DE60032349T2 - Zellenzuchtverfahren für glycoproteine - Google Patents

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Glykoproteinen in einer Säugerzellkultur. Insbesondere erfolgt durch die Erfindung die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von Glykoproteinen in Säugerzellen, das zu einer erhöhten Belegung einer Stelle einer N-gebundenen Glykosylierung, die nur in einer Fraktion eines Glykoproteins besetzt wird, führt. Ein Verfahren zur Erhöhung der Fraktion von Typ-I-Gewebe-Plasminogenaktivator (t-PA) in einer Säugerzellkultur wird speziell offenbart.
  • Beschreibung verwandter Offenbarungen und Technologie
  • Glykoproteine
  • Glykoproteine, von denen viele durch Verfahren der Gentechnik hergestellt werden, sind von großer Bedeutung als diagnostische und therapeutische Mittel. In einer eukaryotischen Zellumgebung wird eine Glykosylierung an einem sezernierten oder membrandurchspannenden Protein durch co- und posttranslationale Modifikation angebracht. Für die Zelloberfläche bestimmte Proteine werden zunächst cotranslational in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums (ER) transloziert, was durch eine Signalsequenz am oder nahe dem Aminoterminus der entstehenden Kette vermittelt wird. Im Inneren des ER wird die Signalsequenz üblicherweise entfernt und eine Oligosaccharideinheit mit einem mannosereichen Kern an dem Aspargin(N)-Rest bzw. den Asparginresten, die als Teil der Sequenz Asn-X-Ser/Thr, worin X für eine beliebige Aminosäure mit Ausnahme von vielleicht Prolin steht, vorhanden sind, angebracht.
  • Die Effizienz dieser cotranslationalen Glykosylierungsstufe hängt von der Präsentation einer geeigneten Konformation der Peptidkette, wenn sie in das endoplasmatische Retikulum eintritt, ab (Imperiali und O' Connor, Pure & Applied Chem., 70, 33–40 (1998)). Potentielle Stellen einer N-gebundenen Glykosylierung können, nachdem das Protein gefaltet ist, nicht länger zugänglich sein (Kornfeld & Kornfeld, Ann. Rev. Biochem. 54: 631–664 (1985)). Die Proteine bewegen sich als nächstes vom ER zum Golgi-Apparat, wo weitere Modifikationen, beispielsweise eine Sulfatierung und Verarbeitung der mannosereichen Oligosaccharidkette zu einem Oligosaccharid des Komplextyps, erfolgen und die Proteine zu ihren passenden Bestimmungsorten geleitet werden.
  • N-gebundene Oligosaccharide können eine tiefe Auswirkung auf die pharmazeutischen Eigenschaften von Glykoproteintherapeutika (beispielsweise die in-vivo-Halbwertszeit und biologische Aktivität) aufweisen. Es wurde gezeigt, dass verschiedene Bioprozessparameter (beispielsweise Bioreaktortyp, pH-Wert, Mediumzusammensetzung und Ammoniak) die Proteinglykosylierung signifikant beeinflussen. Änderungen der terminalen Glykosylierung (Sialylierung und Galactosylierung) und N-Glycanverzweigung sind die am häufigsten beobachteten Änderungen.
  • Die Kohlehydratstruktur von Gewebe-Plasminogenaktivator
  • Gewebe-Plasminogenaktivator (t-PA), ein Glykoprotein, ist eine Mehrdomänen-Serinprotease, deren physiologische Rolle die Umwandlung von Plasminogen in Plasmin und daher das Initiieren oder Beschleunigen des Prozesses der Fibrinolyse ist. Das erste klinische Interesse an t-PA entstand wegen dessen relativ hohen Aktivität in Gegenwart von Fibrin im Vergleich zur Abwesenheit von Fibrin. t-PA des Wildtyps ist in Abwesenheit von Fibrin ein schlechtes Enzym, doch verstärkt das Vorhandensein von Fibrin dessen Fähigkeit zur Aktivierung von Plasminogen überraschend stark. Rekombinanter humaner t-PA wird therapeutisch als Fibrinolytikum bei der Behandlung eines akuten Myokardinfarkts und von Lungenembolie verwendet, wobei beide Zustände von einer Verstopfung eines Blutgefäßes durch einen fibrinhaltigen Thrombus herrühren.
  • Zusätzlich zu dessen überraschender Fibrinspezifität zeigt t-PA mehrere weitere unterscheidende Eigenschaften:
    • (a) t-PA unterscheidet sich von den meisten Serinproteasen darin, dass die Einzelkettenform des Moleküls merkliche enzymatische Aktivität aufweist. Gegenüber einigen kleinen Substraten und gegenüber Plasminogen in Abwesenheit von Fibrin hat zweikettiges t-PA größere Aktivität als einkettiges t-PA. In Gegenwart von Fibrin sind jedoch die zwei Formen von t-PA gleich aktiv (Rijken et al., J. Biol. Chem., 257: 2920–2925 (1982); Lijnen et al., Thromb. Haemost., 64: 61–68 (1990); Bennett et al., J. Biol. Chem., 266: 5191–5201 (1991)). Die meisten anderen Serinproteasen existieren als Zymogene und benötigen eine proteolytische Spaltung zu einer zweikettigen Form, um die volle enzymatische Aktivität freizusetzen.
    • (b) Die Wirkung von t-PA in vivo und in vitro kann durch ein Serpin, PAI-I, gehemmt werden (Vaughan et al., J. Clin. Invest., 84, 586–591 (1989); Wiman et al., J. Biol. Chem., 259: 3644–3647 (1984)).
    • (c) t-PA bindet in vitro an Fibrin mit einem Kd-Wert im μM-Bereich.
    • (d) t-PA zeigt eine rasche in-vivo-Clearance, die durch einen oder mehrere Rezeptoren in der Leber vermittelt wird (Nilsson et al., Thromb. Res., 39: 511–521 (1985); Bugelski et al., Thromb. Res., 53: 287–303 (1989); Morton et al., J. Biol. Chem., 264: 7228–7235 (1989)).
  • Eine im Wesentlichen reine Form von t-PA wurde von Collen et al., US-Patent 4 752 603, erteilt am 21. Juni 1988, zum ersten Mal aus einer natürlichen Quelle produziert und auf in-vivo-Aktivität getestet (siehe auch Rijken et al., J. Biol. Chem., 256: 7035 (1981)). Pennica et al. (Nature, 301: 214 (1983)) bestimmte die DNA-Sequenz von t-PA und er leitete die Aminosäuresequenz von dieser DNA-Sequenz ab (US-Patent 4 766 075, erteilt am 23. August 1988).
  • Humaner t-PA des Wildtyps weist potentielle Stellen der N-gebundenen Glykosylierung an den Aminosäurepositionen 117, 184, 218 und 448 auf. Es wurde berichtet, dass durch Expression in CHO-Zellen produzierter rekombinanter humaner t-PA (ACTIVASE® t-PA) etwa 7 Gew.-% Kohlehydrat enthält, das aus mannosereichem Oligosaccharid an Position 117 und komplexen Oligosacchariden an Asn-184 und Asn-448 besteht (Vehar et al. "Characterization Studies of Human Tissue Plasminogen Activator produced by Recombinant DNA Technology," Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, LI: 551–562 (1986)).
  • Es wurde ermittelt, dass die Position 218 in nativem t-PA oder rekombinantem Wildtyp-t-PA nicht glykosyliert ist. Die Stellen 117 und 448 scheinen immer glykosyliert zu sein, während angenommen wird, dass die Zelle 184 nur in einer Fraktion der Moleküle glykosyliert ist. Die t-PA-Moleküle, die an der Position 184 glykosyliert sind, werden als Typ-I-t-PA bezeichnet und die Moleküle, die an Position 184 nicht glykosyliert sind, werden als Typ-II-t-PA bezeichnet. In von einem Melanom stammendem t-PA beträgt das Verhältnis von Typ-I- zu Typ-II-t-PA etwa 1:1. Die einen sehr guten Überblick ergebende Analyse der Kohlehydratstrukturen von von CHO-Zellen abgeleitetem humanem t-PA wurde von Spellman et al., J. Biol. Chem., 264: 14100–14111 (1989) durchgeführt, der zeigte, dass mindestens 17 verschiedene Asn-gebundene Kohlehydratstrukturen an dem Protein detektiert werden konnten. Diese reichten von den mannosereichen Strukturen an Po sition 117 zu Zwei-, Drei-, und Vierantennen-N-Acetyllactosamin-Typ-Strukturen an denen Positionen 184 und 448. Es wurde berichtet, dass Typ-I- und Typ-II-t-PAs in identischer Weise an den Positionen Asn 117 und Asn 448 N-glykosyliert waren, wenn sie aus der gleichen Zelllinie isoliert wurden. Für weitere Einzelheiten siehe auch Parekh et al., Biochemistry, 28: 7644–7662 (1989). Es wurde gezeigt, dass die spezifische fibrinolytische Aktivität von Typ-II-t-PA etwa 50% größer als die vom Typ-I-t-PA ist (Einarsson et al., Biochim. Biophys. Acta, 830: 1–10 (1985)). Ferner ist erhöhter Typ I mit erhöhter Halbwertszeit korreliert (Cole et al., Fibrinolysis, 7: 15–22 (1993)). Jedoch zeigte Typ-II-t-PA, dem ein mit Typ-I-t-PA verbundener Kohlehydratteil fehlt, sowie desialylierter t-PA längeres T1/2-Beta als Standard t-PA (Beebe und Aronson, Thromb. Res., 51: 11–22 (1988)).
  • Die Analyse der Sequenz von t-PA ergab, dass das Molekül fünf Domänen aufweist. Jede Domäne wurde unter Bezug auf homologe strukturelle oder funktionale Regionen in anderen Proteinen, wie Trypsin, Chymotrypsin, Plasminogen, Prothrombin, Fibronectin und epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), definiert. Diese Domänen wurden, ausgehend vom N-Terminus der Aminosäuresequenz von t-PA, als Finger(F)-Domäne von Aminosäure 1 bis etwa Aminosäure 44, Wachstumsfaktor(G)-Domäne von etwa Aminosäure 45 bis etwa Aminosäure 91 (auf der Basis der Homologie mit EGF), Kringle-1(K1)-Domäne von etwa Aminosäure 92 bis etwa Aminosäure 173, Kringle-2(K2)-Domäne von etwa Aminosäure 180 bis etwa Aminosäure 261 und Serinprotease(P)-Domäne von etwa Aminosäure 264 bis zum Carboxylterminus bei Aminosäure 527 bezeichnet. Diese Domänen befinden sich im Wesentlichen angrenzend zueinander und sie sind durch kurze "Linker"-Regionen verbunden. Diese Linkerregionen bringen die Gesamtzahl der Aminosäuren des reifen Polypeptids auf 527, obwohl drei zusätzliche Reste (Gly-Ala-Arg) fallweise am Aminoterminus gefunden werden. Es wird allgemein angenommen, dass dieses zusätzliche Tripeptid das Er gebnis einer unvollständigen Vorläuferprozessierung ist, und es ist nicht bekannt, dass es eine Funktionalität verleiht. Nativer t-PA kann zwischen Position 275 und Position 276 (die in der Serinproteasedomäne gelegen sind) gespalten werden, wobei die zweikettige Form des Moleküls erzeugt wird.
  • Jede Domäne trägt auf unterschiedliche Weise zu den gesamten biologisch signifikanten Eigenschaften des t-PA-Moleküls bei. Domänendeletionsuntersuchungen zeigen, dass der Verlust der Finger-, Wachstumsfaktor- oder Kringle-2-Domäne zu einer Bindung des varianten t-PA an Fibrin mit geringerer Affinität führt (van Zonneveld et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 4670–4677 (1986); Verheijen et al., EMBO J., 5: 3525–3530 (1986)); jedoch zeigen jüngere Ergebnisse, die mit Substitutionsmutanten erhalten wurden, dass die Kringle-2-Domäne weniger an der Fibrinbindung beteiligt ist, als früher erwartet wurde (Bennett et al., aaO). Die Domänendeletionsuntersuchungen ergaben eine Beteiligung der Finger- und Wachstumsfaktordomänen an der Clearance durch die Leber (Collen et al., Blood, 71: 216–219 (1988); Kalyan et al., J. Biol. Chem., 263: 3971–3978 (1988); Fu et al., Thromb. Res., 50: 33–41 (1988); Refino et al., Fibrinolysis, 2: 30 (1988); Larsen et al., Blood, 73: 1842–1850 (1989); Browne et al., J. Biol. Chem., 263: 1599–1602 (1988)). Die Kringle-2-Domäne ist für die Bindung an Lysin verantwortlich. Die Serinproteasedomäne ist für die enzymatische Aktivität von t-PA verantwortlich und sie enthält spezielle Regionen, für die gezeigt wurde, dass Mutationen sowohl Fibrinbindung als Fibrinspezifität beeinflussen (möglicherweise Interaktionen mit Fibrin leiten), und andere Regionen, worin nur die Fibrinspezifität geändert wird (möglicherweise indirekte Interaktionen mit Fibrin) (Bennett et al., aaO). Untersuchungen mit Mutanten infolge von positionsspezifischen Änderungen zeigen die Beteiligung der Glykosylierung von t-PA an der Clearance (Lau et al., Bio Technology, 5: 953–958 (1987); Lau et al., Bio Technology, 6: 734 (1988)).
  • Es wurde beschrieben, dass eine unglykosylierte Variante von t-PA, die aus den Kringle-2- und Proteasedomänen besteht, eine langsamere Plasmaclearance als Wildtyp-t-PA aufweist (Martin et al., Fibrinolysis, 4: (Suppl. 3): 9 (Abstract 26) (1990)). Die Wirkung einer Änderung von Oligosaccharidstrukturen an den Positionen 184 und 448 von t-PA wurde auch von Howard et al., Glycobiology, 1: 411–418 (1991), untersucht. Hotchkiss et al. (Thromb. Haemost., 60: 255–261 (1988)) entfernten selektiv Oligosaccharidreste von dem t-PA-Molekül und sie zeigten, dass das Entfernen von diesen Resten die Clearancerate von t-PA verringerte. Diese Forscher und Lau et al. ((1987), aaO, (1988), aaO) erzeugten ferner die t-PA-Variante N117Q (worin Aspargin an Position 117 des humanen Wildtyp-t-PA durch Glutamin ersetzt war) zur Verhinderung einer Glykosylierung an Position 117. Diese Variante zeigte ähnlich der durch enzymatische Entfernung des mannosereichen Oligosaccharids an dieser Position erhaltenen eine etwa zweifach langsamere Clearancerate als humaner Wildtyp-t-PA. Siehe auch EP-A-238 304, veröffentlicht am 23. September 1987, und EP-A-227 462, veröffentlicht am 1. Juli 1987.
