JP4192097B2 - 相互作用型透明個別細胞バイオチッププロセッサー - Google Patents
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Description
・試験された化合物の機能の効力が、1個だけの無傷な細胞に対するか、または1個だけの無傷な細胞の内部におけるその生物学的作用を観測および測定することによって最も良く推定され得る;
・細胞の細胞間分子相互作用が細胞の内部の「作用環境」の状況において評価され得る;
・毒性および非特異的作用が個々の細胞のレベルで同定され得る;
・選択的な細胞タイプに対する薬物作用が識別され得る;
・薬物の浸透が、1個だけの完全な細胞を適用する研究において評価され得る;
オーファン標的は、細胞に基づく機能的アッセイを必要とする;
・全細胞アッセイでは、タンパク質の精製工程&発現工程が不要になる。
a)生細胞の性質を観測または測定すること;
b)(個体または亜集団としてではなく細胞キャリアを移動させることによって)生細胞を移動させること;
c)生細胞を殺すこと
の1つ以上を細胞毎に行うための方法および装置が開示されている。
一般的に言えば、上記に示された一連の特許によれば、非常に多数の細胞、例えば、(細胞の一群または規定された集団を表す)血液中のリンパ球が、すべての他の細胞から、すなわち、細胞の異なる集団群から最初に分離される。分離プロセスの後、分離されたリンパ球は、選択された試験に同時に供され、その後、それぞれの細胞が、試験または刺激の結果として、特定の性質を示すか否かを明らかにするために別々に調べられる。前記性質を示すすべての細胞の所在地が記録される。従って、分離された細胞のすべてが調べられた後、特定の性質を示したすべての細胞の所在地が明らかにされる。これらの細胞は、リンパ球のより大きな集団全体におけるリンパ球の特定の亜集団を表す。
(a)生細胞が、その特徴的な円錐形断面のために細胞キャリア(CC)の穴に強固に捕捉され、その中で動くことができない。これは、何らかのさらなる処理のために細胞を取り出すことを含む、捕捉された細胞の何らかの機械的な操作を妨げる。
(b)球状であるが、柔軟な生細胞が穴トラップの内部傾斜(湾曲)壁と接触する最大接線円周の下に始まる空間は、この空間への溶液の流出またはこの空間からの溶液の流入がいずれもできないので、何らかの生化学的操作を妨げている。従って、細胞球体の上半分の表面付近のみが色素および/または生化学物質の送達のために利用される状態のままである。例えば、細胞懸濁物において生じるプロセスと比較して、細胞染色速度、ならびに浸透している物質からの細胞内生成物の産生速度が強く影響を受ける(低下する)。同様に、同じ理由から、生成物の放出速度および漏出速度の測定が不正確になる。
(c)CCは不透明であり、そして各トラップの下部開口部(第2の断面)の直径は、捕捉された細胞の直径よりも小さくなければならないので、その場合、捕捉された細胞の像を決して視覚的に観測することができない。これは、多くの研究分野および適用分野では非常に大きな欠陥である。測定されたデータ(すなわち、蛍光強度(FI)、蛍光の偏光または異方性(FP)、蛍光寿命(FLT)、蛍光偏光減衰(FPD)、および電極に基づく反応)と、視覚的に観測されたデータ(すなわち、形態、形状、細胞内区画化など)とを相関させる方法がないからである。
(d)CC上の穴トラップは一度も視覚的に観測することができない。結果として、偶然により、2つ以上の細胞が同じ穴トラップに捕捉されたとき、そのトラップから得られる測定データは区別することができず、かつ捕捉された細胞のいずれとも特異的に関連させることができない。
(e)強い反射のために、黒色化CCが使用されたときでさえ、CCにおける1個だけの捕捉された細胞の散乱光の測定は実現されていない。
(f)電気めっき技術の望ましくない欠点の1つが、米国特許第5506141号の図19〜図22において認めることができるように、平坦な空間(または非常に穏やかに湾曲した空間)が穴の間に生じるということである。通常、それらの全面積は、穴の上部開口部の全面積よりも4倍大きい。従って、負荷された細胞の大きな割合が、穴の内部ではなく、穴と穴との間に沈む。すなわち、負荷効率を低下させることは、サンプルサイズが限られているときには縮小するかもしれないが、細胞の無駄を生じさせる。
(g)金属CCにより誘導される捕捉細胞への毒性が、生理学的環境では金属イオンが放出されるために避けられない。これにより、捕捉された細胞の長期間にわたる測定、インキュベーションおよび/または成長が妨げられるか、または妨害される。純シリコンまたはシリコン誘導体でCC表面を被覆しても、金属イオンがCC底部(第2の面)からCC穴の下部開口部を通って捕捉細胞に拡散するので、この毒性作用はなくならない。
(h)穴トラップ壁ならびに中間域の滑らかさのレベルは、製造プロセスの固有的な限界のために極めて制限される(米国特許第5506141号における図20〜22、図36および図32を参照のこと)。インビボでの細胞の成長および増殖の経験則により、細胞担持表面が滑らかであるほど、その上部で細胞を培養できる可能性が大きくなると言われている。
(i)CC金属表面の近く(近傍)における電磁気学的操作は、鏡作用のために極めて制限され、かつ不十分である。
(j)金属トラップにおける微小電極の製造が不可能である。
(k)米国特許第5506141号では、操作された生細胞における電場のいくつかの使用が議論されていた(第14欄52行〜第16欄21行)。これらの種類の使用の処理効率は、緩衝化する生理学的懸濁用媒体の遊離イオンにより生じる電気的遮蔽効果によって強く損なわれる。さらに、さらなる望ましくない作用が電気分解であり、これは、米国特許第5506141号(第14欄64行〜65行)に、「駆動力としての電場の使用は電気分解の問題を生じさせ得る」と述べられているように、懸濁用媒体の特性を変化させ、細胞死を生じさせることがある。実際、このことが、その考えがこのCCに関して決して達成されていない理由であった。
1.ウエルにより保持および維持されながら個々の細胞を可視化し、その結果、形態学的に調べることができる非常に優れた透明性。
2.個々のウエルが、1つ以上の透明な微小電極を伴って製造され、一体化された適合し得る電子回路によって制御およびモニターされる。
微小電極は、細胞の電気的特徴の変化を検出する際に微弱な局限化収束交流電圧(CAV)を加えて細胞の取扱いおよび保持(閉じ込め、移動、刺激、融合)を行うことにおいて有用である。また、好適な基質被覆微小電極(電気化学的バイオセンサー)は、様々な生成物の産生および分泌によって現れるような細胞の代謝活性を測定することにおいて有用である。
3.装置により、光学的ピンセットを利用する細胞の選別および分離が、上を通る洗浄、および/または制御されたレーザービーム出力による選択的な細胞殺傷と一緒に局所的な電位を加えることによって行われる。
4.ITICBP装置は、同時に、かつ乱れない様式で、大きな細胞集団を細胞毎に収容することができる。例えば、ITICBP装置は、それぞれが分離用溝を間に有する150x150ミクロンサイズのウエルからなる9個の場を容易に含むことができ、従って、9個の場(それぞれの場が、同じまたは異なる起源および/またはタイプの22500個の個々の細胞で占められる)を少なくとも9個の異なる生物学的および/または生化学的および/または蛍光性の活性な作用剤に同時にさらすことができる。
5.細胞を、様々な生物学的活性物質(光活性化分子を含む)を含有し得るか、または様々な生物学的活性物質(光活性化分子を含む)で被覆され得る細胞キャリア(CCP)のウエル内で増殖させることができる。
