KR20010011212A - 동물 세포의 활성 측정 시스템 및 그를 이용한 동물 세포의 활성 측정방법 - Google Patents

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Abstract

동물의 성장, 운동 등의 종합적인 활성을 전기적인 신호로 측정하기 위한 동물 세포의 활성 측정 시스템 및 그를 이용한 동물 세포의 활성 측정방법에 관한 것으로, 전극 위에 다수개의 동물 세포 배양용 웰(well)들과 기준웰이 배열된 셀 칩 어셈블리부와, 전원부와, 스위칭부와, 차동증폭부와, 모니터부로 구성된다. 이러한 동물 세포의 활성 측정 시스템을 이용하여 먼저, 각 웰 내에 동물 세포와 배지를 주입하고 기준웰 내에 배지만을 주입하고, 웰들 중 측정하고자 하는 웰을 선택적으로 스위칭하여 측정하고자 하는 웰의 전극과 기준웰의 전극에 전압을 인가하며, 기준웰의 출력신호와 측정하고자 하는 웰의 출력신호의 차를 증폭한 다음, 증폭된 신호의 변화를 모니터링하여 측정하고자 하는 웰 내의 동물 세포의 활성도를 측정함으로써, 기존의 광학 현미경을 이용한 육안측정 보다 높은 재현성을 확보하고, 동시/연속 측정이 가능하다.

Description

동물 세포의 활성 측정 시스템 및 그를 이용한 동물 세포의 활성 측정방법{system for measuring activity of animal cell and method for measuring activity of animal cell using the same}
본 발명은 동물의 성장, 운동 등의 종합적인 활성을 전기적인 신호로 측정하기 위한 동물 세포의 활성 측정 시스템 및 그를 이용한 동물 세포의 활성 측정방법에 관한 것이다.
일반적으로 동물세포는 여러 가지의 목적을 위해 인 비트로(in vitro) 배양이 이루어지고 있으며, 미생물 세포와는 달리 배양 플라스크에 배지와 함께 가해졌을 때, 기질에 부착(attachment)하는 특성을 가지고 있다.
부착(attachment)하기 전 세포의 모양은 약 20㎛의 구형(spherical)이지만 일단 기질에 부착하면 평평한 모양(flattened morphology)을 갖게 된다.
이러한 과정은 현재 배양되는 대부분의 동물세포에 있어서 약 2 ~ 3 시간이 걸리며, 부착한 세포는 세포분열하기 전까지 평평한 모양을 유지한다.
반면, 세포분열을 하는 세포는 다시 둥근 모양(rounded morphology)으로 바뀌며, 2개의 세포로 나뉘게 되는데, 분열된 딸 세포(daughter cell)는 플라스크의 기질에 다시 스프레딩(spreading)하는 과정을 거친다.
이와 같이, 배양 플라스크에 스프레딩 및 부착한 세포는 한 곳에 머무르지 않고 기질 위를 계속 운동(motion)하는 성질이 있다.
이러한 세포와 기질간의 상호작용 및 세포의 운동(motion)은 아직까지 그 작용 기작이 정확히 밝혀지지 않았지만, 발생학이나 상처의 재생과 같은 세포활동을 이해하는데 있어서 매우 중요한 분야로 여겨지고 있다.
이러한 동물세포의 활성을 측정하기 위한 방법으로는 광학 현미경을 이용한 사람의 육안 평가가 주로 행해지고 있는데, 이 경우 플라스크 기질에 부착한 세포의 밀도 즉, 콘플루언트(confluent)한 정도를 평가한다.
그 밖에 외부 신호에 대한 세포의 변화도 육안으로 측정하는 경우가 있는데, 예를 들면 화장품에 사용되는 미백제를 선정할 경우에 이용되는 방법이다.
B16 멜라노마(melanoma) 세포주의 경우는 쥐의 멜라노사이트(melanocyte)라는 세포가 형질전환(transformation)되어 암세포화된 세포주로서, 정상 멜라노사이트에 비해 생체 색소인 멜라민(melanin)을 더욱 활발하게 합성한다.
여기서, B16 멜라노마 세포주의 경우, 그의 밀도가 높아지게 되면 세포자체는 물론, 세포를 배양하는 배지의 색이 모두 검게 변하는 특성을 갖는다.
