KR101111231B1 - 마이크로 웰 어레이 칩 및 그 제조방법 - Google Patents

마이크로 웰 어레이 칩 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

기판의 한쪽 주표면에 복수 개의 마이크로 웰을 가지고, 상기 마이크로 웰은 한 개의 마이크로 웰에 한 개의 생체 세포만이 저장되는 형상 및 치수를 가지는 마이크로 웰 어레이 칩으로, 마이크로 웰의 개구와 동일한 기판 표면 상에 마이크로 웰의 마커를 가지는 마이크로 웰 어레이 칩. 기판의 한쪽 주표면에 복수 개의 마이크로 웰을 가지고, 상기 마이크로 웰은 한 개의 마이크로 웰에 한 개의 생체 세포만이 저장되는 형상 및 치수를 가지는 마이크로 웰 어레이 칩. 상기 마이크로 웰의 개구부에 개구부를 좁히도록 돌기부를 가진다. 이 마이크로 웰 어레이 칩의 제조방법. 기판의 적어도 한쪽 주표면에 막을 형성시키는 공정, 형성된 막 위에 레지스트를 도포시키는 공정, 상기 레지스트면에 마이크로 웰 패턴을 가지는 마스크를 통해 노광시키고, 레지스트의 비경화 부분을 제거하는 공정, 상기 막 및 기판의 노출부를 에칭하여 마이크로 웰 어레이 형상의 구멍을 뚫는 공정 및 레지스트를 제거하는 공정을 가진다. 복수 개의 마이크로 웰을 가지고, 각 마이크로 웰에 한 개의 피검체 생체 세포를 저장하여 이용되는 실리콘제의 마이크로 웰 어레이 칩. 상기 마이크로 웰은 한 개의 마이크로 웰에 한 개의 생체 세포만이 저장되는 형상 및 치수를 가진다.
마이크로 웰 어레이 칩, 레지스트, 생체 세포, 마커, 실리콘제

Description

마이크로 웰 어레이 칩 및 그 제조방법{Microwell array chip and its manufacturing method}
본 발명의 제1의 태양은 항원 특이적 림프구 등의 생체 세포 검출 등에 이용할 수 있는 마이크로 웰 어레이 칩에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 제1의 태양은 마이크로 웰의 위치 결정을 용이하게 실시할 수 있는 마이크로 웰 어레이 칩에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 제２의 태양은 마이크로 웰로의 생체 세포의 포집율(捕集率) 및 채집율이 뛰어난 마이크로 웰 어레이 칩 및 그 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 제３의 태양은 항원 특이적 림프구 등의 생체 세포 검출 등에 이용할 수 있는 실리콘제의 마이크로 웰 어레이 칩에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 제３의 태양은 필요에 따라 마이크로 웰에 저장된(stored) 생체 세포를 용이하게 회수할 수 있는 마이크로 웰 어레이 칩에 관한 것이다.
종래, 항원 특이적 림프구는 예를 들면, 96-웰 플레이트(96-well plate)를 이용하여, 한 웰 당 약 200,000개의 림프구를 가하고 3일부터 1주일간 항원의 존재하에서 배양하는 것에 의해 검출하고 있던(「림프구 기능 검색법」야노 쥰이치, 후지와라 미치오 편저, 중외 의학사(1994년), 「면역 실험 조작법 Ⅰ, Ⅱ」미기타 순 스케, 콘다 스스무, 모토 모로스케, 하마오카 토시유키 편집, 남강당(1995년)). 이 방법에서는 약 200,000개라고 하는 림프구 집단 중 항원 특이적 림프구가 존재하는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 림프구 집단 중에 존재하는 개개의 항원 특이적 림프구를 분류(identification)할 수 없었다.
이에 대해 요즘 형광 색소로 표지(標識, mark)한 항원 분자를 림프구와 혼합시키는 것에 의해 항원 특이적 림프구의 항원 수용체에 형광 표지 항원을 결합시키고, 형광 표지 항원을 결합시킨 림프구를, 플로우 사이토미터(Flow Cytometer)를 이용하는 것에 의해 검출하는 방법이 개발되어 이용되고 있다(Altman JD, Moss PA, Goulder PJ, Barouch DH, McHeyzer-Williams MG, Bell JI, McMichael AJ, Davis MM. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes, Science, 274:94～96, 1996). 이 방법에서는 항원에 결합하는 한 개의 림프구를 분류하는 것이 가능하다. 또한, 항원에 결합하는 한 개의 림프구를 분취(分取)하는 것도 가능하다.
그러나 상기 검출 방법에서 분취하기 위해서는 셀 서터(Cell Sorter)라는 고가이면서 복잡한 기기가 필요할 뿐만 아니라, 아래와 같은 문제도 있다.
(1) 분취하기 위한 기기의 조건 설정이 어렵고, 세포를 분취하기 위해서는 기기 조작의 숙련을 요한다.
(2) 백그라운드 노이즈(background noise)가 높기 때문에 항원 특이적 림프구의 빈도가 0.1％이하인 경우는 항원 특이적 림프구를 검출할 수 없다.
(3) 세포를 분취하는 효율이 낮다.
(4) 빈도가 낮은 세포를 분취하는데 시간이 걸린다.
(5) 항원이 결합하는 것은 확인 가능하지만, 항원이 결합한 림프구의 반응을 해석하는 것은 어렵다.
다른 항원 특이적 림프구 검출법으로써 자기(磁氣) 비즈(beads)에 결합한 항원 분자를 림프구와 혼합시키는 것에 의해, 항원 특이적 림프구의 항원 수용체에 자기 비즈 결합 항원을 결합시키고, 자석을 이용하여 항원 특이적 림프구를 분취하는 방법도 개발되고 있다(Abts H, Emmerich M, Miltenyi S, Radbruch A, Tesch H, CD20 positive human B lymphocytes separated with the magnetic sorter(MACS) can be induced to proliferation and antibody secretion in vitro. Journal of Immunological Methods 125:19～28, 1989).
이 방법에서는, 복잡한 장치를 필요로 하지 않고, 세포 분취 시간은 단시간이며, 항원이 결합하는 것도 확인할 수 있다. 그러나 항원이 결합한 림프구가 항원에 반응(세포 내 시그널 전달, RNA 합성, 단백질 합성 등과 같은 세포의 대사(代謝) 생리 반응)하는지를 해석할 수 없었다. 또한, 항원 특이적 림프구의 빈도가 0.1％이하인 경우는 항원 특이적 림프구를 검출할 수 없었다.
그에 대해, 본 발명자들은 복잡한 장치를 필요로 하지 않고, 세포 분취 시간은 단시간이며, 항원이 결합하는 것도 확인할 수 있고, 빈도가 낮은 항원 특이적 림프구(0.001％이상)도 검출할 수 있어 항원이 결합한 림프구가 항원에 반응하는지를 해석할 수 있을 뿐만 아니라, 항원 특이적 림프구를 분취할 수 있는 항원 특이적 림프구 검출법을 제공하는 것을 다양하게 검토해 왔다. 그리고 한 개 한 개의 림프구의 항원 특이성을 개별적으로 검출하고, 또한 검출된 항원 특이적 림프구를 회수하는 방법에 대해서 개발을 진행시켜 왔다.
그러나 종래에는 한 개 한 개의 림프구의 항원 특이성을 개별적으로 검출하고, 또한 검출된 항원 특이적 림프구를 회수할 수 있는 마이크로 웰 어레이 칩은 알려져 있지 않았다.
그래서 본 발명자들은 상기 검출법으로 이용 가능한, 한 개의 림프구를 한 개의 마이크로 웰에 수납 가능한 마이크로 웰 어레이 칩을 제공하기 위하여 여러 가지의 검토를 거듭해 왔다. 그리고 기판 표면에 한 개의 림프구를 수납할 수 있는 정도의 크기의 마이크로 웰을 형성한 마이크로 웰 어레이 칩을 시작(試作)하고, 림프구의 마이크로 웰로의 저장(포집) 및 마이크로 웰로부터의 회수 테스트를 실시하여 왔다. 그 과정에서 미세한 마이크로 웰이 다수 설치된 어레이 칩 상에서 검출된 항원 특이적 림프구를 회수할 경우, 특히, 검출과 회수를 다른 공정으로 실시하는 경우, 검출된 마이크로 웰로부터 실수없이 확실히 항원 특이적 림프구를 회수하기 위해서는 마이크로 웰의 위치 결정을 확실히 실시할 필요가 있다는 것이 판명되었다. 즉, 단순히 다수의 마이크로 웰을 배열한 어레이 칩만으로는 특정 마이크로 웰의 위치 결정이 용이하지 않다는 문제가 있었다.
또한, 상기 과정에서 림프구를 마이크로 웰에 저장할 때, 세포 현탁액(suspension)을 이용하여 림프구를 마이크로 웰에 포집한 후 어레이 칩을 세정하면, 대다수의 세포가 마이크로 웰로부터 흘러 나와 버려서 포집율 및 충전율이 현저하게 저하된다는 문제가 있다는 것도 판명되었다.
따라서, 본 발명의 제1의 목적은, 상기 검출법으로 이용 가능한, 한 개의 림 프구를 한 개의 마이크로 웰에 수납 가능한 마이크로 웰 어레이 칩을 제공하는 것에 있다. 특히 본 발명의 제1의 태양은 다수인 동시에 미세한 마이크로 웰의 위치를 용이하게 결정할 수 있는 마이크로 웰 어레이 칩을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명의 제２의 목적은, 마이크로 웰에 포집된 림프구 등의 세포가 그 이후의 세정시에 마이크로 웰로부터 유출되기 어려운 마이크로 웰 어레이 칩을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 제３의 목적은, 상기 검출법으로 이용 가능한, 한 개의 림프구를 한 개의 마이크로 웰에 수납 가능한 마이크로 웰 어레이 칩을 제공하는 것에 있다.
특히 본 발명의 제３의 태양은 마이크로 웰에 수납한 한 개의 림프구를 용이하게 회수할 수 있는 마이크로 웰 어레이 칩을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명의 제３의 태양은 림프구에 한정되지 않고, 한 개의 생체 세포를 한 개의 마이크로 웰에 수납 가능한 마이크로 웰 어레이 칩을 제공하는 것도 목적으로 한다.
상기 제1의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 제1의 태양은, 이하와 같다.
(1) 기판 한쪽의 주표면에 복수 개의 마이크로 웰을 가지며, 상기 마이크로 웰은 한 개의 마이크로 웰에 한 개의 생체 세포만이 저장되는 형상 및 치수를 가지는 마이크로 웰 어레이 칩에 있어서, 마이크로 웰의 개구와 동일한 기판 표면상에 마이크로 웰의 마커(marker)를 갖는 마이크로 웰 어레이 칩.
(2) (1)에 있어서, 상기 복수 개의 마이크로 웰은 동일 간격으로 종횡(縱橫)으로 배치되어 있고, 소정 갯수의 마이크로 웰마다 마커가 설치되어 있는 마이크로 웰 어레이 칩.
(3) (1) 또는 (2)에 있어서, 상기 복수 개의 마이크로 웰은 소정 갯수의 마이크로 웰마다 그룹을 나누어 기판의 주표면 상에 설치되고, 각 그룹의 위치를 파악할 수 있도록 마커가 설치되어 있는 마이크로 웰 어레이 칩.
(4) (3)에 있어서, 상기 한 개의 그룹에 속하는 마이크로 웰의 수는 10～10000의 범위인 마이크로 웰 어레이 칩.
(5) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, 상기 마커는 형광 재료 또는 반사 재료로 된 마이크로 웰 어레이 칩.
(6) (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 있어서, 상기 마커는 위치 결정을 위한 마커인 마이크로 웰 어레이 칩.
(7) (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 있어서, 상기 기판은 실리콘, 금속 또는 수지제인 마이크로 웰 어레이 칩.
(8) (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 있어서, 상기 마이크로 웰은 원통형(圓筒形), 복수의 면에 의해 구성된 다면체, 역원뿔형 또는 역각뿔형, 또는 이들 중 2개 이상을 조합한 형상인 마이크로 웰 어레이 칩.
(9) (1) 내지 (8) 중 어느 하나에 있어서, 상기 마이크로 웰의 평면 형상에 내접하는 최대 원의 직경은 마이크로 웰에 저장하고자 하는 생체 세포 직경의 0.5～2배의 범위이고, 동시에 마이크로 웰의 깊이는 마이크로 웰에 저장하고자 하는 생체 세포 직경의 0.5～4배의 범위인 마이크로 웰 어레이 칩.
(10) (1) 내지 (9) 중 어느 하나에 있어서, 상기 생체 세포는 림프구이고, 항원 특이적 림프구를 한 개 단위로 검출하기 위해서 이용되는 마이크로 웰 어레이 칩인 마이크로 웰 어레이 칩.
(11) (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 있어서, 상기 주표면 상에 상기 복수 개의 마이크로 웰을 둘러싸듯이 설치된 소수성(疏水性) 영역을 가지는 마이크로 웰 어레이 칩.
(12) (11)에 있어서, 상기 소수성 영역은 실리콘 표면 또는 불소 함유 표면을 가지는 마이크로 웰 어레이 칩.
상기 제２의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 제２의 태양은 이하와 같다.
(13) 기판 한쪽의 주표면에 복수 개의 마이크로 웰을 가지며, 상기 마이크로 웰은 한 개의 마이크로 웰에 한 개의 생체 세포만이 저장되는 형상 및 치수를 가지는 마이크로 웰 어레이 칩에 있어서, 상기 마이크로 웰의 개구부에 개구부를 좁히도록 돌기부를 가지는 마이크로 웰 어레이 칩.