6.研究されているか、または調べられている個々の細胞における生化学的変化を、特異的な蛍光性レポーターを使用する蛍光測定によって、かつ/あるいは、特異的な基質による被覆を有する製造された透明な微小電極を利用して、細胞内代謝産物および/または細胞外代謝産物のいずれかに関連するデータを提供する電気化学的測定によって、その両方で、同時または連続的のいずれかで測定(またはモニター)することができる。
7.ITICBP装置は、清浄化および滅菌化のいずれかが可能であり、従って再使用および/または廃棄可能であり得る。ITICBP装置は、生物学および臨床および毒物学の研究室環境における広範囲の細胞機能研究のために設計されている。
8.ITICBP装置およびアクセサリーは下記の2つのサブシステムから構成される:
a)光学ツール、電子的ツールおよび他の測定用ツール、ならびに制御、データ取得およびデータ分析のための手段を含有するTCCプラットホームおよび装置の測定設備を含むサブシステム(これは、以降、「プラットホーム・測定システムと呼ばれる」);
b)それぞれの個々のウエルにおいて行われるコンピューター制御活動を含むサブシステム(これは、以降、ITICBPシステムと呼ばれる)。
図面の簡単な記述
図1は六角形のウエルから組み立てられたTCCの部分上面図を例示する。
図2はTCCのウエルの内部における個々の細胞(ウエルあたり1個の細胞)を示しており、この場合、細胞のウエル間の集積は不可能である。
図3は図2に示されるウエルの断面を示す。
図4は非常に詰め込まれた六角形の整列させられたウエルの上面図を示す走査電子顕微鏡(SEM)を示す。
図5は図4のSEMからの1つのウエルに注目する。
図6はウエル壁の鋭さを強調するSEMの等角図を示す。
図7は1つのウエルの内部を占有する1個だけの細胞に注目する。
図8は平坦な底部を有するウエルの内部における細胞を示すSEM像を示す。
図9はTCCのウエルの内部におけるTジャーカット細胞の透過光画像(x40)を示す。占有率は90%を越えている。
図10及び11はTCCのウエルの内部における個々の生細胞(ウエルあたり1個だけの細胞)を視覚的に測定することができることを強調する透過光画像(x100)を示す。
図12は集団内の同じ個々の細胞の透過光画像および蛍光画像を提供する装置の特有の特徴を明らかにする。透過画像(x40)が示される。
図13は集団内の同じ個々の細胞の透過光画像および蛍光画像を提供する装置の特有の特徴を明らかにする。蛍光画像(x40)が示される。
図14は集団内の同じ個々の細胞の透過光画像および蛍光画像を提供する装置の特有の特徴を明らかにする。透過画像(x100)が示される。
図15は集団内の同じ個々の細胞の透過光画像および蛍光画像を提供する装置の特有の特徴を明らかにする。蛍光画像(x100)が示される。
図16は1つのウエルにおける細胞間の相互作用を追跡することに関連する別の特有の特徴に注目する。写真の上部右隅に位置する、ウエルの内部における2つの相互作用している細胞が(透過光画像(x100)を使用して)示される。
図17は1つのウエルにおける細胞間の相互作用を追跡することに関連する別の特有の特徴に注目する。蛍光画像(x100)を使用して、同じ1対の細胞が示される。
図18は1つのウエルにおける細胞間の相互作用を追跡することに関連する別の特有の特徴に注目する。15分の相互作用の後における同じ1対の細胞が示される。
図19はウエルの内部における個々の細胞の着色された観察結果を提供する。ギムザ処理された細胞の着色画像が示される。
図20はウエルの内部における個々の細胞の着色された観察結果を提供する。図19の同じ細胞の細胞核および細胞膜が強調される。
図21はウエルの内部における個々の細胞の着色された観察結果を提供する。図19に記載されるように処理された細胞の高分解能拡大写真が示される。
図22は細胞内オルガネラを調べるための画像分析(IA)ツールの使用を明らかにする。
図23は非対称断面を有するウエルを示す。
図24は非対称断面を有するウエルを示す。図24では、垂直壁の一体化された一部として閉鎖用歯状物が含まれる。
図25は階段様壁および対称断面を有するウエルを示す。
図26は波形の反復する丸い丘のアレイを例示する。この場合、細胞は、丸い丘と丘との間に形成される谷に局在化する。
図27は溶液および細胞の両方を輸送するための溝として適用可能である図26の谷のSEM写真を示す。局在化前のリンパ球を示す。
図28は溶液および細胞の両方を輸送するための溝として適用可能である図26の谷のSEM写真を示す。局在化後のリンパ球を示す。
図29は溶液および細胞の両方を輸送するための溝として適用可能である図26の谷のSEM写真を示す。3つの無作為なリンパ球がそれらの位置に近く存在することを示す。
図30は溶液および細胞の両方を輸送するための溝として適用可能である図26の谷のSEM写真を示す。細胞−細胞の相互作用を調べるときには常に、ウエルあたり2つ以上の細胞を有することが、そのようなことが所望される場合には可能であることに関連する。
図31は「波形丘アレイ形態」の透過光画像を示す。丘の円形の円周と、少数の交点において保持または局在化されるリンパ球とを強調する波形丘アレイの上面図(x40)を示す。
図32は「波形丘アレイ形態」の透過光画像を示す。同じ現象がx100で示され、この場合、細胞−細胞の相互作用に関する位置が観測されている。
図33は「波形丘アレイ形態」の透過光画像を示す。同じ現象が示され、この場合、細胞−細胞の相互作用に関する位置が観測されている。
図34は「波形丘アレイ形態」の透過光画像を示す。末梢血リンパ球と比較してサイズがより大きいTジャーカット細胞が示される。
図35は波形丘アレイ形態の蛍光画像を示す。
図36は波形丘アレイ形態の着色画像を示す。細胞膜および核が着色画像において識別される。
図37は装置の電気化学的測定能に関連する。図は、ウエルの内側表面に取り付けられるか、または置かれる円形の電極(20)を含有するウエルを明らかにする。
図38は1つのウエルの内部に多数の電極(20aおよび20b)を有することができることを示す。
図39は細胞位置決め電極の様々な配置およびCAV回路の操作を例示する(図39〜図39f)。
図40は広範囲のウエル詰め込み形態を明らかにする。正方形型ウエルのアレイを例示する。
図41は広範囲のウエル詰め込み形態を明らかにする。三角形型ウエルのアレイに関連する。
図42は所定の数のウエルからなるマトリックスをその中心に有する透明なコインを例示する。この図は、透明な正方形コインが、100x100のウエルからなるマトリックスに対する基部であることに関連する。
図43は所定の数のウエルからなるマトリックスをその中心に有する透明なコインを例示する。この図は、透明な円形コインが同じウエルマトリックスに対する基部であることに関連する。
図44は円形コインの表面図を示す。
図45は円形コインの表面図を示す。互いに向き合うそのベルト壁に2つの開口部を有するコインホルダーを示す。
図46はコインおよびそのホルダーの断面を示す。
図47はコインおよびそのホルダーの断面を示す。細胞を負荷し、溶液を洗浄し、排出するための経路が例示される。
図48はコインおよびそのホルダーの断面を示す。液体容器に注目し、これらは、ホルダーの内部に、そしてホルダーを横切って溶液を移動させるための好適な圧力を生じさせる。図48a〜図48iは穴あきTCCを例示する。図48bおよび図48cは穴あきウエル壁を示す。図48dおよび図48eは、各ウエルの底部に穴が開いていることを明らかにする。図48fおよび図48gは、細胞の超音波処理前および超音波処理後における底部の穴あきウエルに注目する。図48hおよび図48iはTCCにおける多孔性領域および非多孔性領域を記載する。
