JPS62289182A - 新規なプラズミノゲン活性化物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 本発明は細胞培養体から分離され、かつ比較的大規模で
製造され得る、新規なプラズミノゲン活性化物（Ｐ　ｒ
ａｓｍｉｎｏｇｅｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ）に関する。

更に、この活性化物を精製しかつ分離する方法に関する
。

外科手術、分娩、大きい外傷、伝染性の疾病などが血栓
症、すなわち血管内に血液の塊を形成する危険の増大に
つながることは周知である。このような商魂の形成を防
止するため、抗凝血剤たとえばヘパリン、クマリン誘導
体、蛇毒成分、インダンジオールなどが投与される。し
かし、血栓症が生じた後は、生成した商魂を溶解（ジー
ンス）によって血管から除去する機能を持った血栓溶解
剤を用いろことになる。

以下の記載の理解を助けるため簡単に説明すると、商魂
は酵素トロンビンの作用によってフィブリノゲンから形
成されたフィブリンで溝成される。

正常な血液はプラズミノゲンを含んで居り、これはプラ
スミンに活性化された後にフィブリンを溶解してそれを
酵素的に分割する能力を６っている。

プラズミノゲン活性化物は正常な血液中に天然に存在す
るかまたは血液中へ放出されるので、循環する血液は血
管内に商魂が生ずれば直ちにこれを崩壊させて取除くた
めに必要なすべての含有物を含んでいる。しかし、実際
には身体の自己血栓溶解の潜在能力はこの目的には不充
分なことが多いように思われろ。即ちそれは少くと乙部
公的には血中のプラズミノゲン活性化物の不充分な濃度
に起因すると云える。このことは、血管内の血栓を適切
に除去するには体外から投与された血栓溶解剤の使用を
必要とすることがあることを意味する。

今［」まで、尿からまたは培養腎細胞から分離されたプ
ラズミノゲン活性化剤であるウロキナーゼを主とし、か
つストレプトコッキから採ったプラズミノゲン活性化剤
であるストレプトキナーゼが血栓溶解剤として用いられ
て来た。両剤とも比較的大規模に製造することができ、
そして今日では多用されている。しかし、ウロキナーゼ
らストレプトキナーゼも血液から採った正常のプラズミ
ノゲン活性化物とは異るものであり、またそれらはフィ
ブリンに対して特殊な親和性を侍っていないので、血栓
症の治療におけるウロキナーゼ及びストレプトキナーゼ
の使用結果はすべての点て満足ではない。所望の効果を
得るためにはこれらの薬剤を比較的大用量に必要とし、
そしてこのことはフィブリノケン溶解とか内山面などの
副作用の高い危険率につながる。このようなわけで、比
較的大規模に乙製造できて血栓症を治療ケるのに一層効
果かある血栓溶解活性のある薬剤及び物質に対する恒常
的な必要性がある。

本発明の目的は血液から採った正常のプラズミノゲン活
性化物と強い関係を持ち、かつ比較的大規模で製造でき
るプラズミノゲン活性化物を提供することである。また
他の目的はかようなプラズミノゲン活性化物の精製方法
を提供することである。

本発明の基盤を形成した研究中に、驚くべきことに１１
！１液から得たプラズミノゲン活性化物と極めて同様の
プラズミノゲン活性化物を人間の黒色腫細胞（ｍｅｌａ
ｎｏｍａ　ｃｅｌｉｓ）の培養液からかなり多量に分離
することができることが見出された。黒色腫細胞は着色
した腫瘍細胞であり、これを細胞培養の形で連続的に培
養し、それによって比較的大きい割合のプラズミノゲン
活性化物を分泌させる。

これによって細胞が分泌したプラズミノゲン活性化物を
比較的大規模に製造する機会が得られる。

得られろ活性化物はいくつかの点で血液活性化物と緊密
に関係があるように見えるが、ウロキナーゼやストレプ
トキナーゼのような公知の物質とは関係が薄い。このこ
とはこれを薬剤に利用することについて良好な見込を与
えろものである。新規な活性化物について、実験中に事
実強力な血栓溶解効力が見出され、そしてウロキナーゼ
を用いるよりも少い用量で充分であると思われ、また副
作用ら実質的にないように思われた。その結果として、
新規な活性化物を含む組成物は血栓症疾小の治療に利用
して良好な結果を得ることができる。

それゆえ、本発明は第一に人間の黒色腫細胞から得たプ
ラズミノゲン活性化物を提供する。更にこのプラズミノ
ゲン活性化物の有効量を含有する血栓溶解活性性薬剤を
提供する。また本発明は活性化物の製造及び精製の方法
、組成物の製造方法、及び新規組成物を用いて血栓症状
の治療の方法を提供する。

