JP5011984B2 - 細胞電気生理センサ - Google Patents

Description

本発明は、細胞の電気生理的活動の測定に用いられる細胞電気生理センサに関するものである。

従来、電気生理学におけるパッチクランプ法は、細胞膜に存在するイオンチャンネルを測定する方法として知られており、このパッチクランプ法によってイオンチャンネルの様々な機能が解明されてきた。そして、イオンチャンネルの働きは細胞学において重要な関心ごとであり、これは薬剤の開発にも応用されている。

しかし、一方でパッチクランプ法は測定技術に微細なマイクロピペットを１個の細胞に高い精度で挿入するという極めて熟達した操作を必要としているため、熟練作業者でさえ多くの測定をこなせないことがある。従って高いスループットで測定を必要とする場合には適切な方法でない。

このため、微細加工技術を利用した基板型プローブの開発がなされており、これらは個々の細胞についてマイクロピペットの挿入を必要としない自動化システムに適している。例えば、基板の上に設けられた細胞保持手段を備えたウエルと、このウエルの電気信号を検出する測定用電極と、基準電極とを備えた細胞外電位測定用デバイスによって細胞外電位を測定する技術を開示している（例えば特許文献１参照）。図２０はこの従来の細胞電気生理センサのウエル構造を模式断面図で示したものであり、ウエル１０６内に培養液１０７が入れられ、検体細胞１０５は基板１０１に設けられた細胞保持手段によって保持されている。細胞保持手段は基板１０１に形成された窪み１０２とこの窪み１０２に連絡する貫通孔１０３を備えた構成となっている。

この貫通孔１０３の内部にはセンサ手段である測定電極１０４が配置されており、この測定電極１０４は信号検出部に接続されている。

測定の際は検体細胞１０５を貫通孔１０３からポンプなどにより吸引することにより、この検体細胞１０５が窪み１０２に密着し保持される。このようにして検体細胞１０５の活動により発生する電気信号は貫通孔１０３に設けた測定電極１０４と参照電極１０８によって、電位の変化あるいは電流の変化として検出される。

このように、基板１０１に形成された貫通孔１０３はガラスピペットにおける先端穴と同様の役割を果たし、細胞の電気生理現象を記録できるとともに、基板１０１の裏面側からの吸引によって細胞が引きつけられ、検体細胞１０５を容易に保持できる。
国際公開第０２／０５５６５３号パンフレット

前記従来の構成において、微細加工技術を利用した基板型プローブは、シリコンまたはシリコン酸化物のドライエッチング技術を用いて作製されるために極めて微小であり、測定のためにこれら微小な多数のプローブを１枚の枠体基板の決まった場所にきちんと固定する必要がある。しかしながらプローブが極めて微小で、その上下を区別しながら固定せねばならず、また１枚の枠体基板に数十個以上のプローブを固定するので多大な作業を必要とし、製造上のボトルネックとなっている。

上記課題を解決するために本発明は、貫通孔を有するダイアフラム部および、このダイアフラム部の下面に形成された中空の支持部からなるプローブと、このプローブが挿入される孔を有する枠体基板とからなり、前記ダイアフラム部の上面に検体細胞を保持させてこの検体細胞の電気生理現象を測定する細胞電気生理センサであって、前記ダイアフラム部の上面の外径は前記支持部の外径より大きく、かつ前記孔の内径は前記支持部の外径よりも大きくなるように構成したものである。

本発明の細胞電気生理センサによれば多数の微小なプローブを枠体基板に固定する際、プローブの上下を識別することなく容易に位置決めを行い、固定することができる。

以下、本発明を実施するための最良の形態について、図面を参照しながら説明する。なお、本発明はこれら実施の形態に限定されるものではない。

（実施の形態１）
図１において、ダイアフラム部１ａには貫通孔２が形成されており、このダイアフラム部１ａの厚みは約２０μｍである。さらにダイアフラム部１ａの直径は約７００μｍでその下面には、中空円筒状の支持部１ｂが設けられている。

