JP2007225483A

JP2007225483A - 細胞電気生理センサとその使用方法およびその製造方法

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Publication number: JP2007225483A
Application number: JP2006048214A
Authority: JP
Inventors: Makoto Takahashi; 誠高橋; Masaya Nakatani; 将也中谷; Koji Ushio; 浩司牛尾; Soichiro Hiraoka; 聡一郎平岡; Akiyoshi Oshima; 章義大島
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Holdings Corp
Priority date: 2006-02-24
Filing date: 2006-02-24
Publication date: 2007-09-06

Abstract

【課題】気泡を除去し、センサの信頼性を向上させることを目的とする。
【解決手段】上記課題を解決するため本発明は、細胞保持基板１と、この細胞保持基板１の上方に配置したウエル２と、このウエル２の内部に配置した第１電極４と、前記細胞保持基板１の下方に配置した流路５と、この流路５の内部に配置した第２電極７とを備え、細胞保持基板１には、この細胞保持基板１の上面から下面までを連結する貫通孔９を有し、流路５の内部であって貫通孔９の下方に相当する部分には突起１０を設けたものである。これにより貫通孔９の下方に付着した気泡を除去し、センサの信頼性を向上させることができる。
【選択図】図１

Description

本発明は、細胞の細胞外電位あるいは細胞の活動に発生する物理化学的変化を測定するために用いられる細胞電気生理センサに関するものである。

従来の、細胞の電気的活動を指標にして細胞膜に存在するイオンチャネルの機能を解明したり、薬品をスクリーニング（検査）したりする方法として、パッチクランプ法が挙げられる。

このパッチクランプ法は、マイクロピペットの先端部分で細胞膜の微小部分（パッチという）を軽く吸引し、マイクロピペットに設けた微小電極プローブを用いて、パッチを横切る電流を、固定（クランプ）した膜電位のもとで測定するものである。そしてこれにより、パッチに存在する１個または少数個のイオンチャネルの開閉の様子を電気的に記録することができるものである。そしてこれは、細胞の生理機能をリアルタイムで調べることのできる数少ない方法の一つである。

しかし、パッチクランプ法はマイクロピペットの作成および操作に特殊な技術・技能を必要とし、一つの試料の測定に多くの時間を要することから、大量の薬品候補化合物を高速でスクリーニングする用途には適していない。

このため、近年微細加工技術を利用した平板型の微小電極プローブの開発がなされており、これは個々の細胞についてマイクロピペットの挿入を必要としない自動化システムに適している。

下記特許文献１では、細胞保持基板に複数の貫通孔を設け、この貫通孔の開口部に被験体細胞を接着させ、貫通孔の下方に配置した第２電極で、被験体細胞の電位依存性のイオンチャネル活性を測定する技術を開示している。

下記非特許文献１では、シリコン酸化物製の細胞保持基板（ｍｅｍｂｒａｎｅ）の内部に２．５μｍの貫通孔（ｈｏｌｅ）を形成し、この貫通孔にヒト培養細胞株の一種であるＨＥＫ２９３細胞を保持させて高い密着性を確保して高精度に細胞外電位を測定する技術を開示している。

さらに、下記特許文献２で開示された細胞電気生理センサ３１は、図１９に示すように、細胞保持基板３２と、この細胞保持基板３２上面に形成された凹部３３と、この凹部３３の下部から細胞保持基板３２の下面まで連結する貫通孔３４と、細胞保持基板３２の上方に配置された参照電極３５と、前記貫通孔３４の内部に配置された測定電極３６とを備えている。

またこの測定電極３６は、配線３７を経て信号検出部に連結されている。そして上記細胞保持基板３２は、ウエル３８内部に配置されている。

上記細胞電気生理センサ３１の動作方法について以下に説明する。

まず、ウエル３８内に細胞および電解液４０が注入され、細胞が凹部３３によってトラップ（捕捉）され、保持される。この凹部３３に保持された細胞を以下被験体細胞３９という。

