CN102928584B - 微孔阵列芯片及其制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种微孔阵列芯片，该微孔阵列芯片在基板的一侧主表面上具有多个微孔，上述微孔具有在一个微孔中仅可容纳一个生物体细胞的形状和尺寸，在与微孔的开口相同的基板表面上具有微孔的标记。还涉及一种微孔阵列芯片，该微孔阵列芯片在基板的一侧主表面上具有多个微孔，上述微孔具有在一个微孔中仅可容纳一个生物体细胞的形状和尺寸，上述微孔的开口部具有突起部，使开口部变狭窄。又涉及上述微孔阵列芯片的制造方法，该方法具有以下步骤：在基板的至少一侧主表面上形成膜的步骤；在形成的膜上涂布抗蚀剂的步骤；经由具有微孔图案的掩模，对上述抗蚀剂面进行曝光，除去抗蚀剂的非硬化部分的步骤；蚀刻上述膜和基板的暴露部分，打微孔阵列形状的孔的步骤；以及除去抗蚀剂的步骤。还涉及一种微孔阵列芯片，该微孔阵列芯片具有多个微孔，是用于在各微孔中容纳1个被检生物体细胞的硅制微孔阵列芯片。上述微孔具有在一个微孔中仅可容纳1个生物体细胞的形状和尺寸。

Description

微孔阵列芯片及其制造方法
本申请是申请日为2004年9月22日，申请号为200480034519.6的、发明名称和本发明相同的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明的第一方案涉及可用于抗原特异性淋巴细胞等生物体细胞的检测等的微孔阵列芯片。本发明的第一方案特别涉及可容易地进行微孔定位的微孔阵列芯片(Microwell Array Chip)。
本发明的第二方案涉及微孔对生物体细胞的捕集率和收集率均优异的微孔阵列芯片及其制造方法。
本发明的第三方案涉及可用于抗原特异性淋巴细胞等生物体细胞的检测等的硅制微孔阵列芯片。本发明的第三方案特别涉及根据需要，可容易地将容纳在微孔中的生物体细胞进行回收的微孔阵列芯片。
背景技术
以往，抗原特异性淋巴细胞通过例如使用96孔板，每孔加入约200,000个淋巴细胞，在抗原存在下培养3天至一周，由此进行检测(“リンパ球机能检索法”矢野纯一、藤原道夫编著，中外医学社(1994年)；“免疫实验操作法I、II”右田俊介、绀田进、本庶佑、滨冈利之编集，南江堂(1995年))。该方法中，可确认约200,000个淋巴细胞群中存在抗原特异性淋巴细胞。但是无法鉴定存在于淋巴细胞群中的各抗原特异性淋巴细胞。
对于此，近年来人们开发利用了通过将用荧光染料标记的抗原分子与淋巴细胞混合，来使荧光标记抗原与抗原特异性淋巴细胞的抗原受体结合，再使用流式细胞仪检测结合有荧光标记抗原的淋巴细胞的方法(Altman JD，Moss PA，Goulder PJ，Barouch DH，McHeyzer-Williams MG，Bell JI，McMichael AJ，Davis MM.Phenotypic analysis ofantigen-specific T lymphocytes(抗原特异性T淋巴细胞的表型分析)，Science，274：94-96，1996)。该方法可以鉴定与抗原结合的1个淋巴细胞。还可以分选1个与抗原结合的淋巴细胞。
但是，上述检测方法中，为了分选，必须有细胞分选仪这样高价且复杂的仪器，并且还有以下的问题。
(1)用于分选的仪器条件设定较难，用于分选细胞的仪器操作必须熟练。
(2)由于背景噪声高，抗原特异性淋巴细胞的频度为0.1％以下时，无法检测抗原特异性淋巴细胞。
(3)分选细胞的效率低。
(4)分选频度低的细胞需要时间。
(5)可以确认有抗原结合，但难以对结合有抗原的淋巴细胞的反应进行分析。
作为其它的抗原特异性淋巴细胞检测法，还开发出通过将与磁珠结合的抗原分子与淋巴细胞混合，使结合有磁珠的抗原与抗原特异性淋巴细胞的抗原受体结合，使用磁石分选抗原特异性淋巴细胞的方法(Abts H，Emmerich M，Miltenyi S，Radbruch A，Tesch H，CD20positive human B lymphocytes separated with the magnetic sorter(MACS)canbe induced to proliferation and antibody secretion in vitro.Journal ofImmunological methods 125：19-28，1989.)。
该方法无需复杂的装置，细胞分选所需的时间短，可以确认有抗原结合。但无法对结合有抗原的淋巴细胞是否与抗原反应(细胞内信号转导、RNA合成、蛋白质合成等细胞的代谢生理反应)进行分析。另外，抗原特异性淋巴细胞的频度为0.1％以下时，无法检测抗原特异性淋巴细胞。
而本发明人对于提供无需复杂的装置、细胞分选时间短、可确认有抗原结合、也可检测频度低的抗原特异性淋巴细胞(0.001％以上)、可以对结合有抗原的淋巴细胞是否与抗原反应进行分析、并且可分选抗原特异性淋巴细胞的抗原特异性淋巴细胞检测方法进行了各种研究。对个别检测一个个淋巴细胞的抗原特异性、并且回收检测出的抗原特异性淋巴细胞的方法进行了开发。
但是，目前为止尚未知有可个别检测一个个淋巴细胞的抗原特异性，并可回收所检测的抗原特异性淋巴细胞的微孔阵列芯片。
因此，本发明人对于提供可利用于上述检测法中、可将一个淋巴细胞容纳在一个微孔中的微孔阵列芯片的情况进行了各种研究。并试作了在基板表面形成可容纳一个淋巴细胞左右大小的微孔的微孔阵列芯片，进行了将淋巴细胞容纳进(捕集到)微孔中和从微孔中回收的测试。已经清楚：在该过程中，在设置有很多微细的微孔的阵列芯片上回收检测出的抗原特异性淋巴细胞时，特别是将检测与回收以分别的步骤进行时，为了从已检测的微孔中确实无误地回收抗原特异性淋巴细胞，必须进行微孔的定位。即，如果只是将很多微孔排列的阵列芯片，是不容易进行特定的微孔定位的。
还清楚了：上述过程中，将淋巴细胞容纳入微孔中时，如果使用细胞悬浮液将淋巴细胞捕集到微孔中，然后清洗阵列芯片，则大多数细胞从微孔中流出，捕集率和填充率显著降低。
因此，本发明的第一目的在于提供：可利用上述检测法、可将一个淋巴细胞容纳入一个微孔中的微孔阵列芯片。本发明的第一方案的目的特别在于提供：可容易地确定多数且微细的微孔的位置的微孔阵列芯片。
本发明的第二目的在于提供：捕集到微孔中的淋巴细胞等细胞在之后清洗时不易从微孔中流出的微孔阵列芯片。
本发明的第三目的在于提供：可利用上述检测法、可将一个淋巴细胞容纳入一个微孔中的微孔阵列芯片。
本发明的第三方案的目的特别在于提供：可容易地将容纳在微孔中的一个淋巴细胞回收的微孔阵列芯片。本发明的第三方案的目的在于进一步提供：不限于淋巴细胞，可将一个生物体细胞容纳进一个微孔中的微孔阵列芯片。
发明内容
用以实现上述第一目的的本发明的第一方案如下。
(1)微孔阵列芯片，该微孔阵列芯片在基板的一侧主表面上具有多个微孔，上述微孔具有在一个微孔中仅可容纳一个生物体细胞的形状和尺寸，在与微孔的开口相同的基板表面上具有微孔的标记。
(2)(1)的微孔阵列芯片，其中多个微孔以相同的间隔纵横配置，每组规定个数的微孔上设有标记。
(3)(1)或(2)的微孔阵列芯片，其中多个微孔是将规定个数的微孔分成各组，设置于基板的主表面上，并设有标记以掌握各组的位置。
(4)(3)的微孔阵列芯片，其中属于一个组的微孔的数量在10-10000的范围内。
(5)(1)-(4)中任一项的微孔阵列芯片，其中标记含有荧光材料或反射材料。
(6)(1)-(5)中任一项的微孔阵列芯片，其中标记是用于定位的标记。
(7)(1)-(6)中任一项的微孔阵列芯片，其中基板是硅、金属或树脂制的。
(8)(1)-(7)中任一项的微孔阵列芯片，其中上述微孔是圆筒形、由多个面构成的多面体、倒圆锥形或倒角锥形、或上述两种以上形状的组合形状。