貫通孔２の開口径は、測定する細胞の大きさ、形状、性質によって決定され、検体細胞の大きさが５〜５０μｍ程度の場合、細胞が貫通孔２に密着して保持されるには貫通孔２の開口径は３μｍ以下であることが望ましく、本実施の形態１では３μｍである。

このようにダイアフラム部１ａ、貫通孔２、支持部１ｂから構成されるプローブ１は枠体基板３に形成された孔３ａに固定される。枠体基板３は例えばポリエチレンのような容易に成型可能なポリマー材料から成り、厚みは約４００μｍである。

プローブ１におけるダイアフラム部１ａの外形は中空の支持部１ｂの外形より大きく設計されている。また、枠体基板３の孔３ａの内径は、ダイアフラム部１ａの外形より小さく、且つ中空の支持部１ｂの外形より大きく設計されている。このような構成により、プローブ１を枠体基板３の孔３ａへ固定する際に、プローブ１が図の下方向に抜け落ちることなく、孔３ａへ収めることが可能となる。なお、このときプローブ１は支持部１ｂが孔３ａに収まり、ダイアフラム部１ａが枠体基板３の上面側になって、枠体基板３にきちんと収まるという効果が得られる。

また、支持部１ｂの厚みをダイアフラム部１ａに比較して厚く形成しているので、支持部１ｂの重さはダイアフラム部１ａより重くなっている。すなわちプローブ１は外形の大きくて薄いダイアフラム部１ａよりも外形の小さな支持部１ｂの方に重心がくるようになっている。またダイアフラム部１ａの直径に比較して支持部１ｂの高さが低くなっているので、支持部１ｂが孔３ａに斜めに入るというようなことはほとんど起こらない。したがって多数のプローブ１を枠体基板３の上に無作為に置き、枠体基板３を左右に揺動させたり上下に振動を加えたりすると、支持部１ａが重力により下向きになる確率が高くなり、孔３ａへ収まる。このようにして枠体基板３の孔３ａへプローブ１を収めた後に、枠体基板３の横方向からエアーを吹き付けることにより不要なプローブ１を除去し、再度枠体基板３の上に多数のプローブ１を置いて左右に揺動し、エアーを吹き付けることを繰り返すことにより、図２に示すように枠体基板３の孔３ａすべてにプローブ１が収まる。最後に接着剤等を用いて多くのプローブ１が１枚の枠体基板３へ容易に固定される。

図１において、プローブ１の貫通孔２の開口径は３μｍなので、本細胞電気生理センサでは３μｍ程度の埃の混入を抑制する必要がある。本発明の構成によれば、プローブ１を枠体基板３の孔３ａへ収める際に直接触れることはないので、プローブ１の貫通孔２付近への埃やゴミの付着を低減できる。

次に、本発明の細胞電気生理センサの動作について説明する。

図３に示すようにダイアフラム部１ａの上面に検体細胞６を含んだ細胞外液７ａを満たした後、ダイアフラム部１ａの上面から加圧するか、ダイアフラム部１ａの下面を減圧することによって、検体細胞６とダイアフラム部１ａの上面の細胞外液７ａは、貫通孔２に引き込まれ、検体細胞６は貫通孔２を塞ぐように保持される。このとき、ダイアフラム部１ａの下面側は細胞内液７ｂによって満たしておく。

通常、細胞内液７ｂは、例えば哺乳類筋細胞の場合、代表的にはカリウムイオン濃度が１５５ｍＭ程度、ナトリウムイオン濃度が１２ｍＭ程度、塩素イオン濃度が４．２ｍＭ程度添加された電解液であり、細胞外液７ａは、カリウムイオン濃度が４ｍＭ程度、ナトリウムイオン濃度が１４５ｍＭ程度、塩素イオン濃度が１２３ｍＭ程度添加された電解液である。

次に、ダイアフラム部１ａの下面側から吸引、もしくは薬剤、例えばナイスタチンなどを投入することにより、検体細胞６に微細小孔（図示せず）を形成する。

その後、検体細胞６への刺激となりうる行為を細胞外液７ａの方から施す。この刺激の種類としては、例えば化学薬品、毒物などの化学的な刺激に加え、機械的変位、光、熱、電気、電磁波などの物理的な刺激なども含む。

