WO2020198829A1 - Processo de modificação da superfície de eletrodos para construção de biossensores eletroquímicos - Google Patents

Processo de modificação da superfície de eletrodos para construção de biossensores eletroquímicos Download PDF

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Luiz Ricardo Goulart Filho
Isabela Maria BERNARDES GOULART
Fabiane NUNES RIELLO
Ana Flávia OLIVEIRA NOTÓRIO
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Universidade Federal De Uberlândia - Ufu
Cirino Alberto Goulart Eireli – Epp
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Definitions

  • the present invention is about the development of a technique for stabilizing, functionalizing and reusing the surface of screen-printed electrodes by applying Rhodamine 6G (R6G) and creating an experimental electrochemical immunosensor model for detecting mycobacteria exploited to detect other pathogens.
  • R6G Rhodamine 6G
  • the invention has characteristics that call the attention of scientific investments since it tries to overcome an eminent difficulty that is found in commercial electrodes, where the lack of standardization and uniformity of the work area as well as the little recognition of biological samples with the surface make the use of this little viable material in the detection and diagnosis of diseases.
  • R6G is the first organic compound used as a tool to stabilize, functionalize and reuse the surface of commercial screen-printed electrodes. Its use can be explored to detect any sample with protein and / or carbohydrate constitution.
  • the biosensor is an integrated and self-sufficient device capable of providing analytical, quantitative or semi-quantitative information using a biological recognition element (receptor) that guarantees specificity and produces a response that is translated by the physical component into an optical signal or electric. That is, the purpose of a biosensor is to produce a signal proportional, in magnitude or frequency, to the concentration of the analyte (NAKAMURA, H., KARUBE, I. Current research activity in Biosensors, Anal. Bional. Chem. 377: 446-468 , 2003).
  • the receptor consists of a material of biological origin, such as: enzymes, organelles, animal or vegetable tissue, microorganism, antigen or antibody, nucleic acids, among others, which is immobilized on a support, connected to a base sensor ( transducer) that converts the signal.
  • a base sensor transducer
  • Electrochemical biosensors recommended definitions and classification. Biosensor & Bioelectronics. 16: 121-131, 2001).
  • Biosensors can be classified as catalytic which generally use enzymes that are coupled to the working electrode. These have a great activity combined with a high specificity for certain species, catalyzing the formation of electroactive products to be detected. Or of affinity based on the formation of bonds between the analyte and the biological recognition component, using biomolecules, the bond essentially depends on the complementarity between the analyte and the active center of the biological component, both in size and in shape, which allows high selectivity and sensitivity (PATACAS, RC Development, characterization and optimization of an amperometric biosensor for the determination of Nitrate based on gelled microinterfaces. 123 f. Dissertation (Master in Chemistry) - Faculty of Sciences, University of Porto, Porto, 2007 ).
  • biosensors are the most varied and can be present in fields such as human health, veterinary, agriculture, food industry, pharmaceutical industry, environment, defense of the civilian population, hospital infection control, among others, for presenting characteristics that make them an increasingly attractive tool.
  • Biosensors can be classified according to the bi-layer and the transducer used.
  • the bi-layer they can be: enzymatic, which use enzymes as bioreceptor elements; cell phones, which use microorganisms, especially for the environmental monitoring of pollutants and immunosensors, which are based on the immunological reaction, with the antigen or antibody being the receptor immobilized on the sensor surface.
  • the biosensor can be classified as: optical, which are based on changes in the optical properties of substances that can be absorption, refractive index, fluorescence, phosphorescence, reflectivity and wavelength; piezoelectric, which detect the mass (related to the oscillation of the frequency of the piezoelectric crystals); calorimetric, which use the heat generated by catalyst reactions to measure the concentration of the analyte and where the biological element is translated into an electrical signal (DUTRA, RAF Development of biosensors in clinical biochemistry and immunodiagnosis. Doctoral Thesis: Universidade Federal de Pernambuco, 1999) .
  • optical which are based on changes in the optical properties of substances that can be absorption, refractive index, fluorescence, phosphorescence, reflectivity and wavelength
  • piezoelectric which detect the mass (related to the oscillation of the frequency of the piezoelectric crystals)
  • calorimetric which use the heat generated by catalyst reactions to measure the concentration of the analyte and where the biological element is translated into an electrical signal
  • Electrochemical biosensors are probably the largest class of sensors chemicals, being used in the detection of the most diverse molecules, microorganisms, among others. Most transducers used in commercial biosensors are of this type.
  • [01 1] Can be divided into potentiometric, amperometric, voltammetric, conductometric and impedimetric.
  • Amperometric and potentiometric devices have been the most used.
  • Amperometric devices are based on current intensity measurements in an electrochemical cell at a fixed potential, the current being generated by an oxidation reaction or electrochemical reduction of electroactive species on the sensitive surface, proportional to the concentration of the analyte. In this technique, the working electrode potential is usually kept constant in relation to the reference electrode.
  • voltammetric biosensors work with a variation of potential for the detection system until oxidation or reduction of the analyte occurs with variation of the peak current more or less.
  • Electrochemical detection is based on two principles, direct and indirect.
  • Direct detection starts from the principles of oxidation of nitrogenous bases (in the case of DNA) and amino acids (in the case of peptides and proteins), in which, from specific potentials, the quantitative values can provide the concentration of these biomolecules (WO 2012153124 A1 / W020090451 16 A1).
  • Indirect detection uses electrochemical indicators, which can be oxidized and / or reduced with proportional quantitative values (directly or inversely proportional).
  • Electrochemical sensors with disposable electrodes have been an interesting option in the application in several types of systems, since they can be mass produced, at a low cost and without some limitations presented by solid electrodes, such as the lack of repeatability of the active area between successive polishing and the difficulty of regenerating the surface after use, resulting in higher execution costs (NASCIMENTO, VB ANGNES, L. Electrodes manufactured by "silk-screen”. Qu ⁇ m. Nova. 21 (5): 614-629, 1998).
  • the electrodes printed by a screen printing system are called SPE (Screen Printed Electrode) or silk-screen. It has been used with great success because it allows mass production with extremely low cost, simplicity of use, high sensitivity, selectivity, precision, stability and quick responses in addition to being discarded.
  • SPEs consist of a film deposited on a substrate that will serve as a support and provide a surface for printing the electrode, usually PVC or alumina ceramic. It is important that the substrate material is thermally and chemically inert, with low residual current and high electrical conductivity capable of resisting the generations of signals produced by the biosensors. Then the paints are deposited on the substrate, they can be conductive and dielectric.
  • the material used can be powdered metals such as gold, platinum, silver, palladium and carbon, which are dispersed in the binder.
  • Carbon has been widely used as a raw material for making electrodes due to its characteristics such as high chemical inertness and electrochemical inertia, the latter in a wide range of potentials; low current residual; high electrical conductivity and provide easy surface regeneration.
  • this film is partially covered by a second layer of an insulator to define an area of electrical contact at one end and another area to be the surface of the electrode. (BRAININA, KHZ, BOND, AM, Anal. Chem. 67: 2586, 1995 / COOPER, JM, CASS, AEG Biosensors. 2nd ed. Oxford University Press. United States. 268 f., 2004).
  • the printed electrodes have the advantage of being disposable, in addition to the ease of miniaturization, because of their planar shape, they provide their integration with small portable devices.
  • the integrated system of three electrodes - working electrode (ET); reference (ER) and auxiliary (EA) enable its use in small portable equipment.
  • Modified electrodes are defined, those that have immobilized, on their surfaces, chemically active species such as film or monomolecular, multimolecular, ionic or polymeric layer aiming to control the physical-chemical properties of the electrode-solution interface (EDWARDS, GA, BERGREN , A. J cohesivePORTER, MD Chemically Modified Electrodes. In: ZOSKI, CG Handbook of Electrochemistry. Elsevier .. 295-327, 2007).
  • Rhodamines are a family of organic chemicals used as dyes, known as fluorones, it is a cationic fluorescent compound of formula C27H29CIN2O3. These dyes have been widely used as tracking agents in studies of water, pollution and spraying of aerial pesticides and as coloring for drugs, cosmetics, textiles and paints. These compounds are widely used in biotechnological applications, such as fluorescence microscopy, flow cytometry, fluorescence spectroscopy and ELISA (International Agency for Research on Cancer. Rhodamine B. IARC Monogr., 16: 221-231. 1978).
  • Rhodamine 6G is also known as Rhodamine 590, R6G, Rh6G, Basic Red 1 or Basic Rhodamine Yellow. Under normal conditions of pressure and temperature, this compound is a dark purple, brown or black crystalline solid. It has a molar mass of 479.02 g mol-1 and a density of 1.26. It is very soluble in water and in several organic solvents. Although very soluble, this form is quite corrosive to all metals and alloys except stainless steel. Other formulas are less soluble, but less corrosive. It has great photo-stability and a high quantum yield of fluorescence (0.95) and has a maximum absorption at 530 nanometers.
