KR20140084139A

KR20140084139A - 임피던스 스펙트럼 및 필드 포텐셜의 병렬 기록을 위한 장치 및 방법

Info

Publication number: KR20140084139A
Application number: KR1020147012275A
Authority: KR
Inventors: 안드레아 로비츠키; 하인즈- 게오르그 얀케; 로니 아젠도르프
Original assignee: 우니베르지태트 라이치히
Priority date: 2011-10-14
Filing date: 2012-08-13
Publication date: 2014-07-04
Also published as: JP6138805B2; WO2013053513A1; US20140346058A1; JP2014533933A; US9551681B2; EP2766724B1; EP2766724A1; KR101993943B1; EP2581742A1

Abstract

본 발명은 생체 외(in vitro) 세포의 임피던스 스펙트럼 및 필드 포텐셜의 병렬 기록을 위한 장치 및 방법에 관한 것이다.

Description

임피던스 스펙트럼 및 필드 포텐셜의 병렬 기록을 위한 장치 및 방법{Device and Method for parallel recording of impedance spectra and field potential}

복잡한 병리학 메커니즘을 감안하여, 알츠하이머 병(AD), 파킨슨 병, 다발성 경화증(MS), 소 스펀지상 뇌증(BSE), 크로이츠펠트 야콥 병(CJD) 및 다양한 망막 변성증과 같은 신경퇴행병에 대한 약물 개발 프로그램은 대부분 전체 동물 모델에 주로 의존하고 있으나, 이는 매우 고비용이고, 노동력과 시간을 소모하는 것이다. 약효 또는 병리학적 메커니즘의 분석은 대부분 면역세포화학적, 분자생물학적, 및/또는 단백질화학적(proteinchemical)인 것과 같은 세포파괴적인 (cell-destructive) 방법에 의해 수행된다.

생체전자 센서 및 센서 어레이를 사용하여 세포 상의 변화를 비표지(label-free) 탐지하며 실시간 모니터링하는 것은 활성약품성분(active pharmaceutical ingredients, API) 개발, 약물 안전 진단뿐만 아니라 개인화된 의약품의 영역과 특히 관련된 진단 목적의 분야에서 떠오르는 기술이다. API 개발은 많은 비용과 시간을 소모하는 과정이며, 특히 신경퇴행성(예를 들면 알츠하이머병) 및 심장혈관 질환과 같이 복잡하고 다원적인 병에 대해서는 종종 임상 연구에서 높은 실패율로 귀결된다. 따라서 초기 화합물 검사(initial compound screenings)와 (사전)임상 시험 사이에 병목이 존재하는데, (사전)임상 시험에는 초기 개발 단계에서 약효와 관련하여 가장 적절하며 원하지 않는 부작용을 최소로 갖는 화합물을 식별하기 위하여, 고효율 및 고집적 스크리닝(high-throughput and high content screenings, HTS/HCS)에 사용하기에 적합하며 복잡한 질병에 대해 특정한 경로 메커니즘을 개괄할 수 있는 세포/조직 기반 모델이 매우 크게 요구된다.

오늘날의 세포 및 조직 기반 스크리닝 접근법의 주요한 단점은 종종 그 판독능력(대상 제한 등) 내로 제한되는 고전적인 종말점 검정분석(end-point assays)의 사용이다. 이러한 단점을 극복하기 위하여 세포에 영향을 주지 않으면서 세포 상의 변화를 실시간으로 모니터링하기 위한 비표지 검출 기술을 확립하기 위한 강력한 활동이 있어왔다. 두 가지 주요한 생체전자공학 기술, 전기 임피던스 분광학(electrical impedance spectroscopy, EIS) 및 전기생리학적 기록(electrophysiological recording, EPR)이 제약 산업의 스크리닝 플랫폼에서 사용하기에 유망한 기술이다.

임피던스 분광학-또한 세포 유전 분광학(cellular dielectric spectroscopy, CDS) 또는 전기 임피던스 분광학으로도 알려져 있다-은 정해진 교류 전류 및/또는 전압을 인가함으로써 단일 세포의 비활성 전기특성의 주파수 의존 변경을 측정하는 데 사용될 수 있다. 임피던스 분광학이 비침습적 방법이기 때문에, 세포 작용에 영향을 주지 않으면서 장기간의 측정이 구현될 수 있다. 그러므로, 세포의 판독은 복잡하고 오래 지속되는 물리적 과정에 기인한 효과를 방해하지 않고 실시간 조건을 반영한다. 이 방법은 넓은 범위의 생물학적 및 의학적 문제를 연구하는 데 적절하다. 임피던스 분광학은 예를 들면 EP 2 103 933 A1에 더 자세히 논의되어 있다.

전기생리학적 기록(EPR)은 일반적으로 생물학적 세포 및 조직의 전기적 특성의 연구이다. 이는 단일 이온 채널로부터, 전체 세포 내지 전체 기관에 이르기까지 넓은 범위의 척도에 대한 전압, 전압 변화 또는 전류의 측정을 수반한다. 이는, 예를 들면, 뉴런의 전기적 활성의 측정, 특히 활동 전위(active potential) 기능(activity)의 측정을 가능하게 한다. 세포 밖의 필드 포텐셜은 세포 바깥쪽의 세포, 예를 들면, 신경 또는 근육 세포에 의해 생성된 전위이다. 이러한 전위는 일qks적으로 세포 밖 마이크로 전극에 의해 측정된다.

현저한 이점에도 불구하고, 기존의 스크리닝 기술의 적용이나 교체의 과정은 단일 세포 또는 조직 시료로부터 최대한으로 가능한 광범위한 정보를 얻기 위하여 판독 플랫폼을 최적화하는 것에 의하여 완화될 수 있는 어려운 과정이다. 따라서 EIS 및 EPR과 같은 탐지 기술의 결합은 새로운 고용량 스크리닝 플랫폼에 대한 이점을 매우 증가시킬 수 있다. 또한, 기존의 스크리닝 시스템 내에서, 주로 광학/형광 판독에 기반한, EIS 및 EPR의 두 기술 플랫폼을 통합하는 것은, API 개발 플랫폼을 현저히 개선할 수 있으며, 단일 세포/조직 시료로부터의 정보 출력을 또한 증가시킬 수 있다.

API 개발뿐 아니라, EIS 및 EPR 기술의 통합은 위험도 평가 및 약물 안전성 시험에서 실질적인 개선을 나타낸다. 시장에 판매될 때 해로운 부작용(예를 들면, 심장부정맥)을 나타내는 치료약의 승인을 최소화하기 위하여, 새로운 치료학의 승인이 더 제한적인 규제 정책(FDA, EMA)에 의존하고 있기 때문에, 특히 심장독성의 분야에서 안전성 시험을 개선하기 위한 많은 요건이 있다. 이러한 요건은, 예를 들면, 자동화된 패치 클랩 플랫폼(automated patch clap platforms)의 개발 및 EPR을 위한 마이크로 전극 어레이 기반 시스템의 개발에 대한 활성화를 이끌고 있다. 이 분야에서, 다수의 비표지 실시간 모니터링 기술의 결합은 전기생성 세포에 대한 독성/부작용의 더 포괄적인 이해를 얻기 위하여 동일한 시료로부터 다른 검출 방법에 의해 획득된 데이터를 사용함으로써 시험된 API/화합물/화학물질의 안전성을 개선할 수 있다.

임피던스 분광학(EIS) 및 전기생리학적 기록(EPR)은 모두 세포 변화의 비표지 검출 및 실시간 모니터링에 적합한 기술이다. 이러한 기본적인 방법을 HTS/HCS 플랫폼, 특히 자동화된 스크리닝 플랫폼의 필요조건인 96- 및 384- 웰 포맷의 타이터 플레이트(titer plate)와 ANSI 호환가능한 것에 대해 적용할 수 있는 시스템/장치로 개발하기 위한 다양한 시도가 있었다. EIS 시스템은 예를 들면, WO2004/010103 A2, DE202005007547 U1 또는 WO2006/104839 A2에 기재되어 있다. 개시된 시스템은 멀티웰 어레이로 설계되어 있으며, 표준 96 웰 ANSI 포맷에서 사용할 수 있고, 부분적으로 시판되고 있다. 모든 이러한 장치는 임피던스 측정에 대해 최적화된 두 개의 전극 구성으로 기재되어 있으며, 이는 전극의 자체 임피던스를 낮추기 위하여 최대화된 전극 영역을 의미하며, 주로 서로 맞물린(interdigitated) 전극으로 구현된다.