いくつかの型の１ｌｆｆｉ瘍細胞は細胞培養の培養中に
プラズミノゲン活性化物を分泌することは知られていた
（フライストマンらによる［＠乳動物の細胞及び組織に
おけるブロテイナーゼｌ（Ａ、Ｊ、パレット版）９１−
１４９頁、エルゼヴイエル、アムステルダム）。しかし
これらのプラズミノゲン活性化物の犬がいはウロキナー
ゼと関係があり（フエツテルラインらによるジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストり一誌、２５４．５
７５−５７８（１９７９）参照）、そして更に、それら
はこれまでまだ充分な遣で分離されなかった。それゆえ
、細胞培養中の人間の黒色腫細胞が血液中を循環する活
性化物と緊密に連係のあるプラズミノゲン活性化物を分
泌すること、またその上、それらが活性化物を大規模に
回収しかつ精製できるような債で分泌することは、驚く
べきことであった。゛本発明によるプラズミノゲン活性
化物は適当な成育媒体中で人間の黒色腫細胞を培養し、
活性化物を含む培養液を回収し、得られる液を精製する
ことによって製造することができる。

得られる培養液の精製は原則として任意の適当な方法で
行なってよいが、これには蛋白質化学において通常であ
る各々の分離方法を含む。例えば塩、有機溶剤またはポ
リエチレングリコールなどを用いろ分別沈澱法、賢った
緩衝液及び担体を用いる電気泳動法、架橋結合したデキ
ストラン、架橋結合したあるいは架橋結合しないアガロ
ース、架橋結合しｆこポリアクリルアミド、またはそれ
らの混合物などによるゲル濾過、及び仕切りまたは吸着
／脱着に基づく他のクロマトグラフィー操作などである
。後昔の操作はバッチ方式あるいはカラムで行なってよ
い。仕切りロマトグラフィーまたは吸着／脱着クロマト
グラフィーは例えばイオン交換、疎水性相互反応、配位
子交換または生物特異的親和性の方法で行なってよい。

これらの方法においては、ゲル濾過に対すると同じ媒体
を静和として用いてもよいが、粒子の内表面または外表
面に適当な基をつけてする。無機または有機塩、宵機溶
媒、表面活性剤、及び／または分離系の１つ以上は干渉
する物質、のようないくつかの添加物を含む水性緩衝物
を可動相として用いてもよい。

好ましい実施態様においては、好ましくは金属キレ−１
・・アガロースを静柑として用いて、配（）′Ｌ子交換
クロマトグラフィーを用いる。例えば、精製」−ろへき
液をｐＨ７，５で亜鉛キレート・アガＣ？−スのカラム
に通すと、吸着されたプラズミノゲン活性化物がイミダ
ゾール含有緩衝液で溶出できる。亜鉛キレート・アガロ
ースはイミノジ酢酸をアガロースと結合させて生成物を
塩化亜鉛で飽和させることによって製造してもよい。カ
ラムを利用すればバッチ方式よりも良い結果が得られる
。

他の好ましい実施態様においては、前記の実施態様に加
えてまたはその代わりに、好ましくはレクチン・アガロ
ースを外相として用いて、親和クロマトグラフィーを用
いる。例えば、精製するべき液をｐＨ７，５でレクチン
・アガロースのカラムに通すと、吸着されたプラズミノ
ゲン活性化物が、α−Ｄ−メチルマンノシド及びチオシ
アンカリを含む緩衝液で、同じｐＨで溶出する。

主として最終段階として用いられる第３の好ましい態様
は、好ましくは架橋結合したデキストラン粒子上で、ゲ
ル濾過によって形成される。

これらの精製方法においては、プラズミノゲン活性化物
がガラス器の表面に吸着する強い傾向を防止するため及
び製品の安定度を増進させるために用いるすべての緩衝
液に表面活性剤または洗剤を加えろことがす＼められろ
。最終濃度０．Ｏｌパーセント（容ｆｆｉ比）あるいは
０．００１パーセント（容積比）の非イオン性洗剤で良
好な結果が得られている。これらの非イオン性洗剤は主
として脂肪酸アルコールのポリグリコールエーテル、ア
ルキルフェノールのポリグリコールエーテル、または脂
肪酸のポリグリコールエステルから成る。

更に、かような操作中にプラズミノゲン活性化物の劣化
を防止するためにアプロチニンの存在下、これらの精製
方法、ならびに黒色腫細胞の最初の培養を行なうことが
す＼められる。アプロチニンは牛の膵臓組織から分離さ
れた高分子量トリプシン阻止剤である。それは下記のよ
うにプラズミノゲン活性化物の分子量に影響を与えるよ
うに思われる。