(9)(1)-(8)中任一项的微孔阵列芯片，其中与微孔的平面形状内切的最大圆的直径是要容纳到微孔中的生物体细胞直径的0.5-2倍的范围，且微孔的深度是要容纳到微孔中的生物体细胞直径的0.5-4倍的范围。
(10)(1)-(9)中任一项的微孔阵列芯片，其中生物体细胞是淋巴细胞，所述微孔阵列芯片用于以一个单位检测抗原特异性淋巴细胞。
(11)(1)-(10)中任一项的微孔阵列芯片，其中上述主表面上具有疏水性区域，该疏水性区域设置成包围上述多个微孔。
(12)(11)的微孔阵列芯片，其中上述疏水性区域具有硅表面或含氟表面。
用以实现上述第二目的的本发明的第二方案如下。
(13)微孔阵列芯片，该微孔阵列芯片在基板的一侧主表面上具有多个微孔，上述微孔具有在一个微孔中仅可容纳一个生物体细胞的形状和尺寸，上述微孔的开口部具有突起部，使开口部变狭窄。
(14)(13)的微孔阵列芯片，其中上述突起部是由设置于基板表面的膜向上述开口部突出而形成的。
(15)(13)或(14)的微孔阵列芯片，其中由上述突起部形成的开口的大小为可使要容纳到微孔中的生物体细胞通过的大小。
(16)(13)-(15)中任一项的微孔阵列芯片，其中基板是硅、金属或树脂制的。
(17)(14)-(16)中任一项的微孔阵列芯片，其中设于基板表面的膜是氧化膜、氮化膜、杂质扩散层、金属膜或树脂膜。
(18)(13)的微孔阵列芯片的制造方法，该方法包含以下步骤：
在基板的至少一侧主表面上形成膜的步骤；
在形成的膜上涂布抗蚀剂的步骤；
经由具有微孔图案的掩模，对上述抗蚀剂面进行曝光，除去抗蚀剂的非硬化部分的步骤；
蚀刻上述膜和基板的暴露部分，打微孔阵列形状的孔的步骤；以及
除去抗蚀剂的步骤。
(19)(18)的微孔阵列芯片的制造方法，其中基板是硅、金属或树脂制的。
(20)(18)或(19)的微孔阵列芯片的制造方法，其中设于基板表面的膜是氧化膜、氮化膜、杂质扩散层、金属膜或树脂膜。
(21)(13)-(20)中任一项的微孔阵列芯片，其中上述主表面上具有疏水性区域，该疏水性区域设置成包围上述多个微孔。
(22)(21)的微孔阵列芯片，其中上述疏水性区域具有硅表面或含氟表面。
用以实现上述第三目的的本发明的第三方案如下。
(23)微孔阵列芯片，该微孔阵列芯片具有多个微孔，是用于在各微孔中容纳1个被检生物体细胞的硅制微孔阵列芯片，上述微孔具有的每一个微孔中仅可容纳1个生物体细胞的形状和尺寸。
(24)(23)的微孔阵列芯片，其中上述微孔是圆筒形、由多个面构成的多面体、倒圆锥形或倒角锥形、或上述两种以上形状的组合形状。
(25)(23)或(24)的微孔阵列芯片，其中与微孔的平面形状内切的最大圆的直径是要容纳到微孔中的生物体细胞直径的0.5-2倍的范围，且微孔的深度是要容纳到微孔中的生物体细胞直径的0.5-4倍的范围。
(26)(23)-(25)中任一项的微孔阵列芯片，其中生物体细胞为淋巴细胞，所述微孔阵列芯片用于以一个单位检测抗原特异性淋巴细胞。
(27)(23)-(26)中任一项的微孔阵列芯片，其中微孔的内面被氟碳膜或氧化硅膜覆盖。
(28)(27)的微孔阵列芯片，该芯片可用于将容纳到一个微孔中的一个生物体细胞从微孔中回收。
(29)(23)-(28)中任一项的微孔阵列芯片，其中在上述具有多个微孔的面上具有疏水性区域，该疏水性区域设置成包围上述多个微孔。
(30)(29)的微孔阵列芯片，其中上述疏水性区域具有硅表面或含氟表面。
(31)上述微孔阵列芯片，该微孔阵列芯片在基板的一侧主表面上具有微孔，上述主表面上具有疏水性表面区域，该疏水性表面区域设置成包围上述微孔。
(32)(31)的微孔阵列芯片，其中上述疏水性区域具有硅表面或含氟表面。
附图简述
图1表示微孔阵列芯片1a的平面图，其中纵横分别设有3个10×10的微孔1b的组1c。
图2是具有实施例1中的荧光标记的本发明第一方案的微孔阵列芯片的制作方法说明图。
图3表示在硅基板3a上具有反射标记3d的微孔阵列芯片3a的平面图。
图4是反射标记的反射原理说明图。
图5是具有实施例2中的反射标记的本发明第一方案的微孔阵列芯片的制作方法(前半部分)的说明图。
图6是具有实施例2中的反射标记的本发明第一方案的微孔阵列芯片的制作方法(后半部分)的说明图。
图7(A)和(B)是具有在开口部13a不存在突起部的微孔13的阵列芯片的平面图和侧面截面图。图7(C)、(D)和(E)是在微孔13的开口部13a存在由膜12’的一部分形成的突起部14的阵列芯片的平面图、侧面截面图和斜视图。
图8(A)、(B)和(C)是表示与图7不同的本发明第二方案的微孔阵列芯片的平面图、侧面截面图和斜视图。微孔13的开口部13a处存在由膜12”的一部分形成的突起部14’，并且由突起部14’形成的开口的形状为圆形。
图9(A)、(B)和(C)是采用硅基板的微孔阵列芯片的制作过程说明图(侧面截面图)，(C)的微孔是倒四角锥形。(D)的微孔是方形，(E)的微孔是半球形。
图10表示实施例3中制作的微孔阵列芯片的各部分的尺寸。
图11是孔内具有氟碳膜的微孔阵列芯片的概略说明图。
图12是实施例4中孔内具有氟碳膜的微孔阵列芯片的制作方法的说明图。
图13是实施例5中孔内具有氧化膜(氧化硅)的微孔阵列芯片的制作方法的说明图。
图14是在具有多个微孔的主表面上具有疏水性区域的微孔阵列芯片的概略图，该疏水性区域设置成包围上述多个微孔。
图15是图14所示的微孔阵列芯片的制作方法的说明图。
图16是设置有疏水性区域的微孔阵列芯片的制作方法的说明图。
图17是实施例6中对内壁实施了平滑处理的微孔的放大照片。
图18是实施例7中在开口部形成突起的微孔的放大照片。
实施发明的最佳方式
[第一方案]
以下对本发明的第一方案进行说明。
微孔阵列芯片
本发明的第一方案的微孔阵列芯片在基板的一侧主表面上具有多个微孔，上述微孔具有一个微孔中仅可容纳一个生物体细胞的形状和尺寸。本发明的微孔阵列芯片在与微孔的开口相同的基板表面上还具有微孔的标记。
上述被检生物体细胞例如可以是淋巴细胞，本发明的微孔阵列芯片例如可用于以一个单位检测抗原特异性淋巴细胞。
第一方案的微孔阵列芯片中，多个微孔以相同的间隔纵横配置，优选在每组规定个数的微孔上设置标记。特别是在第一方案的微孔阵列芯片中，规定个数的微孔分成各组，设置于基板的主表面上，并设置有标记，以便掌握各组的位置。
例如，图1表示微孔阵列芯片1a的平面图，其中纵横分别设置了3个10×10的微孔1b的组1c。在各10×10的微孔组1c的四个角设置有标记1d。另外，设置在微孔阵列芯片1a整体的四个角的标记可设置为可与设置在各组的四个角的标记区分并识别的标记。
对构成一个微孔组的微孔数量没有特别限定，例如可以是10-10000的范围。
标记可以是只用于显示位置的材料，也可以是数字或文字。通过使用数字或文字的标记，不仅确定各组的位置，也可以特定各组。即，可以赋予各组以编码。
标记例如可通过荧光显微镜或图像扫描仪来读取，因此优选含有荧光材料或反射材料。
荧光材料具体来说是对于由外部入射的激励光具有特定波长的荧光发光的材料，优选选择可形成薄膜、可通过半导体集成电路制作技术之一的光蚀刻法加工的材料。例如优选邻萘醌二叠氮-酚醛清漆型抗蚀剂，例如东京应化工业(株)制造的OFPR-800等。
反射材料可以选择加工过的基板材料、还有在基板上制作的薄膜等。通过蚀刻或压痕加工等对基板材料进行加工，例如可以制作与表面保持倾斜的反射结构，或可形成具有文字或信息等的识别图案等。另外，通过在基板材料上形成薄膜，经过蚀刻等加工制作凹凸结构，可以通过薄膜表面的微细凹凸、薄膜端面的倾斜来形成漫反射结构，也可得到与上述同样的效果。
