JP2007183146A - 細胞電気生理センサとその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】基板と細胞の密着保持性を高めることによって、シール性の高い細胞電気生理センサおよびその製造方法を実現することを目的とするものである。
【解決手段】基板１に少なくとも１つ以上の貫通孔２を設け、この基板１の両面と貫通孔２に培養液５ａ、５ｂを蓄積させ、前記貫通孔２の開口部に細胞４を密着保持させて電気生理現象を測定する細胞電気生理センサであって、前記基板１の片面および貫通孔２において、少なくとも細胞４と培養液との接触部を光触媒作用を有した絶縁層３で被覆した構成とする。
【選択図】図３

Description

本発明は、細胞の電気生理的活動の測定に用いられる細胞電気生理センサとその製造方法に関するものである。

従来、電気生理学におけるパッチクランプ法は、細胞膜に存在するイオンチャンネルを測定する方法として知られており、このパッチクランプ法によってイオンチャンネルの様々な機能が解明されてきた。そして、イオンチャンネルの働きは細胞学において重要な関心ごとであり、これは薬剤の開発にも応用されている。

しかし、一方でパッチクランプ法は測定技術に微細なマイクロピペットを１個の細胞に高い精度で挿入するという極めて高い能力を必要としているため、熟練作業者が必要であり、高いスループットで測定を必要とする場合には適切な方法でない。

このため、微細加工技術を利用した基板型プローブの開発がなされており、これらは個々の細胞についてマイクロピペットの挿入を必要としない自動化システムに適している。例えば、基板の上に設けられた細胞保持手段を備えたウエルと、このウエルの電気信号を検出する測定用電極と、基準電極とを備えた細胞外電位測定用デバイスによって細胞外電位を測定する技術が知られている（例えば、特許文献１参照）。図１２はこの従来の細胞電気生理センサのウエル構造を模式断面図で示したものであり、ウエル２６の内部に培養液２７が入れられ、被験体細胞２５は基板２１に設けられた細胞保持手段によって捕捉または保持されている。細胞保持手段は基板２１に形成された窪み２２および開口部を介してこの窪み２２に連絡する貫通孔２３を備えた構成となっている。

さらに貫通孔２３の内部にはセンサ手段である測定電極２４が配置されており、この電極２４は配線を経て信号検出部に連絡されている。

そして、測定の際には被験体細胞２５を貫通孔２３から吸引ポンプなどの手段により、この被験体細胞２５が窪み２２に密着保持される。このようにして被験体細胞２５の活動により発生する電気信号はウエル２６の内部の培養液２７に漏れることなく、貫通孔２３に設けた測定電極２４と参照電極２８によって電位の変化あるいは電流の変化を検出する。

このように、基板２１に形成された貫通孔２３はガラスピペットにおける先端穴と同様の役割を果たし、高精度な細胞の電気生理現象を記録できるとともに、基板２１の裏面側からの吸引によって被験体細胞２５が自動的に引きつけられ、被験体細胞２５を容易に保持できるという利点を有している。このとき、被験体細胞２５が高い密着性を持って保持されることは、低いバックグランドノイズでイオンチャネル活動によって生じる細胞外電位、或いは細胞内電位を測定するためには重要な要素である。
国際公開第０２／０５５６５３号パンフレット

しかしながら、前記従来の技術においては、細胞の密着性に大きな影響を与える基板の最適な表面加工に関する技術の開示はなかった。

本発明は、基板と細胞の密着保持性を高めることによって、シール性の高い細胞電気生理センサおよびその製造方法を実現することを目的とするものである。

前記課題を解決するための本発明は、基板に少なくとも１つ以上の貫通孔を設け、この基板と細胞と培養液との接触部を光触媒作用を有した絶縁層で被覆し、この基板の両面と貫通孔に培養液を蓄積させ、貫通孔の開口部に細胞を密着保持させる構成とするものである。

本発明の細胞電気生理センサおよびその製造方法は、細胞が密着される面が光触媒作用により表面に吸着した炭素を含む分子鎖を分解除去することによって基板の表面を高い親水性とし、基板と細胞との密着性を高めて安定したシール性を実現できる細胞電気生理センサおよびその製造方法を提供することができる。

（実施の形態１）
以下、本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサおよびその製造方法について、図面を参照しながら説明する。

図１は本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの斜視図であり、図２はその断面図である。また、図３は細胞電気生理センサの動作を説明するための要部拡大断面図であり、図４は別の構成の例を説明するための断面図であり、図５は他の構成の例を説明するための断面図である。

