CN1564942A - 细胞外电位测量装置及其制造方法 - Google Patents

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Abstract

测量被检体细胞的细胞外电位的装置包含：形成第1捕集孔的基板，该基板具有在第1面上形成有底面的凹槽、朝向第2面从凹槽底面形成的第1开口部；通过第1连接部与第1开口部连接的第1空洞部；到达通过第2连接部与第1空洞部连接的第2面的第2开口部，第1连接部直径比第1空洞部的最大直径小，比第2连接部的直径大，而且比被检体细胞的直径小，该装置可以可靠地保持被检体细胞，容易投入药液和被检体细胞。

Description

细胞外电位测量装置及其制造方法
技术领域
本发明涉及以活体试样，尤其是细胞发生的电化学变化作为指标，简易、高速地进行电生理学评价的细胞外电位测量装置及其制造方法。
背景技术
目前以细胞的电气活动作为指标，将药品用碎片夹持(patch clamp)法，或使用荧光色素或发光指示药的方法进行筛选(screening)。
该碎片夹持法通过微小电极探头电记录在微吸管前端部分上附着的称为细胞膜的碎片(patch)的微小部分的、经单一通道蛋白质分子的离子输送。该方法是可以通过实时调查一个蛋白质分子功能的少数方法之一(例如“Molecular Biology of the cell Third Edition”、Garlandpublishing Inc.，New York，1994、Bruce Alberts外，还可参照日语版“细胞の分子生物学 第三版”181～182页，1995年，教育社)。
此外，根据特定的离子浓度变化，通过发光的萤光色素或发光指示剂，监控细胞内的离子移动，可以测量细胞的电气活动。
可是，碎片夹持法在微吸管制作或操作方面需要特殊的技术，因为在一种试样的测定中需要许多时间，所以不适合高速地筛选大量药品候选化合物。此外，利用萤光色素等方法可以高速地筛选大量药品候选化合物，然而，对细胞染色的工序是必要的，在测定中，通过色素的影响也会使背景变色，而且由于随时间而脱色，所以S/N也差。
发明内容
测量被检体细胞的细胞外电位的装置具备在第1面上形成有底面的凹槽且形成有第1捕集孔的基板，该第1捕集孔具有向着第2面从所述凹槽的所述底面形成的第1开口部；通过第1连接部与所述第1开口部连接的第1空洞部；通过第2连接部与所述第1空洞部连接的、到达所述第2面的第2开口部，所述第1连接部的直径比所述第1空洞部的最大直径小，比所述第2连接部的直径大，而且比所述被检体细胞的直径小。
该装置可以可靠地保持被检体细胞，容易投入药液和被检体细胞。
附图说明
图1是本发明实施方式1的细胞外电位测量用装置的立体图。
图2是本发明实施方式1的细胞外电位测量用装置的截面图。
图3是本发明实施方式1的细胞外电位测量用装置的截面放大图。
图4是示出实施方式1的细胞外电位测量用装置的使用方法的截面图。
图5是实施方式1的细胞外电位测量用装置的放大截面图。
图6是实施方式1的细胞外电位测量用装置的放大截面图。
图7是实施方式1的细胞外电位测量用装置的放大截面图。
图8是实施方式1的细胞外电位测量用装置的放大截面图。
图9是实施方式1的细胞外电位测量用装置的放大截面图。
图10是示出实施方式1的细胞外电位测量用装置的制造方法的截面图。
图11是示出实施方式1的细胞外电位测量用装置的制造方法的截面图。
图12是示出实施方式1的细胞外电位测量用装置的制造方法的截面图。
图13是示出实施方式1的细胞外电位测量用装置的制造方法的放大截面图。
图14是示出实施方式1的细胞外电位测量用装置的制造方法的放大截面图。
图15是示出实施方式1的细胞外电位测量用装置的制造方法的放大截面图。
图16是示出实施方式1的细胞外电位测量用装置的制造方法的放大截面图。
图17是示出实施方式1的细胞外电位测量用装置的制造方法的放大截面图。
图18是示出实施方式1的细胞外电位测量用装置的制造方法的放大截面图。
图19是示出实施方式1的细胞外电位测量用装置的制造方法的放大截面图。
图20是示出实施方式1的细胞外电位测量用装置的其它制造方法的放大截面图。
图21是示出实施方式1的细胞外电位测量用装置的其它制造方法的放大截面图。
图22是示出实施方式1的细胞外电位测量用装置的其它制造方法的放大截面图。
图23是本发明实施方式2的细胞外电位测量用装置的立体图。
图24是实施方式2的细胞外电位测量用装置的截面图。
图25是实施方式2的细胞外电位测量用装置的放大截面图。
图26是示出实施方式2的细胞外电位测量用装置的制造方法的截面图。
图27是示出实施方式2的细胞外电位测量用装置的制造方法的放大截面图。
图28是示出实施方式2的细胞外电位测量用装置的制造方法的放大截面图。
图29是实施方式1的其它细胞外电位测量装置的截面图。
图30是本发明的实施方式3的细胞外电位测量装置的立体图。
图31A是实施方式3的细胞外电位测量装置的截面图。
图31B是实施方式3的细胞外电位测量装置的放大截面图。
图32是示出实施方式3的细胞外电位测量装置的动作的截面图。
图33是实施方式3的细胞外电位测量装置的放大截面图。
图34是实施方式3的细胞外电位测量装置的放大截面图。