  • This dye is produced from the condensation of 3-ethylamino-p-cresol (3-ethylamino-4-methylphenol) with phthalic anhydride, followed by esterification with ethanol by acid catalysis (GEORGES, J., ARNAUD, N., PARISE, L. Limitations arising from optical saturation in fluorescence and thermal lens spectrometries using pulsed laser excitation: Application to the determination of the fluorescence quantum yield of rhodamine 6G. Applied Spectroscopy. 50 (12): 1505-1511., 1996 / PUBCHEM. Available at :
  • cationic dyes of this type are used in lasers and as test molecules in various biological applications, mainly because of their low toxicity, quantum efficiency, little dependence on environmental factors, and their fluorescent characteristics do not change over several years. hours if your aqueous solution is continuously stirred.
  • PALMA J.M.L.M.
  • BR 1020160195390 shows the application of tetramethylbenzidine (4-DMAA) since it is an organic compound that can oxidize, reduce and interact with biomolecules.
  • US patent 6750357 B1 shows that rhodamine can be used as a raw material for the synthesis of other light-excitable compounds in appropriate wavelengths.
  • rhodamine is used in the detection of metal ions (KAMAL, A., KUMAR, N StammBHALLA, V., Rhodamine-dimethyliminocinnamyl based electrochemical sensors for selective detection of iron (II). Sens Act B Chem. 190: 127-133, 2013 / KIM, H hinderLEE, DH., SON, YA. Electrochemical Study on Rhodamine 6G-indole Based Dye for HOMO and LUMO Energy Levels. Text. Coloration Finish. 25: 7-12, 2013) .
  • Rhodamine 6G is widely used in Ramam spectroscopy as an analyte model to test modified surfaces as in the case of modification with silver nitrate for the construction of a biosensor for colorectal cancer and on surfaces coated with gold nanostructures due to the detectable signs of fluorescence emitted by this dye (ORS ⁇ GOV ⁇ , KZ, ORINAK, A., ORINAKOV ⁇ , R complicatPETRUS, O., MACKO, J manner RADONAK, J hinderSUKOVSK ⁇ , L. L, JURASEKOV ⁇ , Z satisfy SMITH, R physicallySTRECKOV ⁇ , M» KOVAL, K. Electrochemically deposited silver detection substrate for surface-enhanced Raman spectroscopy cancer diagnostics.
  • Rhodamine 6G is an interesting molecule of technological application and commonly used in microscopy, flow cytometry, spectroscopy, ELISA and Ramam sensors. But there were no uses of the dye in electrochemical biosensors or in preparing surfaces to stabilize and bind biomolecules to electrodes.
  • Rhodamine 6G was tested as a surface modifier for the work area of commercial screen-printed electrodes by present aromatic carbohydrate-binding rings and structure with affinity to biological molecules such as proteins, thus making the surface more receptive to biological elements such as antigens and antibodies being used to prepare biological sensing and disease diagnosis techniques.
  • Leprosy is a chronic infectious disease caused by Mycobacterium leprae mainly affecting the skin and peripheral nerves (WALKER, S.L., LOCKWOOD, D.N.J. Leprosy. Clin. Dermatol. 25 (2): 165-172, 2007).
  • M. leprae The diagnosis of M. leprae is based mainly on clinical tests carried out on the dermatoneurological examination. (DUTHIE, MS, HAY, MN, RADA, EM, CONVIT, J., ITO, L. Specific IgG antibody responses may be used to monitor leprosy treatment efficacy and as recurrence prognostic markers. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 30: 1257-1265, 201 1).
  • PCR polymerase chain reaction
  • Screen-printed commercial electrodes are widely used in the creation of electrochemical sensors, however their use is limited due to the lack of standardization of the work area and little recognition with biological samples thus requiring modifying agents.
  • the invention presents the modification of the transducer surface of a commercial screen-printed electrode with 6G rhodamine, a dye capable of stabilizing and homogenizing the surface and increase the active area of the electrodes ensuring greater electron passage and greater biological recognition for having benzene rings in its structure that interact with proteins, DNA and RNA through electrostatic bonding or fusion enabling the biosensor in the recognition and diagnosis of these samples .
  • the application results in the construction of an immunosensor that uses a screen-printed graphite electrode type DRP1 10 as conductive material and rhodamine 6G dye as a working area modifier and electrochemical analyzes following the variation of the signals by differential pulse voltammetry, cyclic voltammetry another appropriate electrochemical technique, from the peak of oxidation or reduction of the specific recognition bond between probe and targets.
  • the electrode used must be of a preferably conductive material and present electrochemical inertia in the range of -0.4 V to +1, 4 V (versus Ag / AgCI or Ag), such as graphite, glassy carbon, paste carbon, diamond, gold, platinum or even combinations of these materials.
  • electrochemical inertia in the range of -0.4 V to +1, 4 V (versus Ag / AgCI or Ag), such as graphite, glassy carbon, paste carbon, diamond, gold, platinum or even combinations of these materials.
  • These materials and biological recognition compounds can also be incorporated into nanotechnological materials such as polymeric films, graphene, carbon nanotubes and nanoparticles, aiming at increasing conductivity and improving electrochemical signals.
  • FIGURE 1 illustrates the scanning of cyclic voltammetry (VC) (FIG. 1A) and differential pulse voltammetry (VPD) (FIG. 1 B) for three different electrodes modified with rhodamine 6G (4,5 and 6) and the same electrodes before the adsorption of this component (1, 2 and 3). It is observed that in the voltammetry of the electrodes without modification there was a great variation, more than 50uA, in the oxidation current of VPD and VC and in this the potential also varied from 0.2 to 0.4V.
  • Rhodamine 6G has an efficient adsorption on carbon, possibly due to Van der Waals interactions between the planar benzene ring and the electrode surface. Proving that this modification was useful to homogenize, standardize and increase the conductivity of the electrode transducer surface, thus preparing them for sample application.
  • FIGURE 2 shows the adsorption of different concentrations of rhodamine 6G on the surface of the electrodes in order to study their interaction to choose the best dilution to be used in the next tests.
  • FIG 2A and B show cyclic and differential pulse voltamograms for the following rhodamine dilutions: (1) 50pg, (2) 100pg, (3) 500pg, (4) 1 mg, (5) 5mg, (6) 10mg, (7) 50mg, (8) 100mg.
  • FIG 2B shows a table with the values of the scanning speeds of the peaks of oxidation currents in cyclic voltammetry for the different concentrations of rhodamine studied.
  • the specific antibody for mycobacterium leprae antigens Anti-PGL-1 was immobilized on the surface of electrodes modified with rhodamine 6G and tested for recognition with some mimetic, synthetic and native antigens that specifically recognize this probe.
  • FIGURE 3A cyclic voltammetry was performed to determine the difference between the binding of the antibody with the native antigen PGL-1 (curve 1), antibody with mimetic antigen M3R (curve 5) and antibody without recognition antigen (curve 3), the curve 2, electrode without modification and curve 4, electrode modified with rhodamine but without the targets served as baselines.
  • FIG 3B shows the bar graph of the same previous analysis with the values of the oxidation peak currents of the connection in each electrode at the potential of 0.25V. By analyzing the current peaks at this potential, it is possible to verify the difference when there are connections between the antibody and the antigens and when there is no recognition.
  • FIGURE 3C differential pulse voltammetry analyzes were performed with the same anti-PGL-1 antibody recognizing other specific antigens for comparison.
  • CURVE 1 represents the antibody binding with native PGL-1 antigen
  • CURVA 2 the antibody is without recognition antigen
  • CURVA 3 the antibody is recognizing the LAM antigen of M.
  • FIGURE 4 shows the cleaning and reuse of the bioelectrode modified with rhodamine 6G even after the adsorption of the antibody and antigens.
  • FIG. 4A we have the cyclic voltamograms of the modified electrodes immobilized with the Anti-PGL-1 antibody with native PGL-1 antigen (curve 1), without recognition antigen (curve 2) and with M3R mimetic antigen (curve 3). After these readings and differentiation of the curves, the electrodes were washed with alcohol and reused for new adsorption.
  • curve 1 the cyclic voltamograms of the modified electrodes immobilized with the Anti-PGL-1 antibody with native PGL-1 antigen
  • curve 2 without recognition antigen
  • curve 3 M3R mimetic antigen
  • the M3R antigen was added in the second immobilization. Even after washing and immobilization on different electrodes, the bioelectrode maintained the ability to differentiate the antigens with the oxidation and reduction peaks, keeping very close to the modified and immobilized electrodes for the first time.
  • electrodes modified with rhodamine 6G have the ability to be cleaned and reused even after the adsorption of probes and targets, since they bind to the chemical compound adsorbed previously and not directly on the electrode surface and when the modified bioelectrode is washed with some solvent organic, alcohol in the case of this test, manages to undo the connections of the benzene ring between rhodamine and carbon on the electrode surface by washing together all biological material that had been deposited on rhodamine.
  • FIGURE 5 clinical samples of dermal shaving from patients and suspected leprosy contacts were used. These were immobilized in the same way on carbon electrodes modified with 6G rhodamine and anti-PGL-1 antibody.
  • CURVES 1 refer to immobilization with positive dermal scraping and CURVES 2 with negative dermal scraping. It is observed that the curves of positive samples have a lower peak of oxidation and reduction current than negative samples, this is because when there is an antibody-antigen connection, it makes it difficult for electrons to pass through the electrode surface, and when there is no specific connection to electron transfer is greater.
  • V 200 mV.s-1
  • the scanning speed was increased to 500 mV.s-1 and the differentiation between samples also increased to 141 mA at the oxidation peaks.
