JP2008139133A - 細胞電気生理センサ - Google Patents
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Abstract
【課題】これまでの従来の技術において、平面への粘着性が比較的高い細胞を用いる際には、一旦平面上へ到達した細胞が吸引ポンプなどの手段を用いることによっても貫通孔周辺まで到達できないために、細胞の捕捉または保持の確率が著しく低下するといった課題を有する。さらに、貫通孔周辺に細胞が粘着して存在する際には、その細胞によって他の細胞が高い粘着性をもって貫通孔に保持されることが阻害され、電気生理現象を測定することが困難となる。
【解決手段】基板に少なくとも1つ以上の貫通孔3を設け、この基板の両面と貫通孔3に液体を蓄積させ、貫通孔3の開口部に検体細胞4を密着保持させて、細胞の電気生理現象を測定する細胞電気生理センサであり、液体との接触部には貫通孔3を有する検体細胞4と同じ大きさの平面の底面7と、その底面7へ向けて小さくなるテーパー形状部を有する構成とするものである。
【選択図】図2
【解決手段】基板に少なくとも1つ以上の貫通孔3を設け、この基板の両面と貫通孔3に液体を蓄積させ、貫通孔3の開口部に検体細胞4を密着保持させて、細胞の電気生理現象を測定する細胞電気生理センサであり、液体との接触部には貫通孔3を有する検体細胞4と同じ大きさの平面の底面7と、その底面7へ向けて小さくなるテーパー形状部を有する構成とするものである。
【選択図】図2
Description
本発明は、細胞の電気生理的活動の測定に用いられる細胞電気生理センサとその製造方法に関するものである。
従来、電気生理学におけるパッチクランプ法は、細胞膜に存在するイオンチャンネルを測定する方法として知られており、このパッチクランプ法によってイオンチャンネルの様々な機能が解明されてきた。そして、イオンチャンネルの働きは細胞学において重要な関心ごとであり、これは薬剤の開発にも応用されている。
しかし、一方でパッチクランプ法は測定技術に微細なマイクロピペットを1個の細胞に高い精度で挿入するという極めて難しい操作を必要としているため、熟練作業者でさえ多くの測定をこなせない。従って高いスループットで測定を必要とする場合には適切な方法でない。
このため、微細加工技術を利用した基板型プローブの開発がなされており、これらは個々の細胞についてマイクロピペットを挿入しない自動化システムに適している。例えば、基板の上に設けられた細胞保持手段を備えたウエルと、このウエルの電気信号を検出する測定用電極と、基準電極とを備えた細胞外電位測定用デバイスによって細胞外電位を測定する技術を開示している(例えば特許文献1参照)。図13はこの従来の細胞電気生理センサのウエル構造を模式断面図で示したものであり、ウエル26内に培養液27が入れられ、検体細胞25は基板21に設けられた細胞保持手段によって捕捉または保持されている。細胞保持手段は基板21に形成された窪み22およびこの窪み22に連絡する貫通孔23を備えた構成となっている。
さらに貫通孔23の内部にはセンサ手段である測定電極24が配置されており、この測定電極24は信号検出部に接続されている。
測定の際には検体細胞25を貫通孔23から吸引ポンプなどの手段により、この検体細胞25が窪み22に密着保持される。このようにして検体細胞25の活動により発生する電気信号はウエル26の内部の培養液27に漏れることなく、貫通孔23に設けた測定電極24と参照電極28によって電位の変化あるいは電流の変化として検出される。
このように、基板21に形成された貫通孔23はガラスピペットにおける先端穴と同様の役割を果たし、高精度な細胞の電気生理現象を記録できるとともに、基板21の裏面側からの吸引によって細胞が自動的に引きつけられ、検体細胞25を容易に保持できるという利点を有している。このとき、検体細胞25が高い密着性をもって保持されることは、低いバックグラウンドノイズで細胞の電気生理現象を測定するためには重要な要素である。
国際公開第02/055653号パンフレット
しかしながら、上記の従来の技術において、平面への粘着性が比較的高い細胞を用いる際には、一旦平面上へ到達した細胞が吸引ポンプなどの手段を用いても、貫通孔23周辺まで到達できないために、細胞の捕捉または保持の確率が著しく低下するといった課題を有する。さらに、貫通孔23周辺に細胞が粘着して存在する際には、その細胞によって他の細胞が高い密着性をもって貫通孔23に保持されることが阻害され、電気生理現象を測定することが困難となる。
上記課題を解決するために本発明は、基板に少なくとも1つ以上の貫通孔を設け、この基板の両面と貫通孔に液体を蓄積させ、貫通孔の開口部に検体細胞を密着保持させて、細胞の電気生理現象を測定する細胞電気生理センサであり、前記貫通孔はすり鉢状の窪みの底に設けられ、この底の部分は前記検体細胞と略同じ大きさの平面部を有する構成とするものである。