  • Mehrere Berichte legen nahe, dass die Kohlehydrateinheiten von t-PA die in-vitro-Aktivität dieses Enzyms beeinflussen (Einarsson et al., aaO; Opdenakker et al., Proc. Sci., Exp. Biol. Med., 182: 248–257 (1986)). t-PA wird durch Mannoserezeptoren von Leberendothelzellen und durch Galactoserezeptoren von Parenchymzellen endocytosiert. Tatsächlich wurde die in-vivo-Clearance von rekombinantem humanem t-PA, der in Säugerzellkulturen produziert wurde, durch Kohlehydratstrukturen, insbesondere die mannosereichen Oligosaccharide beeinflusst (Hotchkiss et al., aaO). Es wurde gezeigt, dass eine t-PA-Variante (der Bezeichnung TNK-t-PA), die eine an der Aminosäureposition 103 hinzugefügte Glykosylierungsstelle aufweist, die native Glykosylierungsstelle an Aminosäureposition 117 entfernt hat und die Sequenz an den Aminosäurepositionen 296–299 von nativem humanem t-PA durch AAAA er setzt hat, eine erhöhte Halbwertszeit im Kreislauf und eine deutlich bessere Fibrinspezifität als humaner Wildtyp-t-PA aufweist (Keyt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 3670–3674 (1994)).
  • Andere Glykoproteine als nativer t-PA mit mehr als einer Glykoform
  • Zellen, die t-PA-6, ein Molekül, das aus den Kringle-2- und Serinproteasedomänen von t-PA besteht, exprimieren, prozessieren diesen zu zwei Glykoformen, eine monoglykosylierte Form mit besetztem Asn-448 und eine diglykosylierte Form mit besetztem Asn-448 und Asn-184 (Berg et al., Blood, 81: 1312–1322 (1993)).
  • Plasminogen existiert in zwei Glykoformen. Die stärker glykosylierte Form, die üblicherweise als "Plaminogen-1", "Plasminogen I" oder "Typ-1-Plasminogen" bezeichnet wird, weist ein Oligosaccharid auf Galactosaminbasis, das an Aminosäureposition 345 (Thr345) gebunden ist, und ein komplexes Oligosaccharid auf Glykosaminbasis, das an Aminosäureposition 288 (Asn288) eines nativen humanen Plasminogenmoleküls gebunden ist, auf. Die weniger glykosylierte Form, die üblicherweise als "Plasminogen-2", "Plasminogen II" oder "Typ-2-Plasminogen" bezeichnet wird, weist eine einzige Oligosaccharidkette auf, die an der Aminosäureposition 345 (Thr345) gebunden ist (Hayes und Castellino, J. Biol. Chem., 254(18): 8772–8776, 8777–8780 (1979); Lijnen et al., Eur. J. Biochem., 120: 149–154 (1981); Takeda et al., Thrombosis Research, 39: 289–296 (1985)).
  • Andere Glykoproteine, die eine variable Stellenbelegung (Variationen der N- und O-Glykosylierungsstellenbelegung) zeigen, umfassen den Granuolcyte-Macrophage-Colony-Stimulating-Factor (Okamoto et al., Archives of Biochemistry and Biophysics, 286: 562–568 (1991)), Interferon-Gamma (Curling et al., Biochem J., 272: 333–337 (1990)), Protein C (Miletich und Broze, J. Biol. Chem., 265: 11397–11404 (1990)) und Interleukin-2. Die Glykosylierung von Gamma-Interferon war stabil über eine optimierte Kulturdesignstrategie unter Verwendung von Zufuhrchargenkulturen, wobei das Einwirken einer Glucoseverknappung möglicherweise zu einer dramatischen Änderung der Glykosylierungseffizienz führt (Xie et al., Biotechnol. Bioeng., 56: 577–582 (1997)).
  • Es wurden verschiedene Faktoren diskutiert, die möglicherweise für eine variable Positionenbelegung verantwortlich sind, wobei diese die Verfügbarkeit von Dolicholphosphat und Nucleotidzuckern (Nyberg et al., Biotechnol. Bioeng., 62: 336–347 (1998)), Glykosiltransferaseaktivität (Hendrickson und Imperiali, Biochemistry, 34: 9444–9450 (1995); Kaufman et al., Biochemistry, 33: 9813–9819 (1994)) und variable Zugänglichkeit der Glykosylierungsposition aufgrund von Konkurrenz mit Proteinfaltung (Holst et al., The EMBO J., 15: 3538–3546 (1996); Imperiali, Acc. Chem. Res., 30: 452–459 (1997); Shelikoff et al., Biotechnol. Bioeng., 50: 73–90 (1996)) umfassen. Jeder dieser Faktoren kann durch Zellkulturbedingungen beeinflusst werden. Die t-PA-Positionenbesetzung variiert üblicherweise in einem ziemlich engen Bereich (±5%).
  • Untersuchungen von Metallkationen von Oligosaccharyltransferase bei der Glykosylierung
  • Eine aspargingebundene Glykosylierung umfasst die enzymkatalysierte Modifikation einer Asparginseitenkette in einem entstehenden Polypeptid mit einer Dreiantennen-Tetradecasaccharideinheit. Diese als erstes durchgeführte Stufe in der Biosynthese von N-gebundenen Glykoproteinen wird durch eine Oligosaccharyltransferase, einen heteromeren membrangebundenen Enzymkomplex, der im Lumen des endoplasmatischen Retikulums eukaryotischer Zellen gefunden wird, katalysiert. Siehe Imperiali, aaO; Allen et al., J. Biol. Chem., 270: 4797–4804 (1995); Sharma et al., Eur. J. Bio chem., 116: 101–108 (1981); Silberstein und Gilmore, The FASFB Journal, 10: 849–858 (1996); Kumar et al., Biochem. Mol. Biol. Intl., 36: 817–826 (1995); Bause et al., Biochem. J., 312: 979–985 (1995); Xu und Coward, Biochemistry, 36: 14683–14689 (1997); Kumar et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 247: 524–529 (1998); Watt et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7: 652–660 (1997).
  • Zur optimalen Aktivität benötigt Oligosaccharyltransferase eine kleine Menge zweiwertiger Manganionen, doch unterstützen andere zweiwertige Metallkationen mit einer oktaedrischen Koordinationsgeometrie die Übertragung, wenn auch mit verringerten Raten (Hendrickson und Imperiali, aaO; Kaufman et al., aaO; Kumar et al., Biochem. & Mol. Biol. International 36: 817–826 (1995)).
  • Die Rolle der Temperatur in Säugerzellkulturen
  • Zur Simulierung einer normalen Körperumgebung wird die Fermentertemperatur bei der Kultivierung von Säugerzellen fast ausschließlich bei 37°C kontrolliert. Dieses Dogma ist so breit akzeptiert, dass bisher wenig Aufmerksamkeit einer variierenden Temperatur in dem Zellkulturverfahren geschenkt wurde. Die spärlichen Literaturdaten legen nahe, dass verringerte Fermentertemperatur zu einer verbesserten Lebensfähigkeit und Scherbeständigkeit von Zellen, einer höheren Zelldichte und einem höheren Titer in Chargenkulturen und einer Verringerung der Glucose/Lactat-Metabolisierung führt (Chuppa et al., Biotechnol. Bioeng., 55: 328–338 (1997)).
  • Speziell untersuchten Reuveny et al., J. Immunol. Methods, 86: 53–59 (1986), die Wirkung von Temperaturen im Bereich von 28 bis 37°C auf diskontinuierliche Hybridomzellkulturen. Sie ermittelten, dass bei niedrigeren Temperaturen zwar die Lebensfähigkeit der Zellen verbessert war, dies jedoch von einer Abnahme der Glucoseaufnahme und einer Abnahme der spezifischen Antikörperproduktion begleitet war. Daher er höhten niedrigere Temperaturen in diesem speziellen Fall die Gesamtleistung des Zellkulturverfahrens nicht.
  • Sureshkuman und Mutharasan, Biotechnol. Bioeng. 37: 292–295 (1991) untersuchten die Wirkung des Temperaturbereichs von 29°C bis 42°C auf das Zellkulturverfahren und sie ermittelten, dass eine maximale Zelldichte bei 33°C erreicht wurde. Im Gegensatz dazu waren die Glucoseaufnahme und die spezifischen Lactatproduktionsraten bei 33°C gegenüber 39°C dramatisch niedriger. Diese Ergebnisse zeigten, dass die optimalen Temperaturen für Wachstum und Produktivität beträchtlich differieren können. Zwar scheint die Zunahme der Lebensfähigkeit bei Temperaturen unter 37°C ein generelles Phänomen zu sein, doch wurde gezeigt, dass die Wirkung der Temperatur auf die spezifische Produktivität zelllinienabhängig ist (Chuppa et al., aaO).
  • Weidemann et al., Cytotechnology, 15: 111–116 (1994) kultivierten adhärente rekombinante Babyhamsternieren(BHK)zellen bei Temperaturen zwischen 30°C und 37°C. Die Kultivierung bei niederen Temperaturen im diskontinuierlichen und wiederholten diskontinuierlichen Modus in einem 2-l-Bioreaktor zeigte eine geringere Wachstumsrate und eine geringere Glucoseverbrauchsrate (d. h. eine geringere Lactatproduktion). Andererseits wurden die maximale Zelldichte und Produktivität durch die Temperaturverringerung nicht beeinflusst.
  • Kretzmer et al., "Cultivation Temperature – Effect on Cell Culture Processes and Their Optimization" (American Chemical Society Meeting, San Francisco, CA), Abstract 138, präsentiert am 16. April 1997, offenbarte die Wirkung der Kultivierungstemperatur auf Zellkulturverfahren und deren Optimierung, jedoch scheinbar keine spezifische Glykosylierungsanalyse.
  • Es wurde vorgeschlagen, dass verringerte Fermentertemperaturen andere Vorteile in Bezug auf die Produktqualität und -integrität haben könnten; doch wurde die Wirkung niedriger Temperaturen auf die Qualität und insbesondere die Proteinglykosylierung kaum untersucht. Chuppa et al., aaO, berichteten, dass die Fermentationstemperatur keine signifikante Wirkung auf den Sialinsäuregehalt von Glykoproteinen hat. Obwohl der Gesamtzuckergehalt bei 37°C gegenüber bei 34°C oder 35,5°C etwas niedriger war, betrachteten die Autoren diesen Unterschied als "nicht wesentlich".
  • Jedoch beschrieb das US-Patent 5 705 364 die Herstellung von Glykoproteinen durch eine Säugerzellkultur, wobei der Sialinsäuregehalt des produzierten Glykoproteins über einen breiten Wertebereich durch Manipulation der Zellkulturumgebung einschließlich der Temperatur gesteuert wurde. Die Wirtszellkultur wurde in einer Produktionsphase der Kultur durch Zugabe einer Alkansäure oder eines Salzes derselben zu der Kultur in einem bestimmten Konzentrationsbereich unter Halten der Osmolalität der Kultur bei etwa 250 bis etwa 600 mOsm und Halten der Temperatur der Kultur zwischen etwa 30 und 35°C kultiviert.
  • Bahr-Davidson, "Factors Affecting Glycosylation Site Occupancy of ASN-184 of Tissue-Type Plasminogen Activator Produced in Chinese Hamster Ovary Cells", eine Dissertation, die dem Department of Chemical Engineering and the Committee of Graduate Studies of Standford University zum partiellen Erfüllen der Anforderungen für den Grad eines Doktors der Philosophie im Mai 1995 vorgelegt wurde, untersuchte die Wirkungen der Temperatur auf die Besetzung der Glykosylierungsstelle und er berichtete, dass die Stellenbesetzung durch Exposition der Zellen auf 26°C erhöht wurde (siehe Seite 50–51).
  • Hormonale und andere Behandlungen zur Beeinflussung der Glykosylierung
  • Die Wirkung von verschiedenen Additiven, wie Plasmakomponenten, für die Kulturmedien auf die Proteinproduktion und -glykosylierung, beispielsweise die Wirkungen von Hormonbehandlungen auf die Membranglykosylierung in Rattennierenbürstensaummembranen, wurde in der Literatur untersucht (Mittal et al., Indian J. Exper. Biol., 34: 782–785 (1996)). Untersuchungen der Muc-I-Mucinexpression ermittelten die hormonale Basis für mRNA-Expression (Parry et al., J. Cell Sci., 101: 191–199 (1992)). Die Schilddrüsenhormonregulation von α-Lactalbumin mit unterschiedlicher Glykosylierung wurde berichtet (Ziska et al., Endocrinology, 123: 2242–2248 (1988)). Das zelluläre Ansprechen auf Protein-N-Glykosylierung war in Gegenwart von Thyroxin, Insulin und Thrombin erhöht und die Wirkung war dosisabhängig (Oliveira und Banerjee, J. Cell. Physiol., 144: 467–472 (1990)). Es wurde ermittelt, dass Thyroxin Änderungen im Glykosylierungsmuster von Ratten-α-Fetoprotein induziert (Naval et al., Int. J. Biochem., 18: 115–122 (1986)).
  • Zusätzlich zu Hormonbehandlungen erhöhten Glutathion- und Glucose-6-phosphatdehydrogenasemangel die Proteinglykosylierung (Jain, Free Radical Biology & Medicin, 24: 197–201 (1998)). Es wurde ermittelt, dass Thyrotropin Oligosaccharyltransferaseaktivität in Schilddrüsenzellen kontrolliert (Desruisseau et al., Mol. Cell. Endocrinol., 122: 223–228 (1996)). Die Zugabe von Glucose und Triiodthyronin (T3) zu einem Medium, das ein Prourokinasederivat produziert, verbesserte die Produktivität (Hoso et al., Cytotechnology, 19: 1–10 (1996)). Ferner reagierte die Fucosyltransferaseaktivität im Rattendünndarm auf eine Hydrokortisonregulation während der Säugungsperiode (Biol. et al., Biochim. Biophys. Acta, 1133: 206–212 (1992)). Eine Hydrokortisonbehandlung induzierte ferner quantitative Änderungen der Glykosylierung eines Mausmammakarzinoms gegenüber Vorstufen (Maldarelli und Yagi, JNCI, 77: 1109–1115 (1986)). Die Glykosylierung von zellulären Glykokonjugaten in einer Karzinomzelllinie wurde durch eine Retinoesäure verstärkt (Sacks et al., Glycoconju gate J., 13, 791–796 (1996)). Ferner hat Retinoesäure reversible Wirkungen auf die Glykosaminoglykansynthese während der Differenzierung von HL-60-Leukämiezellen (Reiss et al., Can. Res., 45: 2092–2097 (1985)). Ferner wurde ermittelt, dass Retinoesäure sowie Hydrokortison die Glykosaminoglykansynthese von humanen malignen Keratinocyten modulieren (Reiss et al., J. Invest. Dermatol., 86: 683–688 (1986)).