图35是示出实施方式3的细胞外电位测量装置的制造方法的截面图。
图36是示出实施方式3的细胞外电位测量装置的制造方法的放大截面图。
图37是示出实施方式3的细胞外电位测量装置的制造方法的放大截面图。
图38是示出实施方式3的细胞外电位测量装置的制造方法的截面图。
图39是示出实施方式3的细胞外电位测量装置的制造方法的截面图。
图40是示出实施方式3的细胞外电位测量装置的制造方法的截面图。
图41是示出实施方式3的细胞外电位测量装置的制造方法的截面图。
图42是示出实施方式3的细胞外电位测量装置的制造方法的截面图。
图43是本发明的实施方式4的细胞外电位测量装置的截面图。
图44是示出实施方式4的细胞外电位测量装置制造方法的放大截面图。
图45是示出实施方式4的细胞外电位测量装置制造方法的放大截面图。
图46是示出本发明的实施方式5的细胞外电位测量装置制造方法的放大截面图。
图47是示出本发明的实施方式5的细胞外电位测量装置制造方法的放大截面图。
图48是示出本发明的实施方式5的细胞外电位测量装置制造方法的放大截面图。
具体实施方式
(实施方式1)
图1是本发明实施方式1的细胞外电位测定装置的立体图，图2是其截面图，图3是其截面放大图。
该细胞外电位测量装置包含设置凹槽2的、由硅构成的基板1。在凹槽2的底面3上设置多个细胞捕集孔101，各捕集孔101通过在一直线上按顺序连接的第1开口部4、空洞部6、第2开口部5构成。第1开口部4的直径比空洞部6的最大直径小，比第2开口部5的直径大。
这些具体的尺寸根据被检体细胞的大小最适合地决定。例如，在25微米直径的被检体细胞中，第1开口部4的直径为比25微米小的20微米，空洞部6的最大直径为比被检体细胞大的35微米，第2开口部5的直径设定在比被检体细胞小的10微米左右。通常，因为被检体细胞直径为数微米～数十微米，所以第1开口部4的直径取10～50微米，第2开口部5的直径取1～5微米左右，根据这些，希望空洞部6的最大直径在10～100微米之间作为最佳值。
如图3所示，在至少第2开口部5的内壁面和空洞部6的下方形成由金属构成的检测电极7。在基板1的下面设置由金属构成的引出电极8。检测电极7和引出电极8在第2开口部5上电连接。因为在空洞部6的上方没有设置导体，所以检测电极7与凹槽2电绝缘。
下面对该细胞外电位测量用装置的使用方法加以说明。图4是把被检体细胞9和培养液10投入凹槽2内的细胞外电位测定用装置的截面图。图5～图9是第1开口部4、第2开口部5、空洞部6的放大截面图。
如图4及图5所示，在把培养液10和被检体细胞9放入凹槽2内的当初，被检体细胞9浮游在培养液10中。培养液10不仅在凹槽2内，而且在第1开口部4、空洞部6、第2开口部5满了之后，也流出到第2开口部5侧。在该状态下，浮游的被检体细胞9通过凹槽2内培养液10的压力，如图6所示地被引入到第1开口部4。在压力小时，如果通过吸引泵等机构从第2开口部5侧吸引培养液10，则浮游的被检体细胞9被更加可靠地吸引到第1开口部4侧。
因为第1开口部4的直径设计得比被检体细胞9的直径小，所以如7图所示被检体细胞9通过第1开口部4时受到阻力。可是因为受到压力或引力产生的力，被检体细胞9变形，可以到达空洞部6。如图8所示，到达空洞部6内的被检体细胞9即使停止吸引，也从凹槽侧2接受培养液10的压力。而且细胞9也比第1开口部4的直径大，第1开口部4大体是垂直的，只要没有从凹槽2侧来的吸引力等的外力，就不能简单地返回到凹槽2内，而是保持在空洞部6内。
如图所示地把空洞部6的形状作成横径比纵径大的椭圆形状，如果纵径作得比被检体细胞9小，则被检体细胞9可靠地保持在空洞部6内。在这样的状态下，如果把药剂10(未图示)投入到凹槽2的培养液10内，则药剂浸透到培养液10内。如图9所示，被检体细胞被药剂活性化，在第2开口部5产生的电信号改变充满第2开口部5的培养液10的电位。该电位变化通过与培养液10连接的检测电极7以及引出电极8检出。
这样一来，在实施方式1的细胞外电位测量用装置中，检测电极7与凹槽2电绝缘，在量测之际，被检体细胞9可靠地保持在空洞部6内。即：因为第2开口部5侧的培养液10和凹槽2侧的培养液10之间电绝缘，所以由细胞活动产生的电信号不会泄漏至凹槽2侧的培养液10内，通过在第2开口部5侧设置的检测电极7检出。
如果被检体细胞保持在任一细胞捕集孔内，则细胞外电位的测量成为可能。
第1开口部4也可以如图29所示，朝向凹槽2孔径变宽的锥形。这时，被检体细胞9可以容易地从凹槽2侧进入。如果使第1开口部4的空洞部6侧的直径比空洞部6的最大直径小，则防止了被检体细胞9返回到凹槽2侧。据此，因为进入空洞部6的被检体细胞9保持不返回凹槽2，所以得到更高细胞保持率的细胞外电位测量装置。这时，按照从大到小的顺序，空洞部6的直径比第1开口部4在空洞部侧的直径大，第1开口部4在空洞部侧的直径比第2开口部5的直径大。
通过圆锥状的第1开口部4在凹槽侧的直径比被检体细胞直径的2倍小，则可以防止多个细胞从凹槽同时进入，在第1开口部内部堵塞的情况。
在实施方式1的细胞外电位测量装置中，被检体细胞9一旦进入细胞捕集孔101中，则不能返回凹槽2侧。因而，如果进行被检体细胞9的测量，则会污染凹槽2以及细胞捕集孔101内部。因此，由于装置不被再利用而被抛弃，所以没必要取出被检体细胞9。