本発明は、細胞の電気生理的活動の測定に用いられる細胞電気生理センサとその製造方法を提供するものである。本発明の細胞電気生理センサおよびその製造方法は、細胞を粘着性の高低に限らず貫通孔周辺まで引き込むことが可能となり、また他の細胞が高い密着性をもって貫通孔に保持されることを阻害する細胞が貫通孔周辺に粘着する空間を有しないことから、細胞の捕捉または保持の確率を向上させた細胞電気生理センサとその製造方法を提供できる。
以下、本発明の実施の形態1における細胞電気生理センサおよびその製造方法について、図面を参照しながら説明する。なお、本発明はこれら実施の形態に限定されるものではない。
(実施の形態1)
本発明の細胞電気生理センサの構成について説明する。
本発明の細胞電気生理センサの構成について説明する。
図1に示すように基板1には多くの開口部2が設けられている。この開口部2の形状等につき図2を用いて説明する。図2において、基板1は酸化シリコン層1aとシリコン基板1bから形成されている。酸化シリコン層1aの厚みは2μmで、シリコン基板1bはテーパー状の開口部2を有している。開口部2の底面7は酸化シリコン層1aまで達しており、底面7の直径は測定される検体細胞と略同じである。底面7は直径30μmの円形でその中心には酸化シリコン層1aを貫通する直径3μmの貫通孔3が形成されている。この貫通孔3の開口径は測定したい検体細胞の大きさ、形状、性質によって決定することができる。例えば、検体細胞が5〜50μm程度の大きさで高い密着性を持っている時、貫通孔3に保持されるには貫通孔3の開口径は3μm以下であることが望ましい。このような構成により、検体細胞を貫通孔3の周辺まで引き込むことが可能となり、検体細胞4を捕捉し保持しやすくなる。
次に、本発明の細胞電気生理センサの動作について説明する。図3に示すように、基板1のテーパー状の開口部2の中に検体細胞4を含んだ細胞外液5aを満たした後、開口部2を加圧するか、細胞内液5b側を減圧することにより、検体細胞4は貫通孔3に密着する。テーパー状の開口部2の底面7の直径は検体細胞4と略同じ大きさであるので、一つの検体細胞4がこの底面7に密着、保持される。
通常、細胞内液5bは、例えば哺乳類筋細胞の場合、代表的にはカリウムイオン濃度が155mM程度、ナトリウムイオン濃度が12mM程度、塩素イオン濃度が4.2mM程度添加された電解液であり、細胞外液5aは、カリウムイオン濃度が4mM程度、ナトリウムイオン濃度が145mM程度、塩素イオン濃度が123mM程度添加された電解液である。
図3において酸化シリコン層1aの下側から吸引、もしくは薬剤(例えばナイスタチンなど)を投入することにより検体細胞4に微細小孔を形成する。その後開口部2のほうから検体細胞4へ刺激を加える。この刺激の種類としては、例えば化学薬品、毒物などの化学的な刺激に加え、機械的変位、光、熱、電気、電磁波などの物理的な刺激なども含む。検体細胞4がこれらの刺激に対して活発に反応した場合、検体細胞4は細胞膜が保有するチャンネルを通じて各種イオンを放出あるいは吸収する。この結果として、細胞内外の電位勾配が変化するので、その変化を電極8と電極9により測定する。
図4に示したように、検体細胞4にかかる重力Gの開口部2の任意の斜面の角度の正弦成分Aが、検体細胞4の斜面での摩擦力Bより大きくなる傾斜となっている。すなわち斜面と底面7のつくる角度をθ、検体細胞4と開口部2の表面との摩擦係数をμとすれば、
であればよい。
このような構成により、検体細胞4は開口部2の表面にくっつくことなく底面7のほうに落ちるという効果が得られる。
また開口部2の表面に比べて、底面7は水への親和性が高いほうが良い。通常、検体細胞4は水酸基を含んだ親水性の表面を有しているので、貫通孔3へ検体細胞4を密着させて保持するには、貫通孔3の表面周辺は高い親水性を示すことが好ましい。一方、検体細胞4が途中の斜面で引っかからず、一気に底面7に到達するためには、開口部2の斜面の表面は疎水性の表面が好ましい。従って開口部2の斜面の表面に比べて、底面7を親水性が高い構成にすると検体細胞4を密着して保持することが可能となる。
特に、底面7の表面は水との接触角が5度より小さいことが望ましい。このような構成により、貫通孔3へ検体細胞4が密着性よく保持することが可能となる。本実施の形態1において、底面7は酸化シリコンであり、その表面に吸着した炭素を含む有機化合物を洗浄した後に、アルカリ溶液で処理することにより、表面を容易に水酸基で覆うことができる。その結果底面7の表面の親水性が高まり、水との接触角を5度より小さくできる。
次に、本発明の細胞電気生理センサの製造方法について説明する。
