JP2009002876A - 細胞電気生理センサ - Google Patents

Abstract

【課題】気泡の抑制と除去を容易にし、細胞電気生理センサの測定に関する信頼性を向上させることを目的とする。
【解決手段】少なくとも一つの貫通孔１を有したダイアフラム２と、このダイアフラム２を支持するとともにキャビティ４を有したフレーム３とからなる細胞電気生理センサであって、前記フレーム３の端部５の形状を異なった高さとすることによって、気泡の発生を抑制できるとともに残留した気泡の除去を容易にできることから、細胞電気生理センサの測定に対する信頼性を向上させることができる。
【選択図】図１

Description

本発明は、細胞の細胞外電位あるいは細胞の活動に発生する物理化学的変化を測定するために用いられる細胞電気生理センサに関するものである。

従来の、細胞の電気的活動を指標にして細胞膜に存在するイオンチャネルの機能を解明したり、薬品をスクリーニング（検査）したりする方法として、パッチクランプ法が挙げられる。

このパッチクランプ法は、マイクロピペットの先端部分で細胞膜の微小部分（パッチという）を軽く吸引し、マイクロピペットに設けた微小電極プローブを用いて、パッチを横切る電流を、固定（クランプ）した膜電位のもとで測定するものである。そして、これにより、パッチに存在する１個または少数個のイオンチャネルの開閉の様子を電気的に記録することができるものである。そして、これは細胞の生理機能をリアルタイムで調べることのできる数少ない方法の一つである。

しかしながら、パッチクランプ法はマイクロピペットの作成および操作に特殊な技術・技能を必要とし、一つの試料の測定に多くの時間を要することから、大量の薬品候補化合物を高速でスクリーニングする用途には適していない。

これに対して、近年、微細加工技術を利用した平板型の微小電極プローブの開発がなされており、この方法は個々の細胞についてマイクロピペットの挿入を必要としない自動化システムに適している。

例えば、細胞保持基板に複数の貫通孔を設け、この貫通孔の開口部に被験体細胞を接着させ、貫通孔の下方に配置した測定電極で、被験体細胞の電位依存性のイオンチャネル活性を測定する技術を開示している（例えば、特許文献１参照）。

また、シリコン酸化物製の細胞保持基板（ｍｅｍｂｒａｎｅ）の内部に２．５μｍの貫通孔（ｈｏｌｅ）を形成し、この貫通孔にヒト培養細胞株の一種であるＨＥＫ２９３細胞を保持させて高い密着性を確保して高精度に細胞外電位を測定する技術を開示している（例えば、非特許文献１参照）。

さらに、図９に示したように、従来の細胞電気生理センサ３１は細胞保持基板３２と、この細胞保持基板３２の上面に形成された凹部３３と、この凹部３３の下部から細胞保持基板３２の下面まで連結する貫通孔３４と、細胞保持基板３２の上方に配置された参照電極３５と、前記貫通孔３４の内部に配置された測定電極３６とを備えている。そして、この測定電極３６は配線３７を経て信号検出部に連結されている。また、前記細胞保持基板３２はウエル３８の内部に配置されている（例えば、特許文献２参照）。

次に、前記細胞電気生理センサ３１の動作方法について、以下に説明する。

まず、ウエル３８の内部に細胞および電解液４０が注入され、細胞が凹部３３によってトラップ（捕捉）されて保持される。この凹部３３に保持された細胞を以下被験体細胞３９という。

そして、測定の際には被験体細胞３９は貫通孔３４の下方から吸引ポンプなどで吸引され、貫通孔３４の開口部に密着した状態で保持される。すなわち、この貫通孔３４がガラスピペットにおける先端穴と同様の役割を果たしている。そして、被験体細胞３９のイオンチャネルの機能性や薬理反応などは、参照電極３５と測定電極３６との間における反応前後の電圧、あるいは電流を測定し、細胞内外の電位差を求めることによって分析している。
特表２００２−５１８６７８号公報 国際公開第０２／０５５６５３号パンフレット T.Sordel et al, Micro Total Analysis Systems ２００４，Ｐ５２１〜５２２（２００４）

しかしながら、従来の細胞電気生理センサは、参照電極と測定電極との間における電位差の測定値に誤差が生じ、細胞電気生理センサの測定に対する信頼性が低下するという問題があった。

それは、流路の内壁面の親水性が低い部分、あるいは貫通孔の周辺などの凹凸を有する部分には気泡が残りやすく、この気泡の抵抗値は非常に大きいため、この気泡の有無によって測定値が変動するからであった。