利用荧光观察微孔内的试样时，不发荧光的部分完全看不见。因此为了掌握试样在基板上的位置，必须进行荧光标记。
对微孔的形状和尺寸没有特别限定，微孔的形状例如可以是圆筒形，除圆筒形之外，也可以是由多个面构成的多面体(例如长方体、六棱柱、八棱柱等)、倒圆锥形、倒角锥形(倒三角锥形、倒四角锥形、倒五角锥形、倒六角锥形、七角以上的倒多角锥形)等，还可以是将两种以上这些形状组合得到的形状。例如可以是一部分为圆筒形，其余部分为倒圆锥形。为倒圆锥形、倒角锥形时，底面为微孔的开口，不过也可以是从倒圆锥形、倒角锥形的顶切除一部分得到的形状(此时，微孔的底部平坦)。对于圆筒形、长方形，微孔的底部通常是平坦的，不过也可以制成曲面(凸面或凹面)。可以将微孔的底部制成曲面的情形与从倒圆锥形、倒角锥形的顶切除一部分得到的形状的情形同样。
微孔的形状或尺寸可考虑要在微孔中容纳的生物体细胞的种类(生物体细胞的形状或尺寸等)来适当确定，以使一个微孔中可容纳一个生物体细胞。
为了使一个微孔中容纳一个生物体细胞，例如，与微孔的平面形状内切的最大圆的直径为要容纳在微孔中的生物体细胞直径的0.5-2倍的范围、优选0.8-1.9倍的范围、更优选0.8-1.8倍的范围。
微孔的深度为要容纳在微孔中的生物体细胞直径的0.5-4倍的范围、优选0.8-1.9倍的范围、更优选0.8-1.8倍的范围。
微孔为圆筒形时，其尺寸例如可以是直径3-100μm，生物体细胞为B淋巴细胞时，优选直径为4-15μm。另外，深度例如可以是3-100μm，生物体细胞为B淋巴细胞时，可优选深度为4-40μm。不过，如上所述，微孔的尺寸应考虑要容纳在微孔中的生物体细胞直径与微孔尺寸的恰当比来适当决定。
对一个微孔阵列芯片所具有的微孔数量没有特别限定，当生物体细胞为淋巴细胞时，从抗原特异性淋巴细胞的频度为105个中至少有1个、约有500个的角度考虑，1cm2的微孔数可以是例如2,000-1,000,000个的范围。
第一方案中，为了将细胞顺利取出，优选微孔的内壁表面形状是平滑的。表面的凹凸高度可以是0-1.0μm的范围，优选0-0.5μm的范围，更优选0-0.1μm的范围。
在微孔内壁的任意位置都可以改变凹凸高度。通过在进行了平滑处理的孔内壁的一部分上制作凹凸，可以使孔具有功能性。例如，在孔入口附近制作例如高度0.5-1μm的突起，则进入孔中的细胞在清洗时难以流出。该方案相当于后述的第二方案。通过使孔底面带突起，可以使细胞不接触孔底面，而由突起支撑。
微孔内壁的平滑化可通过蚀刻进行。可适当选择蚀刻装置的真空度、蚀刻气体种类、蚀刻步骤等。例如使用STS公司的Multiplex ASE蚀刻装置进行微孔内壁的平滑化时，优选适当设定蚀刻步骤和保护膜形成步骤的工艺周期时间。另外，微孔内壁的平滑化也可以通过湿式蚀刻或将热氧化步骤与氧化膜蚀刻组合来进行。
例如，使用STS公司的Multiplex ASE蚀刻装置，在微孔内壁的任意位置改变凹凸高度时，通过改变该装置的工艺周期，即可在微孔内壁所需的位置形成所需高度的凹凸。湿式蚀刻等中，可通过适当选择蚀刻液的种类、浓度、温度来实现。
还可通过蚀刻，在孔侧壁的任意位置形成突起。例如通过前述的STS公司的Multiplex ASE蚀刻装置，在要形成突起的位置延长工艺周期时间，则可在孔侧壁所需的位置形成所需高度的突起。另外，用该装置以外的蚀刻装置等，通过适当选择、改变蚀刻条件，也可以在要形成突起的位置形成突起。
第一方案的微孔阵列芯片例如可以是硅、金属或树脂制的。不过，如果是硅制，则可直接应用目前半导体集成电路制作技术的主流——硅加工技术，特别是从精细加工性、量产性、将来与包括传感器的分析电路的集成化来看，比其它材料优异。
上述金属例如可以是铝、不锈钢、铜、镍、铬、钛等。
上述树脂例如有：聚酰亚胺、聚乙烯、氯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、丙烯酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯等。
微孔阵列芯片例如是硅制，标记含有荧光材料时，对其制造方法进行说明。
(1)将荧光物质(例如东京应化OFPR-800)涂布在硅基板的一侧主表面上。荧光物质也可以是东京应化OFPR-800以外的材料，只要是具有吸收激励光并因此由激态回复基态时释放能量，发出荧光的特性的物质即可，可适当选择，优选可经光蚀刻法加工的物质。例如也可以用クラリアント公司AZP1350等代替。
(2)通过光蚀刻法，在该表面形成标记图案，为提高荧光物质的耐溶剂性，在高温(例如180℃)下进行硬化处理。硬化处理的温度可根据荧光物质适当选择。
(3)硬化处理后，通过光蚀刻法形成微孔图案，在低温(100℃以下)下进行硬化。微孔图案可根据微孔的尺寸或排列等适当决定。硬化温度可根据在微孔图案中所用的光致抗蚀剂材料适当决定。
(4)通过干式蚀刻法等形成孔。用于形成孔的干式蚀刻法可适当采用公知的方法。
(5)用丙酮等有机溶剂除去在孔图案掩模中所用的光致抗蚀剂。所用有机溶剂不限于丙酮。只要是可除去光致抗蚀剂的物质，均可适当使用。
除去光致抗蚀剂后，只有在硅基板上形成的微孔和荧光标记残留在芯片上，可得到第一方案的微孔阵列芯片。
下面，当微孔阵列芯片例如是硅制、标记含有反射性材料时，对其制造方法进行说明。
(1)通过光蚀刻法，在硅基板的一侧主表面上形成标记图案。通过薄膜等制作反射结构时，在进行光蚀刻前需要预先在该表面上形成薄膜材料。
(2)浸泡在具有蚀刻、例如面方位各向异性蚀刻特性的碱溶液中，例如制作倒锥形的反射结构。当有薄膜时，可适当选择蚀刻方去。
(3)通过光蚀刻来形成微孔图案。微孔图案可根据微孔的尺寸或排列等适当决定。
(4)通过干式蚀刻法等形成孔。用以形成孔的干式蚀刻法可适当采用公知的方法。
(5)使用光致抗蚀剂剥离液等除去光致抗蚀剂。
除去光致抗蚀剂后，只有在硅基板上形成的微孔和反射性标记残留在芯片上，可得到第一方案的微孔阵列芯片。
第一方案的微孔阵列芯片中，还可以利用光致发光结构，该结构利用以电子和空穴等载流子的阻挡现象等为代表的量子效果，例如载流子的密封效果。所使用的光致发光材料可根据所需波长适当选择。可以在芯片上添加光致发光结构，也可以采用在芯片本身中制作进光致发光结构的方法。例如，可以通过量子效应粒子、杂质掺杂、多孔材料、薄膜层合形成的量子阱结构或光致发光材料的成膜，在第一方案的微孔阵列芯片上设置标记。
第一方案的微孔阵列芯片可以在具有多个微孔的主表面上具有疏水性区域，该疏水性区域设置成包围上述多个微孔。设置了所述区域的微孔阵列芯片的概略图如图14所示。如图14所示，通过设置成包围微孔的疏水性区域，接种于微孔阵列上的含有细胞等的溶液不会越过疏水性区域扩散，因此可以将细胞悬浮液有效地约束在微孔上。这样的区域可以是平面，也可以是沟槽状。对其数量没有特别限定，可以设置一个，也可以设置两个以上。上述区域的宽度可根据接种液量适当设定，例如可以是100μm-1mm。上述区域为沟槽状时，其沟槽的深度也可根据接种液量适当设定，例如可以是5-100μm。
上述疏水性区域例如可以是具有硅表面或含氟表面的区域。
以下作为一个例子，参照图15，对于基板为硅制、设置有具硅表面的沟槽状疏水性区域的微孔陈列芯片的制造方法进行说明。
(1)在形成有氧化硅膜32a的硅基板32b(图15(A))上涂布例如东京应化工业(株)制造的酚醛清漆树脂系正性光致抗蚀剂OFPR-800(32c)，形成微孔图案32d。此时，与微孔图案同时形成用于设置沟槽状疏水性区域的图案32e(图15(B))。
(2)通过氟酸等除去图案中露出的氧化硅膜32a(图15(C))，根据需要除去光致抗蚀剂32c。通过采用氟系气体或离子轰击的干式蚀刻或利用碱溶液、氟硝酸等的湿式蚀刻法，蚀刻硅。此时形成微孔32f，同时，制作了图案32e的部分中，具有疏水性的硅表面暴露出来，形成沟槽状疏水性区域32g(图15(D))。