其次，对实施方式1的细胞外电位测量用装置的制造顺序加以说明。图10～图19是用于说明该顺序的细胞外电位测量用装置的截面图。
首先，如图10所示，在硅基板1上通过光刻形成有用于形成凹槽2的抗蚀剂掩模11，其次如图11所示，通过湿蚀刻或干蚀刻来蚀刻基板1直到预定深度，形成凹槽2。在湿蚀刻中使用KOH或氢氧化四甲铵液(TMAH)等蚀刻液，在干蚀刻中使用SF6、CF4等的蚀刻气体。
其次，如图12所示，分别在凹槽2的底面以及硅基板1的下面形成用于形成第1开口部4的抗蚀剂掩模12和用于形成第2开口部的抗蚀剂掩模13。根据被检体细胞9的大小决定第1开口部4和第2开口部5的大小。第1开口部4的直径比第2开口部5的直径大。
其次，如图13所示，从凹槽2侧对基板1进行蚀刻直到预定深度为止，形成第1开口部4。这时希望蚀刻用干蚀刻，而且作为蚀刻的气体用促进蚀刻的气体和抑制蚀刻的气体。在促进蚀刻的气体中用SF6、CF4等，然而这不仅在深度方向促进硅的蚀刻，而且也向横向促进。因此，混入抑制蚀刻的CHF3，C4F8等的气体在开口部壁面上形成CF2聚合物的保护膜，所以可只在蚀刻掩膜的下方进行蚀刻。
在垂直方向进一步促进蚀刻的情况下，通过促进蚀刻的气体对基板稍微蚀刻后，重复通过抑制蚀刻的气体形成保护膜的工序，得到大体垂直的开口部形状。在实验中为了形成大小为20微米的第1开口部4，流过130sccm的SF6，13秒间产生等离子体，对基板进行约1微米蚀刻，其后，流过85sccm的C4F8，7秒间产生等离子体，形成厚度约0.01微米的保护膜。约60次重复该蚀刻和保护膜的形成，得到60微米深度的大体垂直的开口部。
通过抑制蚀刻的气体，保护膜不仅在第1开口部40的壁面形成，而且也在底面形成。因为在底面形成的保护膜与在壁面形成的保护膜相比，容易通过促进蚀刻的气体除去，所以只在下方进行蚀刻。
通过抑制蚀刻的气体形成保护膜，如果形成该开口部4的工序结束，则在第1开口部4的壁面上可靠地形成保护膜。因而，在后续工序即使在形成空洞部6之际也不侵害第1开口部4的壁面。
其次，如图14所示，为了从基板1的下面侧形成第2开口部5；而对基板1蚀刻。与第1开口部4同样，交替地切换促进蚀刻的气体和抑制蚀刻的气体，对基板1进行蚀刻，使其壁面大体垂直地形成。
此外，与第1开口部4同样，通过抑制蚀刻的气体形成保护膜，结束形成第2开口部5的工序。据此，因为在第2开口部5的壁面也可靠地形成保护膜，所以在后续工序形成空洞部6之际，不侵害第2开口部5的壁面。
其次，如图15所示，只用促进蚀刻的气体，从第1开口部4侧对基板1进行蚀刻。因为在刚才的工序中，在第1开口部4的壁面上形成保护膜，所以为了壁面不受蚀刻侵害，在下方进行蚀刻，然而因为在新蚀刻的部分上不形成保护膜，所以在横方向也进行蚀刻，结果如图15所示，在第1开口部4和第2开口部5之间形成比第1开口部4更宽阔的空洞部6。其际，通过只对基板1蚀刻合适的量，空洞部6的形状成为横径大的椭圆形状。
因为即使在第2开口部5侧上贯通后在开口部5的壁面上也形成保护膜，所以空洞部6的大小直到成为所希望的大小为止，即使接着蚀刻一会儿也不会侵蚀第2开口部5的壁面。一旦过度地继续蚀刻，则空洞部6不仅在横方向，而且如图15的虚线所示地成为向整体扩展的形状，所以有必要适时地终止蚀刻。
在该工序中促进蚀刻的气体用SF6，CF4，然而希望用XeF2。因为XeF2几乎不蚀刻保护膜，所以可以几乎不侵害壁面地形成空洞部6。但是，因为该气体对前工序形成的开口部底面的保护膜的蚀刻速度也慢，所以为了回避这一点，在用XeF2蚀刻前，用SF6，CF4，Ar气等可以只蚀刻底面的保护膜。
在实施方式1中，按照第1开口部4，第2开口部5，空洞部6的顺序形成，然而也可以按照第2开口部5，第1开口部4，空洞部6的顺序形成，或者也可以按照第1开口部4，空洞部6，第2开口部5的顺序形成。此外，空洞部6可以从第2开口部5侧蚀刻，然而在这种情况下有必要注意蚀刻量，以便空洞部6变得比第1开口部4更大。
其次，如图16所示，在除去所有的抗蚀剂掩模之后，通过蒸发法附着从第1开口部4侧通过靶放出的金属粒子14形成检测电极7。因为由靶放出的金属粒子14直行，所以通过第1开口部4，如图17所示，只蒸发到第1开口部4的内壁，空洞部6下方以及第2开口部5的内壁。即，检测电极7只在第2开口部5的内壁和空洞部6的下方形成。
其次，如图18所示，通过蒸发法形成从第2开口部5侧由金属形成的引出电极8。因为第2开口部5的直径比第1开口部4小，所以通过金属粒子15直行，同样地只在第2开口部5的内壁和第1开口部4的内壁一部分上附着金属。如图19所示，在空洞部6的下方和第2开口部5上形成的检测电极7和在第1开口部4的内壁上形成的金属之间电绝缘。为了使金属可靠地附着在基板1上，在基板1上作为缓冲层形成铬、钛，其上也可以附着金属。在防止金属向凹槽2底面蒸发时，在除去用于形成第1开口部4而设置的抗蚀剂掩模11之前蒸发金属。据此，在除去抗蚀剂掩模11后，金属不在凹槽2的底部上形成。在这里，通过蒸发法附着金属，然而即使通过溅射法也同样地附着金属。
