NL8003402A - Nieuwe plasminogeen-activator en farmaceutisch preparaat met trombolytische werking. - Google Patents

Nieuwe plasminogeen-activator en farmaceutisch preparaat met trombolytische werking. Download PDF

Info

Publication number
NL8003402A
NL8003402A NL8003402A NL8003402A NL8003402A NL 8003402 A NL8003402 A NL 8003402A NL 8003402 A NL8003402 A NL 8003402A NL 8003402 A NL8003402 A NL 8003402A NL 8003402 A NL8003402 A NL 8003402A
Authority
NL
Netherlands
Prior art keywords
plasminogen activator
activator
purification
plasminogen
agarose
Prior art date
Application number
NL8003402A
Other languages
English (en)
Original Assignee
Leuven Res & Dev Vzw
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=19835452&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NL8003402(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Leuven Res & Dev Vzw filed Critical Leuven Res & Dev Vzw
Priority to NL8003402A priority Critical patent/NL8003402A/nl
Priority to JP8942081A priority patent/JPS5728009A/ja
Priority to DE8181200643T priority patent/DE3176876D1/de
Priority to EP81200643A priority patent/EP0041766B1/en
Publication of NL8003402A publication Critical patent/NL8003402A/nl
Priority to US06/867,561 priority patent/US4752603A/en
Priority to JP62107927A priority patent/JPS62289182A/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
    • Y10S530/828—Cancer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

