 제 23 항에 있어서,
    상기 기준 전극이 침지되는 전해액의 양이 상기 측정용 전극이 침지되는 전해액의 양의 5배 이상인, 세포외 전위 측정 방법.
  25. 제 17 항에 있어서,
    상기 기판이 절연 기판이고, 상기 세포 보유 수단이 상기 절연 기판에 배치된 관통 구멍이고, 상기 관통 구멍 상에 목적 세포가 배치될 때, 상기 기준 전극이 상기 목적 세포가 배치되는 상기 절연 기판의 측면 근방에 배치되고, 상기 측정용 전극이 상기 절연 기판의 대향하는 측면 근방에 배치되고, 상기 기준 전극의 전극 면적과 상기 측정용 전극의 전극 면적이 다른, 세포외 전위 측정 방법.
  26. 제 25 항에 있어서,
    상기 기준 전극의 전극 면적이 상기 측정용 전극의 면적의 1/5 이하인, 세포외 전위 측정 방법.
  27. 제 17 항에 있어서,
    상기 기판이 절연 기판이고, 상기 세포 보유 수단이 상기 절연 기판에 배치된 관통 구멍이고, 상기 관통 구멍 상에 목적 세포가 배치될 때, 상기 기준 전극이 상기 목적 세포가 배치되는 상기 절연 기판의 측면 근방에 배치되고, 상기 측정용 전극이 상기 절연 기판의 대향하는 측면 근방에 배치되고, 상기 기준 전극의 임피던스와 상기 측정용 전극의 임피던스가 다른, 세포외 전위 측정 방법.
  28. 제 27 항에 있어서,
    상기 기준 전극의 임피던스가 상기 측정용 전극의 임피던스의 5배 이상인, 세포외 전위 측정 방법.
  29. 제 17 항에 있어서,
    상기 기준 전극의 목적 세포로부터의 거리가 상기 측정용 전극의 목적 세포로부터의 거리보다 긴, 세포외 전위 측정 방법.
  30. 제 17 항에 있어서,
    상기 세포외 전위 측정용 디바이스가 기준 전극 면적:측정용 전극 면적= 1:5, 기준 전극 임피던스:측정용 전극 임피던스 = 5:1, 또는 기준 전극이 침지되는 전해액의 용적:측정용 전극이 침지되는 용적 = 5:1이도록 구성된, 세포외 전위 측정 방법.
  31. 제 17 항에 있어서,
    상기 세포 외의 전위가 세포의 이온 채널 또는 수용체의 활성화, 또는 세포 내 신호 전달계의 작동에 수반하는 신호인, 세포외 전위 측정 방법.
  32. 제 17 항에 있어서,
    상기 전기적 특성을 검출하는 공정이, 상기 목적 세포에 대한 작용이 이미 알고 있는 표준 화학 물질의 존재 하에서 행하는 공정, 및 피험체 화학 물질의 존재 하에서 행하는 공정을 포함하고,
    상기 표준 화학 물질의 존재 하 및 피험체 화학 물질의 존재 하에서 얻어진 전기적 특성을 비교하여, 상기 피험체 화학 물질의 상기 생체 시료에 대한 작용을 특성화하는 공정을 더 포함하는, 세포외 전위 측정 방법.
  33. 제 17 항에 있어서,
    상기 목적 세포를 배치하는 공정이,
    상기 웰에 측정 용액을 도입하는 공정과,
    상기 웰과, 상기 웰에 연결되는 관통 구멍의 웰과 대향하는 개구부와의 사이에 압력차를 생성하는 공정, 및
    상기 압력차를 10분의 1 이하의 크기로 하는 공정을 포함하는, 세포외 전위 측정 방법.
  34. 제 33 항에 있어서,
    상기 압력차를 생성하는 공정이 상기 개구부를 통하여 감압함으로써 달성되는, 세포외 전위 측정 방법.
  35. 제 33 항에 있어서,
    상기 압력차를 생성하는 공정이 상기 웰을 가압함으로써 달성되는, 세포외 전위 측정 방법.
  36. 제 33 항에 있어서,
    상기 압력차를 생성하는 공정이 상기 개구부를 통하여 감압하는 공정 및 상기 웰을 가압하는 공정에 의해 달성되는, 세포외 전위 측정 방법.
  37. 제 33 항에 있어서,
    상기 압력차가 0.01 ~ 0.5 atm인, 세포외 전위 측정 방법.
  38. 청구항 1의 기재의 세포외 전위 측정용 디바이스, 상기 세포외 전위 측정용 디바이스의 측정용 전극에 연결되는 전기 신호 검출부, 및 신호 처리 수단을 구비하고, 상기 신호 처리 수단이 상기 전기 신호 검출부로부터의 복수의 전기 신호를 처리하여 세포의 활동 상태를 표시하는, 고속 약품 스크리닝 장치.
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