细胞捕集孔在第2开口部的壁面上形成的导体在凹槽下面互相短路。据此，在细胞捕集孔中保持各被检体细胞的情况下，这些被检体细胞外电位的变化并列连接、一个一个的被检体细胞的电位变化至少可以可靠地检出电位。
如上述所示，根据实施方式1的制造方法，在由硅构成的基板1上具有凹槽2、凹槽2内的第1开口部4、第2开口部5以及空洞部6，得到可以可靠地保持在空洞部6内的可靠性高的细胞外电位量测用装置。
在实施方式1中，基板1由硅构成，然而实施方式1的方法适用于干蚀刻是可能的，通过气体转换可以实现直进性蚀刻和横向蚀刻的材料。例如玻璃或石英通过SF6，CF4等气体使深度方向的蚀刻是可能的，通过HF气体，使横方向蚀刻是可能的。
在实施方式1，第1开口部4是与凹槽2底面大体垂直的孔。在使第1开口部4形成在凹槽2侧一方的直径比空洞部6侧一方的直径大的圆锥形的情况下，在对第1开口部4进行蚀刻中，通过抑制蚀刻的气体和促进蚀刻的气体混合气体，蚀刻从凹槽2进入空洞部6，由此减少促进蚀刻的气体比例。据此，如图20所示，第1开口部4的壁面成为锥形，如图21所示，被检体细胞9容易进入，进入空洞部6的被检体细胞9难以返回到凹槽2侧。
为了能够使第1开口部4的壁面成为锥形，另外也可以只用促进蚀刻的气体蚀刻基板1。因为这种情况如图22所示，凹槽2侧的第1开口部4的直径比通过抗蚀剂掩模12作成的直径宽，所以有必要预先决定抗蚀剂掩模12的大小，以得到最适合的锥形。
在实施方式1，阐述了有关开口部4、7的直径和空洞部6的直径之间关系。如图3所示，开口部4和空洞部6的交界的连接部102的直径比空洞部6的最大直径小，而且如果开口部7和空洞部6交界的连接部103的直径比连接部102直径小，则可以得到与实施方式1同样的效果。
(实施方式2)
图23是本发明的实施方式2的细胞外电位测量用装置的立体图，图24是其截面图，图25是其放大截面图。与实施方式1不同，基板16是第1硅层17和二氧化硅层18以及第2硅层19的叠层体。第1开口部21在硅层17上形成，第2开口部22在第2硅层19上形成，空洞部23在二氧化硅层18上形成。
检测电极24只在第2开口部22的内壁和空洞部23下方形成，引出电极25在基板16下面形成。检测电极24和引出电极25在第2开口部22附近电连接。
因为该细胞外电位测量装置的动作与实施方式1的测量装置是相同的，省略其说明。在第1硅层17和第2硅层19之间的二氧化硅层18提高硅层17，19之间的电绝缘，据此，通过在第2开口部22侧发生的细胞活动产生的电信号不泄露到第1开口部21侧，通过检测电极24，可以可靠地进行检测。
其次，说明用于制造实施方式2的细胞外电位量测用装置的顺序。与实施方式1工序相同，省略其说明，只说明形成第1开口部21，第2开口部22，空洞部23的工序。此外，基板材料接照硅层、二氧化硅层、硅层的顺序叠层，然而作为SOI基板通常是购买的，不特别加以说明。
首先，在第1硅层17上形成凹槽20之后，如图26所示，形成用于形成第1开口部21，第2开口部22的抗蚀剂掩模26，27。其次，如图27所示，对层17，19蚀刻直到二氧化硅层18为止，以便通过从凹槽20的底面及下面侧进行干蚀刻，使得壁面与凹槽20的底面垂直。这时，与实施方式1同样，用促进蚀刻的气体和抑制蚀刻的气体对基板蚀刻。通过二氧化硅层18形成第1开口部21和第2开口部22时，也可以对层17，19进行蚀刻直到到达二氧化硅层18为止。因而，没有必要管理蚀刻直到预定深度那样的时间。
其次，如果基板在HF溶液内浸泡，则因为HF溶液并不那样多地蚀刻硅层17，19，只蚀刻二氧化硅层18，所以如图28所示地形成空洞部23。这时蚀刻时间也可以蚀刻二氧化硅层18，直到空洞部23具有必要的横向直径为止。其后，与实施方式1同样，形成检测电极24和引出电极25。二氧化硅18也可以用HF气通过等离子体进行蚀刻。HF气体与HF溶液同样，不多蚀刻硅层，可以只蚀刻二氧化硅层18。因而可以防止向实施方式1那样，如果过度持久地蚀刻基板，则空洞部不成为椭圆形的情况。
如以上所示，因为在叠层硅和二氧化硅两种层的基板16上，预先决定第2开口部22的深度和空洞部23的高度，所以可以容易地制造量测装置。此外，因为第1开口部21和第2开口部22通过二氧化硅层18完全电分离，所以可以得到可靠性更高的细胞电位量测用装置。
在实施方式2，基板16具有第1硅层17，二氧化硅层18，第2硅层19的3层结构，然而，例如基板也可以具有例如硅层，二氧化硅层，硅层，二氧化硅层的4层结构或4层以上的层。
基板16按照硅层、二氧化硅层，硅层的顺序叠层，然而，即使按照二氧化硅层、硅层、二氧化硅层的顺序进行叠层的基板，也可以制造测量装置。此外，基板16的材料，除了硅和二氧化硅的组合之外，可以用硅和玻璃，铝和氧化铝，玻璃和树脂等多种组合。基板16不仅用2种材料，也可以用3种材料，即使各层完全不同也可以得到同样的效果。
与实施方式1同样，可以使第1开口部21的壁面形成锥形，然而，因为效果、方法与在实施方式1所述的相同，所以省略其说明。
与实施方式1同样，如图3所示，第1开口部和空洞部之间的交界的连接部直径比空洞部最大直径小，而且如果第2开口部和空洞部之间交界的连接部直径比第1开口部和空洞部之间的交界的连接部直径小，则可以得到与实施方式2同样的效果。
(实施方式3)