  • FIG 5C the scanning curves were analyzed in differential pulse voltammetry and the difference between the oxidation currents of the positive and negative samples was even more significant (306mA).
  • FIGURE 6 shows cyclic voltammetry (A and B) and differential pulse voltammetry (C) with the specific antigen for tuberculosis Anti-LAM immobilized on the modified electrode in the same way as the previous tests.
  • CURVES 1 the electrodes were incubated with TB culture (positive samples) while CURVES 2 did not contain any target (negative control).
  • a significant difference is observed between the peak oxidation currents of the positive and negative samples, 74mA in FIG. 6A, 139mA in FIG. 6B and 262mA in FIG. 6C.
  • the electrode used was a graphite screen-printed type, consisting of a working electrode (4 mm in diameter), against electrode and reference electrode. (Ref. DRP 1 10).
  • the antigen-antibody conjugate was washed with PBS1X on a magnetic rack and the part attached to the magnet was resuspended and applied 2 to 20 ⁇ l on the working area surface of the 6G rhodamine-modified electrode and incubated at 25 to 37 ° for 5 to 5 minutes. 50 minutes.
  • the analyzes were made by measurements of differential pulse voltammetry and cyclic voltammetry at different scanning speeds on the electrode in portable potentiostat and 50 to 120 pl_ of 1 mM to 5 mM / Kcl 0.1 M potassium ferroferricyanide was used as the support electrolyte.
  • the antibody specific to that tuberculosis anti-LAM pathogen was used, which was immobilized in the same way as the previous tests, and for specific recognition, a sample of tuberculosis culture was subsequently adsorbed in TLN medium (positive sample) and as a negative control, adsorbed only the TLN medium without any type of pathogen and incubated at a temperature between 25 to 37 ° for 5 to 50 minutes.
  • the analyzes were made by measurements of differential pulse voltammetry and cyclic voltammetry at different scanning speeds on the electrode in portable potentiostat and 50 to 120 pL of potassium ferroferricyanide from 1 mM to 5mM / Kcl 0.1 M was used as a support electrolyte.
  • kits containing anti-PGL1 / anti-LAM or other specific antibodies to mycobacteria coupled or not coupled to magnetic nanoparticles will be made available for subsequent agglutination with several types of biological samples to be tested in the field that will be applied to electrodes already prepared with 6G rhodamine which facilitates and speeds up the in-house diagnostic process.
  • the present invention shows that rhodamine 6G functioned as a versatile transducer surface modifier of commercial screen-printed electrodes, it was able to stabilize and functionalize the work area, this because it easily adsorbes on graphite carbon through the benzene ring, and it also binds proteins, and other biological molecules through hydrogen bonds, and their bond breaks down easily when washed with ethyl alcohol making the biosensor reusable.
  • the immunosensor with modified surface promoted the detection of antigens when specific antibodies were used as a target and differentiated samples of dermal shaving from patients with leprosy from contacts without the disease. It presented advantages inherent to its speed in the diagnosis of these pathogens, applicability, specificity, sensitivity, stability, selectivity and low cost.
  • this type of sensor can be used in the detection of biomolecules that have proteins or their biological or synthetic fragments, antigens, antibodies, peptides, DNA, RNA enzymes and aptamers, as analytes or as a biological recognition element.
  • Rhodamine 6G was used in concentrations ranging from 100pg to 100mg diluted in organic solvent, surfactants can be added, chemical compounds or nanotechnological materials to improve the connection with the surface of the electrodes and with the biomolecules.
  • Specific antibodies and their respective native antigens, mimetics, culture of bacteria and samples from patient scrapes can be used, not only restricted to use for mycobacteria, but for immunosensors in general using biomolecules that have proteins or their biological fragments or synthetics, antigens, antibodies, peptides, DNA, RNA enzymes and aptamers, as analytes or as a biological recognition element.
  • the great advantage of the present invention is to make the biosensor reusable by washing the modified electrode with organic solvent in different concentrations.
  • the modification of the electrodes and detection of biological materials occurs through electrochemical analysis, following the variation of the signals by differential pulse voltammetry, cyclic voltammetry, square wave voltammetry or other appropriate electrochemical technique, of the oxidation peak or reduction of specific reconnection link between probe and targets.
  • the modification of the electrode transducer surface with rhodamine 6g may be responsible for obtaining an electrochemical sensor that will be used in the detection of biomolecules that contain proteins or their biological or synthetic fragments, antigens, antibodies, peptides, DNA enzymes, RNA and aptamers, as analytes or as an element of biological recognition.

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Abstract

A presente invenção trata-se do desenvolvimento de uma técnica para modificação, estabilização, funcionalização e reutilização da superfície de eletrodos screen- printed mediante a aplicação de Rodamina 6G como composto orgânico modificador da área de trabalho possibilitando a criação de imunossensores que utilizem proteínas ou seus fragmentos biológicos ou sintéticos, antígenos, anticorpos, peptídeos, enzimas DNA, RNA e aptâmeros como analitos ou como elemento de reconhecimento biológico.

Description

PROCESSO DE MODIFICAÇÃO DA SUPERFÍCIE DE ELETRODOS PARA CONSTRUÇÃO DE BIOSSENSORES ELETROQUÍMICOS
Campo da invenção
[001] A presente invenção trata-se do desenvolvimento de uma técnica para estabilização, funcionalização e reutilização da superfície de eletrodos screen- printed mediante a aplicação de Rodamina 6G (R6G) e criação de um modelo experimental de imunossensor eletroquímico para detecção de micobactérias podendo ser explorados para detecção de outros patógenos. O invento apresenta características que chamam a atenção de investimentos científicos uma vez que tenta suprir uma dificuldade eminente que é encontrada em eletrodos comerciais, onde a falta de padronização e uniformização da área de trabalho assim como o pouco reconhecimento de amostras biológicas com a superfície tornam o uso desse material pouco viável na detecção e diagnostico de doenças. A hanseníase causada pelo mycobacterium leprae assim como outras micobactérias foram usadas como modelo para tal aplicação por se tratar de doença infecciosa tropical negligenciada que carece de um diagnóstico diferencial rápido e sensível. O R6G é o primeiro composto orgânico usado como ferramenta para estabilizar, funcionalizar e reutilizar a superfície de eletrodos comerciais do tipo screen-printed a sua utilização podendo ser explorada para detecção de qualquer amostra com constituição proteica e/ou de carboidratos.
Estado da Técnica
Biossensores
[002] O biossensor é um dispositivo integrado e autossuficiente capaz de fornecer informações analíticas, quantitativas ou semi-quantitativas utilizando um elemento de reconhecimento biológico (receptor) que garante a especificidade e produz uma resposta que é traduzida pelo componente físico em um sinal óptico ou elétrico. Ou seja, o objetivo de um biossensor é produzir um sinal proporcional, em magnitude ou frequência, à concentração do analito (NAKAMURA, H., KARUBE, I. Current research activity in Biosensors, Anal. Bional. Chem. 377: 446-468, 2003). [003] O receptor consiste em um material de origem biológica, tais como: enzimas, organelas, tecido animal ou vegetal, microrganismo, antígeno ou anticorpo, ácidos nucleicos, entre outros, que é imobilizado em um suporte, conectado a um sensor base (transdutor) que converte o sinal. (TRÉVENOT, D.R., TOTH, K„ DURST, R. A., WILSON, G. S. Electrochemical biosensors: recommended definitions and classification. Biosensor & Bioelectronics. 16: 121-131 , 2001 ).
[004] Os biossensores podem ser classificados como catalíticos que geralmente utilizam enzimas que são acopladas ao eletrodo de trabalho. Estas têm uma grande atividade aliada a uma elevada especificidade para determinadas espécies, catalisando a formação de produtos eletroativos para serem detectados. Ou de afinidade que baseiam-se na formação de ligações entre o analito e o componente de reconhecimento biológico, utilizando biomoléculas, a ligação depende essencialmente da complementaridade entre o analito e o centro ativo do componente biológico, quer em tamanho como em forma, o que permite uma elevada seletividade e sensibilidade ( PATACAS, R. C. Desenvolvimento, caracterização e optimização de um biossensor amperométrico para a determinação de Nitrato baseado em microinterfaces gelificadas. 123 f. Dissertação (Mestrado em Química) - Faculdade de Ciências da Universidade do Porto, Porto, 2007).
[005] Dentre os métodos de imobilização, os mais utilizados tem sido: ligação covalente, adsorção física, oclusão em gel ou filme polimérico que podem se formar através de simples imersão ou aplicação de potencial elétrico (eletrodeposição).
[006] As áreas de aplicações dos biossensores são as mais são variadas podendo estar presente em campos como saúde humana, veterinária, agricultura, indústria alimentícia, indústria farmacêutica, meio ambiente, defesa da população civil, controle de infecção hospitalar entre outras por apresentam características que os tornam uma ferramenta cada vez atrativa.
[007] Dentre as características desejáveis ou ideais em relação a um biossensor podemos considerar: seletividade que é a capacidade de distinguir a molécula de interesse dentre as demais presentes na amostra; sensibilidade, o transdutor é capaz de converter um sinal biológico em um sinal elétrico proporcional ao nível de concentração do analito na amostra; estabilidade, tempo em que uma biomolécula permanece com suas características básicas de biorreconhecimento; reprodutibilidade, onde o experimento pode ser repetido por aplicação do mesmo protocolo, obtendo resultados similares ao original; baixo custo e simplicidade de operacionalização (GALLI, A. Desenvolvimento e caracterização de um biossensor bioenzimático imobilizado sobre monocamadas auto-organizadas para determinação de açucares em alimentos. 143 f. Tese (Doutor em Ciências, Química Analítica) - Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Carlos, 2009.)
