CN101158677A

CN101158677A - 细胞电生理集成芯片和制作方法

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Publication number: CN101158677A
Application number: CNA2007101563600A
Authority: CN
Inventors: 王平; 徐莹; 余辉; 蔡华; 刘清君; 朱斯
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2007-10-29
Filing date: 2007-10-29
Publication date: 2008-04-09
Anticipated expiration: 2027-10-29
Also published as: CN101158677B

Abstract

本发明公开了一种细胞电生理集成芯片和制作方法。在Si基底正面中间集成MEA微电极阵列，在MEA微电极阵列两侧分别集成IDA叉指电极和LAPS光寻址电位传感器，在MEA微电极阵列另外两侧分别对称设置参考电极。本集成芯片能同时检测细胞在器件上的贴壁生长状态，动作电位及细胞新陈代谢产物中多种离子的浓度，用于实现多参数的同时并行检测，解决了集成细胞传感器芯片设计、加工的核心技术难题，为集成化细胞传感器技术的便携化及仪器化发展拓展了新的应用领域。

Description

细胞电生理集成芯片和制作方法

技术领域

本发明涉及细胞生理学，细胞传感器以及集成芯片技术，具体涉及一种细胞电生理集成芯片和制作方法。

背景技术

传统的神经电生理检测基本采用微电极进行细胞内记录，或者应用膜片钳(patch clamp)技术，将内装电极的玻璃毛细管紧贴于细胞膜，在吸破细胞膜后进行全细胞记录。微电极和膜片钳所存在的问题主要在于：用微电极刺入细胞或者钳制细胞，都会对细胞造成一定的损害，并导致细胞在很短的时间内死亡，限制了对动作电位以及离子通道电流记录的实时检测；同时，可供选择采集信号的细胞数较少，并且难以确定突触的确切位置，所记录到的信号难以具有代表性；另外，由于技术上的限制，膜片钳技术目前仍难以实现对多个神经元进行同步测量。胞外信号检测方法由于可以实现无损，长时程的测量而受到越来越多的关注，但是，在进行细胞生理实验时，对单一参数的监测往往只能从某一方面反映出细胞的生理活动，而测试环境的复杂性(各种噪声源、长期测试后培养液对电极的腐蚀等)会干扰测试的结果，所以对细胞生理活动的机理的揭示则需要同时对多种相关的生理参数进行综合分析才能完成。目前，现有仪器或器件功能单一，指标不够稳定(信噪比较低，参考对照方法较少)，且不能实现多参数同时检测，成为快速细胞生理分析发展的瓶颈。

发明内容

本发明的目的是提供一种细胞电生理集成芯片和制作方法，将细胞生化参数和电生理参数检测集成于一体，克服细胞生理参数的同时测试的难题。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：

1、一种细胞电生理集成芯片：

在Si基底正面中间集成MEA微电极阵列，在MEA微电极阵列两侧分别集成IDA叉指电极和LAPS光寻址电位传感器，在MEA微电极阵列另外两侧分别对称设置参考电极。

所述的IDA叉指电极为梳状的叉指电极对，单个叉指电极中间为暴露出的Au电极以及下面Cr黏附层，周围高出部分为SiO₂或Si₃N₄绝缘保护层，下面依次分别为SiO₂层和Si基底。

所述的MEA微电极阵列为6排正方形电极孔阵列，单个微电极结构与前所述IDA叉指电极的单个叉指电极结构相同。

所述的LAPS光寻址电位传感器结构分为4层，依次分别为Si₃N₄层，SiO₂层，Si基底以及Al层。

2、一种细胞电生理集成芯片的制作方法：

MEA微电极阵列制备过程为：采用标准半导体制作工艺，先溅射300nm的Au到硅片基底上，再采用剥离技术形成Au电极，为了和绝缘层贴合需加一层30nm的Ti、Cr或Ni层，最后做Si₃N₄或聚酰亚胺绝缘保护层，并蚀刻出电极孔；

IDA叉指电极制备过程为：采用多层光刻工艺加工电极，电极表面的叉指对为暴露出的Au电极，引线部分除了焊盘外均覆盖由等离子体气相沉积技术形成的SiO₂的绝缘层，并刻蚀出有效细胞贴附区；

LAPS光寻址电位传感器制备过程为：在Si基片上采用深法刻蚀技术将LAPS区域的氧化层干法刻蚀掉，然后采用等离子体气相沉积技术先后生长一层SiO₂层和Si₃N₄层；将基底Si基片背面的氧化层用HF溶液腐蚀掉，正面用光刻胶进行保护；然后在硅片背面溅射一层Al层作欧姆接触，完成集成芯片LAPS光寻址电位传感器的制作；