图30是本发明实施方式3的细胞外电位测量装置的立体图，图31A，图31B以及图32是其截面图。此外，图33～图34是测量装置的放大截面图。图35～图42是用于说明测量装置制造方法的截面图。
在图30～图32，基板28通过由硅构成的基底29，由二氧化硅构成的中间层30以及由硅构成的薄板31的叠层构造构成。在基底29上储存包含被检体细胞的样品，设置用于混合被检体细胞37、该培养液38和药剂的凹槽32，此外，在形成凹槽32的底部的薄板31上设置贯通孔33。在贯通孔33的凹槽32侧设置凹坑34，凹槽32侧的开口部直径比基板28下面开口部直径大。
贯通口33，凹坑34的直径可以由被检体细胞37的大小·性质决定。例如如果被检体细胞37的大小成为10微米，则希望凹坑34的直径取10微米以上，20微米以下，贯通孔33的直径取5微米以下。
在实施方式3，凹坑34的内壁部作成以凹槽32侧为底面的圆锥形。
其次，至少凹槽32的内壁以及底面，贯通口33的内壁以及凹坑34的内壁、薄板31的下面设置由二氧化硅构成的绝缘体36。在贯通口32的内壁、薄板31的外侧上，在绝缘体36上设置以金属为主体的检测电极35。
因为通常细胞的直径为5～20微米，所以凹坑34的开口部直径优选取10～100微米，贯通口33的开口部直径优选取1～10微米的范围。
上述所示的细胞外电位测量装置通过如下所示动作可以测量细胞外电位或细胞产生的物理化学变化。用附图说明该动作。
图32是在细胞外电位测量装置内投入被检体细胞37和培养液38的凹槽32的截面图。图33～图34是贯通孔33以及凹槽34的主要部分的放大截面图。
如图32所示，如果在凹槽32内放入培养液38和被检体细胞37，则不久被检体细胞37在培养液38中浮游。此外，培养液38不仅在凹槽32内，而且在凹坑34，贯通口33填满之后，也在凹槽32的下面侧流出。通过该流动，浮游的被检体细胞37通过凹槽32内培养液38的压力，如图33所示地引入到凹坑34。在引入压力小时，如果从贯通口33侧通过吸引泵等手段吸引培养液，则浮游的被检体细胞37可以更可靠地引入凹坑34一侧。
其次，因为到达凹坑34的被检体细胞37受到从贯通口33侧来的吸引或从凹槽32侧的培养液38的压力，所以如图33所示地保持在凹坑34内。在这样的状态下如果把药剂(未图示)投入到凹槽32的培养液38内，药剂浸透到培养液38内。如图34所示地，在被检体细胞37通过与药剂进行离子交换产生反应活性化的情况下，在贯通口33内产生的电信号使充满贯通口33的培养液38的电位改变。该电位变化通过与培养液38连接的检测电极35检测。
这样一来，在实施方式3的细胞外电位测量装置中，通过在凹槽32的底面设置的凹坑34，不必设置其他的凹槽，可以在凹槽32内直接混合被检体细胞37和培养液38以及药剂。因为凹槽32和底面上设置的凹坑34以及贯通口33一体化，所以培养液可靠地流入到贯通口33侧，而不会不小心地泄漏到凹槽32外。
此外，通过在凹坑34内壁、贯通口33内壁、薄板31下面，凹槽32底面以及内壁上设置的由二氧化硅构成的绝缘体36，检测电极35与凹槽32侧电绝缘。此外，因为凹坑34内壁作成以凹槽32侧为底面的圆锥形，所以被检体细胞37不滞留地引入贯通口33侧，可以稳定地保持6。例如，在10微米直径的被检体细胞37中，通过凹坑34的凹槽侧直径，即圆锥形底面直径取20微米以下，使2个以上的被检体细胞37同时进入凹坑34之中。通过取贯通孔33直径在5微米以下，被检体细胞37不能穿过贯通口33。
这样一来，在量测之际，被检体细胞37可以可靠地保持在凹坑34内。使贯通口33侧的培养液38和凹槽32侧的培养液38电绝缘。通过被检体细胞37的活动产生的电信号不泄露到凹槽32侧的培养液38内，可以通过贯通口33侧设置的检测电极35检测。绝缘层36仅在硅表层的表面电阻率低，或者由于在贯通口33附近产生的信号微小，不能测定在凹槽32侧电信号微量泄露的情况下才是必要的。
因而，如果硅本身的表面电阻率足够高，则只通过保持被检体细胞37就能够确保足够的电绝缘，因此，如微量的信号泄露没有影响，则在细胞外电位大的情况下，绝缘体36不一定必要。
其次，用图35～图42说明实施方式3的细胞外电位量测装置的制造方法。
首先，如图35所示准备好基板28，其由硅构成的基底29、由二氧化硅构成的中间层30和由硅构成的薄板31构成，在薄板31侧形成抗蚀剂掩模39。基板28也如实施方式2所述地称为SOI基板，在制作半导体器件之际很好用，容易购得，所以关于该基板的制法，省略其说明。
其次，通过干蚀刻形成贯通口33直到薄板31预定深度为止。图36是图35的A部的主要部分放大图。这时的蚀刻法合适干蚀刻，与实施方式1同样地，在干蚀刻之际，用促进蚀刻的气体和抑制蚀刻的气体是重要的。与实施方式1同样地，如果用这些气体，则通过这些气体各自的作用，如图36所示地，使通过干蚀刻只在抗蚀剂掩模39下方形成贯通孔33成为可能。
在通过抑制蚀刻的气体和促进蚀刻的气体相互地对基板蚀刻的方法中，在实施方式3，通过促进蚀刻的气体进行干蚀刻之际，通过外部线圈以电感耦合法在基板28上施加高频对基板进行蚀刻。据此，在基板28上产生负偏置电压，因为作为等离子体中的正离子的SF5 +或CF3 +指向基板28进行碰撞，所以基板28在与底面垂直方向干蚀刻。