[008] Os biossensores podem ser classificados de acordo com a biocamada e o transdutor utilizado. Quanto a biocamada podem ser: enzimáticos, que utilizam enzimas como elementos bioreceptores; celulares, que usam microrganismos, especialmente, para o monitoramento ambiental de poluentes e imunossensores, que são baseados na reação imunológica, sendo o antígeno ou anticorpo o receptor imobilizado na superfície do sensor.
[009] De acordo com o transdutor utilizado, o biossensor pode ser classificado como: óptico, que se baseiam em mudanças nas propriedades ópticas das substâncias que podem ser absorção, índice de refração, fluorescência, fosforescência, refletividade e comprimento de onda; piezelétricos, que detectam a massa (relacionada a oscilação da frequência dos cristais piezelétricos); calorimétrico, que usam o calor gerado por reações catalisadoras para medir a concentração do analito e onde o elemento biológico é traduzido em sinal elétrico (DUTRA, R. A. F. Desenvolvimento de biossensores em bioquímica clínica e imunodiagnóstico. Tese de Doutorado: Universidade Federal de Pernambuco, 1999).
Biossensores eletroquímicos
[010] Biossensores eletroquímicos é provavelmente a maior classe de sensores químicos, sendo utilizados na detecção das mais diversas moléculas, micro- organismos, entre outros. É deste tipo a maioria dos transdutores usados em biossensores comerciais.
[01 1] Podem ser divididos em potenciométrico, amperométrico, voltamétrico, condutimétrico e impedimétrico. Os amperométricos e potenciométricos tem sido os mais utilizados. Os amperométricos baseiam-se nas medidas de intensidade de corrente em uma célula eletroquímica a um potencial fixo, sendo a corrente gerada por reação de oxidação ou redução eletroquímica de espécies eletroativas na superfície sensitiva, proporcional à concentração do analito. Nessa técnica, usualmente o potencial de eletrodo de trabalho é mantido constante em relação ao eletrodo de referência. Ao contrário dos amperométricos, os biossensores voltamétricos funcionam com uma variação de potencial para o sistema de detecção até ocorrer a oxidação ou redução do analito com variação da corrente de pico para mais ou para menos. Nas medidas potenciométricas, a magnitude do potencial medido em correntes quase nulas e é decorrente da diferença de potencial entre um eletrodo indicador e um eletrodo de referência. Os biossensores condutimétricos medem a condutância entre um par de eletrodos metálicos tendo como consequência a produção de espécies iônicas, resultantes da interação de uma enzima com o analito. Por fim os biossensores impedimétricos são aqueles que utilizam medidas de impedância eletroquímica para a detecção da interação antígeno-anticorpo na superfície modificada do eletrodo. (TRÉVENOT, D.R.; TOTH, K.; DURST, R. A.; WILSON, G. S. Electrochemical biosensors: recommended definitions and classification.Biosensor & Bioelectronics. 16: 121 -131 , 2001 / MOHANTY, S. P., KOUGIANOS, E. Biosensors: a tutorial review. IEEE Potentials, 25( 2): 35-40, 2006).
[012] A detecção eletroquímica parte de dois princípios, direto e indireto. A detecção direta parte dos princípios de oxidação de bases nitrogenadas (no caso de DNA) e de aminoácidos (no caso de peptídeos e proteínas), na qual a partir de potenciais específicos os valores quantitativos podem proporcionar a concentração destas biomoléculas (WO 2012153124 A1 / W020090451 16 A1 ). A detecção indireta utiliza indicadores eletroquímicos sendo estes passíveis de oxidação e/ou redução também com valores quantitativos proporcionais (direta ou inversamente proporcionais).
Elétrodos
[013] A escolha da superfície onde irão ocorrer as biorreações (eletrodos) é uma parte fundamental no processo de criação de biossensores. Os sensores eletroquímicos com eletrodos descartáveis tem sido uma opção interessante na aplicação em vários tipos de sistemas, uma vez que podem ser produzidos em massa, a um baixo custo e sem algumas limitações apresentadas pelos eletrodos sólidos, como a falta de repetibilidade da área ativa entre polimentos sucessivos e a dificuldade de regeneração da superfície após o uso acarretando maior custo na execução (NASCIMENTO, V. B. ANGNES, L. Eletrodos fabricados por "silk-screen". Quím. Nova. 21 (5): 614-629, 1998).
[014] Os elétrodos impressos por sistema de serigrafia são chamados de SPE (Screen Printed Electrode) ou silk-screen. Tem sido empregado com grande sucesso por possibilitar a produção em massa com custo extremamente baixo, simplicidade de utilização, alta sensibilidade, seletividade, precisão, estabilidade e respostas rápidas além de poderem ser descartados. Os SPEs consistem em um filme depositado sobre um substrato que vai servir de suporte e fornecer superfície para impressão do eletrodo, geralmente de PVC ou cerâmica de alumina. É importante que o material do substrato seja termicamente e quimicamente inerte, com baixa corrente residual e alta condutividade elétrica capazes de resistirem às gerações de sinais produzidas pelos biossensores. Em seguida são depositadas as tintas sobre o substrato, elas podem ser condutoras e dielétricas. Nas tintas condutoras o material utilizado pode ser pó de metais como ouro, platina, prata, paládio e carbono, as quais estão dispersas no ligante. O carbono tem sido amplamente empregado como matéria prima para confecção de eletrodos devido suas características como elevada inércia química e inércia eletroquímica, esta última numa ampla faixa de potenciais; baixa corrente residual; alta condutividade elétrica e propiciar uma fácil regeneração da superfície. Em geral, este filme é parcialmente coberto por uma segunda camada de um isolante para definir uma área de contato elétrico numa extremidade e outra área para ser a superfície do eletrodo. (BRAININA, K.H. Z., BOND, A. M., Anal. Chem. 67: 2586, 1995 / COOPER, J. M., CASS, A. E. G. Biosensors. 2nd ed. Oxford University Press. United States. 268 f., 2004).
[015] Os eletrodos impressos possuem a vantagem de serem descartáveis, além da facilidade de miniaturização, pois pelo seu formato planar, propicia a sua integração a pequenos dispositivos portáteis. O sistema integrado de três eletrodos - eletrodo de trabalho (ET); referência (ER) e auxiliar (EA) viabilizam sua utilização em pequenos equipamentos portáteis.
Eletrodos modificados
[016] Os eletrodos screen-printed apesar de serem aplicados em uma gama de situações observa-se uma limitação já que na maioria dos casos necessitam de modificação da superfície objetivando principalmente o controle das reações que ocorrem na interface e propiciando maior seletividade para um determinado analito. A grande dificuldade desses eletrodos comerciais é a falta de padronização da área de trabalho mesmo em eletrodos feitos na mesma linha de produção, assim como a dificuldade de aderência de algumas biomoléculas a superfície da área de trabalho. E apesar de serem descartáveis há um custo maior por não serem reutilizados.
[017] Conceitua-se eletrodos modificados, aqueles que tem imobilizado, em suas superfícies, espécies quimicamente ativas como filme ou camada monomolecular, multimolecular, iônico ou polimérico objetivando controlar as propriedades físico-químicas da interface eletrodo-solução (EDWARDS, G. A., BERGREN, A. J„ PORTER, M. D. Chemically Modified Electrodes. In: ZOSKI, C. G. Handbook of Electrochemistry. Elsevier.. 295-327, 2007).
[018] Essa combinação entre a versatilidade dos eletrodos impressos e a possibilidade de modificação da sua superfície com reagentes específicos, tem ampliado significativamente as suas aplicações. Existem na literatura eletrodos modificados das mais diversas formas como com filme de mercúrio (WANG, J. Decentralized electrochemical monitoring of trace-metals-from disposable strips to remote electrodes - plenary lecture. Analyst. 119: 763- 766, 1994) , filme de bismuto (WANG, Z„ WANG, H„ ZHANG, Z„ LIU, G. Electrochemical determination of lead and cadmium in rice by a disposable bismuth/electrochemically reduced grapheme/ ionic liquid composite modified screen-printed electrode. Sensors and Actuators B. 199: 7-14, 2014), filme de chumbo (BOBROWSKI, A., KROLICKA, A., MACZUGA, M„ ZAREBSKI, J. A novel screen-printed electrode modified with lead film for adsorptive stripping voltammetric determination of cobalt and nickel. Sensors and Actuators B. 191 : 291-297, 2014), nanopartículas de ouro (ASADOLALLAH l-BABOLI , M.. MANI- VARNOSFADERANI, A. Rapid and simultaneous determination of tetracycline and cefixime by mean of gold- nanoparticles-screen-printed gold electrodes and chemometrics tools. Measurements. 47: 145-149, 2014), nanopartículas de oxido de níquel (RAFIEE, B., FAKHARI, A. R. Electrocatalytic oxidation and determination of insulin at nickel oxide nanoparticles-multiwalled carbon nanotube modified screen printed electrode. Biosensors and Bioelectronics. 46: 130-135, 2013), filmes poliméricos também são largamente utilizados para este fim (PI 0413769-8 / BR 102016018862-8).