参考电极制备过程为：采用标准半导体制作工艺，先溅射300nm的Au到硅片基底上，再采用剥离技术形成金电极，为了和绝缘层贴合需加一层30nm的Ti、Cr或Ni层，最后做Si₃N₄或聚酰亚胺绝缘保护层，并蚀刻出参考电极。

在集成芯片上分别集成了微电极阵列传感器(microelectrode array，MEA)，光寻址电位传感器(light-addressable potentiometric sensor，LAPS)和叉指型细胞—阻抗传感器(interdigital sensor，IDA)三种传感器。集成芯片各部分同时工作，通过表面处理在集成芯片上培养了心肌细胞、嗅觉细胞等具有电生理活性的细胞，配合流动注射技术连续监测细胞从正常生理状态到药物刺激下的形态变化、动作电位以及代谢物质的改变。

本发明具有的有益效果是：

本集成芯片能同时检测细胞在器件上的贴壁生长状态，动作电位及细胞新陈代谢产物中多种离子的浓度，用于实现多参数的同时并行检测，解决了集成细胞传感器芯片设计、加工的核心技术难题，为集成化细胞传感器技术的便携化及仪器化发展拓展了新的应用领域。

附图说明

图1是本发明的集成芯片装配图；

图2是本发明的集成芯片的结构图；

图3是本发明的MEA和IDA芯片的剖面结构图；

图4是本发明的LAPS芯片的剖面结构图；

图5是本发明的系统连接示意图；

图6是本发明的微电极阵列(直径30μm)在PBS溶液中的器件稳定性测试图；

图7是本发明的微电极器件没有细胞耦合的电极噪声输出；

图8是本发明的微电极器件培养心肌细胞后，在药物作用下的响应信号；

图9是本发明的IDA电极与细胞的耦合示意图；

图10是本发明的贴有肾细胞的器件随时间的阻抗相对变化率图；

图11是本发明的p型Si₃N₄ LAPS器件于不同pH溶液下的i-V特性曲线；

图12是本发明的p型Si₃N₄ LAPS器件于不同pH溶液下的pH值和偏压的对应变化曲线；

图13是本发明的p型Si₃N₄ LAPS片测试的3种pH溶液在6个不同频率下测试的I-V曲线的灵敏度。

图中：1、PCB底座，2、集成芯片，2.1、IDA叉指电极，2.1.1、Si基底，2.1.2、SiO₂，2.1.3、SiO₂或Si₃N₄绝缘保护层，2.1.4、Cr黏附层，2.1.5、Au电极，2.2、MEA微电极阵列，2.3、LAPS光寻址电位传感器，2.3.1、Al层，2.3.2、SiO₂层，2.3.3、Si₃N₄层，2.4、参考电极，3、腔体槽，4、密封盖。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

如图2所示，本发明是在Si基底2正面中间集成MEA微电极阵列2.2，在MEA微电极阵列2.2两侧分别集成IDA叉指电极2.1和LAPS光寻址电位传感器2.3，在MEA微电极阵列2.2另外两侧分别对称设置参考电极2.4。

如图3所示，所述的叉指电极2.1为梳状的叉指电极对，单个叉指电极中间为暴露出的Au电极2.1.5以及下面Cr黏附层2.1.4，周围高出部分为SiO₂或Si₃N₄绝缘保护层2.1.3，下面依次分别为SiO₂层2.1.2和Si基底2.1.1。

如图2所示，所述的MEA微电极阵列2.2为6排正方形电极孔阵列，单个微电极结构与前所述IDA叉指电极2.1的单个叉指电极结构相同。如图4所示，所述的LAPS光寻址电位传感器2.3结构分为4层，依次分别为Si₃N₄层2.3.3，SiO₂层2.3.2，Si基底2.1.1以及Al层2.3.1。

1.芯片制备：

(1)MEA微电极阵列器件的制备：MEA器件设计成6排等间距阵列，过多的电极将造成引线困难和干扰的增大，寄生效应的增加，以及多路并行分析技术的复杂性。间距设置应该既能监测细胞网络，又不对周围细胞起到干扰作用。电极边长分别为70μm，50μm和30μm，适用于各种尺度的细胞培养。同时，不同的电极直径易于进行电学特性仿真，判断几何尺寸对于细胞动作电位和电生理的影响。在制作过程中，本方法采用标准半导体制作工艺，步骤简述为：溅射3 00nm的Au到硅基底上，采用剥离技术形成金电极，为了和绝缘层贴合需加一层30nm的Ti、Cr或Ni。最后做Si₃N₄或聚酰亚胺等绝缘保护层，并蚀刻出电极孔。

