JP2016174578A - 微小粒子選別装置および前記装置を備えた微小粒子回収装置 - Google Patents

Abstract

【課題】 微小粒子を保持可能な保持手段に保持された目的とする微小粒子を、当該微小粒子を検出する手段の移動等に伴う位置ずれの影響を受けずに検出可能な装置、および前記装置で検出した目的とする微小粒子を回収可能な装置を提供すること。
【解決手段】 微小粒子を保持可能な保持部を設けた保持手段と、前記保持部に保持された微小粒子の中から目的とする微小粒子を検出する手段とを備え、かつ前記目的とする微小粒子が当該粒子の表面または内部に存在する特定物質に蛍光物質が結合された粒子であり、前記微小粒子を検出する手段が前記蛍光物質から発せされる蛍光を検出する手段であり、前記微小粒子を検出する手段で検出可能な位置検出部を前記保持手段にさらに設けた、微小粒子選別装置、および前記選別装置と回収手段とを備えた微小粒子回収装置により、前記課題を解決する。
【選択図】 図３

Description

本発明は、保持部に保持された微小粒子の中から目的とする微小粒子を選別する装置、および前記装置で選別した微小粒子を回収する装置に関する。

溶液中に同じ種類の細胞が含まれていたとしても、当該細胞の性質が個々に異なることが知られている（非特許文献１）。一方で、溶液中に含まれる細胞から通常得られる情報は、個々の細胞の情報が平均化された情報となるため、個々の細胞の情報を得ることは難しい。そのため、溶液中に含まれる細胞を個別に解析し、個々の細胞の情報を得ることへの関心が高まっている。

溶液中に含まれる細胞を個別に解析する例として、血中循環癌細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ、以下ＣＴＣ）の解析があげられる。ＣＴＣは癌の転移や再発に重要な役割を果たすと考えられており、ＣＴＣの解析が可能になると、癌患者の術後診断や投薬方針を決定することができるため、治療の最適化や効率化につながると考えられる。しかしながら、ＣＴＣは未解明な点が多く、またＣＴＣが有する遺伝子の変異やコピー数変化が個々の細胞で異なるという報告もあるため、個別に細胞を解析する必要がある（非特許文献２）。

ＣＴＣは血液中に存在する数が血球細胞と比較して非常に少ない。具体的には、血液１ｍＬあたり、赤血球細胞は５０億個、白血球細胞は３００万から１０００万個含まれているのに対し、ＣＴＣは１０個程度しか含まれない。そのためＣＴＣを解析する際は、多数の血球細胞と少数のＣＴＣとが混合された状態から、ＣＴＣを極力ロスすることなく血球細胞から分離した上で解析する必要がある。

溶液中に含まれる細胞を個々に解析する方法として、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ）や、光ピンセット、誘電泳動、マイクロマニピュレーションを用いた方法が知られている（非特許文献３から５、特許文献１）。ＦＡＣＳとは、蛍光抗体で染色した細胞を液流に乗せて流し、レーザー光の焦点を通過させ、個々の細胞が発する蛍光や前方散乱光、側方散乱光を測定することによって種々の細胞情報を取得し、その情報に基づき特定の細胞を分取する細胞解析方法である。しかしながら特定の細胞を確実に選別することが困難であり、かつソーティングにより細胞が損傷する可能性がある。

光ピンセットは、光を物体に照射した際に生じる光の放射圧を用いて、溶液中の微小粒子を保持する技術である。この技術を光学顕微鏡に導入することで、微小粒子（例えば、１つの細胞）を顕微鏡で観察しながら、非接触・非侵襲で保持し、三次元的に自由に動かすことができる。誘電泳動は、空間的に不均一な電場で分極した微小粒子（例えば、１つの細胞）に力を作用させて当該微小粒子を操作する技術である。この技術は酵素処理や高電圧を必要としないため前記微小粒子へのダメージが少なく、前記微小粒子を特定の位置へ移動可能な技術である。マイクロマニピュレーションは、マイクロオーダーの微小粒子（例えば、１つの細胞）をマイクロマニピュレーターといった精密な操作が可能な装置を用いて操作する技術である。この技術は高い電場や高い圧力をかける必要がないため前記微小粒子へのダメージが少ない。

前述した、光ピンセット、誘電泳動やマイクロマニピュレーションを用いた方法は、微小粒子を含む溶液の中から当該微小粒子を１個単位で操作可能な方法である。溶液中に含まれる微小粒子を、基板上に設けた保持部に保持し、前記保持部に保持された微小粒子の中から目的とする微小粒子を、光ピンセット、誘電泳動またはマイクロマニピュレーションを用いて採取する場合、目的とする微小粒子を形状や光学的情報を基に選別した後、目的とする微小粒子を採取する。光学的情報に基づく選別は、微小粒子表面または内部に存在する特定物質（微小粒子が細胞の場合はタンパク質や遺伝子）へ蛍光物質を結合させ、当該蛍光物質を蛍光顕微鏡で観察して行なうのが一般的である。ＣＴＣのように溶液中に含まれる量が少ない微小粒子を採取する場合は、当該操作によるロスを極力減らしながら採取する必要がある。

微小粒子表面または内部に存在する特定物質に蛍光物質を結合させ、当該蛍光物質を蛍光顕微鏡で観察することで微小粒子を選別する場合、励起光の照射（励起光照射部）によって前記蛍光物質から発せされる蛍光を、当該蛍光波長を選択的に透過する光学系（蛍光透過部）を用いて画像を得た後、画像処理（画像処理部）による選別を行なう。蛍光物質を複数用いる場合は、当該蛍光物質の励起波長と蛍光波長に対応した、励起光照射部、蛍光透過部をそれぞれ用意し、各部を機械的に移動させることで、前記複数の蛍光物質から発せられる蛍光画像を各蛍光について得た後、画像処理部による選別を行なう。しかしながら、励起光照射部および／または蛍光透過部の移動に伴い、各蛍光画像間で得られる画像にずれが生じ、微小粒子の選別に支障をきたすおそれがあった。