特に、貫通孔の近傍に発生した気泡は、測定電極で検知する電流、あるいは電圧の測定値を大きく変動させる要因となっていた。

そこで、本発明は、貫通孔の近傍に気泡の発生を抑制するとともに効率良く気泡を除去することによって、測定に対する信頼性に優れた細胞電気生理センサを実現することを目的とする。

前記従来の課題を解決するために、本発明は、少なくとも一つの貫通孔を有したダイアフラムと、このダイアフラムを支持するとともにキャビティを有したフレームとからなる細胞電気生理センサであって、前記フレームの端部の形状を異なった高さとしたものである。

本発明の細胞電気生理センサは、貫通孔の近傍における気泡の発生を抑制するとともに、残留した気泡を効率良く除去することができる。その結果、貫通孔の近傍に付着した気泡を除去し、センサの測定に対する信頼性を向上させることができる。

（実施の形態１）
以下、本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの構成について、図面を参照しながら説明する。

図１は本発明の実施の形態１による細胞電気生理センサの斜視図、図２はその断面図である。また、図３（ａ）、図３（ｂ）は細胞電気生理センサに液滴を分注する時の様子を説明するための断面図であり、図４は細胞の電気生理現象を測定する方法を説明するための断面図である。また、図５〜図８はそれぞれ別の例の細胞電気生理センサの斜視図である。

図１及び図２において、本実施の形態１における細胞電気生理センサは、シリコン基板などの入手性、加工性に優れたウエハーを準備し、フォトリソ技術を用いたエッチング加工などによって、一括して作製することができる。これによって、高寸法精度で微小な形状を有する細胞電気生理センサを効率よく作製することができる。

そして、本実施の形態１における細胞電気生理センサの基本的な構成は、少なくとも一つの貫通孔１を有する薄板状のダイアフラム２を形成しており、この貫通孔１は少なくとも一つあれば良く、複数の細胞９を同時に測定したいときには、複数の貫通孔１を形成することも可能である。複数の細胞９を同時に測定することによってＳ／Ｎを高めることができる。さらに、前記ダイアフラム２を固定支持するとともに測定装置へ固定配置するためのフレーム３を設けている。このフレーム３の内部には液体などを貯留することができるキャビティ４を形成している。

そして、本実施の形態１における細胞電気生理センサの構成の特徴は、フレーム３の端部５の面をダイアフラム２の平面と平行な一面形状とはしないで、端部５の一部に段差部６を形成していることである。この段差部６は、分注器などを用いて液敵状の液体をキャビティ４の内部へ注入したときの気泡の発生の抑制と気泡の除去を効率よく行うために設けているものであり、その作用について図３（ａ）、図３（ｂ）を用いてさらに詳細に説明する。

通常、細胞９を分散させた液体を分注器などを用いてキャビティ４の中へ注入する場合、液体は表面張力によって球面状の外観形状を形成しており、そのまま自動分注器などを介してキャビティ４の中へ所定量の液体を分注する必要がある。

そして、安定に精度良く被検体細胞９ａの電気化学的変化を測定するためには、貫通孔１の近傍に気泡の残留していない状態で液体を充填しておくことが重要である。

これを実現するため、図３（ａ）、図３（ｂ）に示したようにフレーム３の端部５に段差部６を形成しておくことによって、分注器から分注された細胞外液１０よりなる液滴がフレーム３の端部５を完全に塞ぐことはなくなり、フレーム３の端部５に細胞外液１０よりなる液滴の一部が接触し、段差部６から気体を除去していくとともに、細胞外液１０の表面張力によって、フレーム３の内壁面を濡らしながらキャビティ４の内部に細胞９を含んだ細胞外液１０よりなる液体を細胞９とともに充填することができる。また、段差部６の高さは５０μｍ以上とすることによって段差部６の効果を発揮することができる。そして、より好ましくは１００μｍ以上とすることによって、分注器の先端が傾いたとき、あるいは液滴の形状の対称性が少なくなった場合でも、確実に液滴の一部を端部５の一部に接触させることができ、これによって確実にフレーム３の壁面から気泡の発生を抑制しながら細胞外液１０などの液体を充填することができる。

このように、端部５の高さを同一としないで、異なった高さを有する段差部６を設けておくことによって、キャビティ４の内部に存在していた空気などの気体を段差部６から容易に外部へ放出することができ、キャビティ４の内部へ所定の液体を気泡の無い状態で充填することができる細胞電気生理センサを実現できる。

