CN110935495B - Gaba和电生理微纳同步传感检测芯片及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供了一种GABA和电生理微纳同步传感检测芯片及其制备方法，其中微纳同步传感检测芯片包括：基底层、导电层和绝缘层；基底层为柔性材料，且基底层覆于所述底托上；导电层形成于基底层上，用于同步探测大鼠海马结构的多不同子区中抑制性神经递质GABA和神经电信号的变化；导电层包括：检测位点组，分布位置与大鼠海马结构大小相匹配，检测位点组沿检测区域对角线方向辐射分布且分布于大鼠海马结构的不同子区中；绝缘层为柔性材料，绝缘层形成于除检测位点组所在区域之外的基底层上。本公开可同步探测抑制性神经递质和电信号，结合微加工工艺，纳米材料和生物敏感薄膜技术，有助于发现和理解神经信息网络和圣经退行性疾病的致病机理。

Description

GABA和电生理微纳同步传感检测芯片及其制备方法

技术领域

本公开涉及生物传感器的微加工工艺领域，尤其涉及一种用于癫痫海马脑切片γ-氨基丁酸和神经电活动的微纳同步传感检测芯片及其制备方法。

背景技术

大脑由大量神经突触组成，神经突触之间通过神经递质和神经电信号的两种传导方式进行神经信号的交互转导来完成我们日常的行为运动学习等功能活动。神经突触之间神经递质释放异常或电信号的发放异常都有可能预示潜在的神经性疾病的存在。通过同步检测两种双模信号的变化情况将有助于提前获得神经性细胞病变情况，并有助于掌握和理解神经性疾病的致病机理和发现更为有效的治疗方案。

目前，电生理信号最为常见的是脑电信号，脑皮层信号和脑深部核团信号偏多，单个神经元的放电信号检测由于技术手段限制研究相对较少。而对于神经递质的检测，常见的电活性神经递质多巴胺和五羟色胺，酶类反应神经递质谷氨酸和乙酰胆碱多被检测，γ-氨基丁酸(GABA)作为一种抑制性神经递质与癫痫病有很大的关系。GABA神经递质的检测由于其缺乏电活性基团和独特专一的酶，使其在体内实时检测造成了巨大的困难。

因此设计一种用于癫痫海马脑切片γ-氨基丁酸和神经电活动的微纳同步传感检测技术的方法尤其重要，对于我们发现神经疾病尤其是神经电和GABA在癫痫疾病中的重要角色提供了方便有效的检测手段。

发明内容

(一)要解决的技术问题

本公开提供了一种GABA和电生理微纳同步传感检测芯片及其制备方法，以至少部分解决以上所提出的技术问题。

(二)技术方案

根据本公开的一个方面，提供了一种GABA和电生理微纳同步传感检测芯片，包括：

基底层，为柔性材料，所述基底层覆于底托上；

导电层，形成于所述基底层上，用于同步探测大鼠海马结构的多个不同子区中抑制性神经递质GABA和神经电信号的变化；所述导电层包括：

检测位点组，分布位置与大鼠海马结构大小相匹配，所述检测位点组沿检测区域对角线方向辐射分布且分布于大鼠海马结构的不同子区中；

绝缘层，为柔性材料，所述绝缘层形成于除所述检测位点组所在区域之外的所述基底层上。

在本公开的一些实施例中，所述检测位点组包括：

多个电化学检测位点，分布于大鼠海马结构的多个不同子区中，用于检测海马各区GABA浓度变化；所述电化学检测位点呈矩形；

多个电生理检测位点，沿所述电化学检测位点逐次分布在所述电化学检测位点对应的所述大鼠海马结构的子区中，用于检测海马各区神经电信号变化；所述电生理检测位点呈圆形。

在本公开的一些实施例中，所述大鼠海马结构的子区包括：CA1、CA2、CA3和DG。

在本公开的一些实施例中，所述检测位点组包括4个电化学检测位点和32个电生理检测位点，在大鼠海马结构的四个子区中的神经元胞体位置设置各一个电化学检测位点和多个电生理检测位点进行同步探测。