Rodamina
[019] As rodaminas são uma família de químicos orgânicos usados como corantes, conhecidas como fluoronas, é um composto catiônico fluorescente de formula C27H29CIN2O3. Esses corantes têm sido muito utilizados como agentes de rastreamento em estudos de água, poluição e pulverização de pesticidas aéreos e como coloração de drogas, cosméticos, têxteis e tintas. Estes compostos são muito utilizados em aplicações biotecnológicas, como microscopia de fluorescência, citometria de fluxo, espectroscopia de fluorescência e ELISA (International Agency for Research on Câncer. Rhodamine B. IARC Monogr., 16: 221-231. 1978).
[020] A Rodamina 6G também é conhecida como Rodamina 590, R6G, Rh6G, Basic Red 1 ou Basic Rhodamine Yellow. Em condições normais de pressão e temperatura, este composto é um sólido cristalino vermelho-púrpura escuro, castanho ou preto. Tem massa molar 479,02 g mol-1 e uma densidade de 1 ,26. É muito solúvel em água e em diversos solventes orgânicos. Embora muito solúvel, esta forma é bastante corrosiva para todos os metais e ligas, exceto aço inoxidável. Outras fórmulas são menos solúveis, mas menos corrosivas. Tem uma grande foto-estabilidade e um elevado quantum yield de fluorescência (0,95) e apresenta máximo de absorção aos 530 nanómetros. Este corante é produzido a partir da condensação de 3-etilamino-p-cresol (3-etilamino-4- metilfenol) com anidrido ftálico, seguido de esterificação com etanol por catálise ácida (GEORGES, J., ARNAUD, N., PARISE, L. Limitations arising from optical saturation in fluorescence and thermal lens spectrometries using pulsed laser excitation: Application to the determination of the fluorescence quantum yield of rhodamine 6G. Applied Spectroscopy. 50(12): 1505-1511 ., 1996 / PUBCHEM. Disponível em:
<https://pubchem.ncbi. nlm.nih.gov/compound/rhodamine_6g#section=Top>. Acessado em: 14/08/2018).
[021] Normalmente corantes catiônicos deste tipo são usados em lasers e como moléculas de prova em diversas aplicações biológicas, principalmente por causa de sua baixa toxidade, eficiência quântica, pequena dependência de fatores ambientais, e suas características fluorescentes não se alteram ao longo de várias horas se sua solução aquosa for continuamente agitada. (ARCOUMANIS, C., MCGUIRK, J.J., PALMA, J.M.L.M. On the use of fluorescent dyes for concentration measurements in water flows, ed. E.i. Fluids, 1990).
[022] Em genossensores é comum a utilização de compostos químicos como indicadores para comprovar o processo de hibridação seletiva de DNA, RNA e aptâmeros como mostrado na PI 9302052-0.
[023] Compostos que possuam anéis aromáticos podem ser usados como indicadores eletroquímicos por interagirem com DNA através de ligação eletrostática ou de fusão (RICHARDS, A. D., RODGERS, A. Synthetic metallomolecules as agents for the control of DNA structure. Chemical Rev. 36(3): 471-483, 2007).
[024] Muitos estudos relatam o azul de metileno, brometo de etídio e tetrametilbenzidina como indicadores de DNA (ALVES-BALVEDI, R.P., CAETANO, L.P., MADURRO, J.M., BRITO-MADURRO, A.G. Use of 3,3',5,5'tetramethylbenzidine as new electrochemical indicator of DNA hybridization an dits application in genossensor. Biosens. Bioelectron. 85: 226- 231 , 2016 / BALVEDI, R.P.A., CASTRO, A.C.H., MADURRO, J.M., BRITO- MADURRO, A.G., Detection of a Specific Biomarker for Epstein-Barr Virus Using a Polymer-Based Genosensor. Int. J. Mol. Sei. 15: 9051-9066, 2014 / TALEATAT, Z„ CRISTEA, C„ MARRAZZA, G„ MAZLOU M-ARDAKAN I , M„ SANDULECU, R. Electrochemical immunoassay based on aptamer-protein interaction and functionalized polymer for câncer biomarker detection. J. Electroanalyt. Chem. 15: 119-124, 2014).
[025] Nas pesquisas com indicadores eletroquímicos, para indicar o reconhecimento biológico entre proteínas, a BR 1020160195390 evidencia a aplicação do tetrametilbenzidina (4-DMAA) uma vez que é um composto orgânico que pode oxidar, reduzir e interagir com biomoléculas.
[026] O processo da síntese e preparação industrial das rodaminas (B, 3B, 6G e outras) é descrito na EP 0468821 A1 e da Florina, uma rodamina com radioisótopo F18 na US 9101673 B2.
[027] A preparação de soluções concentradas e diluídas, estáveis, aquosas ou solventes orgânicos de R6G (C28FI31 N2O3CI, MM 479.02g/mol; solubilidade me água 20 g/l e em metanol 400 g/l) estão contidos em US 20070531413 / W02007RU00130 / US 6191278 B1 / WO 2005007678 A2.
[028] A patente US 3849065 A descreve como as soluções de corantes como a rodamina estereficada com glicol e/ou derivado de glicol seriam usadas para corar papel.
[029] A patente US 6750357 B1 mostra que a rodamina pode ser utilizada como matéria-prima para a síntese de outros compostos excitáveis por luz em apropriados comprimentos de onda.
[030] Aplicação de interesse de saúde pública foi a utilização da rodamina no tratamento de células cancerosas, como descrito nas patentes W02010IL00233 / US2010144854.
[031] A interação de diferentes tipos de rodamina no processo de sequenciamento de DNA, é descrito na US 5366860 A.
[032] Nas análises eletroquímicas a rodamina é utilizada na detecção de íons metálicos (KAMAL, A., KUMAR, N„ BHALLA, V., Rhodamine- dimethyliminocinnamyl based electrochemical sensors for selective detection of iron (II). Sens Act B Chem. 190: 127-133, 2013 / KIM, H„ LEE, D-H., SON, Y-A. Electrochemical Study on Rhodamine 6G-lndole Based Dye for HOMO and LUMO Energy Leveis. Text. Coloration Finish. 25: 7-12, 2013).
[033] A rodamina 6G é bastante utilizada em espectroscopia de Ramam como modelo de analito para testar superfícies modificadas como no caso de modifição com nitrato de prata para construção de biossensor para câncer colorretal e em superfícies revestidas com nanoestruturas de ouro devido aos sinais detectáveis de fluorescência emitidos por esse corante (ORSÁGOVÁ, K. Z., ORINAK, A., ORINAKOVÁ, R„ PETRUS, O., MACKO, J„ RADONAK, J„ SUKOVSKÁ, L. L, JURASEKOVÁ, Z„ SMITH, R„ STRECKOVÁ, M„ KOVAL, K. Electrochemically deposited silver detection substrate for surface-enhanced Raman spectroscopy câncer diagnostics. J Biomed Opt. 23(7): 1 -11 . 2018 / TRAN, M„ FALLATAH, A, WHALE, A., PADALKAR, S. Utilization of Inexpensive Carbon-Based Substrates as Platforms for Sensing. Sensors (Basel). 27:18(8), 2018).
[034] A rodamina 6G é uma interessante molécula de aplicação tecnológica e comumente utilizada em microscopia, citometria de fluxo, espectroscopia, ELISA e sensores de Ramam. Mas não foram encontradas utilizações do corante em biossensores eletroquímicos ou no preparo de superfícies para estabilizar e ligar biomoléculas em eletrodos.
[035] Com essas análises, testou-se a Rodamina 6G como modificador da superfície da área de trabalho de eletrodos comerciais screen-printed por apresentar anéis aromáticos ligantes de carboidratos e estrutura com afinidade a moléculas biológicas como proteínas tornando assim a superfície mais receptiva a elementos biológicos como antígenos e anticorpos sendo usada para preparo de técnicas de sensoriamento biológico e diagnóstico de doenças.
Hanseniase
[036] A hanseniase é uma doença infecciosa crónica causada por Mycobacterium leprae acometendo principalmente a pele e os nervos periféricos (WALKER, S.L., LOCKWOOD, D.N.J. Leprosy. Clin. Dermatol. 25(2): 165-172, 2007).
[037] Em 2015, a Organização Mundial da Saúde registrou 21 1 .973 novos casos de hanseniase, sendo este 26.395 somente no Brasil sendo o segundo país com maior prevalência de hanseniase no mundo (WORLD HEALTH ORGANIZATION. Leprosy elimination. Disponível em:<http://www.who.int/lep/en/>. Acesso em: 01.1 1 .2016). Além disso, a hanseniase é uma doença de notificação compulsória no Brasil e de investigação obrigatória.
[038] O diagnóstico de M. leprae é baseado principalmente em testes clínicos realizados no exame dermatoneurológico. (DUTHIE, M.S., HAY, M.N., RADA, E.M., CONVIT, J., ITO, L. Specific IgG antibody responses may be used to monitor leprosy treatment efficacy and as recurrence prognostic markers. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 30: 1257-1265, 201 1 ).