また、前述した励起光照射部、蛍光透過部および画像処理部により選別した微小粒子の採取をマイクロマニピュレーションで行なう場合、当該微小粒子を保持した保持手段や当該手段を覆う蓋を取り外すときに前記微小粒子の保持位置がずれ、結果、マイクロマニピュレーションによる採取が困難となるおそれがあった。

特許５００６１１７号公報

Ｇｒｏｒｉａ，Ｈ．Ｈ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４４，２２５９−２２６５（１９８４） Ｍａｒｔｉｎａ，Ａｕｅｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，４，８１２−８１３（２０１３） Ｆｕ，ＡＹ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，１１０９−１１１１（１９９９） Ｈｅｌｌｍｉｃｈ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２６，３６８９−３６９６（２００５） Ｖｏｌｄｍａｎ，Ｊ．，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８，４２５−４５４（２００６）

本発明の課題は、微小粒子を保持可能な保持手段に保持された目的とする微小粒子を、当該微小粒子を検出する手段の移動等に伴う位置ずれの影響を受けずに検出可能な装置、および前記装置で検出した目的とする微小粒子を回収可能な装置を提供することにある。

上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、本発明に到達した。

すなわち本発明の第一の態様は、
微小粒子を保持可能な保持部を設けた保持手段と、前記保持部に保持された微小粒子の中から目的とする微小粒子を検出する手段とを備えた、微小粒子選別装置であって、
前記目的とする微小粒子が、当該粒子の表面または内部に存在する特定物質に蛍光物質が結合された粒子であり、
前記微小粒子を検出する手段が、前記蛍光物質から発せされる蛍光を検出する手段であり、
前記微小粒子を検出する手段で検出可能な位置検出部を、前記保持手段にさらに設けた、
前記選別装置である。

また本発明の第二の態様は、目的とする微小粒子の表面または内部に存在する特定物質に結合する蛍光物質が複数あり、微小粒子を検出する手段が前記複数の蛍光物質から発せされる蛍光を検出する手段である、前記第一の態様に記載の選別装置である。

また本発明の第三の態様は、微小粒子を検出する手段で取得した位置検出部の位置情報に基づき、微小粒子を検出する手段で取得した微小粒子の位置情報を補正する、前記第一または第二の態様に記載の選別装置である。

さらに本発明の第四の態様は、前記第一から第三の態様のいずれかに記載の選別装置と、前記選別装置により選別された目的とする微小粒子をノズルによる吸引吐出により回収する回収手段とを備えた、微小粒子回収装置である。

また本発明の第五の態様は、ノズルの先端部が透光性材料で形成されており、かつ前記ノズルに光を照射するための照射手段および照射した光を前記ノズルの先端部に導くための導光手段を回収手段にさらに設けた、前記第四の態様に記載の回収装置である。

さらに本発明の第六の態様は、以下の（１）から（４）の工程を含む、前記第四または第五の態様に記載の回収装置を用いた、液体に含まれる微小粒子を回収する方法である。
（１）微小粒子を含む液体を保持手段に導入する工程
（２）前記微小粒子を保持手段に設けた保持部に保持させる工程
（３）保持部に保持された微小粒子の中から、微小粒子を検出する手段で目的とする微小粒子を選別する工程
（４）目的とする微小粒子を回収手段で回収する工程
さらに本発明の第七の態様は、以下の（１）から（４）の工程を含む、前記第四または第五の態様に記載の回収装置を用いた、液体に含まれる目的の微小粒子に液体を投与する方法である。
（１）微小粒子を含む液体を基板に導入する工程
（２）前記微小粒子を基板に設けた保持部に保持させる工程
（３）保持部に保持された微小粒子の中から、微小粒子を検出する手段で目的とする微小粒子を選別する工程
（４）回収手段を用いて目的とする微小粒子に液体を投与する工程
また本発明の第八の態様は、前記（２）の工程を誘電泳動力を利用して行なう、前記第六または第七の態様に記載の方法である。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の微小粒子選別装置を構成する保持手段は、微小粒子を保持可能な保持部を設けてればよく、微小粒子を含む液体を界面張力等で維持できれば平面でもよいが、側壁を設けた方が当該液体を安定に保持できる点で好ましい。また微小粒子を含む液体を前記保持手段に導入し、前記微小粒子を前記保持部に保持させる方法に特に限定はなく、単に保持部に微小粒子を含む液体を導入するだけでもよいし、微小粒子を含む液体を導入した後、遠心力を利用して保持部へ強制的に微小粒子を導入させてもよい。中でも細胞を含む液体を導入した後、誘電泳動力を利用して保持部へ細胞を導入させると、微小粒子を保持部へ効率的に保持させることができる点で好ましい。

本発明において特定物質とは、微小粒子表面または内部に存在する、目的とする微小粒子を特定させるための物質であり、微小粒子が細胞の場合はタンパク質や遺伝子が例示できる。特定物質と蛍光物質との結合は、共有結合、静電気力による結合、抗原−抗体結合、リガンド−レセプター結合、ビオチン−アビジン結合、ヌクレオチド間のハイブリダイズ等の中から特定物質の態様を考慮し適宜選択すればよい。

本発明の微小粒子選別装置は、微小粒子を検出する手段が目的とする微小粒子の表面または内部に存在する特定物質に結合された蛍光物質から発せられる蛍光を検出する手段であり、かつ保持手段に前記微小粒子を検出する手段で検出可能な位置検出部をさらに設けていることを特徴としている。位置検出部の材料は微小粒子を検出する手段で検出可能な蛍光を発する蛍光材料で形成すればよい。位置検出部の形状は微小粒子を検出する手段で検出可能な形状であれば特に限定はなく、十字型や四角型が例示できる。

