KR100450633B1 - 전기적 자극에 의한 신경세포 배양방법 및 그의 장치 - Google Patents

Abstract

본 발명은 전기적 자극에 의한 신경세포 배양방법 및 그의 장치에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 금으로 코팅된 실리콘 기판의 표면에 전도성 고분자가 코팅된 기판 표면에 신경세포를 점착시킨 후 배양액 존재하에 전기적 자극을 가하여 신경세포를 배양시키는 것으로 이루어진 신경세포 배양방법 및 그 장치에 관한 것으로, 상기 신경세포 배양방법 및 그의 장치는 전기적 자극을 조절하여 신경세포를 증식, 분화 유도 및 신경돌기를 유도할 수 있어 신경돌기 사이에서 시납시스 및 신경회로를 형성시킬 수 있으며, 생체소자(biosensor)로 이용할 수 있다.

Description

전기적 자극에 의한 신경세포 배양방법 및 그의 장치{CULTURE METHOD FOR NERVE CELL BY ELECTRONIC STIMULUS AND ITS APPARATUS}

본 발명은 전기적 자극에 의한 신경세포 배양방법 및 그 장치에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 금으로 코팅된 실리콘 기판의 표면에 다시 그 위에 전도성 고분자를 코팅하여 만든 기판의 표면에 신경세포를 점착시킨 후 배양액 존재하에 전기적 자극을 가하여 신경세포를 배양시키는 것으로 이루어진 신경세포 배양방법 및 그 장치에 관한 것이다.

최근 의학의 발달에 의해 인간의 수명이 길어지고 있으나 노령화와 더불어 최신의학에 의해서도 치료 불가능한 부분이 많이 있다. 대표적으로 노인병의 하나인 치매를 들 수 있는데, 이러한 현상을 이해하기 위한 뇌에 대한 연구는 최근 큰 관심을 갖게 되었다. 또한 상기 연구를 통하여 뇌의 사고기능의 원리를 이해하고, 그것을 인공적으로 재현하기 위한 노력이 활발히 일어나고 있다. 구체적으로 뇌과학 또는 신경과학을 중심으로 뇌의 정보처리 원리를 취한 신경회로 모델을 구성하여 뇌와 유사한 정보처리능력을 실현하고, 사고기능의 일부를 재현시킬 수 있는 모델을 구축하고자 하는 연구가 이루어지고 있다.

현재 신경망(neural network)에 대한 연구는 학계뿐만 아니라 산업계에 큰 관심을 나타내고 있으며, 뇌를 모방하여 학습용 신경칩까지 개발하고 현재 실험적 응용범위까지 확대되고 있다. 신경과학의 분자생물학적인 연구는 의학계의 기초 학문에서 관심을 갖고 있으며, 소뇌 등의 신경세포의 전기생리학적 연구를 예로 들 수 있다.

또한, 새로운 체계의 정보전달 장치를 이해하고 모델화하는 시도 역시 활발하게 진행되고 있으며, 그 중의 대표적인 예가 신경(neuron) 컴퓨터이다. 상기 신경 컴퓨터는 생물의 뇌신경계의 역할을 모방한 정보처리기기로 신경회로의 알고리즘을 지향한 연구로부터 신경세포 등의 생체 재료를 직접 이용하여 분자 생물학적으로 그 기능을 이해하려는 연구와 신경세포 및 단백질 등의 생체물질을 셍체세포기질 또는 인공세포기질 위에서 선택적 점착을 선택적 제어하는 재료 분야의 연구까지 다방면의 연구자들이 큰 관심을 가지고 있다.

한편, 신경과학에 대한 중요성을 생물학 및 정보통신 분야뿐만 아니라 생체재료 관계자들도 인식하고 적극적으로 그 연구에 참가하고 있다. 인공재료 또는 인공재료와 생체재료와의 하이브리드에 의해서 가능하다고 생각되는 바이오 칩은 장래의 전자계의 꿈이기도 한 생체소자의 대표적인 예이다.

최근 뇌의 정보처리 장치는 다방면에서 관심을 가지고 있으나, 뇌 전체를 대상으로 연구하는 것은 너무 복잡하여 단순한 신경 회로의 인공적 형성이 절실하게 요구되어 지고 있으며, 정보전달 및 처리 장치를 해명하기 위한 수단을 고려하고 있다. 이러한 생체소자의 실현을 위해서는 재료표면상의 개질을 통한 세포의 점착을 유도할 수 있어야 한다. 재료표면을 부분적으로 화학적인 방법을 통하여 개질하고, 생체물질을 재료표면상에서 임의적으로 배열하여 제어하는 연구가 미국 및 일본을 중심으로 활발히 진행되고 있다. 그러나, 아직까지 신경회로를 형성하고 생체소자까지 가능하게 하기 위해서는 기반이 되는 재료의 선택, 세포의 미세패턴화 기술, 세포의 점착강도의 향상, 생체기능의 유지 및 세포의 분화유도 등 아직 해결해야 할 과제가 많다.