  • Die Konkurrenz zwischen Faltung und Glykosylierung im endoplasmatischen Retikulum (Holst et al., aaO) sowie ein akuter Hitzeschock, der das Phänomen einer prompten Glykosylierung induziert, (Jethmalani et al., J. Biol. Chem., 269: 23603–23609 (1994)) wurden beschrieben.
  • Es besteht Bedarf an einer Erhöhung der zunehmenden Besetzung einer Glykosylierungsstelle in Glykoproteinen mit mehreren Glykoformen zur Herstellung von Glykoprotein-Therapeutika konsistenter Produktqualität. Beispielsweise besteht Bedarf an einer Erhöhung der Fraktion von Typ-I-t-PA im t-PA-Produktionsverfahren. Eine derartige Erhöhung der Stellenbesetzung erzeugt t-PA mit einer Aktivität, die dem internationalen humanen t-PA-Standard stärker ähnelt bzw. nahekommt und daher humanem t-PA stärker nahekommt. Typ-I-t-PA ist auch löslicher als Typ-II, was bei Bearbeitungsstufen von einem gewissen Wert sein kann. Ferner ist eine erhöhte Menge an Typ I mit zunehmender Halbwertszeit im Kreislauf, wie oben angegeben, korreliert.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Es wurde ermittelt, dass während der Herstellung eines Glykoproteins des Wildtyps, d. h. von humanem t-PA, in Säugerzellen, d. h. Chinese Hamster Ovary (CHO)-Zellen, die Verwendung von bestimmten zweiwertigen Metallen, Hormonen oder Faktoren, die die Zellzyklusverteilung unter Kontrolle oder Beeinflussung der Glykosylierung manipulieren, die Stellen besetzung einer Glykosylierungsstelle des Glykoproteins signifikant beeinflussen. Beispielsweise verstärkt eine Verringerung der Kultivierungstemperatur von 37°C auf etwa 30–35°C in der Produktionsphase die Besetzung der Glykosylierungsstelle an der Aminosäureposition 184 signifikant und sie erhöht dadurch das Verhältnis von Typ-I-t-PA zu Typ-II-t-PA. Insbesondere erhöhte eine Verringerung der Temperatur von 37 auf 33 oder 31°C die t-PA-Stellenbesetzung bis zu 6%. Es wird angenommen, dass Temperaturen unter 37°C in ähnlicher Weise die Besetzung von nicht leicht zugänglichen Stellen einer N-gebundenen Glykosylierung in anderen Glykoproteinen erleichtern. Entsprechend kann die Temperatur als empfindliches Werkzeug zum Feintuning des Verhältnisses von verschieden glykosylierten Formen von Glykoproteinen mit einer oder mehreren Stellen von N-gebundener Glykosylierung, die nur in einer Fraktion des Proteins besetzt sind, verwendet werden.
  • Ferner erhöhten andere Umgebungsfaktoren, die diejenigen, die den Wachstumszustand einer Kultur und entsprechend die Zellzyklusverteilung manipulieren, wie Butyrat, oder einen Zellzyklusinhibitor, der den Anteil von Zellen in der G0/G1-Phase erhöht, wie Chinidin, Plasmakomponenten, wie Schilddrüsenhormone, und/oder bestimmte zweiwertige Metallkationen umfassen, den t-PA-Typ-1-Gehalt signifikant (etwa 1–2,5%) im Vergleich zu Kontrollbedingen und es wird angenommen, dass sie im Hinblick auf andere Glykoproteine ähnlich wirken. Im Gegensatz dazu führte die Zugabe der relevanten Nucleosidvorläufermoleküle (beispielsweise Uridin, Guanosin, Mannose) nicht zu einer verbesserten Stellenbesetzung.
  • In einem Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Glykoproteins, das das Kultivieren von Säugerwirtszellen, die das Glykoprotein produzieren (d. h. Zellen, die das Glykoprotein codierende Nucleinsäure exprimieren) in Gegenwart von (a) einem Faktor, der den Wachstumszustand in einer Zellkultur modifiziert, (b) eines zwei wertigen Metallkations, das eine oktaedrische Koordinationsgeometrie annehmen kann und diese bevorzugt, oder (c) einer Plasmakomponente, wodurch die Besetzung der Stelle einer N-gebundenen Glykosylierung, die nur in einer Fraktion des Glykoproteins besetzt wird, in dem so hergestellten Glykoprotein erhöht ist, umfasst. Vorzugsweise ist der Faktor ein Zellzyklusinhibitor, der Zellen in der G0/G1-Phase blockiert, ein Butyratsalz und/oder eine Temperatur der Kultur zwischen etwa 30 und 35°C, das zweiwertige Kation Mangan oder Eisen und die Plasmakomponente ein Hormon. Vorzugsweise umfasst das Zellkulturverfahren eine Wachstumsphase und anschließend eine Übergangsphase und eine Produktionsphase. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Säugerwirtszellen in der Wachstumsphase bei etwa 37°C kultiviert, wobei dann während der Übergangsphase die Temperatur auf zwischen etwa 30°C und 35°C gesenkt wird. Die Wirtszellen sind vorzugsweise CHO-Zellen und das Glykoprotein ist vorzugsweise t-PA.
  • In einem weiteren Aspekt erfolgt durch die Erfindung die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von humanem t-PA, das das Kultivieren von CHO-Zellen, die Nucleinsäure mit Codierung für den t-PA exprimieren, in einem serumfreien Medium in einer Produktionsphase bei einer Temperatur zwischen etwa 30°C und 35°C und in Gegenwart von etwa 0 bis 2 mM eines Butyratsalzes umfasst, wodurch die Besetzung einer Stelle einer N-gebundenen Glykosylierung, die nur in einer Fraktion von t-PA besetzt ist, in dem so produzierten t-PA erhöht ist.
  • In einem noch weiteren Aspekt liefert die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von humanem t-PA, das das Kultivieren von CHO-Zellen, die Nucleinsäure mit Codierung für den t-PA exprimieren, in einem serumfreien Medium in einer Wachstumsphase bei einer Temperatur zwischen etwa 37–40°C, wobei das Medium etwa 10 nM bis 100 μM eines zweiwertigen Metallkations, das eine oktaedrische Koordinationsgeometrie ein nehmen kann und diese bevorzugt, das Kultivieren der Zelle in einer Übergangsphase bei einer Temperatur von etwa 37–40°C und das Kultivieren der Zelle in einer Produktionsphase, wobei nach etwa 48 h in der Produktionsphase die Temperatur auf zwischen etwa 30°C und 35°C gesenkt wird und etwa 0,75 bis 1,5 mM eines Butyratsalzes zu dem Medium gegeben werden, umfasst, wodurch die Besetzung der Stelle einer N-gebundenen Glykosylierung, die nur in einer Fraktion von t-PA besetzt wird, in dem so produzierten t-PA verstärkt wird. Bei diesem Verfahren wird eine Plasmakomponente, wie ein Schilddrüsenhormon, beispielsweise Thyroxin oder Triiodthyronin, oder ein Zellzyklusinhibitor, der Zellen in der G0/G1-Phase blockiert, wie Chinidin, optional zu dem Kulturmedium vor oder während der Wachstumsphase gegeben.
  • Daher ermöglicht das hierin angegebene Verfahren die Herstellung einer bevorzugten Glykoform eines Glykoproteins, beispielsweise von Typ-I-t-PA, in einer Säugerzellkultur und es erhöht auch das Verhältnis von bevorzugten zu nicht bevorzugten Glykoproteinen, beispielsweise das Verhältnis von Typ-I- zu Typ-II-t-PA, in einer Säugerzellkultur.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt ein Schema für Typ-I-t-PA und Typ-II-t-PA und ein Chromatogramm derselben.
  • 2 zeigt den Prozentgehalt von humanem Typ-I-t-PA in Zellkulturen von CHO-Zellen, die in verschiedenen Maßstäben bei 37°C kultiviert wurden.
  • 3 zeigt Diagramme des Prozentgehalts von humanem t-PA des Typs I in Zellkulturen von CHO-Zellen bei 37°C als Funktion der Versuchszeit einer 12K-Fermentation, wobei jede Diagrammlinie für einen anderen Versuch steht.
  • Die 4A und 4B zeigen den Prozentgehalt von humanem t-PA des Typs I in Zellkulturen von CHO-Zellen, die im Labormaßstab (in 25-cm2-T-Kolben und 100-ml-Spinnerkolben – 4A) oder in einem 5-l-Bioreaktor (4B) 5–7 Tage bei 33°C kultiviert wurden, in Bezug auf eine Kontrolle (bei 37°C gehaltene Zellkultur).
  • 5 zeigt den Prozentgehalt von humanem t-PA des Typs I in Zellkulturen von CHO-Zellen, die in T-Kolben bei 37°C 3–4 Tage kultiviert wurden, wobei Natriumbutyrat in der angegebenen Menge zum Inokulationszeitpunkt zugesetzt wurde. Die Werte stammen von dreifachen Experimenten.
  • 6 zeigt den Prozentgehalt von humanem t-PA des Typs I in Zellkulturen von CHO-Zellen, die in 60-mm-Kulturschalen bei 37°C 4–6 Tage gezüchtet wurden, wobei die Temperaturänderungen mit oder ohne Natriumbutyrat verglichen werden (worin 37°C 1-Kontrolle bei 37°C ohne Butyrat bedeutet; 37°C 11× bei 37°C mit 0,75 mM Butyrat bedeutet; 37°C 12× bei 37°C mit 1,5 mM Butyrat bedeutet; 33°C 1- bei 33°C ohne Butyrat bedeutet; 33°C 11× bei 33°C mit 0,75 mM Butyrat bedeutet; 33°C 12× bei 33°C mit 1,5 mM Butyrat bedeutet; 31°C 1- bei 31°C ohne Butyrat bedeutet; 31°C 11× bei 31°C mit 0,75 mM Butyrat bedeutet; 31°C 12× bei 31°C mit 1,5 mM Butyrat bedeutet).
  • 7 zeigt den Prozentgehalt von humanem t-PA des Typs I in Zellkulturen von CHO-Zellen, die in 5-l-Bioreaktoren kultiviert wurden, nach 5–7 Tagen, wobei Temperaturänderungen mit oder ohne Natriumbutyrat verglichen werden (wobei Kontrolle bei 37°C ohne Butyrat bedeutet; 33°C bei 33°C ohne Butyrat bedeutet; 2× butr. bei 37°C mit 1,5 mM Butyrat bedeutet und 33°C/2× bei 33°C mit 1,5 mM Butyrat bedeutet).
  • 8 zeigt den Prozentgehalt von humanem t-PA des Typs I in Zellkulturen von CHO-Zellen, die in Fermentern über eine bestimmte Zeit bei 37°C kultiviert wurden, wobei Natriumbu tyrat bis zu einer Konzentration von 0,75 mM nach etwa 48 h zugegeben wurde, und die Prozentgehalte von Zellen in der G0/G1-Phase an den entsprechenden Zeitpunkten. Diese Ergebnisse reflektieren die Mittelwerte von drei getrennten Kulturen.
  • 9 zeigt den Prozentgehalt von humanem t-PA des Typs I in Zellkulturen von CHO-Zellen, die in T-Kolben bei 37°C 3–4 Tage kultiviert wurden, wobei zum Inokulationszeitpunkt kein Zellzyklusinhibitor zugesetzt wird (Kontrolle), Thymidin (250 μg/ml) zugesetzt wird oder Chinidin (90 μM) zugesetzt wird. Die Werte stammen von dreifachen Experimenten.
  • Die 10A und 10B zeigen den Prozentgehalt von humanem t-PA des Typs I in Zellkulturen von CHO-Zellen, die in 60-mm-Kulturschalen bei 37°C 4–6 Tage kultiviert wurden, wobei zum Inokulationszeitpunkt 3 nM MnCl2 zugesetzt wird (Kontrolle) oder 10 nM, 100 nM, 1 μM, 10 μM oder 100 μM MnCl2 zugesetzt wird. Die Werte sind für 10A dreifach angegeben und in 10B als Mittelwert dreifacher Messungen angegeben.
  • 11 zeigt den Prozentgehalt von humanem t-PA des Typs I in Zellkulturen von CHO-Zellen, die in 60-mm-Kulturschalen bei 37°C 4–6 Tage kultiviert wurden, wobei zum Inokulationszeitpunkt kein Eisen(III)-citrat zugesetzt wurde (Kontrolle) oder 10 μM Eisen(III)-citrat, 50 μM Eisen(III)-citrat oder 100 μm Eisen(III)-citrat zugesetzt wurde.
  • 12 zeigt den Prozentgehalt von humanem t-PA des Typs I in Zellkulturen von CHO-Zellen, die in 60-mm-Kulturschalen bei 37°C 4–6 Tage kultiviert wurden, wobei die Zellen in Gegenwart erhöhter Mengen spezifizierter Nucleotidzuckervorläufermoleküle kultiviert werden.
  • Die 13A und 13B zeigen den Prozentgehalt von humanem t-PA des Typs I in Zellkulturen von CHO-Zellen, die in 60- mm-Kulturschalen bei 37°C 7 Tage kultiviert wurden, wobei zum Inokulationszeitpunkt kein Hormon zugegeben wird (Kontrolle) oder 1 nM, 10 nM oder 100 nM Triiodthyronin (Triiod.) oder Thyroxin (Thyrox.) zugegeben werden. Die Werte sind in 13A dreifach angegeben und in 13B als Mittelwert von dreifachen Messungen angegeben.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • I. Definitionen
  • Das hierin verwendete Wort "erhöht" bezeichnet, wenn es sich auf die Besetzung einer Stelle einer N-gebundenen Glykosylierung, die nur in einer Fraktion des Glykoproteins besetzt ist, bezieht, einen relativen Wert, der durch Durchführen der vorliegenden Erfindung erhalten wurde, gegenüber einem Kontrollwert, der ohne die Verwendung der Parameter dieser Erfindung erhalten wurde. Der Wert wird auf der Basis des Prozentsatzes von Glykosylierungsstellen, die an der speziellen Position des in Frage stehenden Glykoproteins besetzt sind, gegenüber einem Grundlinienwert, der ohne die Verwendung der hierin beanspruchten Faktoren, Kationen oder Plasmakomponenten bestimmt wird, berechnet. Beispielsweise wird t-PA als Gemisch von zwei Hauptglykoformen sezerniert. Typ I (alle drei N-Glykosylierungsstellen sind besetzt) und Typ II (Asn-184 ist nicht besetzt) und ein erhöhter Besetzungsgrad bedeuten eine erhöhte Stellenbesetzung derart, dass das Gemisch erhöhte Mengen an Typ-I- in Bezug auf Typ-II-t-PA gegenüber der Kontrolle aufweist. Dieser Besetzungsgrad kann beispielsweise durch Verwendung von Umkehrphasen-Hochdruckflüssigchromatographie (RP-HPLC) unter Elution der Fragmente der verschiedenen Glykoproteintypen (die Typen, die verschiedene Besetzungsgrade der Glykosylierungsstellen aufweisen) und Integration der Peakflächen für jeden Glykoproteintyp zur Bestimmung von Relativmengen ermittelt werden. Die typischste Weise zum Ausdrücken dieser Mengen ist der Prozentsatz des Glykoproteintyps mit höherer Besetzung in Bezug auf die gesamten Glykoproteintypen. Ein spezielles Beispiel für einen Test, der zur Ermittlung der Verstärkung von Typ I/Typ II-t-PA verwendet wird, ist im Folgenden in Beispiel 1 angegeben.