Br/lh/31
Nieuwe plasminogeen-activator en farmaceutisch, preparaat met trombolytische werking.
De uitvinding betreft een uit celculturen geïsoleerde, nieuwe plasminogeen-activator die op relatief grote schaal kan worden bereid. Tevens betreft zij een methode voor zuivering en isolering van deze activator, en verder een 5 farmaceutisch preparaat met trombolytische werking, dat een dergelijke plasminogeen-activator bevat en dat toepassing kan vinden bij de therapeutische behandeling van bloedstol-lingsstoornissen, in het bijzonder trombo-.embolische ziekten.
Het is bekend, dat.na operaties, bevallingen, 10 ernstig letsel en infectieziekten vaak grote kans op trombose, dat wil zeggen de vorming van intravasculaire bloedstolsels, bestaat. 2fen kan deze stolsels trachten te voorkomen door het toedienen van anticoagulantia, zoals heparine, cumarine-derivaten, slangengifcomponenten, of indaandiol. Is echter 15 eenmaal trombose opgetreden, dan kan men gebruik maken van trombolytische middelen die ten doel hebben het gevormde bloedstolsel door oplossen (lysis) uit de bloedvaten te verwijderen.
Tot goed begrip van het navolgende wordt opgemerkt, 20 dat bloedstolsels bestaan uit fibrine, dat onder invloed van het enzym trombine uit fibrinogeen is gevormd.. Normaal bloed bevat plasminogeen, dat na activering tot piasmine in staat is fibrine te doen oplossen en enzymatisch te splitsen. Ook een activator voor plasminogeen is van nature in normaal 25 bloed aanwezig of wordt daaraan afgegeven, zodat het stromende bloed in principe alle ingrediënten bevat die nodig zijn om een eenmaal gevormd intravasculair bloedstolsel af te breken en te verwijderen. In de praktijk blijkt echter dat het eigen trombolytische vermogen van.het lichaam vaak onvol-30 doende is voor dit doel,, hetgeen tenminste voor een deel kan worden toegeschreven aan een te geringe concentratie aan plasminogeen-activator in het bloed. Dit betekent dat men voor een doeltreffende verwijdering van intravasculaire 800 34 02 »- t -2- bloedstolsels zijn toevlucht moet nemen tot trombolytische middelen die van buitenaf worden ingebracht.
Als trombolytische middelen worden totnutoe vooral urokinase, een uit urine of gekweekte niercellen geisoleerde 5 plasminogeen-activator, en streptokinase, een plasminogeen-activator uit streptococcen, gebruikt. Beide stoffen kunnen op relatief grote schaal worden bereid en worden momenteel veelvuldig toegepast. Aangezien urokinase en streptokinase echter verschillen van de normale plasminogeen-activator uit 10 bloed, en aangezien zij: geen specifieke affiniteit voor fibrine hebben, zijn de resultaten van urokinase en streptokinase bij de trombosebestrijding niet in alle opzichten bevredigend. Ken heeft relatief grote doses van deze middelen nodig ter bereiking van het gewenste effekt en daarbij 15 bestaat groot gevaar voor neveneffekten. in de vorm van fibri-nogenolyse en inwendige bloedingen. Er blijft dus behoefte bestaan aan middelen en actieve stoffen met trombolytische werking, die eveneens op relatief grote schaal zijn te produceren en waarmee trombose doeltreffender kan worden be-2Q streden.
De uitvinding beoogt een plasminogeen-activator te verschaffen die sterke verwantschap met de normale plasminogeen-activator . uit bloed vertoont en die op relatief grote schaal kan worden gewonnen. Daarnaast beoogt zij zuiverings-25 methoden voor een dergelijke plasminogeen-activator te verschaffen. Verder beoogt zij een preparaat met trombolytische werking te bereiden, dat op ruime schaal beschikbaar is en waarmee trombose op doeltreffender wijze dan voorheen kan worden bestreden.
3Q Bij onderzoekingen die aan de uitvinding ten grond slag lagen, is nu verrassenderwijs gevonden, dat een plasminogeen-activator, die sterk gelijkt op de plasminogeen-activator uit bloed, in redelijk goede hoeveelheden kan worden geïsoleerd uit de cultuurvloeistof van menselijke raelanoma-35 cellen. Kelanoma-cellen zijn gepigmenteerde tumorcellen, die als celcultures continu kunnen worden voortgekweekt en daarbij relatief veel plasminogeen-activator afscheiden. Dit opent derhalve de mogelijkheid, de door de cellen afgeschei- 800 34 02 * * -3- • · den plasminogeen-activator op relatief grote schaal te bereiden. De verkregen activator blijkt in diverse opzichten sterk verwant te zijn aan de activator uit bloed, maar minder • sterk verwant aan de bekende stoffen urokinase en strepto-5 kinase, hetgeen gunstige perspectieven biedt voor de toepassing in farmaceutische preparaten. Bij proeven met de nieuwe activator blijkt inderdaad een sterke trombolytische werking op te treden, waarbij men met kleinere doses dan bij urokinase kan volstaan, en blijken nevenwerkingen vrijwel afwezig 10 te zijn. Hieruit volgt, dat preparaten uit de nieuwe activator met goed gevolg toepassing kunnen vinden bij de therapeutische behandeling van tromboseverschijnselen.
De uitvinding verschaft dan ook in de eerste plaats een plasminogeen-activator uit menselijke melanoma-cellen.
15 Verder verschaft zij een farmaceutisch preparaat met trombo-lytische werking, dat een doeltreffende hoeveelheid van deze plasminogeen-activator bevat. Daarnaast verschaft de uitvinding werkwijzen voor de bereiding en zuivering van de activator, een werkwijze voor de bereiding van het preparaat, en 20 een werkwijze voor het therapeutisch behandelen van tromboseverschijnselen met het nieuwe preparaat.
Het was wel bekend, dat diverse soorten tumorcellen bij voortkweken in celcultuur een plasminogeen-activator afscheiden (Christman et al, in: Proteinases in Mammalian 25 Cells and Tissues, (ed. A.J. Barrett) pp 91-149, Elsevier, Amsterdam) maar de meeste van deze plasminogeén-activa tors zijn verwant aan urokinase (zie Vetterlein et al, J. Biol.
Chem. 254, 575-578 (1919)), en bovendien zijn zij geen van alle ooit in voldoende hoeveelheid, geïsoleerd. .Het was dan 3Ö ook verrassend dat menselijke melanoraa-cellen. in celcultuur een plasminogeen-activator afscheiden die nauw verwant is aan de activator die in het bloed circuleert, en bovendien in zodanige hoeveelheden dat de activator daaruit op een redelijke schaal gewonnen en gezuiverd kan worden.
35 De plasminogeen-activator volgens de. uitvinding kan worden bereid door voortkweking van menselijke melanoma-cellen in een daarvoor geschikt groeimedium, gevolgd door winnen van de cultuurvloeistof waarin zich. de activator be- 800 3 4 02 -4- • ·« vindt, en zuivering van de gewonnen vloeistof.