記述したような精製方法を利用することによって良好な
精製ならびに特殊な活性の明瞭な増大を達成することが
でき、そして精製物は同定試験用に及び薬剤への転化に
適するものとなる。

黒色腫細胞から生成したプラズミノゲン活性化物は、Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動法で測定した
場合、非還元形態で約７２，０００の分子量を持つよう
に思われる。還元形態では、培養及び精製がアプロチニ
ンの不在下で行なわれた場合、それぞれ約３３，０００
及び約３９，０００の分子量を持つ２つの帯域を示すか
、あるいは培養及び精製がアプロチニンの存在下で行な
われた場合、約７２．０００の分子量を持つ１つの帯域
を示すことがある。最初の生成物は蛋白質加水分解の劣
化物のようであるが、後者は天然物である。かように、
アプロチニンは活性化物分子の劣化を防止すると思われ
る。

アプロチニンの不在及び存在下に製造された活性化物の
アミノ酸組成物はそれぞれ第１表及び第３表に掲げてあ
り、大きい類似性を示す。更に、生成するプラズミノゲ
ン活性化物は強くフィブリンに結合するようである。

これらの性質すべての結果、新規なプラズミノゲン活性
化物は人間の血液から得た正常のプラズミノゲン活性化
物に極めて類似していると述べることかできる。

免疫学的な点では、新規な活性化物はウロキナーゼとは
相異を示す。

試験管中で発生させた商魂での実験中は、黒色腫細胞か
らのプラズミノゲン活性化物はウロキナーゼよりら高い
繊維素溶解及び血栓溶解効果を持ち、その上より低いフ
ィブリノゲン溶解の副作用を持つように思われる。この
ことは新規なプラズミノゲン活性化物が血栓溶解組成物
として利用する上にウロキナーゼよりも一層適当である
ことを示している。

精製されたプラズミノゲン活性化物から通常の方法で、
塩化ナトリウム、グルコース、マンニトール、アルブミ
ン、などの添加物を用いまたは用いないで、ガレヌス組
成物を作ることができる。

組成物は大がい、静脈内または動脈内注射または注入を
含む非経口投与に適する。

生成した組成物は過当な用噴で患者に投与してよく、そ
して副作用が少いかまたはない潜在力及び有効血栓溶解
力を持つ。それゆえ、組成物は深部静脈血栓症、肺塞栓
症、心筋梗塞、動脈閉塞、体外循環、及び動脈静脈閉鎖
の場合に遭遇するような異った血管床の急性及び慢性の
血栓閉塞を治療するのに用いることができる。

本発明を更に新規な活性化物の特徴づけのための試験を
含む下記の実施例によって説明する。

実施例１　培養及び採取 人間の黒色腫細胞ライン（患者ＢＯ８）を米国ニューヨ
ーク州ニューヨークのロックフェラー大学のり、Ｂ、リ
フキン博士から入手した。この細胞ラインに用いた成育
培体は、重炭酸ナトリウム（１６ａＱ、培体ｌリットル
当り６．５パーセント溶液）、Ｌ−グルタミン（１０ｍ
ｆ２、培体１リットル当り２００ｍＮの溶液）、及び熱
不活性化した新生子牛の血清（英国ペイズリ−のギブコ
）（最終濃度ＩＯペパーント）を補足した修正イーグル
の必須培体（英国のフロー・ラボラトリーズ）であった
。

黒色腫細胞は上記の成育培体中で合流する単層になるよ
うに成育させた。それからこれらを子牛の血清のない成
育培体で洗って、同じ無血清の成育培体中で３０間接種
した。毎日の後、培養液を採取し、取替え、７０００　
ｘｇで２０分間遠心分離し、そして使用時まで一２０℃
で貯蔵した。結合した培養液は約１８０μｇ／ｍＱの蛋
白質含有量と約６０　ｒ　Ｕ／ｍ（！（あるいは約３３
０１　Ｕ／ＦＩ９）のプラズミノゲン活性化物活性を持
っていた。

本実施例及び他の実施例における液の蛋白質含有量は２
８０止での光吸収によって測定した。プラズミノゲン活
性化物の特異活性（ｓｐｅｃｉｒｉｃ　　ａｃｔｉｖｉ
ｔｙ）はプラズミノゲン含宵牛フィブリン仮について、
アストラップ（Ａｓｔｒｕｐ）ら：　Ａ　ｒｃｈ、　Ｂ
　ｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、４０，３４６−３５
１（１９５２）による方法で測定し、国際単位（ＩＵ）
で表わした。なお、この際ウロキナーゼの世界保健機構
第１回国際参考製剤法（ＷＨＯ１ｓｔ　Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　　Ｐ　ｒｅｐａｒ
ａｔｉｏｎ）（６６／　４６　）を標準として用いた。