そして、測定の際には被験体細胞３９は貫通孔３４の下方から吸引ポンプなどで吸引され、貫通孔３４の開口部に密着した状態で保持される。すなわち、この貫通孔３４がガラスピペットにおける先端穴と同様の役割を果たしている。そして被験体細胞３９のイオンチャネルの機能性や薬理反応などは、参照電極３５と測定電極３６との間における反応前後の電圧、あるいは電流を測定し、細胞内外の電位差を求めることによって分析している。
特表２００２−５１８６７８号公報国際公開第０２／０５５６５３号パンフレットＴ．Ｓｏｒｄｅｌｅｔａｌ，ＭｉｃｒｏＴｏｔａｌＡｎａｌｙｓｉｓＳｙｓｔｅｍｓ２００４，Ｐ５２１〜５２２（２００４）

従来の細胞電気生理センサは、第１電極と第２電極との間における電位差の測定値に誤差が生じ、センサの信頼性が低下するという問題があった。

それは、流路上方の親水性が低い部分や、流路上方の貫通孔周辺などの凹凸を有する部分には気泡が付着しやすく、この気泡の抵抗値は非常に大きいため、この気泡の有無によって測定値が変動するからであった。特に、貫通孔の下方に付着した気泡は、第２電極で検知する電流、あるいは電圧の測定値を大きく変動させる要因となっていた。

そこで本発明は、貫通孔の下方に付着した気泡を除去し、センサの信頼性を向上させることを目的とする。

上記課題を解決するため本発明は、細胞保持基板と、この細胞保持基板の上方に配置したウエルと、このウエルの内部に配置した第１電極と、前記細胞保持基板の下方に配置した流路と、この流路の内部に配置した第２電極とを備えている。そして前述の細胞保持基板には、この細胞保持基板の上面から下面までを連結する貫通孔を有し、流路の内部であって貫通孔の下方に相当する部分には突起を設けたものである。

これにより本発明では、貫通孔の下方に付着した気泡を、流路に注入した電解液で押し流し、除去することができる。

それは、流路の内部であって貫通孔の下方に相当する部分には突起を設けていることから、この突起によって貫通孔の下方に相当する部分の流路断面積が小さくなり、流路に流れる電解液の水圧が上がることに起因する。

すなわち、この電解液の水圧で気泡を押し流すことができるのである。そしてその結果、貫通孔の下方に付着した気泡を除去し、センサの信頼性を向上させることができる。

（実施の形態１）
図１は本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの断面図である。

この細胞電気生理センサは、細胞保持基板１と、この細胞保持基板１の上方に配置したウエル２と、このウエル２を備えたウエル基板３と、ウエル２の内部であって細胞保持基板１の上面に配置した第１電極４と、細胞保持基板１の下方に配置した流路５と、この流路５を形成した流路基板６と、流路５の内部であって細胞保持基板１の下面に配置した第２電極７とを備えている。

そして、細胞保持基板１の内部には凹部を有する細胞電気生理センサチップ８を配置し、この凹部の底面からチップの下面までを連結する貫通孔９を形成している。

そして、流路５の内部であって貫通孔９の下方に相当する部分には突起１０を設けている。

本実施の形態では、突起１０を角のある突起形状としたが、このような突起は複数の基板を張り合わせる、切削、射出成型などにより容易に得ることができる。

なお、第１電極４はウエルの内部に注入する電解液（図５の第２電解液１４）に、また第２電極７は流路５の内部に注入する電解液（図５の第１電解液１２）にそれぞれ浸漬させ、その電位差を測定できればよいため、第１電極４および第２電極７は針状の微小電極プローブを用いてもよい。

また、本実施の形態において、ウエル基板３と細胞保持基板１および流路基板６はプラスチックで形成した。そして第１電極４および第２電極７は、クロム、チタン、銅、金、白金、銀および塩化銀からなる材料から選択した。また、細胞電気生理チップ８はシリコンで形成し、細胞保持基板１とは樹脂製接着剤１１で接着した。

さらに、貫通孔９の開口部の直径は３μｍとした。細胞が５〜５０μｍ程度の大きさの場合、細胞と貫通孔９とを高い密着性を持って保持するには、貫通孔９の開口部の直径を３μｍ以下とすることが望ましいからである。その他、この貫通孔９の開口部の最適な大きさは、測定する細胞の形状、性質によって決定する。