本実施の形態1における細胞電気生理センサの製造方法は、図5に示すように酸化シリコン層1aとシリコン基板1bからなる基板1を用意し、基板1の上面のシリコン面には貫通孔3と同じ形状のレジストホール11aを有するレジストマスク11を形成する。
次に、図6のようにドライエッチングによって、シリコン基板1bの垂直方向にトレンチ12aを形成する。このときに用いるエッチング法は、ドライエッチングによる方法が最適であり、ドライエッチングの際にはエッチングを促進するガスと、エッチングを抑制するガスを用いる。このエッチングを促進するガスとしては、二フッ化キセノン、六フッ化硫黄などがある。また、エッチングを抑制するガスとしてはトリフルオロメタン、八フッ化シクロブタンなどがある。これらのガスを混合してエッチングすることにより、エッチングされた壁面にフルオロカーボンのポリマーである保護膜を作製していくことができることから、ドライエッチングによるトレンチ12aの形成を図6のようにレジストマスク11の下方のみに進行させることが可能となる。
次に図7に示すように、レジストマスク11のエッチングホール11aから、エッチングを促進するガスを導入して、所望の形状となるように窪み2aを形成する。ここでは、エッチングを促進するガスとして二フッ化キセノンを用いることが効果的である。この場合はエッチングを抑制するガスを流さないので、シリコン基板1bは左右方向、下方向にエッチングされ丸い窪み2aが形成される。
この窪み2aがシリコン基板1bの半分程度になると、再びレジストマスク11のエッチングホール11aからエッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスを流すことにより垂直方向にエッチングを進め、図8のように酸化シリコン層1aまでトレンチ12が形成される。
次に、図9に示すように、レジストマスク11のエッチングホールから、酸化シリコン層1aのエッチングを促進するガスを導入して、貫通孔3を形成する。このとき、酸化シリコン層1aのエッチングを促進するガスにはアルゴン四フッ化炭素などを用いてプラズマエッチングをすることが望ましい。このようにして貫通孔3はレジストマスク11のエッチングホール11aの直下に形成することが可能となる。
さらにレジストマスク11のエッチングホール11aから、エッチングを促進するガスを導入する。この時、エッチングを抑制するガスを流さないのでシリコン基板1bは左右方向と下方向にエッチングされて図10に示すような形状に加工することが可能になる。
最後にレジストマスク11を除けば、図11に示す細胞電気生理センサが完成する。なお、図10においてレジストマスク11は酸化シリコン層1aのエッチングにおけるプラズマエッチングに対する耐性が必要であるため、アルミニウムまたはシリコン窒化物などが適している。
また酸化シリコン層1aの代わりに光触媒作用を有する材料層を用いてもよい。このような構成の細胞電気生理センサは、光触媒反応が起こる最適な光エネルギーを照射することにより、底面7に吸着した炭素を含む有機化合物の分子鎖のみを分解して除去し、親水性の高い面を得ることができる。
なお、光触媒作用を有する材料として、酸化チタン、酸化タングステン、酸化スズ、酸化亜鉛、酸化鉄、酸化ビスマス、チタン酸ストロンチウム、およびこれらの混合物のいずれかで構成することが効果的である。
なお図12に示すように、基板1の酸化シリコン層1aのほうに中空の支持体6を当接した構成としてもよい。本実施の形態1において、開口部2の底面7は厚み2μmの酸化シリコン層1aで形成されるため、外部から異物の接触等があれば破損する場合もあり得る。そこで基板1の酸化シリコン層1a表面に、貫通孔3のまわりに中空の支持体6を形成することにより酸化シリコン層1aの破損を低減することが可能となる。
本発明の細胞電気生理センサは、検体細胞を高い密着性で且つ高確率に保持する上で有用である。
1 基板
1a 酸化シリコン層
1b シリコン基板
2 開口部
3 貫通孔
4 検体細胞
5a 細胞外液
5b 細胞内液
6 中空の支持体
7 底面
8 電極
9 電極
11 レジストマスク
12 トレンチ
12a トレンチ
1a 酸化シリコン層
1b シリコン基板
2 開口部
3 貫通孔
4 検体細胞
5a 細胞外液
5b 細胞内液
6 中空の支持体
7 底面
8 電極
9 電極
11 レジストマスク
12 トレンチ
12a トレンチ
Claims (12)
- 基板に少なくとも1つ以上の貫通孔を設け、この基板の両面と前記貫通孔に液体を蓄積させ、前記貫通孔の開口部に検体細胞を密着保持させて、細胞の電気生理現象を測定する細胞電気生理センサであって、前記貫通孔はすり鉢状の窪みの底に設けられ、この底の部分は前記検体細胞と略同じ大きさの平面部を有する細胞電気生理センサ。