如果为了抑制干蚀刻，不在基板28上施加高频，则因为在基板28上全不产生偏置电压，所以成为保护膜材料的CF+不偏向，所以可以对基板28的孔壁面形成均匀的保护膜。
即使在实施方式1及2的方法中，由于作成开口部与基板底面垂直，所以上述方法也是有效的。
其次，如图37所示，通过干蚀刻对薄板31干蚀刻直到中间层30为止。在本工序，使薄板31朝向凹槽32的底面进行干蚀刻之际，随着蚀刻的进行，促进蚀刻的气体比例逐渐地增加，或者通过促进蚀刻的气体的蚀刻时间逐渐增加。即，在反复进行促进蚀刻的工序和抑制干蚀刻的工序的过程中，随着干蚀刻的进行，促进干蚀刻的工序比例逐渐增加。
据此，如图37所示，得到使凹槽32侧变宽那样的锥形，贯通口33形成凹槽32侧的开口部一侧比薄板31的下面侧的开口部更大的凹坑34。
在该干蚀刻工序中，通过由二氧化硅形成的中间层30，结束贯通口33的干蚀刻，到达中间层30时，即使不立刻中止干蚀刻也无碍。这与实施方式2同样地是由于干蚀刻气体不会立即对中间层30进行蚀刻之故。
尤其是在促进蚀刻气体用SF6的情况下，因为该蚀刻气体对硅和二氧化硅的蚀刻率之比在10以上，贯通口33的干蚀刻在进行到二氧化硅之后，即使再蚀刻一会儿也不会简单地除去二氧化硅中间层30。因而，可以容易地以高精度形成的凹坑34。
其次，如图38所示，在基底29侧通过光刻形成抗蚀剂掩模40之后，如图39所示，通过对基底29蚀刻直到中间层30为止，形成凹槽32。为了高密度配置凹槽5，作为这时的蚀刻方法，用前述所示的促进蚀刻的气体和抑制蚀刻的气体的干蚀刻是有利的，然而如果没有必要如此高密度地配置，则通过用TMAH或KOH的湿刻蚀也是可能的。
其次，如图40所示，通过HF的湿蚀刻或通过CF4气体的干蚀刻除去在凹槽32底面上露出的二氧化硅中间层30。
其后，如图41所示，在除去抗蚀剂掩模40之后，通过热氧化法在构成基底29以及薄板31的硅基板表面上形成二氧化硅。据此，在凹槽32内壁及底面，凹坑34的内壁，贯通口33的内壁，薄板31的下面形成二氧化硅的绝缘层36。
其次，如图42所示，从薄板31的下面侧通过蒸发金属或通过溅射法形成检测电极35。据此，检测电极35不仅在薄板31的下面，而且也与实施方式1所述同样地在贯通口33的内壁形成。检测电极35由与培养液38不反应的材料形成，然而尤其是用金属、铂、银、氯化银、铝等则更好。用怎样的材料根据试样溶液的种类合适地选择。
这样一来，通过实施方式3的制造方法，具有在薄板31上形成的贯通孔33和在凹槽34侧与其连接的圆锥形凹槽34的细胞外电位量测装置可以通过一次蚀刻容易且高精度地形成。
在实施方式3的制造方法中，不必在两种掩模上通过光刻从凹槽侧加工基板。即使在设置有凹槽的基板那样具有凸凹的基板上，也不需要在凸凹面上均匀地涂抗蚀剂的喷涂装置或者可以使光掩模和基板非接触地以高精度图形进行曝光的投影或逐次移动式曝光装置等高价装置，而以极高精度在凹槽底面上设置贯通口和凹坑。
(实施方式4)
图43是本发明的实施方式4的细胞外电位置测装置的截面图，图44及图45是其主要部分的放大截面图。
实施方式4的测量装置与实施方式3的测量装置基本构成是相同的，因而省略其相同构成的说明。
图43是实施方式4的细胞外电位测量装置的截面图，薄板44上形成的凹坑47的形态如图43所示，为半球形。因为通过半球形的凹坑47，被检体细胞37更加贴紧，可以保持在凹坑47内，所以可以更加容易地检测贯通口46的培养液38的电位变化。
其次，说明该细胞外电位量测装置的制造方法。
实施方式4的细胞外电位测量装置的制造方法是与实施方式3的制造方法大体相同，只是形成薄板44上的贯通口46以及凹坑47的方法不同。用附图对该不同的方法加以说明。
如图44所示，在中间层43和薄板44的叠层状态下，在薄板侧形成抗蚀剂掩模50。其后，为了形成贯通口46通过促进蚀刻气体和抑制蚀刻的气体对薄板44干蚀刻直到预定深度为止。该预定深度指的是贯通口未到达由二氧化硅构成的中间层43的深度，根据凹坑47的尺寸形状可以适当选择最佳深度。
在该蚀刻之际，通过促进蚀刻的气体对薄板44进行蚀刻后，通过抑制蚀刻的气体形成保护膜(未图示)。通过重复这些工序的干蚀刻，可以只对抗蚀剂掩模50的开口部在垂直方向上对薄板44进行蚀刻。而且该工序，通过用促进蚀刻的气体对薄板进行蚀刻后结束。这是由于通过抑制蚀刻的气体形成的保护膜从蚀刻的底面除去的缘故。
其次，如图45所示，通过XeF2气体的干蚀刻形成凹坑47。据此，干蚀刻从露出硅的底面进展，随着蚀刻向凹槽45侧进行，侵蚀部分展宽。
因为在贯通口46的侧壁上形成通过由前一工序抑制蚀刻的气体形成的保护膜(未图示)，所以贯通口46的侧壁并不通过XeF2蚀刻。这样一来，凹坑47可以如图45所示地形成半球形的形状。
其后，与实施方式3相同地，经图38～图42所示的工序，可以制作细胞外电位测量装置。
(实施方式5)
在实施方式5，对形成实施方式3，实施方式4的贯通口33，46和凹坑34，47的其他的制造方法加以说明。
因为在薄板上形成贯通口的方法是与实施方式3及4的方法不同，所以用附图对该方法加以说明。