図49はコインおよびそのホルダーに数タイプの溶液または異なる溶液を供給するためのマルチリザーバーシステムの上面図を例図する。
図50はコインのアレイからなるTCC(MCA)を示す。9個のウエル場の上面図を明らかにする。
図51はコインのアレイからなるTCC(MCA)を示す。同じ9個のウエル場の等角図を表す。
図52はコインのアレイからなるTCC(MCA)を示す。そのような場の拡大図を明らかにする。
図53はコインのアレイからなるTCC(MCA)を示す。そのような場の拡大図を明らかにする。
図54は細胞をそのウエルから回収用の場に移すことに関連する。
図55は細胞をそのウエルから特別設計のマクロウエルに移すことに関連する。
図56はTCCの表面において懸濁物および/または溶液を移動させるためのウエル間の通路を例示する。
図57は液体が谷内を移動し、(ウエルとして役立つ)谷の交点における池として蓄積する、波形の丸い丘からなるTCCを例示する。
図58は液体が谷内を移動し、(ウエルとして役立つ)谷の交点における池として蓄積する、波形の丸い丘からなるTCCを例示する。液体がその間で移動しない池が示される。
図59はTCCの下側から細胞を見るための概略的な光学系配置を示す。
図60は照射面に直交して蛍光を検出するための概略的な光学系配置を示す。
図61はTCCの4つの側面に接続された光ファイバーリード線の4つの束を示す。
図62はアドレス指定可能なデジタルミラーディスプレイを使用するTCCウエルの照射を示す。
図63は液晶ディスプレイ技術を使用するTCCウエルの照射を示す。
図64は光ファイバーを使用するTCCウエルの照射を示す。
図65は一体化されたマイクロレンズアレイを使用するTCCウエルの照射を示す。
図66は一体化されたマイクロレンズアレイを使用するTCCウエルの照射を示す(図66および図66a)。
図67は一体化マイクロレンズアレイおよびCCDアレイを伴うTCCを示す。
図68は細胞の操作、走査、測定および分析を行う本発明のシステムの実施形態を示す。
図69は細胞の操作、走査、測定および分析を行う本発明のシステムの実施形態を示す(図69および図69a)。
図70は蛍光原性基質の細胞内回転を記述するための単純化されたモデルを示す。
図71は染色プロトコルのシミュレーション結果をいくつか示す(図71A〜図71D)。
図72は実際の染色プロトコル実験の結果をいくつか示す(図72A〜図72D)。
ITICBP装置:装置構造ならびに細胞の保持および取扱いおよび処理の原理
下記の章は、生物学的流体に含有される特定タイプの細胞からなる特定の集団を他の細胞集団から選択し、かつ分析するために本発明のITICBP装置において用いられる主要な特徴に関する。また、特別な亜集団のさらなる選択を最初に選択された特定の集団から行うことができる。より詳細には、一例として、Tジャーカット細胞を選択し、かつ分析することが記載される。従って、本発明のITICBP装置のウエルアレイにより、生存細胞の集団および亜集団が、それらのウエルの大きさおよび他の測定可能なパラメーターに従って、驚くべき程度の純度で他にないほど選択されることを理解しなければならない。
(a)透明な細胞チップ(TCC)
下記では、ITICBP装置の詳細な説明が、好ましい形式、形態、細胞の取扱い、観察、操作、制御、測定、データ集積、および装置の一体化された多機能的能力を含めて、議論され、かつ示される。図では、同じ構成要素が、異なる図に、または同じ図の異なる投影図に存在するとしても、同じ数字が、同じ構成要素を記載するために使用される。
図23〜図26には、ウエル内部の構造および形態が非常に万能的であることを強調するために、様々なウエルの断面の例がいくつか明らかにされる。
ITICBP装置における各ウエル2または任意の選択された数のウエル2が、図39gに示されるように、中心電極11bをその底部4に伴って構築される。中心電極11b(これは細胞位置決め電極と呼ばれる)を図38において容易に認めることができる(11b)。中心電極11bのプレート11cに与えられる制御されたCAV15シグナルにより、細胞3をそれぞれのウエル2内において引き寄せ、かつ反発させ、細胞3をウエル2内の所望する位置において正確に配置する電場(13)が誘導される。
自然界は、六角形の詰め込みが最も効率的な詰め込み方法であることを我々に教えている。ITICBP装置のTCCは、個々の細胞ウエルの間にすき間を残さない六角形ウエルのアレイから組み立てられ、従って、ほぼ100パーセントの負荷効率を理論的および実際に明らかにしており、これは、細胞のサンプルサイズ(調べられる細胞の利用可能な量)が制限されるときには重要な特徴である。この状況は、例えば、ガン評価における病理学的検査のためのリンパ節触診の場合、または、肺ガンの評価のために唾液に見出される少量の細胞の場合には一般的である。
ウエルのアレイが配置されるTCCの基本ユニットである「コイン」は任意の所望する形状を有し得る。明らかなことではあるが、そのようなコインは、別のコインに対するその安定な取り付け、または生物学的サンプルの取扱いおよび維持(負荷、洗浄など)、ならびにそのようなコインをITICBP装置の一体化された一部として運搬することを可能するホルダーに対するその安定な取り付けのいずれかを可能にするように設計されていた。
本節では、ITICBP装置のTCCの必須部分としてのコインの保持および取扱いが議論される。図44は、バス18によって囲まれる円形コイン17の上面図を示しており、これらはともに、コインホルダー20の一部であるベルト壁19によって取り囲まれる。ベルト壁19は、TCC表面の全体を覆うための好適なサイズの通常の顕微鏡カバーガラスであり得る透明または部分的に不透明なプレート14を支え、そして、溶液を維持するためにその下側に空間を残す高さを有する。図45には、細胞の負荷21b、洗浄21bおよび排出21aを可能にするための、互いに向き合う2つの開口部21aおよび21bをそのベルト壁19に有する前記コインホルダー17の別の形式が明らかにされる。前記コインホルダーシステムの概略的な断面が図46に示される。別のホルダー形式が図47に示されており、この場合、3つの直交するパイプ22が、上記の開口部21aおよび21bと同じように、任意の所望する溶液および細胞懸濁物の輸送を可能にするために、コインホルダー本体部に貫通している。溶液(または懸濁物)の流速は、そのようなパイプ(水路)に接続されたポンプおよび弁によって制御することができる。流速を制御する多くの可能な方法の1つが図48jに示される。パイプ22の2つが2つの溶液リザーバー23に接続され、この場合、それらの液高(Sh1およびSh2)の差(ΔSh)により、容易に決定され得る勾配が形成される。リザーバー23における圧力は、例えば、ピストン24によって容易に制御することができる。
コイン17のアレイ(マルチコインアレイ、MCA、26)からなるTCCの一例が図50(上面図、mm単位でのスケールバー)に示される。このTCCは、それぞれが150x150のウエル2のマトリックスから構成され、幅が約0.3mmの分離用溝27によって取り囲まれている9個のコイン(17)、すなわち、9個の異なるウエル2の場を含有する。そのような溝27の重要な役割の1つは、1つの場17からその隣りに物質が浸透することを防止することである。従って、溝27には、隣接する場と場との間における任意の物理的バリア、例えば、好適なサイズの壁などが含まれる。