이에, 본 발명자들은 금으로 코팅된 실리콘 기판 위에 전도성 고분자를 코팅한 세포배양용 기판을 포함한 신경세포 배양장치를 제조하고, 상기 기판 위에 신경세포를 점착시키고 배양액 존재하에서 전기적 자극을 가하여 신경세포를 배양하여 신경세포를 증식, 분화 유도 및 신경돌기를 유도할 수 있음을 알아내어 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 금으로 코팅된 실리콘 기판의 표면에 전도성 고분자가 코팅된 기판을 이용하여 신경세포를 배양시키는 신경세포 배양방법 및 그의 장치를 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 각 기판에 점착된 PC12세포의 분화 비교를 나타낸 현미경 사진(×40배율)이며,

(a) 세포배양용 접시,

(b) 금이 코팅된 실리콘 기판,

(c) 폴리피롤이 코팅된 금 표면의 실리콘 기판,

(d) 전기자극을 가한 폴리피롤이 코팅된 금 표면의 실리콘 기판.

도 2는 본 발명의 전압에 따른 PC12세포의 분화 비교를 나타낸 현미경 사진(×40배율)이며,

(a) 100mV, (b) 150 mV, (c) 200 mV

도 3은 본 발명의 시간에 따른 PC12 세포의 분화 비교를 나타낸 현미경 사진(×40배율)이며,

(a) 전기 자극 후 2 시간, (b) 12 시간, (c) 24시간, (d) 48시간

도 4a는 본 발명의 신경세포 배양용 장치의 일예를 나타낸 사시도이며,

도 4b는 본 발명의 신경세포 배양용 장치의 일예를 나타낸 평면도이며,

도 5는 본 발명의 신경세포 배양용 장치내 신경세포를 점착시키는 기판을 나타낸 단면도이다.

* 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명 *

100 : 신경세포 배양용 장치, 10 : 챔버,

20 : 기판, 22 : 유사기준전극,

24 : 음전극, 26 : 양전극

30 : 조절기, 1 : 실리콘 기판,

2 : 금, 3 : 전도성 고분자.

상기한 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 금으로 코팅된 실리콘 기판의 표면에 전도성 고분자가 코팅된 기판을 이용하여 신경세포를 배양시키는 신경세포 배양방법 및 그의 장치를 제공한다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명은 금으로 코팅된 실리콘 기판의 표면에 전도성 고분자가 코팅된 기판을 이용하여 신경세포를 배양시키는 신경세포 배양방법을 포함한다. 구체적으로 상기 세포배양용 기판에 신경세포를 점착시킨 후 배양액 존재하에서 전압을 가하여 신경세포 증식, 분화 유도 및 신경돌기를 유도하는 신경세포 배양방법을 포함한다.

상기 신경세포 배양은 0.01∼1.0 V의 전압에서 1 분∼4 시간동안 수행하는 것이 바람직하며, 상기 전압이 0.01 V 미만이면, 전기적 자극이 약하여 신경세포 배양에 영향을 미치지 못하며, 전압이 1.0 V를 초과하면, 세포분화에 영향을 미치는 것보다 세포가 받는 손상이 더욱 커서 세포 생존능력에는 상당히 영향을 주고 있어 바람직하지 못하다. 하기 실시예에서 배양액은 RPMI1640 배양액에 10%의 말혈청(horse serum)과 5% 어린 송아지 혈청(fetal calf serum)을 첨가하여 사용하나, 본 발명에서는 특별히 한정하지 않는다.

본 발명의 신경세포 배양방법은 금으로 코팅된 실리콘 기판의 표면에 전도성 고분자가 코팅된 기판을 이용하여 그 표면상에서 세포의 점착 및 성장을 제어함으로써, 신경세포의 패턴화를 이룰 수 있다. 특히 코팅된 표면에서 신경세포의 돌기를 유도하여 그들 사이의 시냅시스를 형성할 수 있다. 구체적으로 전기적 자극(전압)을 조절하여 신경세포로부터 돌기 및 시냅시스 형성이나 축삭돌기를 형성시킬수 있다. 상기 형성된 돌기 및 축삭돌기로부터 이온채널을 통한 전기적 신호를 관찰할 수 있다.