本発明の微小粒子選別装置は、微小粒子を検出する手段で取得した位置検出部の位置情報に基づき、前記手段で検出した微小粒子の位置情報を補正することができる。補正方法の一態様として、保持手段に位置検出部を３箇所以上設け、保持手段を覆う蓋を取り外す前と後とで、微小粒子を検出する手段を用いて前記位置検出部の位置情報を取得し、アフィン変換法、ヘルマート変換法、最小二乗法による非線形変換法等で補正計算することで、位置ずれの有無と位置情報を補正する方法がある。補正方法の別の態様として、目的とする微小粒子の表面または内部に存在する特定物質に結合された複数の蛍光物質から発せられる蛍光を微小粒子を検出する手段を用いて各蛍光毎に位置検出部を含めて検出し、得られた位置検出部の位置情報からその中央座標を各蛍光毎に求め、各蛍光間の当該中央座標のずれを計算することで補正する方法がある。

本発明の微小粒子選別装置により目的とする微小粒子を選別した後は、当該目的とする微小粒子をノズルによる吸引吐出により回収する回収手段を用いて回収することで、試料中に含まれる目的とする微小粒子を選択的に回収することができる。なお前記回収手段を構成するノズルの先端部を透光性材料で形成し、かつ前記ノズルに光を照射するための照射手段および前記照射した光を前記ノズルの先端部に導くための導光手段を前記回収手段にさらに設けることで、目的とする微小粒子が保持された保持部の位置（水平位置および垂直位置）の位置合わせが容易となるため、その後の回収手段（ノズル）による、前記目的とする微小粒子を回収する工程や前記目的とする微小粒子へ液体を投与する工程を、確実かつ容易に行なうことができる（特願２０１５−０１８４１０号）。

本発明の装置は、微小粒子を保持可能な保持部を設けた保持手段と前記保持部に保持された微小粒子の中から目的とする微小粒子を検出する手段とを備えた微小粒子選別装置であって、前記目的とする微小粒子が当該粒子の表面または内部に存在する特定物質に蛍光物質が結合された粒子であり、前記微小粒子を検出する手段が前記蛍光物質から発せされる蛍光を検出する手段であり、前記微小粒子を検出する手段で検出可能な位置検出部を前記保持手段にさらに設けていることを特徴としている。本発明により、位置ずれの影響を受けることなく、目的とする微小粒子の選別が可能となる。またノズルによる吸引吐出により回収する回収手段で選別した目的とする微小粒子を回収したり、前記微小粒子に液体を投与するときも、前記位置ずれの影響を受けることなく行なうことができる。

本発明の装置は液体中に含まれる細胞から目的とする細胞を選別する装置、前記目的とする細胞回収する装置、および前記目的とする細胞に液体を投与する装置として好ましい。中でも、血中循環癌細胞（ＣＴＣ）といった、生体試料（血液試料）中に含まれる数が少ない細胞を選別、回収する装置として特に好ましい。

本発明の微小粒子選別装置を構成する基板の一例を示した図（分解図）である。 図１に示す基板の正面図である。 本発明の微小粒子選別装置を構成する微小粒子保持手段の一例を示した図である。（Ａ）は平面図であり、（Ｂ）は微小粒子保持手段の四隅に設けた位置検出部（四角マーク）の拡大図であり、（Ｃ）は（Ａ）の一部領域を拡大した図である。 本発明の微小粒子回収装置の一例を示した図である。（Ａ）は平面、正面および右側面を、（Ｂ）は平面、正面および左側面を、それぞれ示した図である。 本発明の微小粒子回収装置を用いた、微小粒子の回収方法の一例を示した図である。 図５に示す微小粒子の回収方法のうち、（６）から（８）の工程を詳細に示した図である。 本発明の微小粒子選別装置を構成する回収手段の好ましい態様を示す図である。 実施例で作製した微小粒子保持手段の詳細図である。（Ａ）は平面図であり、（Ｂ）は微小粒子保持手段の四隅に設けた位置検出部（四角マーク）の拡大図である。 実施例２および３ならびに比較例１の結果を示した図である。黒丸は実施例２（３点補正）の結果を、黒ひし形は比較例１の結果を、白丸は実施例３（１点補正）の結果を、それぞれ示す。 実施例４において、画像の位置補正を行なわなかったときの蛍光画像（抗ＣＫ抗体由来の蛍光画像、抗ＣＤ４５抗体由来の蛍光画像およびＤＡＰＩ蛍光画像を重ね合わせた画像）。 実施例４において、画像の位置補正を行なったときの蛍光画像（抗ＣＫ抗体由来の蛍光画像、抗ＣＤ４５抗体由来の蛍光画像およびＤＡＰＩ蛍光画像を重ね合わせた画像）。

以下、図面を用いて本発明をさらに詳細に説明する。

本発明の微小粒子回収装置を構成する基板の一例を図１に示す。また図１に示した基板の正面図を図２に示す。

図１に示す基板１００は、
貫通孔１１１ａを有した平板状の遮光部材１１１と、貫通孔１１２ａを有した平板状の絶縁体１１２と、導入口１１３ａ、排出口１１３ｂおよび貫通部１１３ｃを有した平板状のスペーサ１１３とからなる微小粒子導入保持手段１１０と、
微小粒子導入保持手段１１０を上下方向に密着して挟むよう設けた電極１２１・１２２と、
電極１２１・１２２同士を接続する導線１３０と、
電極１２１・１２２に信号を印加する信号発生器１４０と、
を備えている。遮光部材１１１が有する貫通孔１１１ａと絶縁体１１２が有する貫通孔１１２ａとは互いに同一の寸法および形状であり、かつそれぞれの貫通孔の位置が一致するよう遮光部材１１１および絶縁体１１２を設けている。貫通孔１１１ａ、貫通孔１１２ａおよび遮光部材１１１の下部に密着して設けた電極１２１により保持部１５０が構成され、導入口１１３ａから微小粒子を含む液体を導入すると、貫通部１１３ｃを通じて保持部１５０へ微小粒子が導入される。電極１２２はスペーサ１１３上部に密着して設けており、導入口１１３ａから導入した、微小粒子を含む液体の飛散や蒸発を防止している。なお保持部１５０に保持した微小粒子の回収を容易にするため、電極１２２はスペーサ１１３から取り外し可能な構造となっている。