따라서, 새로운 미백제의 개발이나 기존 미백제의 효과를 검증하기 위해서는 미백제 후보 물질을 이 B16 멜라노마 세포주에 첨가하여 배양한 다음, 그 세포를 원심분리로 수확해 세포 펠렛(pellet)의 색을 사람의 육안으로 평가하는 방법을 사용한다.
즉, 이 방법은 첨가한 미백제가 B16 멜라노마 세포주의 특성인 검은 색을 띄는 정도를 얼마나 감소시키는지 측정하는 것이다.
하지만, 이 방법은 실제로 살아 있는 세포의 개수와 색과의 관계를 확립할 수 없으므로 많은 한계를 가지고 있다.
또한, 이 방법은 활성을 지닌 B16 멜라노마 세포뿐만 아니라 배양 중에나 미백제 첨가 후에 활성을 잃고 죽은 세포도 검은색을 띄기 때문에 살아 있는 세포만의 색도 측정이 반드시 필요하다.
이와 같이, 육안에 의한 관능 검사 방법은 개인마다 평가 기준이 다르기 때문에 좀 더 정확한 측정을 위해서는 헤마토시토메터(hematocytometer), 트리판 블루 스테이닝(trypan blue staining)과 같은 방법을 이용하여 세포의 농도를 측정하여 세포의 성장정도를 확인하는 방법을 사용하고 있다.
하지만, 부착, 분열, 성장, 운동 등과 같은 종합적인 세포의 활성을 측정하기에는 역시 한계가 존재한다.
또한, 세포는 외부에서 들어오는 자극이나 정보를 병렬처리하며 그에 대해 복잡하고 다양한 반응패턴을 보이므로, 신약개발이나 독성검사, 유전자발현연구 등에 필요한 세포의 여러 반응의 이해를 위해서는 지금 대부분의 실험에서 행해지고 있는 간헐적인 측정이나 최종결과만을 측정하는 방법은 그 한계가 존재한다.
이러한 문제점을 극복하기 위하여 세포를 전극상에서 배양하여 종합적인 세포의 활성을 온-라인(on-line)으로 동시/연속측정하고, 세포의 다양한 반응들에 기인한 여러 신호들을 병렬로 처리하려는 연구와 외국의 몇몇 연구자들에 의해 진행되고 있다.
그 중에서 대표적인 두 방법은 CMS(Cell Monitoring System)방법과 ECIS(Electric Cell-substrate Impedance Sensing)방법이다.
CMS 방법은 기판상에 인터디지테이트 어레이(InterDigitated Array ; IDA) 전극을 형성시키고, 세포배양을 할 수 있는 웰(well)을 부착한 후, 세포를 배양하면서 세포 활성 변화 신호를 LCR 메터(meter)를 비롯한 계측기로 받아 들여 임피던스 값 등을 측정해서 활성 정도를 측정하는 방법이다.
이 시스템은 세포를 이중 세포 배양 유닛(double cell culture unit)에 배양하면서 한 유닛에서는 IDA 전극을 사용하여 세포가 부착될 때의 임피던스 증가 값을 주요 변수로 측정하고, 다른 유닛에서는 물리적/화학적 센서를 이용하여 배지에서의 pH의 변화, 산소 농도의 변화, 이온농도의 변화 등을 측정한다(Ref. Bioelectrochemistry and Bioenergentics Vol 46,(1998) pp215~225).
ECIS 방법은 직경이 아주 작은 원형의 전극을 세포 배양 웰(well) 바닥에 제작하여 세포의 성장에 따른 저항성분(in-phase voltage)의 증감을 록-인 앰플리파이어(lock-in amplifier)로 측정하는 방법이다.
이 시스템은 어플라이드 바이오피직스(Applied BioPhysics)사에서 현재 판매되고 있으며, CMS의 경우 전극으로 IDA를 이용한 반면 이 시스템에서는 작은 원형의 전극을 이용하며, 주로 세포의 스프레딩(spreading) 및 부착을 측정하는데 쓰이도록 고안되었고, 세포의 모양(morphology)이나 운동(motion)도 시간의 함수로서 측정이 가능하다고 알려져 있다(Ref. Nature Vol 366, (1993) pp591~592).
종래 기술에 따른 동물 세포의 활성 측정 시스템 및 그를 이용한 동물 세포의 활성 측정방법에 있어서는 다음과 같은 문제점이 있었다.