次に、本発明の細胞電気生理センサを用いて細胞の電気生理活動を測定する方法について簡単に述べる。図２〜１０は本発明の細胞電気生理センサを使用する際の断面図である。

まず、図２に示すように、流路５に第１電解液１２を充填する。ここで、第１電解液１２とは、たとえば、哺乳類筋細胞の場合、代表的にはＫ⁺イオンが１５５ｍＭ、Ｎａ⁺イオンが１２ｍＭ程度、Ｃｌ^-イオンが４．２ｍＭ程度添加された電解液である。

この際、流路５上方の親水性が低い部分や、流路５上方の貫通孔９周辺などの凹凸を有する部分には気泡１３が付着、残留しやすい。

次に、図３に示すように、流路５の例えばＡ方向から加圧もしくは減圧することで、流路５内に第１電解液１２の流れを発生させ、付着した気泡１３を取り除く。

次に、図４に示すように、例えば流路５のＢ方向を封止し、Ａ方向から加圧することで、貫通孔９を第１電解液１２で満たすことで、後で説明する工程をスムーズに進行することができる。

次に、図５に示すように、ウエル２に第２電解液１４を充填する。ここで第２電解液１４とは、たとえば、哺乳類筋細胞の場合、代表的にはＫ⁺イオンが４ｍＭ程度、Ｎａ⁺イオンが１４５ｍＭ程度、Ｃｌ^-イオンが１２３ｍＭ程度添加された電解液である。なお、第１電解液１２と第２電解液１４とは、本実施の形態１のように異なる組成のものを用いてもよく、同じものを用いてもよい。

その後、例えば流路５のＢ方向を封止し、Ａ方向から加圧・減圧、もしくはウエル２方向から加圧・減圧することで、貫通孔９に残留した気泡１３を除去する。

ここで、図６に示すように、気泡１３が貫通孔周辺に付着、残留してしまうことがある。

そこで、図７に示すように、例えば流路６のＡ方向から加圧することで、気泡を除去する。

この状態で、ウエル２内に設置された第１電極４と流路５内に設置された第２電極７間で、１００ｋΩ〜１０ＭΩ程度の抵抗値を観察することができる。これは細胞電気生理センサチップ８に設けられた貫通孔９に電解液が浸透し、電極間で電気回路が形成されるからである。

次に、図８および図９に示すように、細胞１５を投入し、例えば流路５のＢ方向を封止し、Ａ方向から減圧することで、細胞１５は貫通孔９へ引き付けられ、ついにはこの貫通孔９をふさぎ、ウエル２と流路５の電気抵抗は十分に高くなる。

さらに、図１０に示すように、減圧を続ける、もしくはナイスタチンのように細胞外壁を溶解する作用のある薬液を流路５内に導入することで、細胞１５に微細小孔を形成する。

その後、この細胞１５に化学的刺激、あるいは物理的刺激を付与する。この化学的刺激としては、化学薬品、毒物、物理的刺激としては機械的変異、光、熱、電気、電磁波などが挙げられる。

そして、細胞１５がこれらの刺激に対して活発に反応する場合、細胞１５はその細胞膜にあるイオンチャネルを通じて各種イオンを放出あるいは吸収する。

そうすると、細胞１５を通るイオン電流が発生し、この細胞１５内外の電位勾配が変化するため、この変化を反応前後の第１電極と第２電極との間の電圧、あるいは電流を測定することによって検出する。

次に、本実施の形態１における効果を以下に説明する。

本実施の形態１では、センサの信頼性を向上させることができる。

それは流路５の内部であって貫通孔９の下方に相当する部分には突起１０を設けていることから、この突起１０によって貫通孔９の下方に相当する部分の流路断面積が狭くなり、流路５に流れる第１電解液１２の水圧が上がることに起因する。

すなわち、この第１電極液１２の水圧で気泡１３を速やかに押し流すことができるのである。そしてその結果、図３および図７に示すように、貫通孔９の下方に付着した気泡１３を除去し、センサの信頼性を向上させることができるのである。

また、本実施の形態１では、細胞１５を貫通孔９に的確に密着させることによってセンサの信頼性の向上に寄与する。

すなわち、貫通孔９に細胞１５を密着させるために流路５内部を減圧する場合、流路５の内壁に付着した気泡１３が膨張してしまい、流路５内部の減圧が阻害されることがあった。そして細胞１５を貫通孔９に的確に吸引することができず、センサの信頼性を悪化させる要因となっていた。

