CN101983335A - 用于机械地变形细胞的装置和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于使细胞机械地变形的装置，其包括：用于在细胞保持区域中保持细胞(32)的细胞保持元件(33)，用于在所述被保持的细胞(32)上施加力的微致动器(31)，其中所述微致动器(31)可以以电、热、光或磁方式被致动并且其中所述微致动器(31)以未致动的状态或以致动的状态在所述细胞(32)上施加所述力，和用于以电、热、光或磁方式致动所述微致动器(31)的激励单元(35)。
Description
技术领域
本发明涉及机械地变形细胞的装置和相应方法。
背景技术
过去的十年已经观察到在研究细胞和亚细胞结构的生物化学和生物物理性能的变化如何产生影响以及被人疾病的发作和发展所影响方面的显著发展。尤其已经发现细胞的机械性能与很多疾病相关，包括癌症和冠状动脉疾病：在西方导致大量死亡的疾病。根据世界卫生组织的公开，在2005年在世界范围内760万人死于癌症，而在美国有800万人患有心肌梗塞。已经显示影响细胞的机械性能的其它疾病是疟疾、心肌病和肌营养不良症。
由疾病导致的机械性能的变化可能是显著的。癌细胞的弹性模量可能比健康细胞的弹性模量小一个数量级。
这表明细胞的机械性能(特别是它们的刚性(stiffness))实际上是很多疾病的发展和/或存在的敏感标志，即使是在初始阶段。通过测量细胞刚性，原理上可以检测单个恶性肿瘤细胞和癌症前期细胞-恶性转化的细胞更容易变形-并且这揭开了例如监控癌症从侵袭前到侵袭的发展的可能性。对于前面提及的其它疾病持有类似的观点。
目前使用数种途径来测量细胞的机械性能。这些技术中的一些探测细胞的局部变形性能，例如局部微吸管法、细胞压痕和原子力显微术，而其它的则探测整个细胞，例如全细胞微吸管法、磁性珠扭曲和细胞压缩测试。这些测量方法具有各种缺点。
首先，对于局部方法，响应可能显著依赖于精确的探测位置并因此显示出大的细胞间离散性。其次，大部分方法是冗长且非常耗时的并因此不适合用于快速临床诊断中。第三，其它方法具有对细胞强加破坏的固有风险(例如光学延伸器)，导致错误的测量结果。最后，在很多方法中不能在待测试的细胞周围产生合适的环境，导致人为的和不相关的结果。
发明内容
本发明的一个目标是提供用于机械变形细胞的装置和相应方法，其避免了上述缺点并且其优选允许监控单个细胞以及同时监控很多细胞的机械性能。
在本发明的第一方面中，提供了用于机械地变形(mechanically deforming)细胞的装置，包括
-用于在细胞保持区域中保持(holding)细胞的细胞保持元件，
-用于在所述被保持的细胞上施加力的微致动器(micro-actuator)，其中所述微致动器可以以电、热、光(photonically)或磁方式被致动并且其中所述微致动器以未致动的状态或以致动的状态在所述细胞上施加所述力，和
-用于以电、热、光或磁方式致动所述微致动器的激励单元(stimulation unit)。
在本发明的一个进一步的方面中，提供了相应的方法，包括以下步骤
-在细胞保持区域中保持细胞，和
-以电、热、光或磁方式致动微致动器以在所述被保持的细胞上施加力，其中所述微致动器可以以电、热、光或磁方式被致动并且其中所述微致动器以未致动的状态或以致动的状态在所述细胞上施加所述力。
本发明的优选实施方案在从属权利要求中限定。应该理解的是要求保护的装置和要求保护的方法具有类似的和/或相同的从属权利要求中所限定的优选实施方案。
本发明是基于以下思想：在一个(或多个)细胞保持位置中保持一个(或多个)细胞并且通过使用一个(或多个)微致动器通过施加机械力变形所述一个(或多个)细胞，例如来探测所述一个或多个细胞的机械性能。为此目的，可以使用不同类型的微致动器，例如聚合物致动器，其描述于WO 2006/087655A1和WO 2008/020374A2中用于在微流(micro-fluidic)装置中操控(传输、混合、引导)流体。