図１に示す基板１００のうち、電極１２１、遮光部材１１１および絶縁体１１２から構成される微小粒子保持手段１１４の一例を図３に示す。図３に示す微小粒子保持手段１１４の周囲（四隅）には、保持手段１１４の位置ずれを検出し補正するための位置検出部（四角マーク）１１５を、遮光部材１１１および絶縁体１１２を設けた位置には、微小粒子を検出手段で取得した微小粒子の位置を検出し補正するための位置検出部（四角マーク１１５および十字マーク１１６）を、それぞれ設けている（図３）。

本発明の微小粒子回収装置の一例を図４に示す。

図４に示す装置は、
装置の土台となるベース３１０と、
図１および２に記載の基板１００と、
基板１００および後述する回収チューブ５００をＸＹ軸方向（水平方向）に移動させるための基板移動部３２０と、
基板１００に励起光源を照射するための励起光源照射部３３０と、
励起光源照射部３３０を基板１００に照射することで得られる、基板に設けた保持手段および保持部に保持された微小粒子に係る蛍光情報を取得するための検出部（対物レンズ）３４０および計測部（画像取得カメラ）３５０と、
前記蛍光情報を照合・解析することで、前記保持部内に保持された微小粒子由来の蛍光情報を抽出するための解析部３６０と、
ベース３１０上に備えた、基板１００に設けた保持部に保持された、目的とする微小粒子を回収するためのノズル４１０および吸引吐出ポンプ４２０と、
ノズル４１０をＺ軸方向（垂直方向）に移動させるためのノズル移動部４３０と、
ノズル４１０で吸引した前記目的とする微小粒子を回収するための回収チューブ５００と、
を備えている。なお基板１００に設けた保持部に保持された微小粒子は、検出部３４０および計測部３５０で光学的に検出することから、少なくとも前記保持部は透光性材料で形成する必要がある。ノズル４１０の先端部は、測定試料由来のコンタミネーションを防止するため、取り外し可能な構造とするとよい。

次に微小流路回収装置が図１から４に示す装置であり、かつ微小粒子が細胞である場合の、本発明の微小粒子回収方法の一例を図５および６を用いて説明する。

（１）保持部へ細胞を導入する工程
図１に示す基板１００に設けた導入口１１３ａから細胞２００を含む液体を導入し、誘電泳動力６００を利用して細胞２００を保持部１５０へ導入させる。具体的には、信号発生器１４０から電極１２１・１２２へ交流電圧を印加することで誘電泳動力６００を発生させ、保持部１５０へ細胞２００を導入する。図１に示す基板１００に導入する細胞を含む液体は、誘電泳動力で細胞が移動できるよう懸濁された液であればよく、例えば、マンニトール、グルコース、スクロース等の糖類を含んだ水溶液や、当該水溶液に塩化カルシウム、塩化マグネシウム等の電解質、および／またはＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）等のタンパク質をさらに含んだ水溶液に、細胞を含んだ試料を懸濁させた液体があげられる。特に細胞を含む液体として、マンニトールを含む水溶液に細胞を含んだ試料を懸濁させた液体を用いると、細胞へのダメージが少なくなる点で好ましい。添加するマンニトールの濃度は等張液となる濃度とすればよく、具体的には２５０ｍＭから３５０ｍＭの間とするとよい。

信号発生器１４０から電極１２１・１２２へ印加する交流電圧は、保持部１５０に保持された細胞２００の充放電が周期的に繰り返される波形を有した交流電圧とすると好ましく、周波数を１００ｋＨｚから３ＭＨｚまでの間とし、電界強度を１×１０^５から５×１０^５Ｖ／ｍまでの間とすると特に好ましい（ＷＯ２０１１／１４９０３２号および特開２０１２−０１３５４９号公報参照）。

（２）接着物質７００を含む試薬を添加する工程
図１に示す基板１００に設けた導入口１１３ａから接着物質７００を含む試薬を導入することで、保持部１５０を接着物質７００で修飾し、接着物質７００を介して保持部１５０と保持部に導入した細胞２００とを接着させる。なお接着物質７００による保持部１５０の修飾は前記（１）の工程の前に実施してもよい。

接着物質は細胞と特異的に結合な物質であれば特に制限はない。一例として、細胞表面にある物質と特異的に結合可能な分子（リガンド−レセプター、糖鎖−レクチン、抗原−抗体）や、細胞の脂質二重膜に結合する脂質オレイル基を有したＢｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ Ａｎｃｈｏｒ ｆｏｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＢＡＭ）があげられる。中でも、ポリ−Ｌ−リジンが、比較的短時間に細胞表面と静電的に結合できる点で好ましい。

接着物質としてポリ−Ｌ−リジンを用いる場合、その濃度は０．０１（ｗ／ｖ）％以下とすると好ましい。また本工程は、細胞へのダメージを少なくするために、短時間で完了させるとよい。本工程の具体例として、ポリ−Ｌ−リジンを０．０１（ｗ／ｖ）％含む溶液を導入口１１３ａから３分間導入して、保持部１５０を置換する工程があげられる。

本工程を前記（１）の工程の後に実施する場合、信号発生器１４０から電極１２１・１２２へ交流電圧を印加した状態（つまり細胞への誘電泳動力が存在する状態）で実施すると、添加した接着物質７００を含む試薬の流れによる保持部１５０からの細胞２００の脱離を防止できる点で好ましい。前記好ましい態様で本工程を実施する場合、接着物質７００を含む試薬に、前記（１）で導入した、細胞２００を含む液体と同じ濃度の糖類（例えば、２５０ｍＭから３５０ｍＭのマンニトール）を含むとよい。