ITICBP装置のTCCにおけるそのウエル2からの細胞3の引き上げおよび移送を、下記に記載されるように、ウエル2とカバーガラス14との間のすき間にコンピューター制御による移動する電場を誘導すること、またはコンピューター制御による光学的ピンセットの使用のいずれかによって行うことができる。選択された細胞3を引き上げるために使用される方法にもかかわらず、選択された細胞3は、試験条件により決定されるように、ウエル場−17A、17B、17Cの間に位置するミクロ水路28、または回収用の場17D(図54)、または選択された細胞の回収用マクロウエル(29、図55)などの任意のアドレス指定可能な場のいずれかに移される。減圧状態が、図55に示されるように、細胞3を吸引し、細胞3を所定のマクロウエル41に向かわせるために、特に、水路コレクター28に存在する。
TCCの表面における懸濁物および/または溶液の微量操作が、図56に示されるように、小さい開通路または閉通路30を生じさせるような方法でウエル2間に、制御されたすき間を有するウエル場17を構築することによって確立され得る。そのような場合、開通している溝30の幅(直径)は壁1幅の程度であり、従って、隣接ウエル2間における細胞3の安定した局在化を妨げる。図27〜図30に記載される詰め込まれたウエル2の丸い丘1の間での谷8における溶液の流れの一例が図57に示される。写真の左から右への溶液の流れが認められる。以前に述べられたように、谷8に存在する、この配置または構造におけるウエル2は、谷8により隔てられた波形の丸い丘1の間における交点である。これらの谷8における最も低いところが各交点2の中心に配置される。これらの交点(ウエル2)は、集積した溶液の小さい池31をもたらし、それにより、最も浅い谷8が、隣接する池31の間の接続用経路として役立つ。温度、流体吸引速度などの様々なパラメーターを制御することによって、池と池との間を流れる流体の連続性の中断が誘導され、従って、これにより、図58に示されるように、離れた接続されていない池31がもたらされる。
図48bに示されるようなウエル2側面1の(1000オングストローム程度での)垂直な小さい穿孔がイオン衝撃技術によって作製される。これらの穿孔32は細胞3の垂直洗浄を可能にする。穿孔32のサイズは、ITICBPに関連して使用される光波長と比較して非常に小さいので、光学的干渉が全く生じない。流れ方向を伴った穴開きウエル壁1の断面が図48cに示される。
一般に、ITICBP装置における保持された細胞3は、通常型または倒立型の顕微鏡を利用して、日常的に使用されているエピフルオレセンス方法によって画像化および試験され得る。さらに、細胞チップが透明であることは、透過光として励起(落射照明)光を利用することによって、細胞3をTCCの下側から見ることを可能する。概略的な光学系配置が図59に示される。
TCC17における個々の細胞3の照射およびそのそれらの放射の測定を行うために光ファイバー(FOP)37を利用する方法が図64に示される。ITICBP17は、多くのファイバー37がウエル2のそれぞれに結合されるように、非常に多数のサブミクロンのファイバー(37、ブローアウト参照)からなるFOP束43に対して、直接的に、または光学的な媒介物質もしくは作用因によって、そのいずれかで光学的に結合させられる。FOP束43のサイズは、TCC17の全領域またはちょうど一部分のいずれかを覆うことができるようにされる。束43は、二次元LCDアレイプレート44によって分離された2つの部分43aおよび43bから構成される。LCDエレメント45はそれぞれが、束の一方の側43aともう一方の側43bとの間での光の通過を、完全または部分的に、通過させるか、または遮断するかのいずれかのために電気的に制御される。この照射配置は、二方向的であるように設計される。すなわち、細胞3の照射光およびその放射光がFOP束43およびLCD44を通過する。細胞3からの放射/散乱光がFOP束の一方の側43aを通り、LCDアレイ44を通って、FOP束のもう一方の側43bに達し、最後には、TCC17の全体または選択された部分が画像化される画像化装置46(例えば、CCDまたは他の検知用装置)に達する。
ITICBP装置のTCC17における細胞3およびそのウエル2の典型的な大きさは、ミクロ光学系構成要素において使用される一体化されたマイクロレンズアレイと同じ程度である。ITICBP装置は、ミクロ光学技術における最新の進歩を利用し、ミクロ光学システムを取り込んでいる。
注目される図68、図69bおよび図69aには、個々の細胞またはグループ化された細胞の操作、走査、測定および分析のための全体的なシステムが示される。このシステムは下記からなる:
(61)中央制御コンピューター;
(62)光源、例えば、多スペクトル線の連続レーザーおよびパルスレーザー、分光的に連続した放電ランプまたは特定スペクトル線の放電ランプ(これらに限定されない)など;
(63)電子的な高速度の二方向の多重化されたシグナルの発生・取得回路;
(64)時間、用量および経路を制御するための適切な電子回路を含む溶液容器;
(65)直立型および倒立型の複合顕微鏡、これには、適切な光学増幅装置、分光的フィルター処理装置、および、ITICBPに捕捉されたサンプルを照射し、その結果としてそのサンプルを観察するためのビーム形状化装置のすべてが含まれる;
(66)コンピューターにより制御されるサブミクロンでの走査機構、これは、(66a)X、Y、Z、および3つの回転軸(θ、φ、δ)でランダムに操作することができるステージ、(66b)検流計偏向型ミラーによりF−θレンズおよび光を操作することによる光学的に制御される視野、から構成される。走査運動の範囲および速度は中央コンピューターによって制御され、生物学的試験条件によって決定される;
(67)上記に記載されるようなITICBP:
(68)測定変換器、例えば、(68a)高感度PMT、(68b)CCDカメラ、(68c)MCP(マイクロチャンネルプレート)で強化されたCCDラインアレイなど;
(69)測定値およびシグナルを処理するサブシステム装置:(69a)蛍光寿命および蛍光偏光減衰の測定、(69b)分光計および音響チューナブルフィルターなどによる観測された光シグナルの分光分析;
(70)捕捉された細胞を機械的に操作するか、または捕捉された細胞をITICBPウエルに、もしくはITICBPウエルから移すための手段、例えば、(70a)光学的ピンセット、(70b)マイクロマニピュレーターなど。
ITICBP装置の細胞キャリアにおける個々のウエルは、1つだけの細胞を保持および維持するために設計されたその特有の形態に加えて、その一時的な閉じ込めのために細胞に対して作用する誘電泳動力を利用する。
ITICBPの主要な局面の1つは、それが、細胞培養を取り扱わなければならないという要件を作業条件が満たさない一般的な分析化学の研究室において潜在的に使用される使い捨て型の密閉/開放TCCチャンバー装置であるということである。概して、これらの状況では、研究室動物が使用されている。研究を開始することによって、使い捨て型の生物TCCおよび/または使い捨て型の完全フロースルー細胞TCCを開発することは、生物医学的な薬物研究において動物の代用物として細胞培養物を使用することを促進することに寄与し、そして成功した場合には、生物医学的な薬物研究において動物の代用物として細胞培養物を使用することを促進することを目的とする世界中のプログラムに強い影響を与える。
a)微小電極アレイおよび蛍光性レポーター分子にそれぞれ基づく電気化学および光学的分光法の測定技術を、
b)非接着性/接着性の動物細胞またはヒト細胞の細胞チップアレイ(培養細胞プレートおよび/または単層)について個々のマイクロウエルと、
結合させることによって「オンチップ」臨床検査の方向での一ステップを提案する。
1個だけの細胞に基づいて測定される生物学的プロセスの光学的分析および生化学的分析に基づく光学的分光システムによって選択された細胞の取扱い。さらなる操作のための、事前に選択された亜集団または個々の細胞または細胞分泌生成物の単離または転化は、すべてが光学的ピンセットまたは機敏な制御されたマイクロピペット操作によって行われる。