  • Der hierin verwendete Ausdruck "Glykoprotein" bezeichnet allgemein Peptide und Proteine mit mehr als etwa 10 Aminosäuren und mindestens einer Glykosylierungsstelle, die nur in einer Fraktion des Glykoproteinprodukts besetzt ist, d. h. sie zeigen variable Stellenbesetzung oder Variationen der Besetzung der N- und O-Glykosylierungsstelle. Die Glykoproteine können homolog zur Wirtszelle sein, sie sind jedoch vorzugsweise heterolog, d. h. fremd, zu der zu verwendenden Wirtszelle, beispielsweise ein durch eine CHO-Zelle produziertes humanes Protein. Vorzugsweise werden Säugerglykoproteine (Glykoproteine, die ursprünglich von einem Säugerorganismus stammen) verwendet, noch günstiger werden solche, die direkt in das Medium sezerniert werden, verwendet und noch besser werden solche, die die Besetzung einer N-Glykosylierungsstelle umfassen, verwendet.
  • Die hierin besonders bevorzugten Glykoproteine sind t-PA, Plasminogen, Interferon-γ, Protein C, IL-2 und CSF, beispielsweise GM-CSF. Die stärker bevorzugten Glykoproteine sind t-PA oder Plasminogen und noch besser ist t-PA, noch günstiger humaner t-PA.
  • Die Ausdrücke "Gewebe-Plasminogenaktivator" und "t-PA" bezeichnen einen humanen extrinsischen (Gewebetyp)Plasminogenaktivator mit fibrinolytischer Aktivität, der typischerweise eine Struktur mit fünf Domänen aufweist (Finger-, Wachstumsfaktor-, Kringle-1-, Kringle-2- und Proteasedomänen), indessen weniger Domänen aufweisen kann oder einige von dessen Domänen wiederholt aufweisen kann, wenn er immer noch als Thrombolytikum wirkt und die Stellen einer N-gebundenen Glykosylierung an den Positionen 117, 184 und 448 beibehält. Das Minimum ist, dass der t-PA aus einer Proteasedomä ne, die Plasminogen in Plasmin umwandeln kann, und einer N-terminalen Region, von der angenommen wird, dass sie mindestens teilweise für die Fibrinbindung verantwortlich ist, besteht und die Stellen einer N-gebundenen Glykosylierung an Positionen, die den Aminosäurepositionen 117, 184 und 448 von humanem t-PA des Wildtyps entsprechen, beibehält. Die Retention dieser Glykosylierungsstellen beruht auf der Tatsache, dass eine variable Stellenbesetzung von rekombinantem und von Melanom abgeleitetem Wildtyp-t-PA zur Produktion von zwei Varianten führt, die als "Typ-I-t-PA" bzw. "Typ-II-t-PA" bezeichnet werden. Typ-I-t-PA enthält N-gebundene Oligosaccharide an den Positionen 117, 184 und 448. Typ-II-t-PA enthielt N-gebundene Oligosaccharide an den Positionen 117 und 448. Siehe 1. Es ist klar, dass natürliche Allelvariationen existieren und unter Individuen auftreten können, was durch eine oder mehrere Aminosäureunterschiede in der Aminosäuresequenz von t-PA eines einzelnen Individuums belegt wird.
  • Die Ausdrücke "humaner Gewebe-Plasminogenaktivator des Wildtyps", "humaner t-PA des Wildtyps", "nativer humaner Gewebe-Plasminogenaktivator" und "nativer humaner t-PA", wobei "humaner t-PA" als "ht-PA" abgekürzt werden kann, bezeichnen humanen t-PA der nativen Sequenz, d. h. denjenigen, der durch die cDNA-Sequenz, die in US-Patent 4 766 075, erteilt am 23. August 1988, angegeben ist, codiert wird. Die Aminosäurepositionszahlen oder -positionen in dem t-PA-Molekül sind entsprechend US-Patent 4 766 075 markiert. Der t-PA kann von jeder nativen Quelle stammen. Ferner kann der t-PA von jedem rekombinanten Expressionssystem, das beispielsweise CHO-Zellen oder humane embryonale Nieren-293-Zellen umfasst, erhalten werden.
  • Die hierin verwendeten Verweise auf verschiedene Domänen von t-PA bedeuten die Domänen von humanem t-PA des Wildtyps gemäß der Definition im Vorhergehenden und funktional äquivalente Teile von humanem t-PA mit Aminosäureänderungen im Vergleich zur nativen humanen t-PA-Sequenz oder zur (nativen oder varianten) t-PA von anderen Quellen, wie Bat-Gewebe-Plasminogenaktivator (bat-BA). Daher bezeichnet der hierin verwendete Ausdruck "Proteasedomäne" die Region, die sich von der Aminosäureposition 264 bis zur Aminosäureposition 527 erstreckt, die die reife Form von humaner t-PA des Wildtyps umfasst, und funktional äquivalente Bereiche von humaner t-PA mit Aminosäureänderungen im Vergleich zur nativen humanen t-PA-Sequenz oder t-PA von anderen Quellen, wie bat-PA.
  • Der hierin verwendete Ausdruck "Faktor, der den Wachstumszustand in einer Zellkultur modifiziert" bezeichnet einen Faktor, der den Anteil von Zellen in der G0/G1-Wachstumsphase erhöht, beispielsweise einen Zellzyklusinhibitor, der die Ansammlung oder Blockierung der Zellen in der G0/G1-Phase verursacht. Derartige Faktoren manipulieren die Zellzyklusverteilung unter Kontrolle oder Beeinflussung der Glykosylierung. Ein derartiger Faktor kann die Glykosylierung in Mechanismen jenseits des Wachstumszustands beeinflussen, doch sind sie hierin als mindestens den Wachstumszustand beeinflussend definiert.
  • Der hierin verwendet Ausdruck "Zellzyklusinhibitor, der Zellen in der G0/G1-Wachstumsphase blockiert" ist ein Molekül, das die Ansammlung von Zellen in der G0/G1-Wachstumsphase verursacht. Dies kann durch eine Zellzyklusanalyse bestimmt werden, d. h. gleichförmige Suspensionen von Kernen werden mit Propidiumiodid (PI) unter Verwendung des Detergens/Trypsin-Verfahrens nach Vindelov et al., Cytometry, 3: 323–327 (1983) angefärbt, um den relativen zellulären DNA-Gehalt durch Durchflusszytometrieanalyse zu bestimmen. Die Ereignisse werden unter Verwendung von Dublettdiskriminierung zum Ausschluss von Dubletten gefiltert und die Daten werden unter Verwendung von ModFit LT Cell Cycle AnalysisTM-Software (Verity Software House) modelliert. Ein bevorzugter derartiger Inhibitor hierin ist Chinidin.
  • "Butyrat" oder "Butyratsalz" bedeutet jedes entsprechende Buttersäuresalz, beispielsweise Natriumbutyrat oder Kaliumbutyrat.
  • "Phase" bedeutet eine bestimmte Phase der Kultivierung der Zellen, was dem Praktiker bekannt ist. Beispielsweise bezeichnet "Wachstumsphase" der Zellkultur die Periode von exponentiellem Zellwachstum (die log-Phase), in der sich die Zellen allgemein schnell teilen. Während dieser Phase werden Zellen über einen Zeitraum von üblicherweise zwischen 1 und 4 Tagen oder unter derartigen Bedingungen, dass das Zellwachstum maximiert ist, kultiviert. Der Wachstumszyklus für die Wirtszelle kann für die in Betracht gezogene spezielle Wirtszelle ohne übermäßigen Arbeitsaufwand bestimmt werden. Während der Wachstumsphase werden Zellen in Nährmedium, das die notwendigen Additive enthält, allgemein bei etwa 30–40°C, vorzugsweise etwa 37°C, in einer befeuchteten kontrollierten Atmosphäre derart kultiviert, dass optimales Wachstum für die spezielle Zelllinie erreicht wird. Zellen werden in der Wachstumsphase über einen Zeitraum von zwischen etwa einem und vier Tagen, üblicherweise zwischen etwa zwei und drei Tagen gehalten.
  • "Übergangsphase" der Zellkultur bezeichnet den Zeitraum, während dem Kulturbedingungen für die Produktionsphase eingestellt werden. Während der Übergangsphase werden Umgebungsfaktoren, wie die Temperatur, von den Wachstumsbedingungen zu den Produktionsbedingungen verschoben.
  • Die "Produktionsphase" der Zellkultur bezeichnet den Zeitraum, während dem das Zellwachstum ein Plateau erreicht hat. Während der Produktionsphase ist das logarithmische Zellwachstum beendet und die Glykoproteinproduktion primär. Während dieses Zeitraums wird das Medium allgemein ergänzt, um die fortgesetzte Glykoproteinproduktion zu unterstützen und das gewünschte Glykoproteinprodukt zu erreichen.
  • "Zweiwertiges Metallkation, das eine oktaedrische Koordinationsgeometrie einnehmen kann und diese bevorzugt" bedeutet ein Metallkation mit zwei Valenzen, das fähig ist, eine oktaedrische Koordinationsgeometrie einzunehmen und tatsächlich eine Vorliebe hierfür zeigt. Derartige Kationen sind auch dadurch gekennzeichnet, dass eine Oligosaccharyltransferase in deren Gegenwart funktionieren kann (d. h. aktiviert ist). Beispiele für derartige Metallionen umfassen Mangan (Mn2+), Eisen (Fe2+), Calcium (Ca2+) und Magnesium (Mg2+). Zweiwertige Kationen, die Vorlieben für andere Koordinationsgeometrien zeigen, die Nickel (Ni2+), Kupfer (Cu2+), Cadmium (Cd2+) und Zink (Zn2+) umfassen, können das Enzym nicht aktivieren und hemmen bei hohen Konzentrationen auch konkurrierend die Aktivität in Gegenwart von Mangan. Daher sind diese letzteren Kationen von der Definition ausgeschlossen.
  • "Plasmakomponente" bedeutet einen Bestandteil von normalem Plasma. Diese umfasst Wachstumspromotoren und tumorfördernde Mittel für Endothelzellenwachstum, Regulatoren der Differenzierung von Epithelgeweben, Glucagon, Heparin, Phorbolmyristatacetat, PRL, Thyroglobulin, 8Br-cAMP, Thrombin, Vitamin A und dessen Derivate (Retinoide, wie Retinoesäure, beispielsweise β-all-trans-Retinoesäure), Glutathion, Steroide, wie Corticosteron, Cortisol und Corticoide, beispielsweise Glucocorticoide, wie Hydrocortison, und Hormone, vorzugsweise, diejenigen, die lebensnotwendige Stoffwechselhormone sind, wie Östrogen, Insulin, und Schilddrüsenhormone, beispielsweise Thyroxin und Triiodthyronin (T3). Die Schilddrüsenhormone sind bevorzugt und noch besser sind Thyroxin und Triiodthyronin. Da Serum, das fetales Kälberserum umfasst, Schilddrüsenhormone und das Schilddrüsenhormon bindende Protein in nanomolaren Mengen enthält, ist es bevorzugt, serumfreies Medium zu verwenden, insbesondere wenn Schilddrüsenhormone zum Erhöhen der Positionsbesetzung verwendet werden.
  • Die Ausdrücke "Zellkulturmedium", "Kulturmedium" und "Fermentationsmedium" bezeichnen eine Nährlösung, die zum Züchten von Säugerzellen verwendet wird, die mindestens eine Komponente von einer oder mehreren der im Folgenden angegebenen Kategorien bereitstellt:
    • 1) eine Energiequelle, üblicherweise in der Form eines Kohlehydrats, beispielsweise Glucose;
    • 2) alle essentiellen Aminosäuren und üblicherweise der Basissatz von 20 Aminosäuren plus Cystein;
    • 3) Vitamine und/oder andere organische Verbindungen, die in niedrigen Konzentrationen erforderlich sind;
    • 4) freie Fettsäuren und
    • 5) Spurenelemente, wobei Spurenelemente als anorganische Verbindungen oder natürlich vorkommende Elemente, die typischerweise in sehr niedrigen Konzentrationen, üblicherweise im Mikromolbereich erforderlich sind, definiert sind.
  • Das Zellkulturmedium ist generell "serumfrei", wenn das Medium im Wesentlichen frei von Serum von einer Säugerquelle ist (beispielsweise fetales Rinderserum (FBS)). "Im Wesentlichen frei" bedeutet, dass das Zellkulturmedium zwischen etwa 0 und 5% Serum, vorzugsweise zwischen etwa 0 und 1% Serum und noch besser zwischen etwa 0 und 0,1% Serum umfasst. Vorteilhafterweise kann als serumfrei "definiertes" Medium verwendet werden, wobei die Identität und Konzentration von jeder der Komponenten in dem Medium bekannt ist (d. h. eine undefinierte Komponente, wie Rinderhypophysenextrakt (BPE) in dem Kulturmedium nicht vorhanden ist).
  • Im Kontext der vorliegenden Erfindung werden die Ausdrücke "Zelle", "Zelllinie" und "Zellkultur" austauschbar verwendet und alle derartigen Bezeichnungen umfassen Nachkommen. Daher umfassen die Wörter "Transformanten" und "transformierte (Wirts)zellen" die primäre Subjektzelle und davon abgeleitete Kulturen ungeachtet der Zahl der Übertragungen. Dies ist auch so zu verstehen, dass alle Nachkommen im Hinblick auf den DNA-Gehalt aufgrund von überlegten oder unvermeidlichen Mutationen nicht genau identisch sein können. Mutierte Nachkommen, die die gleiche Funktion oder biologische Aktivität, auf die in der ursprünglich transformierten Zelle gescreent wurde, aufweisen, werden umfasst. Wenn unterschiedliche Bezeichnungen beabsichtigt sind, wird dies aus dem Zusammenhang klar.