다수의 EPR 다중전극 어레이 시스템 및 개발이, 심근세포(예를 들면 Rothermet et al.,Cell PhysiolBiochem, 16: 51-58 (2005)) 및 뉴런(예를 들면 Berdichevsky et al.,J Neurosci Methods 178(1): 59-64 (2009))을 의미하는 전기생성 세포(electrogenic cells)에 대해 기술되어 있다. EIS 시스템이 주로 두 개의 큰 영역을 갖는 전극 시스템에 의해 구현되는 것에 반해, EPR 시스템은 일반적으로 단일 배양 유닛 내에서 높은 신호 대 잡음 비로 국지적인 필드 포텐셜을 기록하기 위하여 거의 세포 크기의 치수를 갖는 마이크로 전극을 요구한다. 따라서 이 시스템은 일반적으로 다중전극 어레이로 설계된다. 다중전극 어레이의 사용은 심근세포에 대한 여기 라우팅(excitation routing) 및 지체(retardation)에 관한 정보를 얻기 위하여 바람직하며, 자발적인 또는 자극에 의한 뉴런 네트워크 기능을 모니터링하기 위한 필요조건이다.

고속 임피던스 분석기가 WO 2009/137440에 기재되어 있다. 개시된 구성은 심장근육의 박동 주파수에 대한 약물의 단기 효과를 연구하기 위해 사용하는 EIS 측정을 위한 대형의 서로 맞물린 전극을 포함한다. EPR 측정은 이 문서에서 언급되어 있지 않다. 이에 따라, 이 시스템에 의해 획득된 데이터는 지역 및 시간 해상도(심장근육에 대해 4kHz 및 뉴런에 대해 일반적으로 40kHz에 이르는)에 관해 EPR 신호로부터 얻을 수 있는 정보와 비교할 수 없다. EPR 신호만이 이온 채널의 형태 및 특정 상태에 관련된 정보를 제공할 수 있다. 또한, 이 방법은 대형의 서로 맞물린 전극으로부터 신호가 기록되고 이에 따라 챔버/웰 내의 전체 배양에 대한 평균 신호만이 얻어지기 때문에 심장근육에 제한된다. 이는 단일 활성 뉴런의 국지적인 필드 포텐셜의 기록을 위하여 높은 공간 해상도가 요구되는 뉴런 네트워크에 대한 사용을 방해한다.

EPR 측정을 위해서는, EIS에 사용되는 대형의 서로 맞물린 전극 대신 1000 μm² 아래의 범위 내의 콘택 영역을 갖는 마이크로 전극이 사용된다. 이러한 전형적인 EPR 마이크로 전극은 높은 자체 임피던스 때문에 EIS 시스템에서는 난제가 되며, 모니터되는 세포 및 조직으로부터 적합한 신호를 얻기 위하여 고민감도를 제공하는 고정밀 임피던스 분석기를 요구한다. 이러한 기술적인 한계 때문에, EPR 및 EIS 양자를 단일 센서 어레이로 통합하는 것은 지금까지 각 검출 방법에 대한 별도의 전극 세트, 특히 EIS를 위한 서로 맞물린 전극 및 EPR을 위한 하나 이상의 마이크로 전극에 의해 구현되었다.

Xiao et al. (Biosensors and Bioelectronics 26: 1493-1499, (2010))은 이중 기능 세포외 바이오칩(dual functional extracellular biochip)을 사용하여 심장근육에 대한 독소루비신(doxorubicin) 독성을 평가하였다. 이 문서에 기술된 바이오칩 "Excell" 은 EIS를 위한 서로 맞물린 전극 및 EPR 측정을 위한 마이크로 전극 양자를 포함한다. 그러나, 이 문서에 기재된 바와 같이, 세포외 필드 포텐셜 및 세포-전극 임피던스의 모니터링을 위한 시스템 내에서, 임피던스 측정을 위해 필수적인 자극 전압이 마이크로 전극 영역(microelectrode area, MEA) 측정 내에 전기적 교란을 일으켰다. 따라서, 검출 동작은 임피던스 검출 및 MEA 검출 사이에 상당히 긴 매개 시간(5분의 검출 사이클에 대해 약 1분)을 갖고 순차적으로 수행되었다.

이와 같이, Xiao et al. 에 의해 제안된 EIS 및 EPR 을 위해 별도의 전극과 별도의 측정 회로를 갖는 것조차 병렬 모니터링을 방해하는 측정의 간섭을 가져오며 상당히 긴 매개 시간을 갖고 두 방법을 모두 사용하는 것을 필수적으로 한다. 또한, 별도의 전극 세트는 EIS 및 EPR 측정의 각각에 의해 다른 영역의 세포, 세포 클러스터 또는 조직 시료가 조사되는 것을 의미한다.

지역적으로 및 시간적으로 동기화된 측정이 얻어질 수 있도록 EIS 및 EPR 을 단일 센서 어레이로 적절히 결합하는 것이 바람직하다. 특히, 동일한 세포, 세포 클러스터 또는 조직 시료에 대한 EIS 및 EPR 양자의 측정은 시료의 상태에 대한 더 완전한 정보를 밝힐 수 있을 것이다. 시간적으로 동기화된 측정은, 예를 들면 둘러싸고 있는 버퍼 용액에 약물을 추가하는 것과 같은 환경적 조건의 변경 이후의 시료의 상태에 대한 빠른 갱신을 얻기 위하여 바람직할 것이다.

그러므로, 상기한 문제점들을 극복하고 특히 임피던스 스펙트럼 및 EPR, 특히 전위의 양자를 지역적으로 및 시간적으로 동기화하여 기록하는 장치 및 방법을 제공하기 위한 요구가 이 분야에 존재한다.

본 발명은 세포, 특히 심장 세포 또는 신경 세포와 같은 흥분성 세포의, 생체 외, 임피던스 및 전위를 모니터링하는 시스템에 관한 것으로서, 상기 시스템은 상기 세포와 접촉하는 하나 이상의 전극 및 하나 이상의 기준 전극을 포함하는 세포-기판, 상기 전극 사이의 임피던스를 측정할 수 있는 장치(임피던스 분석기), 및 상기 전극 사이의 전위차를 측정하는 장치(포텐셜 분석기)를 포함한다. 시스템은 상기 전극을 임피던스 분석기 또는 포텐셜 분석기에 선택적으로 연결하는 스위치를 더 포함한다. 청구항에 특정된 것과 같이, 낮은 특정한 온 저항(on-resistance), 높은 오프 격리도(off-isolation) 및 높은 크로스톡 격리도(crosstalk isolation)를 갖는 스위치가 사용될 때, 종래기술에서 관찰된 것과 같은 전기적 간섭을 일으키지 않고 동일한 전극이 임피던스 분석기 또는 포텐셜 분석기에 선택적으로 연결될 수 있음이 발견되었다. 임피던스 분석기 및 포텐셜 분석기와 특히 분석기 사이에서 교대로 전극을 연결할 수 있는 여기에서 정의된 것과 같은 스위치를 포함하는 상기 시스템은 생체 외에서 조사하고자 하는 세포의 임피던스 스펙트럼 및 필드 포텐셜 양자를 기록하는 데 훌륭하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 시스템은, 일반적으로 하나 이상의 기록 챔버를 포함하는 세포-기판을 포함한다. 기록 챔버는 일반적으로 임피던스 측정 및 전위 측정 모두를 받기 위한 세포 또는 기관형적 조직(organotypic tissue)을 담고 있다. 기록 챔버는 또한 세포에 접촉하는 하나 이상의 전극과 하나 이상의 기준 전극을 포함한다.