(2)IDA叉指电极器件的制备：

叉指电极对的数量选择中，如果叉指电极对数量过少，则自身的体阻抗较大，且大大降低了细胞与其贴附的概率；如果叉指电极对数量过多，虽然体阻抗会降低，且增大了电极与细胞接触的有效面积，但由于电极并联的关系，检测灵敏度也会相应降低。电极的宽度应与细胞尺度相近，且叉指对选择的数目合适，总体设计原则是在保证器件较小体阻抗的情况下提高测试的精度。叉指电极的基底一般为玻璃或硅基底。在本方法中，为了考虑多个传感单元的集成芯片并行设计，采用了硅基底。目前，IDA的有效电极区面积为4～25mm²左右，本方法设计的有效电极面积为8.4mm²。其中，单个叉指电极的宽度和间距均为50μm，长度为7mm，所加工的IDA电极由12对微带电极组成。采用多层光刻工艺加工电极时，电极表面的叉指对为暴露出的金电极，引线部分除了焊盘外均覆盖了SiO₂绝缘层，同时暴露出面积为8.4mm²的有效细胞贴附区。

(3)LAPS光寻址电位传感器器件的制备：

集成芯片上的LAPS光寻址电位传感器制备工艺步骤为：(1)在基片上光刻出LAPS区域；(2)由于在制作MEA与IDA单元时采用PECVD沉积了500nm厚的SiO₂层，所以LAPS单元需要将该部分氧化层去除，采用深法刻蚀技术将该部分氧化层干法刻蚀掉。(3)在LAPS区域采用等离子气相沉积先后生长一层30nm的SiO₂层和60nm的Si₃N₄层；(4)将基底硅片背面的氧化层用HF溶液腐蚀掉，正面用光刻胶进行保护，避免将正面图形破坏；然后在硅片背面溅射一层0.2μm厚的Al层作欧姆接触，完成LAPS光寻址电位传感器的制作。在集成芯片2完成制作后，将其粘在制作好的PCB底座1上，然后将腔体槽3盖在集成芯片2上，暴露出三个传感器测量区域，最后加上密封盖4，完成装配，如图1所示。芯片测试系统的连接示意图如图5所示。

2.集成芯片测试：

(1).使用聚丙二甲基硅氧烷(PDMS)膜将各单元分隔，单元间通过宽度100μm的微通道相连，并用密封垫圈等形成密封细胞测试腔，在芯片上培养具有电活性的细胞，并将培养液和药物按顺序流过测试单元。培养液或药物首先流过IDA单元，通过电阻抗测试细胞在培养液或药物环境下的生长状况，然后流入中间的MEA区域，进行细胞动作电位的检测；最后进入LAPS区域进行代谢产物中各种离子的浓度变化检测，通过检测细胞在器件上的贴壁生长状态，动作电位以及细胞新陈代谢产物中多种离子的浓度，用于实现多参数的同时并行检测。

(2).选材心肌细胞：实验取1～3天龄的小鼠，用70％乙醇消毒。剪开胸壁，取心室肌。用PBS冲洗三次。将心室肌剪成1mm³左右的小块。消化、离心后，用培养液悬浮沉淀细胞，调整细胞浓度至5×10⁵个/ml，接种到集成芯片表面的培养腔中。根据细胞生长情况，每隔2～3天换液一次。

(3).选材嗅觉细胞：将新生乳鼠剪取鼠头，取下嗅球，置于PBS液中，在解剖显微镜下剥离被膜并剪成1mm³左右的组织块，在0.25％胰蛋白酶37℃中消化并于2ml加有浓度为10μg/l NGF的DMEM培养液吹打成细胞悬液，接种于集成芯片表面的培养腔中，培养第3天滴加5-FU以抑制胶质细胞生长。培养7天后可进行检测。

(4).为了促使细胞和器件的贴合，本方法采用的表面处理过程简述如下：室温下将器件浸入含有100μg/ml的多聚鸟氨酸的磷酸盐缓冲液中24h。冲洗后，再浸入含有8μg/ml层粘素的磷酸盐缓冲液中24h，37℃，5％CO₂环境下。这层膜～4nm，因为多聚鸟氨酸和层粘素含有正电荷而使心肌细胞等细胞粘附在器件上，同时还防止了硅片上SiO₂的水合。