様々な生物学的活性分子(光活性化分子を含む)によるITICBP表面の被覆。
多くの疾患が免疫系における不具合から生じている。不適切な免疫応答が、ガン、移植臓器の拒絶、喘息およびアレルギーを含む多くの疾患において役割を果たしている。2つのタイプの白血球細胞(B細胞およびT細胞)が免疫応答において中心的である。Bリンパ球は、異物のタンパク質および抗原を破壊することによって身体を保護する抗体(免疫グロブリン)を産生することに関わっており、一方、Tリンパ球は、異物の細胞(ガン細胞を含む)を認識し、破壊のための印をそれに付ける。
光活性化可能な物質の閃光光分解は「ケージ化」状態からのその放出をもたらす。非ケージ化はITICBPの照射とともに容易に達成され、これにより、目的とする生物学的活性生成物または他の試薬の空間的および時間的の両方での放出を制御する手段が提供される。「ケージ化」分子は、分子の結合または活性を最大限に妨害するように設計される。「ケージ化」分子は、閃光光分解によってマイクロ秒〜ミリ秒で脱離し、活性な生成物のパルスをもたらす。
ITICBP装置:適用可能な測定技術および測定手順
下記の特徴および適用は、ITICBP装置の広範囲の測定能力を非限定的な様式で明らかにするために示される:
・蛍光測定および電気化学的測定による、ITICBPウエルおよび/または細胞のそれぞれに蓄積した細胞外および細胞内のNO、O2・ラジカルおよびグルタミン酸の測定;
・識別可能な個々の細胞を使用する生物医学的物質の毒性の評価;
・生細胞の構造的パラメーターおよび形態学的パラメーターのモニターリング;
・CAVを利用した誘電泳動力による細胞の閉じ込め;
・一体化されたバイオセンサー技術を使用する(生物)電気化学的測定;
・免疫センサーによる免疫反応性の決定;
・個々の細胞の細胞内酵素反応の推定;
・下記のそれぞれの適用:
1.個々の細胞の生化学
2.個々の細胞の透析
3.同じ個々の細胞に対する生命活動検査およびSEM検査の実施
4.細胞質対核での細胞内蛍光測定値の地形学的分布などの特定の測定の必要性に従って個々の細胞の姿勢を制御することは、NFkBなどの調節分子の転移の分析を可能にし、FISH分析のためには不可欠である。
本発明のITICBP装置およびその周辺測定システムでは、蛍光試験の様々な特有の性質が利用されており、これらには下記が含まれる:
・蛍光強度(FI)
・蛍光スペクトル(FS)
・蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)
・蛍光偏光または蛍光異方性(FPまたはFA)
・時間分解蛍光(TRF)
・蛍光寿命測定(FLT)
・蛍光偏光減衰(EPD)
・蛍光相関分光学(FCS)
・測定の特性および正確性が染色方法によって決定される。種々の製造者によって作製された蛍光プローブの非均一性の程度が大きいことおよびそれらの限られた貯蔵安定性は、日常的な研究適用および臨床適用において、そして結果の解釈に関連する一般的な合意に達することにおいて大きな測定問題を長年にわたってもたらしている。これらの問題はさらに複雑になっており、これは、染色するための調製的技術、例えば、色素を細胞内に入れるために必要とされ得る固定処理および透過化処理などは、未だ均一的でなく、かつ/または確立されていないからである(Shapiro、1995)。
・均一かつ安定した染色が、共有結合的に結合したプローブにおいてさえ保障され得ない。周囲条件(温度、pH、イオン強度など)のわずかな変化が測定結果に大きな影響を及ぼしている。
・免疫蛍光などにおける低い染色レベルでの不安定性の問題に対して、自己蛍光から生じるノイズが加わる。この自己蛍光は、主にピリジンヌクレオチドおよびフラビンヌクレオチドが存在するためであり(Aubin、1979;Benson他、1979)、免疫蛍光測定の感度を制限する。
・蛍光シグナル測定値の標準化。この問題は非常に厄介であるので、雑誌「Cytometry」の特集号がこの課題に対して完全に向けられた(Cytometry、1998年10月)。
・退色、蛍光性マーカーの細胞からの漏出/放出、そして正常な細胞機能の妨害は、蛍光測定に関連して広く知られている欠点である。
生細胞の構造パラメーターを見つけることは、細胞の研究および診断学の分野における中心的なツールになりつつある。雄性および雌性の両方の不妊などのプロセス(Pasteur他、1988;Schiffer他、1996)では、異常な細胞構造が潜在的な機能不全と相関している。細胞増殖およびプログラム化された死(アポトーシス)では、細胞サイズがアポトーシスの段階と相関しており、このことは臨床研究において役立ち得る(Soini他、1997)。現在、構造的パラメーターは、主に、フロースルー法およびビデオ画像分析法を使用して測定されている:
・フローサイトメーター(FC)システムでは、細胞構造が、細胞を含有する生理学的液体のジェット流をレーザービームの中に入れることによってサンプリングされる。細胞によって散乱された光を前方方向および側方方向で集めることができる。前方方向の強度は、細胞体積と相関すると考えられ(Sloot他、1988)、これに対して、側方の散乱は細胞の内部粒状性を表す。しかしながら、実際の使用では、これらのパラメーターは、光学的変動性(Segel他、1981)、誤って解釈される細胞水分含有量の変化(Sloot他、1988)、および細胞の吸収特性、従って前方散乱強度を変化させる蛍光性マーカーの存在(Shapiro他、1985)などの理由のために多くの場合には分かりにくいことが判明している。
バイオセンサーは、複雑なサンプル処理を必要とすることなく直接的に生物学的または化学的な化学種を検出するために生物学的感受性物質を使用する分析装置である。バイオセンサーは、通常、生化学的応答を定量可能かつ処理可能な電気シグナルに変換する好適な変換システムに生物学的感受性物質を結合することによって作製される。
フタロシアニン修飾電極は、ナノモル濃度の一酸化窒素を測定することができるので、活性化剤または阻害剤にさらされた後のガン細胞によって放出されるNOのモニターリングにおいて適用されていた(Raveh他、1997)。
酵素活性は、通常、2つのパラメーターによって特徴付けられる:VMAX−その飽和濃度における基質(S)からの生成物(P)の最大酵素産生割合(速度)、およびKM−ミカエリス−メンテン定数(これは、基質に対する酵素親和性に逆比例する)。
[S]+[E]←→[ES]および[ES]→[P]+[E]
(式中、[E]および[ES]はそれぞれ酵素濃度および酵素−基質複合体濃度である)
が生じる均一な媒体においてだけ正確である。
1.Dolbcare F、フローサイトメトリーのための酵素の蛍光染色、Methods Cell Biol、33:81〜88、1990;
2.Klingel S、Rothe G、Kellerman W、Valet G、ローダミン110基質を用いた生細胞でのセリンプロテイナーゼ活性のフローサイトメトリー測定、Methods Cell Biol、41:449〜460、1994;
3.Malin−Berdel J、Valet G、蛍光原性基質を用いた造血細胞におけるエステラーゼおよびホスファターゼの活性および速度論のフローサイトメトリー測定、Cytometry、1:222〜228、1980;
4.Nooter K、Herweijer H、Jonker RR、van den Engh GJ、オンラインフローサイトメトリー。速度論的測定のための万能的な方法、Methods Cell Biol、41:509〜526、1994;