(3)除去光致抗蚀剂，可得到设置有具硅表面的沟槽状疏水性区域的微孔阵列芯片，该疏水性区域包围微孔(图15(E))。
如上所述，本发明中，通过在形成孔的同时蚀刻硅基板自身，可得到设置有沟槽状疏水性区域的微孔阵列芯片，通过蚀刻氧化膜，使硅表面暴露出来，可得到设置有沟槽状疏水性区域的微孔阵列芯片。以下，参照图16，对所述微孔阵列芯片的制作方法的一个例子进行说明。
(1)在形成有氧化硅膜42a的硅基板42b(图16(A))上涂布例如东京应化工业(株)制造的酚醛清漆树脂系正性光致抗蚀剂OFPR-800(42c)，形成用于设置沟槽状疏水性区域的图案42e(图16(B))。
(2)通过氟酸等除去图案中露出的氧化硅膜42a，使硅暴露出来(图16(C))。这里，除去一部分光致抗蚀剂。
(3)在该硅基板表面上再一次涂布光致抗蚀剂，形成微孔图案42d(图16(D))。通过氟酸等除去形成的图案中暴露出的氧化硅膜。
(4)通过采用氟系气体或离子轰击的干式蚀刻或利用碱溶液、氟硝酸等的湿式蚀刻法，蚀刻硅(图16(E))。
(5)除去光致抗蚀剂，可得到设置有具硅表面的沟槽状疏水性区域的微孔阵列芯片，该疏水性区域包围微孔(图16(F))。
上述疏水性区域可以是具有含氟表面的区域。含氟表面可以是氟碳表面；由碳、氟、氢等构成的氟树脂表面；氟硅表面等。具有含氟表面的疏水性区域可将氟系防水剂通过以下的方法设置：例如通过压印或印刷进行涂布的方法；例如通过蚀刻在基板上设置沟槽、向该沟槽中流入氟系防水剂的方法；还可以通过喷墨法；喷涂法等设置。上述疏水性区域可以使用以聚对亚苯基二甲基(parylene)为代表的聚对二甲苯树脂或硅树脂来设置。由此也可以在金属制或树脂制的基板上设置疏水性区域。
标记的使用方法
将荧光检测器中使用的激励光通过反射结构或凹凸形状表面进行漫反射。检测器上安装有去除通常目标荧光波长以外的带通滤波器，因此在芯片表面全反射的激励光不会入射到检测器中。但是漫反射的光可以经前段具有带通滤波器性能的反射镜进行反射，到达检测器。因此，由位于后段的检测器前的带通滤波器在识别标记时进行排除，漫反射光入射到检测器中。对于标记图案的形状，凹形比凸形的识别性优异。
[第二方案]
以下对本发明的第二方案进行说明。
微孔阵列芯片
本发明的第二方案的微孔阵列芯片在基板的一侧主表面上具有多个微孔，上述微孔具有一个微孔中仅可容纳一个生物体细胞的形状和尺寸，上述微孔的开口部具有突起部，该突起部使开口部狭窄。
上述突起部是设置在基板表面的膜向上述开口部突出而形成的。但上述突起部并不限于本方案。以下按照图7，对设置在基板表面的膜向上述开口部突出而形成上述突起部的方案进行说明。
图7的(A)和(B)是膜12设置在基板11的表面、并且具有微孔13的阵列芯片的平面图和侧面截面图。微孔3的开口部13a不存在突起部。
而图7的(C)、(D)和(E)是膜12’设置在基板11的表面、并且具有微孔13的阵列芯片的平面图、侧面截面图和斜视图。微孔13的开口部13a中存在由膜12’的一部分形成的突起部14。
图8(A)、(B)和(C)是表示与图7不同的第二方案的微孔阵列芯片的方案的平面图、侧面截面图和斜视图。图8(A)、(B)和(C)是在基板11的表面设有膜12”、还具有微孔13的阵列芯片，微孔13的开口部13a处存在由膜12”的一部分形成的突起部14’。由突起部14’形成的开口形状与图7的(E)(方形)不同，为圆形。
由突起部形成的开口形状可以是图7的突起部14和图8的突起部14’以外的形状。另外，由突起部形成的开口大小为可使要容纳到微孔中的生物体细胞通过的大小。
图9表示微孔形状不同的第二方案的微孔阵列芯片方案的侧面截面图。
图9(C)是与上述图7和8同样的方案，但是相对于倒四角锥形的微孔，图9(D)的微孔为方形，图9(E)的微孔为半球形。不过，对微孔的形状没有特别限定，也可以是除此以外的形状。
对微孔的形状和尺寸没有特别限定，微孔的形状例如可以是圆筒形，除圆筒形之外，也可以是由多个面构成的多面体(例如长方体、六棱柱、八棱柱等)、倒圆锥形、倒角锥形(倒三角锥形、倒四角锥形、倒五角锥形、倒六角锥形、七角以上的倒多角锥形)等，还可以是将两种以上这些形状组合得到的形状。例如可以是一部分为圆筒形，其余部分为倒圆锥形。为倒圆锥形、倒角锥形时，底面为微孔的开口，不过也可以是从倒圆锥形、倒角锥形的顶切除一部分得到的形状(此时，微孔的底部平坦)。对于圆筒形、长方体，微孔的底部通常是平坦的，不过也可以制成曲面(凸面或凹面)。可以将微孔的底部制成曲面时，其情形与从倒圆锥形、倒角锥形的顶切除一部分得到的形状的情形同样。
微孔的形状或尺寸可考虑要在微孔中容纳的生物体细胞的种类(生物体细胞的形状或尺寸等)来适当确定，以使一个微孔中可容纳一个生物体细胞。
为了使一个微孔中容纳一个生物体细胞，例如，与开口的平面形状内切的最大圆的直径为要容纳在微孔中的生物体细胞直径的0.5-2倍的范围、优选0.8-1.9倍的范围、更优选0.8-1.8倍的范围，其中所述开口由设在微孔的开口部的突起形成。
微孔的深度为要容纳在微孔中的生物体细胞直径的0.5-4倍的范围、优选0.8-1.9倍的范围、更优选0.8-1.8倍的范围。
微孔为圆筒形时，其尺寸例如可以是直径3-100μm，生物体细胞为B淋巴细胞时，优选直径为4-15μm。另外，深度例如可以是3-100μm，生物体细胞为B淋巴细胞时，可优选深度为4-40μm。不过，如上所述，微孔的尺寸应考虑要容纳在微孔中的生物体细胞直径与微孔尺寸的恰当比来适当决定。
对一个微孔阵列芯片所具有的微孔数量没有特别限定，当生物体细胞为淋巴细胞时，从抗原特异性淋巴细胞的频度为105个中至少有1个、约有500个的角度考虑，1cm2的微孔数可以是例如2,000-1,000,000个的范围。
与上述第一方案同样，第二方案中，为了将细胞顺利取出，优选微孔的内壁表面形状是平滑的。其详细情况如之前第一方案所述。
构成第二方案的微孔阵列芯片的基板例如可以是硅、金属或树脂制的。不过，如果是硅制，则可直接应用目前半导体集成电路制作技术的主流——硅加工技术，特别是从精细加工性、量产性、将来与包括传感器的分析电路的集成化来看，比其它材料优异。
构成基板的金属例如可以是铝、不锈钢、铜、镍、铬、钛等。
构成基板的树脂例如有：聚酰亚胺、聚乙烯、氯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、丙烯酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯等。
设于基板表面的膜例如可以是氧化膜、氮化膜、杂质扩散层、金属膜或树脂膜。
氧化膜例如有氧化硅膜、氮氧化硅膜、氧化铝膜、氧化钛膜。
氮化膜例如有氮化硅膜、氮化铝膜、氮化钛膜。
杂质扩散层可以是在硅基板表面高浓度分布硼的层。
金属膜例如有铝、金、铂、不锈钢、铜、镍、铬、钛、锗、硅锗等。
树脂膜例如有：聚酰亚胺、聚乙烯、氯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、丙烯酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯等。
对设置于基板表面的膜厚没有特别限定，例如是100nm-5μm的范围。优选300nm-1μm的范围。
基板为硅制时，设置于基板表面的膜的种类可以直接应用目前主流的集成电路制造技术，从量产性、低成本化、可靠性等角度看，优选为氧化膜、氮化膜、杂质扩散层。
基板为硅制时，从光蚀刻的应用、蚀刻选择性、量产性等观点看，优选设置于基板表面的膜为树脂制。