Het zuiveren van de gewonnen cultuurvloeistof kan in principe op elke geschikte wijze geschieden en kan elke scheidingsmethode omvatten die in de proteïne-chemie gebruike-5 lijk is, zoals gefraktioneerde precipitatie, bijvoorbeeld met zouten, organische oplosmiddelen of polyethjdeenglycolen, elektroforese met verschillende buffers en dragers, gelfil-tratie over bijvoorbeeld verknoopt dextran, verknoopte of niet verknoopte agarose, verknoopt polyacrylamide, of mengsels 10 daarvan, en andere chromatografische bewerkingen gebaseerd op verdeling of op adsorptie/desorptie. Laatstgenoemde bewerkingen kunnen chargegewijs of in een kolom.worden uitgevoerd. Verdelingschromatografie of adsorptie/desorptie-chromatografie kan bijvoorbeeld geschieden door. ionenuitwis-15 seling, hydrofobe wisselwerking, liganden-uitwisseling of biospecifieke affiniteit. Daarbij kunnen voor de stationaire fase dezelfde media worden gebruikt als voor de gelfiltratie, maar met geschikte groepen aan het inwendige of uitwendige oppervlak van de deeltjes gehecht. Voor de mobiele fase kun-2Q nen waterige buffers worden gebruikt, die diverse toevoegsels kunnen bevatten, zoals anorganische of organische zouten, organische oplosmiddelen, oppervlakte-actieve stoffen en/of stoffen die inwerken op één of meer componenten van het scheidingssysteem.
25 In een voorkeursuitvoering wordt gebruik gemaakt van ligand-uitwisselingschromatografie, bij voorkeur met een metaalchelaat-agarose als stationaire fase. De te zuiveren vloeistof wordt dan bijvoorbeeld bij pH = 7,5 over een kolom zinkchelaat-agarose gevoerd, waarna, de geadsorbeerde 30 plasminogeen-activator met een imidazool-houdende bufferop los sing kan worden geelueerd. Het zinkchelaat-agarose kan worden bereid door iminodiazijnzuur' te koppelen aan agarose en het produkt dan te verzadigen met zinkchloride. Gebruik van een kolom geeft betere resultaten dan een discontinue 35 méthode.
In een andere voorkeursuitvoering, naast of in plaats van de voorgaande, maakt men gebruik, van affiniteits-chromatografie, bij voorkeur met lectine-agarose als statio- 800 34 02 -5- naire fase. De te zuiveren vloeistof wordt dan bijvoorbeeld bij pH 7,5 over een kolom lectine-agarose gevoerd, waarna de geadsorbeerde plasminogeen-activator wordt geelueerd bij dezelfde pH met een buf feroplossing die ^-D-methylmannos!.ide 5 en kaliumthiocyanaat bevat.
Een derde voorkeursuitvoering, die meestal als laatste trap wordt toegepast, is gelfiltratie, bij voorkeur over verknoopte dextrandeeltjes.
Het verdient aanbeveling bij deze zuiveringsmetho-.10 den aan alle gebruikte bufferoplossingen een oppervlakte- actieve stof, c.q. reinigingsmiddel, toe te voegen, teneinde een sterke neiging van de plasminogeen-activator tot hechten aan glasoppervlakten tegen te gaan.
Door gebruik van de beschreven zuiveringsmethoden 15 kan een goede zuivering en een duidelijke verhoging van de specifieke activiteit worden verkregen,rzodat het gezuiverde produkt geschikt voor identificatieproeven en verwerking tot een farmaceutisch preparaat.
De verkregen plasminogeen-activator uit melanoma-2Q cellen blijkt in ongereduceerde vorm een molecuulgewicht van circa 72.000 te hebben, bepaald met SDS-polyacrylamide-gel-elek-troforese, en in gereduceerde vorm twee banden met molecuulgewichten van resp. circa 33.000. en circa 39.000 te vertonen, eveneens bepaald met SDS-polyacrylaroidegel-25 elektroforese, Verder blijkt hij een sterke binding aan fibrine te vertonen. De aminozuursamenstelling wordt gegeven in de navolgende tabel 1. Door al deze eigenschappen gelijkt de nieuwe plasminogeen-activator sterk, op de normale plasminogeen-activator uit menselijk bloed.
30 In immonologisch opzicht blijkt de nieuwe activa tor te verschillen van urokinase.
Bij proeven met in vitro opgewekte bloedstolsels blijkt de plasminogeen-activator uitmelanoma-cellen een grotere fibrinolytische en trombolytische werking dan uroki-35 nase te hebben en tevens een geringere fihrinogenolytische nevenwerking. Dit wijst erop dat de nieuwe plasminogeen-activator beter dan urokinase geschikt is voor toepassing als trombolytisch preparaat.
λ λ λ -7 / üi-t de gezuiverde plasminogeen-activator kan op 8 0 0 o 4 -6- gebruikelijke wijze een galenisch preparaat worden gemaakt, met of zonder gebruik van toevoegsels zoals natriumchloride, glucose, mannitol, alburaine/βη dergelijke. Meestal zal het preparaat geschikt zijn voor parenterale toediening, waaronder 5 intraveneuze of intra-artêriële injectie of infusie.
Het verkregen preparaat kan in een geschikte dosis aan patiënten worden toegediend en zal dan een .krachtige en doeltreffende trombolytische werking uitoefenen, met weinig of geen nevenwerkingen. Het preparaat kan daarom worden 10 gebruikt ter genezing van acute en chronische trombo-emboli-sche occlusies van diverse vasculaire bevloeiingsgebieden, zoals die voorkomen bij adertrombose, pulmonaire. emboibie, myocardiale infarcten, arteriële occlusie, extracorporale circulatie en arterioveneuze shunt.
15 De uitvinding wordt nader verduidelijkt door de volgende voorbeelden, waarin ook proeven ter karakterisering van de nieuwe activator zijn opgenomen.
Voorbeeld I Kweken en winnen.
20 Een menselijke melanoma-cellijn (patiënt Bo.) werd verkregen van Dr. D.B. Rifkin, Rockefeller üniversiteit, New York, N.Y., Ü.S.A. Het voor deze cellijn gebruikte groei-medium bestond uit gemodificeerd “Eagle's essential medium" (Flow Laboratories, Engeland).,, aangevuld met natriumbicar-25 bonaat (16 ml 6,5 %'s oplossing per liter medium)., L-gluta-mine (10 ml 2Q0 mM oplossing per liter medium) en door warmte geïnactiveerd pasgeboren kalverserum (Gibco, Paisley, Engeland), (eindconcentratie 10%).
De melanoma-cellen werden in het bovenstaande 30 groeimedium voortgekweekt tot het stadium van confluente monolagen. Daarna werden zij gewassen met groeimedium zonder kalverserum en drie dagen in hetzelfde serumvrije groeimedium geincubeerd. Na elke dag werd de cultuurvloeistof verzameld, 20 minuten bij 7000 g gecentrifugeerd en daarna bij. -20°C 35 bewaard totdat zij gebruikt werd. De gecombineerde cultuurvloeistof had een proteinegehalte van circa 180. jug/ml en een plasminogeen-activator-activitèit.van circa 60 IÜ./ml, oftewel circa 330 lü/mg.
80 0 3 4 02 -7-
Het proteinegehalte van de vloeistoffen in dit en andere voorbeelden werd bepaald door lichtadsorptie bij 280 nm. De plasminogeen-activator-activiteit werd bepaald op plasminogeen-houdende runderfibrine-platen volgens Astrup 5 cL'.s., Arch. Biochem. Biophys. £0, 346-351 (1952) en uitgedrukt in Internationale Eenheden (IU), waarbij het WHO eerste internationale referentiepreparaat van Urokinase (66/46) als standaard werd gebruikt. Dezelfde bepalingsmethode werd in alle andere voorbeelden gebruikt.