在本公开的一些实施例中，所述导电层还包括：

对电极，设置于所述大鼠海马结构的中心位置，所述对电极呈矩形；

参比电极，设置于所述大鼠海马结构的中心位置，且与所述对电极相邻；所述参比电极呈矩形。

在本公开的一些实施例中，对电极和所述参比电极分别设置两对，且对称分布于所述大鼠海马结构的中心位置。

在本公开的一些实施例中，所述导电层还包括：多个焊盘，分布于所述基底层边缘，且所述绝缘层形成于所述焊盘所在区域之外的所述基底层上；所述焊盘分别与所述检测位点组通过导线对应相连，用于接收检测位点组输出的传感信号并通过外接导线传出到记录仪器中；所述焊盘呈矩形。

在本公开的一些实施例中，电化学检测位点表面修饰纳米聚合物材料和/或双酶GABase氧化酶和间苯二胺抗干扰膜；电生理检测位点表面修饰纳米聚合物材料；所述基底层和所述绝缘层的材料为Parylene C薄膜。

根据本公开的另一个方面，提供了一种GABA和电生理微纳同步传感检测芯片的制备方法，包括：

在干净的硅片或玻璃表面进行Parylene C薄膜的沉积形成基底层，在基底层上进行甩胶，光刻，显影，溅射和剥离获得导电层；

在剥离后的导电层上进行第二次Parylene C薄膜的沉积，得到绝缘层；

通过第二次甩胶光刻显影显露出需要刻蚀掉的Parylene C薄膜，包括电化学检测位点、电生理检测位点和焊盘所在区域，并进行氧气等离子体刻蚀；

进行第三次光刻，暴露出电极与电极之间需要刻蚀的部分，进行干法刻蚀；

进行清洗后，焊盘与转接口连接，在多个电化学检测位点表面修饰纳米聚合物材料和/或双酶GABase氧化酶和间苯二胺抗干扰膜；在多个电生理检测位点表面修饰纳米聚合物材料。

(三)有益效果

从上述技术方案可以看出，本公开GABA和电生理微纳同步传感芯片及其制备方法至少具有以下有益效果其中之一或其中一部分：

(1)本公开检测位点组同步探测大鼠海马区各个不同亚区中抑制性神经递质GABA和神经电信号的变化，海马各区GABA浓度变化和神经放电信号的探测对我们发现相应性海马神经性疾病具有重要的意义，尤其是与GABA浓度和放电极其相关的癫痫疾病，海马病灶区的检测有助于我们发现癫痫致病机理。

(2)本公开采用Parylene C薄膜作为基底膜和绝缘薄膜具有良好的生物相容性，能够用于脑片培养或者神经元的大量培养繁殖。

(3)本公开表面修饰的PEDOT：PSS聚合物材料具有生物相容性，有助于神经细胞的生存和粘附。

(4)本公开采用双酶法对GABA神经递质的检测，实现了实时同步原位直接探测。

附图说明

图1为本公开实施例微纳同步传感检测芯片的平面微电极阵列设计示意图。

图2为检测位点组中心位点布局放大示意图。

图3为检测位点组与大鼠海马结构匹配测试结构示意图。

图4a-图4i为本公开实施例微纳同步传感芯片制备方法的平面微电极阵列工艺制备流程图示意图。

【附图中本公开实施例主要元件符号说明】

1-底托；

2-基底层；

3-检测位点组；

31-电化学检测位点；

32-电生理检测位点；

4-焊盘；

5-导线；

6-对电极；

7-参比电极；

8-大鼠海马结构。

具体实施方式

本公开提供了一种GABA和电生理微纳同步传感检测芯片及其制备方法，其中微纳同步传感检测芯片包括：基底层、导电层和绝缘层；基底层为柔性材料，且基底层覆于所述底托上；导电层形成于所述基底层上，用于同步探测大鼠海马结构的多不同子区中抑制性神经递质GABA和神经电信号的变化；所述导电层包括：检测位点组，分布位置与大鼠海马结构大小相匹配，所述检测位点组沿检测区域对角线方向辐射分布且分布于大鼠海马结构的不同子区中；绝缘层为柔性材料，所述绝缘层形成于除所述检测位点组所在区域之外的所述基底层上。本公开可同步探测抑制性神经递质和电信号，结合微加工工艺，纳米材料和生物敏感薄膜技术，有助于发现和理解神经信息网络和圣经退行性疾病的致病机理。

为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本公开进一步详细说明。

本公开某些实施例于后方将参照所附附图做更全面性地描述，其中一些但并非全部的实施例将被示出。实际上，本公开的各种实施例可以许多不同形式实现，而不应被解释为限于此数所阐述的实施例；相对地，提供这些实施例使得本公开满足适用的法律要求。