도 1에서 보는 바와 같이, PC12 세포는 금으로 코팅된 실리콘 기판(b)에서는 접착과 증식이 그다지 많이 일어나지 않았으나 폴리피롤이 코팅된 금 표면 실리콘 기판(c)에서는 상기 금으로 코팅된 실리콘 기판(b) 보다 훨씬 많은 숫자의 PC12 세포가 점착함을 알 수 있다.

전기적 자극에 의한 PC12 세포의 분화를 살펴보면, 폴리피롤이 코팅된 금 기판에서 전기적 자극에 의한 PC12 세포(d)의 분화가 활발하게 일어남을 알 수 있다. 이는 전기전도성 고분자인 폴리피롤이 신경세포의 점착과 증식에 영향을 끼칠 뿐만 아니라 세포의 분화를 유도함을 알 수 있다.

도 2에서 보는 바와 같이, 전기적 강도가 클수록 세포의 분화에 미치는 영향이 큼을 알 수 있다. 100 ㎷(a)에서는 세포의 분화가 거의 보이지 않다가 150 ㎷(b)로 증가하면 세포의 분화가 커짐을 알 수 있다. 또한, 전기적 강도가 200 ㎷(c)로 증가하면 거의 모든 세포가 신경돌기를 보이며 활발하게 망(network)을 형성함을 알 수 있다. 상기 결과로 신경세포가 분화하는데 있어서 외부 전기적 자극이 필수적이며, 이 전기적 자극도 어느 정도 이상이 되지 않으면 세포분화를 유도하지 못함을 알 수 있다. 그러나, 전압이 250 mV 이상이 되면 세포 생존능력(cell viability)에 상당한 영향을 주어 세포가 분화하는 것 보다도 세포가 받는 손상이 커진다.

도 3에서 보는 바와 같이, 전기적 자극을 주고 2시간 후 PC12 세포(a)에서는별다른 변화를 관찰하지 못하였으나, 12시간이 경과한 후 PC12세포(b)에서는 신경돌기가 형성하고 있었으며, 24시간이 지난 후 PC12세포(c)에서는 더욱 많은 신경돌기를 관찰하였다. 48시간 후 PC12세포들(d) 간의 망이 형성함을 알 수 있었다. 상기 결과로 전기적 자극에 의하여 PC12 세포가 즉각적인 반응은 보이지 않지만 시간이 지남에 따라 세포가 반응함을 알 수 있었다.

또한, 금으로 코팅된 실리콘 기판의 표면에 전도성 고분자가 코팅된 기판을 포함한 신경세포 배양용 장치를 포함한다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부되는 도면에 의거하여 더욱 상세하게 설명한다.

도 4a는 본 발명의 신경세포 배양용 장치의 일예를 나타낸 사시도이며,도 4b는 본 발명의 신경세포 배양용 장치의 일예를 나타낸 평면도이며,도 5는 본 발명의 신경세포 배양용 장치내 신경세포를 점착시키는 기판을 나타낸 단면도이다.

구체적으로 본 발명은도 4a,도 4b및도 5에 도시된 바와 같이, 배양액 존재하에 세포를 배양하는 배양기(10), 세포를 점착시키기 위한 세포배양용 기판(20), 전기적 자극을 가하기 위한 전극(24, 26) 및 기판(20)에 주는 양(+)전극의 전압을 일정하게 유지 시켜 주기 위한 유사전극(22)으로 이루어진 전기 자극에 의해 신경세포를 배양하는 통상적인 세포배양 장치(100)에 있어서, 신경세포를 점착시키기 위한 기판(20)이 금(2)으로 코팅된 실리콘 기판(1)의 표면에 전도성 고분자(3)가 코팅된 기판인 것을 특징으로 하는 신경세포 배양용 장치를 포함한다.

상기 금(2)으로 코팅된 실리콘 기판(1)의 표면에 전도성 고분자(3)가 코팅된기판(20)은 세포를 점착시켜 신경세포의 증식성의 억제 및 증진을 제어할 수 있는 것으로, 상기 전도성 고분자(3)는 폴리피롤이 바람직하며, 코팅된 폴리피롤의 두께는 전기화학적 중합법에 의하여 용도에 따라 다양하게 조절할 수 있으며, 얇은 박막은 광학적으로 투명하여 생체외 실험에서 유용하게 사용될 수 있으며, 두꺼운 필름 형태는 생체내에 삽입할 때 사용되어질 수 있다. 상기 폴리피롤은 전기중합에 의해 기판위에 코팅되어지며, 코팅 두께는 전기중합 시간 및 전류의 양에 의해 조절할 수 있다. 바람직하게는 0.5∼1.0 V에서 필요한 두께에 따라 일정한 시간동안 전기중합한다.