(14) (13)에 있어서, 상기 돌기부는 기판 표면에 설치된 막이 상기 개구부에 돌출되도록 형성되어 있는 마이크로 웰 어레이 칩.
(15) (13) 또는 (14)에 있어서, 상기 돌기부에 의해 형성되는 개구의 크기는 마이크로 웰에 저장되어야 할 생체 세포가 통과할 수 있는 크기인 마이크로 웰 어레이 칩.
(16) (13) 내지 (15) 중 어느 하나에 있어서, 상기 기판은 실리콘, 금속 또는 수지제인 마이크로 웰 어레이 칩.
(17) (14) 내지 (16) 중 어느 하나에 있어서, 상기 기판 표면에 설치된 막은 산화막, 질화막, 불순물 확산층, 금속막 또는 수지막인 마이크로 웰 어레이 칩.
(18) 기판의 적어도 한쪽의 주표면에 막을 형성시키는 공정,
형성된 막 위에 레지스트(resist)를 도포시키는 공정,
상기 레지스트면에 마이크로 웰 패턴을 가지는 마스크를 통해 노광(露光)시키고, 레지스트의 비경화 부분을 제거하는 공정,
상기 막 및 기판의 노출부를 에칭(etching)하여 마이크로 웰 어레이 형상의 구멍을 뚫는 공정, 및
상기 레지스트를 제거하는 공정을 포함하는 (13)에 기재된 마이크로 웰 어레이 칩의 제조방법.
(19) (18)에 있어서, 상기 기판은 실리콘, 금속 또는 수지제인 마이크로 웰 어레이 칩의 제조방법.
(20) (18) 또는 (19)에 있어서, 상기 기판 표면에 설치된 막은 산화막, 질화막, 불순물 확산층, 금속막 또는 수지막인 마이크로 웰 어레이 칩의 제조방법.
(21) (13) 내지 (20) 중 어느 하나에 있어서, 상기 주표면 상에 상기 복수 개의 마이크로 웰을 둘러싸듯이 설치된 소수성 영역을 가지는 마이크로 웰 어레이 칩.
(22) (21)에 있어서, 상기 소수성 영역은 실리콘 표면 또는 불소 함유 표면을 가지는 마이크로 웰 어레이 칩.
상기 제３의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 제３의 태양은 이하와 같다.
(23) 복수 개의 마이크로 웰을 가지며, 각 마이크로 웰에 한 개의 피검체(被檢體) 생체 세포를 저장하여 이용되는 실리콘제의 마이크로 웰 어레이 칩에 있어서, 상기 마이크로 웰은 한 개의 마이크로 웰에 한 개의 생체 세포만이 저장되는 형상 및 치수를 가지는 마이크로 웰 어레이 칩.
(24) (23)에 있어서, 상기 마이크로 웰은 원통형, 복수의 면에 의해 구성되는 다면체, 역원뿔형 또는 역각뿔형, 또는 이들 중 2개 이상을 조합한 형상인 마이크로 웰 어레이 칩.
(25) (23) 또는 (24)에 있어서, 상기 마이크로 웰의 평면 형상에 내접하는 최대 원의 직경은 마이크로 웰에 저장하고자 하는 생체 세포 직경의 0.5～2배의 범위이고, 동시에 마이크로 웰의 깊이는 마이크로 웰에 저장하고자 하는 생체 세포 직경의 0.5～4배의 범위인 마이크로 웰 어레이 칩.
(26) (23) 내지 (25) 중 어느 하나에 있어서, 상기 생체 세포는 림프구이고, 항원 특이적 림프구를 한 개 단위로 검출하기 위해 이용되는 마이크로 웰 어레이 칩인 마이크로 웰 어레이 칩.
(27) (23) 내지 (26) 중 어느 하나에 있어서, 상기 마이크로 웰의 내면은 플루오르 카본(Fluoro carbon)막 또는 산화 실리콘막으로 피복되어 있는 마이크로 웰 어레이 칩.
(28) (27)에 있어서, 상기 한 개의 마이크로 웰에 저장한 한 개의 생체 세포가 마이크로 웰로부터 회수되도록 이용되는 마이크로 웰 어레이 칩.
(29) (23) 내지 (28) 중 어느 하나에 있어서, 상기 복수 개의 마이크로 웰을 가지는 면 위에, 상기 복수 개의 마이크로 웰을 둘러싸듯이 설치된 소수성 영역을 가지는 마이크로 웰 어레이 칩.
(30) (29)에 있어서, 상기 소수성 영역은 실리콘 표면 또는 불소 함유 표면을 가지는 마이크로 웰 어레이 칩.
(31) 기판 한쪽의 주표면에 마이크로 웰을 가지는 마이크로 웰 어레이 칩에 있어서, 상기 주표면 상에 상기 마이크로 웰을 둘러싸듯이 설치된 소수성 표면 영역을 가지는 마이크로 웰 어레이 칩.
(32) (31)에 있어서, 상기 소수성 영역은 실리콘 표면 또는 불소 함유 표면을 가지는 마이크로 웰 어레이 칩.
도 1은 10×10의 마이크로 웰(1b)의 그룹(1c)를 종횡으로 3개씩 설치한 마이크로 웰 어레이 칩(1a)의 평면도를 도시한다.
도 2는 실시예 1에서 형광 마커를 가지는 본 발명의 제1의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩의 제작방법 설명도이다.
도 3은 실리콘 기판(3a) 상에 반사 마커(3d)를 가지는 마이크로 웰 어레이 칩(3a)의 평면도를 도시한다.
도 4는 반사 마커의 반사 원리의 설명도이다.
도 5는 실시예 2에서 반사 마커를 가지는 본 발명의 제1의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩의 제작방법(전반) 설명도이다.
도 6은 실시예 2에서 반사 마커를 가지는 본 발명의 제1의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩의 제작 방법(후반) 설명도이다.
도 7(A) 및 (B)는 개구부(13a)에 돌기부가 존재하지 않는 마이크로 웰(13)을 가지는 어레이 칩의 평면도 및 측면 단면도이다. 도 7(C), (D) 및 (E)는 마이크로 웰(13)의 개구부(13a)에 막(12')의 일부로 형성된 돌기부(14)가 존재하는 어레이 칩의 평면도, 측면 단면도 및 사시도이다.
도 8(A), (B) 및 (C)는 도 7과는 다른 태양인 본 발명의 제２의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩을 도시하는 평면도, 측면 단면도 및 사시도이다. 마이크로 웰(13)의 개구부(13a)에는 막(12'')의 일부로 형성된 돌기부(14')가 존재하고, 돌기부(14')로 형성되는 개구의 형상은 원형이다.
도 9(A), (B) 및 (C)는 실리콘 기판을 이용한 마이크로 웰 어레이 칩의 제작 과정 설명도(측면 단면도)이고,(C)의 마이크로 웰은 역사각뿔 형상이다. (D)의 마이크로 웰은 사각형이고,(E)의 마이크로 웰은 반구형(半球形)이다.
도 10은 실시예 3에서 작성한 마이크로 웰 어레이 칩의 각 부분의 치수를 도시한다.
도 11은 웰 내에 플루오르 카본막을 가지는 마이크로 웰 어레이 칩의 개략 설명도이다.
도 12는 실시예 4에서 웰 내에 플루오르 카본막을 가지는 마이크로 웰 어레이 칩의 제작 방법 설명도이다.
도 13은, 실시예 5에서 웰 내에 산화막(산화 실리콘)을 가지는 마이크로 웰 어레이 칩의 제작 방법 설명도이다.
도 14는 복수 개의 마이크로 웰을 가지는 주표면 상에, 상기 복수 개의 마이크로 웰을 둘러싸듯이 설치된 소수성 영역을 가지는 마이크로 웰 어레이 칩의 개략도이다.
도 15는 도 14에서 도시한 마이크로 웰 어레이 칩의 제작 방법 설명도이다.
도 16은 소수성 영역이 설치된 마이크 웰 어레이 칩의 제작 방법 설명도이다.
도 17은 실시예 6에서 내벽에 평활화(平滑化) 처리를 가한 마이크로 웰의 확대 사진이다.
도 18은 실시예 7에서 개구부에 돌기를 형성한 마이크로 웰의 확대 사진이다.
발명을 실시하기 위한 바람직한 형태
[제1의 태양]
이하, 본 발명의 제1의 태양에 대해서 설명한다.
마이크로 웰 어레이 칩
본 발명의 제1의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩은, 기판의 한쪽 주표면에 복수 개의 마이크로 웰을 가지며, 상기 마이크로 웰은 한 개의 마이크로 웰에 한 개의 생체 세포만이 저장되는 형상 및 치수를 가진다. 또한, 본 발명의 마이크로 웰 어레이 칩은 마이크로 웰의 개구와 동일한 기판 표면상에 마이크로 웰의 마커를 가진다.
상기 피검체 생체 세포는 예를 들면 림프구일 수 있으며, 본 발명의 마이크로 웰 어레이 칩은 예를 들면 항원 특이적 림프구를 한 개 단위로 검출하기 위해 이용할 수 있다.
제1의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩에서는, 복수 개의 마이크로 웰이 동일 간격으로 종횡으로 배치되어 있어 소정 갯수의 마이크로 웰마다 마커가 설치되어 있는 것이 바람직하다. 특히, 제1의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩에서는, 소정 갯수의 마이크로 웰마다 그룹을 나누어 기판의 주표면 상에 설치하고, 각 그룹의 위치를 파악할 수 있도록 마커가 설치되어 있다.
예를 들면, 도 1에 10×10의 마이크로 웰(1b)의 그룹(1c)을 종횡으로 3 개씩 설치한 마이크로 웰 어레이 칩(1a)의 평면도를 도시한다. 그리고, 각 10×10의 마이크로 웰의 그룹(1c)의 네 모서리에 마커(1d)가 설치되어 있다. 또한, 마이크로 웰 어레이 칩(1a) 전체의 네 모서리에 설치되는 마커는, 각 그룹의 네 모서리에 설치된 마커와 식별할 수 있는 마커가 설치될 수도 있다.
한 개의 마이크로 웰의 그룹을 구성하는 마이크로 웰의 수에는 특별히 제한은 없지만, 예를 들면, 10～10000의 범위일 수가 있다.
또한, 마커는 단순히 위치를 알려주기 위한 것이어도 되지만, 숫자나 문자이어도 된다. 숫자나 문자의 마커를 이용하는 것으로 각 그룹의 위치를 결정할 뿐만 아니라, 각 그룹을 특정할 수도 있다. 즉, 각 그룹에 번지를 부여할 수도 있다.
마커는, 예를 들면, 형광 현미경이나 이미지 스캐너로 읽어낼 수 있는데 그 때문에 형광 재료 또는 반사 재료로 된 것이 바람직하다.
형광 재료로써는, 구체적으로는, 외부로부터 입사(入射)한 여기광(勵起光)에 대해서 특정 파장의 형광 발광을 가지는 재료로, 바람직하게는 박막화가 가능하고 반도체 집적회로 제작 기술 중 하나인 사진 석판술(photolithography)에 의해 가공이 가능한 재료를 선택한다. 예를 들면, o-나프토퀴논 다이아지드(naphthoquinone diazide)-노볼락형(Novolac type) 레지스트, 예를 들면, 도쿄 오카 공업(東京應化工業)(주) OFPR-800등이 바람직하다.
또한, 반사 재료로써는 가공된 기판 재료, 또한, 기판상에 제작된 박막 등이 선택된다. 기판 재료를 에칭이나 밀어 넣는 가공 등으로 가공하는 것으로, 예를 들면, 표면에 대해서 경사를 가진 반사 구조를 제작하거나 또한, 문자나 정보 등을 가지는 인식 패턴 등을 형성하는 것이 가능하다. 또한, 기판 재료상에 박막을 형성하고, 에칭 등의 가공에 의해 요철 구조를 제작하는 것으로, 박막 표면의 미세한 요철, 박막 단면(端面)의 경사에 의해 난반사 구조가 형성되어 상기와 같은 효과가 가능하다.
마이크로 웰 내에 있는 시료를 형광을 이용하여 관찰할 때, 형광을 발하고 있지 않은 부분은 전혀 보이지 않는다. 그렇기 때문에, 시료의 기판상에서의 위치를 파악하기 위해서는 형광에 의한 표지가 필요하다.
마이크로 웰의 형상이나 치수에 특별히 제한은 없지만, 마이크로 웰의 형상은 예를 들면 원통형일 수 있고, 원통형 이외에 복수의 면에 의해 구성되는 다면 체(예를 들면, 직방체, 육각기둥, 팔각기둥 등), 역원뿔형, 역각뿔형(역삼각뿔형, 역사각뿔형, 역오각뿔형, 역육각뿔형, 칠각 이상의 역다각뿔형) 등일 수도 있으며, 이들 형상 중 두 개 이상을 조합한 형상일 수도 있다. 예를 들면, 일부가 원통형이고, 나머지가 역원뿔형일 수 있다. 또한, 역원뿔형, 역각뿔형의 경우, 저면이 마이크로 웰의 개구가 되는데, 역원뿔형, 역각뿔형의 정상에서 일부를 잘라낸 형상인(그 경우, 마이크로 웰의 저부는 평탄해진다) 것도 가능하다. 원통형, 직방체는, 마이크로 웰의 저부가 통상 평탄하지만, 곡면(볼록면이나 오목면)으로 할 수도 있다. 마이크로 웰의 저부를 곡면으로 할 수 있는 것은 역원뿔형, 역각뿔형의 정상에서 일부를 잘라낸 형상의 경우도 마찬가지이다.