まず、本実施の形態１における細胞電気生理センサの構成について説明する。

図１〜図３において、基板１はシリコン基板で形成しており、基板１にはエッチング加工などにより貫通孔２を複数形成している。この貫通孔２の最小開口径は３μｍとしており、貫通孔２の最小開口径は測定する細胞の大きさ、形状、性質によって決定することができる。例えば、細胞４の大きさが５〜５０μｍ程度の場合、細胞４が高い密着性を持って保持されるには貫通孔２の最小開口径を３μｍ以下とすることが望ましい。

そして、基板１および貫通孔２の表面は、光エネルギーの照射に伴う光触媒作用を有した絶縁層３で被覆している。この光触媒作用を有した絶縁層３に最適な光エネルギーを照射することで、絶縁層３で光触媒反応が起こり、基板１および貫通孔２の表面に吸着した炭素を含む有機化合物の分子鎖を分解して除去することによって、基板１の表面および貫通孔２の内壁面は高い親水性を示すことができる。

ここで、細胞４は水酸基を含んだ親水性の表面を有しており、基板１の表面および貫通孔２の内壁の表面を高い親水性に保持することによって、細胞４は高い密着性をもって保持できるという効果が得られる。そして、この効果は少なくとも細胞４と細胞外液５ａが基板１と貫通孔２の接触部において光触媒作用を有した絶縁層３で被覆していることによって発揮することができる。

このように、細胞４を高い密着性を持って保持する上では、細胞４が水酸基を含んだ親水性の表面を有していることから、細胞４が密着される面は高い親水性であることが重要な要素となる。

さらに、基板１の第一面１ａと第二面１ｂおよび貫通孔２の内壁を絶縁層３で被覆することによって培養液の浸透を速やかに行うことができるという利点を有している。特に、貫通孔２は微少な穴径を有していることから、この貫通孔２の内壁面を絶縁層３で被覆し、光触媒作用によって親水性を高めておくことによって培養液の充填を速やかに確実に行うことができる。

次に、本発明の細胞電気生理センサの動作について説明する。

図３に示すように、基板１の上部に細胞４を含んだ細胞外液５ａと共に満たした後、基板１の第１面１ａから加圧するか、第２面１ｂを減圧することによって細胞４と第１面１ａの細胞外液５ａは、貫通孔２に引き込まれ、細胞４は貫通孔２を塞ぐように保持される。このとき、第２面１ｂは細胞内液５ｂによって満たしておく。

通常、細胞内液５ｂは、ほ乳類筋細胞の場合、代表的にはＫ＋イオンが１５５ｍＭ、Ｎａ＋イオンが１２ｍＭ程度、Ｃｌ−イオンが４．２ｍＭ程度添加された電解液であり、後に述べる細胞外液５ａは、Ｋ＋イオンが４ｍＭ程度、Ｎａ＋イオンが１４５ｍＭ程度、Ｃｌ−イオンが１２３ｍＭ程度添加された電解液である。

ここで、培養液はこの細胞外液５ａと細胞内液５ｂを含んでおり、細胞外液５ａのみ、あるいは細胞内液５ｂのみを用いて行う測定も含むものである。

次に、第２面１ｂから吸引、もしくは薬剤（ナイスタチン）を投入して細胞４の細胞膜に微細小径を形成する。

その後、細胞４への刺激となりうる行為を第１面１ａから施す。この刺激の種類としては、例えば化学薬品、毒物などの化学的な刺激に加え、機械的変位、光、熱、電気、電磁波などの物理的な刺激などによって細胞４に刺激を与える。

そして、細胞４がこれらの刺激に対して活発に反応する場合、例えば細胞４は細胞膜が保有したチャネルを通じて各種イオンを放出あるいは吸収する。この結果として、細胞内外の電位勾配が変化し、その変化を検出することができる。この電位勾配の変化を細胞外液５ａに設けた電極７と細胞内液５ｂに設けた電極８によって測定する。

このとき、細胞４が高い密着性を持って貫通孔２の開口部に保持されることは、前記のように低いバックグランドノイズで細胞４の電気生理現象を測定するために重要な要素となり、少なくとも基板１の第一面１ａおよび貫通孔２において、少なくとも細胞４と細胞外液５ａとの接触部を光触媒作用を有した絶縁層３で被覆することによって前記のようなシール性に優れた細胞電気生理センサを実現することができる。