전기적 자극을 가하기 위한 전극(24, 26)은 전압, 전류 및 시간을 조절하기 위한 조절기와 연결되어 있어 전기적 자극을 조절할 수 있다. 전극(26)은 분 발명의 기판(20)과 연결되어 양(+)극의 역할을 수행하며, 전극(24)는 배양기(10)내에 설치되어 있으며 전극(26)의 반대편에 위치하며 백금 와이어(Pt wire)(24)로 구성되어 음(-)극의 역할을 수행한다. 그리고 전극(20)은 은와이어(Ag wire)로 구성되어 있으며 기판(20)에 주는 양(+)전극의 전압을 일정하게 유지 시켜 주기 위한 유사-기준전극(quasi-reference electrode)이다.

또한 상기 신경세포 배양용 장치에 전극에 전압, 전류 및 시간을 조절하기 위한 조절기(30)가 추가로 설치하여 신경세포를 신경세포 증식, 분화유도 및 신경돌기를 유도한다. 상기 조절기(30)는 동물 체내에 삽입이 가능한 재질 및 크기로 제작하여 사용한다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다.

단, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 금이 코팅된 실리콘 기판의 표면에 폴리피롤의 전기중합

금이 코팅된 실리콘 기판 위에 전도성 고분자인 폴리피롤을 전기적으로 중합하였다.

먼저, 금이 코팅된 기판을 헥산, 메탄올 및 메틸렌클로리드 용액에서 순차적으로 초음파 세척을 수행하였다. 전기화학적 중합을 하기 위하여 금이 코팅된 기판에 작업전극(working electrode), 백금 상대전극(Pt counter electrode) 및 은 기준전극(Ag reference electrode)을 준비하였다. 0.1몰 KCl이 함유된 0.1몰의 피롤 수용액으로부터 0.7 V의 일정한 전압에서 2분 동안 금이 코팅된 기판위에 얇은 박막 형태의 폴리피롤을 코팅하였다. 이 때 코팅된 폴리피롤의 두께는 0.3 ㎛였다.

<실시예 2> 시험관내(In Vitro) 전기적 자극

PC12 세포주는 콜라젠(collagen)이 코팅된 조직배양용 접시에 RPMI1640 배양액에서 10%의 말혈청(horse serum)과 5% 어린 송아지 혈청(fetal calf serum)의 조건하에서 배양하였다.

배양된 PC12 세포를 1.33 ×10⁴cells의 밀도로 상기 실시에 1의 폴리피롤이 코팅된 기판위에 분주를 24 시간 동안 배양하였다. 24 시간 배양 후 CO₂배양기에서 200 ㎷의 일정한 전압으로 1 시간 동안 전기적 자극을 주었다. 전기적 자극을주는 동안 폴리피롤이 코팅된 기판에는 양극을 주고, 반대편에 위치하도록 한 백금 와이어(Pt wire)에는 음극을 주도록 하였다. 그리고 은 와이어(Ag wire)에는 유사-기준전극(quasi-reference electrode)을 꽂아 두었다. 전기적 자극을 준 후 세포들은 24 시간 동안 다시 배양하였다.

분주된 세포(1.33×10⁴cells)의 수는 모든 실험이 진행되는 동안 숫자의 변화는 없었다. 자극에 의한 세포의 신경돌기의 길이는 분화의 정도를 관찰할 수 있는 척도가 된다.

<실험예 1> 폴리피롤이 코팅된 실리콘 기판위에서의 전기적 자극에 의한 PC12 세포의 분화

상기 실시예 2의 신경세포 배양방법에 의한 PC12세포의 분화를 관찰하기 위하여 전기적 자극을 주기 전과 후로 나뉘어 현미경(×40 배율)으로 관찰하였다. 폴리피롤이 코팅된 실리콘 기판에 전기적 자극을 주지 않는 것과 일반적으로 사용되는 조직배양용 접시에 배양된 PC12 세포를 비교예로 하였다.

세포배양용 접시(a), 금이 코팅된 실리콘 기판(b), 폴리피롤이 코팅된 금 기판(c) 및 전기적 자극을 가한 폴리피롤이 코팅된 금 기판(d)에서 배양된 PC12 세포를도 1에서 나타내었다.