종래에는 세포주의 활성여부와 상태 등은 플라스크에서 세포주를 배양하는 중이나 배양이 끝난 후, 광학현미경을 이용하여 플라스크 바닥면에 부착하여 자라는 세포주를 육안으로 식별하는 방법이 가장 일반적이었다.
그러나, 이 방법은 육안으로 식별하기 때문에 개인마다 평가 기준이 차이가 나므로 정확도 및 신뢰도가 떨어지는 문제가 있었다.
또한, 헤마토시토메터(Hematocytometer)나 트리판 블루 염색법(trypan blue staining)과 같은 방법은 상당히 정확하게 세포농도를 측정 할 수 있는 방법이지만 세포의 배양을 종료한 후에만 측정이 가능하므로 동시/연속 측정이 불가능한 단점이 있다.
그리고, 이러한 일련의 단점들을 극복하기 위해 개발된 ECIS나 CMS 등의 방법들은 모두 단일 측정 시스템이기 때문에 얻은 결과를 확인하기 위해서는 반드시 대조군을 같은 조건하에서 측정하여야 하고, 전극 각각의 개체특성이 무시되는 문제점이 있었다.
또한, 현재 언급한 두 시스템을 포함하여 여러 가지 형태의 세포 활성 측정 시스템이 논문 등에 소개되고 있지만, 아직 뚜렷한 응용분야를 정하지 못하고 있는 상태이며 시장에 출시되어 있는 제품도 ECIS를 제외하고는 거의 없는 상태다.
어플라이드 바이오피직스(Applied BioPhysics)사의 ECIS도 아직은 세포의 부착정도를 측정하는 정도로만 쓰여지는게 현실이다.
본 발명은 이러한 문제들을 해결하기 위한 것으로, 높은 재현성을 확보하고 동시/연속측정이 가능한 동물 세포의 활성 측정 시스템 및 그를 이용한 동물 세포의 활성 측정방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
도 1 및 도 2는 8개의 웰을 갖는 본 발명의 셀 칩 어셈블리를 보여주는 평면도 및 사시도
도 3은 24개의 웰을 갖는 본 발명의 셀 칩 어셈블리를 보여주는 평면도
도 4는 본 발명에 따른 동물 세포의 활성 측정 시스템을 보여주는 개략도
본 발명에 따른 동물 세포의 활성 측정 시스템은 전극 위에 다수개의 동물 세포 배양용 웰(well)들과 기준웰이 배열된 셀 칩 어셈블리부와, 웰들과 기준웰의 전극에 전압을 인가하는 전원부와, 웰들의 전극에 인가되는 전압을 각각 스위칭하는 스위칭부와, 기준웰의 출력신호와 상기 스위칭된 각 웰의 출력신호의 차를 증폭하는 차동증폭부와, 차동증폭부에서 증폭된 신호의 변화를 모니터링하여 각 웰의 동물 세포의 활성도를 측정하는 모니터부로 구성된다.
여기서, 셀 칩 어셈블리부는 기판과, 기판 위에 배열되는 다수개의 빗살형 미세 전극 어레이들과, 빗살형 미세 전극 어레이들을 전기적으로 연결하기 위한 커넥터 패드와, 각 빗살형 미세 전극 어레이 위에 형성되고 동물 세포와 배지를 가지는 다수개의 세포 배양용 웰들과 배지만을 가지는 기준웰과, 세포 배양용 웰들 및 기준웰을 덮기 위한 웰 덮개로 이루어지며, 웰들과 기준웰의 전극에는 교류 전압이 인가된다.
그리고, 스위칭부는 아날로그 멀티플렉서로 이루어진 스캐너를 사용하고, 차동증폭부는 듀얼 채널 록-인 앰플리파이어(dual channel lock-in amplifier)를 사용한다.
또한, 전원부와 스위칭부 사이, 전원부와 셀 칩 어셈블리부의 기준웰 사이에는 각각 저항을 형성하여 각 웰의 전극에 인가되는 전류를 제한한다.