根据一个优选实施方案，所述微致动器具有条带形式，其在未致动的状态或致动的状态之一中是卷曲的并且在另一状态中是未卷曲的，如例如上述现有技术文献中所公开的那样。在一个实施方案中，当微致动器被从卷曲状态致动为展开状态时将力施加到细胞，而在另一个实施方案中当微致动器被从致动的(展开)状态释放到卷曲状态时将力施加到细胞。在进一步的实施方案中，也可以调节微致动器使得卷曲状态是致动的状态和展开状态是未致动的状态。
根据一个进一步的实施方案，微致动器包括双层(包含聚合物薄膜层特别是丙烯酸酯薄膜和导电薄膜层)，和激励单元包括激励电极和用于在所述激励电极和所述导电薄膜层之间施加电压的电压源。特别地，根据该实施方案使用WO 2008/020374A2中描述的聚合物MEMS(微电-机械系统)致动器(PMA)，其易于通过施加电压例如高AC电压来控制。
根据一个可选的实施方案，微致动器包含磁性材料和激励单元包含用于产生穿过所述细胞保持区域的磁场的磁场单元。在该实施方案中，微致动器优选包含复合结构，特别是具有分散的磁性颗粒的聚合物薄膜或非磁性和磁性薄膜的叠层。相对于电激励和检测，磁激励和检测的优点是磁场展示出较少的与装置中存在的生物材料的相互作用。因此，电化学作用例如电解被容易地避免并且检测较少地被背景噪声影响。
为了使得能够监控细胞的机械性能，邻近所述细胞保持区域提供传感元件，用于传感当通过所述微致动器将力施加到细胞时细胞的变形。因此，由通过微致动器施加的力引起的并且被细胞的刚性阻碍的细胞的变形(特别是其量、位置、持续时间等)被检测，允许得到关于细胞的重要信息。
根据一个优选的实施方案，所述传感元件是光学磁或电传感元件，尤其是照相机、GMR传感器或传感电极。因此对于检测变形存在不同的选择。光学传感的优点是直接的通常使用的细胞成像方式。电传感的优点是使得能够整合到装置中。
进一步的传感元件优选包括传感电极和用于测量所述传感电极和所述微致动器的所述导电薄膜层之间的电容的电容量测量元件。特别地在使用静电致动的实施方案中，电容量测量是优选的，电容量是传感电极和致动器电极(致动器的导电薄膜层)之间距离的量度。
本发明的所述装置和方法的一种进一步的应用是细胞的裂解(lysing)。为此目的，根据一个实施方案，激励单元被调整为施加激励信号，其如此之大以致于微致动器在细胞上施加了导致细胞裂解的力。这提供了裂解细胞的简单并且有效的可能选择。
为了避免细胞被由单个致动器施加力而从细胞保持位置推离，根据一个进一步的实施方案提出在细胞保持元件的不同侧设置两个或更多个微致动器来从不同方向在相同细胞上施加力。
在一个进一步的实施方案中，提供微致动器和相关细胞保持元件的阵列以同时变形许多细胞。以这种方式可以快速得到大量细胞的机械性能的统计资料。为此目的，可以使用如例如WO 2008/020374A2中描述的LTPS(低温多晶Si)平台，根据其所述以两维矩阵阵列设置许多微致动器。
优选地，本发明被用作微流体系并且包括微流腔室，所述微流腔室包括所述微致动器、所述细胞保持元件、所述激励单元和包含细胞的缓冲溶液，特别是糖溶液。这种微流体系概括地也描述于WO2006/087655A1和WO 2008/020374A2中。
附图说明
本发明的这些和其它方面从下文描述的实施方案将变得显而易见并且将参考下文描述的实施方案进行阐述。在后面的图中：
图1a-1e显示了根据本发明使用的微致动器的各种实施方案，
图2显示了根据本发明的装置的一个实施方案的一般布局，
图3a-3b显示了根据本发明的装置的第一实施方案，
图4a-4b显示了根据本发明的装置的第二实施方案，