5.Turck JJ、Robinson JP、フローサイトメトリーによるロイシンアミノペプチダーゼ活性、Methods Cell Biol、41:461〜468、1994;
6.Watson JV、Dive C、酵素速度論、Methods Cell Biol、41:469〜508、1994。
速度論的パラメーターは、線形モデル構築および非線形モデル構築の適用によって得られる。線形モデルのy(t)=At+Bでは、データを直線式に近似するパラメーター(AおよびB)が求められる:この場合、y(t)は測定量であり、tは時間であり、AおよびBは、計算されたパラメーターである。CS−Sアルゴリズムでは、χ2が、適合度に対する基準として使用される。
蛍光原性基質の細胞内回転を記述するための単純化されたモデルが図70に示される。最初に、細胞外基質[S]Oが細胞内に浸透して、[S]i(細胞内基質濃度)になる。その後、[S]iは酵素によって加水分解または切断されて、細胞内(例えば、蛍光性)生成物[P]iをもたらし、これは細胞から培地に放出され、[P]oになり得る。
本発明の別の局面は、同じ個々の細胞を種々の基質濃度に順次さらすことに関する。これは、染色開始時点において、所定の溶液に関して、細胞が、既に、下記のレベル:
に染色されつつあるという事実によって上記の場合とは異なる。
a)[N]=[M]を維持する染色液[N]で細胞を洗浄することにより、染色曲線[P(t)]I=α[S]N[τ+t]が得られる。観測時間τ+tにおいて、[P]iは、α[S]Nの生成速度を有していた。これは、τ+tの前におけるα[S]Mの生成速度と同じ速度である(図71a)。
b)細胞をPBS単独で洗浄することにより、[M]残渣が洗い流され、染色液が濃度[M]=0で残る。この作用は、任意のさらなる産生[P]Iを停止させた(適用時間τにおいてα[S]N=0であるからである)。従って、[P]i線は、観測継続期間tにわたって時間軸に平行したままであった(図71b)。
c)同様に、細胞が染色液[N]≠[M]で洗浄され、これにより、[M]が洗い流され、染色液が濃度[N]で残った。[P]iの生成速度は、予想されるように、観測継続期間tにわたってαN[S]に変化した(図71c)。
d)最後の実験は、b)およびc)を連続して組み合わせたものであった。最初に、細胞が時間t1においてPBSで洗浄され、これにより、FIの産生が停止した。次の段階は、PBSを濃度[N]の溶液によって置き換えて、染色液[N]≠[M]で洗浄することであった。その場合の生成速度は、観測継続期間tにわたってα[S]Nに変化した(図71d)。
exp(−βΔt)/(1−βΔt)≒2%
を保つΔt値が求められる。従って、β≒10−4秒−1(これは、数百回の独立した実験の結果(データは示されず)である)を導入することにより、Δt≒103秒が得られる。
フィトヘマグルチニンPHA(HA15、Murex Biotech)を5mlの二回蒸留水で再構成し、さらに10倍に希釈した。刺激のために、この溶液の10μlを90μlの細胞懸濁物(7x106細胞/ml)に加えた。
30ヘパリン添加血液(30ml)は健康かつ正常な志願者に由来した。PBMCの分離手順はどこかに詳細に記載されている[Sunray M、Deutsch M、Kaufman M、Tirosh R、Weinreb AおよびRachmani H、細胞の活性化は細胞染色速度論に影響を及ぼす、Spectrochimica Acta A(1997)、53:1645〜1653]。鉄吸収細胞を除いた後直ちに、残った細胞を2層(100%および80%)での細胞密度勾配(フィコールパーク(Pharmacia)、1.077g/ml)に重層し、遠心分離した。2つのフィコール層の間の境界に集積した細胞を集めて、5mlの富化培養培地において37℃で一晩保った。翌日、PBMCを洗浄し、PBSに7・106細胞/mlの最終濃度で再懸濁した。70%を超える細胞がTリンパ球として明らかにされ、そしてエオシンを使用して決定された生存性は常に90%よりも大きかった。
新しく調製されたPBMC(7・106細胞/ml)を、37℃、5%CO2で、5μgr/mlのPHAと30分間インキュベーションした。PBMCのコントロールは、同一条件下、PHAを加えることなくインキュベーションされた。
ウエルにおける細胞の負荷を、Deutsch MおよびWeinreb A、生細胞の高精度な反復的逐次光学測定を行うための装置、Cytometry(1994)、16:214〜226に記載されるように行った。80μl量の非染色細胞懸濁物(7x106細胞/ml)をCCに負荷した。その後、最初の走査を、個々の細胞のバックグラウンドの散乱および自己蛍光を検出するために行った。この望まれないシグナルは、測定位置毎に記録され、正しい蛍光シグナルを得るために(暴露後の)総放射シグナルから引かれる。
蛍光強度FI(t)を測定するために、CC上の捕捉された細胞を、PBS染色液においてFDAの濃度を増大させながらFDAに順次さらした。
時間ゼロで、40μlの最低基質濃度溶液を捕捉細胞の上に加え、事前に選ばれた細胞場を6回順次走査した。これにより、正確な時間での6個のFIデータポイントが所定の色素濃度でそれぞれの個々の細胞について得られた。FIは、通常、励起エネルギーと、光電子増倍管、CCD検出器などにより検出され得る放射蛍光エネルギーとの区別を可能にするエピフルオレセンス光学配置を利用して測定される。
この節は、フローサイトメトリー分析および蛍光画像分析の能力を補うITICBP装置技術の下記の特有の分析能力に集中する:
a)個々の細胞が、測定期間中、ITICBPの識別されたウエルに配置され、その結果、個々の細胞を経時的に繰り返し試験することができる。これは、酵素速度論および他の時間分解プロセスの研究のためには有用な特徴である;
b)同じ細胞の逐次分析を、異なる免疫染色または細胞化学的染色または遺伝子プローブを使用して行うことができ、これにより、細胞免疫表現型、細胞機能、特定のタンパク質の発現、DNA倍数性および細胞周期位置、および/または細胞遺伝学的プロフィルに関する情報がそれぞれの測定された細胞についてまとめられる;
c)測定された細胞はどれも、蛍光顕微鏡観察もしくは明視野顕微鏡観察による肉眼検査と、または任意の他のパラメーターと相関させるために再配置することができる;
d)細胞質対核での細胞内蛍光測定値の地形学的分布は、NFKB、p53などの調節分子の転移の分析を可能にし、そしてFISH分析のためには不可欠である;
e)最大画素蛍光強度によって測定されるような核DNAの濃色性により、有糸分裂細胞またはアポトーシス細胞などの、クロマチン凝縮の程度が異なる細胞タイプを同定することが可能になる;
f)DNA含有量に対して正規化される比率測定法アッセイによる組織切片内の横切断細胞における組織断面構造および構成要素の分析により、臨床病理学においてITICBP技術の適用が拡大される;
g)サンプル調製時および染色時における細胞喪失が最小限であるので、少量の細胞を含むサンプルを分析することができる;
h)分析された細胞は、例えば、記録的保存またはさらなる分析のために無限に保管することができる。
いくつかのパラメーターの相関された測定は、機能的パラメーターに相関し得る形態学的変化および生化学的変化のモニターリングを可能にする。この方法は、アポトーシス、細胞周期、細胞成長および細胞分化などの複雑な生物学的プロセスを伴うマルチパラメーター変化の非妨害性の定量的測定が必要であることに対する答えを提供する。