(5).MEA器件特性测试：为了测试每个系统中通道是否工作良好，将MEA器件的培养腔内注入pH＝7.3的PBS溶液，以直径0.1mm的螺旋状铂丝作为对电极接地，选用MEA器件上一排直径均为30μm的8个电极阵列，并行接入到8通道放大器上。将器件浸浴在PBS溶液中，连续浸泡2d，观察器件在PBS溶液的连续浸泡下，输出的噪声变化情况。可以看出，在6h测量范围内，各通道的输入噪声变化幅度不大可以看出每个通道的噪声幅度波动不是很大，基本保持在一定范围内，说明了系统8通道噪声的量级大致相同(图6)。

(6).MEA细胞动作电位测试：

MEA器件经表面处理后，可培养上团状的心肌细胞。为了初步验证基于MEA的细胞芯片的可行性，我们选用PBS液配制10μg/ml的去甲肾上腺素(NE)，作为细胞的刺激底物。鉴于去甲肾上腺素可以引起心肌兴奋性，所以被选为心肌细胞的兴奋性刺激底物，用以检测MEA细胞芯片的敏感性。

将细胞在芯片上培养2d后，用显微镜观察有细胞生长的电极并进行编号。将未加入药物的培养液泵入细胞培养测试腔，根据电极编号进行多通道测试。在无细胞耦合的电极上，主要为一些环境噪声和系统噪声输出，该记录信号可以看作是测试基线，如图7中波形。

泵入NE后，耦合有心肌细胞的电极得到如图8波形所示的电位信号改变：即出现幅度大约为30～40μV的峰值改变，在1s内出现2～3次搏动，动作电位时程为200ms左右，细胞自发放电明显。由于其余通道没有耦合上细胞，均为噪声信号，所以不作记录。对记录得到的单个波形进行分析得出，所测得信号有上升峰和下降峰，复极化时间较长。上升峰占整个信号幅度的10％～30％左右，负向峰持续时间为100ms左右。该信号与经典的膜片钳测量的波形不同，这主要与细胞-器件耦合情况、刺激、细胞类型有很大关系。根据这种差异，有研究者针对记录胞外电生理芯片的特点已采集了大量数据进行统计分析，认为胞外信号在芯片上测得的较长复极化时间可能是由于测量过程中的心肌细胞胞外Ca²⁺浓度的缓慢增强以及细胞-芯片间的耦合层电容的逐渐放电过程所共同造成的。

从研究结果得出，心肌细胞对于药物的刺激响应表现在细胞放电频率和幅度的改变，肾上腺素会影响细胞放电过程，这个结果同膜片钳电生理研究的诸多结果吻合，进一步验证了MEA细胞芯片应用于细胞电生理研究的可行性。

(7).IDA器件细胞贴壁性测试：

为测试在细胞贴壁培养后的细胞-阻抗变化影响，我们将肾细胞培养在叉指电极上。由于肾细胞属于贴壁性、繁殖力较强的细胞，在叉指电极上未进行表面处理，直接进行培养。经2d培养后，肾细胞在叉指电极上生长情况良好，细胞与器件的耦合示意图如图9所示。

5-氟尿嘧啶(5-Fluororacil)是一种抗癌药物，具有较强细胞毒性作用，尤其会影响细胞自身新陈代谢，如糖代谢、氧代谢等。为了测试肾细胞在给药或物理性的伤害下细胞贴壁程度对阻抗的影响，本实验在器件上培养了肾细胞后，采用了浓度为100μg/mL的5-氟尿嘧啶注射液作用于培养了肾细胞的多个叉指电极上，连续观察系统的输出阻抗值随时间的变化曲线。

将培养2d的肾细胞从培养箱中取出后，分别选择工作频率于6kHz、8kHz、10kHz进行测试。对肾细胞在药物刺激前，首先于室温下(20℃)静置1h后进行扫频阻抗测试；然后再隔1h加入100μg/mL的5-氟尿嘧啶，间隔1h进行扫频阻抗测试，得到如图10的时间-阻抗平均相对变化率曲线(n＝5)。在曲线中，可以看出细胞于静置状态下1h内阻抗的相对变化率在6％～8％左右，说明温度及CO₂等因素对细胞的贴壁性影响是较大的，而在加药后的1h内在10kHz下的阻抗相对变化率最大，达到8％左右，这可能是由于细胞在药物毒性的作用下凋亡或漂浮在溶液中造成的，在后2h内阻抗变化率在4％左右，阻抗变化已不太明显，而在显微镜下镜检时，这些细胞也从透明鼓起状变为皱缩状，说明药物对细胞毒性是较强的，在本实验中所引起的阻抗变化率范围在12％～16％左右，且10kHz是较好的工作点频率。由于目前实验结果只是初步的测试，应进一步将实验结果定量化。当然，从以上实验结果可看出，基于IDA的ECIS阻抗器件作为一种评价细胞生理状态的器件是具有显著意义的。