（３）細胞膜透過試薬を添加する工程
排出口１１３ｂから接着物質７００を含む試薬を排出した後、導入口１１３ａから細胞固定試薬を含む細胞膜透過試薬を導入することで、保持部１５０に導入した細胞２００を標本化する。

細胞膜透過試薬の例として、エタノール、メタノールなどのアルコール類や、サポニン、Ｔｗｅｅｎ ２０（商品名）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（商品名）、ジギトニンなどの界面活性剤があげられる。また添加する細胞固定試薬の例としては、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、パラホルムアルデヒドなどのアルデヒド系の固定液や、金属塩系固定液があげられる。中でも細胞膜透過試薬としてはエタノールが、細胞固定試薬としてはホルムアルデヒドが、それぞれ好ましい。細胞固定試薬を含む細胞膜透過試薬の好ましい具体例として、０．１から１％のホルムアルデヒドを含んだ３０から６５（ｖ／ｖ）％のエタノールがあげられる。細胞固定試薬を含む細胞膜透過試薬の導入時間（保持部への試薬置換時間）は５から１５分が好ましく、１０分前後がより好ましい。

（４）ブロッキング試薬を添加する工程
後述の標識工程における非特異標識の発生を防止するため、導入口１１３ａから洗浄液を導入して、残存した細胞膜透過試薬を除去した後、導入口１１３ａから非特異標識を防止するためのブロッキング試薬を導入する。洗浄液は、細胞膜透過試薬に含まれる有機溶媒成分（エタノール、ホルムアルデヒド等）を除去可能な水系溶媒であればよく、例えば、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）があげられる。また洗浄液に界面活性剤を添加すると、液置換による洗浄が容易に行なえるため好ましく、前記好ましい洗浄液の一例として、Ｔｗｅｅｎ ２０（商品名）を０．０５（ｖ／ｖ）％添加したＰＢＳがあげられる。

ブロッキング試薬としては、タンパク質や界面活性剤を含んだ水溶液が例示できる。具体的にはタンパク質としてはＢＳＡ、ゼラチン、カゼインなどが、界面活性剤としてはサポニン、Ｔｗｅｅｎ ２０（商品名）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（商品名）、ジギトニンなどが、それぞれ例示できる。ブロッキング試薬を導入する時間（保持部への試薬置換時間）は含まれる成分およびその濃度によって異なるが、ＢＳＡを１（ｗ／ｖ）％含んだＰＢＳをブロッキング試薬として用いる場合、５から１５分導入すればよく、１０分前後の導入時間とすると好ましい。

（５）標識試薬を添加する工程
排出口１１３ｂからブロッキング試薬を排出した後、導入口１１３ａから標識試薬を導入して、標本化した細胞を標識させる（標識化細胞２１０）。標識試薬は、目的細胞の検出に適した標識物質の中から適宜選択すればよい。例えば目的細胞が血中循環癌細胞（ＣＴＣ）の場合、蛍光標識された抗サイトケラチン抗体もしくは抗ＥｐＣＡＭ抗体を含む溶液や、白血球染色試薬である抗ＣＤ４５抗体と細胞核染色試薬である４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８（商品名）、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（商品名）等との混合溶液が使用できる。なお抗原抗体反応を利用して目的細胞を標識する場合であって、当該細胞における抗原発現量が少ないときは、当該抗原に対する抗体を含む標識試薬を添加後、添加した抗体に対する抗体を順次添加していくことで蛍光シグナルを増幅させる方法を採用してもよい。

（６）目的細胞２１０を選別する工程
標識試薬に由来するバックグラウンドの上昇を防止するため、導入口１１３ａから洗浄液を導入して、残存した標識試薬を除去した後、基板移動部３２０で基板をＸＹ軸方向に移動させながら、検出部３４０および計測部により、標識化細胞（目的細胞）２１０の蛍光および位置情報を取得し、目的細胞２１０の位置を検出する。位置情報の取得は、あらかじめ検出部３４０および計測部により、基板（微小粒子保持手段）に設けた位置検出部のうち最低３箇所を検出し、その中心（重心）を算出し記録する。その後、保持部１５０に保持された目的細胞２１０由来の蛍光情報に基づき、前記検出した位置検出部のうちの１点を（ｘ，ｙ，ｚ）＝（０，０，焦点位置からの計測値）としたときの位置情報を取得し、検出部３４０および計測部で得られた蛍光情報から目的細胞２１０を選別し、目的細胞２１０の位置を検出する。洗浄液としては、標識試薬を除去できる水系の溶媒であればよく、一例として前記（４）の工程で洗浄液として用いた、ＰＢＳやＴｗｅｅｎ ２０を０．０５（ｖ／ｖ）％添加したＰＢＳがあげられる。なお目的細胞２１０がＣＴＣの場合、検出部３４０および計測部により、抗サイトケラチン抗体または抗ＥｐＣＡＭ抗体由来の蛍光が確認され、ＤＡＰＩ等の細胞核染色試薬由来の蛍光が確認され、かつ抗ＣＤ４５抗体由来の蛍光が確認されない細胞を選別すればよい。

（７）目的細胞２１０を回収する工程
検出部３４０および計測部により選別した目的細胞２１０を回収するために、電極１２２をスペーサ１１３から取り外した後、ノズル４１０で吸引することで、基板１００から目的細胞２１０を回収する。電極１２２を取り外す際は、スペーサ１１３を剥がさないよう取り外す必要がある。もしスペーサ１１３が絶縁体１１２から剥がれると、装置内に保持されている溶液が系外に流れてしまい、目的細胞２１０が破壊されるからである。