在本公开的一个示例性实施例中，提供了一种GABA和电生理微纳同步传感检测芯片。图1为本公开实施例微纳同步传感检测芯片的平面微电极阵列设计示意图。图2为检测位点组中心位点布局放大示意图。图3为检测位点组与大鼠海马结构匹配测试结构示意图。如图1至图3所示，本公开GABA和电生理微纳同步传感检测芯片，基底层2以具有一定厚度的玻璃基底为底托1，自下而上顺次包括基底层2、导电层和绝缘层。在底托1上蒸镀一层薄薄的Parylene C薄膜作为基底层2，其厚度为2μm。中层光刻显影溅射剥离获得导电层结构，上层蒸镀Parylene C绝缘层薄膜。

如图2所示，导电层包括检测位点组3、对电极6、参比电极7、导线5和焊盘4。检测位点组3包括电化学检测位点3l和电生理检测位点32，电化学检测位点31和电生理检测位点32分布在导电层的最中心，分布在大鼠海马结构8的各个子区域，如图3所示。对电极6和参比电极7分别设计了两组，对称分布于所述大鼠海马结构8的中心位置。其中一组作为测试用，另一组作为备用。焊盘4分别设计在基底层2的最外围，以方便连接外端仪器测试。多个焊盘4分布于基底层2边缘且呈矩形，焊盘4分别与检测位点组3通过导线5对应相连，用于接收检测位点组输出的传感信号并通过外接导线传出到记录仪器中。绝缘层形成于除电化学检测位点31、电生理检测位点32和焊盘4所在区域之外的基底层2上。在一具体实施例中，检测位点组包括4个电化学检测位点31为正方形结构和32个电生理检测位点32，分别在大鼠海马结构8的四个子区(CA1、CA2、CA3和DG)中的神经元胞体位置设置各一个电化学检测位点31和多个电生理检测位点32进行同步探测。可以选择的，所述电化学检测位点31呈矩形，所述电生理检测位点32呈圆形，对电极6、参比电极7和焊盘4均呈矩形。

导电层包含薄薄的粘附层钛层(厚度50nm)和金导电层(厚度200nm)，通过甩胶光刻显影溅射剥离获得导电层结构。

导电层表面的绝缘层结构为Parylene C薄膜，厚度为2μm，通过AZ9260光刻厚胶作掩膜保护，厚度为9μm，使用氧气等离子体刻蚀敏感检测位点和焊盘4表面的Parylene薄膜。

用丙酮清洗干净的检测位点组3，具体包括电化学检测位点31和电生理检测位点32均修饰纳米聚合物薄膜PEDOT：PSS材料。电化学检测位点31另外再使用涂覆法修饰GABase酶和电镀修饰间苯二胺mPD抗干扰膜。具体地，GABase双酶与戊二醛、牛血清白蛋白以浓度为2％，0.5％，0.1％混合交联4分钟左右出现淡黄色后，借助微注射泵和显微镜下滴涂，选择相应大鼠海马结构的子区中对应的电化学检测位点(在本设计中为方形结构)涂覆酶交联剂作为电化学检测位点31，后常温静置48h后，电镀mPD抗干扰膜。

GABA反应检测原理如下所示：

步骤1：

步骤2：

步骤3：2NADPH+O₂+2H⁺→2NADP⁺+2H₂O

其中GABA-T和SSDH双酶已经固定在电位位点的表面，而NADP+辅酶是步骤2的反应物同时也是步骤3的生成物，也就是该辅酶在反应中只需要一次加入即可。对GABA浓度的检测过程即为首先在脑片溶液中加入一定浓度的NADP+辅酶和α-ketoglutarate即可。脑片溶液中的GABA浓度的量即和反应电流的大小成正比。

在本公开的一个示例性实施例中，还提供了一种GABA和电生理微纳同步传感检测芯片的制备方法。图4a-图4i为本公开实施例微纳同步传感芯片制备方法的平面微电极阵列工艺制备流程图示意图。如图4a-图4i所示，本发明的具体制备过程示意如图4详述如下：

步骤1：为在干净的硅片或玻璃上蒸镀一层Parylene C薄膜，厚度为2μm，作为基底层，如图4a所示。

步骤2：在作为基底层的Parylene C薄膜表面旋涂一层正性光刻胶AZ1505，厚度为1.5μm；通过导电层掩膜版光刻显影后裸露出导电层结构图案，如图4b所示。