마이크로 웰의 형상이나 치수는, 마이크로 웰에 저장되어야 할 생체 세포의 종류(생체 세포의 형상이나 치수 등)를 고려하고, 한 개의 마이크로 웰에 한 개의 생체 세포가 저장되도록 적당히 결정된다.
한 개의 마이크로 웰에 한 개의 생체 세포가 저장되도록 하기 위해서는, 예를 들면, 마이크로 웰의 평면 형상에 내접하는 최대 원의 직경이 마이크로 웰에 저장하고자 하는 생체 세포 직경의 0.5～2배의 범위, 바람직하게는 0.8～1.9배의 범위, 보다 바람직하게는 0.8～1.8배의 범위인 것이 적당하다.
또한, 마이크로 웰의 깊이는 마이크로 웰에 저장하고자 하는 생체 세포 직경의 0.5～4배의 범위, 바람직하게는 0.8～1.9배의 범위, 보다 바람직하게는 0.8～1.8배의 범위인 것이 적당하다.
마이크로 웰이 원통형인 경우, 그 치수는 예를 들면 직경 3～100㎛일 수 있 고, 생체 세포가 B림프구인 경우, 바람직하게는 직경 4～15㎛이다. 또한, 깊이는 예를 들면, 3～100㎛일 수 있고, 생체 세포가 B림프구인 경우, 바람직하게는 깊이 4～40㎛일 수 있다. 단, 마이크로 웰의 치수는, 상술한 바와 같이 마이크로 웰에 저장하고자 하는 생체 세포 직경과의 마이크로 웰의 치수의 적합한 비를 고려하여 적당히 결정한다.
한 개의 마이크로 웰 어레이 칩이 가지는 마이크로 웰의 수는, 특별히 제한은 없지만, 생체 세포가 림프구인 경우, 항원 특이적 림프구의 빈도가 105개에 1개에서부터 많은 경우에는 약 500개이라는 관점에서, 1㎠당 예를 들면, 2,000～1,000,000개의 범위일 수 있다.
제1의 태양에 있어서, 마이크로 웰의 내벽 표면 형상은 세포를 원활하게 꺼내기 위해 평활한 것이 바람직하다. 표면 요철의 높이는 0～1.0미크론의 범위일 수 있고, 바람직하게는 0～0.5미크론의 범위, 보다 바람직하게는 0～0.1미크론의 범위이다.
또한, 마이크로 웰의 내벽의 임의의 위치에 있어서, 요철 높이를 변경하는 것도 가능하다. 평활 처리를 실시한 웰 내벽의 일부에 요철을 만드는 것으로, 웰에 기능성을 부가할 수 있다. 예를 들면, 웰 입구 부근에, 예를 들면 높이 0.5～1미크론의 돌기를 제작하는 것으로, 웰에 들어간 세포를 세정 시에 흘러가기 어렵게 하는 것이 가능하다. 또한, 이 태양은 후술하는 제２의 태양에 상당한다. 또한, 웰 저면에 돌기를 붙이는 것으로, 세포를 웰 저면에 닿게 하지 않고 돌기에 의해 지지 할 수 있다.
마이크로 웰 내벽의 평활화는, 에칭에 의해 실시할 수 있다. 에칭 장치의 진공도, 에칭 가스 종(種), 에칭 공정 등은 적당히 선택할 수 있다. 예를 들면, STS사 Multiplex ASE 에칭 장치를 이용하여 마이크로 웰 내벽의 평활화를 실시하는 경우는, 에칭 공정과 보호막 형성 공정의 처리(process) 주기 시간을 적당히 설정하는 것이 바람직하다. 또한, 마이크로 웰 내벽의 평활화는 습식 에칭(wet etching)이나 열산화 공정과 산화막 에칭을 조합하는 것으로도 실시할 수 있다.
예를 들면, STS사 Multiplex ASE 에칭 장치를 이용하여 마이크로 웰 내벽의 임의의 위치에서 요철의 높이를 변경하는 경우는, 상기 장치의 처리 주기를 바꾸는 것으로 마이크로 웰 내벽의 원하는 위치에 원하는 높이의 요철을 형성할 수 있다. 또한, 습식 에칭 등으로는 약품액의 종류, 농도, 온도를 적당히 선택하는 것으로 실현 가능하다.
또한, 에칭으로 웰 측벽의 임의 장소에 돌기를 형성하는 것도 가능하다. 예를 들면 상술한 STS사 Multiplex ASE 에칭 장치에 의해, 돌기를 형성하고 싶은 위치에서 처리 주기 시간을 길게 하는 것에 의해, 웰 측벽의 원하는 위치에 원하는 높이의 돌기를 형성할 수 있다. 또한, 상기 장치 이외의 에칭 장치 등에서도 돌기를 형성하고 싶은 위치에서 에칭 조건을 적당히 선택, 변경하는 것으로 돌기를 형성할 수 있다.
제1의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩은 예를 들면, 실리콘, 금속, 또는 수지제일 수 있다. 단, 실리콘제인 것으로, 현재 반도체 집적회로 제조 기술의 주류인 실리콘 가공 기술을 그대로 응용하는 것이 가능하고, 특히 미세 가공성, 대량 양산성, 장래의 센서를 포함한 분석 회로와의 집적화라는 의미에서 다른 재료보다 우수하다.
상기 금속으로써는 예를 들면, 알루미늄, 스테인레스, 동, 니켈, 크롬, 티탄 등을 들 수 있다.
상기 수지로써는 예를 들면, 폴리이미드, 폴리에틸렌, 염화 비닐, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, 아크릴, 폴리에틸렌테레프탈레이트 등을 들 수 있다.
마이크로 웰 어레이 칩이 예를 들면 실리콘제이고, 마커가 형광 재료로 된 경우에 대해서 그 제조방법을 설명한다.
(1) 형광 물질(예를 들어, 도쿄 오카 OFPR-800)을 실리콘 기판의 한쪽 주표면에 도포한다. 형광 물질은 도쿄 오카 OFPR-800이외의 재료라도, 여기광을 흡수하고, 그에 따라 여기 상태에서 기저(基底) 상태로 돌아갈 때에 형광으로써 에너지를 방출하는 특성을 가지는 물질이라면, 적당히 선택할 수 있고, 바람직하게는 사진 석판술(photolithography)에 의한 가공이 가능한 것이 바람직하다. 예를 들면, 클라이언트사 AZP1350 등으로도 대용할 수 있다.
(2) 이 표면에 사진석판술(photolithography)로 표지 패턴을 형성하고, 형광 물질의 내용제성(耐溶劑性)을 향상시키기 위해서 고온(예를 들어 180℃)에서 경화(hardening) 처리를 실시한다. 경화 처리의 온도는 형광 물질에 따라 적당히 선택할 수 있다.
(3) 경화 처리 후, 사진 석판술에 의해 마이크로 웰 패턴을 형성하고, 저 온(100℃ 이하)에소 경화를 실시한다. 마이크로 웰 패턴은 마이크로 웰의 치수나 배열 등에 따라 적당히 결정할 수 있다. 또한, 경화 온도는 마이크로 웰 패턴에 사용하는 포토레지스트(photoresist) 재료에 따라 적당히 결정할 수 있다.
(4) 건식 에칭법 등에 의해, 웰을 형성한다. 웰 형성을 위한 건식 에칭법은 공지의 방법을 적당히 사용할 수 있다.
(5) 아세톤 등의 유기용제에서 웰 패턴 마스크에 이용한 포토레지스트를 제거한다. 사용하는 유기용제는 아세톤에 한정되지 않는다. 포토레지스트를 제거할 수 있는 것이면, 적당히 사용할 수 있다.
포토레지스트를 제거하는 것으로, 실리콘 기판에 형성된 마이크로 웰과 형광 표지만이 칩 상에 남아 제1의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩이 얻어진다.
이어서, 마이크로 웰 어레이 칩이 예를 들면 실리콘제이고, 마커가 반사성 재료로 된 경우에 대해서 그 제조방법을 설명한다.
(1) 사진 석판술에 의해 실리콘 기판의 한쪽 주표면에 표지 패턴을 형성한다. 또한, 박막 등에 의해 반사 구조를 제조하는 경우는 사진 석판술 전에 미리 박막 재료를 동일 표면에 형성할 필요가 있다.
(2) 에칭, 예를 들면 면 방위이방성(azimuthal anisotropy) 에칭 특성을 가지는 알칼리 용액에 담그고, 예를 들면, 역피라미드 형상의 반사 구조를 제작한다. 박막의 경우에는 에칭 방법을 적당히 선택한다.
(3) 사진 석판술에 의해 마이크로 웰 패턴을 형성한다. 마이크로 웰 패턴은 마이크로 웰의 치수나 배열 등에 따라 적당히 결정할 수 있다.
(4) 건식 에칭법 등에 의해 웰을 형성한다. 웰 형성을 위한 건식 에칭법은 공지의 방법을 적당히 사용할 수 있다.
(5) 포토레지스트 박리액(剝離液) 등을 이용하여 포토레지스트를 제거한다.
포토레지스트를 제거하는 것으로, 실리콘 기판 상에 형성된 마이크로 웰과 반사성 표지만이 칩 상에 남아 제1의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩이 얻어진다.
또한, 제1의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩으로는 전자나 정공(Electron hole) 등과 같은 캐리어의 장벽 현상 등에 대표되는 양자(量子) 효과, 예를 들면 캐리어의 잠금 효과를 이용한 광 발광(photoluminescence) 구조를 이용할 수도 있다. 사용하는 광 발광 재료는, 필요로 하는 파장에 따라 적당히 선택할 수 있다. 광 발광 구조를 칩에 첨부해도 되고, 칩 자체에 광 발광 구조를 만들어 넣는 방법을 이용해도 된다. 예를 들면, 양자 효과 입자, 불순물 도핑(doping), 다공질(porous) 재료, 박막 적층에 의한 양자 우물 구조의 형성 또는 광 발광 재료의 성막에 의해, 제1의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩에 마커를 설치할 수도 있다.
또한, 제1의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩은 복수 개의 마이크로 웰을 가지는 주표면 상에, 상기 복수 개의 마이크로 웰을 둘러싸듯이 설치된 소수성 영역을 가질 수도 있다. 그러한 영역을 설치한 마이크로 웰 어레이 칩의 개략도를 도 14로 도시한다. 도 14에서 도시하는 바와 같이 마이크로 웰을 둘러싸듯이 소수성 영역을 설치하는 것으로, 마이크로 웰 어레이 상에 파종(播種)된 세포 등을 포함한 용액은, 소수성 영역을 넘어 확산되지 않기 때문에, 세포 현탁액(suspension)을 마이크로 웰 상에 효율적으로 집약시킬 수 있다. 이러한 영역은 평면이어도 되고 또는 홈 형상이어도 된다. 그 수는 특별히 한정되지 않고, 한 개 설치할 수 있고, 또한 두 개 이상 설치할 수도 있다. 상기 영역의 폭은 파종하는 용액량에 따라 적당히 설정할 수 있고, 예를 들면, 100㎛～1㎜로 할 수 있다. 또한, 상기 영역이 홈 형상인 경우, 그 홈의 깊이도 파종하는 용액량에 따라 적당히 설정할 수가 있고 예를 들면, 5～100㎛로 할 수 있다.
상기 소수성 영역은, 예를 들면, 실리콘 표면 또는 불소 함유 표면을 가지는 것일 수 있다.
이하에 일례로써 기판이 실리콘제이고, 실리콘 표면을 가지는 홈 형상의 소수성 영역을 설치한 마이크로 웰 어레이 칩의 제조방법을, 도 15를 참조하여 설명한다.
(1)　산화 실리콘막(32a)가 형성된 실리콘 기판(32b)(도 15(A))에, 예를 들면 도쿄 오카 공업(주) 노볼락 수지계 포지티브(positive)형 포토레지스트 OFPR-800(32c)를 도포하여 마이크로 웰 패턴(32d)을 형성한다. 이 때, 마이크로 웰 패턴과 함께 홈 형상의 소수성 영역을 설치하기 위한 패턴(32e)을 동시에 형성한다(도 15(B)).
(2)　불화수소산 등으로 패턴으로부터 노출된 산화 실리콘막(32a)을 제거하고(도 15(C)), 필요에 따라서 포토레지스트(32c)는 제거한다. 불소계 가스나 이온 충격을 이용한 건식 에칭 또는 알칼리 용액, 불초산 등에 의한 습식 에칭에 의해 실리콘을 에칭한다. 이때, 마이크로 웰(32f)이 형성되고, 동시에 패턴(32e)을 작성한 부분은 소수성을 가지는 실리콘 표면이 노출되어 홈 형상의 소수성 영역(32g)이 형성된다(도 15(D)).
(3)　포토레지스트를 제거하면, 마이크로 웰을 둘러싸듯이 실리콘 표면을 가지는 홈 형상의 소수성 영역이 설치된 마이크로 웰 어레이 칩을 얻을 수 있다(도 15(E)).
또한, 본 발명에 있어서는, 상술한 바와 같이 실리콘 기판 자체를 웰 형성과 함께 에칭하는 것에 의해, 홈 형상의 소수성 영역이 설치된 마이크 웰 어레이 칩을 얻을 수 있으며, 산화막을 에칭하여 실리콘 표면을 노출시키는 것으로 홈 형상의 소수성 영역이 설치된 마이크로 웰 어레이 칩을 얻을 수도 있다. 이하, 그러한 마이크로 웰 어레이 칩의 제작 방법의 일례를, 도 16을 참조하여 설명한다.