目的細胞２１０の吸引は、基板移動部３２０およびノズル移動部４３０を用いて前記（６）の工程で検出した目的細胞２１０が標本化されている保持部をノズル４１０の中心に移動させ、ノズル４１０により液を吸引することで目的細胞２１０を回収する。電極１２２をスペーサ１１３から取り外す際、基板（微小粒子保持手段）と検出部３４０の光軸中心との間に数十から数百μｍのずれが生じるため、スペーサ１１３から取り外す前と後で、基板（微小粒子保持手段）に設けた位置検出部のうち、少なくとも３点についてその中心をそれぞれ算出する。算出した結果からヘルマート変換式を用いてスペーサ１１３から取り外す工程で生じたずれを算出する。得られた補正値を用いて、基板移動部３２０の物理アドレスを補正して基板（微小粒子保持手段）の正確な位置として認識させる。なお、あらかじめノズル４１０を検出部３４０の光軸中央に調整しておくことで前記補正した保持手段１１０の位置に変換された目的細胞２１０の位置へ、基板移動部３２０により移動させればよい。

またノズル４１０による目的細胞２１０の吸引位置を、目的細胞２１０を標本化した保持部１５０の中心から水平方向に一定距離ずらした位置とすると、目的細胞２１０の吸引を容易に行なえるため好ましい。具体的には目的細胞２１０の吸引位置を、保持部５０の中心から水平方向に保持部１５０の直径の０．１倍から２倍の長さ分（ただし隣接する保持部１５０間の距離の２分の１以下）ずらし、かつ保持部１５０の高さから垂直方向に保持部１５０の高さの０．０１倍から２倍の高さ分高い位置とすると好ましい。またノズル４１０による目的細胞２１０の吸引操作の前に、目的細胞２１０と保持部１５０との接着性を弱める酵素を含む溶液を添加する操作を行なってもよい。

前記（６）の工程で検出した目的細胞２１０が標本化されている保持部をノズル４１０の中心に移動させる操作は、基板移動部３２０により前記保持部の位置情報からノズル４１０先端部の中心位置を保持部１５０の中心（または保持部の中心から水平方向に一定距離ずらした位置）に合致させるよう基板１００を移動させた後、ノズル移動部４３０によりノズル４１０先端部の垂直方向の位置を、保持部１５０の高さから垂直方向に一定の高さ分高い位置（例えば、保持部１５０の高さの０．０１倍から２倍の高さ分高い位置）まで移動させて行なう。

検出（対物レンズ）３４０および計測部（画像取得カメラ）で取得するノズル４１０先端部の画像は不明瞭なため、そのままではノズル４１０先端部の位置を正確に把握するのは困難であり、目的細胞２１０が標本化されている保持部を正確にノズル４１０の中心へ移動させるのは困難である。本態様の微小粒子回収装置に設けたノズル４１０は図７に示すように、根元に照射部４４０を設けており、照射部４４０から光４５１を照射すると、導光部４６０を経由し、ノズル４１０先端から基板へ光が照射される。そうすることでノズル４１０先端部を、検出部３４０および計測部により、リング状の鮮明な画像として取得できるため、ノズル４１０先端部の位置を正確に算出することができ、目的細胞２１０が標本化されている保持部からのずれを算出することが容易となる。

同様にノズル４１０先端部の垂直方向の位置も、図７のノズルによりノズル４１０先端部から基板へ光を照射し、検出部３４０および計測部により得られる画像のコントラストまたは画像微分値の最大値の変化等を計測し、焦点位置を算出することで、正確に算出することができる。

なお前述した操作を、前記（６）の工程（細胞を選別する工程）を行ないながら実施する際は、ノズル４１０先端部から照射される光および目的細胞由来の蛍光以外の光が検出部（対物レンズ）３４０に極力入射されない必要がある。本態様の微小粒子回収装置に設けたノズル（図７）は、根元から先端部までの間に２か所屈曲しており、ノズル根元から照射する光４５１の方向が基板および検出部３４０に直接照射しない方向となっているため、好ましいノズル４１０の態様といえる。

図４に示す装置では、ノズル４１０で目的細胞２１０を吸引する方法として、ポンプ４２０を用いた陰圧により吸引する方法を採用している。目的細胞２１０は保持部１５０に比較的強く接着されていることから、ポンプとしてシリンジポンプを用いる場合は高流速で吸引する必要があり、具体的には０．０１μＬ／ｓ以上の流量が必要である。しかしながら流量を大きくしすぎると、流路内に気泡が発生し、著しく流量が低下してしまうため、流量は０．０１から５．０μＬ／ｓの間が好ましい。

ノズル４１０の内径は、吸引後のノズル４１０の詰まりを防ぐため、吸引する細胞の直径よりも大きくするとよい。例えば、直径３０μｍの保持部（保持部間の距離は５０μｍ）に導入された細胞を吸引する場合は、ノズル４１０の内径を２５μｍから３５μｍの間とするとよい。

（８）回収した目的細胞２１０を回収チューブ５００へ吐出する工程
ノズル４１０による吸引で回収した目的細胞２１０を回収チューブ５００へ吐出し、回収チューブ５００へ目的細胞２１０が吐出されたかどうかを検出部３４０で検出する。図３に示す装置では、ノズル２１０で目的細胞２１０を吐出する方法としてポンプ４２０を用いた陽圧により吐出する方法を、検出部３４０で目的細胞２１０を検出する方法として、回収チューブ５００底面に吐出された目的細胞２１０由来の蛍光画像を底面側から（対物レンズ）３４０および計測部（画像取得カメラ）で取得する方法を、それぞれ採用している。なお検出部３４０で目的細胞２１０を検出する方法としては、前述した方法の他にも、回収チューブ５００底面に吐出された目的細胞２１０由来の蛍光画像を回収チューブ５００開口部側から検出部３４０および計測部で取得する方法や、あらかじめ目的細胞２１０を含む溶液および比重の重たい液体を回収チューブ５００へ滴下した上で、当該回収チューブ５００へ目的細胞２１０を吐出することで重層させた後、回収チューブ５００底面側に設けた検出部３４０から蛍光画像を取得する方法があげられる。