(8).LAPS器件的测试：

为了对LAPS的H标准曲线进行测试，我们取p型Si₃N₄片LAPS测量四种不同pH的标准溶液的I-V曲线(pH6～pH9)，如图11所示。将这四条S形特征曲线的下降沿用最小二乘法对其进行线性回归，可得出LAPS的线性工作区为-1.5V～0.5V，取归一化后的斜率在0.5处的点进行测试比较，发现传感器的灵敏度S为50.65mV/pH，即溶液pH变化一个单位，若光生电压(电流)要保持不变，偏置电压需变化50.65mV。pH的改变量和偏压的对应线性曲线如图12所示，线性度为0.9978，有良好的响应曲线。由于整个线性区的范围大于700mV，所以可以测试14个pH变化范围。在测量药物的酸化率时，应固定偏置电压在工作点，则当光生电压上升50.65mV，pH减少一个单位。

为直观地比较在不同光源频率下，LAPS上检测不同pH值溶液的灵敏度，本设计将3种pH溶液于6个频率下测试同一LAPS的响应曲线灵敏度用柱状图进行比较，如图13所示，各个pH的灵敏度基本相近，但6kHz和8kHz左右得到的结果较好，所以在考虑多光源对器件检测时，所采用的频率应选择在该范围内能达到较理想的结果，且能达到相近的灵敏度。

Claims

1.一种细胞电生理集成芯片，其特征在于：在Si基底(2.1.1)正面中间集成MEA微电极阵列(2.2)，在MEA微电极阵列(2.2)两侧分别集成IDA叉指电极(2.1)和LAPS光寻址电位传感器(2.3)，在MEA微电极阵列(2.2)另外两侧分别对称设置参考电极(2.4)。

2.根据权利要求1所述的一种细胞电生理集成芯片，其特征在于：所述的IDA叉指电极(2.1)为梳状的叉指电极对，单个叉指电极中间为暴露出的Au电极(2.1.5)以及下面Cr黏附层(2.1.4)，周围高出部分为SiO₂或Si₃N₄绝缘保护层(2.1.3)，下面依次分别为SiO₂层(2.1.2)和Si基底(2.1.1)。

3.根据权利要求1所述的一种细胞电生理集成芯片，其特征在于：所述的MEA微电极阵列(2.2)为6排正方形电极孔阵列，单个微电极结构与前所述IDA叉指电极(2.1)的单个叉指电极结构相同。

4.根据权利要求1所述的一种细胞电生理集成芯片，其特征在于：所述的LAPS光寻址电位传感器(2.3)结构分为4层，依次分别为Si₃N₄层(2.3.3)，SiO₂层(2.3.2)，Si基底(2.1.1)以及Al层(2.3.1)。

5.一种细胞电生理集成芯片的制作方法，其特征在于：

(1).MEA微电极阵列制备过程为：采用标准半导体制作工艺，先溅射300nm的Au到硅片基底上，再采用剥离技术形成Au电极，为了和绝缘层贴合需加一层30nm的Ti、Cr或Ni层，最后做Si₃N₄或聚酰亚胺绝缘保护层，并蚀刻出电极孔；

(2).IDA叉指电极制备过程为：采用多层光刻工艺加工电极，电极表面的叉指对为暴露出的Au电极，引线部分除了焊盘外均覆盖由等离子体气相沉积技术形成的SiO₂的绝缘层，并刻蚀出有效细胞贴附区；

(3).LAPS光寻址电位传感器制备过程为：在Si基片上采用深法刻蚀技术将LAPS区域的氧化层干法刻蚀掉，然后采用等离子体气相沉积技术先后生长一层SiO₂层和Si₃N₄层；将基底Si基片背面的氧化层用HF溶液腐蚀掉，正面用光刻胶进行保护；然后在硅片背面溅射一层Al层作欧姆接触，完成集成芯片LAPS光寻址电位传感器的制作；

(4).参考电极制备过程为：采用标准半导体制作工艺，先溅射300nm的Au到硅片基底上，再采用剥离技术形成金电极，为了和绝缘层贴合需加一层30nm的Ti、Cr或Ni层，最后做Si₃N₄或聚酰亚胺绝缘保护层，并蚀刻出参考电极。