步骤3：在光刻胶图案的表面首先溅射一层粘附层Ti 50nm，接着溅射金导电薄膜层200nm，金属层溅射后的硅片放入丙酮溶液中进行剥离，将多余的金属层结构去除，裸露出需要的检测位点组，焊盘及导线，如图4c所示。

步骤4：在导电层结构表面进行第二次绝缘层Parylene C薄膜的蒸镀，厚度为2μm，如图4d所示。

步骤5：在绝缘层表面旋涂一层正性光刻胶AZ9260，厚度为9μm，如图4e所示。

步骤6：通过光刻显影以后裸露出需要刻蚀开窗口的检测位点组和焊盘的图案，如图4f所示。

步骤7：将硅片放入Plasma氧气中进行Parylene刻蚀，光刻胶和Parylene薄膜都会被刻蚀，检测位点组和焊盘上直接刻蚀2μm厚度的Parylene薄膜，别的位置刻蚀的是9μm厚度的光刻胶，Parylene薄膜和光刻胶两者刻蚀速率相差不大，检测位点组和焊盘上2μm厚度的Parylene薄膜刻蚀完成以后，导线上9μm厚度光刻胶还会有大部分残留在导线表面以保护绝缘层结构，如图4g所示。

步骤8：清洗微纳同步传感检测芯片表面剩余光刻胶，裸露出检测位点组和焊盘，如图4h所示。

步骤9：为在裸露检测位点组的电化学检测位点和电生理检测位点电镀PEDOT：PSS纳米颗粒材料，并在电化学检测位点上另外修饰GABase酶和间苯二胺薄膜，如图4i所示。

至此，已经结合附图对本公开实施例进行了详细描述。需要说明的是，在附图或说明书正文中，未绘示或描述的实现方式，均为所属技术领域中普通技术人员所知的形式，并未进行详细说明。此外，上述对各元件和方法的定义并不仅限于实施例中提到的各种具体结构、形状或方式，本领域普通技术人员可对其进行简单地更改或替换。

依据以上描述，本领域技术人员应当对本公开微纳同步传感检测芯片及其制备方法有了清楚的认识。

综上所述，本公开提供一种微纳同步传感检测芯片及其制备方法同步探测大鼠海马区各个不同亚区中抑制性神经递质GABA和神经电信号的变化，海马各区GABA浓度变化和神经放电信号的探测对我们发现相应性海马神经性疾病具有重要的意义，尤其是与GABA浓度和放电极其相关的癫痫疾病，海马病灶区的检测有助于我们发现癫痫致病机理。

还需要说明的是，实施例中提到的方向用语，例如“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”等，仅是参考附图的方向，并非用来限制本公开的保护范围。贯穿附图，相同的元素由相同或相近的附图标记来表示。在可能导致对本公开的理解造成混淆时，将省略常规结构或构造。

并且图中各部件的形状和尺寸不反映真实大小和比例，而仅示意本公开实施例的内容。另外，在权利要求中，不应将位于括号之间的任何参考符号构造成对权利要求的限制。

除非有所知名为相反之意，本说明书及所附权利要求中的数值参数是近似值，能够根据通过本公开的内容所得的所需特性改变。具体而言，所有使用于说明书及权利要求中表示组成的含量、反应条件等等的数字，应理解为在所有情况中是受到「约」的用语所修饰。一般情况下，其表达的含义是指包含由特定数量在一些实施例中±10％的变化、在一些实施例中±5％的变化、在一些实施例中±1％的变化、在一些实施例中±0.5％的变化。

再者，单词“包含”不排除存在未列在权利要求中的元件或步骤。位于元件之前的单词“一”或“一个”不排除存在多个这样的元件。

说明书与权利要求中所使用的序数例如“第一”、“第二”、“第三”等的用词，以修饰相应的元件，其本身并不意味着该元件有任何的序数，也不代表某一元件与另一元件的顺序、或是制造方法上的顺序，该些序数的使用仅用来使具有某命名的一元件得以和另一具有相同命名的元件能做出清楚区分。

此外，除非特别描述或必须依序发生的步骤，上述步骤的顺序并无限制于以上所列，且可根据所需设计而变化或重新安排。并且上述实施例可基于设计及可靠度的考虑，彼此混合搭配使用或与其他实施例混合搭配使用，即不同实施例中的技术特征可以自由组合形成更多的实施例。