そして検体細胞６がこれらの刺激に対して活発に反応する場合、検体細胞６は細胞膜が保有するチャンネルを通じて各種イオンを放出あるいは吸収する。この結果として、細胞内外の電位勾配が変化し、その変化を電極４、電極５によって電流値として測定する。

次に、本発明の細胞電気生理センサの製造方法について説明する。

この細胞電気生理センサにおけるプローブの製造方法は図４に示すように基板８として中間にシリコン酸化物層１０を有するＳＯＩ（Silicon On Insulator）基板を用意し、基板８の上面９ａにレジストマスク１１を形成する。

次に基板８の上面９ａを下方向にドライエッチングすることにより、図５に示すように中空円筒状の支持体１ｂと中空の支持体１ｂ外形より大きいダイアフラム部１ａが得られ結果的にプローブ１が形成される。このときエッチング法は、ドライエッチングによる方法が最適であり、ドライエッチングの際にはエッチングを促進するガスと、エッチングを抑制するガスを用いる。このエッチングを促進するガスとしては、二フッ化キセノン、六フッ化硫黄などがある。また、エッチングを抑制するガスとしてはトリフルオロメタン、八フッ化シクロブタンなどがある。これらのガスを混合してエッチングすることにより、エッチングされた壁面にフルオロカーボンのポリマーである保護膜を作製できるので、ドライエッチングによる中空の支持体１ｂの形成をレジストマスクの下方のみに進行させることが可能となる。なお、このときエッチングストップ層としてシリコン酸化物層１０を用いる。このことにより、中空の支持体の深さを高精度に制御することが可能となる。その後、レジストマスク１１を除去すると図６に示すようなプローブ１が形成される。

次に、図７に示すように、プローブ１の上下を逆転して、ダイアフラム部１ａの上面に所定のパターンでレジストマスク１２を形成する。このとき、レジストマスク１２のエッチングホール１２ａの形状は、必要とする貫通孔の形状とほぼ同じになるように設計する。

その後、ドライエッチングすることによって図８のように貫通孔２が形成される。続いてエッチングストップ層であるシリコン酸化物層１０をドライエッチングするのに適したガス、例えば四フッ化炭素などを用いてこのシリコン酸化物層１０をエッチングし、図９のように貫通孔２を完成させる。

ここで得られるプローブ１は、エッチングストップ層としてシリコン酸化物層１０を用いたために、高精度に加工することが可能である。最後にレジストマスク１２を除去すると図１０に示すようなプローブ１が得られる。

このようにして得られたプローブ１は図１に示すように、枠体基板３の孔３ａに抜け落ちることなく容易に収めることが可能となり、最後に接着剤等を用いることで、プローブ１を枠体基板３へ固定する。

（実施の形態２）
次に実施の形態２を用いて本発明について説明する。

本実施の形態２は実施の形態１の枠体基板の厚みを変えた以外は実施の形態１と同一であるのでこの枠体基板についてのみ説明する。

図１１に示したように、枠体基板２１はプローブ１よりも厚くなっている。これによりダイアフラム部１ａが枠体基板２１から浮き出ることなく枠体基板２１の表面に着実に接することが可能となる。

（実施の形態３）
実施の形態３を用いて本発明について説明する。本実施の形態３は、実施の形態２の枠体基板の形状を変更した以外は実施の形態２と同一であるのでこの枠体基板について説明する。

図１２に示したように、枠体基板２２の孔２２ａの上側の開口部周辺にはプローブ１のダイアフラム部１ａの外形より大きい凹部２２ｂが形成されている。

枠体基板２２をこのような構造にすることにより、接着剤等を用いてプローブ１を固定する際、接着剤を塗布するスペースを設けることが可能となる。また枠体基板２２の横方向からの風圧により不要なプローブを除去する場合には、枠体基板２２の孔２２ａに収まったプローブ１への影響を軽減することが可能となる。