  • Die Ausdrücke "Säugerwirtszelle", "Wirtszelle", "Säugerzelle", "rekombinante Wirtszelle eines Säugers" und dergleichen bezeichnen Zelllinien, die von Säugern abgeleitet sind, die zu Wachstum und Überleben fähig sind, wenn sie in entweder eine Monoschichtkultur oder eine Suspensionskultur in einem Medium, das die entsprechenden Nährstoffe und Wachstumsfaktoren enthält, gegeben werden. Die notwendigen Wachstumsfaktoren für eine spezielle Zelllinie werden empirisch ohne weiteres ohne übermäßigen Arbeitsaufwand gemäß der Beschreibung in beispielsweise Mammalian Cell Culture, J. P. Mather, Hrsg. (Plenum Press, N.Y.) (1984) und Barnes und Sato, Cell, 22: 649 (1980) bestimmt. Typischerweise sind die Zellen zur Expression und Sekretion von großen Mengen eines speziellen interessieren Glykoproteins in das Kulturmedium fähig. Beispiele für geeignete Säugerwirtszellen im Kontext der vorliegenden Erfindung können CHO-Zellen umfassen ( EP 117 159 , veröffentlicht am 29. August 1989; US-Patent 4 766 075, 4 853 330, 5 185 259; Lubiniecki et al., in Advances in Animal Cell Biology and Technology for Bioprocesses, Spier et al., Hrsg. (1989), S. 442–451), beispielsweise CHO-Derivate, wie CHO-DHFR (Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)), CHO-K1 DUXB11 (Simonsen und Levinson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 2495–2499 (1983); Urlaub und Chasin, aaO) und dp12.CHO-Zellen ( EP 307 247 , veröffentlicht am 15. März 1989); Ratten-Myelom-YB2/3.oAg20 (WO 86/00127, veröffentlicht am 1. April 1985); Maus-C127-Fibroblasten (Reddy et al., DNA, 6: 461–472 (1987)); Maus-Sertolizellen (TM4, Mather. Biol. Reprod., 23: 243–251 (1980)); humane Cervix karzinomzellen (HELA, ATCC CCL2); humane Lungenzellen (W138, ATCC CCL75); humane Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Maus-Mammakarzinom (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI-Zellen (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci., 383: 44–68 (1982)); MRC-5-Zellen; FS4-Zellen und humane Melanomzellen (Browne et al., Thromb. Haemost., 54: 422–424 (1985)). Bevorzugte Wirtszellen umfassen CHO-K1 DUX B11 und dp12.CHO-Zellen.
  • Die CHO-Zellen, die zur Produktion von t-PA in großem Maßstab entwickelt wurden, werden kryogen in einem MCB/Arbeitszellenbank(WCB)-System gemäß der Beschreibung von Wiebe et al. in Large Scale Mammalian Cell Culture Technology, Lubiniecki, Hrsg. (Marcel Dekker, New York, 1990), S. 147–160, gehalten. DHFR + CHO-K1-Zellen, die mit DNA mit Codierung für humanen t-PA transfiziert wurden, wurden bei der American Type Culture Collection, Manassas, Virginia (ATCC), hinterlegt und sind unter der Hinterlegungsnummer CCL 61 erhältlich. Eine Probe einer anderen, t-PA produzierenden CHO-Zelllinie (CHO-Zelllinie 1-1515) wurde unter der ATCC-Hinterlegungsnummer CRL 9606 hinterlegt. Von der letzteren Zelllinie wurde berichtet, dass sie zu humanen t-PA-Konzentrationen nahe 50 pg/Zelle/Tag führt.
  • II. Verfahren zur Durchführung der Erfindung
  • Allgemeine und spezielle Merkmale der Erfindung
  • Es wurde entdeckt, dass die Verwendung eines Faktors, der den Wachstumszustand in einer Zellkultur modifiziert, (beispielsweise ein Zellzyklusinhibitor, ein Butyratsalz oder eine Senkung der Temperatur während der Produktion eines Glykoproteins in einer Säugerzellkultur von 37°C auf etwa 30–35°C) oder die Verwendung eines zweiwertigen Metallkations, das eine oktaedrische Koordinationsgeometrie einnehmen kann und diese bevorzugt, oder die Verwendung einer Plasmakomponente die Besetzung der Glykosylierungsstelle an einer ausgewählten und gewünschten Aminosäureposition des Wildtyp-Glykoproteins erhöht.
  • Beispielsweise erhöht diese Senkung der Temperatur die Besetzung der Glykosylierungsstelle an der Aminosäureposition 184 von humanem t-PA des Wildtyps und sie erhöht daher das Verhältnis von Typ-I-t-PA zu Typ-II-t-PA. Die Fähigkeit zur Einstellung und Erhöhung des Verhältnisses von Typ-I- zu Typ-II-t-PA ist signifikant, da sie es ermöglicht, dass der Hersteller ein rekombinantes Protein, in dem dieses Verhältnis nahe dem in nativem t-PA vorhandenen Verhältnis (etwa 1:1) kommt, produziert. Ferner beeinflusst das Verhältnis von Typ I- zu Typ-II-t-PA die Löslichkeit und Clearancerate von t-PA und es gibt Belege, dass eine erhöhte Typ-I-t-PA-Konzentration die Halbwertszeit von t-PA im Kreislauf etwas erhöht. Es ist bekannt, dass das mannosereiche Oligosaccharid der Aminosäureposition 117 für die rasche Clearance von nativem humanem t-PA primär verantwortlich ist. Wenn dieses Oligosaccharid entfernt ist, wurde beobachtet, dass Typ-I-t-PA eine längere Halbwertszeit als Typ-II-t-PA aufweist, was anzeigt, dass ein sekundärer Mechanismus besteht, auf den das auf Typ-I-t-PA vorhandene zusätzliche Oligosaccharid eine positive Wirkung hat. Die experimentellen Erkenntnisse hierbei können auf andere Glykoproteine, die (wie t-PA) mindestens eine Glykosylierungsstelle, die nur in einer Fraktion des Glykoproteinprodukts besetzt ist, aufweisen, erstreckt werden.
  • Wenn der Faktor ein Butyratsalz ist, ist das Butyrat allgemein in einer Konzentration von bis etwa 2 mM, noch günstiger etwa 0,35 bis 2 mM, noch besser etwa 0,75 bis 1,5 mM vorhanden. Die Konzentration desselben, die in diesem Bereich zu wählen ist, hängt hauptsächlich von der Temperatur, der die Kultur ausgesetzt wird, und dem Glykoproteintyp ab. Daher beträgt, wenn für t-PA die Temperatur bei etwa 37°C bleibt oder auf etwa 33–35°C gesenkt wird, die Butyratkonzentration vorzugsweise weniger als etwa 1,5 mM und noch günstiger etwa 0,3 bis 1 mM, noch besser 0,75 mM. Wenn jedoch für t-PA die Temperatur auf etwa 30–31°C gesenkt wird, beträgt die Butyratkonzentration vorzugsweise 1–2 mM, noch besser etwa 1,5 mM. Diese Erläuterung zeigt, dass mehr als einer dieser Faktoren in der Zellkultur wirken können oder vorhanden sein können.
  • In einem bevorzugten Aspekt finden die Temperatursenkung und/oder Butyratzugabe während der Produktionsphase des Wachstumszyklus statt. Bei einem derartigen Szenario wird die Temperatur auf zwischen etwa 30 und 35°C gesenkt und/oder ein Butyratsalz etwa 48 h in die Produktionsphase zugegeben. Der Produktionsphase gehen günstigerweise eine Wachstumsphase und eine Übergangsphase des Wachstumszyklus voraus. Während der Wachstumsphase wird die Temperatur vorzugsweise bei etwa 37°C gehalten und/oder während der Übergangsphase wird die Temperatur der Kultur vorzugsweise auf zwischen etwa 30°C und 35°C, noch günstiger etwa 31–33°C und noch besser etwa 31°C gesenkt.
  • Alternativ oder zusätzlich zu dem obigen Faktor bzw. den obigen Faktoren werden die Zellen in Gegenwart eines zweiwertigen Kations gemäß der obigen Definition kultiviert. Die Wahl eines zu verwendenden zweiwertigen Kations sowie die spezielle Konzentration desselben hängt unter anderem von dem Typ des zu produzierenden Glykoproteins und den Metallkationen und anderen Komponenten, die bereits in dem Kulturmedium vorhanden sind, und deren jeweiligen Konzentrationen ab. Beispielsweise ist es, wenn das Glykoprotein eine Zahl von Thiogruppen aufweist, bevorzugt, ein thiophiles Metall, wie Mangan und Eisen, zu verwenden, wobei Eisen das am stärksten thiophile Metall ist. Im Gegensatz dazu sind, wenn das Glykoprotein mehr Sauerstoffgruppen enthält, dann die oxophilen Kationen Magnesium und Calcium bevorzugt. Wenn Calciumionen bereits in ausreichenden Mengen in dem Medium vorhanden sind, wird es nicht typischerweise für die Zwecke hierin verwendet und es wird ein anderes Metallkation verwendet. Ferner kann die Größe des Metallkations Einfluss haben, wobei Eisen und Magnesium kleiner sind und Calcium und Mangan größer sind. Sterische Effekte aufgrund von Schwefelgruppen an dem Glykoprotein können ein Kation eines kleineren Ionenradius diktieren. Das hierin bevorzugte zweiwertige Metallkation ist Mangan, Magnesium oder Eisen, noch günstiger Mangan oder Eisen und noch besser Mangan.
  • Das zweiwertige Metallkation ist in dem Kulturmedium vorzugsweise während der gesamten Kultivierungsdauer vorhanden und es wird mindestens während der Wachstumsphase zugesetzt. Die Konzentration desselben liegt allgemein im Bereich zwischen etwa 10 nM und 150 μM, vorzugsweise von etwa 10 nM bis 100 μM für Mangan und von etwa 20 μM bis 100 μM für Eisen.
  • In einer weiteren Alternative ist eine Plasmakomponente allein oder zusammen mit dem zweiwertigen Kation und/oder einem Faktor während der Kultivierung vorhanden. Die Plasmakomponente ist typischerweise in einer Menge von etwa 1 nM bis 15–20 μM in Abhängigkeit von hauptsächlich dem zu produzierenden Glykoproteintyp, dem verwendeten Plasmakomponententyp und dem Fermentationsmaßstab vorhanden. Beispielsweise ist die Plasmakomponente, wenn sie ein Schilddrüsenhormon ist, vorzugsweise in einer Menge von etwa 1–150 nM, vorzugsweise etwa 10–100 nM vorhanden. Wenn die Plasmakomponente Glutathion ist, ist sie vorzugsweise mit etwa 1–10 μM vorhanden, und wenn sie Hydrocortison ist, ist sie vorzugsweise mit etwa 5–15 nM, vorzugsweise etwa 10 nM vorhanden. Vorzugsweise ist die Plasmakomponente ein Hormon, noch günstiger ein Schilddrüsenhormon und noch besser Thyroxin oder Triiodthyronin.
  • Der für das Glykoprotein zu erreichende Stellenbesetzungsgrad muss gegen den gewünschten Sekretionsgrad des Glykoproteins ausbalanciert werden, wobei dies allgemein berücksichtigt wird, wenn die zu verwendenden Faktoren und anderen Komponenten und die entsprechenden Konzentrationen oder Temperaturen gewählt werden. Beispielsweise wird die Stel lenbesetzung allgemein in einem Auswahlbereich von etwa ±5% ohne Beeinflussung der t-PA-Sekretion kontrolliert.
  • Zellkulturverfahren
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Säugerzellen zur Produktion eines gewünschten Glykoproteinprodukts kultiviert. Bei der Wahl einer Wirtszelle zur Produktion des Glykoproteins im Kontext der vorliegenden Erfindung ist es wichtig, zu erkennen, dass verschiedene Wirtszellen charakteristische und spezifische Mechanismen für die translationale und posttranslationale Prozessierung und Modifikation (beispielsweise Glykosylierung, Spaltung) der exprimierten Proteine aufweisen. Geeignete Zelllinien sollten gewählt werden, um sicherzustellen, dass die gewünschten posttranslationalen Modifikationen möglich sind. Alternativ können Wirtszellen so modifiziert werden, dass sie ein bestimmtes Genprodukt, das für die spezifische posttranslationale Modifikation erforderlich ist, exprimieren.
  • Insbesondere sollten die Säugerzellen, wie das gewünschte Glykoprotein exprimieren, derartige spezielle Enzyme exprimieren oder zu einer entsprechenden Expression manipuliert werden, dass unter geeigneten Bedingungen die entsprechende posttranslationale Modifikation in vivo erfolgt. Die Enzyme umfassen die Enzyme, die zur Addition und Komplettierung N- und O-gebundener Kohlehydrate notwendig sind, beispielsweise die gemäß der Beschreibung in Hubbard und Ivatt, Ann. Rev. Biochem., 50: 555–583 (1981) für N-gebundene Oligosaccharide. Die Enzyme umfassen optional Oligosaccharyltransferase, α-Glucosidase I, α-Glucosidase II, ER-α(1.2)Mannosidase, Golgi-α-Mannodase 1, N-Acetylglucosaminyltransferase I, Golgi-α-Mannodase II, N-Acetylglucosaminyltransferase II, α(1.6)Fucosyltransferase, β(1.4)Galactosyltransferase und eine geeignete Sialyltransferase.
  • Zur Kultivierung der Säugerzellen, die das gewünschte Glykoprotein exprimieren und zur Addition der gewünschten Kohlehydrate in einer spezifischen Position und Verknüpfung fähig sind, können zahlreiche Kulturbedingungen verwendet werden, wobei spezielle Aufmerksamkeit der zu kultivierenden Wirtszelle geschenkt wird. Geeignete Kulturbedingungen für Säugerzellen sind einschlägig bekannt (J. Immunol. Methods, 56: 221–234 (1983)) oder können vom erfahrenen Fachmann ohne weiteres bestimmt werden (siehe beispielsweise Animal Cell Culture: A Practical Approach, 2. Auflage, D. Rickwood und B. D. Hames, Hrsg. (Oxford University Press, New York, 1992)) und sie variieren entsprechend der speziellen gewählten Wirtszelle.