回収チューブ５００に回収された目的細胞２１０はその後遺伝子解析等さらなる解析に供される。

（９）目的細胞の近傍に薬液を吐出する工程
本態様の微小流路回収装置は、前記（６）の工程で検出した目的細胞に特殊な薬液を吐出することも可能である。あらかじめ必要な薬液をノズルおよび吸引吐出用ポンプで必要量吸引し、前記（７）の工程に記載の方法と同様な方法で、前記（６）の工程で検出した目的細胞が標本化されている保持部をノズルの中心に移動させた後、ノズルおよび吸引吐出用ポンプで前記保持部へ薬液を吐出すればよい。

以下、実施例および比較例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は本例の内容に限定されるものではない。

実施例１ 微小粒子保持手段の作成
以下に示す方法で、図３に示す、遮光部材１１１と絶縁体１１２と電極１２１とが一体となった微小粒子保持手段１１４を作成した。
（１）ＩＴＯ導電膜を成膜した１．２ｍｍ厚の青板ガラス基板上にＣｒ膜を２００ｎｍ成膜した。
（２）レジスト剤をスピンコーターで塗布し、微細孔１１１ａ、位置検出部（四角マーク）１１５・１１６、および位置検出部（十字マーク）１１７を形成する領域をマスキングした。なお位置検出部１１５は図３（Ｂ）に示すように内部にさらに細かな四角形状を形成した。一般に対物レンズの焦点位置の決定は、顕微鏡の対物レンズを上下させたときに撮像した画像の微分値の変化を求め、微分値が最大となる対物レンズの位置を最も焦点が合った位置に決定する。前記操作を行なう際、コントラストの変動部（明暗の差）を撮像画像に多く分布させると、広い範囲の画像領域で焦点位置を容易かつ精度よく特定することができるため、位置検出部１１５を図３（Ｂ）に示した形状とした。
（３）ＵＶ光源で露光し、エッチング（現像液：リン酸塩：４％）処理することで、マスキングした領域のＣｒ膜を除去した後、ベークすることでパターンを形成した。
（４）レジストを除去後、マイクロケム社製ＳＵ−８をスピンコーターにより厚さ４０μｍとなるよう塗布し、９５℃でベーク後、微細孔１１１ａと同じ位置をマスキングした。
（５）ＵＶ光源で露光し、現像工程（現像液：プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート）およびベーク工程により、図３に示す微小粒子保持手段１１４を作製した。なお位置検出部１１６と位置検出部１１７の領域は、エッチング処理でＣｒ膜は除去されているが、ＳＵ−８膜は残存したままである。ＳＵ−８は若干ではあるが自己蛍光を有しているため、検出部および計測部による目的細胞由来の蛍光を検出する際、当該目的細胞とともに位置検出部も検出することができる。

上記方法で実際に作製した微小粒子保持手段１１４を図８に示す。４つの位置検出部１１５ａ・１１５ｂ・１１５ｃ・１１５ｄは一辺５００μｍの四角形状（図８（Ｂ））であり、このうち、位置検出部１１５ａを座標原点（０ｍｍ，０ｍｍ）とした。その他の位置検出部の位置はそれぞれ、位置検出部１１５ｂは（５５ｍｍ，０ｍｍ）となり、位置検出部１１５ｃは（５５ｍｍ，２８ｍｍ）となり、位置検出部１１５ｄは（０ｍｍ，２８ｍｍ）となる（図８（Ａ））。

実施例２ 本発明の微小粒子選別装置の評価（３点補正）
（１）実施例１で作製した微小粒子保持手段１１４（図８）のうち、３つの位置検出部（四角マーク）１１５ａ・１１５ｂ・１１５ｃが蛍光顕微鏡の検出部（対物レンズ）中央に概ね位置するよう、基板移動部を用いて保持手段１１４を移動し、各位置検出部の画像を取得した。
（２）取得した画像を２値化し、位置検出部１１５の四角形状が明確となるように焦点を合わせた。
（３）２値化画像の重心に対物レンズ光軸の中心（または撮像画像の中央）を一致させて、位置検出部１１５ａ・１１５ｂ・１１５ｃの基板移動部での座標に対する物理座標を計測した。
（４）保持手段１１４の取り外し毎に位置検出部１１５ａ・１１５ｂ・１１５ｃにおける基板移動部での物理座標を計測し、ヘルマート変換による補正係数を算出した上で、位置検出部１１５ａを原点とする座標系に変換した（３点補正）。
（５）（４）に記載の補正を行なった後で、図８（Ａ）のＥ領域にある位置検出部（十字マーク）の十字が交差する位置の座標を測定した。
（６）保持手段１１４の取り外し操作を計１０回行ない、その都度（４）に記載の補正および（５）に記載の座標測定を行なった。

結果を図８の黒丸に示す。取得した１０個の座標位置ずれは３μｍ以下であることを確認した。

比較例１
実施例２（１）から（３）の操作を行なった後は、位置座標を補正は行なうことなく、保持手段１１４の取り外し操作を２０回行ない、その都度図８（Ａ）のＥ領域にある位置検出部（十字マーク）の十字が交差する位置の座標を測定した。結果を図９の黒ひし形に示す。取得した２０個の座標位置ずれは最大４０μｍ程度になった。

実施例３ 本発明の微小粒子選別装置の評価（１点補正）
実施例２（４）の補正を位置検出部１１５ａにおける基板移動部での物理座標に基づき行ない（１点補正）、保持手段１１４の取り外し操作を２０回行なった他は、実施例２と同様の操作を行なった。結果を図９の白丸に示す。取得した２０個の座標位置ずれは最大２０μｍとなり、３点補正（実施例２）と比較するとずれは大きくなったものの、補正なし（比較例１）との比較ではずれを抑えることができた。