また、図１３に示したように枠体基板２３に形成された凹部２３ｂの深さを、ダイアフラム部１ａの厚さとほぼ同じにしてもよい。

このような構造にすることにより枠体基板２３とダイアフラム部１ａとの段差がなくなり、検体細胞を貫通孔２の位置に引き込む際、検体細胞に傷をつけることなく滑らかに引き込むという効果が得られる。

また、図１４に示したように、枠体基板２３に設けられた凹部２３ｂの深さを含めた形状が、プローブ１と相似形状としてもよい。これにより、細胞外液７ａを貫通孔２へ引き込む際に気泡が発生する原因となり得る微小スペースが低減され、気泡の発生を抑制できるといった効果も得られる。

（実施の形態４）
次に本実施の形態４を用いて本発明を説明する。本実施の形態４は、実施の形態１のダイアフラム部の形状を変えた以外は実施の形態１と同一であるのでこのダイアフラム部についてのみ説明する。

図１５において、プローブ１３のダイアフラム部１３ａの厚みは外周部から中心の貫通孔１４に向かって薄くなっている。すなわちダイアフラム部１３ａの貫通孔１４の付近にくぼみを設けることにより検体細胞６が貫通孔１４へ引き込まれやすくなり、安定して保持されるという効果が得られる。

（実施の形態５）
実施の形態５を用いて本発明について説明する。本実施の形態５は、実施の形態１のプローブのみを変えている。図１６に示したように、プローブ１５のダイアフラム部１５ａには検体細胞を引き込み保持する３つの貫通孔１６ａ、１６ｂ、１６ｃが直線状に設けられている。支持部１５ｂは実施の形態４と同じく中空の円形であり、枠体基板（図示せず）にはダイアフラム部１５ａが収まる窪みが設けられている。

本プローブ１５の貫通孔１６ａ、１６ｂ、１６ｃに検体細胞が一つずつ保持されて合計３つの検体細胞の電流値の合計を測定することになるためＳ／Ｎ比がよくなり、測定精度が向上するという効果を有する。

（実施の形態６）
実施の形態６を用いて本発明について説明する。本実施の形態６は実施の形態５のプローブ形状を変えている。

図１７に示すようにプローブ１７のダイアフラム部１７ａは長方形であり、その中央部に貫通孔１８ａ、１８ｂ、１８ｃが直線状に形成されている。支持部１７ｂはこれまでの実施の形態と同じく中空の円形である。この長方形のプローブ１７の配置は図１８に示すように多数のプローブ１７が枠体基板２４に固定されており、この枠体基板２４には長方形のダイアフラム部が収まるように長方形の窪み（図示せず）が形成されているので多数のプローブ１７と枠体基板２４とはほぼ同一平面上になっている。

以上のような構成により、多数のプローブ１７を枠体基板２４に固定するためにダイアフラム部周辺に接着剤を塗布する際、直線的な動きで接着剤の塗布ができるので、正確にかつ短時間で接着剤の塗布を行い固定することが可能になる。

さらに各プローブ１７の貫通孔１８ａ、１８ｂ、１８ｃが直線状に配列され、枠体基板２４全体で直線状に整然と配列されるので、各プローブにマイクロピペットを用いて細胞外液を滴下し供給していく際、直線的な動きで多数の貫通孔の近傍に滴下することができ、効率のよい測定が可能となる。

なお本実施の形態においてプローブ１７のダイアフラム部１７ａは必ずしも長方形でなくとも多角形の形状でもよい。たとえば図１９に示すプローブ１９のダイアフラム部１９ａの形状は五角形でありその中央部に貫通孔２０ａ、２０ｂ、２０ｃが直線状に形成されているので、枠体基板２５全体で各プローブに形成された貫通孔が直線状に整然と配列される。

本発明による細胞電気生理センサは、複数個の微小なプローブを枠体基板の決められた位置に容易に配置し、固定できるので細胞の電気生理的活動の測定に用いられる細胞電気生理センサとして有用である。