(1) 산화 실리콘막(42a)이 형성된 실리콘 기판(42b)(도 16(A))에, 예를 들면 도쿄 오카 공업(주) 노볼락 수지계 포지티브형 포토레지스트 OFPR-800(42c)를 도포하여, 홈 형상의 소수성 영역을 설치하기 위한 패턴(42e)을 형성한다(도 16(B)).
(2) 불화수소산 등으로 패턴으로부터 노출된 산화 실리콘막(42a)을 제거하고, 실리콘을 노출시킨다(도 16(C)). 여기서, 일단 포토레지스트를 제거한다.
(3) 다시 한번 동일 실리콘 기판 표면상에 포토레지스트를 도포하여, 마이크로 웰 패턴(42d)을 형성한다(도 16(D)). 형성된 패턴으로부터 노출된 산화 실리콘막은 불화수소산 등으로 제거한다.
(4) 불소계 가스나 이온 충격을 이용한 건식 에칭 또는 알칼리 용액, 불초산 등에 의한 습식 에칭에 의해 실리콘을 에칭한다(도 16(E)).
(5) 포토레지스트를 제거하면, 마이크로 웰을 둘러싸듯이 실리콘 표면을 가 지는 홈 형상의 소수성 영역이 설치된 마이크로 웰 어레이 칩을 얻을 수 있다(도 16(F)).
또한, 상기 소수성 영역은 불소 함유 표면을 가지는 것일 수도 있다. 불소 함유 표면으로써는, 플루오르 카본 표면, 탄소, 불소, 수소 등에 의해 구성되는 불소 수지 표면, 플루오르 실리콘 표면 등을 들 수 있다. 불소 함유 표면을 가지는 소수성 영역은 불소계 발수제(撥水劑)를, 예를 들면 스탬프나 인쇄에 의해 도포하는 방법, 기판상에 예를 들면 에칭에 의해 홈을 설치하고, 그 홈에 불소계 발수제를 흘러 들어가게 하는 방법에 의해 설치할 수 있으며, 또는, 잉크젯법, 스프레이 코팅법에 의해 설치할 수도 있다. 또한, 상기 소수성 영역은 파릴렌(parylene)으로 대표되는 폴리파라크실렌(polyparaxylene) 수지나 실리콘 수지를 이용하여 설치할 수도 있다. 이것에 의해, 금속제 또는 수지제의 기판상에도, 소수성 영역을 설치할 수 있다.
마커의 사용방법
형광 검출기에 있어서 사용되는 여기광을 반사 구조나 요철 형상 표면에서 난반사(亂反射)시킨다. 검출기에는 통상 목적으로 하는 형광 파장 이외를 제거하는 밴드 패스 필터가 장착되어 있기 때문에, 칩 표면에서 전반사한 여기광은 검출기에는 입사(入射)하지 않는다. 그러나 난반사한 광은 초단(初段)의 밴드 패스 필터적인 성능을 가지는 미러(mirror)를 반사하여 검출기까지 도달하는 것이 가능해진다. 그래서 후단에 있는 검출기 앞의 밴드 패스 필터를 표지 인식 시에 떼어내는 것으로 난반사광이 검출기까지 입사 한다. 표지 패턴 형상은 돌기보다도 홈 형상인 것 이 인식성이 우수하다.
[제２의 태양]
이하, 본 발명의 제２의 태양에 대해서 설명한다.
마이크로 웰 어레이 칩
본 발명의 제２의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩은 기판의 한쪽 주표면에 복수 개의 마이크로 웰을 가지고, 상기 마이크로 웰은 한 개의 마이크로 웰에 한 개의 생체 세포만이 저장되는 형상 및 치수를 가지는 마이크로 웰 어레이 칩으로, 상기 마이크로 웰의 개구부에 개구부를 좁히도록 돌기부를 가진다.
상기 돌기부는 기판 표면에 설치된 막이 상기 개구부에 돌출되도록 형성되어 있을 수 있다. 단, 상기 돌기부는 이 태양으로 한정되는 것은 아니다. 상기 돌기부는 기판 표면에 설치된 막이 상기 개구부에 돌출되도록 형성되어 있는 태양에 대해서, 도 7을 기초로 이하에 설명한다.
도 7의(A) 및 (B)는 기판(11)의 표면에 막(12)이 설치되어 있으며, 또한 마이크로 웰(13)을 가지는 어레이 칩의 평면도 및 측면 단면도이다. 마이크로 웰(3)의 개구부(13a)에 돌기부는 존재하지 않는다.
그에 대해, 도 7의(C), (D) 및 (E)는 기판(11)의 표면에 막(12')이 설치되어 있으며, 또한 마이크로 웰(13)을 가지는 어레이 칩의 평면도, 측면 단면도 및 사시도이다. 마이크로 웰(13)의 개구부(13a)에는 막(12')의 일부로 형성되는 돌기부(14)가 존재한다.
또한, 도 8의(A), (B) 및 (C)에는 도 7과는 다른 제２의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩의 태양을 나타내는 평면도, 측면 단면도 및 사시도를 도시한다. 도 8의(A), (B) 및 (C)는 기판(11)의 표면에 막(12'')이 설치되어 있으며, 또한 마이크로 웰(13)을 가지는 어레이 칩으로, 마이크로 웰(13)의 개구부(13a)에는 막(12'')의 일부로 형성되는 돌기부(14')가 존재한다. 돌기부(14')로 형성되는 개구의 형상이 도 7의(E)(사각형)와 달리 원형이다.
돌기부에 의해 형성되는 개구의 형상은 도 7의 돌기부(14) 및 도 8의 돌기부(14') 이외의 형상이어도 된다. 또한, 돌기부에 의해 형성되는 개구의 크기는 마이크로 웰에 저장되어야 할 생체 세포가 통과할 수 있는 크기인 것이 적당하다.
또한, 도 9에는 마이크로 웰의 형상이 다른 제２의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩의 태양을 나타내는 측면 단면도를 도시한다.
도 9(C)는 상기 도 7 및 8과 같은 태양으로 마이크로 웰이 역사각뿔 형상인데 대해, 도 9(D)의 마이크로 웰은 사각형이고, 도 9(E)의 마이크로 웰은 반구형(半球形)이다. 단, 마이크로 웰의 형상에 특별히 제한은 없고 이들 이외의 형상이어도 된다.
마이크로 웰의 형상이나 치수에 특별히 제한은 없지만, 마이크로 웰의 형상은 예를 들면 원통형일 수 있고, 원통형 이외에 복수의 면에 의해 구성되는 다면체(예를 들면, 직방체, 육각기둥, 팔각기둥 등), 역원뿔형, 역각뿔형(역삼각뿔형, 역사각뿔형, 역오각뿔형, 역육각뿔형, 칠각 이상의 역다각뿔형) 등일 수도 있으며, 이들 형상 중 2개 이상을 조합한 형상일 수도 있다. 예를 들면, 일부가 원통형이고, 나머지가 역원뿔형일 수 있다. 또한, 역원뿔형, 역각뿔형의 경우, 저면이 마이 크로 웰의 개구가 되는데, 역원뿔형, 역각뿔형의 정상에서 일부를 잘라낸 형상인(그 경우, 마이크로 웰의 저부는 평탄해진다) 것도 가능하다. 원통형, 직방체는 마이크로 웰의 저부가 통상 평탄하지만, 곡면(볼록면이나 오목면)으로 할 수도 있다. 마이크로 웰의 저부를 곡면으로 할 수 있는 것은 역원뿔형, 역각뿔형의 정상에서 일부를 잘라낸 형상의 경우도 마찬가지이다.
마이크로 웰의 형상이나 치수는 마이크로 웰에 저장되어야 할 생체 세포의 종류(생체 세포의 형상이나 치수 등)를 고려하고, 한 개의 마이크로 웰에 한 개의 생체 세포가 저장되도록 적당히 결정된다.
한 개의 마이크로 웰에 한 개의 생체 세포가 저장되도록 하기 위해서는, 예를 들면, 마이크로 웰의 개구부에 설치된 돌기에 의해 형성되는 개구의 평면 형상에 내접하는 최대 원의 직경이 마이크로 웰에 저장하고자 하는 생체 세포 직경의 0.5～2배의 범위, 바람직하게는 0.8～1.9배의 범위, 보다 바람직하게는 0.8～1.8배의 범위인 것이 적당하다.
또한, 마이크로 웰의 깊이는 마이크로 웰에 저장하고자 하는 생체 세포 직경의 0.5～4배의 범위, 바람직하게는 0.8～1.9배의 범위, 보다 바람직하게는 0.8～1.8배의 범위인 것이 적당하다.
마이크로 웰이 원통형인 경우, 그 치수는 예를 들면 직경 3～100㎛일 수 있고, 생체 세포가 B림프구인 경우, 바람직하게는 직경 4～15㎛이다. 또한, 깊이는 예를 들면, 3～100㎛일 수 있고, 생체 세포가 B림프구인 경우, 바람직하게는 깊이 4～40㎛일 수 있다. 단, 마이크로 웰의 치수는, 상술한 바와 같이 마이크로 웰에 저장하고자 하는 생체 세포 직경과의 마이크로 웰의 치수의 적합한 비를 고려하여 적당히 결정한다.
한 개의 마이크로 웰 어레이 칩이 가지는 마이크로 웰의 수는, 특별히 제한은 없지만, 생체 세포가 림프구인 경우, 항원 특이적 림프구의 빈도가 105개에 1개에서부터 많은 경우에는 약 500개이라는 관점에서, 1㎠당 예를 들면, 2,000～1,000,000개의 범위일 수 있다.
상술한 제1의 태양과 같이, 제２의 태양에 있어서도, 마이크로 웰의 내벽 표면 형상은 세포를 원활하게 꺼내기 위해 평활한 것이 바람직하다. 그 상세한 내용에 대해서는 앞서 제1의 태양에 대해서 말한 바와 같다.
제２의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩을 구성하는 기판은 예를 들면, 실리콘, 금속 또는 수지제일 수 있다. 단, 실리콘제인 것으로, 현재 반도체 집적회로 제작 기술의 주류인 실리콘 가공 기술을 그대로 응용하는 것이 가능하고, 특히 미세 가공성, 양산성, 장래의 센서를 포함한 분석 회로와의 집적화라는 의미에서 다른 재료보다 우수하다.
기판을 구성하는 금속으로써는, 예를 들면, 알루미늄, 스테인레스, 동, 니켈, 크롬, 티탄 등을 들 수 있다.
기판을 구성하는 수지로써는, 예를 들면, 폴리이미드, 폴리에틸렌, 염화 비닐, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, 아크릴, 폴리에틸렌테레프탈레이트 등을 들 수 있다.
또한, 기판 표면에 설치된 막은 예를 들면, 산화막, 질화막, 불순물 확산층, 금속막 또는 수지막일 수 있다.
산화막으로써는 예를 들면, 산화 실리콘막, 질화 산화 실리콘막, 산화 알류미늄막, 산화 티탄막을 들 수 있다.
질화막으로써 질화 실리콘막, 질화 알루미늄막, 질화 티탄막을 들 수 있다.
불순물 확산층으로써 실리콘 기판 표면에 고농도로 붕소(boron)를 분포시킨 것을 들 수 있다.
금속막으로써는, 예를 들면, 알루미늄, 금, 백금, 스테인레스, 동, 니켈, 크롬, 티탄, 게르마늄, 실리콘 게르마늄 등을 들 수 있다.
수지막으로써는, 예를 들면, 폴리이미드, 폴리에틸렌, 염화 비닐, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, 아크릴, 폴리에틸렌테레프탈레이트 등을 들 수 있다.
기판 표면에 설치되는 막의 두께는 특별히 제한은 없지만, 예를 들면, 100 ㎚에서 5㎛의 범위이다. 바람직하게는, 300㎚에서 1㎛의 범위이다.
기판이 실리콘제인 경우, 기판 표면에 설치되는 막의 종류는 현재 주류의 집적회로 제조 기술을 그대로 응용 가능한데, 양산성, 저비용화, 신뢰성이라는 관점에서는 산화막, 질화막, 불순물 확산층인 것이 바람직하다.
또한, 기판이 실리콘제인 경우, 사진 석판술의 응용이나 에칭 선택성, 양산성 등이라는 관점에서 기판 표면에 설치되는 막은 수지제인 것이 바람직하다.
또한, 기판이 실리콘제인 경우, 사진 석판술의 응용이나 센서와의 복합화, 막의 내구성, 양산성 등이라는 점에서, 기판 표면에 설치되는 막은 금속제인 것이 바람직하다.
기판이 금속제인 경우, 에칭 선택성이나 막의 내열성, 내구성 등의 향상이라는 관점에서, 기판 표면에 설치되는 막은 금속제인 것이 바람직하다.
또한, 기판이 금속제인 경우, 사진 석판술의 응용이나 에칭 선택성 등이라는 관점에서, 기판 표면에 설치되는 막은 수지제인 것이 바람직하다.
기판이 금속제인 경우, 성막(成膜)의 용이성, 막의 내구성이나 밀착성 등의 관점에서, 기판 표면에 설치되는 막은 산화막, 질화막 등인 것이 바람직하다.
기판이 수지제인 경우, 저비용화나 공지된 다양한 성형, 가공 기술을 이용하여 제조 가능하다는 관점에서, 기판 표면에 설치되는 막은 수지제인 것이 바람직하다.
기판이 수지제인 경우, 막의 기능성, 가공성, 내구성 등의 관점에서, 기판 표면에 설치되는 막은 금속제인 것이 바람직하다.
마이크로 웰 어레이 칩의 제조방법
제２의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩은, 예를 들면, 이하의 방법에 의해 제조할 수 있다.