基板为硅制时，从光蚀刻的应用、与传感器的一体化、膜的耐久性、量产性等观点看，优选设置于基板表面的膜为金属制。
基板为金属制时，从蚀刻选择性、膜的耐热性、耐久性等提高的观点看，优选设置于基板表面的膜为金属制。
基板为金属制时，从光蚀刻的应用、蚀刻选择性等观点看，优选设置于基板表面的膜为树脂制。
基板为金属制时，从成膜的容易性、膜的耐久性或贴合性等观点看，优选设置于基板表面的膜为氧化膜、氮化膜等。
基板为树脂制时，从低成本以及可利用公知的各种成型、加工技术的观点看，优选设置于基板表面的膜为树脂制。
基板为树脂制时，从膜的功能性、加工性、耐久性等观点看，优选设置于基板表面的膜为金属制。
微孔阵列芯片的制造方法
第二方案的微孔阵列芯片例如可通过以下的方法制造，其制造方法包含以下步骤：
在基板的至少一侧主表面上形成膜的步骤；
在形成的膜上涂布抗蚀剂的步骤；
经由具有微孔图案的掩模，对上述抗蚀剂面进行曝光，除去抗蚀剂的非硬化部分的步骤；
蚀刻上述膜和基板的暴露部分，打微孔阵列形状的孔的步骤；以及
除去抗蚀剂的步骤。
以下对基板为硅制的情形进行说明。
(1)通过热CVD、CVD等方法，在洗净的硅基板表面上形成氧化膜等薄膜。
(2)在形成的薄膜上涂布抗蚀剂。
(3)经由具有微孔图案的掩模，对抗蚀剂面进行曝光，除去抗蚀剂的非硬化部分。即，通过光蚀刻法，在薄膜上形成微孔图案，使硅表面暴露。
(4)对膜和基板的暴露部分进行蚀刻，打出微孔阵列形状的孔。蚀刻例如可使用碱蚀刻溶液(例如TMAH：氢氧化四甲基铵等)进行。此时，蚀刻沿基板厚度方向和薄膜下方向进行。这里，若进行规定时间以上的蚀刻，则在形成于硅基板上的微孔入口处形成薄膜的遮沿状突起。
(5)除去抗蚀剂，得到第二方案的微孔阵列芯片。
接着，对基板为金属制的情形进行说明。
(1)在洗净的金属基板表面上形成树脂或与基板具有蚀刻选择性的金属薄膜，或者对金属基板表面进行氧化处理、氮化处理，形成薄膜。
(2)在形成的薄膜上涂布光致抗蚀剂。
(3)经由具有微孔图案的光掩模，对光致抗蚀剂面进行曝光，除去光致抗蚀剂的未硬化部分。即，通过光蚀刻法，在薄膜上形成微孔图案，使基板表面暴露。
(4)通过蚀刻等方法，将基板的暴露部分打出微孔阵列形状的孔。此时，蚀刻方法可任意选择。
(5)这里，在向底部方向进行蚀刻的同时也向薄膜下横向进行一些蚀刻，因此形成遮沿状结构。
(6)除去光致抗蚀剂，得到第二方案的微孔阵列芯片。
下面，对基板为树脂制的情形进行说明。
(1)在洗净的树脂基板上形成树脂或金属薄膜，或者进行改性处理，以提高树脂表面的耐性。该改性处理例如可以是UV处理或注入改性材料等。
(2)在形成的薄膜上涂布光致抗蚀剂。
(3)经由具有微孔图案的光掩模，对光致抗蚀剂面进行曝光，除去光致抗蚀剂的未硬化部分。即，通过光蚀刻法，在薄膜上形成微孔图案，使基板表面暴露出来。
(4)通过溶解等方法，在基板的暴露部分打出微孔阵列形状的孔。此时，可适当选择用于蚀刻的溶液。或者如果基板自身可以光蚀刻，则也可以例如以微孔图案的金属薄膜作为掩模，进行UV曝光，除去曝光部分。此时，孔的深度可通过UV曝光量控制。
(5)这里，在向底部方向进行溶解的同时也向薄膜下横向进行一些蚀刻，因此形成遮沿状结构。
(6)除去光致抗蚀剂，得到第二方案的微孔阵列芯片。
接着，对硅基板表面设置有氧化膜的情形进行说明。
(1)通过热氧化、热CVD、等离子体CVD等方法，在洗净的硅基板上形成氧化膜(氧化硅膜等)。
(2)在形成的薄膜上涂布光致抗蚀剂。
(3)经由具有微孔图案的掩模，对光致抗蚀剂面进行UV曝光，除去光致抗蚀剂的未硬化部分。即，通过光蚀刻法，在薄膜上形成微孔图案，使硅表面暴露出来。除去光致抗蚀剂。
(4)对基板的暴露部分进行蚀刻，打出微孔阵列形状的孔。蚀刻例如可使用碱蚀刻溶液(例如TMAH：氢氧化四甲基铵等)进行。此时，蚀刻沿基板厚度方向和薄膜下横向进行。这里，若进行规定时间以上的蚀刻，则在形成于硅基板上的微孔入口处形成薄膜的遮沿状突起。
(5)由此得到第二方案的微孔阵列芯片。
下面，对硅基板表面设置有金属薄膜的情形进行说明。
(1)通过CVD、电阻加热蒸镀、溅射蒸镀、电子射线蒸镀等，在硅基板上形成金属薄膜。
(2)在形成的薄膜上涂布光致抗蚀剂。
(3)经由具有微孔图案的掩模，对光致抗蚀剂面进行UV曝光，除去光致抗蚀剂的未硬化部分。即，通过光蚀刻法，在薄膜上形成微孔图案，使硅表面暴露出来。此时，为形成图案而对薄膜进行蚀刻的方法可适当选择。例如，当为铝时，使用磷酸+硝酸+乙酸+水的混合酸。这里，如果需要，可以除去光致抗蚀剂。
(4)对基板的暴露部分进行蚀刻，打出微孔阵列形状的孔。蚀刻例如可使用碱蚀刻溶液等进行。蚀刻溶液等可适当选择。例如制作由铝薄膜构成的结构时，使用可蚀刻硅而不蚀刻铝的蚀刻溶液(例如选择水合肼。肼不侵蚀大部分的金属)。此时，蚀刻沿基板厚度方向和薄膜下横向进行。这里，若进行规定时间以上的蚀刻，则在形成于硅基板上的微孔入口处形成薄膜的遮沿状突起。
(5)由此得到第二方案的微孔阵列芯片。
下面，对硅基板表面设置有树脂薄膜的情形进行说明。
(1)通过CVD、涂布、浸渍等方法，在洗净的硅基板上形成树脂薄膜。
(2)在形成的薄膜上涂布光致抗蚀剂。经由具有微孔图案的掩模，对光致抗蚀剂面进行UV曝光，除去光致抗蚀剂的未硬化部分。即，通过光蚀刻法，在薄膜上形成微孔图案，使硅表面暴露出来。此时，为形成图案而除去树脂薄膜的方法可适当选择。例如使用感光性聚酰亚胺薄膜时，涂布形成的树脂薄膜本身具有图案形成能力，因此可以省略光致抗蚀剂涂布步骤，只通过曝光显影步骤即可进行树脂薄膜的加工。
(3)对基板的暴露部分进行蚀刻，打出微孔阵列形状的孔。蚀刻例如可使用碱蚀刻溶液等进行。蚀刻溶液等可适当选择。例如为聚酰亚胺薄膜时，可以选择水合肼、乙二胺焦儿茶酚。此时，蚀刻沿基板厚度方向和薄膜下横向进行。这里，若进行规定时间以上的蚀刻，则在形成于硅基板上的微孔入口处形成薄膜的遮沿状突起。
(4)由此得到第二方案的微孔阵列芯片。
下面，对硅基板表面设置有氮化硅膜的情形进行说明。
(1)通过CVD、溅射蒸镀等方法，在洗净的硅基板上形成氮化硅薄膜。
(2)在形成的薄膜上涂布光致抗蚀剂。
(3)经由具有微孔图案的掩模，对光致抗蚀剂面进行UV曝光，除去光致抗蚀剂的未硬化部分。即，通过光蚀刻法，在薄膜上形成微孔图案，使硅表面暴露。除去光致抗蚀剂。
(4)对基板的暴露部分进行蚀刻，打出微孔阵列形状的孔。蚀刻例如可使用碱蚀刻溶液(例如TMAH：氢氧化四甲基铵等)进行。此时，蚀刻沿基板厚度方向和薄膜下横向进行。这里，若进行规定时间以上的蚀刻，则在形成于硅基板上的微孔入口处形成薄膜的遮沿状突起。
(5)由此得到第二方案的微孔阵列芯片。
下面，对硅基板表面设置有杂质扩散膜的情形进行说明。
(1)在洗净的硅基板上涂布光致抗蚀剂。
经由具有微孔图案的掩模，对光致抗蚀剂面进行UV曝光，除去光致抗蚀剂的未硬化部分。即，通过光蚀刻法，在薄膜上形成微孔图案，使孔图案部分以外的硅表面暴露。
(2)清洗基板，通过热扩散法、离子注入等方法，将硼以高浓度(-1020/cm2左右)扩散到硅暴露的部分。扩散源除硼以外还可以是锗、硅锗等。可通过热处理(Drive-in)控制扩散层厚，其中所述热处理是为了加深扩散。此时，向热处理炉中导入氧，在表面形成氧化硅膜。
(3)孔的蚀刻例如可使用碱蚀刻溶液(例如TMAH：氢氧化四甲基铵等)进行。此时，未扩散有硼的硅表面容易被蚀刻，但硼高浓度扩散的硅表面难以被蚀刻。因此蚀刻是对未扩散硼的孔图案部分选择性地进行。蚀刻沿基板厚度方向和薄膜下横向进行。这里，若进行规定时间以上的蚀刻，则在形成于硅基板上的微孔入口处形成薄膜的遮沿状突起。
(4)由此得到第二方案的微孔阵列芯片。