- 前記窪みの傾斜面は、この傾斜面と前記検体細胞間の摩擦力よりも前記検体細胞の傾斜面に平行な重力成分のほうが大きくなるように形成されている請求項1に記載の細胞電気生理センサ。
- 前記平面部の表面は、前記傾斜面の表面より水への親和性が高い請求項1に記載の細胞電気生理センサ。
- 前記平面部の表面と水との接触角は5度より小さい請求項3に記載の細胞電気生理センサ。
- 前記平面部は酸化シリコンで形成される請求項1に記載の細胞電気生理センサ。
- 前記平面部は、光触媒作用を有する材料で形成される請求項1に記載の細胞電気生理センサ。
- 前記光触媒作用を有する材料は、酸化チタン、酸化タングステン、酸化スズ、酸化亜鉛、酸化鉄、酸化ビスマス、チタン酸ストロンチウムの中から選ばれた少なくとも1種を含む材料である請求項6に記載の細胞電気生理センサ。
- 前記傾斜面は、シリコンで形成されることを特徴とする請求項1に記載の細胞電気生理センサ。
- 前記窪みのある面と反対側の面に、中空の支持体が形成され、この中空の部分と前記貫通孔とがつながっている請求項1に記載の細胞電気生理センサ。
- 少なくとも1つ以上の貫通孔を有する基板と、この基板の両面と前記貫通孔に液体を蓄積させ、前記貫通孔の開口部に検体細胞を密着保持させて細胞の電気生理現象を測定する細胞電気生理センサの、前記貫通孔はすり鉢状の窪みの底に設けられ、この底の部分は前記検体細胞と略同じ大きさの平面部を有する細胞電気生理センサの製造方法であって、基板の一方の面に貫通孔の形状と同じレジストホールを有するレジストマスクを形成するステップと、異方性のドライエッチングによってトレンチを形成するステップと、等方性のドライエッチングによってすり鉢状の空間と検体細胞と略同じ大きさの平面部を形成するステップと、平面部に貫通孔を形成するステップとを含む細胞電気生理センサの製造方法。
- 平面部をシリコン酸化物で、テーパー形状部をシリコンで形成した後、アルカリ溶液により表面処理を行う請求項10に記載の細胞電気生理センサの製造方法。
- 平面部が光触媒作用を有する材料であり、光触媒が作用する光エネルギーを照射する請求項10に記載の細胞電気生理センサの製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2006325181A JP2008139133A (ja) | 2006-12-01 | 2006-12-01 | 細胞電気生理センサ |
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Publication Number | Publication Date |
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Family
ID=39600764
Family Applications (1)
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JP2006325181A Pending JP2008139133A (ja) | 2006-12-01 | 2006-12-01 | 細胞電気生理センサ |
Country Status (1)
Country | Link |
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JP (1) | JP2008139133A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011089894A (ja) * | 2009-10-22 | 2011-05-06 | Nagoya Univ | 細胞組織評価装置 |
KR101099670B1 (ko) | 2009-04-14 | 2011-12-29 | 한국과학기술원 | 단일 세포 분석 장치 |
JP2015083012A (ja) * | 2008-09-02 | 2015-04-30 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 細胞検出方法及び該方法に用いるマイクロアレイチップ |
-
2006
- 2006-12-01 JP JP2006325181A patent/JP2008139133A/ja active Pending
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KR101099670B1 (ko) | 2009-04-14 | 2011-12-29 | 한국과학기술원 | 단일 세포 분석 장치 |
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