[039] Atualmente testes laboratoriais complementares têm demonstrado uma importante ferramenta no diagnóstico da hanseniase. A técnica de reação em cadeia polimerase (PCR) apresentam uma boa sensibilidade em de hanseniase multibacilar, mas geralmente é pouco sensível (inferior a 50%) em casos de hanseniase paucibacilar. Além disso, a tecnologia de PCR requer equipamentos e infraestrutura de alto custo, são testes para diagnóstico diferencial e complementar e não são utilizados na rotina dos serviços de atenção primária, e sim, nos serviços de referência e em pesquisas (SANTOS, A. R., MIRANDA, A. B„ SARNO, E. M„ SUFFYS, P. N„ DEGRAVE, W.M. Uso de PCR mediada por amplificação de Mycobacterium leprae DNA em diferentes tipos de amostras clínicas para o diagnóstico da lepra. J. Med. Microbiol. 39: 298-304, 1993).
[040] Com isso existe um interesse crescente no desenvolvimento de métodos portáteis, simples, rápidos e precisos para a detecção desses patógenos. Métodos que envolvem a detecção eletroquímica têm mostrado novas possibilidades para o diagnóstico de doenças infecciosas ou outras doenças.
[041] Devido a busca por novas técnicas de diagnóstico para doenças infecciosas como a hanseníase e tuberculose utilizou-se então essas doenças como modelo experimental para testar a utilização dos eletrodos modificados com rodamina 6G.
Descrição e detalhamento dos componentes da invenção
[042] Eletrodos comerciais screen-printed são amplamente utilizados na criação de sensores eletroquímicos, porém seu uso é limitado devido falta de padronização da área de trabalho e pouco reconhecimento com amostras biológicas necessitando assim de agentes modificadores. Visando proporcionar um modificador de superfície de baixo custo, baixa toxicidade, eficiente, estável e com afinidade a moléculas biológicas, a invenção apresenta a modificação da superfície transdutora de um eletrodo comercial tipo screen-printed com rodamina 6G, um corante capaz de estabilizar e homogeneizar a superfície e aumentar a área ativa dos eletrodos garantindo maior passagem de elétrons e maior reconhecimento biológico por possuir anéis de benzeno em sua estrutura que interagirem com proteínas, DNA e RNA através de ligação eletrostática ou de fusão capacitando o biossensor no reconhecimento e diagnóstico dessas amostras.
[043] Nesta plataforma, utilizou-se anticorpos específicos para algumas bactérias imobilizados sobre a superfície transdutora de um eletrodo comercial tipo screen-printed modificado com rodamina 6G como componente biológico de reconhecimento, porém, cabe ressaltar que esta aplicação serve como exemplo da viabilidade de seu uso, não sendo exclusivamente para este fim e sim poderá ser utilizado em diagnóstico de outras doenças e/ou reconhecimento de biomoléculas que possuam proteínas ou seus fragmentos biológicos ou sintéticos, antígenos, anticorpos, peptídeos, enzimas DNA, RNA e aptâmeros.
[044] A aplicação resulta na construção de um imunossensor que utiliza um eletrodo de grafite tipo screen-printed DRP1 10 como material condutor e corante rodamina 6G como modificador da área de trabalho e análises eletroquímicas acompanhando a variação dos sinais por voltametria de pulso diferencial, voltametria cíclica outra técnica eletroquímica apropriada, do pico de oxidação ou redução da ligação de reconhecimento específica entre sonda e alvos.
[045] Para os ensaios de especificidade e sensibilidade do imunossensor modificado foram utilizados anticorpos específicos, seus respectivos antígenos nativos ou miméticos, cultura de bactérias e amostras clínicas de raspado dérmico de pacientes. No entanto, a presente invenção não se restringe apenas à utilização para essas amostras e sim para imunossensores de maneira geral.
[046] O eletrodo utilizado deve ser de um material preferencialmente condutor e, apresentar inércia eletroquímica na faixa de -0,4 V à +1 ,4 V (versus Ag/AgCI ou Ag), tal como o grafite, carbono vítreo, pasta de carbono, diamante, ouro, platina ou até mesmo combinações destes materiais. Estes materiais e os compostos biológicos de reconhecimento também podem estar incorporados aos materiais nanotecnológicos como filmes poliméricos, grafeno, nanotubos de carbono e nanopartículas, visando o aumento da condutividade e melhoramento de sinais eletroquímicos.
Descrição das figuras
[047] Para melhor compreensão das características da presente invenção que utiliza a rodamina 6G como modificador da superfície transdutora de um eletrodo comercial tipo screen-printed resultados gráficos exemplificadores são apresentados os quais representam uma forma de produção do imunossensor para diagnóstico de micobactérias como hanseníase e tuberculose a título de exemplo da aplicação.
Interação da Rodamina 6G com a superfície dos eletrodos [048] A FIGURA 1 ilustra a varredura de voltametria cíclica (VC) (FIG. 1A) e voltametria de pulso diferencial (VPD) (FIG. 1 B) para três eletrodos diferentes modificados com rodamina 6G (4,5 e 6) e os mesmos eletrodos antes da adsorção deste componente (1 , 2 e 3). Observa- se que nas voltametrias dos eletrodos sem modificação ocorreu uma grande variação, mais de 50uA, na corrente de oxidação da VPD e da VC e nesta o potencial também variou de 0,2 a 0,4V. Enquanto os eletrodos modificados com rodamina 6G além de aumentar significativamente os picos das correntes na VC e na VPD indicando maior passagem de elétrons, as correntes e potenciais desses eletrodos modificados permaneceram bem homogéneas entre as analises voltamétricas entre áreas de eletrodos diferentes. A rodamina 6G tem uma adsorção eficiente no carbono, possivelmente devido a interações de Van der Waals entre o anel de benzeno planar e a superfície do eletrodo. Provando assim que essa modificação foi útil para homogeneizar, padronizar e aumentar a condutividade da superfície transdutora dos eletrodos preparando-os assim para aplicação das amostras.
Investigação da concentração de rodamina 6G
[049] A FIGURA 2 mostra a adsorção de diferentes concentrações de rodamina 6G na superfície dos eletrodos a fim de estudar sua interação para escolha da melhor diluição a ser usada nos próximos testes. A FIG 2A e B apresentam voltamogramas cíclicos e de pulso diferencial para as seguintes diluições de rodamina: (1 ) 50pg, (2) 100pg, (3) 500pg, (4) 1 mg, (5) 5mg, (6) 10mg, (7) 50mg, (8) 100mg. Analisando a VC observamos que conforme aumenta a concentração de rodamina a corrente de oxidação e redução também aumenta, porém, o desenho das curvas voltamétircas são destorcidas e os picos começam a ficar mais espaçados a partir da concentração de 1 mg provavelmente pelo acumulo e saturação da rodamina na superfície dos eletrodos. Na VPD FIG 2B o pico de oxidação decresce com a concentração acima de 500pg novamente comprovando que essa é a concentração limite para modificar de forma eficiente os eletrodos e concentrações acima dessa margem saturam a superfície transdutora dificultando a ligação das sondas e dos alvos. A FIG 2C apresenta uma tabela com os valores das velocidades de varredura dos picos das correntes de oxidação em voltametria cíclica para as diferentes concentrações de rodamina estudadas. Esses valores foram utilizados para formulação da equação de Randles-Sevcik que mede a área ativa e a passagem de elétrons da superfície transdutora, mostrando assim que a modificação dos eletrodos com rodamina aumenta em até 99% da área ativa em relação a eletrodos não modificados.
Deteccão de antíqenos com eletrodos modificados
[050] Para construção do bioeletrodo foi imobilizado o anticorpo específico para antígenos de micobactérium leprae Anti-PGL-1 na superfície dos eletrodos modificados com rodamina 6G e testados o reconhecimento com alguns antígenos miméticos, sintéticos e nativos que reconhecem especificamente essa sonda. Na FIGURA 3A foram realizadas voltametria cíclica para determinação da diferença entre a ligação do anticorpo com o antígeno nativo PGL-1 (curva 1 ), anticorpo com antígeno mimético M3R (curva 5) e anticorpo sem antígeno de reconhecimento (curva 3), a curva 2, eletrodo sem modificação e a curva 4, eletrodo modificado com rodamina mas sem os alvos serviram como linhas base.
[051] A FIG 3B apresenta o gráfico de barras da mesma análise anterior com os valores das correntes dos picos de oxidação da ligação em cada eletrodo no potencial de 0,25V. Analisando os picos de corrente nesse potencial é possível verificar a diferença quando há ligações do anticorpo com os antígenos e quando há ausência de reconhecimento. Na FIGURA 3C foram feitas analises em voltametria de pulso diferencial com o mesmo anticorpo anti-PGL-1 reconhecendo outros antígenos específicos para a comparação. A CURVA 1 representa a ligação do anticorpo com antígeno nativo PGL-1 , na CURVA 2 o anticorpo está sem antígeno de reconhecimento, na CURVA 3 o anticorpo está reconhecendo o antígeno LAM de M. leprae, na CURVA 4 a ligação é com antígeno PGL-1 sintético, na CURVA 5 com antígeno mimético de PGL-1 , o M3R e na CURVA 6 o anticorpo reconheceu outro antígeno mimético, MPML14. Na FIGURA 3C as mesmas ligações foram analisadas pelo gráfico de barras. [052] Podemos concluir com essas análises que cada tipo de antígeno possui um reconhecimento específico e que todas as curvas diferem da curva sem o alvo de reconhecimento, mostrando a especificidade do bioeletrodo construído.