*0 " Voorbeeld II
Zuivering.
De gecombineerde cultuurvloeistoffen van voorbeeld I werden onderworpen aan een driestaps zuiveringsmethode.
Alle stappen daarvan werden bij 4°C uitgeVoerd. Aan de hier- 2-5 bij gebruikte bufferoplossing werd een kleine hoeveelheid Tween 80, een niet ionogeen reinigingsmiddel van J.T. Baker Chemicals, toegevoegd teneinde een adsorptie van de plasmi-nogeen-activator aan glaswaren tegen te gaan.
a) In een eerste stap werden de gecombineerde 2°· cultuurvloeistoffen onderworpen aan chromatografie op zink-chelaat-agarose. Dit materiaal werd bereid door imModiazijn-zuur te koppelen aan agarosedeeltjes (Sepharose 4B van Pharmacia Fine Chemicals, Üppsila, Zweden! en door het produkt te verzadigen met zinkchloride. De koppelingsmethode is 25 beschreven door Porath c.s., Nature, 258, 598-599 (1975).
Na gebruik kon de zinkchelaat-agarose worden geregenereerd door achtereenvolgens te wassen met 0,05 M ethyleendiamine-tetraazijnzuur (EDTAl yan pH =0 8,0, 0,05 M NH^HCO^ van pH = 10.5, en water, gevolgd door opnieuw verzadigen met zink-2° chloride.
Een kolom zihkchelaat-agarose. (5 x 10 cm) werd geequilibreerd met 0,02 M Tris HC1 bufferoplossing van pH = 7.5, welke 1 M NaCl en 0,01% (v.v);Tween 80 bevatte. In deze bufferoplossing bestaat Tris uit trihydroxymethyl-35 aminomethaan. 10 liter van de gecombineerde cultuurvloeistoffen werden op de geequilibreede zinkchelaat-agarosekolom aangebracht. De stroomsnelheid was 200 ml/h. De kolom werd gewassen met equilibratiebuffer en daarna geelueerd met de- 800 34 02 * τ -8- zelfde buffer (totaal volume 1 liter) welke een lineaire gradient (van 0-0,05 M) aan imidazool bevatte. Frakties van 10 ml werden met een stroomsnelheid van 120 ml/uur verzameld terwijl de plasminogeen-.activator-activiteit en de proteine-5 concentratie (zie hierboven) in alle frakties werd bepaald.
Dit leerde dat de plasminogeen-activator werd gedesorbeerd als een enkele piek in de frakties 28-42, welke slechts gedeeltelijk gescheiden was van een grote proteine-piek. De activator-houdende frakties werden samengevoegd (151 ml).
10 Zij hadden een proteinegehalte van 900 jug/ial en een specifieke activiteit van .1100 IU/ml oftewel ' <'·. circa 3600 IU/mg.
De totale.opbrengst was derhalve 83% en de zuiveringsfaktor was 11.
b) in een tweede trap werd de plaminogeen-activa-15 tor-oplossing, afkomstig van de eerste trap onderworpen aan chromatografie op lectine-agarose (Concanatfalin A Sepharose van Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Zweden).
Een kolom Concanavalin A agarose (0,9 x 25 cm) werd geequilibreef.d met 0,1 Z1 fosfaatbuffer van pH = 7,5, 2Q welke 1 *1 NaCl en 0,01% (v/v) Tween 80 bevatte. De samengevoegde activatorhoudende frakties van (al werden op deze kolom gebracht. Bij een snelheid van 8 ml/uur werden frakties van 4 ml verzameld. De kolom werd gewassen met equilibratie-buffer en’ geelueerd met dezelfde buffer ·. (totaal volume 200 25 ml) welke lineaire gradiënten van o<-D-methylmannoside (van 0-0,6 M) en kaliumthiocyanaat (van 0-2 M) bevatte. Opnieuw werden frakties van 4 ml verzameld, waarin de plasminogeen- activator- activiteit en het proteinegehalte werd bepaald.
*
De plasminogeen-activator bleek te worden gedesorbeerd bij • 30 circa 0,3 M c(-D-methylmannoside en 1 M kaliumthiocyanaat.
De activator werd gewonnen in een enkele piek die gescheiden was van een duidelijke proteine-piek. De activator-houdende frakties werden samengevoegd (84 ml). Zij hadden een proteinegehalte van 159 pg/ml en een specifieke activiteit van 35 1300 IU/ml oftewel circa 25000 IU/mg. De totale opbrengst was derhalve 57% en de totale zuiveringsfaktor 77.
c) In een derde stap werd de plasminogeen-activa-tor-oplossing, afkomstig van de tweede stap, onderworpen aan 800 34 02 # -9- gelfiltratie op verknoopte dextrandeeltjes. Het gebruikte materiaal was Sephadex G-150 ( superfine) van Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Zweden.
Voorafgaand aan de. gelfiltratie werd kaliumthio-5 cyanaat aan de plasminogeen-activator-oplossing. toegevoegd tot een eindconcentratie van 1,6 M en werd de oplossing tot circa 10 ml geconcentreerd door dialyses te'gen vast poly-ethyleenglycol 20.000. Een gering neerslag werd verwijderd door 15 min centrifugeren bij 10.000 g.
10 Een Sephadex G-150 (superfine) kolom (2,5 x 90 cm) werd geequilibreerd met 0,01 M fosfaatbuffer van pH 7,5, die 1,5 M kaliumthiocyanaat en 0,01% (v/v) Tween 80 bevatte. Daarna werd de geconcentreerde activator-oplossing op de . kolom gebracht en door de kolom gefiltreerd, gevolgd door 15 de equilibratiebuffer. Bij een stroomsnelheid van 6,8 ml/uur werden frakties van 3,4 ml verzameld, waarin de plasrainogeen-activator-activiteit en het proteinegehalte werden bepaald.
De plasminogeen-activator bleek uit de kolom te voorschijn te komen op een enkele piek, die samenviel met een proteine-20 piek. De activator-houdende frakties werden samengevoegd (37 ml). Zij hadden een proteinegehalte van 81 jig/ml.en een specifieke activiteit van 7200 lU/ml oftewel circa 9Q.Q00 IU/mg. De totale opbrengst was derhalve 46% en de zuiverings-faktor vergeleken met het uitgangsmateriaal was 263.
25 De verkregen activator-oplossing werd bij -20°C
bewaard en verder gebruikt voor karakteriserings- en toepas-singsproeven.
Voorbeeld III Karakterisering 30 De gezuiverde plasminogeen-activator-oplossing afkomstig van voorbeeld II werd onderworpen aan diverse karakteriseringsproeven.
a) Bij onderwerping aan SDS-polyacrylamidegel-elektroforese vertoonde de nieuwe activator een enkele 35 band met een geschat molecuulgewicht van 72.000. Na reduktie met dithiotritol, werden twee banden waargenomen.met mole-cuulgewichten van resp. circa 33.000 en circa 33.000. a λ λ τ / λ rt Bij deze proef werd de SDS-acrylamidegel-elektro-
8 0 0 3 4 0 Z
-10- forese uitgevoerd volgens Weber en Osborn, J. Biol. Chem., 244, 4406-4412 (1969) onder gebruikmaking'/van 7%’s gels.
Het molecuulgewicht werd geschat met behulp van een cali-bratiepakket (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Zweden) dat 5 fosforylase b (94.000), cerum albumine (67.000), ovalbumine (43.0001, koolzuur-anhydrasè (30.000), trypsine-inhibitor (20.000) en ix'2-lactalbumine (14.400) bevatte.
, b) Bij onderwerping aan hydrolyse met 6 M HC1 in vacuo bij 110°C gedurende 20 uuSf, gevolgd door bepaling 10 van het aminozuurgehalte, bleek de nieuwe activator de volgende aminozuursamenstelling te hebben (in % van het totaal): TABEL 1
Aminozuur Gehalte 15 Asparaginezuur 10,1
Threonine 5,0
Serine 11,4
Glutaminezuur 11,5
Proline 5,7 2Q Glycine 11,2
Alanine 7,! 8