一方、従来の構成である同じ高さからなる平面形状を有したセンサ構造では、マイクロピペットの先端に存在する液滴がキャビティ４の入り口を瞬間的に塞いでしまい、キャビティ４の内部に存在していた空気などの気体がうまく除去できず、気泡となって残存することが問題であった。そして、この気泡が貫通孔１の近傍に残存していると、吸引手段を用いて貫通孔１の上方に固定させた被検体細胞９ａの電気化学的変化である電流あるいは電圧の微小変化を高精度に測定することが困難であった。

そして、気泡が残留しない状態で液体を充填し、例えばキャビティ４の内部に細胞９を分散させた細胞外液１０を貯留し、その内の一個の細胞９を貫通孔１の上に吸引などの手段によってトラップさせることによって被検体細胞９ａとする。

なお、充填する液体は特に限定するものではなく、前記細胞外液１０の他に、細胞９を培養する培養液あるいはその他の薬液などであっても良い。

次に、吸引力を制御することによって前記被検体細胞９ａの皮膜の一部を破るとともに、さらに被検体細胞９ａの貫通孔１の下面側より、細胞内液１１を注入することによって、被検体細胞９ａの一部に細胞内液１１を接触させることができる。これによって、被検体細胞９ａの電気化学的変化を測定できる状態となる。

ここで、細胞外液１０とは、例えば、哺乳類筋細胞の場合、代表的にはＫ⁺イオンが４ｍＭ程度、Ｎａ⁺イオンが１４５ｍＭ程度、Ｃｌ^-イオンが１２３ｍＭ程度添加された電解液であり、細胞内液１１とは、例えば、哺乳類筋細胞の場合、代表的にはＫ⁺イオンが１５５ｍＭ、Ｎａ⁺イオンが１２ｍＭ程度、Ｃｌ^-イオンが４．２ｍＭ程度添加された電解液である。

なお、細胞外液１０と細胞内液１１とは、本実施の形態１のように異なる組成のものを用いてもよく、同じものを用いてもよい。

次に、この電気的変化を測定するために、細胞外液１０に接続するように参照電極１２を配置するとともに、細胞内液１１に接続する測定電極１３を配置し、この参照電極１２と測定電極１３との間で電流あるいは電圧変化を測定することによって被検体細胞９ａの電気化学的変化を測定検出することができる（図４参照）。

また、このような状態を安定して行うためには、前記貫通孔１の大きさは被検体細胞９ａの大きさよりも少し小さな形状とし、この貫通孔１を塞ぐように被検体細胞９ａを吸引などの手段によって被検体細胞９ａを固定しておける形状とすることが好ましい。そして、前記貫通孔１の開口部の直径は３μｍとした。

このように、細胞９の大きさが５〜５０μｍ程度である場合、細胞９と貫通孔１とを高い密着性を持って保持するには、貫通孔１の開口部の直径を３μｍ以下とすることが望ましいからである。

なお、この貫通孔１の開口部の最適な大きさは、測定する細胞９の形状、性質によって決定することができる。

そして、ダイアフラム２の厚みは１０〜３００μｍとすることが加工性、機械的強度等の観点から好ましい。

また、キャビティ４の内径は１００μｍ〜１．０ｍｍとすることが生産性の観点から好ましい。１００μｍより小さくなると気泡の残留が多く発生するようになり、１ｍｍを越えるとセンサの生産性が低下する。

また、このダイアフラム２を支持するとともに液体を貯留しておくためのキャビティ４を有したフレーム３から構成することが機械的強度と取り扱いの観点から好ましい。

次に、前記のような構成を有する細胞電気生理センサを用いて、細胞９が活動する際に発する電気生理活動を測定する方法について、図面を用いてさらに詳細に説明する。図４は前記細胞電気生理センサを測定装置にセットした際の測定装置の模式断面図である。

図４に示すように、細胞電気生理センサはプラスチックなどの絶縁体からなる容器１７の内部に設けた仕切り板１４の内部にセットされている。そして、この仕切り板１４の上層部には液体を貯留するためのウエル１５を配置している。