图46是示出本发明实施方式5的细胞外电位量测装置的制造工序的截面图。对由二氧化硅构成的中间层51和由硅形成的薄板52进行叠层，在薄板52侧形成抗蚀剂掩模53之后，通过用促进蚀刻的气体和抑制蚀刻的气体的干蚀刻形成贯通口56。对薄板44进行蚀刻直到贯通口56达到中间层51为止。
而且在贯通口56达到中间层51后也还要继续蚀刻。中间层51是绝缘体，由硅等构成的薄板52的电阻比中间层51低。因而，一旦过度继续蚀刻，则在中间层51的面上通过促进蚀刻的气体干蚀刻之际，如图47所示地滞留SF5 +等的蚀刻离子54，从等离子体中供给的蚀刻离子55向图47所示的箭头方向弹开。
其结果，干蚀刻集中于中间层51的侧壁附近，如图48所示，贯通口56的凹槽侧可以形成扩展的凹坑57。
在实验中，直径3微米的贯通口56到达中间层51之后也还对薄板44进行干蚀刻，由此可以形成最大直径10微米的凹坑57。
工业上利用的可能性
在本发明的测量细胞外电位的装置中，被检体细胞是可能进入空洞部内的，在进入后可以把被检体细胞封闭在空洞部之中。因而，该装置可以可靠地检测由细胞活动产生的电信号。

Claims (46)

1.一种用于测量被检体细胞的细胞外电位装置，其特征在于，具备在第1面上形成有底面的凹槽且形成有第1捕集孔的基板，该第1捕集孔具有向着第2面从所述凹槽的所述底面形成的第1开口部；通过第1连接部与所述第1开口部连接的第1空洞部；通过第2连接部与所述第1空洞部连接的、到达所述第2面的第2开口部，
所述第1连接部的直径比所述第1空洞部的最大直径小，比所述第2连接部的直径大，而且比所述被检体细胞的直径小。
2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述第1开口部和所述第2开口部在一直线上配置。
3.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述基板包含硅。
4.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述基板具备由蚀刻率不同的材料形成的、叠层的第1层和第2层。
5.根据权利要求4所述的装置，其特征在于，所述第1层包含硅，所述第2层包括含有二氧化硅的玻璃。
6.根据权利要求4所述的装置，其特征在于，所述第1和第2开口部中的一个在所述第1层上形成，所述第1空洞部在所述第2层上形成。
7.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，还包含形成在所述第2开口部的壁面和与所述第2连接部连接的所述第1空洞部的壁面的一部分上、不到达所述第1连接部的第1导体层。
8.根据权利要求7所述的装置，其特征在于，所述第1导体层不到达所述第1连接部。
9.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述第1开口部从所述第1连接部向着所述凹槽，内径变大。
10.根据权利要求9所述的装置，其特征在于，所述第1开口部在所述凹槽的所述底面上的开口直径比所述被检体细胞的所述直径的两倍小。
11.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述第1空洞部具有与所述第1直径成直角方向的第2直径比连接所述第1和第2连接部的方向的第1直径大的形状，而且，所述第1直径比所述被检体细胞的所述直径小。
12.根据权利要求11所述的装置，其特征在于，所述第1连接部的所述直径为10～50微米，所述第2连接部的所述直径为1～5微米，所述第1空洞部的所述第2直径为10～100微米，所述第1空洞部的所述第1直径为50微米以下。
13.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述基板形成第2捕集孔，该第2捕集孔具有向着所述基板的所述第2面，从所述凹槽的所述底面形成的第3开口部、通过第3连接部与所述第3开口部连接的第2空洞部、通过第4连接部与所述第2空洞部连接的、到达所述基板的所述第2面的第4开口部，
所述第3连接部的直径比所述第2空洞部的最大直径小，比所述第3连接部的直径大，而且比所述被检体细胞的所述直径小。
14.根据权利要求13所述的装置，其特征在于，还包含形成在所述第4开口部的壁面和与所述第4连接部连接的所述第2空洞部的壁面的一部分上、不到达所述第3连接部的第2导体层。
15.根据权利要求14所述的装置，其特征在于，还包含连接所述第1和第2导电层的、在所述基板的所述第2面上设置的第3导体层。
16.一种测量被检体细胞的细胞外电位的装置的制造方法，其特征在于，包含如下工序：
在基板的第1面上形成具有底面的凹槽的工序；
在所述凹槽的所述底面上形成具有第1孔的第1掩模的工序；
通过所述第1掩模的所述第1孔，用抑制蚀刻的第1气体和促进蚀刻的第2气体，通过干蚀刻形成第1开口部的工序；
在所述基板的第2面上形成具有第2孔的第2掩模的工序；
通过所述第2掩模的所述第2孔，用所述第1气体和所述第2气体，通过干蚀刻形成与所述第1开口部连接的第2开口部的工序；以及
通过使用所述第2气体的蚀刻，在所述第1开口部和所述第2开口部的连接部上形成空洞部的工序。
17.根据权利要求16所述的制造方法，其特征在于，在形成所述第1开口部的工序之后，进行形成所述第2掩模的工序。