이와 같이 구성되는 동물 세포의 활성 측정 시스템을 이용한 동물 세포의 활성 측정방법은 각 웰 내에 동물 세포와 배지를 주입하고 기준웰 내에 배지만을 주입하는 단계와, 웰들 중 측정하고자 하는 웰을 선택적으로 스위칭하여 측정하고자 하는 웰의 전극과 기준웰의 전극에 전압을 인가하는 단계와, 기준웰의 출력신호와 측정하고자 하는 웰의 출력신호의 차를 증폭하는 단계와, 증폭된 신호의 변화를 모니터링하여 측정하고자 하는 웰 내의 동물 세포의 활성도를 측정하는 단계로 이루어진다.
여기서, 기준웰과 스위칭된 웰의 출력 신호의 차는 임피던스 값으로서, 이 임피던스 값의 미세한 변화를 분석하여 동물 세포의 활성도를 측정한다.
이와 같이, 본 발명은 빗살형 미세 전극 어레이(InterDigitated Electrode Array : IDEA)와 세포 배양용 웰들이 집적화된 세포 활성 측정용 셀 칩 어셈블리를 이용하여 동물 세포의 성장, 운동(motion) 등의 종합적인 활성을 저항성분, 전도도, 커패시턴스(capacitance), 임피던스(impedance) 등의 전기적인 인자(factor)를 이용하여 측정함으로써, 기존의 광학 현미경을 이용한 육안측정 보다 높은 재현성을 확보하고, 동시/연속 측정이 가능하다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 잇점들은 첨부한 도면을 참조한 실시예들의 상세한 설명을 통해 명백해질 것이다.
본 발명에 따른 동물 세포의 활성 측정 시스템 및 그를 이용한 동물 세포의 활성 측정방법의 바람직한 실시예에 대하여 첨부된 도면을 참조하여 설명하면 다음과 같다.
먼저, 본 발명에서는 기존의 전극을 이용한 배양 시스템에서 필연적인 계측신호의 재현성을 증진시키기 위해서 차동 측정 시스템을 선택하였다.
이 차동 측정 시스템의 장점은 대조군을 사용하지 않고, 매번 측정결과에 대해 보정(calibration)을 할 필요가 없다는 데에 있으며, 또한 단일 측정 시스템에 비해 감도가 향상되는 효과가 있다.
기존의 ECIS 및 CMS의 경우에도 소프트웨어적인 프로그래밍으로 대조군값을 측정값으로부터 감산하여 간접적으로 차동 측정을 할 수도 있지만, 본 발명에서는 하드웨어적인 프리-앰프(pre-amp) 방식을 적용하여 프로그래밍에 의한 오차를 배제할 수 있으며, 더 정학한 임피던스 변화 값을 얻을 수 있는 장점이 있다.
도 1 및 도 2는 본 발명에 따른 셀 칩 어셈블리를 보여주는 평면도 및 사시도로서, 도 1 및 도 2에 도시된 바와 같이 본 발명의 셀 칩 어셈블리는 기판 위에 배열되는 다수개의 빗살형 미세 전극 어레이(InterDigitated Electrode Array : 이하, IDEA라 함)과, 빗살형 미세 전극 어레이들을 전기적으로 연결하기 위한 커넥터 패드와, 각 빗살형 미세 전극 어레이 위에 형성되는 다수개의 웰들과, 웰들 및 기준웰을 덮기 위한 웰 덮개로 구성된다.
여기서, 다수개의 웰들은 동물 세포와 배지를 가지는 다수개의 세포 배양용 웰들과 배지만을 가지는 기준웰로 나눌 수 있다.
이러한 구조의 셀 칩 어셈블리(cell chip assembly)의 제작 과정을 설명하면 다음과 같다.
먼저, 세포가 부착하여 성장 및 분열을 하는 유리 기판 위에 포토리소그래피(photolithography) 기술을 사용하여 일정한 간격과 폭을 갖는 IDEA를 형성시킨다.
즉, 유리 기판이나 이와 유사한 성질을 갖는 투명한 기판을 100×100(mm)의 크기로 자른 후, 적당한 용제로 잘 세척한다.
그리고, 감광제를 약 1,000rpm 정도로 스핀 코팅(spin coating) 한 후에 베이킹(baking) 한다.
이어, IDEA가 패터닝되어 있는 마스크를 사용하여 약 10 초간 UV 노광을 시켜준 후, 약 60 도의 온도에서 약 60 초간 포스트 익스포우져 베이킹(post exposure baking)을 한다.