また、前記仕切り板１４とウエル１５は樹脂などで構成することが生産性、加工性及び寸法精度などの観点から好ましい。

さらに、この仕切り板１４の内部には開口部を設けており、細胞電気生理センサは開口部の内部にダイアフラム２を下面側とし、開口部に液漏れが発生しないように隙間無く接合することによって、容器１７の内部の空間はダイアフラム２を境に２つの領域に仕切られることとなり、仕切り板１４によって仕切られた上下の領域内には細胞外液１０または培養液などの液体と細胞内液１１または薬液などの液体がそれぞれ貯留されることとなる。そして、これらの被検体細胞９ａの上下の液体の移動は貫通孔１を介してのみ行われることとなる。また、容器１７の一部を用いて仕切り板１４の下面側には流路１６を形成しておき、この流路１６の内部にマイクロポンプなどの送液手段を用いて細胞内液１１あるいは薬液などの液体を充填、除去することができるようにしている。

さらに、仕切り板１４の上側には細胞外液１０中に銀・塩化銀電極などで構成した参照電極１２を配置し、仕切り板１４の下側には細胞内液１１中に銀・塩化銀電極などで構成した測定電極１３を配置している。

なお、これらの参照電極１２と測定電極１３が入れ替わっていても良い。また、参照電極１２及び測定電極１３は、クロム、チタン、銅、金、白金、銀および塩化銀からなる材料から選択することも可能である。さらに、参照電極１２及び測定電極１３は針状の微小電極プローブを用いてもよい。

次に、上記のような細胞電位測定装置を準備した状態で、測定対象である細胞外液１０などの液体中に分散させた被検体細胞９ａを容器１７の上部側より分注器を用いて分注し、その後吸引ポンプなどを用いて仕切り板１４の下側が低圧になるように仕切り板１４の上下間に所定の圧力差を発生させる。このとき、一個の細胞９が貫通孔１の開口部に引き寄せられて吸引保持され、被検体細胞９ａとしている。そして、この圧力差が維持されていると十分な密着性が確保されることとなり、内部にある細胞外液１０と細胞内液１１との間で電気的抵抗値を持つようになる。

その後、被検体細胞９ａに薬品などの化学化合物などの刺激が加わると、被検体細胞９ａは電気生理的応答を示すこととなり、その結果、参照電極１２と測定電極１３との間において、例えば電圧、電流などの電気的応答として観測することができる。

なお、前記細胞電位測定装置の測定方法における細胞電気生理センサはダイアフラム２を下面側に配置して測定する例について説明してきたが、ダイアフラム２を上面に配置して測定することも可能である。この場合、細胞内液１１の気泡の発生と残留を抑制することが可能となり、被検体細胞９ａは前記と反対側の貫通孔１の開口部に被検体細胞９ａが密着することになるが、被検体細胞９ａが平らな面に形成した穴に密着する方が都合の良い場合などに用いることができる。どちらを使用するかは被検体細胞９ａの性質によって適宜決めることが好ましい。

また、ウエル１５に細胞外液１０を充填すると、ウエル２の内部に設置された参照電極１２と流路１６の内部に設置された測定電極１３との間で、１００ｋΩ〜１０ＭΩ程度の抵抗値を観察することができる。これは細胞電気生理センサに設けられた貫通孔１に電解液が浸透し、それぞれの電極１２，１３との間で電気回路が形成されるからである。

次に、例えば流路１６の一方を封止し、他方から減圧することで、細胞９は貫通孔１へ引き付けられ、ついにはこの貫通孔１を塞ぎ、細胞外液１０を充填したキャビティ４と細胞内液１１などの液体を充填した流路１６との電気抵抗は十分に高くなる。

そして、さらに減圧を続ける、もしくはナイスタチンのように被検体細胞９ａの外壁を溶解する作用のある薬液を流路１６の内部に導入することで、被検体細胞９ａに微細小孔を形成する。

その後、この被検体細胞９ａに化学的刺激、あるいは物理的刺激を付与する。この化学的刺激としては、化学薬品、毒物、物理的刺激としては機械的変異、光、熱、電気、電磁波などが挙げられる。

そして、被検体細胞９ａがこれらの刺激に対して活発に反応する場合、被検体細胞９ａはその細胞膜にあるイオンチャネルを通じて各種イオンを放出あるいは吸収する。そうすると、被検体細胞９ａを通るイオン電流が発生し、この被検体細胞９ａの内外の電位勾配が変化するため、この変化を反応前後の参照電極１２と測定電極１３との間の電圧、あるいは電流を測定することによって検出することができる。