第二方案的微孔阵列芯片可以在具有多个微孔的主表面上具有疏水性区域，该疏水性区域设置成包围上述多个微孔。上述区域的详细情况如之前第一方案所述。
[第三方案]
以下对本发明的第三方案进行说明。
微孔阵列芯片
本发明的第三方案的微孔阵列芯片是具有多个微孔、用于在各微孔中容纳一个被检生物体细胞的硅制微孔阵列芯片，上述微孔具有一个微孔中仅可容纳一个生物体细胞的形状和尺寸。
上述被检生物体细胞例如可以是淋巴细胞，本发明的微孔阵列芯片例如可用于以一个单位检测抗原特异性淋巴细胞。
对微孔的形状和尺寸没有特别限定，微孔的形状例如可以是圆筒形，除圆筒形之外，也可以是由多个面构成的多面体(例如长方体、六棱柱、八棱柱等)、倒圆锥形、倒角锥形(倒三角锥形、倒四角锥形、倒五角锥形、倒六角锥形、七角以上的倒多角锥形)等，还可以是将两种以上这些形状组合得到的形状。例如可以是一部分为圆筒形，其余部分为倒圆锥形。为倒圆锥形、倒角锥形时，底面为微孔的开口，不过也可以是从倒圆锥形、倒角锥形的顶切除一部分得到的形状(此时，微孔的底部平坦)。对于圆筒形、长方体，微孔的底部通常是平坦的，不过也可以制成曲面(凸面或凹面)。可以将微孔的底部制成曲面时，其情形与从倒圆锥形、倒角锥形的顶切除一部分得到的形状的情形同样。
微孔的形状或尺寸可考虑要在微孔中容纳的生物体细胞的种类(生物体细胞的形状或尺寸等)来适当确定，以使一个微孔中可容纳一个生物体细胞。
为了使一个微孔中容纳一个生物体细胞，例如，与微孔的平面形状内切的最大圆的直径为要容纳在微孔中的生物体细胞直径的0.5-2倍的范围、优选0.8-1.9倍的范围、更优选0.8-1.8倍的范围。
微孔的深度为要容纳在微孔中的生物体细胞直径的0.5-4倍的范围、优选0.8-1.9倍的范围、更优选0.8-1.8倍的范围。
微孔为圆筒形时，其尺寸例如可以是直径3-100μm，生物体细胞为B淋巴细胞时，优选直径为4-15μm。另外，深度例如可以是3-100μm，生物体细胞为B淋巴细胞时，可优选深度为4-40μm。不过，如上所述，微孔的尺寸应考虑要容纳在微孔中的生物体细胞直径与微孔尺寸的恰当比来适当决定。
对一个微孔阵列芯片所具有的微孔数量没有特别限定，当生物体细胞为淋巴细胞时，从抗原特异性淋巴细胞的频度为105个中至少有1个、约有500个的角度考虑，1cm2的微孔数可以是例如2,000-1,000,000个的范围。
与上述第一和第二方案同样，第三方案中，为了将细胞顺利取出，优选微孔的内壁表面形状是平滑的。其详细情况如之前第一方案中所述。
本发明的第三方案的微孔阵列芯片是硅制的。通过采用硅制芯片，可直接应用目前半导体集成电路制作技术的主流——硅加工技术，特别是从精细加工性、量产性、将来与包含传感器的分析电路等的集成化来看，比其它材料优异。
并且，如果第三方案的微孔阵列芯片是硅制、基板表面被氧化硅膜覆盖，则从该芯片表面的亲水性、膜的稳定性、量产性角度考虑优选。硅表面通常为疏水性，接种细胞悬浮液时，具有排斥细胞悬浮液的性质，会妨碍生物细胞容纳到微孔中。因此，从比硅具有亲水性、且是稳定的膜的观点看，优选氧化硅膜。
第三方案的微孔阵列芯片优选微孔内面被氟碳膜或氧化硅膜覆盖。通过微孔的内面形成氟碳膜或氧化硅膜等惰性且排他性的表面，可以防止生物体细胞的粘附，使生物体细胞从微孔的回收变得容易，因此优选。
即，在微孔等中处理生物体细胞时，微孔内部会有生物体细胞粘附的问题。特别是从微孔回收微孔内的生物体细胞时，生物体细胞的粘附是一个大的问题。为解决该问题，本发明中，优选生物体细胞所接触的微孔内部形成氟碳膜或氧化硅膜等膜。
氟碳膜是具有防水性的膜，优选只在孔内部形成防水性膜，如前所述，微孔阵列芯片的孔以外的表面优选为氧化硅膜。
尽管氧化硅膜不显示氟碳膜那样的防水性，但具有可防止生物体细胞粘附的效果。特别是通过干燥氧进行的高温热氧化法，由该方法制作的氧化硅膜，其膜致密，虽然不显示象氟碳膜那样的可形成水珠程度的防水性，但显示亲水性和斥水性之间的性质。
通常，生物体细胞分散在溶液中进行处理，因此，如果微孔阵列芯片整体具有防水性或疏水性的表面，则生物体细胞有难以容纳到孔中的倾向。因此，本发明中，优选孔以外的表面覆盖氧化硅膜，只有孔内部选择性地形成氟碳膜或氧化硅膜。
不过，以通常的处理方法形成氟碳膜时，是在孔制作后进行膜的形成。因此基板整体被氟碳膜覆盖，基板表面也具有了防水性。因此本发明采用以下的方法。以使用硅基板的微孔阵列芯片为例，对该方法进行说明。
通过光蚀刻法，在硅基板上形成微孔图案。此时的光致抗蚀剂硬化温度在100℃以下进行。接着，通过干腐蚀用真空装置形成微孔。确认制作好微孔后，向真空装置内导入CF系气体，进行等离子体CVD。等离子体CVD可以直接使用蚀刻装置，也可以用另外的CVD装置进行。成膜数分钟后，从真空装置中取出基板，浸泡到甲醇、丙酮等有机溶剂中。由此，其上的氟碳膜也与微孔图案掩模一起被移走，只有微孔内壁残留有氟碳膜。对于蚀刻和成膜步骤，只需改变气体种类即可用相同的装置应对。
如前所述，可以用硅氧化膜代替氟碳膜覆盖孔内面。用硅氧化膜代替氟碳膜覆盖孔内面，也可以得到生物体细胞由孔回收的回收率改善效果。
以下对用硅氧化膜覆盖孔内面的方法进行说明。
这种情况下，如果在形成孔图案后除去光致抗蚀剂，然后形成热氧化膜等，则可得到用硅氧化膜覆盖孔内面的微孔阵列芯片。
通过在孔内部形成多孔硅，以此代替氟碳膜或硅氧化膜，也可得到具有抑制生物体细胞与孔内面粘附的效果的微孔阵列芯片。多孔硅可通过阳极作用等方法制作孔内面。
除氟碳膜、硅氧化膜、多孔硅以外，也可以对本发明的微孔阵列芯片实施抑制活性硅表面的处理，或形成膜。
第三方案的微孔阵列芯片可以在具有多个微孔的面上具有疏水性区域，该疏水性区域设置成包围上述多个微孔。上述疏水性区域的详细情况如之前的第一方案所述。如前所述，第三方案的微孔阵列芯片中，用氟碳膜覆盖微孔内面时，上述区域也一并被氟碳膜覆盖，形成疏水性区域。
实施例
实施例1
(荧光标记)
图1是本发明第一方案的装置的实施方案例。
图1是在硅材料等的基板上面1a形成多个微孔1b的微孔阵列芯片。为了容易地进行位置识别，微孔1b以适当的数量单位(例如10×10：100个)形成群1c。该微孔阵列芯片的用途之一是向各孔中导入附加有荧光物的评价对象，确认其荧光发光。此时，通过荧光显微镜、荧光扫描仪等进行的观察是按照荧光波长的规格进行的，因此无法观察到荧光不发光的细胞。因此，如图1所示，各群之间形成有荧光物质的微小的标记1d。
该标记的制作方法如下(图2)。
以在硅材料等基板上形成的微孔为例，以下给出两种制作方法。
标记制作法(I)
(1)在带有氧化硅膜2a的硅基板2b(图2(I)(A))上涂布例如东京应化工业(株)制造的酚醛清漆树脂系正性光致抗蚀剂OFPR-800，在基板上形成标记图案2c(图2(I)(B))。
(2)为了通过热交联等提高光致抗蚀剂的耐化学品性，在180℃、将基板进行30分钟的硬化等处理。
(3)再次涂布光致抗蚀剂2d，在硅基板2b上形成制作微孔所必需的开口图案2e(图2(I)(C)和(D))。此时，显影后的硬化以100-110℃左右的低温进行。
(4)用氟酸除去开口部的氧化硅膜2a，使硅暴露。
(5)通过干式蚀刻法等蚀刻硅基板2b，制作微孔2f(图2(I)(E))。
(6)用甲醇、丙酮等除去(3)中涂布的光致抗蚀剂2d，得到第一方案的微孔阵列芯片(图2(I)(F))。
标记制作法(II)
(1)在带有氧化硅膜2a的硅基板2b(图2(II)(A))上涂布例如东京应化工业(株)制造的酚醛清漆树脂系正性光致抗蚀剂OFPR-800，在基板上形成标记图案2c(图2(II)(B))。
(2)为了通过热交联等提高光致抗蚀剂的耐化学品性，在180℃、将基板进行30分钟的退火等处理。