기판의 적어도 한쪽 주표면에 막을 형성하는 공정,
형성한 막 위에, 레지스트를 도포하는 공정,
상기 레지스트면에 마이크로 웰 패턴을 가지는 마스크를 통해 노광시키고, 레지스트의 비경화 부분을 제거하는 공정,
상기 막 및 기판의 노출부를 에칭하여 마이크로 웰 어레이 형상의 구멍을 뚫 는 공정, 및
레지스트를 제거하는 공정을 포함하는 본 발명의 제２의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩의 제조방법.
이하에, 기판이 실리콘제인 경우에 대해서 설명한다.
(1) 세정한 실리콘 기판 표면상에 열CVD, CVD등의 방법에 의해 산화막 등의 박막을 형성한다.
(2) 형성한 박막 위에 레지스트를 도포한다.
(3) 레지스트면에 마이크로 웰 패턴을 가지는 마스크를 통해 노광시키고, 레지스트의 비경화 부분을 제거한다. 즉, 사진 석판술에 의해 박막 상에 마이크로 웰 패턴을 형성하고, 실리콘 표면을 노출시킨다.
(4) 막 및 기판의 노출부를 에칭하여 마이크로 웰 어레이 형상의 구멍을 뚫는다. 에칭은, 예를 들면, 알칼리 에칭 용액(예를 들면, TMAH：테트라메틸암모늄하이드록사이드(Tetramethyl ammonium hydroxide) 등)을 이용하여 실시할 수 있다. 이때, 에칭은 기판 두께 방향과 박막 아래 방향을 향해 진행된다. 여기서 규정 시간 이상의 에칭을 실시하면, 실리콘 기판에 형성된 마이크로 웰의 입구에 박막의 차양 형상의 돌기(eave-shaped protrusions)가 형성된다.
(5) 레지스트를 제거하여 제２의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩을 얻을 수 있다.
이어서, 기판이 금속제인 경우에 대해서 설명한다.
(1) 세정한 금속 기판 표면상에 수지 또는 기판과 에칭 선택성이 있는 금속 박막을 형성하거나, 또는 금속 기판 표면을 산화 처리, 질화 처리를 하여 박막 형성을 한다.
(2) 형성한 박막 위에 포토레지스트를 도포한다.
(3) 포트레지스트 면에 마이크로 웰 패턴을 가지는 포토마스크를 통해 노광시키고, 포토레지스트의 미경화 부분을 제거한다. 즉, 사진 석판술에 의해 박막 상에 마이크로 웰 패턴을 형성하고, 기판 표면을 노출시킨다.
(4) 기판의 노출된 부분을 에칭 등의 방법으로 마이크로 웰 어레이 형상으로 구멍을 뚫는다. 이때, 에칭 수단은 적당히 선택한다.
(5) 여기서, 저부 방향으로 에칭이 진행되는 동시에 박막 직하 가로 방향도 약간 에칭되므로, 차양 구조가 형성된다.
(6) 포토레지스트를 제거하면, 제２의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩을 얻을 수 있다.
이어서, 기판이 수지제인 경우에 대해서 설명한다.
(1) 세정한 수지 기판 상에 수지 또는 금속 박막을 형성, 또는 수지 표면을 내성 향상시키는 것과 같은 개질 처리를 한다. 그 개질 처리는 예를 들면, UV처리나 개질 재료의 주입 등이다.
(2) 형성한 박막 위에 포토레지스트를 도포한다.
(3) 포토레지스트 면에 마이크로 웰 패턴을 가지는 포토마스크를 통해 노광시키고, 포토레지스트의 미경화 부분을 제거한다. 즉, 사진 석판술에 의해, 박막 상에 마이크로 웰 패턴을 형성하고, 기판 표면을 노출시킨다.
(4) 기판의 노출된 부분을 용해 등에 의한 방법으로 마이크로 웰 어레이 형상으로 구멍을 뚫는다. 이때, 에칭에 사용하는 용액은 적당히 선택한다. 또는, 기판 자체가 사진 석판술이 가능하면, 예를 들면, 마이크로 웰 패턴의 금속 박막을 마스크로 하여 UV노광, 노광 부분을 제거하는 것도 가능하다. 이때, 웰의 깊이는, UV노광량에 의해 제어할 수 있다.
(5) 여기서, 저부 방향으로 용해가 진행되는 동시에 박막 직하 가로방향도 약간 에칭되므로, 차양 구조가 형성된다.
(6) 포토레지스트를 제거하면, 제２의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩을 얻을 수 있다.
이어서, 실리콘 기판에 있어서 그 표면에 산화막을 설치했을 경우에 대해 설명한다.
(1) 세정한 실리콘 기판 상에 열산화(熱酸化), 열CVD, 플라스마(plasma)CVD 등의 방법에 의해 산화막(산화 실리콘막 등)을 형성한다.
(2) 형성한 박막 위에 포토레지스트를 도포한다.
(3) 포토레지스트 면에 마이크로 웰 패턴을 가지는 마스크를 통해 노광시키고, 포토레지스트의 미경화 부분을 제거한다. 즉, 사진 석판술에 의해 박막 상에 마이크로 웰 패턴을 형성하고, 실리콘 표면을 노출시킨다. 포토레지스트는 제거한다.
(4) 기판의 노출 부분을 에칭하여 마이크로 웰 어레이 형상으로 구멍을 뚫는다. 에칭은 예를 들면, 알칼리 에칭 용액(예를 들면, TMAH：테트라메틸암모늄하이 드록사이드 등)을 이용하여 실시할 수 있다. 이때, 에칭은 기판 두께 방향과 박막 직하 가로 방향으로 진행된다. 여기서 규정 시간 이상의 에칭을 실시하면, 실리콘 기판에 형성된 마이크로 웰의 입구에 박막의 차양 형상의 돌기가 형성된다.
(5) 이것에 의해, 제２의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩을 얻을 수 있다.
이어서, 실리콘 기판에 있어서 그 표면에 금속 박막을 설치했을 경우에 대해 설명한다.
(1) 실리콘 기판 상에 CVD, 저항 가열 증착, 스퍼터링(sputtering) 증착, 전자선 증착 등에 의해 금속 박막을 형성한다.
(2) 형성한 박막 위에 포토레지스트를 도포한다.
(3) 포토레지스트 면에 마이크로 웰 패턴을 가지는 마스크를 통해 UV노광시키고, 포토레지스트의 미경화 부분을 제거한다. 즉, 사진 석판술에 의해 박막 상에 마이크로 웰 패턴을 형성하고, 실리콘 표면을 노출시킨다. 이때, 패턴을 형성하기 위해 박막을 에칭하기 위한 방법은 적당히 선택한다. 예를 들면, 알루미늄의 경우는 인산＋질산＋초산＋물의 혼합산을 사용한다. 여기서 필요한 경우에는 포토레지스트를 제거한다.
(4) 기판의 노출 부분을 에칭하여 마이크로 웰 어레이 형상의 구멍을 뚫는다. 에칭은 예를 들면, 알칼리 에칭 용액 등을 이용하여 실시할 수 있다. 에칭 용액 등은 적당히 선택한다. 예를 들면, 알루미늄 박막에 의한 구조를 제작하는 경우는 실리콘 에칭하고, 알루미늄을 에칭하지 않는 에칭 용액(예를 들면, 히드라진(hydrazine) 수화물을 선택한다. 히드라진은 대부분의 금속을 손상시키지 않는 다)을 이용한다. 이때, 에칭은 기판 두께 방향과 박막 직하 가로 방향으로 진행된다. 여기서 규정 시간 이상의 에칭을 실시하면, 실리콘 기판에 형성된 마이크로 웰의 입구에 박막의 차양 형상의 돌기가 형성된다.
(5) 이것에 의해,제２의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩을 얻을 수 있다.
이어서, 실리콘 기판에 있어서 그 표면에 수지 박막을 설치했을 경우에 대해 설명한다.
(1) 세정한 실리콘 기판 상에 CVD, 도포, 디핑(dipping) 등의 방법에 의해 수지 박막을 형성한다.
(2) 형성한 박막 상에 포토레지스트를 도포한다. 포토레지스트 면에 마이크로 웰 패턴을 가지는 마스크를 통해 UV노광시키고, 포토레지스트의 미경화 부분을 제거한다. 즉, 사진 석판술에 의해 박막 상에 마이크로 웰 패턴을 형성하고, 실리콘 표면을 노출시킨다. 이때, 패턴을 형성하기 위해 수지 박막을 제거하기 위한 방법은 적당히 선택한다. 예를 들면, 감광성(感光性, photo-sensitivity) 폴리이미드 박막을 이용했을 경우, 도포 형성된 수지 박막 그 자체가 패턴 형성 능력을 가지므로, 포토레지스트 도포 공정을 생략하고 노광 현상 공정만으로 수지 박막의 가공이 가능하다.
(3) 기판의 노출 부분을 에칭하여 마이크로 웰 어레이 형상의 구멍을 뚫는다. 에칭은 예를 들면, 알칼리 에칭 용액 등을 이용하여 실시할 수 있다. 에칭 용액은 적당히 선택한다. 예를 들면, 폴리이미드 박막의 경우는 히드라진 수화물 또는 에틸렌 디아민 파이로카테콜(ethylene diamine pyrocatechol)을 선택할 수 있 다. 이때, 에칭은 기판 두께 방향과 박막 직하 가로 방향으로 진행된다. 여기서 규정 시간 이상의 에칭을 실시하면, 실리콘 기판에 형성된 마이크로 웰의 입구에 박막의 차양 형상의 돌기가 형성된다.
(4) 이것에 의해, 제２의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩을 얻을 수 있다.
이어서, 실리콘 기판에 있어서 그 표면에 질화 실리콘막을 설치했을 경우에 대해 설명한다.
(1) 세정한 실리콘 기판 상에 CVD, 스퍼터링 증착 등의 방법에 의해 질화 실리콘 박막을 형성한다.
(2) 형성한 박막 위에 포토레지스트를 도포한다.
(3) 포토레지스트 면에 마이크로 웰 패턴을 가지는 마스크를 통해 UV노광시키고, 포토레지스트의 미경화 부분을 제거한다. 즉, 사진 석판술에 의해 박막 상에 마이크로 웰 패턴을 형성하고, 실리콘 표면을 노출시킨다. 포토레지스트를 제거한다.
(4) 기판의 노출 부분을 에칭하여 마이크로 웰 어레이 형상의 구멍을 뚫는다. 에칭은 예를 들면, 알칼리 에칭 용액(예를 들면, TMAH：테트라메틸암모늄하이드록사이드 등)을 이용하여 실시할 수 있다. 이때, 에칭은 기판 두께 방향과 박막 직하 가로 방향으로 진행된다. 여기서 규정 시간 이상의 에칭을 실시하면, 실리콘 기판에 형성된 마이크로 웰의 입구에 박막의 차양 형상의 돌기(eave-shaped protrusions)가 형성된다.
(5) 이것에 의해, 제２의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩을 얻을 수 있다.
이어서, 실리콘 기판에 있어서 그 표면에 불순물 확산막을 설치했을 경우에 대해 설명한다.
(1) 세정한 실리콘 기판상에 포토레지스트를 도포한다.
포토레지스트 면에 마이크로 웰 패턴을 가지는 마스크를 통해 UV노광시키고, 포토레지스트의 미경화 부분을 제거한다. 즉, 사진 석판술에 의해 박막 상에 마이크로 웰 패턴을 형성하고, 웰 패턴 부분 이외의 실리콘 표면을 노출시킨다.
(2) 기판을 세정하고, 열 확산법, 이온 집어 넣기 등의 방법에 의해 실리콘이 노출된 부분에 붕소를 고농도로(～1020/㎠정도) 확산시킨다. 확산원(擴散源)은 붕소 이외에 게르마늄, 실리콘 게르마늄 등이어도 된다. 확산을 깊게 하기 위한 열처리(드라이브 인)에 의해 확산층 두께를 제어할 수 있다. 이때, 열처리노에 산소를 도입하여 표면에 산화 실리콘막을 형성한다.
(3) 웰의 에칭은 예를 들면, 알칼리 에칭 용액(예를 들면, TMAH：테트라메틸암모늄하이드록사이드 등)을 이용하여 실시할 수 있다. 이때, 붕소가 확산되지 않은 실리콘 표면은 에칭되기 쉽지만, 붕소가 고농도로 확산된 실리콘 표면은 에칭되기 어렵다. 따라서, 에칭은 붕소를 확산하고 있지 않는 웰 패턴 부분에 대해 선택적으로 진행된다. 또한, 에칭은 기판 두께 방향과 박막 직하 가로 방향으로 진행된다. 여기서 규정 시간 이상의 에칭을 실시하면, 실리콘 기판에 형성된 마이크로 웰의 입구에 박막의 차양 형상의 돌기가 형성된다.
(4) 이것에 의해, 제２의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩을 얻을 수 있다.
또한, 제２의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩은 복수 개의 마이크로 웰을 가지는 주표면 상에, 상기 복수 개의 마이크로 웰을 둘러싸듯이 설치된 소수성 영역을 가질 수도 있다. 상기 영역의 상세한 내용에 대해서는 앞서 제1의 태양에 대해 말한 바와 같다.
[제３의 태양]
이하, 본 발명의 제３의 태양에 대해서 설명한다.
마이크로 웰 어레이 칩
본 발명의 제３의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩은 복수 개의 마이크로 웰을 가지고, 각 마이크로 웰에 한 개의 피검체 생체 세포를 저장하여 이용되는 실리콘제의 마이크로 웰 어레이 칩으로, 상기 마이크로 웰은 한 개의 마이크로 웰에 한 개의 생체 세포만이 저장되는 형상 및 치수를 가진다.