  • Die Säugerzellkultur der vorliegenden Erfindung wird in einem für die spezielle, zu kultivierende Zelle geeigneten Medium hergestellt. Die Nährlösung kann optional mit einer oder mehreren Komponenten aus einer der im Folgenden angegebenen Kategorien ergänzt werden:
    • 1) Plasmakomponenten gemäß der obigen Definition und/oder Wachstumsfaktoren, beispielsweise Insulin, Transferrin und EGF;
    • 2) Salze und Puffer, beispielsweise Natriumchlorid, Calcium, Magnesium, Phosphat und HEPES;
    • 3) Nucleoside und Basen, beispielsweise Adenosin, Thymidin und Hypoxanthin;
    • 4) Protein- und Gewebehydrolysate;
    • 5) Antibiotika, wie GENTAMYCINTM-Arzneistoff, und
    • 6) Lipide, wie Linolsäure oder andere Fettsäuren, und deren geeignete Träger.
  • Etwaige andere notwendige Ergänzungsstoffe können in geeigneten Konzentrationen, die dem Fachmann geläufig sind, ebenfalls eingearbeitet werden.
  • Im Handel erhältliche Medien, wie Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma) und Dul becco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Sigma) sind Beispiele für Nährlösungen. Ferner kann jedes der Medien gemäß der Beschreibung in Ham and Wallace, Meth. Enz., 58: 44 (1979); Barnes und Sato, Anal. Biochem., 102: 255 (1980); US-Patent 4 767 704; 4 657 866; 4 927 762; 5 122 469 oder 4 560 655; WO 90/03430 und WO 87/00195 als Kulturmedium verwendet werden. Jedes dieser Medien kann nach Bedarf mit den oben genannten Komponenten ergänzt werden.
  • Die Verwendung eines speziellen Mediums, das kein Tierserum enthält, (serumfreies Medium) ist bevorzugt, um eine Störung oder Gegenwirkung von Komponenten des Serums mit einem oder mehreren der Faktoren, zweiwertigen Metallkationen, Plasmakomponenten und anderen Bestandteilen, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, zu vermeiden. Darüberhinaus sollte die Konzentration der Amingruppen ausreichend hoch sein, um t-PA in Lösung zu halten, wenn die Konzentration zunimmt. Dies kann durch die Verwendung von Konzentrationen von mehr als etwa 1 mM Lysin, durch die Gegenwart von HEPES oder durch die Verwendung von ausreichend hohen Ammoniumchloridkonzentrationen erreicht werden, obwohl jede andere Amin- oder Ammoniumquelle ausreichend ist.
  • Wenn das Ziel die Produktion von t-PA in im Wesentlichen Einzelkettenform ist, enthält das Kulturmedium (wie auch das in den anschließenden Gewinnungs- und Reinigungsstufen verwendete Medium) einen Proteaseinhibitor, wie Aprotinin, α-1-Antitrypsin, α-2-Macroglobulin, Sojabohnentrypsin und dergleichen. Vorzugsweise wird Aprotinin mit einer Konzentration von etwa 5 bis 100 kIU/ml, noch besser etwa 10 kIU/ml in dem t-PA-Produktionsmedium verwendet.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Säugerwirtszelle eine CHO-Zelle, vorzugsweise CHO-K1 DUX B11. Die notwendigen Nährstoffe und Wachstumsfaktoren für das Medium, einschließlich von deren Konzentrationen, für eine spezielle Zelllinie werden empirisch ohne übermäßigen Ar beitsaufwand gemäß der Beschreibung beispielsweise in Mammalian Cell Culture, Mather, Hrsg. (Plenum Press, NY, 1984) und bei Barnes und Sato, Cell, 22: 649 (1980), bestimmt. Ein geeignetes Medium enthält eine Basismediumkomponente, wie eine Formulierung auf DMEM/HAM F-12-Basis, (für die Zusammensetzung von DMEM- und HAM F12-Medien und insbesondere serumfreien Medien siehe die Kulturmediumformulierungen in dem American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, 6. Auflage, 1988, S. 346–349) mit modifizierten Konzentrationen von einigen Komponenten, wie Aminosäuren, Salzen, Zuckern und Vitaminen, und die optional Glycin, Hypoxanthin und Thymidin; rekombinantes humanes Insulin, hydrolysiertes Pepton, wie PRIMATONE HSTM oder PRIMATONE RLTM (Sheffield, England) oder das Äquivalent; ein zellschützendes Mittel, wie PLURONIC F68TM oder das äquivalente Pluronicpolyol, GENTAMYCINTM; und Spurenelemente enthalten. Die Mediumformulierungen gemäß der Beschreibung in US-Patent 5 122 469, die durch das Vorhandensein hoher Konzentrationen bestimmter Aminosäuren gekennzeichnet sind, sowie PS-20 gemäß der folgenden Beschreibung, sind besonders geeignet.
  • Die Glykoproteine der vorliegenden Erfindung können durch Züchten von Zellen, die das gewünschte Glykoprotein exprimieren, unter einer Vielzahl von Zellkulturbedingungen produziert werden. Beispielsweise sind Zellkulturverfahren für die Produktion von Glykoproteinen im kleinen oder großen Maßstab im Kontext der vorliegenden Erfindung potentiell verwendbar. Verfahren, die ohne hierauf beschränkt zu sein, einen Wirbelschichtbioreaktor, Hohlfaserbioreaktor, eine Rollflaschenkultur oder ein Rührtankbioreaktorsystem umfassen, können verwendet werden, in den letzteren zwei Systemen mit oder ohne Mikroträger verwendet werden und alternativ in einen diskontinuierlichen Modus, Zufuhrchargenmodus oder kontinuierlichem Modus betrieben werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Zellkultur der vorliegenden Erfindung in einem Rührtankbioreaktorsystem durchgeführt und es wird ein Zufuhrchargenkulturverfahren verwendet. In der bevorzugten Zufuhrchargenkultur werden die Säugerwirtszellen und Kulturmedium einem Kulturgefäß am Anfang zugeführt und zusätzliche Kulturnährstoffe kontinuierlich oder in diskreten Inkrementen der Kultur während des Kultivierens mit einer oder ohne eine periodische Zellen- und/oder Produkternte vor der Beendigung der Kultur zugeführt. Die Zufuhrchargenkultur kann beispielsweise eine halbkontinuierliche Zufuhrchargenkultur umfassen, wobei periodisch die gesamte Kultur (die Zellen und Medium umfasst) entfernt wird und durch frisches Medium ersetzt wird. Eine Zufuhrchargenkultur unterscheidet sich von einer einfachen Chargenkultur, bei der alle Komponenten zur Zellkultivierung (die die Zellen und alle Kulturnährstoffe umfassen) dem Kulturgefäß am Beginn des Kulturverfahrens zugeführt werden. Eine Zufuhrchargenkultur kann ferner von einer Perfusionskultur insofern unterschieden werden, als der Überstand von dem Kulturgefäß während des Verfahrens nicht entfernt wird (Bei der Perfusionskultivierung werden die Zellen in der Kultur durch beispielsweise Filtration, Verkapselung, Verankerung an Mikroträgern und dergleichen gehalten und das Kulturmedium kontinuierlich oder intermittierend eingeführt und aus dem Kulturgefäß entfernt).
  • Ferner können die Zellen der Kultur nach einem beliebigen Schema oder einer beliebigen Routine, die für die spezielle Wirtszelle und den speziellen betrachteten Produktionsplan geeignet sein können, vermehrt werden. Daher betrachtet die vorliegende Erfindung ein einstufiges oder mehrstufiges Kulturverfahren. In einer einstufigen Kultur werden die Wirtszellen in eine Kulturumgebung geimpft und die Verfahren der vorliegenden Erfindung werden während einer einzigen Produktionsphase der Zellkultur verwendet. Alternativ wird eine mehrstufige Kultur in Betracht gezogen. In der mehrstufigen Kultur können Zellen in einer Zahl von Stufen oder Phasen kultiviert werden. Beispielsweise können Zellen in einer ersten Stufe oder einer Wachstumsphasenkultur, wobei Zellen, die möglicherweise von einer Lagerung entfernt wurden, in ein zur Förderung von Wachstum und hoher Lebensfähigkeit geeignetes Medium überimpft werden, gezüchtet werden. Die Zellen können in der Wachstumsphase über einen geeigneten Zeitraum durch Zugabe von frischem Medium zur der Wirtszellkultur gehalten werden.
  • Gemäß einem bevorzugten Aspekt der Erfindung werden Zufuhrchargen- oder kontinuierliche Zellkulturbedingungen zur Erhöhung von Wachstum der Säugerzellen in der Wachstumsphase der Zellkultur ersonnen. In der Wachstumsphase werden Zellen unter Bedingungen und über einen Zeitraum, die für das Wachstum maximiert sind, gezüchtet. Die Kulturbedingungen, beispielsweise Temperatur, pH-Wert, gelöster Sauerstoff (DO2) und dergleichen, sind diejenigen, die mit dem speziellen Wirt verwendet werden und dem Fachmann üblicher Erfahrung geläufig sind. Allgemein wird der pH-Wert auf eine Höhe zwischen etwa 6,5 und 7,4 unter Verwendung von entweder einer Säure (beispielsweise CO2) oder einer Base (beispielsweise Na2CO3 oder NaOH) eingestellt. Ein geeigneter Temperaturbereich zur Kultivierung von Säugerzellen, beispielsweise CHO-Zellen, liegt zwischen etwa 30 und 40°C und vorzugsweise bei etwa 37°C, und ein geeigneter DO2-Wert beträgt zwischen 5 und 90% Luftsättigung.
  • In einer speziellen Stufe können die Zellen zur Inokulation einer Produktionsphase oder -stufe der Zellkultur verwendet werden. Alternativ kann, wie oben beschrieben, die Produktionsphase oder -stufe kontinuierlich mit der Inokulations- oder Wachstumsphase oder -stufe sein.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Zellkulturumgebung während der Produktionsphase der Zellkultur kontrolliert. In einem bevorzugten Aspekt geht der Produktionsphase des Zellkulturverfahrens eine Übergangsphase der Zellkultur voraus, in der die Parameter für die Produktionsphase der Zellkultur eingestellt werden.
  • Die t-PA-Produktion bei Säugerzellen, beispielsweise CHO-Zellen, verwendet typischerweise ein halbkontinuierliches Verfahren, wobei Zellen in einem "Samenzug" über verschiedene Zeiträume kultiviert werden und periodisch in Inokulumfermenter überführt werden, um das Zellamplifikationsverfahren auf dem Wege zur t-PA-Produktion in größerem Maßstab zu initiieren. Auf diese Weise sind Zellen, die zur rt-PA-Produktion verwendet werden, über verschiedene Zeiträume bis zu einem maximalen, vordefinierten Zellalter in Kultur. Die Parameter der Zellkulturverfahrens, beispielsweise die Samendichte, der pH-Wert, der DO2-Wert und die Temperatur während der Kultur, die Dauer der Produktionskultur, die Betriebsbedingungen der Ernte und dergleichen, sind eine Funktion der speziellen Zelllinie und des verwendeten Kulturmediums und sie können empirisch ohne übermäßigen Arbeitsaufwand bestimmt werden.
  • Gewinnung des Glykoproteins aus der Zellkultur
  • Nach der Polypeptidproduktionsphase wird das interessierende Glykoprotein aus dem Kulturmedium unter Verwendung von Techniken, die einschlägig bekannt sind, gewonnen. Das interessierende Glykoprotein wird vorzugsweise aus dem Kulturmedium als sezerniertes Polypeptid gewonnen, obwohl es auch aus Wirtszelllysaten gewonnen werden kann.
  • Als erste Stufe wird das Kulturmedium oder Lysat zur Entfernung von teilchenförmigen Zellabfällen zentrifugiert. Das Glykoprotein wird danach von kontaminierenden löslichen Proteinen und Polypeptiden gereinigt, wobei die folgenden Verfahren Beispiele für geeignete Reinigungsverfahren sind: Fraktionierung auf Immunaffinitäts- oder Ionenaustauschsäulen; Ethanolfällung; Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie auf Siliciumdioxid oder einem Kationenaustauscherharz, wie DEAE; Chromatofokussierung; SDS-PAGE; Ammoniumsulfatfällung; Gelfiltration unter Verwendung von beispielsweise SEPHADEX G-75TM und Protein-A-SEPHAROSETM-Säulen zur Entfernung von kontaminierenden Stoffen, wie IgG. Ein Proteaseinhibitor, wie Methylsulfonylfluorid (PMSF), kann auch zur Hemmung eines proteolytischen Abbaus während der Reinigung verwendbar sein. Dem Fachmann ist klar, dass für das interessierende Glykoprotein geeignete Reinigungsverfahren eine Modifikation erfordern können, um Änderungen des Charakters des Glykoproteins bei Expression in einer rekombinanten Zellkultur zu berücksichtigen.
  • Von Nutzen im Kontext der vorliegenden Erfindung sind auch Reinigungstechniken und Verfahren, die auf die Kohlehydrate der Erfindung selektieren. Derartige Techniken umfassen beispielsweise Ionenaustausch-Weichgelchromatographie oder HPLC unter Verwendung von Kationen- oder Anionenaustauscherharzen, wobei die stärker saure oder stärker basische Fraktion in Abhängigkeit davon, auf welches Kohlehydrat selektiert wird, gewonnen wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden CHO-Zellen, die ht-PA produzieren können, als Suspension in einem CHO-Medium zu einer vorgegebenen Zelldichte gezüchtet. Die Zellsuspension kann durch Querdurchflussfiltration konzentriert werden. Aktives ht-PA wird anschließend durch die in dem serumfreien Expressionsmedium suspendierten CHO-Zellen produziert. Das auf diese Weise produzierte ht-PA wird durch die CHO-Zellen in das Expressionsmedium sezerniert und kann aus diesem durch Standardtechniken abgetrennt werden.
  • Mehrere Techniken können zur Gewinnung des t-PA verwendet werden. Beispielsweise kann am Ende der Kultur tangentiale Durchflussfiltration, die tangentiale Durchflussfiltration bei hohem Druck umfasst, zur Entfernung des t-PA enthaltenden Mediums von den Zellen verwendet werden.
  • Die Zellkulturüberstände können eingeengt, diafiltriert und auf eine Affinitätssäule, die zur spezifischen Bindung von t-PA fähig ist, typischerweise eine Lysin-Affinitätssäule, geladen werden. Unter den verwendeten Chromatographiebedingungen haftet t-PA selektiv an der Affinitätssäule, von der er gewonnen und einer weiteren Reinigung unterzogen werden kann.