Investigação da limpeza e reutilização do bioeletrodo
[053] A FIGURA 4 mostra a limpeza e reutilização do bioeletrodo modificado com rodamina 6G mesmo após a adsorção do anticorpo e dos antígenos. Na FIG. 4A temos os voltamogramas cíclicos dos eletrodos modificados imobilizados com o anticorpo Anti-PGL-1 com antígeno PGL-1 nativo (curva 1 ), sem antígeno de reconhecimento (curva 2) e com antígeno mimético M3R (curva 3). Após essas leituras e diferenciação das curvas, os eletrodos foram lavados com álcool e reutilizados para novas adsorções. Na FIG. 4B os eletrodos que foram lavados e voltaram a sua linha base original foram modificados novamente com rodamina 6G, nota-se que as curvas que eram diferentes na figura anterior devido as imobilizações ficaram homogéneas comprovando a limpeza do eletrodo com álcool e homogeneidade da superfície com a deposição da rodamina. Os eletrodos modificados pela segunda vez foram então imobilizados com o mesmo anticorpo, mas a ordem de adsorção dos antígenos foi modificada. No eletrodo que não havia sido imobilizado com antígeno, no segundo teste foi imobilizado com antígeno PGL-1 nativo (FIG. 4C curva 1 ), o que havia sido imobilizado com antígeno M3R, na segunda leitura não foi adicionado antígeno (FIG. 4C curva 2) e o eletrodo que fora adsorvido antígeno PGL-1 nativo na primeira modificação, foi adicionado o antígeno M3R na segunda imobilização. Mesmo depois de lavado e realizadas imobilizações em eletrodos diferentes, o bioeletrodo manteve a capacidade de diferenciação dos antígenos com os picos de oxidação e redução se mantendo bem próximos dos eletrodos modificados e imobilizados pela primeira vez. Esse estudo demonstrou que eletrodos modificados com rodamina 6G possuem a capacidade de serem limpos e reutilizados mesmo após a adsorção de sondas e alvos, já que estas se ligam no composto químico adsorvido anteriormente e não diretamente na superfície do eletrodo e quando o bioeletrodo modificado é lavado com algum solvente orgânico, o álcool no caso desse teste, consegue desfazer as ligações do anel de benzeno entre a rodamina e o carbono da superfície do eletrodo lavando junto todo material biológico que havia sido depositado sobre a rodamina.
Protótipo para diferenciação entre amostras clínicas
[054] Na FIGURA 5 foram utilizadas amostras clínicas de raspado dérmico de pacientes e contatos suspeitos de hanseníase. Estes foram imobilizados da mesma forma em eletrodos de carbono modificados com rodamina 6G e anticorpo anti-PGL-1 . As CURVAS 1 referem-se à imobilização com raspado dérmico positivo e as CURVAS 2 com raspado dérmico negativo. Observa-se que as curvas das amostras positivas têm o pico da corrente de oxidação e redução menores do que as amostras negativas, isso porque quando há ligação anticorpo-antígeno dificulta a passagem de elétrons na superfície do eletrodo, e quando não há ligação específica a transferência de elétrons é maior. Na FIG. 5A o teste foi realizado em voltametria cíclica com V= 200 mV.s-1 e apresentou diferenciação entre a corrente dos picos de oxidação da amostra positiva e negativa de 88mA. Já na FIG. 5B a velocidade de varredura foi aumentada para 500 mV.s-1 e a diferenciação entre as amostras também aumentou para 141 mA nos picos de oxidação. Na FIG 5C as curvas de varredura foram analisadas em voltametria de pulso diferencial e a diferença entre as correntes de oxidação das amostras positiva e negativa foram ainda mais significativas (306mA).
Estudo com outras micobactérias
[055] A FIGURA 6 apresenta voltametrias cíclicas (A e B) e voltametria de pulso diferencial (C) com o antígeno específico para tuberculose Anti-LAM imobilizado no eletrodo modificado da mesma forma dos testes anteriores. Nas CURVAS 1 os eletrodos foram incubados com cultura de TB (amostras positivas) enquanto as CURVAS 2 não contém nenhum alvo (controle negativo). Observa-se uma diferença significativa entre os picos das correntes de oxidação das amostras positivas e negativas, 74mA na FIG. 6A, 139mA na FIG. 6B e 262mA na FIG. 6C. Os resultados foram similares aos da FIGURA 5 com as amostras clínicas de raspado dérmico devido à mesma forma de reconhecimento do anticorpo específico e o antígeno com a rodamina 6G imobilizada nos bioeletrodos, confirmando assim que essa forma de modificação é útil no diagnóstico de outras doenças e/ou reconhecimento de diversas biomoléculas.
Descrição da invenção
Preparo do bioeletrodo
[056] O eletrodo utilizado foi do tipo screen-printed de grafite, consiste em um eletrodo de trabalho (4 mm de diâmetro), contra eletrodo e eletrodo de referência. (Ref. DRP 1 10).
[057] Na superfície do eletrodo de trabalho foram aplicados 2mI_ a 4 mI_ de rodamina 6G espalhado por toda área (testado em diferentes concentrações), a adsorção física foi feita entre 10 a 20 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, o eletrodo foi conectado ao receptor do potenciostato PalmSens 3, (Compact Electrochemical Interfaces) e a eletrodeposição foi realizada em três medições consecutivas em voltametria cíclica (V= 10 a 200 mV.s-1 ) utilizando 50 a 120 mI_ de ferroferricianeto de potássio 1 mM a 5mM / Kcl 0,1 M como eletrólito suporte. Após essa etapa o eletrodo foi lavado com 100 mI_ de água destilada e em seguida secado em temperatura ambiente.
[058] Elétrodos sem modificação também foram medidos nas mesmas condições anteriores para determinar a diferença entre eles.
Concentrações de rodamina 6G
[059] Para definir qual a melhor concentração de rodamina a ser utilizada no preparo do eletrodo foram testadas variações de 100ug a 100mg de corante diluídos em água ultrapura. Foram realizadas voltametria cíclica e voltametria de pulso diferencial com diferentes velocidades de varredura para determinação da área ativa do eletrodo através da equação de Randles-Sevcik. Os testes de reconhecimento biológico do anticorpo também foram realizados em todas as concentrações.
Deteccão de antíqenos na superfície do eletrodo modificado
[060] Para a formulação da linha base medições de voltametria de pulso diferencial e voltametria cíclica em diferentes velocidades de varredura no eletrodo screen-printed modificado e sem modificação conectados a um potenciostato PalmSens 3, (Compact Electrochemical Interfaces) foram obtidas, utilizando 50 a 120 pl_ de ferroferricianeto de potássio de 1 mM a 5mM / Kcl 0,1 M como eletrólito suporte.
[061 ] Em eletrodos modificados com rodamina 6G foram aplicados na superfície de trabalho 2 a 10 pL do anticorpo específico de M. leprae (anti-PGL-1 ) ou específico de M. tuberculosis (anti-LAM de TB) ou outro anticorpo específicos de micobacterias e incubados a temperatura entre 25 a 37° durante 5 a 50 minutos. Posteriormente foram incubados com 2 a 10 pL de antígeno específico aos anticorpos nativo ou sintéticos por mais 5 a 50 min de 25 a 37° e lavados com água destilada. As leituras foram realizadas por voltametria de pulso diferencial e voltametria cíclica em potenciostato portátil utilizando o ferroferricianeto de potássio como eletrólito suporte.
Limpeza e reutilização de eletrodos
[062] Foi investigada uma técnica para limpeza dos eletrodos usados e modificados com a rodamina, sabendo que ela é muito solúvel em solventes orgânicos, utilizou-se o álcool etílico que é capaz de desfazer as ligações desse corante com o carbono da superfície dos eletrodos. Os eletrodos usados após a adsorção das sondas e alvos foram imersos em álcool por 5 a 30 min e posteriormente lavados com água destilada e secados a temperatura ambiente. A rodamina 6G foi novamente eletrodepositada nesses eletrodos preparando-os para reuso.
Deteccão em amostras clinicas
[063] Foram usados raspados dérmicos de pacientes e contatos suspeitos de hanseníase. A técnica tipo slit skin parte do princípio da coleta de amostras contaminadas de lobo de orelha, cotovelos, joelhos e a de lesão ativa se estiver presente que são armazenadas em tampão fosfato. Os raspados foram previamente quantificados por PCR em tempo real e suas concentrações já eram conhecidas assim como amostras classificadas como negativas que foram usadas como controle. [064] O anticorpo específico de M. leprae (anti-PGL-1 ) foram acoplados a nanopartículas magnéticas COFe2C>4 com tratamentos para a bioconjugação. Após este processo as amostras de raspado positivos e negativos foram incubadas ao anticorpo conjugado por 30 min a 2 horas em 37 a 45°C. O conjugado antígeno-anticorpo foi lavado com PBS1X em estante magnética e a parte presa ao magneto foi ressuspendida e aplicada 2 a 20 pl_ na superfície da área de trabalho do eletrodo modificado com rodamina 6G e incubados a temperatura entre 25 a 37° durante 5 a 50 minutos. As analises foram feitas por medições de voltametria de pulso diferencial e voltametria cíclica em diferentes velocidades de varredura no eletrodo em potenciostato portátil e 50 a 120 pl_ de ferroferricianeto de potássio de 1 mM a 5mM / Kcl 0,1 M foi utilizado como eletrólito suporte.