상기 피검체 생체 세포는 예를 들면 림프구일 수 있으며, 본 발명의 마이크로 웰 어레이 칩은 예를 들면 항원 특이적 림프구를 한 개 단위로 검출하기 위해 이용할 수 있다.
마이크로 웰의 형상이나 치수에는 특별히 제한은 없지만, 마이크로 웰의 형상은 예를 들면 원통형일 수 있고, 원통형 이외에 복수의 면에 의해 구성되는 다면체(예를 들면, 직방체, 육각기둥, 팔각기둥 등), 역원뿔형, 역각뿔형(역삼각뿔형, 역사각뿔형, 역오각뿔형, 역육각뿔형, 칠각 이상의 역다각뿔형) 등일 수도 있으며, 이들 형상 중 두 개 이상을 조합한 형상일 수도 있다. 예를 들면, 일부가 원통형이고 나머지가 역원뿔형일 수 있다. 또한, 역원뿔형, 역각뿔형의 경우, 저면이 마이 크로 웰의 개구가 되는데, 역원뿔형, 역각뿔형의 정상에서 일부를 잘라낸 형상인(그 경우, 마이크로 웰의 저부는 평탄해진다) 것도 가능하다. 원통형, 직방체는 마이크로 웰의 저부가 통상 평탄하지만, 곡면(볼록면이나 오목면)으로 할 수도 있다. 마이크로 웰의 저부를 곡면으로 할 수 있는 것은 역원뿔형, 역각뿔형의 정상에서 일부를 잘라낸 형상의 경우도 마찬가지이다.
마이크로 웰의 형상이나 치수는, 마이크로 웰에 저장되어야 할 생체 세포의 종류(생체 세포의 형상이나 치수 등)를 고려하고, 한 개의 마이크로 웰에 한 개의 생체 세포가 저장되도록 적당히 결정된다.
한 개의 마이크로 웰에 한 개의 생체 세포가 저장되도록 하기 위해서는, 예를 들면, 마이크로 웰의 평면 형상에 내접하는 최대 원의 직경이 마이크로 웰에 저장하고자 하는 생체 세포 직경의 0.5～2배의 범위, 바람직하게는 0.8～1.9배의 범위, 보다 바람직하게는 0.8～1.8배의 범위인 것이 적당하다.
또한, 마이크로 웰의 깊이는 마이크로 웰에 저장하고자 하는 생체 세포 직경의 0.5～4배의 범위, 바람직하게는 0.8～1.9배의 범위, 보다 바람직하게는 0.8～1.8배의 범위인 것이 적당하다.
마이크로 웰이 원통형인 경우, 그 치수는 예를 들면 직경 3～100㎛일 수 있고, 생체 세포가 B림프구인 경우, 바람직하게는 직경 4～15㎛이다. 또한, 깊이는 예를 들면, 3～100㎛일 수 있고, 생체 세포가 B림프구인 경우, 바람직하게는 깊이 4～40㎛일 수 있다. 단, 마이크로 웰의 치수는, 상술한 바와 같이 마이크로 웰에 저장하고자 하는 생체 세포 직경과의 마이크로 웰의 치수의 적합한 비를 고려하여 적당히 결정한다.
한 개의 마이크로 웰 어레이 칩이 가지는 마이크로 웰의 수는, 특별히 제한은 없지만, 생체 세포가 림프구인 경우, 항원 특이적 림프구의 빈도가 105개에 1개에서부터 많은 경우에는 약 500개이라는 관점에서, 1㎠당 예를 들면, 2,000～1,000,000개의 범위일 수 있다.
상술한 제1 및 제２의 태양과 같이, 제３의 태양에 있어서도, 마이크로 웰의 내벽 표면 형상도 세포를 원활하게 꺼내기 위해 평활한 것이 바람직하다. 그 상세한 내용에 대해서는 앞서 제1의 태양에 대해 말한 바와 같다.
본 발명의 제３의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩은 실리콘제이다. 실리콘제인 것으로, 현재 반도체 집적회로 제작 기술의 주류인 실리콘 가공 기술을 그대로 응용하는 것이 가능하고, 특히 미세 가공성, 양산성, 장래의 센서를 포함한 분석 회로 등과의 집적화라는 의미에서 다른 재료보다 우수하다.
또한, 제３의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩은 실리콘제로, 기판 표면은 산화 실리콘막으로 피복되어 있는 것이 칩 표면의 친수성, 막의 안정성, 양산성이라는 관점에서 바람직하다. 실리콘 표면은 통상 소수성이고, 세포 현탁액(suspension)을 파종했을 때 세포 현탁액을 튕겨내는 성질이 있어, 마이크로 웰로의 생물 세포의 저장을 방해할 수 있는 경우가 있다. 따라서, 산화 실리콘막은 실리콘보다는 친수성이면서 안정된 막이라는 관점에서 바람직하다.
또한, 제３의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩은 마이크로 웰의 내면이 플루오 르 카본(Fluoro carbon)막 또는 산화 실리콘막으로 피복되어 있는 것이 바람직하다.
마이크로 웰의 내면이 플루오르 카본막 또는 산화 실리콘막과 같은 불활성이고 배타적인 표면을 형성하는 것으로, 생체 세포의 접착을 막을 수 있으며, 마이크로 웰로부터의 생체 세포의 회수가 용이해지므로 바람직하다.
즉, 마이크로 웰 등으로 생체 세포를 취급하는 경우, 마이크로 웰 내부에서의 생체 세포의 접착이 문제가 된다. 특히, 마이크로 웰 내의 생체 세포를 마이크로 웰로부터 회수할 때 생체 세포의 접착은 큰 문제이다. 이 문제를 해결하기 위해서, 본 발명에서는 생체 세포가 접촉하는 웰 내부에 플루오르 카본막 또는 산화 실리콘막과 같은 막을 형성하는 것이 바람직하다.
플루오르 카본막은 발수성(撥水性)을 가지는 막으로, 발수성 막의 형성은 웰 내부만인 것이 바람직하고, 마이크로 웰 어레이 칩의 웰 이외의 표면은 상술한 바와 같이 산화 실리콘막(산화 실리콘막)인 것이 바람직하다.
또한, 산화 실리콘막은 플루오르 카본막과 같은 발수성은 나타내지 않지만, 생체 세포의 접착을 방지할 수 있는 효과를 가지고 있다. 특히, 건조 산소에 의한 고온 열산화법으로 제작한 산화 실리콘막은 막이 치밀하고, 플루오르 카본막과 같은 물방울이 생길 정도의 발수성은 나타내지 않지만, 친수성과 소수성의 중간 성질을 나타낸다.
통상, 생체 세포는 용액에 분산시켜 취급하기 때문에, 마이크로 웰 어레이 칩 전체가 발수성 또는 소수성의 표면을 가지면 웰로의 생체 세포의 저장이 어려워 지는 경향이 있다. 그렇기 때문에, 본 발명에서는, 웰 이외의 표면은 산화 실리콘막을 피복하고, 웰 내부에만 선택적으로 플루오르 카본막 또는 산화 실리콘막을 형성하는 것이 바람직하다.
단, 통상의 표면 처리 방법으로 플루오르 카본막을 형성하는 경우, 웰의 제작 후에 막 형성을 실시한다. 그렇기 때문에 기판 전체가 플루오르 카본막으로 덮이고 기판 표면도 발수성이 되어 버린다. 그래서 본 발명에서는 이하의 방법을 채용한다. 이 방법에 대해서는 실리콘 기판을 이용한 마이크로 웰 어레이 칩을 예로 들어 설명한다.
실리콘 기판에 사진 석판술에 의해 마이크로 웰 패턴을 형성한다. 이 때의 포토레지스트 경화(hardening) 온도는 100℃이하로 실시한다. 이어서 건식 에칭용 진공 장치에 의해 마이크로 웰을 형성한다. 마이크로 웰이 제작된 것을 확인하면, 진공 장치 내에 CF계의 가스를 도입하여 플라스마 CVD를 실시한다. 또한, 플라스마 CVD는 에칭 장치를 그대로 사용해도, 또한 다른 케이스의 CVD 장치로 실시해도 된다. 몇 분간 성막하면, 기판을 진공 장치로부터 꺼내고, 메탄올(methanol), 아세톤 등의 유기용제에 침지(浸漬)시킨다. 이것에 의해 마이크로 웰 패턴 마스크와 함께 그 위의 플루오르 카본막도 리프트 오프(lift off)되어 마이크로 웰 내벽에만 플루오르 카본막이 남겨진다. 에칭과 성막 공정은 가스 종류를 변경하는 것만으로 같은 장치로 대응이 가능하다.
플루오르 카본막 대신에 웰 내면을 상술한 바와 같이 실리콘 산화막으로 피복해도 된다. 플루오르 카본막 대신에 웰 내면을 실리콘 산화막으로 피복 해도, 웰 로부터의 생체 세포의 회수율의 개선 효과는 얻을 수 있다.
웰 내면을 실리콘 산화막으로 피복하는 방법에 대해 이하에 설명한다.
이 경우, 웰 패턴 형성 후에 포토레지스트를 제거하고, 열산화막 등을 형성하면, 웰 내면을 실리콘 산화막으로 피복한 마이크로 웰 어레이 칩을 얻을 수 있다.
또한, 플루오르 카본막 또는 실리콘 산화막 대신에, 웰 내부에 다공질(porous) 실리콘을 형성하는 것에 의해서도 웰 내면으로의 생체 세포의 접착 억제 효과를 가지는 마이크로 웰 어레이 칩을 얻을 수 있다. 다공질 실리콘은 웰 내면을 양극 화성법(anodizing) 등의 방법으로 제작할 수 있다.
플루오르 카본막, 실리콘 산화막, 다공질 실리콘 이외에도 본 발명의 마이크로 웰 어레이 칩에 활성인 실리콘 표면을 억제하는 처리를 가하거나 또는 막을 형성할 수도 있다.
또한, 제３의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩은 복수 개의 마이크로 웰을 가지는 면 위에, 상기 복수 개의 마이크로 웰을 둘러싸듯이 설치된 소수성 영역을 가질 수도 있다. 상기 소수성 영역의 상세한 내용에 대해서는 앞서 제1의 태양에 대해 말한 바와 같다. 또한, 앞서 말한 바와 같이, 제３의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩에 있어서, 마이크로 웰 내면을 플루오르 카본막으로 피복할 때, 상기 영역도 아울러 플루오르 카본막으로 피복하는 것으로 소수성 영역을 형성할 수도 있다.
실시예
실시예 1
(형광 마커)
도 1은 본 발명의 제1의 태양에 따른 장치(device)의 실시형태예이다.
도 1은 실리콘 재료 등의 기판 윗면(1a)에 다수의 마이크로 웰(1b)이 형성된 마이크로 웰 어레이 칩이다. 마이크로 웰(1b)은 위치 인식을 용이하게 하기 위해 적당한 수(예를 들면, 10×10：100개) 단위로 클러스터(cluster)(1c)를 형성하고 있다. 본 마이크로 웰 어레이 칩의 용도 중 하나로써, 각 웰에 형광체를 부가한 평가 대상물을 도입, 그 형광 발광의 확인이 있다. 이때, 형광 현미경, 형광 스캐너 등에 의한 관찰은 형광 파장에 준한 방법으로 실시되기 때문에, 형광 발광하지 않는 것은 관찰할 수 없다. 거기서, 도 1에서 도시하는 바와 같이, 각 클러스터 간에 형광 물질에 의한 미소한 마커(1d)가 형성되어 있다.
본 마커의 제작 방법은 이하와 같다(도 2).
예로써, 실리콘 재료 등의 기판에 형성되는 마이크로 웰에 대해 그 제작 방법을 2대로 나타낸다.
마커 제작법(Ⅰ)
(1) 산화 실리콘막(2a)이 붙은 실리콘 기판(2b)(도 2(Ⅰ)(A))에 예를 들면 도쿄 오카 공업(주) 노볼락 수지계 포지티브형 포토레지스트 OFPR-800을 도포하여 마커 패턴(2c)을 기판 상에 형성한다(도 2(Ⅰ)(B)).
(2) 열가교(熱架橋) 등에 의한 포토레지스트의 내약품성(耐藥品性) 향상을 위해, 180℃에서 30분간 기판을 경화(hardening)시키는 등의 처리를 실시한다.
(3) 다시 한번 포토레지스트(2d)를 도포하여 마이크로 웰을 제작하기 위해 필요한 개구 패턴(2e)을 실리콘 기판(2b) 상에 형성한다(도 2(Ⅰ)(C) 및 (D)). 이때, 현상 후의 경화는 100～110℃정도의 저온에서 실시한다.
(4) 불화수소산(Hydrofluoic Acid)으로 개구부의 산화 실리콘막(2a)을 제거하여 실리콘을 노출시킨다.
(5) 건식 에칭법 등에 의해 실리콘 기판(2b)을 에칭하여 마이크로 웰(2f)을 제작한다(도 2(Ⅰ)(E)).
(6) (3)에서 도포한 포토레지스트(2d)를 메탄올, 아세톤 등으로 제거하고, 제1의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩을 얻는다(도 2(Ⅰ)(F)).
마커 제작법(Ⅱ)
(1) 산화 실리콘막(2a)이 붙은 실리콘 기판(2b)(도 2(Ⅱ)(A))에 예를 들면 도쿄 오카 공업(주) 노볼락 수지계 포지티브형 포토레지스트 OFPR-800을 도포하여 마커 패턴(2c)을 기판 상에 형성한다(도 2(Ⅱ)(B)).