类似地，应当理解，为了精简本公开并帮助理解各个公开方面中的一个或多个，在上面对本公开的示例性实施例的描述中，本公开的各个特征有时被一起分组到单个实施例、图、或者对其的描述中。然而，并不应将该公开的方法解释成反映如下意图：即所要求保护的本公开要求比在每个权利要求中所明确记载的特征更多的特征。更确切地说，如下面的权利要求书所反映的那样，公开方面在于少于前面公开的单个实施例的所有特征。因此，遵循具体实施方式的权利要求书由此明确地并入该具体实施方式，其中每个权利要求本身都作为本公开的单独实施例。

以上所述的具体实施例，对本公开的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本公开的具体实施例而已，并不用于限制本公开，凡在本公开的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种GABA和电生理微纳同步传感检测芯片，包括：

基底层，为柔性材料，所述基底层覆于底托上；

导电层，形成于所述基底层上，用于同步探测大鼠海马结构的多个不同子区中抑制性神经递质GABA和神经电信号的变化；所述导电层包括：

检测位点组，分布位置与大鼠海马结构大小相匹配，所述检测位点组沿检测区域对角线方向辐射分布且分布于大鼠海马结构的不同子区中；其中，所述检测位点组包括：

多个电化学检测位点，分布于大鼠海马结构的多个不同子区中，用于检测海马各区GABA浓度变化；所述电化学检测位点呈矩形；其中，所述电化学检测位点表面修饰纳米聚合物材料和/或双酶GABase氧化酶和间苯二胺抗干扰膜；

多个电生理检测位点，沿所述电化学检测位点逐次分布在所述电化学检测位点对应的所述大鼠海马结构的子区中，用于检测海马各区神经电信号变化；所述电生理检测位点呈圆形；其中，所述电生理检测位点表面修饰纳米聚合物材料；

其中，所述大鼠海马结构的子区包括：CA1、CA2、CA3和DG；

其中，所述检测位点组包括4个电化学检测位点和32个电生理检测位点，在大鼠海马结构的四个子区中的神经元胞体位置设置各一个电化学检测位点和多个电生理检测位点进行同步探测；

绝缘层，为柔性材料，所述绝缘层形成于除所述检测位点组所在区域之外的所述基底层上；其中，所述基底层和所述绝缘层的材料为Parylene C薄膜。

2.根据权利要求1所述的GABA和电生理微纳同步传感检测芯片，其中，所述导电层还包括：

对电极，设置于所述大鼠海马结构的中心位置，所述对电极呈矩形；

参比电极，设置于所述大鼠海马结构的中心位置，且与所述对电极相邻；所述参比电极呈矩形。

3.根据权利要求2所述的GABA和电生理微纳同步传感检测芯片，其中，对电极和所述参比电极分别设置两对，且对称分布于所述大鼠海马结构的中心位置。

4.根据权利要求1所述的GABA和电生理微纳同步传感检测芯片，其中，所述导电层还包括：

多个焊盘，分布于所述基底层边缘，且所述绝缘层形成于所述焊盘所在区域之外的所述基底层上；所述焊盘分别与所述检测位点组通过导线对应相连，用于接收检测位点组输出的传感信号并通过外接导线传出到记录仪器中；所述焊盘呈矩形。

5.一种如权利要求1至4中任一项所述的GABA和电生理微纳同步传感检测芯片的制备方法，包括：

在干净的硅片或玻璃表面进行Parylene C薄膜的沉积形成基底层，在基底层上进行甩胶，光刻，显影，溅射和剥离获得导电层；

在剥离后的导电层上进行第二次Parylene C薄膜的沉积，得到绝缘层；

通过第二次甩胶光刻显影显露出需要刻蚀掉的Parylene C薄膜，包括电化学检测位点、电生理检测位点和焊盘所在区域，并进行氧气等离子体刻蚀；

进行第三次光刻，暴露出电极与电极之间需要刻蚀的部分，进行干法刻蚀；

进行清洗后，焊盘与转接口连接，在多个电化学检测位点表面修饰纳米聚合物材料和/或双酶GABase氧化酶和间苯二胺抗干扰膜；在多个电生理检测位点表面修饰纳米聚合物材料。

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