도 1에서 보는 바와 같이, PC12 세포는 금이 코팅된 실리콘 기판(b)에서는 접착과 증식이 그다지 많이 일어나지 않았으나 폴리피롤이 코팅된 금 기판(c)에서는 상기 금이 코팅된 실리콘 기판(b) 보다 훨씬 많은 숫자의 PC12 세포가 점착함을알 수 있다.

전기적 자극에 의한 PC12 세포의 분화를 살펴보면, 폴리피롤이 코팅된 금 기판에서 전기적 자극에 의한 PC12 세포(d)의 분화가 활발하게 일어남을 알 수 있다. 이는 전기전도성 고분자인 폴리피롤이 신경세포의 점착과 증식에 영향을 끼칠 뿐만 아니라 세포의 분화를 유도함을 알 수 있다.

<실험예 2> 전기적 강도에 의한 PC12 세포 분화유도

상기 실시예 2에서 전압을 100 ㎷, 150 ㎷ 및 200 ㎷인 것을 제외하고 동일한 방법을 수행하여 각각 PC12 세포의 분화유도를 현미경(×40 배율)을 이용하여 전기적 강도에 의한 PC12 세포의 분화를 관찰하였다. 결과는도 2에 나타내었다.

도 2에서 보는 바와 같이, 전기적 강도가 클수록 세포의 분화에 미치는 영향이 큼을 알 수 있다. 100 ㎷(a)에서는 세포의 분화가 거의 보이지 않다가 150 ㎷(b)로 증가하면 세포의 분화가 커짐을 알 수 있다. 또한, 전기적 강도가 200 ㎷(c)로 증가하면 거의 모든 세포가 신경돌기를 보이며 활발하게 망(network)을 형성함을 알 수 있다. 상기 결과로 신경세포가 분화하는데 있어서 외부 전기적 자극이 필수적이며, 이 전기적 자극도 어느 정도 이상이 되지 않으면 세포분화를 유도하지 못함을 알 수 있다. 그러나, 전압이 250 mV 이상이 되면 세포 생존능력(cell viability)에 상당한 영향을 주어 세포가 분화하는 것 보다도 세포가 받는 손상이 커짐을 알 수 있다.

<실험예 3> 시간에 따른 PC12 세포의 세포분화 증가

상기 실시예 2에서 전압을 200 mV로 고정을 하고 시간을 2 시간(a), 12시간(b), 24 시간(c) 및 48 시간(d)으로 각각 변화시켜 PC12세포의 분화를 현미경(×40 배율)으로 관찰하였다. 결과는도 3에 나타내었다.

도 3에서 보는 바와 같이, 전기적 자극을 주고 2시간 후 PC12 세포(a)에서는 별다른 변화를 관찰하지 못하였으나, 12시간이 경과한 후 PC12세포(b)에서는 신경돌기가 형성하고 있었으며, 24시간이 지난 후 PC12세포(c)에서는 더욱 많은 신경돌기를 관찰하였다. 48시간 후 PC12세포들(d) 간의 망이 형성함을 알 수 있었다. 상기 결과로 전기적 자극에 의하여 PC12 세포가 즉각적인 반응은 보이지 않지만 시간이 지남에 따라 세포가 반응함을 알 수 있었다.

상술한 바와 같이, 본 발명은 금으로 코팅된 실리콘 기판의 표면에 전도성 고분자가 코팅된 기판 위에 신경세포를 점착시킨 후 배양액 존재하에서 전기적 자극을 가하여 신경세포 증식, 분화 유도 및 신경돌기를 유도하였다. 구체적으로 전기적 자극을 조절하여 신경세포로부터 돌기 및 축삭돌기(axon guidance) 형성을 관찰할 수 있었으며, 형성된 돌기 및 축삭돌기로부터 이온채널을 통한 전기적 신호를 관찰할 수 있었다. 상기한 바와 같이, 상기 신경세포 배양방법은 신경돌기의 패턴화가 가능하며, 그 위에 신경세포를 배양하여 간단한 인공회로를 형성시킨 하이브리드 소자를 제조할 수 있으며 또한 다양한 생체소자(biosensor)로 이용할 수 있다.

Claims (7)

1. 금으로 코팅된 실리콘 기판의 표면에 전도성 고분자가 코팅된 기판위에 신경세포를 점착시킨 후 전압 0.01∼1.0 V를 1 분∼4 시간동안 가하여 신경세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 신경세포 배양방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 신경세포 배양이 신경세포 증식, 분화유도 및 신경돌기 유도하는 것을 특징으로 하는 신경세포 배양방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 전도성 고분자가 폴리피롤이며, 상기 금으로 코팅된 실리콘 기판 위에 전기 중합에 의해 코팅된 것을 특징으로 하는 신경세포 배양방법.
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