  • In der Diafiltrationsstufe kann der Überstand der Zellkultur an einer Dialysemembran mit einem Dialysepuffer, der Propylenglykol umfasst, diafiltriert werden, die durch Diafiltration erhaltene Lösung auf eine Affinitätssäule, die zur selektiven Bindung von t-PA fähig ist, geladen werden und t-PA von der Affinitätssäule mit einem Puffer bei einem pH-Wert von etwa 5,0 bis etwa 9,0 eluiert werden. Die Affinitätssäule ist vorzugsweise eine Lysin-Affinitätssäule, die vorzugsweise bei einem pH-Wert von etwa 5,0 bis etwa 8,5, noch besser etwa 6,0 bis etwa 8,5 eluiert wird. Lysin-Affinitätssäulen sind einschlägig bekannt und im Handel erhältlich. Geeignete Säulen umfassen Lysine CPGTM (Bioprocessing), ECH Lysine CLTM (Pharmacia) und Lysine Hyper DTM (Biosepra). Das Gel wird vorzugsweise mit einer Lösung von 50 mM Na2HPO4 oder K2HPO4 (pH 7,5) vor dem Laden der t-PA-Lösung equilibriert. Der Elutionspuffer enthält typischerweise 200 mM Arginin und 50 mM Na2HPO4 oder K2HPO4 (pH 7,5). Vorzugsweise enthält der Elutionspuffer zusätzlich Propylenglykol in einer Konzentration von etwa 2,5 bis etwa 20%.
  • Nach den im Vorhergehenden genannten Anfangsreinigungsstufen der Rückgewinnung enthält der Zufuhrstrom, der 0,5 bis 3,0 mg/ml t-PA enthält, gleichzeitig generell etwa 0,05 bis 5 ng/ml DNA, was durch einen DNA-Dot-Blot-Assay unter Verwendung von 32P-markierter DNA, die von der gleichen Zelllinie stammte, bestimmt wurde, was zu einer berechneten Clearance von etwa 2 × 104-fach führt (in Abhängigkeit von der Quelle des Lysinharzes und den verwendeten Waschbedingungen). Zur weiteren Verringerung der DNA-Menge in dem Produkt bis auf weniger als 1 Pikogramm pro humaner Dosis kann eine spezifische Ionenaustauschstufe in das Reinigungsverfahren unter Verwendung von im Handel erhältlichen Ionenaustauschsäulen, wie eine DE-52TM-Säule (Whatman) oder DEAE-SEPHAROSE FAST FLOWTM-Säule (Pharmacia), eingearbeitet werden.
  • Das Reinigungsprotokoll umfasst ferner zusätzliche Stufen, die Retroviren, die potentiell in dem Zellkulturfluidum kontinuierlicher Säugerzelllinien vorhanden sein können, inaktivieren und/oder entfernen. Eine signifikante Zahl von Virusclearancestufen sind verfügbar, wobei diese zusätzliche Ultrafiltrations-/Diafiltrationsstufen, eine Behandlung mit Chaotropen, wie Harnstoff oder Guanidin, extreme pH-Bereiche, Detergentien, Hitze, chemische Derivatisierung, wie Formaldehyd, Proteasen, herkömmliche Abtrennung, wie Ionenaustausch- oder Größenausschlusschromatographie, organische Lösemittel und dergleichen umfassen. Die spezielle Stufe bzw. die speziellen Stufen, die zur Virusentfernung gewählt werden, sind kein kritischer Aspekt bzw. keine kritischen Aspekte der vorliegenden Erfindung und sie müssen die folgenden Kriterien für t-PA erfüllen: 1. t-PA muss unter den Behandlungsbedingungen stabil sein, während das Zielvirus für die Behandlung empfindlich sein muss; und 2. das "Clearancefenster" muss maximal sein. Das "Clearancefenster" ist für diesen Zweck als das Verhältnis des Anfangsvirustiters (Spike) in dem Prozessfluidum vor der Behandlung zum Virustiter nach der Behandlung des Prozessfluidums definiert.
  • Der rekombinante humane t-PA, der nach dem im Vorhergehenden angegebenen Protokoll gewonnen und gereinigt wurde, ist typischerweise mindestens etwa 97–99,9% rein (in Abhängigkeit vom Lysinharz). Falls nötig, kann eine weitere Reinigung durch zusätzliche Stufen, wie Kationenaustauschchromatographie, erreicht werden. Entsprechend ist das Produkt für therapeutische Anwendungen geeignet. Verschiedene Varianten von nativem humanem t-PA können durch im Wesentlichen das gleiche Verfahren gereinigt werden und andere Glykoproteine können durch Verfahren, die für deren Wildtyp-Gegenstücke verwendet werden, unter Verwendung von einschlägig bekannten Verfahren gereinigt werden.
  • Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden, nicht beschränkenden Beispiele weiter erläutert. Es ist anzumerken, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung in gleicher Weise für die Produktion anderer Glykoproteine mit mehr als einer Glykoform in Säugerzellkulturen verwendbar ist und dass die Modifikationen, die im Laufe der Anpassung der als Beispiele angegebenen Verfahren zur Produktion verschiedener Glykoproteine notwendig werden können, dem Fachmann üblicher Erfahrung geläufig sind.
  • Beispiel 1
  • Temperaturverschiebung bei der Produktion von rht-PA
  • Materialien und Verfahren
  • CHO-Zellen: Die CHO-Zelllinie, die als die Säugerwirtszelllinie verwendet wird, stammte von CHO-K1 (ATCC Nr. CCL61 CHO-K1) und sie ist eine mutierte, Dihydrofolatreduktase(DHFR–)-defiziente CHO-K1-Zelllinie der Bezeichnung CHO-K1 DUX-B11 (DHFR–) (erhalten von Dr. L. Chasin der Columbia University; Simonsen und Levinson, aaO; Urlaub und Chasin, aaO).
  • PS-20-Basismedium: Die Komponenten dieses Mediums sind in der folgenden Tabelle 1 aufgelistet. Tabelle 1
    Komponente Konzentration (mg/l)
    wasserfreies Calciumchlorid 116,61
    Kupfer(II)sulfatpentahydrat 0,0012
    Eisen(III)nitratnonahydrat 0,05
    Eisen(II)sulfatheptahydrat 0,417
    Kaliumchlorid 759,0
    wasserfreies Magnesiumsulfat 48,835
    wasserfreies Magnesiumchlorid 143,05
    monobasisches Natriumphosphatmonohydrat 62,5
    wasserfreies dibasisches Natriumphosphat 71,02
    Zinksulfatheptahydrat 0,4315
    Linolsäure 0,294
    Liponsäure (DL-Thioctansäure) 0,735
    Putrescindihydrochlorid 0,5635
    Natriumpyruvat 385,0
    Alanin 31,15
    Argininmonohydrochlorid 780,5
    Asparginmonohydrat 52,53
    Asparginsäure 46,55
    Cysteinmonohydrochloridmonohydrat 122,92
    Cystindihydrochlorid 31,285
    Glutaminsäure 51,45
    Glutamin 1606,0
    Histidinmonohydrochloridmonohyrat 94,36
    Isoleucin 66,29
    Leucin 98,35
    Lysinmonohydrochlorid 200,75
    Methionin 30,68
    Phenylalanin 50,36
    Prolin 120,75
    Serin 57,75
    Threonin 89,15
    Tryptophan 15,14
    Tyrosindinatriumsalzdihydrat 79,125
    Valin 87,95
    Biotin 0,0256
    D-Calciumpantothenat 3,68
    Cholinchlorid 50,86
    Cyanocobalamin (B12) 4,76
    Folsäure 6,55
    i-Inosit 66,60
    Nicotinamid 2,1295
    Pyridoxalmonohydrochlorid 2,000
    Pyridoxinmonohydrochlorid 0,217
    Riboflavin 0,3330
    Thiaminmonohydrochlorid 3,190
    Glucose 4301,0
    Natriumbicarbonat 2440,0
    Natriumchlorid 5900,0
    Pluronic F-68 Prill 1000,0
    HEPES 2383,0
    Phenol Red 8,10
  • Der Einfachheit halber können die festen Bestandteile des Mediums mit den Aminosäuren zusammen kombiniert werden und dieses Gemisch als eine Einheit aufbewahrt werden.
  • Typ-I/Typ-II-t-PA-Assay:
    • 1. Auftauen von Zellkulturüberstandsprobe (bei gesamter Nährlösung Abschleudern der Zellen in der Zentrifuge)
    • 2. Zugabe von 2 μl frisch aufgetautem Plasminogen zu 400 μl Probe.
    • 3. Inkubieren bei 37°C während 60 min.
    • 4. Zugabe von 20 μl frisch aufgetautem 1 M DTT und 400 μl 8 M Guanidin-HCl/50 mM TRIS 3,2 mM EDTA-Lösung.
    • 5. Inkubation bei 37°C während 15 min.
    • 6. Übertragen in Ampulle und Laden von 250 μl für den Assay auf HP1090TM-HPLC unter Verwendung der folgenden Bedingungen: ZORBAXTM-C8-Säule bei 40°C; Überwachen der eluierenden Stoffe durch Fluoreszenz (Anregung bei 275 nm, Emission bei 340 nm); Durchführen des im Folgenden angegebenen Verfahrens von 70 min an jeder Probe, wobei das Elutionsmittel A 0,1%ige Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser ist und das Elutionsmittel B 0,1%ige TFA in Acetonitril ist: 0 bis 5 min – 75% A (und 25% B) 5 bis 35 min – linearer Gradient von 75% A bis 60% A 35,1 bis 45 min – 0% A 45 min bis 70 min – 75% A zur Reequilibrierung der Säule
  • Die Typ I/Typ II-Fragmente eluieren nach etwa 25 min und die Peakflächen werden zur Bestimmung der relativen Mengen integriert.
  • Protokoll
  • Rekombinante, ht-PA produzierende CHO-Zellen werden in Spinner-Kolben, die alle 3 oder 4 Tage durchgeleitet werden, (mit einer Dichte von 0,1% gepacktem Zellvolumen (PCV)) in einem selektiven Medium (PS-20-Basismedium, das mit 500 mM Methotrexat, 10 mg/l rekombinantem humanem Insulin (rh-Insulin), 0,1 ml/l Spurenelementen und 0,05 ml/l Lipid-Ethanol ergänzt ist) gehalten. Ausreichend Kultur wurde zum Säen von 15 ml Medium mit 0,2% PCV entfernt und in ein steriles Falcon-Röhrchen von 50 ml gegeben. Die Kultur wurde 10 min mit 700–1000 rpm zentrifugiert und der Überstand wurde abgegossen. Nach Zugabe von 15 ml frischem selektivem Medium wurde die Kultur zum Resuspendieren der Zellen sanft gerührt. 5 ml Kultur wurden in drei T-25-Kolben (25-cm2-T-Kolben) gegeben. Die Kappen wurden locker belassen, um eine Equilibrierung mit der Inkubatoratmosphäre zu ermöglichen, und die Kolben wurden in einen Inkubator von 33°C oder 31°C mit 5% Kohlendioxid gegeben. Nach Inkubation von 5 bis 8 Tagen wurden die Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers oder durch Überprüfen des gepackten Zellvolumens gezählt und die Lebensfähigkeit unter Verwendung von Trypanblau überprüft. Die Kultur wurde aus den Kolben entfernt, 10 min mit 2000–2200 zentrifugiert und der Überstand wurde auf rht-PA-Glykosylierung getestet. Alternativ zu den T-25-Kolben wurden die Zellen unter Verwendung von 60-mm-Zellkulturplatten in dreifacher Ausführung kultiviert.
  • Die Überstände wurden bei –20°C oder –70°C eingefroren, bis die Typ I/II-t-PA-Analyse stattfand.
  • Für Spinnerexperimente wurde das im Vorhergehenden genannte Protokoll verwendet, wobei jedoch die Zellen in 200 ml frisches Medium (mit einem Anfangs-PCV von 0,1%) in einen 250-ml-Spinnerkolben überführt wurden. Die Kappen wurden auf den Kolben fest verschlossen und diese wurden dann in den Inkubator von 33°C oder 31°C auf einer Magnetrührplatte mit 60 rpm gegeben.
  • Die Minifermenterexperimente wurden unter Standard-t-PA-Produktionsbedingungen im Zufuhrchargenmodus, der hierin angegeben ist, in 5-l-Rührtankbioreaktoren (Applikon, Foster City, CA) durchgeführt. Die Temperatur wurde am Tag 2 der Produktionsphase auf 33°C oder 31°C verschoben.
  • Für Kontrollexperimente wurden die im Vorhergehenden genannten Experimente verfolgt, wobei jedoch die Inkubation bei 37°C stattfand. Ferner wurden Experimente wie oben in 12-K-Fermentern über einen Verlauf von 200 h durchgeführt und der Prozentgehalt von Typ-I-t-PA wurde festgestellt.
  • Für die hierin und im Folgenden verwendeten Experimente wurden die Kulturbedingungen üblicherweise am Tag 1 (beispielsweise Zugabe von verschiedenen Mediumkomponenten) und Tag 2 (beispielsweise Temperaturverschiebung) geändert.
  • Ergebnisse
  • Die Besetzung der t-PA-Stelle an Asn-184 wurde über eine Vielzahl von Maßstäben (T-Kolben, Spinner und 80-l-, 400-l-, 2000-l- und 12000-l-Fermenter) (2) und von Versuch zu Versuch bei der Produktion als relativ konsistent ermittelt. Die Faktoren, die die Stellenbesetzung beeinflussen können, umfassen die Faktoren, die die Oligosaccharid-Dolichol-Verfügbarkeit beeinflussen (Dolicholphosphat, Lipide und Hormone), Faktoren, die die Proteintranslationsverlängerungsrate beeinflussen (beispielsweise Cyclohexamid), Faktoren, die Oligosaccharyltransferaseaktivität oder Proteinfaltungsrate beeinflussen (beispielsweise Dithiothreit), und Faktoren, die durch unbekannte Mechanismen wirken, beispielsweise die Dauer der Kultur. Als Erläuterung des letzten Phänomens zeigt 3 Diagramme des Prozentgehaltes von humanem t-PA des Typs I in Zellkulturen von CHO-Zellen bei 37°C als Funktion der 12K-Fermentationsversuchszeit, wobei jede Diagrammlinie für einen anderen Versuch steht. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Stellenbesetzung im Laufe einer Chargenkultur (über die Kulturlänge) zunimmt.