图5显示了根据本发明的装置的第三实施方案，和
图6显示了微致动器阵列的一般布局。
具体实施方式
图1显示了微致动器的多个实施方案。图1a显示了微致动器1的双层复合结构，包括聚合物薄膜2(例如丙烯酸酯)和导电薄膜3(例如铬)。调整加工过程使得所述结构一端固定向上弯曲。当在导电薄膜3和电极4之间施加电压差时，静电力将把致动器1拉向基底6，所述电极4放置在致动器1下面并且通过另一绝缘层5(例如丙烯酸酯层)与导电薄膜3绝缘。结果，其将展开并且平铺在基底6上。当除去电压时，该板片将通过弹性回复返回其原始卷曲形状。致动效果是双稳态的，致动器尖端的位置是所施加的电压的函数。对于一个特定的PMA设计，“铺开”电压Vun是11V，“弹性回复”电压Ver是5V。取决于致动器1的尺寸和机械性能，这些值典型地可以在1V和100V之间调节。图1b显示了在这种情况下制备的实际结构的SEM图像，长度100μm，宽度20μm，厚度1μm。这样的致动器实施方案更详细地描述于WO 2008/020374A2中(参看图1)。
能够设想图1a和1b中示出的几何结构的很多替代方案。代替卷曲的条带，它们可以是直棒、圆柱杆等等。条带7，8的起始取向可以是与表面平行(条带7)或垂直(条带8)，如图1c中所示。
此外，可以使用不同于电场的“激励”来致动所述结构。在图1d中描绘了具有致动器尖端10的以磁方式激励的致动器9。该致动器尖端10由复合材料组成，其一种组分是磁性的。一个例子是具有分散的磁性颗粒的聚合物薄膜。所述磁性颗粒可以是顺磁性的或铁磁性的。另一个实例是由非磁性(例如聚合物)和磁性(例如镍)薄膜的叠层组成的结构。这样的磁性致动器可以通过由外部机构例如(组合的)线圈或由集成的电流线或线圈产生的磁场进行移动，如图1d中所示，其中电流线11在条带10附近引起磁场，其然后因为作用在其上的磁力移动。这样的致动器实施方案更详细地描述于WO 2006/087655A1中(参见图13)。
再其它的可能是响应于光或温度的致动器。通过变形响应于温度变化的几种聚合物材料是已知的。综述和一些背景技术可以在Broer等[Dirk J.Broer，Henk van Houten，Martin Ouwerkerk，Jaap M.J.den Toonder，Paul van der Sluis，Stephen I.Klink，Rifat A.M.Hikmet，Ruud Balkenende.Smart Materials.Chapter 4，True Visions：Tales on the Realization of Ambient Intelligence，Emile Aarts和JoséEncarnacao编辑Springer Verlag，2005.]中找到。例如，通过将LC(液晶)材料加入到弹性体网络中，可以制备这样的材料，其当加热经过特定的温度(向列各向同性温度)时在弹性体分子主链中发生转变并且改变长度。通过仔细控制加工条件[D.J.Broer等，接受等待发表，Adv.Funct.Mater.，(2005)]，可以在薄膜的厚度上实现LC分子的取向梯度，从而薄膜的一侧收缩而另一侧膨胀。这在特定温度产生薄膜的可逆卷起。图1e显示了这样的薄膜在不同温度的横截面照片。
光致动或光子寻址可以使用光敏材料实现，其含有生色团，导致光致变色现象。光致变色现象定义为化学物种在具有不同吸收谱的两种形式之间的可逆光转换。在光致异构期间，其它性能也可能变化，例如折射率、介电常数和几何结构。这些材料的特定的非限制性的例子包括偶氮苯类，螺苯并吡喃类，均二苯代乙烯类，α-肼叉基-β-酮酯类和肉桂酸酯类。
基于聚合物的致动器可以集成到微流体系中，例如覆盖阵列设置中的微流腔室或通道的底面。在静电、磁或温度致动的情形中，可以设计并且制造电极图案使得可以单独寻址微致动器或它们的组。