そして、このとき貫通孔１の近傍に気泡が存在すれば、抵抗値の増大により測定電極１３で検知する電流・電圧の測定値が変動するが、図１に示したような構成の細胞電気生理センサを用いることによって残留する気泡の発生を抑制することができることから測定の信頼性を高めた細胞電気生理センサを実現することができる。

次に、図５を用いて別の例の細胞電気生理センサの構成について説明する。

図５に示したように、図１で示した細胞電気生理センサの構成と大きく異なっているところは、フレーム２の端部５を斜面としたことである。このような構成とすることによって、段差部６を設けたセンサと同様の効果を発揮することができる。すなわち、端部５の高いところに分注器から分注された液滴が液滴に最も近い斜面の一部に接触し、この端部５を形成する一部の斜面の壁面を液体の表面張力で移動しながらキャビティ４の内部へ液体を充填することができる。これによって、気泡の発生の抑制と残留した気泡を効率よく除去することができる細胞電気生理センサを実現することができる。

また、このような斜面を有する端部５の形成はダイアフラム２と平行となるように加工した後、最後に個片化されたセンサチップを研磨することによって、斜面を有する端部５を形成することができ、所定の細胞電気生理センサを作製することができる。

次に、図６を用いてさらに別の例の細胞電気生理センサの構成について説明する。図６に示したように、図１で示した細胞電気生理センサの構成と異なっているところはフレーム３に切り欠き部７を設けたことである。このような構成とすることによって切り欠き部７からの気泡の除去が容易となり、気泡の抑制と残留した気泡を効率よく除去することができる細胞電気生理センサを実現することができる。この切り欠き部７は少なくとも一つを設けることによってその効果を発揮することができる。さらに、図７に示したように複数の切り欠き部７を形成することによって気泡の除去をより効果的に行うことができるとともに、より小さな気泡を除去することができることが分かった。このような細胞電気生理センサは、生産性の観点から、レーザー加工またはダイシング装置を用いて切り欠き部７を形成することが容易となる。

また、切り欠き部７の底面をダイアフラム２の平面と同一平面となる深さまで形成することによって、ダイアフラム２の上面における気泡の発生と残留した気泡の除去をより効率的に行うことができる。

次に、さらに別の例の細胞電気生理センサの構成について説明する。図８はさらに別の例の細胞電気生理センサの断面図であり、このセンサ構造の特徴は、端部５の一部に突起部８を形成していることである。この突起部８を設けることによって、前記細胞電気生理センサと同様の効果を発揮することができるとともに、後工程で突起部８を接合によって形成することが容易となり、所望の形状を有する突起部８を効率良く形成することができる。

本発明の細胞電気生理センサは、気泡の発生の抑制と残留した気泡の除去を容易に行うことができることから、細胞電気生理センサの測定に対する信頼性を向上させることができる。従って、高精度な測定が要求される医療分野等における細胞電気生理センサとして、大いに利用可能性を有するものである。

本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの斜視図 同断面図 （ａ）同分注器を用いて液滴を分注する時の様子を説明するための断面図、（ｂ）同断面図 同細胞の電気生理現象を測定する方法を説明するための断面図 同別の例の細胞電気生理センサの斜視図 同別の例の細胞電気生理センサの斜視図 同別の例の細胞電気生理センサの斜視図 同別の例の細胞電気生理センサの斜視図 従来の細胞外電位測定センサの断面図

符号の説明

１ 貫通孔
２ ダイアフラム
３ フレーム
４ キャビティ
５ 端部
６ 段差部
７ 切り欠き部
８ 突起部
９ 細胞
９ａ 被検体細胞
１０ 細胞外液
１１ 細胞内液
１２ 参照電極
１３ 測定電極
１４ 仕切り板
１５ ウエル
１６ 流路
１７ 容器

Claims (7)

1. 少なくとも一つの貫通孔を有したダイアフラムと、このダイアフラムを支持するとともにキャビティを有したフレームとからなる細胞電気生理センサであって、前記フレームの端部を異なった高さとした細胞電気生理センサ。
2. フレームの端部を傾斜面とした請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
3. フレームの端部に段差を設けた請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
4. フレームの端部に切り欠き部を設けた請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
5. 切り欠き部を複数設けた請求項４に記載の細胞電気生理センサ。
6. 切り欠き部の底面をダイアフラムと同一平面となるように設けた請求項４に記載の細胞電気生理センサ。
7. フレームの端部に突起部を設けた請求項１に記載の細胞電気生理センサ。

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