(2) 열가교 등에 의한 포토레지스트의 내약품성 향상을 위해, 180℃에서 30분간 기판을 어닐(anneal)하는 등의 처리를 실시한다.
(3) 다시 한번 포토레지스트(2d)를 도포하여 마이크로 웰을 제작하기 위해 필요한 개구 패턴(2e)을 실리콘 기판(2b) 상에 형성한다(도 2(Ⅱ)(C) 및(D)). 이때, 현상 후의 열처리는 100～110℃정도의 저온에서 실시한다.
(4) 불화수소산으로 개구부의 산화 실리콘막(2a)을 제거하여 실리콘을 노출시킨다(도 2(Ⅱ)(E)).
(5) 여기서 웰 패턴을 형성하는 포토레지스트를 아세톤 등의 유기용제로 제 거한다.
(6) 실리콘 기판(2b) 상의 산화 실리콘막(2a)을 마스크로 하고, 건식 에칭법 등의 방법으로 실리콘 기판(2b)을 에칭하여 마이크로 웰(2f)을 제작하는 것에 의해, 제1의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩을 얻는다(도 2(Ⅱ)(F)).
또한, 마커 제작법(Ⅱ)에 의하면, 웰 형성 후의 포토레지스트 제거 시에 건식 에칭 공정에서 포토레지스트가 변성하여 제거하는 것이 어려워지는 것과 같은 일은 없다. 또한, 형성된 실리콘 기판 표면은 플라스마 효과에 의해 그대로의 상태로 초친수성(超親水性) 표면을 얻을 수 있게 된다.
이상의 공정에 의해 도 2와 같은 형상을 용이하게 제작할 수 있다. 마커(2c)의 패턴은 디자인, 기호, 문자 등 자유롭게 선택하는 것이 가능하다. 또한, 마커 이외에 마이크로칩 상에 정보 등을 표시하는 것도 가능하다.
실시예 2
(반사 마커)
도 3은 실리콘 기판(3a) 상에 요철을 형성하여 그 산란광을 상기와 동일한 형광 현미경, 형광 스캐너에 의해 관찰 가능하게 하는 반사 마커(3d)의 실시형태이다. 실리콘 기판(3a) 상에 다수 배열된 마이크로 웰(3b)의 클러스터의 위치 인식 등의 마커 등에 사용된다. 기판 상에 에칭 등에 의해 홈(3e)을 제작하는 것으로, 형광 여기광(勵起光)을 홈에서 난반사시켜 관찰 장치에 도입시키는 것으로 그 홈 위치를 인식할 수 있도록 하는 것이다.
도 4에 그 원리를 도시한다. 도 좌측과 같은 요철 등, 아무것도 없는 기 판(4a) 표면에 부딪혔을 경우에는 전면 반사에 의해 관찰 장치로의 여기광의 입사가 없다. 그러나 우측과 같이 홈(4b)에 의해 여기광을 방사형(a radial shape)으로 산란시키면, 관찰 장치의 광학계에 반사광이 입사되어 인식할 수 있게 된다.
여기광을 방사형으로 산란시킨다는 관점에서, 홈(4b)의 저부는 역피라미드 형상인 것이 바람직하다.
반사 마커를 가지는 마이크로 웰 어레이 칩의 제조예를, 기판을 실리콘으로 했을 경우에 대해서 도 5 및 6에 근거하여 설명한다.
(1) 산화 실리콘막(5a)이 붙은 실리콘 기판(5b)(도 5(A))에 예를 들면 도쿄 오카 공업(주) 노볼락 수지계 포지티브형 포토레지스트 OFPR-800(5c)를 도포하여 마커 패턴(5d)을 기판 상에 형성한다(도 5(B)).
(2) 불화수소산으로 포토레지스트(5c)로부터 개구되어 있는 산화 실리콘막(5a)을 제거하여 실리콘을 노출시킨다(도 5(C)).
(3) 포토레지스트(5c)를 제거하고, 실리콘 기판(5b)을 수산화테트라메틸 암모늄이나 수산화 칼륨 등의 알칼리 에칭액에 담가 이방성 에칭을 실시하여 홈 구조(5e)를 제작한다(도 5(D)). 이 시점에서 본 발명에 의한 마커는 완성된다. 그 후, 마이크로 웰 어레이 구조를 제작한다.
(4) 여기서 필요한 경우에는 산화 실리콘막이나 질화 실리콘막 등의 마스크 박막을 다시 기판(5b) 표면에 추가 형성한다(도 6(A)).
(5) 다시 포토레지스트(5f)를 도포하여(도 6(B)) 마이크로 웰 패턴(5g)을 형성하고, 개구부의 산화 실리콘막 또는 질화 실리콘막 등을 에칭액으로 제거하여 실 리콘을 노출시킨다(도 6(C)).
(6) 필요에 따라 포토레지스트(5f)를 제거하고, 건식 에칭(dry etching), 습식 에칭(wet etching)에 의해 마이크로 웰(5h)을 제작한다(도 6(D)).
(7) 필요하면 포토레지스트(5f)를 제거하여 제1의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩을 얻었다(도 6(E)).
실시예 3(차양 구조 실시예)
도 7에 본 발명의 제２의 태양에 의해 제작된 마이크로 웰 구조를 도시한다.
본 구조는 반도체 기판, 수지 기판 등과의 가공시에 있어서의 윗면 박막과의 재료 가공 용이성의 선택성이 있으면 실현 가능하다. (100)면 실리콘 기판(11) 표면 상에 형성되는 마이크로 웰(13)은 개구 지름, 깊이가 모두 수 미크론(micron)～수십 미크론이다. 웰이 형성되어 있지 않은 표면은 산화막이나 금속 등의 박막층(12')에 덮여져 있다. 기판을 에칭하는 것으로 형성되는 웰의 개구부(13a)에는 박막층(12')에 의한 차양 형상의 돌기부(14)가 부속되어 있다. 박막층(12')의 두께는 수백 나노미터(nanometer)에서부터 수 미크론으로 형성시에 제어되고 있다. 박막층(12')에 의해 형성되는 차양 형상의 돌기부(14)는 마이크로 웰(13)을 에칭 형성할 때, 박막층(12')이 별로 에칭되지 않으면서, 기판에 대해서도 박막층(12')의 하부까지 에칭하는 것 같은 에칭 수법에 의해 실현된다.
본 실시예에서는, 예를 들면 대표적인 반도체 기판인 실리콘을 이용하여 그 제작 과정을 도 9에서 설명한다.
(1) (100) 실리콘 기판(11)을 열산화하고, 표면에～수 ㎛정도의 박막층(12) 을 형성한다.［도 9(A)］
(2) 사진 석판술 공정에서 웰 패턴(15)을 실리콘 기판(11)에 전사, 웰 부분만 실리콘을 노출시킨다.［도 9(B)］
(3) 수산화 테트라 메틸 암모늄 수용액(90℃, 25％) 속에 실리콘을 수십 분간 담가 에칭을 실시한다. 에칭 시간은 원하는 웰의 깊이(d)와 차양의 크기(w)에 의해 결정된다. [도 8(B)]
(4) 규정된 시간 에칭하면, 에칭 용액으로부터 실리콘 기판을 꺼낸다.
이상의 공정을 거쳐 도 9(C)의 구조가 형성 가능하다. 여기서 이용된 수산화 테트라 메틸 암모늄 수용액은 산화막의 에칭이 늦고 웰 측면 방향의 에칭이 진행되기 때문에, 산화막 아래의 중공(中空, hollowness) 구조를 가능하게 한다.
또한, 제２의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩은 도 9(D) 및 (E)의 구조의 것이어도 된다. 도 9(D) 및 (E)의 구조의 마이크로 웰을 가지는 어레이 칩은 상기 방법을 이하와 같이 변경하는 것으로 형성할 수 있다.
예를 들면, 실리콘 기판을 선택했을 경우, 도 9(D)는 RIE 건식 에칭이나 기판면 방위(方位)나 웰 패턴을 적당히 선택하는 것으로 실현된다. 예를 들면, 기판면 방위를(100)이나 (110), (111)면으로 하고, 기판 표면에 대해 수직인 에칭면이 나타나는 것 같은 패턴 형상을 선택하는 것으로 가능하다. 도 9(E)는 등방성(等方性, isotrope) 에칭 특성을 나타내는 에칭 방법에 의해 실현된다. 예를 들면, 통상의 건식 에칭이나 불화수소산과 질산의 혼합액에 의한 에칭에서는 실리콘이 등방적으로 에칭되기 때문에, 본 발명의 제２의 태양의 구조를 용이하게 얻을 수 있다.
또한, 박막층은 산화막으로 한정하지 않고, 고농도 불순물 확산된 실리콘, 게르마늄, 실리콘 게르마늄, 금속 박막, 수지 등으로의 변경이 가능하다. 또한, 에칭은 습식 에칭, 건식 에칭 등의 어느 것이라도 상관없다. 습식 에칭에 있어서는 기판을 일괄적으로 처리하는 것이 가능하므로, 제품 양산 효율이 우수하다.
상기 방법으로 얻을 수 있는 마이크로 웰 어레이 칩의 각 치수(도 10에 도시한다)를 표 1에 기재한 바와 같이 변경하였을 때의 마이크로 웰 어레이 칩 어레이율(충전율)을 평가했다. 결과를 표 1로 나타낸다. 파종한 세포 농도는 105cells/㎕이다.
세포 어레이율(충전율) 평가방법
1. 마우스로부터 림프구를 채취한다. 이때, 얻을 수 있는 세포의 농도는 1마이크로 리터당 104～105세포(104～105cells/㎕)이다. 세포는 보존하기 위해 HBSS(Hanks' balanced salt solution)에 넣어 둔다.
2. 각 세포에 형광 염색을 실시한다. 각 세포를 측정에 사용하는 형광 스캐너의 여기 파장(532㎚)에 대해 형광을 발하는 셀트랙커 오렌지(CellTracker　Orange)로 염색을 실시한다.
3. 염색한 세포를 마이크로 피펫(pipette)으로 실리콘 칩 상에 파종한다. 파종은 3회 반복하고, 마지막에 웰에 들어가지 않은 세포를 세정에 의해 제거한다.
4. 칩이 건조하지 않도록 커버 글래스(cover glass)로 덮고, 마이크로 어레이 스캐너로 형광 강도를 읽어낸다.
5. 칩 상의 4500웰을 선택하고, 그 중 형광 발광하고 있는 웰의 수를 센다. 어레이율(충전율)은 이하의 식으로 산출한다.
어레이율(충전율)=(형광을 발하고 있는 웰수/4500)×100
샘플의 차양 및 웰의 치수와 어레이(충전)율과의 관계
d p 2r W1 W2 어레이(충전) 율

샘플 A
9.2㎛
13.0㎛
12㎛
0.5㎛
2.7㎛
～73％

샘플 B
11.8㎛
16.7㎛
13.9㎛
1.4㎛
5.0㎛
～24.9％
샘플 A 및 B에 대해서, 차양 및 웰 치수의 차이에 의한 어레이(충전) 율이 어떻게 변화하는지를 검토했다. 그 결과, 세포가 직경 8㎛인 경우, 샘플 B의 어레이(충전)율은 샘플 A의 어레이(충전)율보다 뒤떨어지고 있었다. 이것은 샘플 B의 개구 지름 2r이 너무 크기 때문이라고 생각된다.
또한, 어레이(충전)율은 웰의 깊이가 깊을수록 향상되지만, 샘플 B와 같이 개구가 크면 어레이(충전)율이 감소하는 경향을 볼 수 있다. 따라서, 웰의 설계는 그 깊이, 개구 지름, 차양 치수를 적당히 선택하여 실시하는 것이 적당하다.
실시예 4
(플루오르 카본막 형성 실시예)
도 11은 본 발명의 제３ 태양에 따른 마이크로 웰 어레이 칩의 개략 설명도이다.
실리콘 기판(21a) 표면 상에 마이크로 웰 패턴(21b)을 다수 배열하는데, 그 각 마이크로 웰(21b)의 사이즈는 수 미크론에서부터 수십 미크론이다. 형성된 각 웰 측벽에는 CxFy계 가스에 의해 형성된 플루오르 카본막(21c)이 형성되고 있고, 표면 에너지 저하 효과에 의해 불활성 상태가 되어 있다. 소수성을 나타내는 플루오르 카본막(21c)은 마이크로 웰 내부에 선택적으로 성막되어 있고 실리콘 최표면(21d)에는 존재하지 않는다. 이것에 의해, 마이크로 웰(21b)에 들어간 생체 세포 A는 용이하게 접착하기 어려워진다. 마이크로 웰 내부에 플루오르 카본막을 설치하는 효과는 마이크로 웰이 깊을 때 특히 현저하게 나타난다.
실리콘 기판을 사용한 마이크로 웰 어레이 칩의 제작 공정을 도 12로 도시한다.
(1) 산화 실리콘막(22a)이 형성된 실리콘 기판(22b)에 예를 들면 도쿄 오카 공업(주) 노볼락 수지계 포지티브형 포토레지스트 OFPR-800(22c)를 도포하여 마이크로 웰 패턴(22d)을 형성한다. 이때, 현상 후의 열처리는 통상보다 저온(100에서 110℃정도)에서 실시한다.
(2) 플라스마 건식 에칭 장치에 SF6 등의 실리콘 에칭 가스를 도입하는 것에 의해, 실리콘 기판(22b)을 에칭하여 마이크로 웰(22e)을 형성한다.
(3) 상기 에칭 장치에 CxFy계 가스를 도입하여 플라스마 성막을 실시한다. 이 시점에서 웰 내부, 실리콘 기판 표면 상에 플루오르 카본막(22f)이 형성된다. 이 공정은 플라스마 CVD 장치 등에 기판을 반송하여 동일한 처리를 해도 된다.