측정 동안, 예를 들면 임피던스 측정 동안, 기준 전극은 일반적으로 배양 매체와 직접 접촉하거나 배양 매체와 직접 접촉하는 추가의 층을 가지고 있다. 추가 층은 폴리머 코팅일 수 있다. 바람직하게는 기준 전극은 배양 매체와 직접 접촉한다. 전극은 필요한 전기 전도도를 갖는 임의의 물질로 이루어질 수 있다. 임피던스 측정 및 전위 측정에 기반한 전극에 적합한 물질은 이 기술 분야에서 공지되어 있다. 바람직하게는 전극은 금, 백금, ITO(indium tin oxide), 은, 구리, 이리듐 또는 이의 합금으로 이루어진다. 사용되는 재료에 따라, 전극의 두께는 바람직하게는 10nm 내지 100μm 사이이며, 더 바람직하게는 50nm 내지 10μm 사이, 가장 바람직하게는 100nm 내지 1μm 사이이다. 사용되는 세포 타입/세포 배양 모델에 대하여 더 높은 민감도와 신호 대 잡음 비를 제공하기 위하여, 상기 세포에 접촉하는 전극의 크기는 바람직하게는 최대 1mm²이며, 더 바람직하게는 최대 10,000μm², 및 가장 바람직하게는 최대 500μm²이다. 기준 전극에 부착된 세포로부터의 세포 신호 기여를 최소화하기 위하여 기준 전극의 크기는 측정 전극보다 몇 자리수(several orders) 커야 한다. 따라서, 기준 전극의 크기는 상기 세포에 접촉하는 전극의 크기보다 일반적으로 크며, 예를 들면 바람직하게는 10배 크고, 더 바람직하게는 100배 크며, 특히 1000배 크다. 바람직하게는, 기준 전극의 크기는 적어도 5,000μm², 더 바람직하게는 적어도 100,000μm², 가장 바람직하게는 적어도 1mm² 또는 그 이상이다. 바람직하게는 기준 전극의 크기는 최대 50mm², 더 바람직하게는 최대 10mm², 예를 들면 최대 5mm² 또는 최대 2mm², 또는 그 이하이다.

전극은 통상 기록 챔버의 바닥에 부착되며, 기록 챔버는 바람직하게는 멀티웰 플레이트(multiwell plate) 또는 멀티웰 프레임(multiwell frame)에 의해 형성된다. 전극은 반도체 기술에 의하여 기록 챔버의 바닥에 증착될 수 있다. 전극은 예를 들면, 산화규소, 폴리에틸렌(PE), 유리 또는 이와 유사한 기판 상에 위치할 수 있다.

기준 전극 및 세포에 접촉하는 전극은, 예를 들면 보호층(passivation layer) 또는 국소 분리(local separation)와 같이, 이 기술분야에서 공지된 적절한 수단에 의해 전기적으로 서로 격리된다.

세포에 접촉하는 전극은 세포-기판, 즉 기록 챔버 바닥 상의 기준 전극 옆의 하나 또는 그 이상의 전극일 수 있으며, 특히 마이크로 전극 어레이일 수 있다. 또는, 세포에 접촉하는 전극은 스탬프 형태 또는 핀 형태를 갖는 추가의 전극일 수 있으며, 바람직하게는 둘 이상의 방향으로 움직일 수 있어, 세포, 기관형적 조직 또는 배양 매체와 접촉하거나 세포로부터 분리될 수 있다. 바람직하게는 상기 세포와 접촉하는 하나 이상의 전극이 마이크로 전극이며, 더 바람직하게는 상기 세포와 접촉하는 모든 전극이 마이크로 전극이다. 마이크로 전극은 바람직하게는 최대 10,000μm², 더 바람직하게는 최대 500μm²의 크기를 갖는다.

본 발명에 따른 바람직한 세포-기판, 즉 기록 챔버는 바람직하게는 시판되는 멀티웰 플레이트 또는 바닥이 없는(bottomless) 멀티웰 프레임을 포함한다. 또한 생체분자스크리닝학회(Society of biomolecular Screening, SBS)에 따른 표준 풋프린트(footprint) 다중 플레이트 포맷을 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 바람직하게는 본 발명에 따른 세포-기판은 표준 바닥이 없는 멀티웰 프레임, 즉, 384 기록 챔버를 포함하는 단일 384 웰 플레이트, 192 기록 챔버를 포함하는 192 플레이트 등에 기반한다. 사용되는 멀티웰 포맷에 따라, 웰 당 다른 수의 마이크로 전극이 세포-기판 내에 통합될 수 있다. 각 기록 챔버는 하나 이상의 기준 전극 및 하나 이상의 상기 세포와 접촉하는 전극을 포함한다. 따라서, 각 기록 챔버는 두 개 이상의 전극을 포함하는 웰 당 두 전극이 바람직하며, 예를 들면 384 멀티웰 플레이트의 웰에 대하여 384*2 전극이 된다. 이러한 구성에서 768 전기적 연결을 갖는 멀티웰 플레이트가 바람직하며, 이는 멀티웰 플레이트의 ANSI 요구조건과도 일치한다. 기록 챔버는 또한, 96 멀티웰 플레이트의 웰 당 2, 4, 또는 8개의 전극을 가질 수 있으며, 또는 48 멀티웰 플레이트의 웰 당 16 마이크로 전극을 가질 수 있다. 전극 어레이 크기는 적절한 웰 크기에 적응될 수 있다.

본 발명에 따른 시스템의 세포-기판은 일반적으로 기록 챔버의 전극, 연결 패드 등이 증착되는 기판을 포함한다. 전극, 컨덕터 및 연결 패드가 그 위에 증착된 결과 기판은, 일반적으로 멀티웰 어레이의 형태이다. 기판은 유리, 석영 유리, 붕규산 유리(borosilicate glass), 실리콘, 세라믹, 고분자, 폴리메틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티롤, 폴리에스테르, 폴리카보네이트 또는 전극 및 컨덕터를 증착하기에 적합한 임의의 다른 재료로 이루어진다. 기판의 두께는 일반적으로 약 100μm 내지 수 mm, 예를 들면, 0.1mm 내지 2mm의 범위 내이며, 그 준비를 위해 사용되는 요구 재료에 의존한다. 유리가 기판으로 사용되면 그 두께는 1mm 이하로부터 수 mm까지 변할 수 있다. 기판이 고분자인 경우, 그 위에 전극이 증착될 수 있는 수백 μm의 얇은 막이 사용될 수 있다. 전극, 컨덕터 및 연결/접지 패드는 바람직하게는 하부 기판에 통합된다. 추가로, 기판은 전기적 구성을 보호하기 위하여 그 표면에 얇은 막을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 시스템은 바람직하게는 초 범위, 더 바람직하게는 밀리초 범위, 가장 바람직하게는 마이크로초 범위의 고 시간해상도 임피던스 측정을 할 수 있는 시판 또는 주문제작 임피던스 분석기 시스템을 포함한다. 임피던스 분석기는 바람직하게는 100mV 이하의 낮은 전압 수준에서 임피던스를 측정하기에 적합한 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 15mV 이하, 가장 바람직하게는 10mV이하이다. 이는 시료에 대한 최소한의 영향을 보장한다. 또한, 적절한 신호 대 잡음 비를 보장하기 위하여 임피던스 분석기는 500Hz에서 100kOhm 내지 1MOhm의 범위의 높은 자체 임피던스를 나타내는 마이크로 전극에서 바람직하게는 0.1% 이상의 정확도로 이러한 전압 수준의 임피던스 측정을 수행하기에 적합하여야 한다. 이러한 장치는 이 기술분야에서 공지되어 있다. 적합한 임피던스 분석기는, 예를 들면, ScioSpec Scientific Instruments GmbH로부터 입수할 수 있으며, 예를 들면, ScioSpecICX-5 또는 ScioSpec SCX-3이다. 적절한 성능을 갖는 다른 임피던스 분석기는, 예를 들면, Agilent 4294A (Agilent Technologies) 및 Solartron 1260A+1296A high impedance dielectric interface (Solartron Analytical)이다. 일반적으로, 임피던스 분석기는 예를 들면 개인용 컴퓨터 시스템과 같은 데이터 처리 시스템에 연결된다.

본 발명에 따른 시스템은 또한 전극 사이의 전위차를 측정하기 위한 장치, 즉 포텐셜 분석기와 연결되며, 이는 바람직하게는 초 범위, 더 바람직하게는 밀리초 범위, 및 가장 바람직하게는 마이크로초 범위의 높은 시간 해상도를 갖는다. 적합한 포텐셜 분석기는, 예를 들면, 고속 전압계, 바람직하게는 멀티채널 변압계이며, 일반적으로 아날로그-디지털 변환기(ADC)에 기반한다. 각 채널, 즉 각 전극에 대하여 하나의 ADC가 사용될 수 있으며, 바람직하게는, 다수의 채널이 하나의 ADC로 다중화된다. ADC에 대한 일반적인 샘플링률은, ADC 당 채널의 수에 의존하며, 적어도 1MHz 또는 그 이상이며, 바람직하게는 2MHz 이상, 더욱 바람직하게는 10MHz 이상, 특히 100MHz 이상이다. 바람직하게는 디지털화 해상도는 12비트 이상이며, 더 바람직하게는 14비트, 더욱 바람직하게는 16비트, 특히 24비트이다. 적합한 아날로그-디지털 변환기는 이 기술분야에서 공지되어 있으며, Analog Devices (AD 7667, AD 7626, AD 9446) 또는 Texas Instruments (AD 5482)에 의해 입수할 수 있다.