低出力レーザー照射の生物刺激作用が、様々な分子レベルおよび細胞レベルで、そして同様に、全体的な器官レベルおよび組織レベルで明らかにされている。ある種の状況のもとでは、レーザー照射による相乗的作用が、免疫系において明らかにされるように見出されている。様々な作用が照射部位から離れて生じるという証拠が存在する。このことは、循環性の活性な分子が存在することを示唆している。十分な強度の場合、刺激作用は消失し、阻害が生じる。
光活性化可能なプローブまたは「ケージ化」プローブの閃光光分解は、生物学的活性分子の放出を制御するための手段を提供する。ケージ化成分は、分子の結合または活性を妨害するように設計されているので、マイクロ秒〜ミリ秒を要する光活性化による非ケージ化は、活性な生成物のパルスを生じさせる。非ケージ化は、レーザービームによる照射により達成され得る。ケージ化されたイオンまたは薬物または神経伝達物質の光活性化は、細胞活性または神経伝達物質作用を迅速に開始または阻止し、従って、受容体結合、チャンネル開放および細胞活性化の速度論的研究のためのツールを提供する。
生物学的活性分子(抗体、抗原、薬物)をITICBP装置におけるTCCウエルの表面に取り込むことによって、そして生理学的条件(緩衝液、イオン、浸透圧モル濃度、活性な分子)を操作することによって誘導され得るそれらの結合特性または代謝挙動による特定の細胞の検出および選択。
a)抗体を分泌するハイブリドーマ細胞の選択
b)細胞の融合をモニターすること
c)細胞分類
において非常に有用である。
ITICBP装置は、特定の個々の細胞の、正常および異常な分化、成長、加齢および挙動のときにおける機能的特長と相関させられた構造的変動を検出および定量することにおいて適用可能である。これは、細胞サイズ、細胞形状、細胞形態、細胞内運動、細胞質の流動性または微小粘度などの構造的パラメーターを測定することによって、そして蛍光強度および蛍光偏光によって行われ、相補的段階として、着色データおよびIAデータと相関させられる。
ガン患者に由来するT細胞により認識される腫瘍抗原の近年の分子同定により、腫瘍免疫学における新しい時代が始まっている(Coolie、1997)。これまで、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の応答を刺激することが知られている明らかにされた腫瘍抗原のほとんどすべてが、MHCクラスI分子と非共有結合的に会合した短い抗原性ペプチドからなる。これらの複合体は、腫瘍細胞の表面に呈示されるが、CD8+のCTLの表面における特異的なクローン分布したT細胞受容体(TCR)に対するリガンドである。
ITICBP装置により提供される生物学的研究および生化学的研究および毒物学的研究の範囲
一般に、内容が多い同時スクリーニングを行うための、生物学的な乱れをもたらさないITICBPの導入は、関連する情報を細胞から得るために、別のスクリーニング形式の層を置き換えるか、または少なくともそのような層を加える。ITICBPは、下記のような複雑な細胞活性:
・形態学の変化
・分化
・移動
・アポトーシス
・接着
・シグナル伝達分子の転移
・タンパク質輸送
を捕捉するために設計されている。
個々の細胞が周囲の生物学的活性物質の存在と相互作用的に応答する広範囲の生物学的研究におけるその適用に基づくITICBP装置の顕著な特徴。2つの主要な相互作用研究は非常に注目される:
(a)表面に結合した生物学的活性物質との相互作用反応
誘電性表面における物質の様々な固定化技術が広く知られており、特に、吸着、共有結合的な結合、ビオチン−アビジン架橋などが広く知られている。その結果、試験されている個々の細胞の機能の活性化因子/阻害剤/調節因子/センサーとして作用する表面結合の生物学的活性物質(酵素、薬物、抗原、抗体、受容体など)の様々な研究を、ITICBPを使用して行うことができる。例えば、ITICBPの開口域表面に固定化された薬物または特異的な抗原を、Tリンパ球の細胞機能を活性化または制限するために使用することができる。同様に、開口域表面に固定化されたT細胞受容体特異的抗原を、特異的なリガンド結合性T細胞を活性化するために利用することができる。このことは、抗原性の腫瘍特異的T細胞がガンの実験的免疫治療のために使用される腫瘍免疫学の分野において非常に重要である。
(b)光活性化可能な物質との相互作用反応
光活性化可能(「ケージ化」)分子の閃光光分解は、(溶液中での)遊離した生物学的活性物質または表面結合した生物学的活性物質の放出を制御するための手段を提供する。光活性化(「非ケージ化」)は、ITICBP開口域のレーザー(またはUV)照射により行うことができる。光分解的放出の細胞相互作用的作用を、蛍光プローブを使用すること、またはITICBP開口域内に埋め込まれた電極を使用することのいずれかによってモニターすることができる。その結果、ケージ化分子(薬物、抗体、抗原など)の光活性化は、試験されている個々の細胞の活性を迅速に開始/阻害し、従って、光活性化可能な物質と試験されている個々の細胞との間における相互作用的関係の速度論的研究に対するツールを提供する。
NO、過酸化物(O2・・)およびグルタミン酸の細胞内および細胞外のレベルを測定することによる高反応性物質(これは「フリーラジカル」と呼ばれることが多い)の細胞外および細胞内の同時モニターリング。
・細胞外のNO、O2・・およびグルタミン酸は、修飾された微小電極をアレイで利用して電気化学的に測定される(Barker他、1998)。
それぞれのウエルが、これらの3つの重要な細胞反応物に対して特異性を向かわせる「感知化学反応性」でそれぞれが被覆された少なくとも3つの微小電極を伴って製造される。
・酸化的活性の細胞内アッセイが、蛍光強度(FI)、蛍光偏光(FP)、蛍光寿命(FLT)および蛍光偏光減衰(FPD)を使用して、蛍光プローブを用いてNOおよびO2・・のレベルを測定することによって行われる。
ジヒドロローダミン6Gの細胞内酸化は、生細胞のミトコンドリアに局在化するローダミン6Gをもたらす。このカチオン性酸化生成物は、より低い波長のスペクトル(赤方放射)を有しており、フルオレセイン誘導体を用いた同時分析のために特に使用することができる。
ITICBPプラットホームの重要な局面の1つは、個々にアドレス指定されるアレイ電極を利用すること(すなわち、個々の微小電極の非常に近いところにおけるフリーラジカルの局所的濃度を測定すること)によって、生物医学的物質の毒性が、インビボでの生細胞の乱れを伴うことなく研究され得るということである。さらに、これは、毒性化合物が(例えば、ロボット工学によって、そして同様に、毒性被覆ITICBPを利用することによって)局所的に送達される場合、局所的な毒生試験を細胞モデルに対して行うことを可能にする増大した空間分解能のもとで行われる。
ガン患者に由来するT細胞により認識される腫瘍抗原の近年の分子同定により、腫瘍免疫学における新しい時代が始まっている(Coolie、1997)。これまで、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の応答を刺激することが知られている明らかにされた腫瘍抗原のほとんどすべてが、MHCクラスI分子と非共有結合的に会合した短い抗原性ペプチドからなる。これらの複合体は、腫瘍細胞の表面に呈示されるが、CD8+のCTLの表面における特異的なクローン分布したT細胞受容体(TCR)に対するリガンドである。
・第1に、当該技術の熟知者により理解されるように、そしてCercek他による論文から明らかに認められるように、この技術は非常に時間がかかる。
・第2に、Cerceek他が認めるように、最終的に分離された細胞は、目的とする亜群だけに属しておらず、非常に多数(50%程度)の他のリンパ球を含む。従って、分離された細胞の刺激に対するそれらの応答の分析は非常に限られることがある。