18.根据权利要求17所述的制造方法，其特征在于，形成所述空洞部的工序包含从所述形成的第2开口部、通过使用所述第2气体的蚀刻形成所述空洞部的工序。
19.根据权利要求16所述的制造方法，其特征在于，所述第2气体是SF6，CF4，XeF2中任一种气体或混合气体，所述第1气体是CHF3，C4F8的任一种气体或混合气体。
20.根据权利要求16所述的制造方法，其特征在于，形成所述第1开口部的工序包括：随着蚀刻从所述凹槽进到所述空洞部，而使得所述第1和第2气体的比例中，所述第2气体的比例降低的工序。
21.根据权利要求16所述的制造方法，其特征在于，形成所述第1开口部的工序包含通过交替使用所述第1气体和所述第2气体的干蚀刻，形成所述第1开口部的工序。
22.根据权利要求16所述的制造方法，其特征在于，形成所述第1开口部的工序在使用所述第1气体的干蚀刻中结束。
23.根据权利要求16所述的制造方法，其特征在于，形成所述第1开口部的工序包含：在所述第1开口部的壁面上形成通过所述第1气体进行干蚀刻中的生成物的工序。
24.根据权利要求16所述的制造方法，其特征在于，在形成所述第2开口部的工序后，进行形成所述第1掩模的工序。
25.根据权利要求24所述的制造方法，其特征在于，形成所述空洞部的工序包含从所述形成的第1开口部、通过使用所述第2气体的蚀刻形成所述空洞部的工序。
26.根据权利要求16所述的制造方法，其特征在于，还包含在所述空洞部的一部分和所述第2开口部上形成导体层的工序。
27.根据权利要求26所述的制造方法，其特征在于，形成所述导体层的工序包含从所述第1开口部使导体粒子进入，通过蒸发法或溅射法形成所述导体层的工序。
28.一种测量被检体细胞的细胞外电位的装置，其特征在于，具备基板，该基板具有基底、叠层在所述基底上且由不同于所述基底的材料构成的中间层、以及叠层在所述中间层上，由与所述基底相同的材料构成的薄板，
从所述基底开始，所述中间层具有从所述基底到达所述中间层而设置的具有底面的凹槽，
所述薄板具有通向所述凹槽和所述基板外方的贯通口。
29.根据权利要求28所述的装置，其特征在于，所述贯通口在所述凹槽侧具有凹坑，所述凹坑的开口部直径比所述贯通口的开口部直径大。
30.根据权利要求29所述的装置，其特征在于，所述凹坑的所述开口部的所述直径为10～100微米，所述贯通口的所述开口部的所述直径为1～10微米。
31.根据权利要求29所述的装置，其特征在于，所述凹坑的内壁为圆锥形。
32.根据权利要求29所述的装置，其特征在于，所述凹坑的内壁为半球形。
33.根据权利要求28所述的装置，其特征在于，所述中间层的电阻率比所述薄板的电阻率高。
34.根据权利要求28所述的装置，其特征在于，所述中间层和所述薄板由蚀刻率不同的材料构成。
35.根据权利要求28所述的装置，其特征在于，所述基底由硅构成，所述中间层由二氧化硅构成。
36.一种测量细胞外电位的装置的制造方法，其特征在于，包含以下工序：
准备基板的工序，该基板具有基底、层叠在所述基底上且由不同于所述基底的材料构成的中间层、层叠在所述中间层上且由与所述基底相同材料构成的薄板；
设置凹槽的工序，从而通过在所述基底上蚀刻而露出所述中间层的一部分；
通过使用所述掩模的干蚀刻设置直到所述中间层的贯通口的工序；
除去所述中间层的所述露出的一部分的工序；以及
从与所述中间层相反一侧，在所述贯通口的壁面上形成检测电极的工序。
37.根据权利要求36所述的制造方法，其特征在于，设置所述贯通口的工序包含：从与所述中间层相反一侧通过干蚀刻形成所述贯通口的工序。
38.根据权利要求36所述的制造方法，其特征在于，所述中间层由二氧化硅构成。
39.根据权利要求36所述的制造方法，其特征在于，设置所述贯通口的工序包含：通过使用抑制蚀刻的第1气体和促进蚀刻的第2气体的干蚀刻，设置所述贯通口的工序。
40.根据权利要求39所述的制造方法，其特征在于，设置所述贯通口的工序包含：随着蚀刻的进行，令使用所述第1气体的干蚀刻比使用所述第2气体的干蚀刻更长地进行的工序。
41.根据权利要求39所述的制造方法，其特征在于，设置所述贯通口的工序包含：通过交替地使用所述第1气体和所述第2气体的干蚀刻，设置所述贯通口的工序。
42.根据权利要求41所述的制造方法，其特征在于，设置所述贯通口的工序包含：使通过交替使用所述第1气体和所述第2气体的干蚀刻而设置所述贯通口的工序在所述贯通口到达所述中间层之前停止，然后，通过使用所述第1气体的干蚀刻，设置所述贯通口的工序。
43.根据权利要求39所述的细胞外电位测量装置的制造方法，其特征在于，设置所述贯通口的工序包含：在用所述第1气体进行干蚀刻时，在所述基板上施加高频的工序。
44.根据权利要求39所述的制造方法，其特征在于，还包含在所述贯通口到达所述中间层之后，再对所述薄板进行干蚀刻的工序。
45.根据权利要求39所述的制造方法，其特征在于，所述第1气体包含SF6，CF4，XeF2中至少一种气体。
46.根据权利要求39所述的制造方法，其特征在于，所述第2气体包含C4F8、CHF3中至少一种气体。
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