また、図４に示したように、さらに細胞４との密着性を高めるために貫通孔２の第一面１ａ側に窪み６を形成し、この窪み６の表面に光触媒作用を有する絶縁層を形成することによってさらにシール性の高い細胞電気生理センサを実現することができる。

また、細胞外液５ａおよび細胞内液５ｂにおいても親水性を有していることから貫通孔２の内壁と基板１の第二面１ｂにも光触媒作用を有する絶縁層３を形成することによって、速やかに細胞外液５ａまたは細胞内液５ｂを貫通孔２の内部に充填することができるとともに、気泡などの発生を抑制することができることからより効率の高い細胞電気生理センサを実現することができる。

なお、細胞外液５ａと細胞内液５ｂを同じ培養液とし、別途薬剤などをどちらかの培養液に添加し、そのときの細胞４の反応を測定するときも同様の方法によって測定することができる。

次に、本発明の光触媒作用を有した絶縁層３の効果について詳細に説明する。

例えば二酸化チタンに代表されるような光触媒作用物質の作用は、この二酸化チタンに光をあてると電子と正孔が生成し、水や溶存酸素などとの反応によりＯＨラジカルやスーパーオキサイドアニオンなどの活性酸素を生じる。このとき、絶縁層３は光照射によって光触媒作用を有するときには半導体化すると考えられている。このＯＨラジカルは１２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ相当の非常に大きなエネルギーを持っており、これ対して有機物を構成する分子中の結合エネルギーは１００ｋｃａｌ／ｍｏｌ前後である。このことから、より大きなエネルギーを持つＯＨラジカルは有機物の結合を簡単に切断して分解することができる。この光触媒作用により、有機物を完全に分解して基板１の表面あるいは貫通孔２の内壁に付着した有機物を分解除去することができる。これは、バンドギャップエネルギー以上のエネルギーを照射することによって生成されたキャリアが近傍に存在する化合物と反応するものと考えられている。特に、近傍に存在する化合物の結合エネルギーが弱い場合には、分解したり除去したりすることが可能である。

前記の理由により、光触媒作用を有した絶縁層３に最適なエネルギーを照射することで、光触媒作用により、表面に吸着した有機物の炭素を含む分子鎖が分解あるいは分解除去されることによって、光触媒作用を有した絶縁層３を形成した基板１の表面および貫通孔２の内壁表面が高い親水性を示す。そして、細胞４は水酸基を含んだ親水性の表面を有している。そこで、基板１の表面および貫通孔２の内壁表面が高い親水性を示すとき、細胞４は基板１の表面および貫通孔２近傍で高い密着性をもって保持されるという効果が得られる。このことは高いシールド性を実現することとなり、高精度に細胞４の電気生理的変化を測定することができる。

なお、光エネルギーを照射した後、純水などで光エネルギーを照射した基板１の表面を洗浄した後、培養液と細胞４を用いて測定することによって、不純物の影響を完全に排除した測定が可能となる。

また、図５に示したように光触媒作用を有した絶縁層３を形成した部分が、細胞４を密着させる基板の第１面１ａに形成した構造としてもよい。このような構成の細胞電気生理センサを作製するとき、貫通孔２を形成した基板の第一面１ａに光触媒作用を有した絶縁層３である二酸化チタンなどをスパッタ法などの技術を用いて製膜したとき、貫通孔２の上部付近においても二酸化チタンの薄膜が回り込むように製膜される。これによって、生産性に優れた細胞電気生理センサを提供することが可能となる。

なお、光触媒作用を有した絶縁層３は、例えば二酸化チタン、酸化タングステン、酸化スズ、酸化亜鉛、酸化鉄、酸化ビスマス、チタン酸ストロンチウム、およびこれらの混合物のような光触媒作用物質で構成することが効果的である。

その中でも、化学的に安定であり、励起波長が３８０ｎｍ以下であるアナターゼ型の二酸化チタンが特に好ましい。励起波長を３８０ｎｍ以下としたとき、意図的に光エネルギーを照射しない限りは光触媒作用を示さないことから、光触媒作用による細胞４への細胞４への悪影響を抑制する上で有効である。