Cysteine N.B.
Valine 4,4
Methionine 1,5 25 Isoleucine 3,1
Leucine 7,6
Tyrosine 4,1
Fenylalanine 3,3
Lysine 4,6 30 Histidine 3,3
Arginine 5,6
Tryptofan N.B.
N.B. = niet bepaald.
c) Bij onderwerping aan een fibrine-bindingsproef, 35 bleek de nieuwe activator goed te binden aan fibrine, in tegenstelling tot urokinase dat in het geheel niet gebonden werd.
» - * . ma De proef werd uitgevoerd door fibrinogeen en 800 3 4 02 *> f -11- trombine aan de activator-oplossing toe te voegen. Na 30 min incuberen bij 37°C werd het fibrine door centrifugeren verwijderd en na wassen geextraheerd met 1,6 M kaliumthiocyanaat-oplossing. De resultaten zijn samengevoegd in tabel 2.
5 TABEL 2
Nieuwe activator Urókinas (%) (%)
Niet gebonden 10+1 98 + 1 KSCN-extract 6i + 3 8+2 10 dl Bij onderwerping aan immunodiffusie-analyse bleek de nieuwe activator immunologisch, te verschillen van menselijk urokinase (Mr = 54.000) aangezien zich wel preci-pitinelijnen ontwikkelden tussen de nieuwe activator en antistoffen daartegen, maar zulke precipitinelijnen ontbraken 15 tussen urokinase en dezelfde activator-antistoffeii. Deze immunodiffusie-analyse werd uitgevoerd met de methode van Ouchterlony, Progress in Allergy, Vol. V (Kallos, B.ed.), p 1- , Karger, Basel/New York, 1958. Aan de agarose werd Tween 80 toegevoegd tot een eindconcentratie van 0,1% (v/v)..
2Q el Bij onderwerping aan uitdovingsproeven op een plasminogeen-houdende runderfibrine-plaat werden soortgelijke resultaten behaald. De fibrinolytische activitéit van de nieuwe plasminogeen-activa tor ..werd volledig uitgedoofd door antistoffen (IgG-fraktie) tegen die activator, terwijl de 25 fibrinolytische activiteit van een urokinase-oplossing (met dezélfde activiteit) niet daardoor werden uitgedoofd. Verder werd in het concentratiegebied van de experimenten geen enkele fibrinolytische werking uitgedoofd door de IgG-fraktie van een controle-antiserum.1 30 De uitdovingsproeven werden uitgevoerd volgens
Astrup c.s., Arch. Bioch. Biophys., 40-, 346.-351 (1252)..
De plasminogeen-activator (140 IU/ml) werd daartoe opgelost in 0,(12 M Tris/HCl van pH ?,5, dat 0,15 M NaCl en 0,01%
Tween 80 bevatte.
35 De voor de proeven (d) eri (e) benodigde anti stoffen werden als volgt bereid: in een konijn werd een antiserum tegen de nieuwe plasminogeen-activator opgewekt door injectie van 100 jug gezuiverde activator, opgelost in 800 3 4 02 * * -12- 0,5 ml fysiologische keukenzoutoplossing en geemulgeerd met 0,5 ml Freund's Complete Adjuvant. Met tussenpozen van twee weken werden nog hulpinjecties van 50 jag gegeven. Het serum werd 1 week na de tweede hulpinjectie gewonnen. De 5 IgG-fraktie van het antiserum.werd geïsoleerd door affiniteits chromatografie op Protein A Sepharose en gedialyseerd tegen 0,15 M NaCl oplossing.
Voorbeeld IV
Fibrinolytische, fibrinogenolytische en tooinbo-10 lytische werking.
De relatieve fibrinolytische werking van de nieuwe plasminogeen-activator en urokinase werd vergeleken in een bloedstolsel-oplossingssysteem bestaande uit vers., bevroren hloedbankplasma. In proefbuisjes, die in duplo werden ge-15 bruikt, werd 0,4 ml plasma gecombineerd en vermengd met 50 yül activator-oplossing (eindconcentratie variërend van 10-200 ID per ml) en 50 ml menselijk trombine (eindconcentratie 1 NIH eenheid per ml) (NIH betekent National Institute of Health, Bethesda, Maryland, USA). Bij één serie proeven 20 werd de nieuwe plasminogeen-activator en bij een andere serie/proeven urokinase als activator gebruikt. Na de vorming van een bloedstolsel werden de mengsels hij 37°C geincubeerd en werd de benodigde tijd voor volledige lysis van het stolsel opgetekend.
25 In dit systeem wordt een fibrino-stolsel gevormd door inwerking van toegevoegd trombine op.fibrinogeen van het plasma, terwijl een lysis van het stolsel kan worden verkregen door de toegevoegde activator die een omzetting van plasminogeen uit het plasma tot piasmine veroorzaakt.
30 Deze lysis van het stolsel kan worden tegengewerkt door de aanwezigheid van antiplasmine in het bloedplasma.
Het bleek dat beide activatoren lysis van het stolsel veroorzaakten en zodoende een fibrinolytisch. effekt hadden, maar de aard van dit effekt was verschillend. Bij 35 hoge activator-concentraties was de lysistijd vergelijkbaar, maar bij lage concentraties bleek de nieuwe plasminogeen-activator veel effectiever dan urokinas. Bij een urokinase-concentratie van 80 eenheden/ml loste het plasmastolsel in 800 3 4 02 * t -13- 24 uren nog niet op, terwijl de met 20 eenheden van de nieuwe plasminogeen-activator opgewekte lysistijd minder dan 2 uren was, b) De fibrinogenolytische werking van de nieuwe 5 plasminogeen-activator en vein urokinase werd vergeleken in een plasmasysteem. Aan 1,8 ml menselijk bloedplasma werd 0,2 ml activatoroplossing (eindconcentratie variërend van 5-2QQ IU/mll toegevoegd. Op verschillende tijdstippen werden monsters van 0,2 ml genomen ter bepaling van het fibrinogeen-10 gehalte met de methode van Vermyleri c.s., .Clin. Chim. Acta, 8, 418-424. (19631.
Er bleek een verschil in gedrag tussen urokinase en de nieuwe activator op te treden. Bij 1Q0. eenheden/ml werd eenmilde graad van fibronogeen-afbraak met urokinase, 15 maar niet met de nieuwe plasminogeen-activator waargenomen.
cl De trorabolytische werking van de nieuwe plasminogeen-activator en van urokinase werd gemeten in een kunstmatig systeem, bestaande uit een radio-actieve menselijke thrombus, gesuspendeerd .in een hoeveelheid circulerend bloed-20 plasma, waaraan door infusie langzaam een activatoroplossing werd toegevoegd. Voor het begin van de activator-toevoeging en gedurende 8-12 uren daarna werden met tussenpozen van 1 uur plasmamonsters genomen. De graad van trombolyse werd geschat uit de vrijkomende radio-activiteit en uitgedrukt 25 in procenten.
Het bleek dat een significante trombolyse in 12 uur kon worden verkregen met 10 eenheden of meer van de nieuwe plasminogeen-activator per ml plasma, maar niet met 20 eenheden urokinase/ml. De specifieke trombolytische 30 werking van de nieuwe activator in dit systeem is circa IQ maal zo hoog als die van urokinase. Verder blijkt na afloop van de activatortoevoeging de door urokinase opgewekte tromholyse snelheid af te vlakken, terwijl de door de nieuwe plasminogeen-activator opgewekte trombolyse. veel. geleidelijker 35 verloopt.
Voorbeeld V
Farmaceutisch, preparaat.
800 3 4 02 Als preparaat voor intraveneuze injectie kan men -« t -14- oplossing van de nieuwe activator in een met fosfaat gebufferde fysiologische keukenzoutoplossing nemen, welke 0,001% ïween 80 en 0,1-1% albumine of mannitol bevat.
< 80 0 3 4 02