すべての他の実施例にも同じ測定方法を用いた。

実施例２　精製 実施例１の結合培養液を３段階精製処理にかけた。その
すべての段階は４℃で実施した。これらの段階に用いた
緩衝液に対して、ガラス器に対するプラズミノゲン活性
化物の吸着を防止するために、Ｊ、Ｔ、ベーカー・ケミ
カルズの非イオン性洗剤「トウィーン８０」を少量加え
た。

ａ）第１段階では、結合培養液を亜鉛キレート・アガロ
ースのクロマトグラフィーにたけた。この材料はイミノ
ジ酢酸をアガロース粒子（スエーデン国、アブサラのフ
ァルマシア・ファイン・ケミカルズの「セファロース４
Ｂ」）に結合させ、そして生成物を塩化亜鉛で飽和させ
ることによって製造されｆコ。結合方法はＮａｔｕｒｅ
、　２５８　、５９８−５９９（１９７５）にポラスら
によって開示されている。使用後、亜鉛キレート・アガ
ロースを１）Ｈ８，０の０．０５Ｍエチレンジアミンテ
トラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ｐｌ−１１０，５の０．０５Ｍ
のＮＨ，ＨＣＯ３、及び水で順次洗浄し、これを塩化亜
鉛で再飽和させることによって再生させることができた
。

亜鉛キレート・アガロースのカラム（５ｘ　Ｉ　Ｏｃｍ
）をＩＭのＮａＣｆｆを含むｐＨ７，５の０．０２Ｍト
リストＩＣＱと０．０１パーセント（容積比）の「トウ
ィーン８０Ｊとで平衡させた。この緩衝液においては、
トリスはトリヒドロキシメチルアミノメタンである。１
０リツトルの結合培養液を平衡させｆこ亜鉛キレート・
アガロース・カラムにかけた。流速は２００　ｍＱ／時
であった。カラムを平衡緩衝液で洗浄し、次に直線クラ
ジエント（０から０．０５Ｍまで）のイミダゾールを含
む同一の緩衝液（合計ｆｆ１１リツトル）で溶出した。

１０ｍ１２の分画は流速１２０ｍＱ／時で収集し、そし
てすべての分画はプラズミノゲン活性化物活性と蛋白質
濃度（上記参照）とに基づいて分析した。これによって
プラズミノゲン活性化物は大蛋白質ピークから僅かに部
分的に分離されて、分画２８−４２の単一ピークとして
脱着されたことがわかった。活性化物を含む分画は貯留
された（１５１ｍ□。これらは９００ｕ　ｇ／　ｍＱの
蛋白質含有量と１１００［Ｕ／ｍｄま１こは３６００Ｉ
Ｕ／ｍ９の特別活性を持っていた。従って、合計収率は
８３パーセント、精製比率は１１であった。

ｂ）第２段階では、第１段階から生成したプラズミノゲ
ン活性化物溶液をレクチン・アガロース（スエーデン国
、アブサラのファルマシア・ファイン・ケミカルズから
出ている「コンカナヴアリンＡセファロース」）のクロ
マトグラフィーにかけた。

コンカナヴアリンＡアガロースのカラム（０，９Ｘ　２
５　ｃｍ）をｌ　ＭのＮａＣ（！と０．０１％（容量比
）のトウィーン８０とを含むｐＨ７，５の０．０１Ｍの
りん酸塩緩衝液で平衡させた。段階（ａ）の貯留された
活性化物を含有する分画をこのカラムにかけた。４ｍＱ
の分画を８　ｍＱ／時の流速で収集した。カラムを平衡
緩衝液で洗浄して、α−Ｄ−メヂルマンノシド（０乃至
０　、６　Ｍ）とチオシアンカリ（０乃至２ｍ）を含む
同じ緩衝液（合計ｆｉ２００ｍ＆）で溶出した。４ｍｇ
の分画を再び収集してそれぞれをプラズミノゲン活性化
物活性及び蛋白質濃度について分析した。プラズミノゲ
ン活性化物は約０，３Ｍのα−Ｄ−メヂルマンノシド及
びＩＭのチオシアンカリで脱着されたようであった。活
性化物は清澄な蛋白質ピークから分離した単一ピークで
回収された。分画を含む活性化物のピークを貯留した（
８４ｍ１２）。それらは１５９μｇ／ｍ（の蛋白質含有
ｆＬ！＝　１３００１　Ｕ／ｍ（！あるイハ約２５，０
００１Ｕ／、ｌＩ９の特殊活性を持っていた。従って、
全体の収率は５６パーセント、全体の精製率は７７てあ
った。