根据本发明的一个应用，单个微致动器或微致动器阵列被集成到微流体系中来测量生物细胞的机械性能，特别是刚性(例如用于诊断分析)。关键是在所述一个或多个微致动器上或在它们之间捕获/束缚细胞，通过致动所述一个或多个微致动器在所述细胞上施加力，和检测所述一个或多个微致动器的变形，其将被激励例如电场或磁场引起但是却被附着/接触细胞的刚性阻碍。根据本发明的装置的实施方案20的一般布局是如图2中所示。细胞21，悬浮在缓冲液体22中，通过供应管道23供应到诊断腔室24中。腔室24含有细胞捕获位点和相应的聚合物致动器(都未在图2中示出)。使用所示致动器细胞21被变形，而变形水平被传感。在这样的诊断腔室24中，使用微致动器的阵列可以同时检测很多细胞21。
下面，将展示并解释一些特定实施方案来更详细地说明本发明。
本发明的一个主要应用是细胞刚性测量，利用通过致动的微致动器造成的细胞挤压。用于这种应用的装置30的第一实施方案示于图3中。该实施方案包括两个用于分别变形单个细胞32的微致动器31，所述细胞通过细胞保持元件33保持在细胞保持位置。在细胞保持元件33下面，提供传感单元34例如传感电极34来测量其上面的细胞32的变形(当通过相应的微致动器31向细胞32施加力时)。此外，在各个微致动器31下面提供致动电极35，其通过绝缘层36与(导电)微致动器31绝缘。所有的元件都提供在基底37上面。
微致动器31与图1a，1b中示出的那些类似。它们可以是静电致动的或磁致动的结构。在图3a中示出的未致动状态，它们卷曲离开(向上)基底37。细胞32被细胞保持元件在细胞粘附点之上在致动器31之间被捕获，所述细胞保持元件例如由细胞粘附蛋白质(整合素)形成。或者，可以在细胞保持位置放置组织粘合剂例如BD Cell-TakTM作为细胞保持元件33。
致动器31的尺寸和间隔应该调节到细胞尺寸。由于典型的生物细胞尺寸是10-20μm，所以致动器31的尺寸和间隔应该是数十微米，采用当前的技术其是容易实现的。
优选地，向致动电极35施加高频AC电压以展开微致动器31的翼片，如图3b中所示。相同的信号也可以用于探测上面覆盖的翼片的阻抗，并因此用于传感翼片的位置和推断捕获的细胞32的存在和最终尺寸。
细胞34应该位于传感电极34正上方，并且优选地在绝缘体36中应该存在间隙从而致动电极35与细胞32位于其中的介质直接接触。这将场线集中穿过细胞32并增加电测量的灵敏度。
在一个稍微改动的实施方案中，微致动器的尺寸是使得在每个翼片下面可以具有多个传感电极34。
当被致动后，微致动器31被吸引向基底37并且细胞32被“挤压”。所产生的细胞32的变形以及致动器31的相应形状改变由细胞刚性决定。变形可以以多种方式观察：
i)以光学方式，例如用CCD直接成像
ii)以磁方式：如果致动器31是磁性的，则集成在基底37中的磁性检测器(作为传感元件34)，例如GMR传感器，能够检测致动器31的移动和整体形状；
iii)电容量测量(特别是对于静电致动)：在集成于致动器31中的电极和集成于基底37中的致动电极35之间的电容量取决于它们之间的距离；因此该电容量的测量给出了关于细胞31的挤压程度的信息。在实践中，最感兴趣的可能是首先施加电压以引起致动器展开。展开后即刻的电容量是在翼片下捕获的细胞31的体积的量度。然后可以改变电压及因此施加的力并且测量电容量。这给出了作为力的函数的变形曲线。
显著变形细胞所需要的力为大约1nN，并且采用所提出的静电或磁性致动器可以容易地达到这些值。
根据本发明的装置40的一个可选实施方案示于图4中。在该实施方案中，每个细胞保持位置提供两个位于细胞保持元件33的相对侧的微致动器31a，31b。图4a同样示出了未致动状态，图4b示出了致动的状态。如从图4b可以看出的那样，细胞32被从两侧挤压，降低了其被从细胞粘附点推开而不是被变形的可能性。应该注意的是，当然，在单个细胞粘附点周围可以设置多于两个微致动器31a，31b以进一步增加该益处。