그 다음으로, 현상액을 사용하여 형성된 패턴을 현상한 후, 금속 물질을 이-빔 이베포레이터(E-beam evaporator)를 사용하여 증착시킨다.
이때, 증착시키는 금속물질은 접착제(adhesive)로서, Ti 또는 Cr이 사용되며 그 위에 Au를 증착시켜 IDEA를 형성한다.
여기서, 금속 물질들은 세포들의 모폴로지(morphology)를 인버티드 라이트 마이크로스코프(inverted light microscope)를 사용하여 볼 수 있을 정도로 투명도를 가져야 한다.
이와 같이, 제작된 IDEA의 전극 쌍은 각각 50개씩의 밴드(band)를 갖고 있으며, 전극간의 거리는 약 50㎛, 전극의 넓이는 약 10㎛ 정도이다.
이렇게 투명한 기판에 형성된 IDEA 위에 세포 배양용 웰 카트리지(well cartridge)를 접착시킨 다음, 배지와 동물 세포주를 각 웰(well)에 주입하게 되면 최종적으로 셀 칩 어셈블리가 완성된다.
셀 칩 어셈블리를 이용한 세포의 활성도 측정 실험은 일반적으로 CO2인큐베이터(incubator)안에서 일정시간 배양한 후, 셀 칩 어셈블리를 현미경 스테이지(stage) 위에 올려놓은 다음, 스크리닝 실험에 사용하면 된다.
이러한 셀 칩 어셈블리는 세포 배양시 실시간(real-time)으로 자극(stimulation)실험 등을 인 비트로(in vitro)에서 실시할 수 있다는 장점이 있을 뿐만 아니라, CCD 카메라 등이 부착된 광학 현미경상에 위치시키고 프로그래밍으로 CCD 카메라를 일정한 시간 간격으로 작동시켜서 그 이미지 데이터(image data)를 저장하게 되면, 세포의 성장, 모양(morphology) 등을 IDEA에서 얻은 전기적 신호와 결부하여 새로운 함수 관계를 찾을 수 있게 된다.
본 발명에 의한 셀 칩 어셈블리는 마이크로 전극 제작기술에 의해 IDEA 크기를 조절할 수 있을 뿐만 아니라, 세포 배양용 웰(well)의 수 또한 8개에서 24개, 96개, 384개 등으로 확대 적용할 수 있다.
도 3은 본 발명에 따른 24개의 웰을 갖는 셀 칩 어셈블리를 보여주는 평면도이다.
이러한 셀 칩 어셈블리를 이용한 본 발명에 따른 동물 세포의 활성 측정 시스템은 도 4에 도시된 바와 같다.
여기서, 도 4는 일실시예로서 8개의 웰을 갖는 셀 칩 어셈블리를 이용한 측정 시스템을 보여주고 있다.
본 발명의 측정 시스템은 도 4와 같이 전극 위에 7개의 동물 세포 배양용 웰(well)들과 1개의 기준웰이 배열된 셀 칩 어셈블리부와, 각 웰의 전극 패드에 교류 전압을 인가하는 전원과, 전원과 셀 칩 어셈블리 사이에 전기적으로 연결되어 셀 칩 어셈블리의 기준웰을 제외한 7개의 웰들을 스위칭하여 선택적으로 교류 전압이 인가되도록 하는 셀 스캐너와, 기준웰의 출력신호와 스위칭된 각 웰의 출력신호의 차를 증폭하는 듀얼 채널 록-인 앰플리파이어(dual channel lock-in amplifier)와, 듀얼 채널 록-인 앰플리파이어에서 증폭된 신호의 변화를 모니터링하는 컴퓨터 등으로 구성된다.
여기서, 전원과 셀 스캐너 사이, 전원과 셀 칩 어셈블리의 기준웰 사이에는 각각 저항이 연결되어 있다.
이와 같이 구성된 측정 시스템을 이용한 동물 세포의 활성도 측정 방법은 다음과 같다.
먼저, 셀 칩 어셈블리의 제 1 웰부터 제 7 웰까지는 실험용 동물 세포가 배지와 함께 주입되고, 기준웰에는 배지만 주입된다.