바람직한 실시예에서 본 발명에 따른 시스템은 추가로 다중화기(multiplexer)를 포함하며, 이는 바람직하게는 임피던스 분석기에 연결된다. 다중화기는 다중화를 수행하는 장치이다. 다중화는 상기 세포에 접촉하는 각 전극, 예를 들면, 각 웰이 임피던스 분석기에 연결되는 것이 필요하지 않도록 상기 세포에 접촉하는 둘 이상의 전극을 하나의 임피던스 분석기에 연결하는 것을 의미한다. 상기 세포에 접촉하는 다수의 전극, 예를 들면, 96 멀티웰 플레이트, 192 멀티웰 플레이트, 또는 384 멀티웰 플레이트의 각 전극이 병렬로 측정될 때, 다중화기의 사용이 일반적으로 적합하다. 다중화기는 일반적으로 시분할 다중화에 기반하며, 즉 임피던스 분석기를 상기 세포에 접촉하는 전극에 차례로 연결한다. 다중화기가 임피던스 분석기의 측정 경로 상에 위치한 전자 회로 요소이므로, 다중화기는 가능한 한 낮은 신호 변경(왜곡)을 제공하는 것이 바람직하다. 특히, 100mV 이하, 특히 15mV 이하, 예를 들면 10mV 이하의 전압 범위 내에서, 500Hz에서 적어도 1kOhm 내지 10MOhm 범위, 더 바람직하게는 100kOhm 내지 1MOhm의 범위의 자체 임피던스와 10^-7 내지 10^-10 암페어 범위의 전류 흐름을 갖는 전극의 신호가 다중화되어야 한다. 다중화기는 바람직하게는 10 Ohm 이하, 더 바람직하게는 2 Ohm 이하, 특히 0.5 Ohm 이하의 온 저항을 갖는다. 바람직하게는, 오프 격리도는 -60dB 이하이며, 바람직하게는 -75dB 이하, 특히 -90dB 이하이다. 바람직하게는, 크로스톡(channel-to-channel)은 -60dB 이하이며, 바람직하게는 -75dB 이하, 특히 -90dB 이하이다. 또한, 다중화기는 빠른 스위칭 성능을 제공하여야 하는데, 바람직하게는 마이크로초 시간 범위 내이다. 바람직하게는 스위칭 시간은 100ns 이하여야 하며, 특히 50ns 이하이다. 적합한 장치는 예를 들면 Analog Devices, USA의 ADG731 또는 ADG725이다.

스크리닝 동안 세포에 대해 적합한 환경을 제공하기 위하여, 특히 세포에 대한 화합물(약물 또는 독성 성분)의 시험에 대하여, 본 출원에 따른 시스템은 추가로 습한 환경(humidified atmosphere)(예를 들면, 37℃, 5% CO2, 95% 공기)을 또한 제공하는 자동화된 액체 취급 시스템을 더 포함할 수 있다. 적합한 액체 취급 및 로봇 시스템은 예를 들면, Freedom EVO^®, TECAN Trading AG (Switzerland); Biomek FX systems, Biomek^®Assay Workstation, Beckmann Coulter, 또는 Biorobot 8000, Qiagen이다.

본 발명에 따른 시스템은 전극을 임피던스 분석기 또는 포텐셜 분석기에 선택적으로 연결하는 스위치를 더 포함한다. 상기 스위치는 대향 전극 및 상기 세포에 접촉하는 전극을 제1 스위칭 상태에서 임피던스 분석기에 연결하기에 적합하여야 한다. 이는 대향 전극이 임피던스 분석기의 대향 전극 입력에 연결되고 상기 세포에 접촉하는 하나 이상의 전극이, 바람직하게는 다중화기를 통하여, 임피던스 분석기의 입력에 연결되는 것을 의미한다. 바람직하게는 상기 세포에 접촉하는 모든 전극이, 더 바람직하게는 다중화기를 통하여, 임피던스 분석기의 입력(들)에 연결된다. 스위치의 이 위치에서, 임피던스 분석기에 의하여 임피던스 측정이 수행될 수 있다. 스위치는 전극을 제2 스위칭 상태에서 포텐셜 분석기에 연결하기에, 즉 대향 전극을 접지에 연결하고, 하나 이상의, 바람직하게는 모든, 상기 세포에 접촉하는 전극이, 바람직하게는 사전증폭(preamplification) 장치를 통하여, 포텐셜 분석기의 입력에 연결하기에, 적합하여야 한다. 이 제2 스위칭 상태에서, 포텐셜 분석기는 기준 전극 및 상기 세포에 접촉하는 하나 이상의 전극 사이의 전위차를 측정할 수 있다. 세포 밖의 필드 포텐셜이 일반적으로 마이크로볼트 범위 내이므로, 사전증폭을 위해서 저잡음 증폭기가 사용되는 것이 바람직하다. 바람직하게는 증폭기(사전증폭기)의 잡음 수준은 25 nV/√Hz 이하이며, 더 바람직하게는 10 nV/√Hz 이하이고, 특히 5 nV/√Hz 이하이다. 잡음수준은 이 기술분야에서 공지된 바와 같이 정의된다. 바람직하게는 증폭기의 공통 모드 입력 범위 값은 10⁷ Ohm 이상이며, 더 바람직하게는 10¹⁰ Ohm 이상, 특히 10¹² Ohm 이상이다. 사전증폭 장치에 대한 적합한 동작 및/또는 측정 증폭기는 이 기술분야에서 공지되어 있으며, 예를 들면, Texas Instruments TLC 2274로부터의 OPV 또는 Analog Devices OPA 4228로부터의 OPV이다.

본 발명에 따른 시스템의 스위치는 분석기 사이, 즉 임피던스 분석기 및 포텐셜 분석기 사이에서 전극을 스위칭할 수 있으며, 바람직하게는 낮은 스위칭 잡음을 갖는다. 본 발명에 따른 시스템에서 사용되는 스위치는 50 Ohm 이하의 온 저항(on-resistance)을 갖는다. 온 저항은 스위치가 “온 상태”, 즉 닫힌 스위치일 때의 전기적 저항에 대응한다. 이론에 의해 제한되지 않기를 희망하며, 낮은 스위치 온 저항은 결정적으로 임피던스 측정 신호에 대한 영향을 줄이기 위해서, 또한 EPR 측정에 대해서도 적합한 전극인 상기 세포에 접촉하는 전극과 적합한 임피던스 측정을 허용하기 위한 것으로 가정된다. 바람직하게는, 온 저항은 10 Ohm 이하, 더 바람직하게는 5 Ohm 이하, 특히 2 Ohm 이하이다. 여기에서 사용되는 온 저항(R_ON)은 이 기술분야에서 공지된 바와 같이, 닫힌 상태에서 스위치의 옴 저항의 값이며, 도 7에 나타난 바와 같이 결정될 수 있다. R_ON은 일반적으로 25℃, 10 mA의 전류(lOS) 에서 측정된다.

또한, 본 출원에 따른 시스템의 스위치(스위칭 요소)는, 낮은 온 저항과 결합하여, 높은 오프 격리도 및 높은 크로스톡(channel-to-channel) 격리도를 제공하여야 한다. 이는 스위칭 요소에 의해 최소한의 신호 변경이 초래되는 것을 보장한다. 본 출원에 따른 시스템의 스위치(스위칭 요소)의 오프 격리도 및 크로스톡 격리도는 일반적으로 -60dB 이하이며, 바람직하게는 -75dB 이하, 특히 -90dB 이하이다. 여기에서 사용되는 오프 격리도는 이 기술분야에서 공지된 바와 같이 열린(OFF) 상태에서 스위치를 통한 원하지 않은 신호 커플링의 값이다. 오프 격리도는 도 8에 나타난 바와 같이 결정될 수 있으며: 오프 격리도(dB)=20log(V_s/V_OUT), 일반적으로 25℃, 10MHz의 신호 주파수에서 측정된다.