しかし、本実施の形態１では、流路５内壁に付着する気泡１３を低減することができ、その結果流路５内部の減圧が適切に行われ、センサの信頼性を向上させることができるのである。

なお、貫通孔９の近傍に気泡が存在すれば、抵抗値の増大により第２電極１４で検知する電流・電圧の測定値が変動することから、突起１０は貫通孔９の下方に相当する部分に形成し、この部分の水圧を上げることが好ましい。

また、本実施の形態１のように細胞保持基板１の下面に第２電極７を形成する場合、図１１のように、貫通孔９の下方から第２電極７の下方の間まで突起部１０を延長してもよい。この部分の気泡を除去することが、センサの信頼性に寄与するからである。

また、本実施の形態１では、突起１０を角のある突起形状としたが、図１２のように、貫通孔の下方に相当する部分には流路内方に突出した湾曲部１６を設けても同様の効果を有する。

さらに、湾曲部１６とすることで、電解液の流れをスムーズにすることができるので、速やかに測定可能な状態にすることが可能である。

また、図１３に示すように、細胞保持基板１の下面に第２電極７を形成する場合、貫通孔９の下方から第２電極７の下方の間まで湾曲部１６を延長してもよい。この部分の気泡を除去することが、センサの信頼性に寄与するからである。

さらに、図１４に示すように、貫通孔９の下方に相当する部分に流路５の一方の電解液の流入方向に傾斜を形成した突起１７を設けてもよい。この場合、気泡の除去を促す効果だけでなく、電解液の流入の際の抵抗を減らすことができる。

また、図１５に示すように、細胞保持基板１の下面に第２電極７を形成する場合、貫通孔９の下方から第２電極７の下方の間まで、流路５の一方の電解液の流入方向に傾斜を形成した突起１７を延長してもよい。この部分の気泡を除去することが、センサの信頼性に寄与するからである。

さらに、図１４および図１５に示した一方に傾斜を形成した突起とすることで、図１６に示すように、流路５内を減圧した場合、膨張した気泡１８が、第２電極７もしくは貫通孔９に再付着するのを抑制するストッパの効果も有する。

（実施の形態２）
次に、図１７を用いて本発明の実施の形態２について説明する。なお、図面において実施の形態１と同じ機能を持つ構成部材については同番号を付与する。本発明の実施の形態２が実施の形態１と異なる部分は、流路の側壁に突起１９を設けた部分である。

このような構成とすることで、流路５に流れる第１電解液１２の水圧が上がるだけでなく、水流を確実に貫通孔方向へ導くことができるので、気泡を速やかに押し流すことができ、センサの信頼性向上に寄与することができる。

（実施の形態３）
次に、図１８を用いて本発明の実施の形態３について説明する。なお、図面において実施の形態２と同じ機能を持つ構成部材については同番号を付与する。本発明の実施の形態３が実施の形態２と異なる部分は、細胞電気生理センサチップ８が複数構成されており、それにともない貫通孔９の下方まで電解液を導く流路も複数形成されている部分である。

このような構成とすることで、複数の細胞電気生理センサチップを同時に測定することが可能になるだけでなく、貫通孔付近から除去した気泡が、再び別の貫通孔付近に付着するのを防ぐことができるため、気泡除去にかかる時間を低減することができるという効果を有する。

本発明の細胞電気生理センサ、センサの信頼性を向上させることができる。

よって、高精度な測定が要求される医療分野等における細胞電気生理センサとして、大いに利用可能性を有するものである。

本発明の実施の形態１における細胞電位測定センサの断面図同細胞電位測定センサの使用方法を説明するための断面図同断面図同断面図同断面図同断面図同断面図同断面図同断面図同断面図同別の例１の細胞電位測定センサの断面図同別の例２の細胞電位測定センサの断面図同別の例３の細胞電位測定センサの断面図同別の例４の細胞電位測定センサの断面図同別の例５の細胞電位測定センサの断面図同別の例４，５の効果を説明するための断面図本発明の実施の形態２における細胞電位測定センサの上面図本発明の実施の形態３における細胞電位測定センサの上面図従来の細胞外電位測定センサの断面図

符号の説明

１細胞保持基板
２ウエル
３ウエル基板
４第１電極
５流路
６流路基板
７第２電極
８細胞電気生理センサチップ
９貫通孔
１０突起
１１樹脂製接着剤
１２第１電解液
１３気泡
１４第２電解液
１５細胞
１６湾曲部
１７電解液の流入方向に傾斜を設けた突起
１８減圧により膨張した気泡
１９流路壁の突起