本発明の実施の形態１による細胞電気生理センサの断面図 同センサのプローブを複数個固定した枠体基板の斜視図 同センサの要部拡大断面図 同センサを製造する基板の断面図 同センサ用の基板のエッチングを示す断面図 同センサの基板のエッチングを示す断面図 同センサの基板のエッチングを示す断面図 同センサの基板のエッチングを示す断面図 同センサの基板のエッチングを示す断面図 同センサの基板のエッチングを示す断面図 本発明の実施の形態２による細胞電気生理センサの断面図 本発明の実施の形態３による細胞電気生理センサの断面図 本発明の実施の形態３による別の細胞電気生理センサの断面図 本発明の実施の形態３による別の細胞電気生理センサの断面図 本発明の実施の形態４による細胞電気生理センサの断面図 本発明の実施の形態５による細胞電気生理センサのプローブの斜視図 本発明の実施の形態６による細胞電気生理センサのプローブの斜視図 同センサのプローブを複数個固定した枠体基板の斜視図 本発明の実施の形態６による細胞電気生理センサの別形状のプローブを複数個固定した基板の斜視図 従来の細胞電気生理センサの断面図

符号の説明

１ プローブ
１ａ ダイアフラム部
１ｂ 支持体
２ 貫通孔
３ 枠体基板
３ａ 孔
４ 電極
５ 電極
６ 検体細胞
７ａ 細胞外液
７ｂ 細胞内液
８ 基板
１０ シリコン酸化物層
１３ プローブ
１３ａ ダイアフラム部
１３ｂ 支持体
１４ 貫通孔
１７ プローブ
１７ａ ダイアフラム部
１７ｂ 支持体
１８ａ 貫通孔
１８ｂ 貫通孔
１８ｃ 貫通孔
１９ａ ダイアフラム部
２０ａ 貫通孔
２０ｂ 貫通孔
２０ｃ 貫通孔
２１ 枠体基板
２２ 枠体基板
２２ａ 孔
２２ｂ 凹部
２３ 枠体基板
２３ａ 孔
２３ｂ 凹部
１０１ 基板
１０２ 細胞を保持する窪み
１０３ 貫通孔
１０４ 測定電極
１０５ 検体細胞
１０６ ウエル
１０７ 培養液
１０８ 参照電極

Claims (13)

1. 貫通孔を有するダイアフラム部および、このダイアフラム部の下面に形成された中空の支持部からなるプローブと、このプローブが挿入される孔を有する枠体基板とからなり、前記ダイアフラム部の上面に検体細胞を保持させてこの検体細胞の電気生理現象を測定する細胞電気生理センサであって、前記ダイアフラム部の上面の外径は前記支持部の外径より大きく、かつ前記孔の内径は前記支持部の外径よりも大きくなるように構成された細胞電気生理センサ。
2. 前記支持部の質量が前記ダイアフラム部の質量より大きい請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
3. 前記ダイアフラム部の厚みは前記支持部の高さより薄く形成されている請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
4. 前記ダイアフラム部の外形が前記支持部の高さよりも大きく形成された請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
5. 前記支持部の肉厚は前記ダイアフラム部から遠ざかるにつれて厚くなっている請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
6. 前記枠体基板が、前記プローブの全高よりも厚くなっている請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
7. 前記枠体基板に設けられた前記プローブ挿入用の孔外縁には凹部が形成され、前記凹部の内径は前記ダイアフラム部の下面の外径より大きい請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
8. 前記凹部の深さが、前記ダイアフラム部の厚みと等しい請求項４に記載の細胞電気生理センサ。
9. 前記凹部の形状が、前記ダイアフラム部の外形と相似形状である請求項４に記載の細胞電気生理センサ。
10. 前記ダイアフラム部の厚みは、外周部から中心にむけて薄くなっている請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
11. 前記ダイアフラム部の外形が、３本以上の直線により形成される請求項６に記載の細胞電気生理センサ。
12. 前記ダイアフラム部の上面形状が、矩形であることを特徴とする請求項６に記載の細胞電気生理センサ。
13. 前記プローブがＳＯＩ基板を用いて形成されている請求項１に記載の細胞電気生理センサ。

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