그리고, 셀 칩 어셈블리의 전극 패드에 전기적으로 연결된 아날로그 멀티플렉서(analog multiplexer)로 이루어진 스캐너(scanner)에 의해 측정하고자 하는 웰을 선택적으로 스위칭한 후, 측정하고자 하는 웰의 IDEA 전극 양단에 교류 전압(약 1~10kHz, 100mV)을 인가한다.
이어, 듀얼 채널 록-인 앰플리파이어를 이용하여 인-페이즈 전압(in-phase voltage)을 측정하게 되면, 세포 배양에 따른 임피던스 변화를 컴퓨터를 통해 모니터링 할 수 있게 된다.
여기서, 제 1 내지 제 7 웰에서 출력된 신호는 록-인 앰플리파이어의 A 채널(channel)로 인가되고, 기준웰에서 출력된 신호는 록-인 앰플리파이어의 B 채널(channel)로 인가된다.
듀얼 채널 록-인 앰플리파이어는 A 채널과 B 채널 간의 차동 신호를 증폭하여 컴퓨터로 출력하면 컴퓨터에서는 각 웰의 임피던스 값의 미세한 변화를 모니터링 할 수 있다.
즉, 세포가 있는 웰은 세포가 시간이 지남에 따라 웰의 바닥면에 형성된 전극에 부착되므로 전극의 임피던스(impedance) 값이 증가하고, 반면에 기준웰에는 세포가 없고 배지만 있으므로 임피던스 값이 변하지 않게 된다.
그러므로, 이 두 값의 차이를 록-인 앰플리파이어로 측정하게 되는 것이다.
이러한 차동형 측정 방식의 장점은 무엇보다 동물 세포 배양시 수행하는 실험조건을 조절하는데 유리할 뿐 아니라, 배지 성분에 의한 측정신호의 간섭효과를 배제시킬 수 있다는데 있다.
그런데, 여기서 주의할 점은 세포에 가해지는 전압이 높을 경우, 전극에 부착하는 세포에 손상을 줄 수 있다는 점이다.
그러므로, 세포의 손상을 최소화하기 위해 본 발명에서는 도 4에 도시된 바와 같이 저항 R1과 R2를 연결하였다.
물론, 저항 R1과 R2의 값은 각각의 IDEA에 인가되는 전류를 약 1㎂미만이 되도록 조절이 될 수 있는 것이어야 한다.
이와 같이, 록-인 앰플리파이어에서 얻어지는 인-페이즈 전압은 임피던스 값의 저항성분을 반영한 것인데, 이 값을 컴퓨터로 분석하면 세포의 부착, 스프레딩(spreading), 운동, 성장, 분열 등에 의한 변화를 알 수 있게 된다.
이러한 측정 방법을 갖는 본 발명은 여러 대상 세포들에 확대 적용될 수 있다.
일 예로서, 본 발명을 적용할 수 있는 대상 세포로는 화장품 미백제 및 피부암 항암제 탐색에 응용이 가능하고 멜라닌(melanin) 합성이 활발한 쥐의 피부암 세포주(cell line)인 B16-F1 멜라노마(melanoma) 세포주와, 한국인에게서 많이 생기는 간암, 위암 등의 항암제 개발을 위한 HepG2, Hep3B와 같은 간암(hepatocarcinoma) 세포주 및 위암 세포주 등 모든 암 세포주에 확대할 수 있다.
미백제 탐색시에는 멜라노마(melanoma) 세포를 전극상에서 일정한 시간 배양한 후, 여기에 미백제 후보로 여겨지는 티로신 키나제 억제제(tyrosine kinase inhibitor) 등을 가한다.
만약, 미백효과가 있다면, 멜라노마 세포의 배양 시 관찰할 수 있는 특징인 세포와 배지의 흑화 현상이 둔화될 것이다.
하지만, 미백효과가 있더라도 세포에 가해지는 손상이 크면 화장품으로는 사용이 불가능하므로 세포의 활성은 위의 시스템으로 계속 측정하고, 광학 소자(optical device)를 부착하여 세포 및 배지의 색 변화를 관찰한다면, 동시에 세포에 대한 손상 여부 및 미백 효과를 판단할 수 있다.
항암제 및 신약 탐색시에는 암세포주 등을 전극상에서 배양 한 후, 위와 같은 방법으로 후보물질을 가해서 암세포주의 활성 및 성장 저해 효과 여부를 판단하는 방법으로 여러 물질에 대한 스크리닝이 가능하다.