Deteccão de outras micobactérias
[065] Foi realizado teste com os eletrodos modificados com rodamina 6G para detectar outro tipo de micobactéria, o M. tuberculosis. Para isso foi utilizado o anticorpo específico desse patógeno Anti-LAM de tuberculosis que foi imobilizado da mesma forma dos testes anteriores, e para o reconhecimento específico foi adsorvido posteriormente uma amostra de cultura de tuberculose em meio TLN (amostra positiva) e como controle negativo foi adsorvido somente o meio TLN sem nenhum tipo de patógeno e incubados a temperatura entre 25 a 37° durante 5 a 50 minutos. As analises foram feitas por medições de voltametria de pulso diferencial e voltametria cíclica em diferentes velocidades de varredura no eletrodo em potenciostato portátil e 50 a 120 pL de ferroferricianeto de potássio de 1 mM a 5mM / Kcl 0,1 M foi utilizado como eletrólito suporte.
Proposta para uso em campo
[066] kits liofilizados contendo anti-PGL1/anti-LAM ou outros anticorpos específicos para micobactérias acoplados ou não a nanopartículas magnéticas serão disponibilizados para posterior aglutinação com diversos tipos de amostras biológicas a serem testadas em campo que serão aplicadas em eletrodos já preparados com rodamina 6G o que facilita e agiliza o processo de diagnóstico in house.
Conclusões
[067] A presente invenção mostra que a rodamina 6G funcionou como um versátil modificador da superfície transdutora de eletrodos comerciais do tipo screen-printed, ela foi capaz de estabilizar e funcionalizar a área de trabalho, isso, porque adsorve facilmente em carbono grafite através do anel de benzeno, e também liga-se as proteínas, e outras moléculas biológicas por meio de ligações de hidrogénio, e sua ligação se desfaz facilmente quando lavado com álcool etílico tornando o biossensor reutilizável. O Imunossensor com superfície modificada promoveu a detecção de antígenos quando usados anticorpos específicos como alvo e diferenciou amostras de raspado dérmico de pacientes com hanseníase dos contatos sem a doença. Apresentou vantagens inerentes à sua rapidez no diagnóstico destas patogenias, aplicabilidade, especificidade, sensibilidade, estabilidade, seletividade e baixo custo. Exemplificando assim que este tipo de sensor pode ser utilizado na detecção de biomoléculas que possuam proteínas ou seus fragmentos biológicos ou sintéticos, antígenos, anticorpos, peptídeos, enzimas DNA, RNA e aptâmeros, como analitos ou como elemento de reconhecimento biológico.
[068] No processo de modificação da superfície de eletrodos para a construção de biossensores pode-se utilizar eletrodo de trabalho de grafite ( screen-printed DRP 1 10) ou outros eletrodos de trabalho preferencialmente de material condutor, apresentando inércia eletroquímica na faixa de -0,4V e +1 ,4V (versus Ag/AgCI ou Ag), tal como carbono vítreo, pasta de carbono, diamante, ouro, platina, podendo ser de combinação de materiais nanotecnológicos como filmes poliméricos, grafeno, nanotubos de carbono e nanopartículas na superfície dos eletrodos assim como nas sondas usadas para reconhecimento.
[069] A rodamina 6G foi utilizada em concentrações que variam de 100pg a 100mg diluídas em solvente orgânico, podendo ser adicionados surfactantes, compostos químicos ou materiais nanotecnológicos para melhorar a ligação com a superfície dos eletrodos e com as biomoléculas.
[070] Pode-se utilizar anticorpos específicos e seus respectivos antígenos nativos, miméticos, cultura de bactérias e amostras de raspados de pacientes, não restringindo apenas à utilização para micobactérias e sim para imunossensores de maneira geral utilizando biomoléculas que possuam proteínas ou seus fragmentos biológicos ou sintéticos, antígenos, anticorpos, peptídeos, enzimas DNA, RNA e aptâmeros, como analitos ou como elemento de reconhecimento biológico.
[071] A grande vantagem da presente invenção é tornar o biossensor reutilizável através da lavagem do eletrodo modificado com solvente orgânico em diferentes concentrações.
[072] A modificação dos eletrodos e detecção de materiais biológicos se dá através da análise eletroquímica, acompanhando a variação dos sinais por voltametria de pulso diferencial, voltametria cíclica, voltametria de onda quadrada ou outra técnica eletroquímica apropriada, do pico de oxidação ou redução da ligação de reconhecimento específica entre sonda e alvos.
[073] A modificação da superfície transdutora de eletrodos com rodamina 6g pode ser a responsável pela obtenção de um sensor eletroquímico que será utilizado na detecção de biomoléculas que possuam proteínas ou seus fragmentos biológicos ou sintéticos, antígenos, anticorpos, peptídeos, enzimas DNA, RNA e aptâmeros, como analitos ou como elemento de reconhecimento biológico.

Claims

REIVINDICAÇÕES
1 ) PROCESSO DE MODIFICAÇÃO DA SUPERFÍCIE DE ELETRODOS PARA CONSTRUÇÃO DE BIOSSENSORES ELETROQUÍMICOS
caracterizado por compreender as seguintes etapas:
a) na superfície do eletrodo de trabalho foram aplicados 2mI_ a 4 mI_ de rodamina 6G espalhado por toda área;
b) a adsorção física foi feita entre 10 a 20 minutos à temperatura ambiente; c) em seguida, o eletrodo foi conectado ao receptor do potenciostato PalmSens 3, (Compact Electrochemical Interfaces) e a eletrodeposição foi realizada em três medições consecutivas em voltametria cíclica (V= 10 a 200 mV.s-1 ) utilizando de 50 a 120 mI_ de ferroferricianeto de potássio 1 mM a 5mM / Kcl 0,1 M como eletrólito suporte;
d) após essa etapa o eletrodo foi lavado com 100 mI_ de água destilada e em seguida secado em temperatura ambiente.
2) PROCESSO DE MODIFICAÇÃO DA SUPERFÍCIE DE ELETRODOS PARA CONSTRUÇÃO DE BIOSSENSORES ELETROQUÍMICOS de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado por ser composto por eletrodo de grafite (screen-printed DRP 110) ou outros eletrodos de trabalho preferencialmente de material condutor, apresentando inércia eletroquímica na faixa de -0,4V e +1 ,4V (versus Ag/AgCI ou Ag), tal como carbono vítreo, pasta de carbono, diamante, ouro, platina, podendo ser de combinação de materiais nanotecnológicos como filmes poliméricos, grafeno, nanotubos de carbono e nanopartículas na superfície dos eletrodos assim como nas sondas usadas para reconhecimento.
3) PROCESSO DE MODIFICAÇÃO DA SUPERFÍCIE DE ELETRODOS PARA CONSTRUÇÃO DE BIOSSENSORES ELETROQUÍMICOS de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado por usar a rodamina 6G em concentrações que variam de 100pg a 100mg diluídas em solvente orgânico, podendo ser adicionados surfactantes, compostos químicos ou materiais nanotecnológicos para melhorar a ligação com a superfície dos eletrodos e com as biomoléculas.
4) PROCESSO DE MODIFICAÇÃO DA SUPERFÍCIE DE ELETRODOS PARA CONSTRUÇÃO DE BIOSSENSORES ELETROQUÍMICOS de acordo com a reivindicação 1 , caracterizados por usar anticorpos específicos e seus respectivos antígenos nativos, miméticos, cultura de bactérias e amostras de raspados de pacientes, não restringindo apenas à utilização para micobactérias e sim para imunossensores de maneira geral utilizando biomoléculas que possuam proteínas ou seus fragmentos biológicos ou sintéticos, antígenos, anticorpos, peptídeos, enzimas DNA, RNA e aptâmeros, como analitos ou como elemento de reconhecimento biológico.
5) PROCESSO DE MODIFICAÇÃO DA SUPERFÍCIE DE ELETRODOS PARA CONSTRUÇÃO DE BIOSSENSORES ELETROQUÍMICOS de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado por tornar o biossensor reutilizável através da lavagem do eletrodo modificado com solvente orgânico em diferentes concentrações.
6) PROCESSO DE MODIFICAÇÃO DA SUPERFÍCIE DE ELETRODOS PARA CONSTRUÇÃO DE BIOSSENSORES ELETROQUÍMICOS de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado por ser a modificação de eletrodos e detecção de materiais biológicos através da análise eletroquímica, acompanhando a variação dos sinais por voltametria de pulso diferencial, voltametria cíclica, voltametria de onda quadrada ou outra técnica eletroquímica apropriada, do pico de oxidação ou redução da ligação de reconhecimento específica entre sonda e alvos.
7) PROCESSO DE MODIFICAÇÃO DA SUPERFÍCIE DE ELETRODOS PARA CONSTRUÇÃO DE BIOSSENSORES ELETROQUÍMICOS de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado por ser a modificação da superfície transdutora de eletrodos com rodamina 6g a responsável pela obtenção de um sensor eletroquímico que poderá por ser utilizado na detecção de biomoléculas que possuam proteínas ou seus fragmentos biológicos ou sintéticos, antígenos, anticorpos, peptídeos, enzimas DNA, RNA e aptâmeros, como analitos ou como elemento de reconhecimento biológico.
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