  • Die 4 zeigt, dass eine Verringerung der Temperatur die t-PA-Stellenbesetzung erhöht. Insbesondere zeigt die 4A die Ergebnisse von Experimenten im Labormaßstab, die 5–7 Tage durchgeführt wurden (T-Kolben und Spinnerkolben). In den Kontrollexperimenten, wobei die Temperatur in der Produktionsphase bei 37°C blieb, enthielt das Produkt etwa 38% Typ-I-t-PA. Im Gegensatz dazu enthielt in den Experimenten, wobei die Temperatur in der Produktionsphase auf 33°C gesenkt wurde, das erhaltene t-PA-Produkt etwa 43–46% Typ-I-t-PA. 4B zeigt die Ergebnisse von Bioreaktorexperimenten, die zeigen, dass die niedrigere Temperatur in ähnlicher Weise einen höheren Prozentgehalt von Typ-I-t-PA ergibt.
  • Beispiel 2
  • Butyratzugabe bei der Produktion von rht-PA
  • Materialien und Verfahren
  • Die Zellmenge, die für eine Saatdichte von 0,2% gepacktem Zellvolumen notwendig war, wurde mit etwa 700 × g 10 min zentrifugiert und in 25-cm2-T-Kolben in dem geeigneten frischen Medium für jeden Testfall resuspendiert. Die T-Kolben wurden in dreifacher Ausführung mit 5 ml in jedem Kolben eingerichtet und 3 bis 4 Tage bei 37°C und 95% Luft/5% CO2 inkubiert. Natriumbutyrat wurde bis zu einer Konzentration von 0,375 mM, 0,75 mM oder 1,5 mM zum Inokulationszeitpunkt für die 25-cm2-T-Kolben zugegeben. Zellen wurden auch in Spinnerkolben mit Volumina von 100 ml mit ähnlichen Butyratkonzentrationen wie die T-Kolben-Fälle kultiviert. Für Fermenterexperimente wurde Butyrat am zweiten Tag des Experiments zugegeben. T-Kolben-Kulturen wurden ebenfalls bei 33°C und 37°C ohne Butyratzugaben durchgeführt. Die für die T-Kolbenkulturen bei 33°C angegebenen Daten stammen aus zwei dreifachen Experimenten (n = 6). Die t-PA-Stellenbesetzung wurde unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 1 analysiert.
  • Ergebnisse
  • 5 zeigt, dass das Vorhandensein von Natriumbutyrat mit Konzentrationen von 0,375 bis 1,5 mM zum Inokulationszeitpunkt die t-PA-Stellenbesetzung in dem T-Kolben bei 37°C erhöhte. Die gleiche erhöhte Wirkung wurde für die Spinnerkolben- und Fermenterexperimente beobachtet.
  • 6 zeigt, dass für die 60-mm-Kulturplattenexperimente Temperaturverschiebungen auf 33°C und 31°C die größte Wirkung und eine erhöhte t-PA-Stellenbesetzung, stufenweise bis zu 6% zeigten. 0,75 mM Butyrat erhöhte den Typ-I-Gehalt im Vergleich zu keinem Butyrat leicht (etwa 1%) (6). Im Gegensatz dazu verringerte eine weitere Erhöhung der Butyratkonzentration (1,5 mM) die Stellenbesetzung bei 37°C und 33°C, erhöhte sie jedoch bei 31°C (6).
  • 7 zeigt die Wirkung von Temperatur und Butyrat auf die t-PA-Stellenbesetzung in 5-l-Bioreaktoren. Der Typ-I-Gehalt wurde an den Tagen 5–7 analysiert. Eine Verringerung der Temperatur von 37°C auf 33°C erhöhte die t-PA-Stellenbesetzung. Jedoch verringerte eine Erhöhung der Butyratkonzentration von 0,75 auf 1,5 mM den Typ-I-Gehalt bei beiden Temperaturen. Dies bestätigt die in 60-mm-Plattenexperimenten erhaltenen Daten (siehe 6).
  • Beispiel 3
  • Zugabe von Zellzyklusinhibitor bei der Produktion von rht-PA
  • Einführung
  • Es wurde ermittelt, dass eine Temperaturverringerung, die Kulturlänge und eine Butyratzugabe die Glykosylierung von t-PA an der Asn-184-Stelle erhöhen, was in den Beispielen 1 und 2 festgestellt wurde. Alle diese Faktoren entsprechen einer verringerten Zellwachstumsrate, was zu der Hypothese führt, dass die Glykosylierung und Stellenbesetzung zellzyklusabhängig sind. Diese Hypothese wurde dadurch getestet, dass zwei weitere Experimente, die in diesem Beispiel angegeben sind, unter Verwendung von Zellzyklusinhibitoren (Chinidin und Thymidin) durchgeführt wurden.
  • Materialien und Verfahren
  • Zellen wurden wie für das in Beispiel 2 beschriebene Natriumbutyratexperiment kultiviert. Thymidin wurde in Wasser gelöst und für eine 33–36X-Stammlösung sterilfiltriert. Chinidin wurde in Dimethylsulfoxid (DMSO) zubereitet und filtriert, um ein 1000–1800X-Stammmaterial herzustellen. Thymidin und Chinidin wurden zu den Kulturen zum Inokulationszeitpunkt bis zu Endkonzentrationen von 250 μg/ml bzw. 90 μM zugegeben. Die t-PA-Stellenbesetzung wurde unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 1 analysiert.
  • Ergebnisse
  • Die Zellzyklusanalyse für die Kontrolle, das Chinidin und das Thymidin, die durch das Modell F ANI T3.MOD bestimmt wurde, ist in Tabelle 2 angegeben.
  • Tabelle 2 Zellzyklusanalyse
    Figure 00500001
  • 8 zeigt, dass die Stellenbesetzung und die Zellzyklusposition in ähnlicher Weise über die Zeit in einer Kultur variieren. Die 9 zeigt, dass Chinidin die Zellen in der G0/G1-Phase (mit 67% in der G0/G1-Phase) blockiert und zu einer erhöhten Stellenbesetzung im Vergleich zur Kontrolle ohne einen Zellzyklusinhibitor (54% in der G0/G1-Phase) führt und Thymidin eine Ansammlung der Zellen in der S/G2-Phase (mit 33% in der G0/G1-Phase) bewirkt und zu einer verminderten Stellenbesetzung im Vergleich zur Kontrolle führt. Diese Ergebnisse bestätigen, dass Faktoren, die den Anteil von Zellen in der G0/G1-Phase erhöhen, die Stellenbesetzung erhöhen.
  • Beispiel 4
  • Zugabe von zweiwertigem Metallkation, Nucleotidzuckervorläufer und Hormon bei der Produktion von rht-PA
  • Materialien und Verfahren
  • Alle Experimente wurden in 60-mm-Kulturschalen unter Verwendung des Verfahrens gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 durchgeführt, wobei jedoch ein Mn-Salz, Fe-Salz, ein Nucleotidzuckervorläufer oder ein Hormon zu dem Wachstumsmedium während der Wachstumsphase gegeben wurden, wobei ein Mn- oder Fe-Salz oder ein Nucleotidzuckervorläufer am Tag 1 zugesetzt wurden. Alle Platten wurden mit einer Saatdichte von 0,1% PCV mit einem Arbeitsvolumen von 6–8 ml beimpft. Alle Fälle wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt. Die Platten wurden bei 37°C in CO2-Inkubatoren inkubiert.
  • Die Mengen von MnCl2 oder Eisen(III)-citrat in dem Wachstumsmedium während der Wachstumsphase wurden erhöht. Für MnCl2 war 3 nM die Kontrolle, mit zunehmenden Mengen von MnCl2 mit Konzentrationen von 10 nM, 100 nM, 1 μM, 10 μM und 100 μM. Für Eisen(III)-citrat war die Kontrolle kein Salz, mit zunehmenden Mengen bei 10, 50 und 100 μM.
  • Die Mengen von Uridin, Adenosin und Guanosin betrugen jeweils 0,5 mM und die Menge von Mannose betrug 5 g/l (Guanosin und Mannose wurden kombiniert) und -GHT ist ein selektives Medium minus Glycin, Hypoxanthin und Thymidin.
  • Die Mengen von Triiodthyronin und Thyroxin, die in dem Kulturmedium verwendet wurden, waren gegenüber einer Kontrolle ohne Hormon mit Mengen von 1 nM, 10 nM oder 100 nM Triiodthyronin oder 1 nM, 10 nM oder 100 nM Thyroxin erhöht.
  • Die t-PA-Stellenbesetzung wurde an den Tagen 4–6 (Mangan-, Eisen- oder Nucleotidzuckervorläuferexperiment) oder am Tag 7 (Hormone) unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens analysiert.
  • Ergebnisse
  • Die Wirkung einer Erhöhung der Mangankonzentration auf die t-PA-Stellenbelegung (dreifache Versuche) ist in den 10A und 10B angegeben. Eine Ergänzung des Mediums mit zusätzlichem Mangan über den Kontrollwert von 3 nM erhöhte den t-PA-Typ-I-Gehalt (verbesserte Stellenbesetzung) signifikant etwa 2,5%. Eine positive Titrationswirkung wurde zwischen 3 nM und 100 nM beobachtet. Keine weitere Verbesserung trat auf, wenn die Konzentration auf 100 μM erhöht wurde, was immer noch eine wirksame Konzentration ist.
  • Oligosaccharyltransferase benötigt Mn2+-Ionen für maximale Aktivität, doch unterstützen zweiwertige Metallkationen mit einer oktaedrischen Koordinationsgeometrie, die Mg, Ca und Fe umfassen, eine Übertragung, wenngleich mit verringerten Raten (Hendrickson und Imperiali, aaO, und Kaufman et al., aaO). Daher wurde die Wirkung von Fe2+ auf die t-PA-Stellenbesetzung untersucht. Wie aus 11 ersichtlich ist, erhöhte die Zugabe von 10–100 μM Fe2+ (Eisen(III)-citrat) die t-PA-Stellenbesetzung stufenweise bis etwa 4%.
  • Ein Erhöhen der Verfügbarkeit von Nucleotidzuckervorläufern (beispielsweise Nucleosiden, Mannose, Glycin, Thymidin oder Hypoxanthin) verbesserte die Stellenbesetzung nicht. Darüberhinaus verringerte die Zugabe von Uridin und Guanosin die t-PA-Stellenbesetzung etwa 2% (siehe 12).
  • Die Wirkung von Schilddrüsenhormonen (Thyroxin und Triiodthyronin) auf die t-PA-Stellenbesetzung ist in den 13A und 13B angegeben. Diese Hormone erhöhten die Stellenbesetzung etwa 2% und es wird angenommen, dass andere Plasmakomponenten, die oben definiert sind, in ähnlicher Weise eine derartige Wirkung aufweisen.
  • Folglich wurden mehrere Kulturbedingungen, die die t-PA-N-Glykosylierungsstellenbesetzung beeinflussen, identifiziert. Diese Faktoren sind potentiell zur weiteren Verbesserung der Produktkonsistenz verwendbar. Die t-PA-Stellenbesetzung an Asn-184 ist über eine Vielzahl von Bedingungen, die eine Vielzahl von Maßstäben (T-Kolben, Spinner, 80 l, 400 l, 2000 l und 12000 l) umfassen, und von Versuch zu Versuch bei der Produktion relativ konsistent. Faktoren, die den Anteil von Zellen in der G0/G1-Phase erhöhen, wie die Temperatur, Butyrat und Zellzyklusinhibitoren, erhöhen die Stellenbesetzung, wie dies auch erhöhte Mengen bestimmter zweiwertiger Metallkationen und/oder Plasmakomponenten, die vorzugsweise während der gesamten Kultivierungsdauer vorhanden sind, tun.
  • Die gesamten Offenbarungen aller in der Beschreibung angegebenen Verweisstellen und die darin angegebenen Fundstellen sind hierdurch ausdrücklich als Bezug aufgenommen.
  • Obwohl das Vorhergehende spezielle bevorzugte Ausführungsformen betrifft, ist selbstverständlich, dass die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt ist. Dem Fachmann ist klar, dass verschiedene Modifikationen ohne Abweichen vom Gesamtkonzept der Erfindung durchgeführt werden können. Alle derartigen Modifikationen sollen im Umfang der vorliegenden Erfindung enthalten sein.

Claims (6)

  1. Verfahren zur Herstellung von humanem Gewebe-Plasminogenaktivator (t-PA), das das Kultivieren von Chinese Hamster Ovary-Zellen, die für den t-PA codierende Nucleinsäure exprimieren, in einem serumfreien Medium in einer Produktionsphase bei einer Temperatur zwischen 30°C und 35°C umfasst, wobei das Verfahren ein erhöhtes Verhältnis von Typ-I-t-PA-Molekülen zu Typ-II-t-PA-Molekülen, bezogen auf ein identisches Verfahren, das bei 37°C durchgeführt wird, produziert.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Medium in der Produktionsphase bis zu 2 mM eines Butyratsalzes umfasst und wobei das Verfahren ein erhöhtes Verhältnis von Typ-I-t-PA-Molekülen zu Typ-II-t-PA-Molekülen, bezogen auf ein identisches Verfahren, das in Abwesenheit von Butyrat durchgeführt wird, produziert.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Butyratsalz in einer Konzentration von 0,35 bis 2 mM vorhanden ist.
  4. Verfahren zur Herstellung von humanem Gewebe-Plasminogenaktivator (t-PA), das das Kultivieren von Chinese Hamster Ovary-Zellen, die für t-PA codierende Nucleinsäure exprimieren, in einem serumfreien Medium in einer Wachstumsphase bei einer Temperatur von 37–40°C, wobei das Medium 10 nM bis 100 μM eines zweiwertigen Metallkations, das eine oktaedrische Koordinationsgeometrie annehmen kann und diese bevorzugt, umfasst; das Kultivieren der Zellen in einer Übergangsphase bei einer Tempe ratur von 37–40°C; und das Kultivieren der Zellen in einer Produktionsphase, wobei nach 48 h in die Produktionsphase die Temperatur auf zwischen 30°C und 35°C gesenkt wird und 0,75 bis 1,5 mM eines Butyratsalzes zu dem Medium gegeben werden, umfasst, wobei das Verfahren ein erhöhtes Verhältnis von Typ-I-t-PA-Molekülen zu Typ-II-t-PA-Molekülen, bezogen auf ein identisches Verfahren, das bei 37°C in Abwesenheit eines Butyrats oder des Kations durchgeführt wird, produziert.
  5. Verfahren nach an Anspruch 4, wobei eine Plasmakomponente oder ein Zellzyklusinhibitor, der Zellen in der G0/G1-Phase blockiert, zu dem Kulturmedium vor oder während der Wachstumsphase gegeben wird.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei Thyroxin, Triiodthyronin oder Chinidin zu dem Kulturmedium gegeben wird.
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