(3)再次涂布光致抗蚀剂2d，在硅基板2b上形成制作微孔所必需的开口图案2e(图2(II)(C)和(D))。此时，显影后的热处理以100-110℃左右的低温进行。
(4)用氟酸除去开口部的氧化硅膜2a，使硅暴露(图2(II)(E))。
(5)在此用丙酮等有机溶剂除去形成孔图案的光致抗蚀剂。
(6)以硅基板2b上的氧化硅膜2a作为掩模，通过干腐蚀法等方法对硅基板2b进行蚀刻，制作微孔2f，由此得到第一方案的微孔阵列芯片(图2(II)(F))。
根据标记制作法(II)，在孔形成后除去光致抗蚀剂时，在干腐蚀步骤中，光致抗蚀剂改性，不会有难以除去的问题。另外，通过等离子体效果，所形成的硅基板表面以该状态即可得到超亲水性表面。
由以上的步骤，可容易地制作图2的形状。标记2c的图案可自由选择成图形、记号、文字等。另外，除标记外，还可以在微芯片上表示信息等。
实施例2
(反射标记)
图3是在硅基板3a上形成凹凸，与上述同样，其漫反射光可通过荧光显微镜、荧光扫描仪进行观察的反射标记3d的实施方案。可用于在硅基板3a上排列很多的微孔3b群的位置识别等的标记等。通过蚀刻等，在基板上制作凹陷3e，使荧光激励光在凹陷处漫反射，导入观察装置，由此可识别凹陷位置。
图4表示其原理。当光入射到象图左侧那样的没有任何凹凸等的基板4a表面时，由于全反射，没有激励光入射到观察装置中。但是，象右侧，由于凹陷4b，使激励光漫反射成放射状，有反射光入射到观察装置的光学系统中，可以进行识别。
从使激励光漫反射成放射状的观点考虑，优选凹陷4b的底部为倒锥形。
基板为硅基板时，根据图5和6，对具有反射标记的微孔阵列芯片的制造例进行说明。
(1)在带有氧化硅膜5a的硅基板5b(图5(A))上涂布例如东京应化工业(株)制造的酚醛清漆树脂系正性光致抗蚀剂OFPR-800(5c)，在基板上形成标记图案5d(图5(B))。
(2)用氟酸除去光致抗蚀剂5c开口处的氧化硅膜5a，使硅暴露(图5(C))。
(3)除去光致抗蚀剂5c，将硅基板5b浸泡在氢氧化四甲基铵或氢氧化钾等碱蚀刻液中，进行各向异性蚀刻，制作凹陷结构5e(图5(D))。此时，本发明的标记完成。然后制作微孔阵列结构。
(4)这里，如有需要，可再次在基板5b表面追加形成氧化硅膜或氮化硅膜等掩模薄膜(图6(A))。
(5)再次涂布光致抗蚀剂5f(图6(B))，形成微孔图案5g，通过蚀刻剂除去开口部的氧化硅膜或氮化硅膜等，使硅暴露(图6(C))。
(6)如果需要，除去光致抗蚀剂5f，通过干式蚀刻、湿式蚀刻，制作微孔5h(图6(D))。
(7)根据需要，除去光致抗蚀剂5f，得到第一方案的微孔阵列芯片(图6(E))。
实施例3(遮沿结构实施例)
图7表示由本发明的第二方案制作的微孔结构。
本结构只要是半导体基板、树脂基板等与加工时上面薄膜的材料加工容易程度有选择性，即可实现。在(100)面硅基板11表面上形成的微孔13的开口直径、深度都是数微米至数十微米。未形成孔的表面被氧化膜或金属等薄膜层12’覆盖。在通过对基板进行蚀刻而形成的孔的开口部13a上附有由薄膜层12’形成的遮沿状突起部14。薄膜层12’的厚度在形成时控制在数百纳米至数微米。由薄膜层12’形成的遮沿状突起部14在蚀刻并形成微孔13时，可通过薄膜层12’不被过度蚀刻，且对基板蚀刻到薄膜层12’的下部的蚀刻方法来实现。
本实施例中，在图9中例如使用代表性的半导体基板-硅来说明其制作过程。
(1)热氧化(100)硅基板11，在表面形成最厚为数微米左右的薄膜层12。[图9(A)]
(2)通过光蚀刻步骤，将孔图案15转印在硅基板11上，只有孔部分暴露硅。[图9(B)]
(3)将硅在氢氧化四甲基铵水溶液(90℃、25％)中浸泡数十分钟，进行蚀刻。蚀刻时间根据所需孔的深度d和遮沿的大小w来决定。[图8(B)]
(4)蚀刻规定的时间，将硅基板从蚀刻溶液中取出。
经过以上的步骤，可形成图9(C)的结构。这里所用的氢氧化四甲基铵水溶液对氧化膜的蚀刻慢，对孔侧面方向的蚀刻快，因此可形成氧化膜下的中空结构。
第二方案的微孔阵列芯片可以是图9(D)和(E)的结构。具有图9(D)和(E)结构的微孔的阵列芯片可以将上述方法进行以下变更来实现。
例如，选择硅基板时，图9(D)通过适当选择RIE干式蚀刻、基板面方位或孔图案来实现。例如，基板面方位为(100)或(110)、(111)面，可选择使与基板表面垂直的蚀刻面露出的图案形状。图9(E)可通过显示各向同性蚀刻特性的蚀刻方法来实现。例如，通常的干式蚀刻或通过氟酸和硝酸的混合液进行的蚀刻中，硅被各向同性地蚀刻，因此可容易地得到本发明的第二方案的结构。
薄膜层不限于氧化膜，可以改为有高浓度杂质扩散的硅、锗、硅锗、金属薄膜、树脂等。蚀刻可以是湿式蚀刻、干式蚀刻等的任何形式。湿式蚀刻中，可以将基板一并进行处理，因此产品量产效率优异。
将由上述方法得到的微孔阵列芯片的各尺寸(图10所示)变更为表1的记载，评价微孔阵列芯片的阵列比率(填充率)。结果如表1所示。所接种的细胞浓度为105个细胞/μL。
细胞阵列比率(填充率)的评价方法
1.由小鼠采集淋巴细胞。此时，所得细胞的浓度为1微升中含104-105个细胞(104-105个细胞/μl)。为了保存，将细胞装入HBSS(Hank’s平衡盐溶液)中。
2.对各细胞进行荧光染色。将各细胞用CellTracker Orange进行染色，该染色物质对测定中使用的荧光扫描仪的激励波长(532nm)发出荧光。
3.将染色的细胞用微量移液器铺于硅芯片上。重复接种3次，最后清洗除去未进入孔中的细胞。
4.用盖玻片覆盖，以防芯片干燥，用微阵列扫描仪读取荧光强度。
5.选择芯片上4500个孔，计数其中发荧光的孔数。阵列比率(填充率)由以下的式子计算。
阵列比率(填充率)＝(发荧光的孔数/4500)×100
表1
样品的遮沿与孔的尺寸和阵列比率(填充率)的关系
对样品A和B研究其遮沿及孔的尺寸的不同会引起阵列(填充)比率怎样变化。结果，细胞直径为8μm时，样品B的阵列(填充)比率比样品A的阵列(填充)比率差。这可能由于样品B的开口直径2r过大。
阵列(填充)比率是孔越深则比率越高，但象样品B那样开口大，则阵列(填充)比率可见减少的倾向。因此，孔的设计优选适当选择其深度、开口直径、遮沿尺寸来进行。
实施例4
(氟碳膜形成实施例)
图11是本发明第三方案的微孔阵列芯片的概略说明图。
硅基板21a表面上排列很多微孔图案21b，其各微孔21b的尺寸为数微米至数十微米。形成的各孔侧壁上形成由CxFy系气体形成的氟碳膜21c，由于表面能量低的效果而成惰性状态。显示疏水性的氟碳膜21c在微孔内部选择性地成膜，不存在于硅的最表面21d。因此，进入微孔21b的生物体细胞A难以粘附，微孔内部设有氟碳膜的效果在微孔深时特别明显地表现出来。
使用硅基板的微孔阵列芯片的制作步骤如图12所示。
(1)在形成了氧化硅膜22a的硅基板22b上涂布例如东京应化工业(株)制造的酚醛清漆树脂系正性光致抗蚀剂OFPR-800(22c)，形成微孔图案22d。此时，显影后的热处理以比通常低的温度(100-110℃左右)进行。
(2)向等离子体干式蚀刻装置中导入SF6等硅蚀刻气体，蚀刻硅基板22b，形成微孔22e。
(3)向该蚀刻装置中导入CxFy系气体，进行等离子体成膜。此时，在孔内部、硅基板表面上形成氟碳膜22f。该步骤可以是将基板搬运到等离子体CVD装置等中，进行同样的处理。
(4)将从装置中取出的基板浸泡在甲醇或丙酮等有机溶剂中，除去光致抗蚀剂。此时，在抗蚀剂上形成的氟碳膜也一起被移走。
(5)可得到硅基板最表面形成氧化硅膜22a、孔内部形成惰性氟碳膜22f的微孔阵列芯片。
按照与实施例3同样的方法，对由上述方法得到的微孔阵列芯片的阵列比率(填充率)进行评价。收集率由下述方法进行评价。结果如表2所示。表2也给出了孔内部未形成氟碳膜的微孔阵列芯片的评价结果。对于各样品，选择孔直径和深度相同的孔。所接种的细胞浓度为105个细胞/μL。