・第3に、分離された細胞に対してCercek他によって行われた刺激および応答測定はすべてが、細胞毎ではなく、バッチ物(懸濁物)における細胞のすべてに対して行われている。しかしながら、細胞毎の分析は、研究中の現象の生物学的意味を理解することについてはるかにより多くの情報をもたらすことは明らかである。
・第4に、そして最も重要なことではあるが、SCM試験での刺激は、分離された細胞を、腫瘍組織から抽出された可溶性の腫瘍由来タンパク質(TDP)とインキュベーションすることによって行われている。細胞活性化のこの方法は、リンパ球の刺激は、好ましくは固相として与えられるMHCとの会合で所定のペプチドを与えることによって最も良く達成されるという事実のために、あまり十分ではない。
ITICBP装置は、ドナーリンパ球の特異的な活性化によるウイルス感染および細菌感染ならびに自己免疫疾患の検出;個体の混合リンパ球応答(MLR);潜在的な化学療法剤、薬物および増殖因子のスクリーニング;ウイルスワクチンおよび細菌ワクチンの試験;アレルギー試験;精子の分析;ウイルスおよび他の細胞内病原体の検出;移植における移植片拒絶の診断を含む広範囲の免疫診断アッセイにおいて適用可能である。
緑色蛍光タンパク質(GFP)(これはクラゲ(Aequorea victoria)から最初に単離された)は、インビボおよびインシトゥーでの遺伝子発現をモニターするための有用なレポーターであることが証明されている(LittleおよびMount、1982;WoodgateおよびSedgwick、1992)。
ITICBP装置は、モニターリング、研究、および刺激に対して応答することを可能にするだけでなく、遺伝子作用および細胞産物(サイトカイン、ケモカイン、NOおよび他の細胞産物など)の検査をさらに可能にする。これは、回折測定と一緒に作動する装置のバイオセンサー能力を開発することによって容易になる。
全体的な構成要素および対応する方法論は、すべてが本発明に付属するが、細胞生物学適用および電気光学の絶えず拡大し続けている総合的な分野に影響を及ぼすことが予想される。見込まれる開発には、新しい設計、製造技術、細胞操作技術および細胞診断ツールが含まれる。これらの新しい開発は、ミクロ光学、電気光学および細胞生物学技術の一体化を成功させるためには必須である。そのような一体化は、一般には細胞の進化および操作、特に、細胞の悪性形質転換の研究、薬物R&D、ならびに診断および治療などの、非常に労力を要する適用に対して非常に有益である。
C9.経済的なハイスループットスクリーニングの産物
TCC装置プレートは、100x100または150x150のマイクロウエルからそれぞれが組み立てられる少数の試験用の場を保有する顕微鏡スライドガラスの標準的な外形寸法を有し得る。それにもかかわらず、マイクロウエルは、約5x10−12リットル(5μμL、プレートにおいて今日利用可能な96マイクロウエルについての50μLと比較のこと)の総体積と、光学的に平坦な、直径が約12μmの底部とを有するように特別に設計される。減少した作業体積は、様々な蛍光アッセイおよび比色測定アッセイにおいて使用される試薬の著しい削減と、顕著なコスト削減との両方を可能にする。狭い直径の底部はまた、約10個のマイクロウエルの底部の全量が、ITICBPプレートを移動させることなく、x100の倍率で同時に、または観測場を限定することにより別々に可視化され得るので、微量の単一細胞培養物の迅速な分析を可能にする。
・一般的な使用については、非処理で、標準的な詰め込み;
・ELISAアッセイにおいて有用であるITICBP表面に対するタンパク質の結合を改善するための表面処理;
・それぞれのITICBPが個々に包まれ、放射線滅菌される、細胞培養のための表面処理;
・溶液がマイクロウエル全面に均一に広がるように濡れ性を増大させるための表面処理
からの選択で製造することができる。
Claims (22)
- 複数の少なくとも部分的に光学的に透明なミクロンサイズのウエルを含む、複数の生細胞を保持するための装置であって、前記ウエルが、少なくとも部分的に光学的に透明なチップの実質的に平坦な表面上に配列されたアレイで配置されており、それぞれのウエルは少なくとも一つの生細胞を保持するように構成されており、二つの隣接する前記ウエルの間の距離は前記ウエルの前記サイズの130%以下であることを特徴とする装置。
- 前記ウエルは、特定の種類の一つの生細胞を保持するように構成されていることを特徴とする請求項1に記載の装置。
- 前記ウエルは、特定の種類の予め定められた数の生細胞を保持するように構成されていることを特徴とする請求項1に記載の装置。
- 前記ウエルは、保持された生細胞が外部力の付与なしに前記ウエルの底部に静止するように構成されていることを特徴とする請求項1に記載の装置。
- 前記ウエルは、前記実質的に平坦な表面の方に沈降させられる生細胞が、前記ウエル間の細胞の実質的な蓄積なしに前記ウエルの底部に沈降するように構成されていることを特徴とする請求項1に記載の装置。
- 前記ウエルは六角形のアレイで配置されていることを特徴とする請求項1に記載の装置。
- 前記ウエルは四角形のアレイで配置されていることを特徴とする請求項1に記載の装置。
- 前記ウエルは三角形のアレイで配置されていることを特徴とする請求項1に記載の装置。
- 前記アレイは少なくとも10000個のウエルを含むことを特徴とする請求項1に記載の装置。
- 前記アレイは少なくとも22500個のウエルを含むことを特徴とする請求項1に記載の装置。
- 前記ウエルのリムは1マイクロメートル未満の幅であることを特徴とする請求項1に記載の装置。
- 前記ウエルの底部は、前記ウエルが前記実質的に平坦な表面中の実質的に凹状のくぼみであるように湾曲していることを特徴とする請求項1に記載の装置。
- 二つの隣接するウエルはウエル壁によって分離されていることを特徴とする請求項1に記載の装置。
- 前記ウエルは、前記ウエル壁上の前記ウエル間の細胞の蓄積が実質的に不可能であるように配置されていることを特徴とする請求項13に記載の装置。
- 前記ウエル壁は、前記実質的に平坦な表面に対して垂直のとがった断面を有するようにウエルの底部から外側に傾斜することを特徴とする請求項13に記載の装置。
- 前記ウエル壁は、前記実質的に平坦な表面に対して垂直な非対称断面を有することを特徴とする請求項13に記載の装置。
- 二つの隣接する前記ウエルの間の距離は前記ウエルの前記サイズの120%以下であることを特徴とする請求項1に記載の装置。
- 二つの隣接する前記ウエルの間の距離は前記ウエルの前記サイズの112%以下であることを特徴とする請求項1に記載の装置。
- 二つの隣接する前記ウエルの間の距離は前記ウエルの前記サイズの105%以下であることを特徴とする請求項1に記載の装置。
- 二つの隣接する前記ウエルの間の距離は前記ウエルの前記サイズとほぼ同じであることを特徴とする請求項1に記載の装置。
- 以下のステップを含む、細胞を研究する方法:
a)液体中に懸濁された複数の細胞を、請求項1に記載の装置中に分配し、;
b)液体が前記装置中に保持されている間に、前記複数の細胞からの細胞を前記複数のウエルのウエル中に沈降させてその中に保持されるようにし;そして
c)もし前記複数の細胞の必ずしもすべての細胞が前記複数のウエルのウエル中に保持されないならば、液体の流れを前記平坦な表面に対して実質的に平行に付与し、前記ウエル中に保持されていない細胞が流し去られるか又は前記複数のウエルのウエル中に入るようにさせる。 - 前記細胞は、重力作用の結果として前記ウエル中に沈降することによって前記ウエル中に入ることを特徴とする請求項21に記載の方法。
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