また、光触媒作用を有した絶縁層３は、前記の光触媒作用物質と非光触媒作用物質の混合物で構成することが可能である。このとき、非光触媒作用物質中に微細化された光触媒作用物質が分散した構造を有することが望ましい。微粉化された光触媒作用物質は、高効率の光触媒作用を示すものを容易に入手することが可能であるという利点を有するとともに、光触媒作用を有した絶縁層３を基板１へ形成する場合のプロセス工法についてその自由度を高めることができる。例えば、光触媒作用物質である二酸化チタンと非光触媒作用物質である有機材料を均一に分散可能な有機溶剤を用いることで、簡便な製造方法であるスピンコート法、スプレーコート法、ディップコート法などの塗布法により塗布形成した後、有機材料を硬化させることによって、光触媒作用を有した絶縁層３を容易に形成できる。

このとき、非光触媒作用物質として重要なことは、光触媒作用によって分解されないという特性を有していることが重要であり、非光触媒作用物質として用いる有機材料としては光触媒作用によって分解されないことが必要である。このような特性を有する有機材料の中でも特にシリコン樹脂が光触媒作用に対する安定性、生産性の観点から好ましい。このことにより、化学的に安定で耐久性に優れた光触媒作用を有した絶縁層３を形成可能となる。

また、本発明の細胞電気生理センサの構成において十分な効果を得るには、光触媒作用を有した絶縁層３の表面における吸着炭素元素と、光触媒作用を有した絶縁層の非被覆面に対する吸着炭素元素の比は１未満であることが好ましい。これによって、細胞４は親水性の高い光触媒作用を有した絶縁層３の上に滞留することの確率が高くなり、吸引などの手段によって簡単に貫通孔２の開口部に細胞４を密着保持することができる。

なお、ここで用いた吸着炭素元素の比とは、光触媒作用を有した絶縁層３の被覆面と非被覆面の表面に吸着した炭素元素の比を示しており、例えば非光触媒作用物質に含有されるような炭素元素を含むものではない。

本実施の形態１における細胞電気生理センサは、最適な光エネルギーを照射するなどの何らかの刺激を与えることにより、前記条件を満たすことが可能であり、そのような細胞電気生理センサを全て含む。これにより、何らかの原因で親水性が悪化した場合にも、最適な光エネルギーを照射することで容易に親水性を向上させることが可能となる。

次に、本実施の形態１における細胞電気生理センサの製造方法について説明する。

図６〜図１１は本実施の形態１における細胞電気生理センサの製造工程を説明するための断面図である。

この細胞電気生理センサの製造方法は、図６に示すようにシリコン基板からなる基板１を用意し、基板１の第１面１ａに所定のパターンでレジストマスク１１を形成する。

次に、図７に示すように基板１をエッチングによって貫通孔２を形成する。このときのエッチング方法としては貫通孔２の寸法形状を高精度に作製するためにはドライエッチングを用いることが好ましく、そのときのエッチングガスとしてはエッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスを交互に用いる。エッチングを促進するガスにはＸｅＦ₂、ＳＦ₆、ＣＦ₄などを用いるが、これらはシリコンのエッチングを深さ方向だけではなく、横方向へも促進する作用がある。そこで、ＣＨＦ₃、Ｃ₄Ｆ₈等のエッチングを抑制するガスを混合させておくことで、エッチングの壁面にＣＦ₂のポリマーである保護膜を作製するので、ドライエッチングによる貫通孔２の形成をレジストマスク１１の下方のみに進行させることが可能となり、アスペクト比の高い貫通孔２を高精度に形成することができる。

その後、図８に示すようにレジストマスク１１を除去する。

次に、図９に示すように基板１の第１面１ａおよび貫通孔２の内壁表面にスパッタ法によって二酸化チタンを光触媒作用を有した絶縁層３として製膜する。このとき、貫通孔２の内壁面にも二酸化チタン膜が形成できるようにスパッタ装置を工夫することによって容易に光触媒作用を有した絶縁層３を形成することができる。

そして、さらに培養液との濡れ性を高めるために、図１０に示すように基板１の第２面１ｂからも同様の方法によって光触媒作用を有した絶縁層３を形成する。

このとき、光触媒作用を有した絶縁層３が光触媒作用物質のみから構成する場合には、真空蒸着法、スパッタリング法、イオンプレーティング法、ＣＶＤ法等の真空成膜法を用いることが可能である。そして、貫通孔２の穴径に対する深さ方向のアスペクト比が５倍程度まではスパッタ法などで形成することができるが、アスペクト比が１０倍程度の高い場合にはＣＶＤ法などが効果的である。