Claims

細胞保持基板と、この細胞保持基板の上方に配置したウエルと、このウエルの内部に配置した第１電極と、前記細胞保持基板の下方に配置した流路と、この流路の内部に配置した第２電極とを備え、前記細胞保持基板には、この細胞保持基板の上面から下面までを連結する貫通孔を有し、前記流路の内部であって前記貫通孔の下方に相当する部分には突起を設けた細胞電気生理センサ。
細胞保持基板と、この細胞保持基板の上方に配置したウエルと、このウエルの内部に配置した第１電極と、前記細胞保持基板の下方に配置した流路と、この流路の内部に配置した第２電極とを備え、前記細胞保持基板には、この細胞保持基板の上面から下面までを連結する貫通孔を有し、前記流路の内部であって前記貫通孔の下方から前記第２電極までの間の部分には突起を設けた細胞電気生理センサ。
細胞保持基板と、この細胞保持基板の上方に配置したウエルと、このウエルの内部に配置した第１電極と、前記細胞保持基板の下方に配置した流路と、この流路の内部に配置した第２電極とを備え、前記細胞保持基板には、この細胞保持基板の上面から下面までを連結する貫通孔を有し、前記流路の内部であって前記貫通孔の下方に相当する部分には流路内方に突出した湾曲部を設けた細胞電気生理センサ。
細胞保持基板と、この細胞保持基板の上方に配置したウエルと、このウエルの内部に配置した第１電極と、前記細胞保持基板の下方に配置した流路と、この流路の内部に配置した第２電極とを備え、前記細胞保持基板には、この細胞保持基板の上面から下面までを連結する貫通孔を有し、前記流路の内部であって前記貫通孔の下方から前記第２電極までの間の部分には流路内方に突出した湾曲部を設けた細胞電気生理センサ。
細胞保持基板と、この細胞保持基板の上方に配置したウエルと、このウエルの内部に配置した第１電極と、前記細胞保持基板の下方に配置した流路と、この流路の内部に配置した第２電極とを備え、前記細胞保持基板には、この細胞保持基板の上面から下面までを連結する貫通孔を有し、前記流路の内部であって前記貫通孔の下方に相当した部分には、一方向に傾斜をつけた突起を設けた細胞電気生理センサ。
細胞保持基板と、この細胞保持基板の上方に配置したウエルと、このウエルの内部に配置した第１電極と、前記細胞保持基板の下方に配置した流路と、この流路の内部に配置した第２電極とを備え、前記細胞保持基板には、この細胞保持基板の上面から下面までを連結する貫通孔を有し、前記流路の内部であって前記貫通孔の下方から前記第２電極までの間の部分には、一方向に傾斜をつけた突起を設けた細胞電気生理センサ。
細胞保持基板と、この細胞保持基板の上方に配置したウエルと、このウエルの内部に配置した第１電極と、前記細胞保持基板の下方に配置した流路と、この流路の内部に配置した第２電極とを備え、前記細胞保持基板には、この細胞保持基板の上面から下面までを連結する貫通孔を有し、前記貫通孔の下方に相当する前記流路の壁面に、一方向に傾斜をつけた突起を設けた細胞電気生理センサ。
細胞保持基板と、この細胞保持基板の上方に配置したウエルと、このウエルの内部に配置した第１電極と、前記細胞保持基板の下方に配置した流路と、この流路の内部に配置した第２電極とを備え、前記細胞保持基板には、この細胞保持基板の上面から下面までを連結する貫通孔を有し、前記貫通孔の下方から前記第２電極までの間の前記流路の壁面に、一方向に傾斜をつけた突起を設けた細胞電気生理センサ。
細胞保持基板と、この細胞保持基板の上方に配置したウエルと、このウエルの内部に配置した第１電極と、前記細胞保持基板の下方に配置した流路と、この流路の内部に配置した第２電極とを備え、前記細胞保持基板には、この細胞保持基板の上面から下面までを連結する複数の貫通孔を有し、前記複数の貫通孔の下方に、一方向に傾斜をつけた突起を壁面に形成した流路を複数設けた細胞電気生理センサ。