Claims (14)

1. Een plasminogeen-activator uit menselijke me lanoma-ce Hen.
2. De plasminogeen-activator volgens conclusie 1, gekenmerkt door een molecuulgewicht van circa 72.000 in 5 ongereduceerde vorm, bepaald met SDS-polyacrylamidegel- elektroforese, en door twee banden met molecuulgewichten van resp. circa 33.000 en circa 39.000 in gereduceerde vorm, eveneens bepaald met SDS-polyacrylamidegel-elektroforese, welke activator een sterke binding aan fibrine vertoont.
3. De plasminogeen-activator volgens conclusie 1, gekenmerkt door een aminozuursamenstelling volgens tabel 1.
4. Werkwijze voor het bereiden van een plasminogeen-activaror volgens conclusie 1-3, gekenmerkt door voortkweken van menselijke melanoma-cellen in een geschikt groeimedium, 15 gevolgd door winnen van de cultuurvloeistof die een plasminogeen-activator bevat, en zuivering van de gewonnen vloeistof.
5. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat het voortkweken van de me1anoma-ce1len geschiedt 20 in een gebruikelijk, groeimedium en dat de gewonnen vloeistof wordt gezuiverd met een gebruikelijke zuiveringsmethode voor proteïnen.
6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat de melanoma-cellen worden gekweekt in een gemodi- 25 ficeerd medium volgens Eagle, waaraan natriumbicarbonaat, L-glutamine en door warmte geinactiveerde pasgeboren kal-verserum is toegevoegd.
7. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat het zuiveren van de gewonnen vloeistof geschiedt 30 met behulp van liganden-uitwisselingschromatografie.
8. Werkwijze volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat daarbij een metaalchelaat van agarose als stationaire fase wordt gebruikt.
9. Werkwijze volgens conclusie 8, met het ken- 35 merk, dat de liganden-uitwisselingschromatografie plaatsvindt op zinkchelaat-agarose. 8003402 Werkwijze volgens conclusie 5, met het ken- Λ- ί -16- merk, dat de zuivering geschiedt met affiniteitschromatogra-fie.
11. Werkwijze volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat de affiniteitschromatografie plaatsvindt op 5 léctine-agarose.
12. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat de zuivering geschiedt door gelfiltratie, bij voorkeur van een reeks partieel gezuiverd produkt. - 13. Werkwijze volgens conclusie 12, met het 10 kenmerk, dat de gelfiltratie plaatsvindt over verknoopte dextrandeeltjes.
14. Farmaceutisch preparaat met trombolytische werking, dat een doeltreffende hoeveelheid plasminogeen-activator volgens conclusies 1-3 bevat.
15. Werkwijze voor het bereiden van een farma ceutisch preparaat met trombolytische werking, met het kenmerk, dat men een plasminogeen-activator volgens conclusies 1-3 in een voor therapeutische toepassing geschikte toedieningsvorm brengt.
16. Werkwijze voor de therapeutische behandeling van tromboseverschijnselen, met het kenmerk, dat men aan een patient een therapeutisch werkzame dosis van een trombolytisch preparaat volgens conclusie 14 toedient. 800 34 02
NL8003402A 1980-06-11 1980-06-11 Nieuwe plasminogeen-activator en farmaceutisch preparaat met trombolytische werking. NL8003402A (nl)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL8003402A NL8003402A (nl) 1980-06-11 1980-06-11 Nieuwe plasminogeen-activator en farmaceutisch preparaat met trombolytische werking.
JP8942081A JPS5728009A (en) 1980-06-11 1981-06-09 Novel plasminogen activator and drug having thrombosis dissolving activity
DE8181200643T DE3176876D1 (en) 1980-06-11 1981-06-10 New plasminogen activator and pharmaceutical composition having thrombolytic activity
EP81200643A EP0041766B1 (en) 1980-06-11 1981-06-10 New plasminogen activator and pharmaceutical composition having thrombolytic activity
US06/867,561 US4752603A (en) 1980-06-11 1986-05-28 Plasminogen activator and pharmaceutical composition having thrombolytic activity
JP62107927A JPS62289182A (ja) 1980-06-11 1987-04-28 新規なプラズミノゲン活性化物