実施例４ 本発明の微小粒子選別装置による微小粒子選別
（１）実施例１で作製した微小粒子保持手段１１４（図８）に、スペーサ１１３および電極１２２を組み合わせることで、図１に記載の基板１００を作製した。
（２）作製した基板１００に設けた導入口１１３ａからモデル癌細胞を導入し、図５（１）から（５）までの操作を行なった。なお標識試薬としては、細胞を標識するための蛍光標識された抗ＣＫ（Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ）抗体、白血球を染色するための蛍光標識された抗ＣＤ４５抗体と、細胞核染色試薬であるＤＡＰＩ（４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）を用いた。なお抗ＣＫ抗体への蛍光標識、抗ＣＤ４５抗体への蛍光標識、およびＤＡＰＩが発する蛍光波長は、それぞればらばらとなるよう（すなわち、３つの蛍光として測定できるよう）設定した。
（３）（２）の操作後、保持手段１１４のうち貫通部１１３ｃに位置する領域全てに対して、抗ＣＫ抗体への蛍光標識、抗ＣＤ４５抗体への蛍光標識、およびＤＡＰＩが発する蛍光を測定し、画像を取得した。その後各撮像位置における抗ＣＫ抗体由来の蛍光画像を基準に位置検出部（十字マーク）の形状を認識し、各位置検出部（十字マーク）の座標を算出した。
（４）抗ＣＤ４５抗体由来の蛍光画像およびＤＡＰＩ蛍光画像について、（３）に記載の方法で各位置検出部（十字マーク）の座標を算出し、各画像における位置検出部（十字マーク）の座標を算出した。
（５）抗ＣＫ抗体由来の蛍光画像を基準に、抗ＣＤ４５抗体由来の蛍光画像およびＤＡＰＩ蛍光画像を位置検出部（十字マーク）が重なるよう位置補正を行なった後、各画像毎に輝度情報を基に閾値を設け２値化処理を行なった。

抗ＣＫ抗体由来の蛍光画像、抗ＣＤ４５抗体由来の蛍光画像およびＤＡＰＩ蛍光画像を重ね合わせた結果を図９および１０に示す。図１０は（５）に記載の位置補正を行なわなかったときの結果であり、図１１は（５）に記載の位置補正を行なったときの結果である。保持手段に位置検出部を設け、各画像における位置検出部の座標に基づき補正することで、図１１に示す画像が得られるため、保持部に保持された目的細胞の選別が容易となる。

１００：基板
１１０：微小粒子導入保持手段
１１１：遮光部材
１１２：絶縁体
１１１ａ、１１２ａ：貫通孔
１１３：スペーサ
１１３ａ：導入口
１１３ｂ：排出口
１１３ｃ：貫通部
１１４：微小粒子保持手段
１１５、１１６：位置検出部（四角マーク）
１１７：位置検出部（十字マーク）
１２１、１２２：電極
１３０：導線
１４０：信号発生器
１５０：保持部
２００：細胞
２１０：標識化細胞（目的細胞）
３１０：ベース
３２０：基板移動部
３３０：励起光源
３４０：検出部（対物レンズ）
３５０：計測部（画像取得カメラ）
３６０：解析部
４１０：ノズル
４２０：吸引吐出用ポンプ
４３０：ノズル移動部
４４０：ノズル照射部
４５１：ノズル照射部からの光
４５２：ノズル先端部から発せられる光
４６０：導光部
５００：回収チューブ
６００：誘電泳動力
７００：接着物質

Claims (8)

1. 微小粒子を保持可能な保持部を設けた保持手段と、前記保持部に保持された微小粒子の中から目的とする微小粒子を検出する手段とを備えた、微小粒子選別装置であって、
   前記目的とする微小粒子が、当該粒子の表面または内部に存在する特定物質に蛍光物質が結合された粒子であり、
   前記微小粒子を検出する手段が、前記蛍光物質から発せされる蛍光を検出する手段であり、
   前記微小粒子を検出する手段で検出可能な位置検出部を、前記保持手段にさらに設けた、
   前記選別装置。
2. 目的とする微小粒子の表面または内部に存在する特定物質に結合する蛍光物質が複数あり、微小粒子を検出する手段が前記複数の蛍光物質から発せされる蛍光を検出する手段である、請求項１に記載の選別装置。
3. 微小粒子を検出する手段で取得した位置検出部の位置情報に基づき、微小粒子を検出する手段で取得した微小粒子の位置情報を補正する、請求項１または２に記載の選別装置。
4. 請求項１から３のいずれかに記載の選別装置と、前記選別装置により選別された目的とする微小粒子をノズルによる吸引吐出により回収する回収手段とを備えた、微小粒子回収装置。
5. ノズルの先端部が透光性材料で形成されており、かつ前記ノズルに光を照射するための照射手段および照射した光を前記ノズルの先端部に導くための導光手段を回収手段にさらに設けた、請求項４に記載の回収装置。
6. 以下の（１）から（４）の工程を含む、請求項４または５に記載の回収装置を用いた、液体に含まれる微小粒子を回収する方法。
   （１）微小粒子を含む液体を保持手段に導入する工程
   （２）前記微小粒子を保持手段に設けた保持部に保持させる工程
   （３）保持部に保持された微小粒子の中から、微小粒子を検出する手段で目的とする微小粒子を選別する工程
   （４）目的とする微小粒子を回収手段で回収する工程
7. 以下の（１）から（４）の工程を含む、請求項４または５に記載の回収装置を用いた、液体に含まれる目的の微小粒子に液体を投与する方法。
   （１）微小粒子を含む液体を基板に導入する工程
   （２）前記微小粒子を基板に設けた保持部に保持させる工程
   （３）保持部に保持された微小粒子の中から、微小粒子を検出する手段で目的とする微小粒子を選別する工程
   （４）回収手段を用いて目的とする微小粒子に液体を投与する工程
8. 前記（２）の工程を誘電泳動力を利用して行なう、請求項６または７に記載の方法。

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