여기에서 사용되는 크로스톡 격리도는 이 기술분야에서 공지된 바와 같이 기생 용량의 결과로 하나의 채널로부터 다른 채널을 통해 연결되는 원하지 않은 신호의 값이다. 크로스톡 격리도는 도 9에 나타난 바와 같이 결정될 수 있으며: 크로스톡 격리도(dB)=20log(V_s/V_OUT), 일반적으로 25℃, 10MHz의 신호 주파수에서 측정된다.

바람직하게는, 스위칭 요소는 2% 또는 그 이하의 낮은 왜곡을 제공하며, 바람직하게는 0.5% 또는 그 이하, 특히 0.1% 또는 그 이하이다. 여기에서 사용되는 (신호의) 왜곡은 이 기술분야에서 공지된 바와 같이 출력 신호의 왜곡이다. 이는 예를 들면, 특정한 아날로그 신호 범위 내에서 측정된, 온 저항에 대한 온 저항의 최대 및 최소값 사이의 차로 결정될 수 있다. 바람직하게는, 스위치는 전극을 높은 시간 해상도, 즉 짧은 스위칭 시간((t_ON and t_OFF)으로 스위칭할 수 있으며, 바람직하게는 밀리초 범위, 예를 들면, 1000 마이크로 초 이하의 시간 범위, 더 바람직하게는 마이크로초 시간 범위 내이다. 여기에서 마이크로초 시간 범위(해상도)는 전극의 스위칭 시간 범위가 바람직하게는 1000 마이크로초 이하이며, 더 바람직하게는 100 마이크로 초 이하이고, 더욱 바람직하게는 10 마이크로초 이하이며, 특히 2 마이크로초 이하, 예를 들면 0.5 마이크로초 이하를 의미한다. 여기에서 사용되는 스위칭 시간은 이 기술분야에서 공지된 바와 같으며, 도 10에 나타난 바와 같이 결정될 수 있다(스위칭 시간 t_ON and t_OFF).

바람직하게는, 본 출원에 따른 시스템의 스위치는 1ns 이하, 더 바람직하게는 1ns 내지 10ns 범위의 BBM(break-before-make) 시간 지연을 갖는다. BBM 시간 지연(t_D)은 이 기술분야에서 공지된 바와 같으며, 도 11에 나타난 바와 같이 결정될 수 있다.

바람직하게는, 스위치는 분석기들 사이에서 전극을 20kHz 이상, 더 바람직하게는 50kHz 이상, 특히 100kHz 이상의 주파수로 스위칭할 수 있다. 적합한 초고속 스위칭 장치가 이 기술분야에서 공지되어 있으며, 예를 들면, MAXIM 4619, ADG 774 또는 ADG 794이다. (서브) 마이크로초 시간 스케일로 수백 개의 전극/채널에 대한 데이터 경로 라우팅 및 측정 경로의 측정 제어 고속 스위칭을 허용하는 다른 적합한 장치는, 예를 들면, ATXMEGA (Atmel), Cyclone/Aria (Alterra) 및 Spartan (Xilinx)이다. 바람직하게는, 이 기술분야에서 공지된 바와 같이, 스위치는 디지털 신호 처리장치 (digital signal processor, DSP) 또는 필드 프로그래밍 지원 게이트 어레이(field programmable gate array, FPGA)에 기반하거나, 특히 이에 통합된다. 이러한 장치는 원하는 응용에 대해 쉽게 구성될 수 있는 집적 회로 기반의 프로그래밍 가능한 고 병렬 장치이며, 상당히 낮으며 되풀이되지 않는 기술 비용으로 기능성의 업데이트가 쉬운 것으로 알려져 있다. 이러한 장치를 사용함으로써, 많은 병렬 콘택에 대한 높은 스위칭 주파수 및 낮은 스위칭 시간을 얻을 수 있다. 신호 처리 제어를 위한 적합한 장치는, 예를 들면, ASIC 또는 Fusion-Mixed-Signal-FPGAs (Microsemi)에 기반할 수 있다.

스위치 및 다른 장치의 모든 전기적 파라미터는 달리 언급되지 않는 한 25℃에서 결정된다.

본 발명은 세포, 바람직하게는 흥분성 세포, 특히 심장 세포 또는 신경 세포의 임피던스와 전위를 모니터링하는 방법에 관련되며, 상기 방법은 상술한 바와 같은 시스템을 제공하는 단계, 및 세포의 임피던스 및 전위를 측정하는 단계를 포함한다. 전극은 분석기들, 즉 임피던스 분석기 및 포텐셜 분석기 사이에서 상술한 스위치에 의하여 스위칭된다.

본 발명의 방법에서, 바람직하게는 임피던스 분석기 및 포텐셜 분석기 양자가 모두 낮은, 더 바람직하게는 밀리초의 시간 해상도를 갖는다. 이러한 구성에서, 전극은 분석기들 사이에서 1000 마이크로초 이하, 바람직하게는 10 마이크로초 이하, 특히 2 마이크로초 이하, 예를 들면 0.5 마이크로초 이하의 시간 범위 내에서 스위칭된다. 바람직하게는 스위칭 주파수는 상술한 바와 같다.

바람직한 실시예에서, 본 발명의 시스템은 전위 측정(electric potential measurement, EPR)의 두 샘플링 지점 사이에서 임피던스가 측정되도록 전극을 스위칭할 수 있으며, 그리고 본 발명에 따른 방법은 전위 측정(electric potential measurement, EPR)의 두 샘플링 지점 사이에서 임피던스가 측정되도록 전극을 스위칭하는 것을 포함한다. EPR 측정은 일반적으로 특정한 샘플링률, 예를 들면 1kHz 내지 1MHz, 바람직하게는 2kHz 내지 100MHz, 특히 4kHz 내지 100kHz의 샘플링률에서 수행된다. 또한, 일반적으로 전압계, 일반적으로 아날로그-디지털 변환기(ADC)와 함께 다중화기(MUX)가 사용된다. 이에 따라, 두 샘플링 지점 사이에 샘플링률 및 샘플링 시간에 따른 간격이 존재한다. 바람직하게는 이 간격은 EIS 측정을 위해 사용된다. 예를 들면, 일반적인 회로 설계가 10mhz 이상의 ADC 및 4KHz의 샘플링 주파수 내의 16 채널 MUX를 포함할 때, 두 샘플 사이에 약 250 마이크로초의 간격이 존재한다. 16채널의 다중화 때문에 채널 당 약 25 마이크로초의 디지털화 윈도우(digitalization window)가 존재하며, 이는 EIS를 위해 사용될 수 있는 200 마이크로초 이상의 시간 영역이 있는 것을 의미한다. 대응하여, 20kHz의 샘플링률은 샘플링 지점 사이의 50마이크로 초의 시간 간격을 가져오며, 따라서 약 30마이크로초의 시간 간격이 EIS를 위해 사용될 수 있다. 이에 따라, 본 발명에 따른 시스템을 사용하여, 특히 스위치가 분석기들 사이에서 마이크로초 시간 해상도로, 특히 5 이하의 범위, 더 바람직하게는 2마이크로초 이하에서, 전극을 스위칭할 수 있을 때, EPR 측정의 두 샘플링 지점 사이에서 EIS 측정이 수행될 수 있다. 이는 공백 없는(gapless) EPR 데이터 스트림을 가져온다. 이러한 주파수에 대해서 획득된 불연속적인 임피던스 값 또는 심지어 임피던스 스펙트럼이 기록될 수 있으며, 이는 단지 EPR 샘플링 주파수에 의해서만 제한된다. 이러한 구성은 탁월하고, 공백이 없으며, 거의 동시적인 EPR 및 EIS 양자의 측정을 제공한다.

본 발명에 따른 시스템 및 방법에서, 바람직하게는 하나 이상의 전극은 마이크로 전극이며, 세포-기판은 바람직하게는, 이 기술분야에서 공지된 것과 같은 마이크로 전극 어레이이다.