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL8003402 1980-06-11
NL8003402A NL8003402A (nl) 1980-06-11 1980-06-11 Nieuwe plasminogeen-activator en farmaceutisch preparaat met trombolytische werking.

Publications (1)

Publication Number Publication Date
NL8003402A true NL8003402A (nl) 1982-01-04

Family

ID=19835452

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NL8003402A NL8003402A (nl) 1980-06-11 1980-06-11 Nieuwe plasminogeen-activator en farmaceutisch preparaat met trombolytische werking.

Country Status (5)

Country Link
US (1) US4752603A (nl)
EP (1) EP0041766B1 (nl)
JP (2) JPS5728009A (nl)
DE (1) DE3176876D1 (nl)
NL (1) NL8003402A (nl)

Families Citing this family (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5865218A (ja) * 1981-10-13 1983-04-18 Kowa Co 組織プラスミノーゲンアクチベーターの製造方法
ZA831399B (en) * 1982-03-05 1984-02-29 Health Lab Service Board New fibrinolytic enzymes and methods for their production and pharmaceutical compositions containing them
US5185259A (en) * 1982-05-05 1993-02-09 Genentech, Inc. Truncated human tissue plasminogen activator
US4766075A (en) * 1982-07-14 1988-08-23 Genentech, Inc. Human tissue plasminogen activator
GT198302091A (es) * 1982-05-05 1984-10-25 Activador de plasminogeno de tejido humano a),b),c).
US4853330A (en) * 1983-04-07 1989-08-01 Genentech, Inc. Human tissue plasminogen activator
IL68561A (en) * 1982-05-05 1991-01-31 Genentech Inc Preparation of polypeptide with human tissue plasminogen activator function,processes for making it,and dna and transformed cell intermediates thereof
DE3348289C2 (de) * 1982-05-05 1994-05-05 Genentech Inc Verfahren zur Herstellung von Human-Gewebe-Plasminogen-Aktivator
FI831484L (fi) 1982-05-05 1983-11-06 Genentech Inc Plasminogen aktivator foer maenskovaevnad
JPS5913732A (ja) * 1982-07-16 1984-01-24 Mitsui Toatsu Chem Inc 血栓溶解剤
JPS5951220A (ja) * 1982-08-02 1984-03-24 Asahi Chem Ind Co Ltd 新規なプラスミノ−ゲン・アクチベ−タ−およびその製法ならびにこれを含有する薬剤
WO1984001786A1 (en) * 1982-10-28 1984-05-10 Beecham Group Plc Enzyme derivatives and their use in the treatment of thrombosis
JPS5980613A (ja) * 1982-10-29 1984-05-10 Mitsui Toatsu Chem Inc 新規なプラスミノ−ゲン・アクチベ−タ及びその製造方法
WO1984001714A1 (en) * 1982-10-29 1984-05-10 Mitsui Toatsu Chemicals Novel plasminogen activator, process for its preparation, and thrombolytic drug containing the same
WO1984001960A1 (en) * 1982-11-11 1984-05-24 Beecham Group Plc Pharmaceutically active compounds
AU554862B2 (en) * 1982-12-14 1986-09-04 Implico B.V. Plasminogen activator isolated by affinity chromatography
US6001355A (en) * 1982-12-14 1999-12-14 Dowdle; Eugene Bernard Davey Pro-tPA for the treatment of thrombosis, embolism and related conditions
EP0112122B1 (en) * 1982-12-14 1991-08-28 South African Inventions Development Corporation Plasminogen activator
NZ206699A (en) * 1982-12-30 1989-08-29 Bio Response Inc Process for the production of serum independent cell lines
US5011795A (en) 1983-01-19 1991-04-30 Genentech, Inc. Human tPA production using vectors coding for DHFR protein
FR2548211B1 (fr) * 1983-06-29 1985-10-18 Choay Sa Procede de production d'un activateur tissulaire du plasminogene et activateur obtenu par ce procede
JPS60103964A (ja) * 1983-11-10 1985-06-08 ユニチカ株式会社 抗血栓性材料
GB8334499D0 (en) * 1983-12-24 1984-02-01 Beecham Group Plc Derivatives
JP2648301B2 (ja) * 1983-12-27 1997-08-27 ジエネテイツクス・インスチチユ−ト・インコ−ポレ−テツド 真核細胞の形質転換のための補助ｄｎａを含むベクター
US5079159A (en) * 1983-12-27 1992-01-07 Genetics Institute, Inc. Method for making tissue plasminogen activator
EP0151996B1 (en) * 1984-01-30 1991-04-03 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Process for the preparation of a double-chain plasminogen activator
JPS60158117A (ja) * 1984-01-30 1985-08-19 Asahi Chem Ind Co Ltd 新規なプラスミノ−ゲン・アクチベ−タ−およびその製法ならびにこれを含有する薬剤
JPS60158115A (ja) * 1984-01-30 1985-08-19 Meiji Milk Prod Co Ltd プラズミノーゲンアクチベーターの製造法
JPS60174727A (ja) * 1984-02-21 1985-09-09 Asahi Chem Ind Co Ltd 新規なプラスミノ−ゲン・アクチベ−タ−の安定化方法
JPS60259187A (ja) * 1984-04-19 1985-12-21 マイルス・ラボラトリ−ス・インコ−ポレ−テツド プラスミノーゲン活性化因子を増収する方法
US4753879A (en) * 1984-08-27 1988-06-28 Biogen N.V. Modified tissue plasminogen activators
GB8508717D0 (en) * 1985-04-03 1985-05-09 Beecham Group Plc Composition
DE3512910A1 (de) * 1985-04-11 1986-10-16 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Verfahren zur reinigung von plasminogenaktivatoren
GB8513358D0 (en) * 1985-05-28 1985-07-03 Wellcome Found Formulation
NL8601354A (nl) * 1985-05-28 1986-12-16 Wellcome Found Nieuwe samenstelling.
JPS624233A (ja) * 1985-07-01 1987-01-10 Toyobo Co Ltd 組織性プラスミノ−ゲン活性化因子の製造法
ZW14486A1 (en) * 1985-07-29 1986-10-22 Smithkline Beckman Corp Pharmaceutical dosage unit
EP0238551A4 (en) * 1985-09-06 1988-02-01 Codon METHODS OF RECOVERING A TISSUE PLASMINOGEN ACTIVATOR.
US4960702A (en) * 1985-09-06 1990-10-02 Codon Methods for recovery of tissue plasminogen activator
US4889808A (en) * 1985-10-01 1989-12-26 American Home Products Method of enchancing t-PA and SCU-PA production
NL8503097A (nl) * 1985-11-11 1987-06-01 Leuven Res & Dev Vzw Geneesmiddel met thrombolytische werking.
US5258298A (en) * 1986-01-31 1993-11-02 Genetics Institute, Inc. Deletion and glycosylation mutant of human tissue plasminogen activator
US5837518A (en) * 1986-01-31 1998-11-17 Genetics Institute, Inc. Thrombolytic proteins
US5002887A (en) * 1986-01-31 1991-03-26 Genetics Institute, Inc. Truncated thrombolytic proteins
US4927630A (en) * 1986-02-26 1990-05-22 Monsanto Company Tissue plasminogen activator from normal human colon cells
US4851517A (en) * 1986-02-26 1989-07-25 Monsanto Company Tissue plasminogen activator oligosaccharide from normal human colon cells
US5132214A (en) * 1986-04-09 1992-07-21 Monsanto Company Large scale production of plasminogen activator from normal human colon cells
US4751084A (en) * 1986-02-26 1988-06-14 Monsanto Company Tissue plasminogen activator from normal human colon cells
US5589361A (en) * 1986-03-18 1996-12-31 Genentech, Inc. Human tissue-type plasminogen activator variant
DK237187A (da) * 1986-05-12 1987-11-13 Wellcome Found Farmaceutisk anvendelse af t-pa
US4857320A (en) * 1987-02-19 1989-08-15 Monsanto Company Method of enhancing the solubility of tissue plasminogen activator
MY103358A (en) * 1987-04-15 1993-06-30 Novartis Ag Process for the production of protiens.
US5149533A (en) * 1987-06-04 1992-09-22 Zymogenetics, Inc. Modified t-PA with kringle-/replaced by another kringle
US4929560A (en) * 1988-02-03 1990-05-29 Damon Biotech, Inc. Recovery of tissue plasminogen activator
DE3804600A1 (de) * 1988-02-13 1989-08-24 Basf Ag Mischung aus einer thrombolytisch wirkenden und einer antithrombotischen substanz
US5210037A (en) * 1988-03-22 1993-05-11 Centocor Incorporated Method to enhance TPA production
WO1989009257A1 (en) * 1988-03-22 1989-10-05 Invitron Corporation METHOD TO ENHANCE tPA PRODUCTION
US5262170A (en) * 1988-09-02 1993-11-16 Genentech, Inc. Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties and substituted at amino acid positions 296-299, DNA molecules encoding them, vectors, and host cells
US5714145A (en) * 1988-09-02 1998-02-03 Genentech, Inc. Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties
GB8822147D0 (en) * 1988-09-21 1988-10-26 Ciba Geigy Ag Pharmaceutically active combination
US5130143A (en) * 1988-11-04 1992-07-14 The Research Foundation Of State University Of New York Use of a low affinity-heparin fraction in conjunction with t-pa for thrombolytic therapy
DE3905723A1 (de) * 1989-02-24 1990-08-30 Boehringer Ingelheim Int Verwendung von tpa zur prophylaxe und/oder therapie von schwangerschaftskomplikationen
US5141862A (en) * 1990-04-17 1992-08-25 Smithkline Beecham Corporation Method of purifying tpa or plasminogen activator using a tripeptide of the formula: -X-Y-argininal wherein X and Y are selected from the group consisting of pro,phe,trp and tyr
US5227297A (en) * 1990-04-17 1993-07-13 Smithkline Beecham Corporation Affinity purification ligands
US5189019A (en) * 1990-04-23 1993-02-23 Merck & Co., Inc. Antistasin derived anticoagulant protein
FR2661920B1 (fr) * 1990-05-10 1995-10-06 Serbio Procede de determination d'un activateur du plasminogene et de son inhibiteur.
US5223408A (en) * 1991-07-11 1993-06-29 Genentech, Inc. Method for making variant secreted proteins with altered properties
AU664469B2 (en) * 1992-06-03 1995-11-16 Genentech Inc. Tissue plasminogen activator glycosylation variants with improved therapeutic properties
WO1996004371A1 (fr) * 1994-08-04 1996-02-15 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Dimere, activateur plasminogene des tissus humains
ES2281342T3 (es) 1999-04-26 2007-10-01 Genentech, Inc. Proceso de cultivo de celulas para la produccion de glicoproteinas.
WO2005032572A2 (en) 2003-10-03 2005-04-14 Vib Vzw Means and methods for the recruitment and identification of stem cells
WO2006023530A2 (en) * 2004-08-16 2006-03-02 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for enhancing structural and functional nervous system reorganization and recovery