또한, 지금까지 로보틱스와 분석기기 등이 조합된 형태의 고가의 HTS 시스템도 본 발명에 의한 셀 칩 어셈블리를 응용 확대할 경우, 반도체 칩 크기의 셀 칩으로 발전되어 소형, 저가의 하이 스로풋 스크리닝(high throughput screening) 시스템으로의 대체 적용이 가능하다.
이와 같이 본 발명을 적용할 수 있는 대상 세포들 중에서, B16 멜라노마(melanoma)를 이용한 미백제 스크리닝 방법과, Hep 3B를 이용한 항간암제 스크리닝 방법을 일 예로 설명하면 다음과 같다.
B16 멜라노마(melanoma)를 이용한 미백제 스크리닝 방법은 먼저, 제작된 셀 칩 어셈블리의 각 웰에 전체 웰 용량의 10%가 되도록 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium)배지를 첨가한다.
이어, 세포 배양용 웰을 스캐너에 연결하고, 기준웰과 세포 배양용 웰의 인 페이즈 전압(in phase voltage)를 연속적으로 측정할 수 있도록 하기 위해 록-인 앰플리파이어에 기준웰과 세포 배양용 웰에 연결된 스캐너를 연결시킨다.
그 다음으로, 기준웰을 제외한 나머지 웰에는 10%의 콘플루언스(confluence)를 갖도록 B16 멜라노마 세포를 첨가한 후, 셀 칩 전체를 일정온도로 유지시키는 플로우 셀(flow cell)이나 CO2인큐베이터(incubator)에서 배양하면서 미백제 후보 물질을 첨가한다.
이어, 세포의 자극 변화를 모니터링 하는 실험을 행하는데, 셀 칩에 연결된 스펙트로포토메터(spectrophotometer)를 이용하여 세포 배지의 흡광도를 온라인으로 동시에 비교한다.
그리고, 컴퓨터를 이용하여 각 웰에서 얻어진 임피터스 값으로부터 세포의 활성, 스프레딩(spreading), 운동(motion), 성장(growth) 등을 흡광도값과 분석 비교한다.
한편, Hep 3B을 이용한 항간암제 스크리닝 방법은 상기와 동일한 방법으로 제작된 셀 칩 어셈블리의 각 웰에 전체 웰 용량의 10%가 되도록 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium)배지를 첨가한다.
이어, 세포 배양용 웰을 스캐너에 연결하고, 기준웰과 세포 배양용 웰의 인 페이즈 전압(in phase voltage)를 연속적으로 측정할 수 있도록 하기 위해 록-인 앰플리파이어에 기준웰과 세포 배양용 웰에 연결된 스캐너를 연결시킨다.
그 다음으로, 기준웰을 제외한 나머지 웰에는 10%의 콘플루언스(confluence)를 갖도록 HepG2, Hep3B 등의 세포를 첨가한 후, 셀 칩 전체를 일정온도로 유지시키는 플루우 셀이나 CO2인큐베이터에서 배양하면서 항간암제 후보물질을 첨가한다.
이어, 세포의 자극변화를 모니터링 하는 실험을 행하는데, 실험에 따라서는 셀 칩 상부에 연결된 인버티드 광학 현미경(inverted light microscope)을 이용하여 세포의 영상 이미지를 온라인으로 동시에 비교한다.
그리고, 컴퓨터를 이용하여 각 웰에서 얻어진 임피던스 값으로부터 세포의 활성, 스프레딩(spreading), 운동(motion), 성장(growth)등을 분석 비교한다.
본 발명에 따른 동물 세포의 활성 측정 시스템 및 그를 이용한 동물 세포의 활성 측정방법에 있어서는 다음과 같은 효과가 있다.
본 발명에서 고안한 IDEA가 내장된 차동 측정형 시스템(differential-type multi-channel cell monitoring system)은 광학현미경을 이용한 광학 측정(optical measurement)으로 진행되었던 기존의 신물질/신약 탐색 방법 등을 대체하는 새로운 스크리닝 시스템으로서, 정확성, 비용, 시간 등에서 많은 장점을 가지고 있다.
또한, 집적도를 높여 96개 이상의 웰을 갖는 측정 시스템을 구현한다면 하이 스로풋 스크리닝(High Throughput Screening ; HTS) 시스템으로의 적용도 가능하다.