(4) 장치에서 꺼낸 기판을 메탄올 또는 아세톤 등의 유기용제에 담가 포토레지스트를 제거한다. 이때 레지스트 상에 형성된 플루오르 카본막도 함께 리프트 오프된다.
(5) 실리콘 기판 최표면은 산화 실리콘막(22a), 웰 내부는 불활성 플루오르 카본막(22f)이 형성된 마이크로 웰 어레이 칩을 얻을 수 있다.
상기 방법으로 얻어진 마이크로 웰 어레이 칩에 대해, 실시예 3과 같은 방법으로 어레이율(충전율)을 평가했다. 채취율은 하기 방법에 의해 평가했다. 결과를 표 2로 나타낸다. 표 2에는 웰 내부에 플루오르 카본막이 형성되어 있지 않은 마이크로 웰 어레이 칩의 평가 결과도 나타낸다. 어떠한 샘플에 대해서도 웰 지름 및 깊이는 같은 것을 선택했다. 또한, 파종한 세포 농도는 105cells/㎕이다.
채취율 평가방법
1. 상기 세포 어레이율 평가법에 근거하여 세포를 마이크로 웰 어레이에 파종한다.
2. 임의의 복수 개(10～30개 정도)의 웰을 선택하여, 마이크로 매니퓰레이터(manipulator)로 세포를 웰에서 꺼낸다. 이때, 적극적으로 꺼내거나 하지 않고, 각 웰에 대한 꺼냄 조건이 불규칙적으로 분포하지 않도록 주의한다.
3. 임의적으로 선택한 웰의 수에 대해, 세포를 꺼낼 수 있었던 웰 수의 비율을 채취율로써 나타낸다.
채취율=(세포를 꺼낼 수 있었던 웰의 수/임의적으로 선택한 웰의 수)×100
샘플 A B C D E F

어레이(충전)율
99.4％
99.2％
99.2％
99.4％
99.3％
98.9％

채취율
0％
10％
6.7％
50％
30％
89.3％
샘플 사양：웰 지름　11㎛, 깊이　30㎛
샘플 A～C：코팅 없음, 에칭 시간：8min
샘플 D～F：코팅 있음, 에칭 시간：8min＋코팅 시간：1min
실시예 5
웰 내에 산화막(산화 실리콘)을 가지는 마이크로 웰 어레이 칩의 제작(도 13 참조)
(1) 산화 실리콘(23a)이 형성된 실리콘 기판(23b)에 예를 들면 도쿄 오카 공업(주) 노볼락 수지계 포지티브형 레지스트 OFPR-800을 도포하여 마이크로 웰 패턴(23d)을 형성한다.
(2) 플라스마 건식 에칭 장치에 SF6 등의 실리콘 에칭 가스를 도입하는 것에 의해, 실리콘 기판(23b)을 에칭하여 마이크로 웰(23e)을 형성한다.
(3) 장치에서 꺼낸 기판을 황산과 과산화 수소수의 혼합액 등의 레지스트 박리액으로 기판 상의 포토레지스트를 제거한다.
(4) 이른바 RCA 세정인 암모니아 세정(암모니아＋과산화 수소수＋물), 염산 세정(염산＋과산화 수소수＋물)으로 기판을 세정한다.
(5) 건조 산소 분위기 중의 열처리노에 도입하고, 1100℃에서 30분간 열산화 처리를 실시한다.
(6) 온도가 내리면, 열처리노에서 꺼낸다.
(7) 여기서 실리콘 기판 표면, 웰 내에 산화막(23f)을 형성할 수 있고, 웰 내에 산화막(산화 실리콘)을 가지는 마이크로 웰 어레이 칩을 제작할 수 있다.
상기 방법으로 얻어진 마이크로 웰 어레이 칩에 대해, 상기와 동일한 방법으로 어레이율(충전율) 및 채취율을 평가했다. 결과를 표 3으로 나타낸다. 어떠한 샘플에 대해서도 웰 지름 및 깊이는 같은 것을 선택했다. 또한, 파종한 세포 농도는 105cells/㎕이다.
샘플 A B C D E F

어레이(충전)율
99.4％
99.2％
99.2％
91.6％
98.4％
98.5％

채취율
0％
10％
6.7％
45％
30％
55.6％
샘플 사양：웰 지름　11㎛,　깊이　30㎛
샘플 A～C：산화막 없음. 에칭 시간：8min
샘플 D～F：산화막 있음. 에칭 시간：8min,　산화 온도：1100℃,　산화 분위기：건조 산소,　산화 시간　30min,　산화 막두께：63㎚(실리콘 결정면(100) 위)
실시예 6
(평활화 처리)
실시예 4에서의 제작에 있어서, 마이크로 웰 어레이 칩의 내벽에 평활화 처리를 가한 후에 플루오르 카본막을 형성했다. 평활화 처리는 STS사 Multiplex ASE 에칭 장치를 이용하여, 에칭 공정과 보호막 형성 공정의 처리(process) 주기 시간을 조정하는 것에 의해 실시하였다. 이와 같이 하여, 내벽에 높이 0.5㎛의 요철과 높이 0.1㎛의 요철을 가지는 2종류의 마이크로 웰 어레이 칩을 제작했다. 내벽에 높이 0.1㎛의 요철을 가지는 마이크로 웰의 확대 사진을 도 17로 도시한다.
상기 방법으로 얻어진 마이크로 웰 어레이 칩에 대해, 상기와 동일한 방법으로 채취율을 평가했다. 결과를 표 4로 나타낸다. 파종한 세포 농도는 105cell/㎕이다. 파종 직후에서는 양 칩의 채취율에 큰 차이는 없었다. 그러나 파종 후 1시간이 경과하자, 평활화 처리에 의해 높이 0.5㎛의 요철을 설치한 칩에서는 채취율이 0％로 저하한 것에 대해, 평활화 처리에 의해 높이 0.1㎛의 요철을 설치한 칩은 파종 직후의 채취율을 거의 유지하고 있었다. 이것은 내벽의 요철 높이를 작게 하는 것이 시간 경과에 의해 일어나는 웰로의 세포접착을 억제한다는 것을 나타내고 있다. 또한, 내벽의 평활화에 의해 실시예 4의 코팅이 효율적으로 기능하고 있는 것으로 생각된다.
요철 높이 0.5㎛ 요철 높이 0.1㎛

파종 직후의 채취율
80％
100％

파종 1시간 후의 채취율
0％
90％
실시예 7
(개구부 돌기 형성)
실시예 4에서의 제작에 있어서, 마이크로 웰 개구부에 높이 0.6㎛의 돌기부를 형성했다. STS사 Multiplex ASE 에칭 장치를 이용하여 에칭 초기에 있어서의 상기 장치의 처리(process) 주기 시간을 길게 하는 것에 의해, 원하는 높이의 돌기를 형성할 수 있었고, 또한, 돌기 형성 후, 처리 주기 시간을 조정하는 것으로, 개구부에만 돌기를 가지는 마이크로 웰을 제작할 수 있었다. 개구부에 돌기를 형성한 마이크로 웰의 확대 사진을 도 18로 도시한다.
또한, 본 마이크로 웰 제작 후에 내벽에 플루오르 카본막을 형성하는 것도 가능하다. 또한, 돌기를 임의의 위치에 형성하는 것도 가능하다. 돌기를 형성하고 싶은 위치에서 처리 주기 시간을 조정하는 것으로, 마이크로 웰 중간, 저면 등과 같은 임의의 위치에도 제작할 수 있다. 또한, 그 형상이나 수량을 적당히 선택하는 것으로, 다양한 효과를 기대할 수 있다.
본 발명의 제1의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩은 목표로 하는 위치에 형광 물질 또는 반사 구조체 등의 마커를 가지는데, 이 마커는 위치 결정을 위한 마커로써 기능하기 때문에, 이것에 의해 형광 현미경 등에 의한 위치 인식을 보조할 수 있다. 제1의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩으로는 예를 들면, 형광 현미경이나 이미지 스캐너 등에 의해 마이크로 웰의 위치를 용이하게 결정할 수 있으며, 그 결과, 각 마이크로 웰에 저장된 특정의 1개의 피검체 생체 세포, 예를 들면, 항원 특이적 림프구를 특정하는 것이 용이해진다. 그 결과, 예를 들면, 검출된 항원 특이적 림프구를 꺼내 항원 특이적 항체 유전자나 T세포 수용체 유전자를 클로닝(cloning)하는 것도 가능해진다. 예를 들어, 항원 특이적 항체 유전자를 클로닝 할 수 있으면, 그것을 이용하여 대량으로 인간형 단일 클론(monoclonal) 항체를 생산할 수 있다. 이 항체를 감염증 등의 환자에게 투여하는 것에 의해, 감염증 등의 치료, 예방에 이용할 수 있다고 생각된다. 또한, 제1의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩을 이용하는 것으로, 혈중 세포의 분별을 실시할 수도 있다. 즉, 마이크로 웰 지름을 소정의 값으로 설정하는 것으로, 혈중 세포를 마이크로 웰 지름을 초과하는 것과 밑도는 것으로 분별할 수도 있다.
본 발명의 제２의 태양에 따르면, 한 번 웰 내에 들어간 세포는 웰 윗면의 돌기(차양)에 걸리기 때문에, 세정시에 웰 밖으로 유실되지 않고 웰 내에 높은 확률로 고정될 수 있다. 예를 들면, 웰이 역피라미드 구조인 경우, 차양을 형성하는 것으로 칩 표면 및 웰 내부의 유체(流體, a fluid) 분포가 바뀌기 때문에, 세정 등과 같은 시에 한 번 들어간 세포가 유체와 함께 흘러나오지 않도록 할 수 있다. 또한, 한 번 웰에 들어간 세포는 다시 웰 밖으로 나오려고 해도 차양에 걸려 웰에 고정되기 쉬워진다.
또한, 웰에 들어간 세포를 꺼낼 때도 웰 형상을 고안하는 것으로 흡인 시에 생기는 세포와 웰 표면의 부압 발생을 억제하는 것이 가능해진다. 즉, 웰 형상을 역피라미드 구조로 하면, 능선 부분이 압력 축출 기능을 가지게 되어 세포를 흡인했을 때 웰과 세포 간이 진공이 되지 않도록 할 수 있어 세포의 채취를 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 제３의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩은 각 마이크로 웰이 림프구와 같은 피검체 생체 세포를 1개만 포함할 수 있는데, 그것에 의해 예를 들면, 항 원 특이적 림프구를 1개 1개의 세포 레벨로 특정하는 것이 가능해진다. 즉, 제３의 태양의 마이크로 웰 어레이 칩을 이용하는 것으로, 항원 특이적 림프구의 검출에 있어서는, 마이크로 웰에 포함되는 피검체 림프구가 1개인 것으로부터 항원에 반응하는 피검체 림프구를 1개의 세포로써 특정할 수 있다.
그 결과, 예를 들면, 검출된 항원 특이적 림프구를 꺼내 항원 특이적 항체 유전자나 T세포 수용체 유전자를 클로닝하는 것도 가능해진다. 예를 들어, 항원 특이적 항체 유전자를 클로닝할 수 있으면, 그것을 이용하여 대량으로 인간형 단일 클론 항체를 생산할 수 있다. 이 항체를 감염증 등의 환자에게 투여하는 것에 의해, 감염증 등의 치료, 예방에 이용할 수 있다고 생각된다.

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  23. 복수 개의 마이크로 웰을 가지는, 실리콘제의 마이크로 웰 어레이 칩으로서, 각 마이크로 웰은 한 개의 피검체(被檢體) 생체 세포를 저장하고 그리고 저장된 한 개의 피검체 생체 세포를 마이크로 웰로부터 회수하기 위하여 사용되는 것이며,
    상기 각 마이크로 웰은 3～100㎛의 직경을 가지고, 그리고 상기 마이크로 웰의 평면 형상에 내접하는 최대 원의 직경이 마이크로 웰에 저장하고자 하는 생체 세포 직경의 0.5～2배의 범위에 있고,
    상기 마이크로 웰의 내면은 플루오르카본(Fluorocarbon) 막으로 피복되어 상기 마이크로 웰의 내면이 생체 세포의 응집을 방지하고 마이크로 웰로부터 저장된 생체 세포의 회수를 용이하게 하는 것인, 마이크로 웰 어레이 칩.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 마이크로 웰이 원통형, 복수의 면에 의해 구성되는 다면체, 역원뿔형 또는 역각뿔형, 또는 이들 중 2개 이상을 조합한 형상인 것을 특징으로 하는 마이크로 웰 어레이 칩.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서,
    마이크로 웰의 깊이는 마이크로 웰에 저장하고자 하는 생체 세포 직경의 0.5～4배의 범위인 것을 특징으로 하는 마이크로 웰 어레이 칩.
  26. 제23항 또는 제24항에 있어서,
    상기 생체 세포가 림프구이고, 항원 특이적 림프구를 한 개 단위로 검출하기 위해 이용되는 마이크로 웰 어레이 칩인 것을 특징으로 하는 마이크로 웰 어레이 칩.
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  29. 제23항 또는 제24항에 있어서,
    상기 복수 개의 마이크로 웰을 가지는 면 위에, 복수 개의 마이크로 웰을 둘러싸는 소수성 영역을 가지는 것을 특징으로 하는 마이크로 웰 어레이 칩.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 소수성 영역은 실리콘 표면 또는 불소 함유 표면을 가지는 것을 특징으로 하는 마이크로 웰 어레이 칩.
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