これにより、基板１および貫通孔２の内壁表面に均一に絶縁層３を形成することが可能となる。

また、光触媒作用を有した絶縁層３を光触媒作用物質と非光触媒作用物質の混合物で構成する場合には、光触媒作用物質である二酸化チタン粉末と非光触媒作用物質である有機材料を溶剤中に均一に分散させた塗布液を調製し、この塗布液をスピンコート法、スプレーコート法、ディップコート法等で塗布した後、有機材料を硬化することによっても絶縁層３を形成することが可能である。

これにより、簡便な製造方法にて絶縁層３を形成することが可能となる。

その後、図１１に示すように光触媒が作用するのに最適な紫外線ランプ、あるいは紫外線レーザなどの光エネルギーを絶縁層３に照射する。この光エネルギーを照射するタイミングは測定の直前に行うことが好ましい。すなわち、測定の直前に付着した有機物を除去することによって最善の親水性を実現することができる。

そして、光触媒作用を有した絶縁層３の表面の吸着炭素元素の量が絶縁層３を形成していない表面の吸着炭素元素の量に対する吸着炭素元素比が少なくとも１未満となるまで照射し、その後、測定に用いられる培養液および細胞４を投入して測定を行うと、細胞４が高い密着性を持って保持されることから、低いバックグラウンドノイズで細胞４の電気生理現象を測定することが可能となる。

以上のように、本発明にかかる細胞電気生理センサおよびその製造方法は、細胞が密着保持される近傍の基板および貫通孔の内壁の表面が高い親水性を有することにより、細胞が高い密着性を持って保持されることから高精度な細胞電気生理センサとして有用である。

本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの斜視図 同断面図 同要部拡大断面図 同別の構成を有した細胞電気生理センサの要部拡大断面図 同別の構成を有した細胞電気生理センサの要部拡大断面図 同製造方法を示すための断面図 同断面図 同断面図 同断面図 同断面図 同断面図 従来の細胞電気生理センサの断面図

符号の説明

１ 基板
１ａ 第１面
１ｂ 第２面
２ 貫通孔
３ 光触媒作用を有した絶縁層
４ 細胞
５ 培養液
５ａ 細胞外液
５ｂ 細胞内液
６ 窪み
７ 電極
８ 電極
１１ レジストマスク

Claims (12)

1. 基板に少なくとも１つ以上の貫通孔を設け、この基板の両面と貫通孔に培養液を蓄積させ、前記貫通孔の開口部に細胞を密着保持させて電気生理現象を測定する細胞電気生理センサであって、
   前記基板の片面および貫通孔において、少なくとも細胞と培養液との接触部を光触媒作用を有した絶縁層を設けた細胞電気生理センサ。
2. 細胞と貫通孔の間に光触媒作用を有した絶縁層で被覆した窪みを設けた請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
3. 貫通孔の内壁を光触媒作用を有した絶縁層で被覆した請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
4. 絶縁層を光触媒作用物質で構成した請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
5. 絶縁層を光触媒作用物質と非光触媒作用物質の混合物で構成した請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
6. 光触媒作用物質を二酸化チタン、酸化タングステン、酸化スズ、酸化亜鉛、酸化鉄、酸化ビスマス、チタン酸ストロンチウムの中から選ばれた少なくとも一種を含む光触媒作用物質とした請求項４または請求項５に記載の細胞電気生理センサ。
7. 非光触媒作用物質を有機材料とした請求項５に記載の細胞電気生理センサ。
8. 有機材料をシリコン樹脂とした請求項７に記載の細胞電気生理センサ。
9. 光触媒作用を有した絶縁層と、この絶縁層以外の基板の表層部における炭素元素比を１未満とした請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
10. 基板に少なくとも１つ以上の貫通孔を設け、この基板の両面と貫通孔に培養液を蓄積させ、この基板の貫通孔の片面の開口部に細胞を密着保持し、この細胞の電気生理現象を測定する細胞電気生理センサの製造方法であって、
    前記基板の一面側のドライエッチングによって所望の形状の貫通孔を形成する工程と、光触媒作用を有した絶縁層で被覆する工程と、光触媒が作用する光エネルギーを照射する工程を含む細胞電気生理センサの製造方法。
11. 光触媒作用を有した絶縁層で被覆する工程を、真空蒸着法、スパッタリング法、イオンプレーティング法、ＣＶＤ法のいずれか一つを用いて行う請求項１０に記載の細胞電気生理センサの製造方法。
12. 光触媒作用を有した絶縁層で被覆する工程を、スピンコート法、スプレーコート法、ディップコート法のいずれか一つを用いて行う請求項１０に記載の細胞電気生理センサの製造方法。

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