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3904480A (en) * 1972-10-24 1975-09-09 Lilly Co Eli Enhanced production of plasminogen activator
FR2252842B1 (nl) * 1973-12-03 1977-11-04 Fabre Sa Pierre
FR2310133A2 (fr) * 1975-05-05 1976-12-03 Fabre Sa Pierre Nouveau medicament comportant un activateur du plasminogene perfectionne
US4245051A (en) * 1978-03-30 1981-01-13 Rockefeller University Human serum plasminogen activator
US4190708A (en) * 1978-05-24 1980-02-26 Monsanto Company Production of urokinase
CH643297A5 (de) * 1978-06-30 1984-05-30 Alpha Patent Ltd Verfahren zur reindarstellung von urokinase.
DE3015699C2 (de) * 1979-04-26 1982-07-15 Asahi Kasei Kogyo K.K., Osaka Herstellung eines Plasminogen-Aktivators
US4370417A (en) * 1980-04-03 1983-01-25 Abbott Laboratories Recombinant deoxyribonucleic acid which codes for plasminogen activator

Also Published As

Publication number Publication date
US4752603A (en) 1988-06-21
EP0041766B1 (en) 1988-09-14
EP0041766A2 (en) 1981-12-16
DE3176876D1 (en) 1988-10-20
JPH0378375B2 (nl) 1991-12-13
JPS5728009A (en) 1982-02-15
JPS62289182A (ja) 1987-12-16
EP0041766A3 (en) 1981-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NL8003402A (nl) Nieuwe plasminogeen-activator en farmaceutisch preparaat met trombolytische werking.
JP5025868B2 (ja) 可逆的に不活性な酸性化プラスミン組成物の調製法
EP0100982B1 (en) Novel purified plasminogen activator, process for its production and thrombolytic composition containing it
JP2540541B2 (ja) 第ｖ因子濃縮物の製法
JP2631645B2 (ja) 新規化合物、その製法及びそれを含む医薬組成物
US20040063187A1 (en) Process for the preparation in pure form of the protease activating blood clotting factor VII, its proenzyme or a mixture of both proteins by means of chromatography
JPH05186369A (ja) 治療的用途のためのヒトトロンビン濃厚液の製造法
JP2001095563A (ja) イオン交換クロマトグラフィーによって血液凝固第ｖｉｉ因子を活性化するプロテアーゼ、そのプロ酵素または両タンパク質の混合物を純粋形態で調製する方法
WO1996013274A1 (en) Process for production of inhibited forms of activated blood factors
EP0310065A2 (en) Fibrinolytic activity enhancer
DK173151B1 (da) Fremgangsmåde til oprensning af enkeltkædet og dobbeltkædet vævsplasminogenaktivator
DK147408B (da) Fremgangsmaade til udvinding af thrombinagtige enzymer fra slangegifte eller slangegiftfraktioner
US5004609A (en) Fibrinophilic urokinase complex
JPS63108000A (ja) 第８因子の精製方法
JP3805378B2 (ja) ｒＤＳＰＡα１の製造の方法
JPS59118717A (ja) プラスミノーゲン活性化剤
JPS60152421A (ja) ヒト胎盤性プラスミノ−ゲン活性化因子、及びそれとヒトプラスミノ−ゲン活性化阻害因子との結合物、及びそれらの製法
CN109952374A (zh) 用于从人类血浆开始的纤溶酶原纯化的工艺
JPS6338327B2 (nl)
US20020031518A1 (en) Plasminogen fragment having activity to inhibit tumor metastasis and growth and process for preparing same technical field
JPH0393798A (ja) プラスミノゲン活性化因子阻害剤２（ｐａｉ―２）の精製方法
AU781741B2 (en) Process for the preparation in pure form of the protease activating blood clotting factor VII, its proenzyme or mixture of both proteins by means of ion-exchange chromatography
JPH05271098A (ja) 活性化プロテインｃを有効成分とする抗血小板剤
JPS62158219A (ja) ヒト由来組織型プラスミノ−ゲン活性化因子、その製造方法及びこれを有効成分とする血栓溶解剤
JP2714817B2 (ja) ウロキナーゼ前駆体の製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
A1B A search report has been drawn up
A85 Still pending on 85-01-01
BC A request for examination has been filed
BV The patent application has lapsed