在一个进一步的实施方案中，使用电活性的基底。然后也可以设计基底上的电极几何形状，其将细胞定位于所需的位置。这可以为致动电极中的孔洞形式或是任何低电场陷阱，并且可以用于保持细胞或用于将其操控到正确的位置以与整合素结合。
细胞的保持机理也可以是微流起源的，其中在两个体积之间产生小孔洞。所述体积之间的压力差将会把细胞吸到孔洞中并且保持细胞用于探测。
对于致动，在一个实施方案中提出将细胞放置在糖(蔗糖或甘露糖醇)水缓冲溶液。该介质具有低电导率，因此防止了电场的任何离子屏蔽。
本发明的另一个主要应用是清洁机械裂解。如果细胞被牢固地保持在粘附点上，则致动电压可以有意地设置为非常高。这导致翼片被巨大的力致动并且可以造成捕获的细胞的裂解。这是令人感兴趣的，因为细胞膜此后结合到基底而细胞的内容物自由扩散到溶液中。对于单细胞PCR(聚合酶链反应)或者对于其中必须实施下游DNA提取的任何集成生物装置，这是所希望的。
本发明也可以利用磁性致动和检测。如图1d中所示，将电流线集成到基底中。使电流流经它们产生了将致动器吸引向表面的同心磁场。
另一种可能是在装置周围放置电磁体或磁性线圈，例如图5中示出的微流装置50的对称布局中的四个磁性线圈51-54。磁性线圈51-54可以是单独寻址的。将可以产生随时间变化和大小变化的磁场，通过其激励致动器55(聚合物微致动器)。
微致动器一个阵列的一般布局示于图6中。微致动器1的电极3，4的阵列可以连接到外电压驱动器60，61。为了实现该无源矩阵布局，需要致动和箔电极以彼此成一定角度取向的排形式构造。在图6的例子中，致动电极构造为列的形式，而箔电极3构造为行的形式。为了使无源矩阵体系成功运行，需要微致动器1显示出电压阈值。需要约Vur的电压来展开箔3，而约Vt的电压将不足以引起展开。
各行和各列可以单独地连接到电压源。例如，行电极(箔电极3)可以连接到选择驱动器61，例如类似于AMLCD的门驱动器的标准移位寄存器，其能够在0V和Vt之间切换。然后列电极(致动器电极4)连接到致动驱动器60。致动驱动器60可以仅仅是用于例如无源或有源矩阵液晶显示器(LCD)的标准电压数据驱动器，输出可以具有0V或(Vur-Vt)水平。
该阵列的操作和根据本发明通常可以使用的微致动器阵列的其它实施方案示于WO 2008/020374A2的图2-6中，其描述通过引用并入本文。
因此，根据本发明可以得到所测量的细胞性能的统计数据，因为每个单独的致动器都可以读出信号。LTPS平台(如例如描述于WO2008/020374A2中)的使用使得能够实现这一点。作为选择，所述致动器也可以集合在一起以给出该组群的一个平均数。
此外，可以以动态的时间-变化方式实施致动以探测细胞的与时间相关的机械性能。所述方法也可以与细胞分类方法组合。进一步地，可以控制细胞的“环境”(化学的，温度)以产生特殊的或最优的条件。
存在不同的本发明的应用领域：
-通常的细胞机械表征；
细胞的机械裂解；
-用于癌症、疟疾、心肌病、肌营养不良症或影响细胞的机械性能的其它疾病的诊断微流装置：检测这些疾病的存在或发展；
-筛选大量的细胞来找到受影响的细胞，例如当试图在很多正常细胞中找到少数癌症细胞时；
-筛查药物的效果。
-使用集成在微流体系中的微致动器(同时)测量(很多)细胞的机械性能；该方法使得能够得到感兴趣的性能的统计数据，因为原则上可以对每个致动器进行读出，例如使用LTPS平台；
-基于该原理的医疗诊断装置；
-静电/磁/光学/热致动结合静电/磁/光学检测。