도 1은 종래기술에서 알려진 바와 같이 전기생리학적 기록(EPR)과 전기화학 임피던스 분광학(electrochemical impedance spectroscopy, EIS) 측정 회로 경로의 연결에 의해 초래되는 간섭을 나타낸다.
도 2는 측정 인공물의 제거를 위한 회로 설계를 나타낸다.
도 3은 멀티웰 어레이(multiwell array)에서 본 발명에 따른 시스템의 사용을 나타낸다.
도 4는 멀티웰 어레이에서 본 발명에 따른 시스템을 사용하여 획득한 데이터를 나타낸다.
도 5는 다중전극 멀티웰(multi electrode-multiwell) 어레이에서 본 발명에 따른 시스템의 사용을 나타낸다.
도 6은 공백 없는 병렬 기록을 위한 고속 DSP/FPGA 컨트롤 구성에서 본 발명에 따른 시스템의 사용을 나타낸다.
도 7은 온 저항(on-resistance) 결정을 위한 시험 회로를 나타낸다.
도 8은 오프 격리도(off-isolation) 결정을 위한 시험 회로를 나타낸다.
도 9는 크로스톡 격리도(crosstalk isolation) 결정을 위한 시험 회로를 나타낸다.
도 10은 스위칭 시간 결정을 위한 시험 회로를 나타낸다.
도 11은 BBM(break-before-make) 시간지연 결정을 위한 시험 회로를 나타낸다.
본 발명은 첨부된 도면을 참조로 더 자세히 설명된다. 이러한 예들은 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 의도는 아니다.

본 출원에서는 임피던스 분광학(EIS) 및 전기생리학적 기록(EPR) 기술이 하나의 시스템 내에서 결합된다. 이에 따라, 고효율 및 고집적 스크리닝(HTS/HCS) 시스템이 제공되며, 이는 바람직하게 또한 유리하게 ANSI 96 또는 ANSI 384 호환 멀티웰 타이터 플레이트(multiwell titer plate)에 기반한다. 임피던스 분광학 및 전기생리학적 기록 모두가 동일한 마이크로 전극을 사용하며, 즉 두 분석기가 동일한 전극, 즉 하나 이상의 기준 전극(또한 접지 또는 대향 전극으로도 지칭됨)과 세포에 접촉하는 전극(또한 작동 전극으로도 지칭됨)에 연결된다. 이에 따라 연결은 최소로 줄어든다. 또한, 동일한 전극으로부터의 기록은 동일한 세포/세포 클러스터로부터 획득된 필드 포텐셜 데이터와 국지화된 EIS 데이터의 직접적인 상관관계를 제공한다. 하나의 기록 챔버 내에 더 많은 전극-예를 들면 마이크로 어레이의-이 있으면, EPR에 사용되는 다수의 전극 중 하나 이상이 EIS에 사용된다.

본 발명에 따른 시스템의 하나의 바람직한 실시예가 도 1에 나타나 있다. 작동 전극 및 기준 전극은 모두 EPR을 위해 사용되며, 이는 주로 증폭 장치 및 전압계로 구성되는 수동적인 검출 방법이다. 동일한 전극이 임피던스 분광학에 사용되는데, 이는 교류 전류 전압이 전극에 인가되는 능동적인 검출 방법이다. 모니터링되는 세포/세포 클러스터에 영향을 주지 않도록, 주입되는 전하는 mV 범위로 제한되어야 하며, 사용되는 마이크로 전극의 크기에 따라, 바람직하게는 100mV 이하, 더 바람직하게는 10mV 이하로 제한된다.

도 1에 나타난 바와 같이, EPR 및 EIS의 상반되는 성질에 기인하여, 동시에 두 데이터를 측정하는 것은 불가능하다. 오히려 측정 회로 경로가 연결되고 동시에 동작할 경우 서로 간섭 및 교란을 일으킨다(이 경우 200μm 직경의 원형 금 마이크로 전극이 적용되었다). 다른 방법의 능동적 측정이 이루어지지 않는 경우에조차, 회로 경로의 연결만으로도 EPR 증폭기 회로에 대해 허용할 수 없을 정도의 간섭을 유발할 수 있으며(도 1b 참조), 반대의 경우도 마찬가지로 비능동적인 EPR 회로 경로가 임피던스 측정에 특정한 세포 배양 내의 교란을 일으킬 수 있다(도 1c 참조).

더 자세하세는, EPR 스트림이 획득되고 EIS 측정이 동일한 배양 챔버 또는 적어도 전기적으로 연결된 칸 내에서 시작될 때, 주입된 교류 전류(일반적으로 mV 범위의 전위를 갖는)는 전류가 인가되는 동안 교란을 일으킬 뿐만 아니라(도 1b의 1.9 내지 2.3 초), 또한 EIS 기록 이후 또는 그 이전에조차 그렇다. 일반적으로, EIS 측정은 EIS 획득을 위해 요구되는 시간 윈도우로부터 독립적인 수 초의 시간 범위 내에 EPR 교란을 일으킨다. EPR 측정에 병행하여 획득된 EIS 데이터로부터 알 수 있는 것과 같이, 연결된 EPR 회로 경로에 의해 도입된 현저한 인공물이 있으며, 이는 EPR 기록이 활성화되지 않은 경우에조차 그렇다(도 1c). 이러한 교란은 세포-호환 매체와 버퍼 용액의 수성 환경 내의 마이크로 전극의 높은 자체 임피던스와 각각 다른 검출 방법의 다른 전자 장치와의 보호되지 않은 연결로 인한 것일 수 있다.

100Hz에서 일반적으로 10⁵ 내지 10⁶인 마이크로 전극의 높은 자체 임피던스에 관하여, nA 또는 심지어 pA 범위의 전류를 측정하기 위한 임피던스 분석기에 대한 높은 요구가 있다. 이는 EIS 회로 경로가 EPR 회로와 같은 다른 연결된 전자 요소에 대한, 특히 회로가 보호되지 않거나 접지되지 않은 경우에, 높은 민감도의 원인일 수 있다.

EPR 및 EIS 측정 사이의 이러한 간섭을 방지하기 위하여 본 출원에서는 위에서 정의된 것과 같은 스위치가 전극을 임피던스 분석기 또는 포텐셜 분석기로 선택적으로 연결한다. 바람직하게는, 하나의 분석기가 전극에 연결되어 있을 때, 대응하는 임피던스 분석기 또는 포텐셜 분석기 중 사용되지 않는 것의 입력은 접지된다. 이에 따라, 민감한 증폭기는 전극이 스위칭되거나 연결되어 있지 않을 때 일어날 수 있는 전하공급(charging)이나 전압 펄스로부터 보호된다.

바람직한 실시예에서 본 발명에 따른 시스템에서 사용되는 스위치는 DSP/FPGA 스위치에 기반하며, 특히 그 내부에 집적되고, 고용량(μC) 요소 또는 스위칭 잡음을 줄이기 위한 것으로 이 기술분야에서 알려진 유사한 장치와 결합되는 것이 더 바람직하다(도 2 참조). 이 저잡음 스위치는 기준 전극과 상기 세포에 접촉하는 전극 모두를 각 분석기에 연결하고 바람직하게는 다른 분석기의 입력을 접지에 연결함으로써 양쪽의 측정에 대해 교란이 없는 동작을 보장한다. 예를 들면, 측정 전극이 EIS 회로 경로로 스위칭될 때, 기준 전극은 임피던스 분석기의 대향 전극 연결로 스위칭된다. EPR 증폭 오버차지(overcharge)를 피하기 위하여, 증폭기 입력은 접지로 스위칭된다. 반대의 경우, 측정 전극이 EPR 회로 경로로 연결될 때에는, 기준 전극이 접지로 스위칭된다. 고용량 μC는 저잡음 스위칭을 보장하고 및/또는 적절한 DSP/FPGA는 초 이하, 바람직하게는 밀리초, 특히 마이크로초 범위 내에 모든 경로의 동시 스위칭을 보장한다. EPR 증폭기 회로의 오버차지를 피하기 위하여, 증폭기 입력은 기준 전극이 임피던스 분석기의 대향 전극 연결에 연결되기 직전에 접지에 연결된다. 이는 교류 전류 전압의 인가를 필요로 하는 임피던스 스펙트럼이 기록되는 동안 EPR 스트림이 중단(interrupt)되는 것을 보장한다. EPR 스트림의 중단 동안, 데이터 내의 공백(gap)이 생성되며, 이는 다른 회로에 의한 교란 없이 접지에 대한 연결에 기인하여 0의 필드 포텐셜로 채워진다(도 2b). EPR 스트림의 중단 동안 기록되는 대응되는 임피던스 데이터는 EPR 회로의 간섭에 의해 일어나는 교란이 없다(도 2c).

사용되는 고정밀 임피던스 분석기와 측정 파라미터에 따라, 임피던스 스펙트럼 획득은 EPR 스트림 공백(0의 필드 포텐셜)을 일으킨다. 이러한 공백이 발생하며 상술한 스위치에 의해 제어된다는 사실 때문에, 타임스탬프(timestamp) 데이터가 통상 컴퓨터 워크스테이션인 전자 데이터 처리로 전달되어, 데이터 분석을 위해 사용될 수 있으며, 공백은 예를 들면 주파수 분석을 위해 일반적으로 제거된다. 이에 따라, 상술한 바와 같은 스위치를 낮은 시간 단위로 전극을 동기화하여 스위칭하기 위해 사용하는 동안, 도 1에 나타난 바와 같은 측정 인공물은 두 가지 방법 모두에 대해 제거될 수 있다(도 2b 및 c 참조).