그리고, 투명 기판을 사용하기 때문에 세포의 상태를 전기적인 인자(factor)로 측정하는 동안에도 광학 측정(optical measurement)을 동시에 수행할 수 있으므로 활성과 색도 변화의 측정이 함께 요구되는 미백제 등의 스크리닝에도 이용될 수 있다.
또한, 세포-세포/세포-기질의 상호 작용의 이해가 요구되는 발생학 및 세포 생물학, 암 발생에 관계되는 종양 형성(tumorigenesis), 종양학(oncology) 등의 기초 연구에도 응용될 수 있을 것이다.
이상 설명한 내용을 통해 당업자라면 본 발명의 기술 사상을 이탈하지 아니하는 범위에서 다양한 변경 및 수정이 가능함을 알 수 있을 것이다.
따라서, 본 발명의 기술적 범위는 실시예에 기재된 내용으로 한정되는 것이 아니라 특허 청구의 범위에 의하여 정해져야 한다.

Claims (8)

  1. 전극 위에 다수개의 동물 세포 배양용 웰(well)들과 기준웰이 배열된 셀 칩 어셈블리부;
    상기 웰들과 기준웰의 전극에 전압을 인가하는 전원부;
    상기 웰들의 전극에 인가되는 전압을 각각 스위칭하는 스위칭부;
    상기 기준웰의 출력신호와 상기 스위칭된 각 웰의 출력신호의 차를 증폭하는 차동증폭부; 그리고,
    상기 차동증폭부에서 증폭된 신호의 변화를 모니터링하여 상기 각 웰의 동물 세포의 활성도를 측정하는 모니터부로 구성되는 것을 특징으로 하는 동물 세포의 활성 측정 시스템.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 셀 칩 어셈블리부는
    기판;
    상기 기판 위에 배열되는 다수개의 빗살형 미세 전극 어레이들;
    상기 빗살형 미세 전극 어레이들을 전기적으로 연결하기 위한 커넥터 패드;
    상기 각 빗살형 미세 전극 어레이 위에 형성되고, 동물 세포와 배지를 가지는 다수개의 세포 배양용 웰들과 배지만을 가지는 기준웰; 그리고,
    상기 세포 배양용 웰들 및 기준웰을 덮기 위한 웰 덮개로 구성되는 것을 특징으로 하는 동물 세포의 활성 측정 시스템.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 웰들과 기준웰의 전극에 인가되는 전압은 교류 전압인 것을 특징으로 하는 동물 세포의 활성 측정 시스템.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 스위칭부는 아날로그 멀티플렉서로 이루어진 스캐너인 것을 특징으로 하는 동물 세포의 활성 측정 시스템.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 차동증폭부는 듀얼 채널 록-인 앰플리파이어(dual channel lock-in amplifier)인 것을 특징으로 하는 동물 세포의 활성 측정 시스템.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 전원부와 스위칭부 사이, 상기 전원부와 셀 칩 어셈블리부의 기준웰 사이에는 각각 저항이 형성되는 것을 특징으로 하는 동물 세포의 활성 측정 시스템.
  7. 전극 위에 다수개의 동물 세포 배양용 웰(well)들과 기준웰이 배열된 셀 칩 어셈블리부, 전원부, 스위칭부, 차동증폭부, 모니터부를 갖는 동물 세포의 활성 측정 시스템에 있어서,
    상기 각 웰 내에 동물 세포와 배지를 주입하고, 상기 기준웰 내에 배지만을 주입하는 제 1 단계;
    상기 웰들 중 측정하고자 하는 웰을 선택적으로 스위칭하여 상기 측정하고자 하는 웰의 전극과 기준웰의 전극에 전압을 인가하는 제 2 단계;
    상기 기준웰의 출력신호와 상기 측정하고자 하는 웰의 출력신호의 차를 증폭하는 제 3 단계; 그리고,
    상기 증폭된 신호의 변화를 모니터링하여 상기 측정하고자 하는 웰 내의 동물 세포의 활성도를 측정하는 제 4 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 동물 세포의 활성 측정 시스템을 이용한 동물 세포의 활성 측정방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 제 3 단계의 출력 신호의 차는 임피던스 값인 것을 특징으로 하는 동물 세포의 활성 측정 시스템을 이용한 동물 세포의 활성 측정방법.
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