总结而言，本发明的一个目标是提供装置和方法以使用集成在微流装置中的微致动器通过变形细胞来测定生物细胞的机械性能。该方法使得可以同时分析很多细胞。由于细胞的机械性能与很多疾病包括癌症和冠状动脉疾病相关，所以提出的微流装置可以用作检测这些疾病的存在或进展的快速且灵敏的诊断工具。此外，细胞的裂解是可行的。
虽然已经在附图和前述说明书中详细解释和描述了本发明，但是这些解释和描述将被理解为是说明或示例性的而不是限制性的；本发明不限于所公开的实施方案。通过研究附图、公开内容和后附的权利要求，本领域技术人员在实践要求保护的本发明时能够理解并且实施所公开的实施方案的其它变体。
在权利要求中，术语“包含(包括，含有)”并不排除其它要素或步骤，不定冠词“a”或“an”并不排除复数。单个元件或其它单元可能满足权利要求中提出的数个项目的功能。某些措施在相互不同的从属权利要求中被提及的简单事实并不表示不能有利地使用这些措施的组合。
权利要求中的任何附图标记都不应该理解为对范围的限制。
Claims (13)
1.用于机械地变形细胞的装置，包括：
-用于在细胞保持区域中保持细胞(32)的细胞保持元件(33)，
-用于在所述被保持的细胞(32)上施加力的微致动器(31)，其中所述微致动器(31)能够以电、热、光或磁方式被致动并且其中所述微致动器(31)以未致动的状态或以致动的状态在所述细胞(32)上施加所述力，和
-用于以电、热、光或磁方式致动所述微致动器(31)的激励单元(35)。
2.权利要求1的装置，其中所述微致动器(31)具有条带形式，其在未致动状态或致动状态之一中是卷曲的并且在另一状态中是未卷曲的。
3.权利要求1的装置，其中所述微致动器(31)包括双层，该双层包含聚合物薄膜层(2)，特别是丙烯酸酯薄膜，和导电薄膜层(3)，并且其中所述激励单元(35)包括激励电极(4)和用于在所述激励电极(4)和所述导电薄膜层(3)之间施加电压的电压源(60)。
4.权利要求1的装置，其中所述微致动器(31)包括磁性材料，并且其中所述激励单元(35)包括用于产生穿过所述细胞保持区域的磁场的磁场单元。
5.权利要求4的装置，其中所述微致动器(31)包括复合结构，特别是具有分散的磁性颗粒的聚合物薄膜或者非磁性薄膜和磁性薄膜的叠层。
6.权利要求1的装置，进一步包含邻近所述细胞保持区域的传感元件(34)，用于当通过所述微致动器(31)将力施加到细胞(31)时传感细胞(32)的变形。
7.权利要求6的装置，其中所述传感元件(34)是光学、磁或电传感元件，特别是照相机、GMR传感器或传感电极。
8.权利要求3和6的装置，其中所述传感元件(34)包括传感电极和用于测量所述传感电极和所述微致动器的所述导电薄膜层之间的电容的电容量测量元件。
9.权利要求1的装置，其中所述激励单元(35)被调整为用于施加激励信号，该信号如此之大使得微致动器在细胞上施加力导致细胞裂解。
10.权利要求1的装置，包括两个或更多个微致动器(31a，31b)，其设置在细胞保持元件(33)的不同侧并且调整为用于从不同方向在相同的细胞(32)上施加力。
11.权利要求1的装置，包括微致动器(31)和相关的细胞保持元件(33)的阵列，用于同时变形很多细胞(32)。
12.权利要求1的装置，包括微流腔室(24)，该微流腔室(24)包括所述微致动器(31)、所述细胞保持元件(33)、所述激励单元(35)和包含细胞(21)的缓冲溶液(22)，特别是糖溶液。
13.用于机械地变形细胞的方法，包括以下步骤：
-在细胞保持区域中保持细胞(32)，和
-以电、热、光或磁方式致动微致动器(31)以在所述被保持的细胞(32)上施加力，其中所述微致动器(31)能够以电、热、光或磁方式被致动并且其中所述微致动器(31)以未致动的状态或以致动的状态在所述细胞(32)上施加所述力。
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