收集率评价方法
1.按照上述细胞阵列比率评价法向微孔阵列中接种细胞。
2.选出任意的多个(10-30个左右)的孔，用显微操作器从孔中取出细胞。此时，不要主动取出，要注意对各孔的取出条件不要有偏差。
3.以可取出细胞的孔数相对于任意选择的孔数的比例表示为收集率。
收集率＝(可取出细胞的孔数/任意选择的孔数)×100
表2
样品 A B C D E F
阵列(填充)比率 99.4％ 99.2％ 99.2％ 99.4％ 99.3％ 98.9％
收集率 0％ 10％ 6.7％ 50％ 30％ 89.3％
样品规格：孔径11μm，深度30μm
样品A-C：无涂膜，蚀刻时间：8分钟
样品D-F：有涂膜，蚀刻时间：8分钟+涂膜时间：1分钟
实施例5
孔内具有氧化膜(氧化硅)的微孔阵列芯片的制作(参照图13)
(1)在形成了氧化硅23a的硅基板23b上涂布例如东京应化工业(株)制造的酚醛清漆树脂系正性抗蚀剂OFPR-800，形成微孔图案23d。
(2)向等离子体干式蚀刻装置中导入SF6等硅蚀刻气体，蚀刻硅基板23b，形成微孔23e。
(3)将从装置中取出的基板用硫酸和过氧化氢水的混合液等抗蚀剂剥离液除去基板上的光致抗蚀剂。
(4)用所谓的RCA清洗，即氨清洗(氨+过氧化氢水+水)、盐酸清洗(盐酸+过氧化氢水+水)清洗基板。
(5)将基板导入干燥氧气氛中的热处理炉，在1100℃进行30分钟热氧化处理。
(6)温度降下后从热处理炉中取出。
(7)在此硅基板表面、孔内形成氧化膜23f，可制作孔内具有氧化膜(氧化硅)的微孔阵列芯片。
按照与上述同样的方法，对由上述方法得到的微孔阵列芯片的阵列比率(填充率)和收集率进行评价。结果如表3所示。对于各样品，选择孔直径和深度相同的孔。所接种的细胞浓度为105个细胞/μL。
表3
样品 A B C D E F
阵列(填充)比率 99.4％ 99.2％ 99.2％ 91.6％ 98.4％ 98.5％
收集率 0％ 10％ 6.7％ 45％ 30％ 55.6％
样品规格：孔径11μm，深度30μm
样品A-C：无氧化膜。蚀刻时间：8分钟
样品D-F：有氧化膜。蚀刻时间：8分钟，氧化温度：1100℃，氧化气氛：干燥氧，氧化时间：30分钟，氧化膜厚：63nm(硅结晶面(100)上)
实施例6
(平滑化处理)
在实施例4的制作中，在实施平滑化处理后，在微孔阵列芯片的内壁形成氟碳膜。平滑化处理使用STS公司的Multiplex ASE蚀刻装置，通过调整蚀刻步骤和保护膜形成步骤的工艺周期时间来进行。如此，制作了内壁具有高度0.5μm的凹凸和高度0.1μm的凹凸两种微孔阵列芯片。内壁具有高度0.1μm的凹凸的微孔的放大照片如图17所示。
按照与上述同样的方法，对由上述方法得到的微孔阵列芯片的收集率进行了评价。结果如表4所示。所接种的细胞浓度为105个细胞/μL。刚接种时，两芯片的收集率没有大的不同。但是，接种后1小时，因平滑化处理而具有高度0.5μm的凹凸的芯片中，收集率降至0％，而因平滑化处理而具有高度0.1μm的凹凸的芯片中，大致保持了刚接种时的收集率。这显示：内壁的凹凸高度小，则随时间的延长而发生的细胞与孔的粘附受到抑制。并且可认为由于内壁的平滑化，实施例4的涂布可有效地发挥功能。
表4
实施例7
(开口部突起的形成)
在实施例4的制作中，微孔开口部形成了高度0.6μm的突起部。使用STS公司的Multiplex ASE蚀刻装置，通过延长蚀刻初期该装置的工艺周期时间，可形成所需高度的突起，并且，突起形成后，通过调整工艺周期时间，可以制作只在开口部具有突起的微孔。在开口部形成突起的微孔的放大照片如图18所示。
制作该微孔后，可在内壁形成氟碳膜。还可在任意的位置形成突起。通过调整工艺周期时间，可以在希望形成突起的位置，例如微孔中间、底面等任意的位置制作突起。通过适当选择其形状或数量，有望获得各种效果。
产业实用性
本发明第一方案的微孔阵列芯片在目标位置具有荧光物质或反射结构物等标记，该标记发挥定位标记的功能，由此可辅助荧光显微镜进行位置识别。第一方案的微孔阵列芯片中，例如通过荧光显微镜或图像扫描仪等，可容易地确定微孔的位置，结果，可容易地特定容纳在各微孔中的特定的一个被检生物体细胞、例如抗原特异性淋巴细胞。结果，例如可取出所检测的抗原特异性淋巴细胞，克隆抗原特异性抗体基因或T细胞受体基因。例如如果可克隆到抗原特异性抗体基因，则可使用该基因，大量生产人源单克隆抗体。将该抗体给予感染症等患者，则可用于感染症等的治疗、预防。并且，通过使用第一方案的微孔阵列芯片，可进行血液中细胞的区分。即，通过将微孔径设定为规定的值，可以将血液中细胞区分成超过微孔径的细胞和低于其的细胞。
根据本发明的第二方案，一旦进入孔内的细胞被孔上面的突起(遮沿)挡住，因此清洗时不会流失到孔外，可以高概率留在孔内。例如孔为倒锥形结构时，通过形成遮沿，使芯片表面和孔内部的流体分布改变，清洗等时，一旦进入的细胞不会随流体流出。并且，一旦进入孔中的细胞即使要出孔外，也会被遮沿挡住，容易留在孔中。
另外，将进入孔中的细胞取出时，通过对孔形状加以改进，可以抑制在吸引时产生的细胞与孔表面的负压发生。即，如果将孔形状制成倒锥形结构，则棱线部分具有减压功能，吸引细胞时，可以使孔与细胞之间不呈真空状态，可容易地进行细胞的收集。
本发明的第三方案的微孔阵列芯片中，各孔可只含有一个淋巴细胞这样的被检生物体细胞，因此，例如可以将抗原特异性淋巴细胞以一个一个的细胞水平进行特定。即，通过使用第三方案的微孔阵列芯片，在抗原特异性淋巴细胞的检测中，微孔中所含的被检淋巴细胞为1个，因此可以将与抗原反应的被检淋巴细胞特定为一个细胞。
结果，例如可取出所检测的抗原特异性淋巴细胞，克隆抗原特异性抗体基因或T细胞受体基因。例如如果可克隆到抗原特异性抗体基因，则可使用该基因，大量生产人源单克隆抗体。将该抗体给予感染症等患者，则可用于感染症等的治疗、预防。

Claims (7)

1.回收单个样品生物细胞的方法，其包含：
在硅制的、包含多个微孔的微孔阵列芯片的每一微孔中储存单个样品生物细胞；以及，
从所述的微孔中回收所述储存的单个样品生物细胞，
其中，每一微孔的形状和尺寸仅容纳一个生物细胞，
其中，在实施平滑化处理后，在所述微孔的内壁形成氟碳膜，
其中，所述微孔的内壁表面形状是平滑的意味着，所述表面的凹凸高度是0-0.1微米的范围，
其中所述微孔的内壁涂覆氟碳膜以防止生物细胞粘附于所述微孔的内壁，且易于从所述微孔回收所储存生物细胞，
其中，所述微孔阵列芯片的孔以外的表面涂覆氧化硅膜，且
其中，所述单个样品生物细胞是与特异抗原反应的抗原特异性B淋巴细胞。
2.权利要求1所述的回收单个样品生物细胞的方法，其中，所述的方法还包括在回收步骤前检测所述的抗原特异性B淋巴细胞。
3.权利要求1或2所述的回收单个样品生物细胞的方法，其中，每一所述微孔是圆筒形、由多个面构成的多面体、倒圆锥形或倒角锥形、或上述两种以上形状的组合形状。
4.权利要求1或2所述的回收单个样品生物细胞的方法，其中，与所述微孔阵列芯片的微孔的平面形状内切的最大圆的直径是要容纳到微孔中的生物细胞直径的0.5-2倍，且微孔的深度是要容纳到微孔中的生物细胞直径的0.5-4倍。
5.权利要求1或2所述的回收单个样品生物细胞的方法，其中，其中所述微孔阵列芯片还包括包围所述多个微孔的疏水性区域。
6.权利要求5所述的回收单个样品生物细胞的方法，其中所述疏水性区域具有硅表面或含氟表面。
7.权利要求1或2所述的回收单个样品生物细胞的方法，其中，对于圆筒形微孔，直径为4至15微米。
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