바람직한 96-멀티웰 어레이에 기반한, 동일한 전극에 대해 EPR 및 EIS 양자를 사용하기 위한 실험적 구성이 도 3에 나타나 있다. 상기 도면에 나타난 바와 같이, 96-웰 플레이트의 각 웰에 대하여 하나의 어레이가 하나 이상의 측정 전극과 하나의 기준 전극과 함께 사용된다. 각 측정 전극과 각 기준 전극은 EPR 및 EIS 측정 경로 양쪽에 연결되어 있는 저잡음 스위치(low noise switch, LNS)에 연결된다. EPR 경로는 예를 들면, 700 내지 1200의 적당한 팩터에 의해 마이크로볼트 범위 내의 세포 포텐셜을 통상 증폭시키는 필드 포텐셜 증폭기(field potential amplifier, FPC) 회로로 구성되며, 세포 신호 주파수 범위 주변의 잡음을 제거한다. FPA 경로를 지난 다음에는 다중화(multiplexed, MUX)되고, 아날로그-디지털 컨버터(ADC)에 의해 디지털화된다. EPR 경로에 대해서는 기준 전극(CE)은 접지로, EIS 경로에 대해서는 임피던스 분석기(ImpA)의 대향 전극 연결로 스위칭된다.

MUX는 통상 FPA 경로 다음에 위치하며, 이는 MUX를 FPA 앞에 위치시키는 것에 비해 크로스톡 및 잡음을 더 감소시키기 때문이다. 바람직하게는 각 전극에 대해 하나의 FPA 회로가 있다. 사용되는 MUX 및 ADC와 얻고자 하는 최대 샘플링 주파수에 따라, 일반적으로 ADC 당 30-60 채널이 다중화된다.

EIS 측정 경로는 고정밀 임피던스 분석기(ImpA)에 연결된 저잡음 다중화기로 구성된다. ImpA는 적절한 시간 범위, 바람직하게는 밀리초 시간 범위, 더 바람직하게는 마이크로초 시간 범위 내에서 낮은 전압 진폭(바람직하게는 100mV 이하, 특히 10mV 이하)에서 높은 자체 임피던스(100Hz에서 105 내지 106 Ohm)을 갖는 다중 전극에 대해 임피던스 스펙트럼을 측정할 수 있어야 한다. 적절한 성능의 임피던스 분석기는 예를 들면, Agilent 4294A(Agilent Technologies) 및 Solartron 1260A+1296A 고 임피던스 유전 인터페이스(Solartron Analytical)이며, 또한 ScioSpec ISX-03과 같은 적합한 분석기이다.

모든 구성요소의 동기화된 스위칭을 위하여 성능이 높은 용량에 기반한 DSP/FPGA가 사용된다. 이러한 시스템에 의하여, 양 측정 경로의 스위칭이 모두 엄격히 제어될 수 있으며, 스위칭 정보(타임스탬프)가 개인용 컴퓨터 상의 데이터 분석을 위해 추가될 수 있다.

도 4에 나타난 바와 같이, EPR 스트림은 모든 96개의 전극 상에서 연속적으로 기록되는 한편, EIS 스펙트럼의 획득을 위하여 각 웰의 EPS 스트림이 저잡음 스위치에 의하여 동기화식으로 중단된다. 임피던스 스펙트럼의 획득을 위한 시간은 사용되는 임피던스 분석기와 획득 파라미터(주파수 범위, 주파수 지점의 수, 획득된 주파수 당 평균 또는 통합 시간 등)에 의존한다. 예를 들면, ScioSpec ISX-3이 1kHz 내지 5MHz 사이에 동일한 거리로 분포된 51 주파수 지점에 대해 사용될 때, 획득 시간은 500밀리초이다. 이러한 시간 윈도우 동안, EPS 스트림은 중단된다. 모든 96 웰을 판독하기 위하여, 스위칭 및 임피던스 스펙트럼 획득은 순차적으로 수행된다. 따라서, 모든 96-웰 플레이트가 1분 이내에 판독된다. (저잡음 스위치에 의해 얻어진) 공백 위치 데이터와 임피던스 스펙트럼이 분석 소프트웨어에 의해 분석되며, 각 전극/웰에 대한 세포 기여(상대 임피던스)가 계산된다(도 4 우측). 예를 들면, 분당 수축 주파수 및 (분당) 평균 신호 형태를 얻기 위하여 EPR 스트림은 공백을 제거하고 분석된다.

웰 당 얻어진 정보를 늘리기 위하여, 웰 당 두 개 이상의 마이크로 전극이 통합될 수 있다. 웰 당 측정 전극의 증가, 바람직하게는 웰 당 상기 세포에 접촉하는 2, 4, 8 전극, 더 바람직하게는 2 또는 4, 특히 4개의 전극과 웰 당 하나의 기준 전극으로 더 많은 데이터 포인트가 얻어지며 이들은 평균된다. 한편, 각 웰의 전극 어레이는 예를 들면 심근세포 배양의 여기 확산(excitation spreading)(EPR) 또는 신경세포 네트워크 배양의 활동 패턴(EPR)과 같은 시공 분석에 사용될 수 있다. 동일한 방법으로 임피던스 스펙트럼은 2D 임피던스 맵으로 구성될 수 있다.

도 5는 웰 당 4개의 측정 전극 및 하나의 대향/기준 전극을 갖는 웰들을 포함하는 96-웰 플레이트의 응용예를 보여준다. 이 경우에는, 96*4 측정 전극과 동일한 수의 저잡음 스위치(LNS)가 있으며, 통상 30 내지 60 채널의 다중화기로 연결된 필드 포텐셜 증폭기(FPR) 경로가 있다. 다중화된 EPR 스트림은 아날로그 디지털 컨버터(ADC)에 의해 디지털화된다. 모든 임피던스 관련 경로는 적절한 고정밀 임피던스 분석기(ImpA)로 다중화된다(도 5a 참조). 웰 당 하나를 넘는 측정 전극이 있으며, 동일한 웰 내의 조화된 임피던스 측정(congruent impedimetric measurement)은 기술적으로 가능하지 않으므로, EPR 스트림 내에 증가된 공백(gap)이 웰 당 존재한다(도 5b 참조). 이러한 공백은 하나의 임피던스 스펙트럼에 대한 측정 시간 및 웰 당 측정 전극의 수에 의존한다. 예를 들면, 1kHz로부터 5MHz까지의 임피던스 스펙트럼이 500 밀리초 내에 획득된다. 이는 웰 당 2초의 EPR 스트림 공백이 있는 것을 의미한다. 상술한 획득 파라미터에서 하나의 정밀 임피던스 분석기 채널을 이용할 때, 전체 임피던스 스펙트럼 및 EPR 스트림에 대해서 전체 플레이트의 판독은 약 200초가 소요된다. 데이터 분석 동안 저잡음 스위치의 데이터를 고려함으로써, 예를 들면, 분당(per minute), 평균 주파수 및 신호 형태 파라미터가 계산될 수 있다. EPR 스트림 공백을 최소화하기 위하여, 임피던스 스펙트럼 파라미터는 낮은 획득 주파수를 갖는 더 높은 주파수로 제한될 수 있다. 또한 임피던스가 결정되는 하나 이상의 독립된 주파수, 예를 들면 100kHz로 임피던스 스펙트럼을 최소화하는 것도 가능하다. 이러한 방법으로 획득 시간은, ScioSpec SCX-3과 같은 고정밀 임피던스 분석기가 사용될 때, 예를 들면 25 마이크로초로 줄어들 수 있다.

예를 들면, 96-웰 플레이트와 같은 전체 플레이트의 측정 시간을 더 줄이기 위하여, FPGA 기반 측정 시스템과 같은 병렬 채널 고정밀 임피던스 분석기(다중채널 임피던스 분석기)가 사용될 수 있다. 둘 이상의 병렬 임피던스 획득 채널을 통해, 획득 시간이 더 줄어들 수 있다.

웰 당 측정 전극의 증가로, 웰 당 EPS 스트림 공백은 연장된다. 예를 들면, 웰 당 60 측정 전극을 사용하면, 앞서 기술한 전체 스펙트럼 획득을 위해 30초가 필요하며, 하나 이상의 임피던스 측정 채널이 있으면 전체 96-웰 플레이트에 대해 50분 이상의 획득 시간이 필요하다. 단일 주파수 측정 및 병렬 임피던스 채널 획득의 사용은 이를 5초 이하로 줄일 수 있지만, 획득된 임피던스 데이터는 상당히 제한된다. 이러한 제한을 피하기 위하여, 특히 EPR 스트림 공백을 제거하기 위하여, 본 출원에 따른 시스템은 도 6에 나타난 바와 같이 임피던스 스펙트럼 획득을 공백 없이 EPR 스트림 획득에 통합할 수 있다.

도 6에 나타난 시스템의 개선은 EPR 스트림이 FPR 경로에 의하여 병렬로 증폭된다는 사실에 기반하지만, ADC에 의한 아날로그 스트림의 최종 디지털화는 일반적으로 다중화된 스트림의 형태로 수행된다. 결과적으로, 다중화된 통상 16 내지 64 증폭된 스트림에서, 각 스트림의 디지털화를 위해 사용되는 시간 윈도우는 단지 1/30 내지 1/60이다. 예를 들면, EPS 스트림이 4kHz, 즉 초당 4000번 샘플링될 때, 획득 기간은 약 250 마이크로 초의 길이를 갖는다(또 6a). 30 채널의 다중화 및 10MHz이상의 디지털화는 단일 데이터 지점은 1/10마이크로초에 디지털화되며 각 채널은 50마이크로초 이상에 대해 디지털화되는 것을 의미한다. 스위칭 시간을 포함하는 안전 시간(safety window)을 가정하면, 채널 당 EPS 디지털화를 위해 250 마이크로초 시간 윈도우로부터 약 25마이크로초가 사용된다. 결과적으로, 임피던스 스펙트럼 기록을 위해 사용될 수 있는 200마이크로초를 넘는 시간 윈도우가 존재한다. 임피던스 획득 파라미터(주파수 지점의 수 및 주파수 범위)에 따라 보수적인 계산은 10kHz 를 넘는 임피던스 스펙트럼 획득이 가능하게 한다. 스펙트럼 해상도와 획득할 수 있는 주파수 범위를 더 개선하기 위하여, 멀티-사이너스 여기(multi-sinus excitation)와 같은 기술이 바람직하게 사용될 수 있는 고속 및 고정밀 임피던스 분석기 내에서 알려져 있다. EPR 스트림의 공백 없는 검출을 보장하기 위하여, 임피던스 데이터 획득은 가용 시간 범위, 즉 위의 예에서는 200마이크로초 내로 제한된다. 이는 신호 안정성/신호 대 잡음 비를 개선하기 위해 시간에 대한 적분은 가능하지 않거나 제한되는 것을 의미할 수 있다. 임피던스 스펙트럼이 (4kHz의 샘플링 주파수에서) 초당 4000번 획득될 수 있기 때문에, 신호 품질 개선은 초당 수백 내지 수천 단일 측정을 평균하는 것을 연장함으로써 얻어질 수 있다.

(예를 들면 신경세포 네트워크 활동을 모니터링하기 위하여) 더 높은 EPS 샘플링 주파수가 요구될 때, 획득 윈도우는 짧아질 수 있다. 20kHz 샘플링률의 경우 획득 윈도우는 50마이크로초의 범위 내에 있다(도 6b 참조). EIS 측정을 위한 적절한 시간 영역을 보장하기 위하여, 3마이크로초보다 짧은 EPR 획득 시간을 얻기 위해서 고속 다중화기가 바람직하게 사용된다. 따라서, EIS 측정을 위하여 30마이크로초 이상이 가용하다. 보수적으로 계산하여도, 70kHz 이상의 주파수 범위 내에서 임피던스 값 또는 심지어 스펙트럼을 얻을 수 있는 가능성이 있다.

이와 같이, 고속 스위칭 가능한 구성에 기반한, 본 출원에 따른 시스템을 이용하면, 획득된 데이터는 공백 없는(gapless) EPR 스트림과 불연속적인 주파수에 대한 임피던스 값 또는 요구되는 EPR 샘플링 주파수에만 의존하는 주파수 범위에서의 전체 임피던스 스펙트럼으로 구성된다(도 6c).

Claims

생체 외(in vitro) 세포의 임피던스 및 전위를 모니터링하는 시스템에 있어서,
a) 상기 세포와 접촉하는 하나 이상의 전극 및 하나 이상의 기준 전극을 포함하는 세포-기판;
b) 상기 전극 사이의 임피던스를 측정할 수 있는 장치(임피던스 분석기);
c) 상기 전극 사이의 전위차를 측정하는 장치(포텐셜 분석기); 및
d) 상기 전극을 상기 임피던스 분석기 또는 상기 포텐셜 분석기에 선택적으로 연결하는 스위치를 포함하며,
상기 스위치는 50 Ohm 이하의 온 저항(on-resistance), -60dB 이하의 오프 격리도(off-isolation), 및 -60dB 이하의 크로스톡 격리도(crosstalk isolation)를 갖는 것을 특징으로 하는 시스템.
제1항에 있어서,
상기 스위치는 10 Ohm 이하의 온 저항을 갖는 시스템.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 스위치는 -75dB 이하의 오프 격리도를 갖는 시스템.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 스위치는 -75dB 이하의 크로스톡 격리도를 갖는 시스템.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포는 흥분성 세포(excitable cell)이며, 특히 심장 세포 또는 신경 세포인 시스템.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 스위치는 디지털 신호 처리장치(digital signal processor, DSP) 또는 필드 프로그래밍 지원 게이트 어레이(field programmable gate array, FPGA) 기반인 시스템.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 임피던스 분석기 및 상기 포텐셜 분석기는 모두 밀리초 단위의 시간 해상도를 가지며, 상기 스위치는 상기 임피던스 분석기 및 상기 포텐셜 분석기 사이를 1000 마이크로초 이하의 시간 범위 내로 스위칭할 수 있는 시스템.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포와 접촉하는 하나 이상의 전극은 마이크로 전극이며, 상기 세포-기판은 마이크로 전극 어레이인 시스템.
생체 외(in vitro) 세포의 임피던스 및 전위를 모니터링하는 방법에 있어서,
i) 시스템을 제공하는 단계로서, 상기 시스템은,
a) 상기 세포와 접촉하는 하나 이상의 전극 및 하나 이상의 기준 전극을 포함하는 세포-기판;
b) 상기 전극 사이의 임피던스를 측정할 수 있는 장치(임피던스 분석기);
c) 상기 전극 사이의 전위차를 측정하는 장치(포텐셜 분석기); 및
d) 상기 전극을 상기 임피던스 분석기 또는 상기 포텐셜 분석기에 선택적으로 연결하는 스위치를 포함하는, 시스템을 제공하는 단계; 및
ii) 각각 세포의 임피던스 또는 전위를 측정하기 위하여 상기 전극을 상기 임피던스 분석기 또는 상기 포텐셜 분석기에 선택적으로 연결하는 단계를 포함하며, 상기 스위치는 50 Ohm 이하의 온 저항, -60dB 이하의 오프 격리도, 및 -60dB 이하의 크로스톡 격리도를 갖는 방법.
제9항에 있어서,
상기 스위치는 10 Ohm 이하의 온 저항을 갖는 방법.
제9항 또는 제10항에 있어서,
상기 스위치는 -75dB 이하의 오프 격리도 및/또는 -75dB 이하의 크로스톡 격리도를 갖는 방법.
제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 임피던스 분석기 및 상기 포텐셜 분석기는 모두 밀리초 단위의 시간 해상도를 가지며, 상기 전극들은 상기 임피던스 분석기 및 상기 포텐셜 분석기 사이를 1000 마이크로초 이하의 시간 범위 내로 스위칭할 수 있는 스위치에 의해 스위칭되는 방법.
제12항에 있어서,
상기 스위칭은 전위 측정의 두 샘플링 지점 사이에서 임피던스가 측정되도록 수행되는 방법.
제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 스위치는 디지털 신호 처리장치(digital signal processor, DSP) 또는 필드 프로그래밍 지원 게이트 어레이(field programmable gate array, FPGA) 기반인 방법.
제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하나 이상의 전극은 마이크로 전극이며, 상기 세포-기판은 마이크로 전극 어레이인 시스템.