Ｃ）第３段階では、第２段階から生成したプラズミノゲ
ン活性化物溶液を架橋結合したデキストラン粒子のゲル
濾過にかけた。用いた材料はスエーデン国、アブザラの
ファルマシア・ファイン・ケミカルズから出ているセフ
ァデックスＣ−１５０（極小）であった。

ゲル濾過に先立って、固型チオシアンカリをプラズミノ
ゲン活性化物液に加えて最終濃度が１゜６Ｍに達するよ
うにし、そして溶液を固型ポリエチレングリコール２０
，０００に対する透析によって約１０ｍＣに濃縮した。

小さい沈澱物をＩ　Ｏ，０００×ｇで１５分間の遠心分
離によって除去した。

セファデックスＧ−１５０（極小）カラム（２，５Ｘ　
９０　ｃｍ）を１．６Ｍのチオシアンカリと０．０１％
（容積比）のトウィーン８０を含むｐｉ−１７、５の０
０１Ｍのりん酸塩緩衝液で平衡させた。それから、濃縮
された活性化物溶液をカラムにかけてこれを通して濾過
し、次に平衡緩衝液を通した。３．４ｍＱの分画を６　
、８　ｍｌ／時の流速で収集し、そしてプラズミノゲン
活性化物活性及び蛋白質濃度について分析した。プラズ
ミノゲン活性化物が蛋白質ピークと一致する単一ピーク
としてカラムから出たように思われた。活性化物を含む
分画を貯留した（３７ｍの。これらは８１μｇ／ｍ（！
の蛋白賃金１と７２００１　Ｕ／ｍ（！あるいは約９０
，０００１０／　ｍ９の特別活性を持っていた。従って
、合計収率は４６パーセントであり、出発物質と比較し
た精製比率は２６３であった。

得られた活性化物溶液を一２０°Ｃで貯蔵して、特徴化
及び利用試験に用いた。

実施例３　特徴化 実施例２から得られた精製され１こプラズミノゲン活性
化物溶液令が（種の特徴化試験にかけた。

ａ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法にかけ
た場合、新しい活性化物は予想分子量７２゜０００を持
った一帯域を示した。ノチオトレイトールで還元した後
、それぞれ約３３．０００と杓３９．０００の分子量で
２つの帯域が認められた。

この試験では、７％ゲルを用いて、ウェーバ−・アンド
・オズボーン、Ｊ　、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、　２４４　
。

４＝１０６−４４１２（１９６９）の方法に従ってＳＤ
Ｓ−アクリルアミドゲル電気泳動を実施した。

分子量はフォスフォリラーゼ１）（９・１，０００）、
血清アルブミン（６７，０００）、オヴアルブミン（４
３，０００）、炭酸アンバイトラーゼ（３０，０００＞
、トリプシン阻止剤（２０，０００）、及びα２−ラク
トアルブミン（１４，４００）を含む検量キット（ス工
−デン国、アブザラのフアルマシア・ファイン・ケミカ
ルズ）によって想定された。

１））真空中ノロ　！ＶＩノＴ（ＣＱテＩ　Ｉ　０℃で
２０時間加水分解し、続いてアミノ酸測定をした場合、
新規な活性化物は下記のアミノ酸組成（合計のパーセン
トで）を示しｆこ。

第　　　　１　　　　表 アスパラギン酸　　　　　　　　　　１０．１トレオニ
ン　　　　　　　　　　　　　５．０セリン　　　　　
　　　　　　　１１．４グルタミン酸　　　　　　　　
　　　　１１．５プロリン　　　　　　　　　　　　　
　　５．７グリシン　　　　　　　　　　　　　１１．
２アラニン　　　　　　　　　　　　　　７．８システ
イン　　　　　　　　　　　　未測定ヴアリン　　　　
　　　　　　　　　　４，４メチオニン　　　　　　　
　　　　　　１．５イソロインン　　　　　　　　　　
　　３．１０イシン　　　　　　　　　　　　　７．６
チロシン　　　　　　　　　　　　　４．１フエニルア
ラニン　　　　　　　　　　３．３リンン　　　　　　
　　　　　　　　４・６ヒスチジン　　　　　　　　　
　　　　３．３アルギニン　　　　　　　　　　　　　
５・６トリブトフアン　　　　　　　　　　未測定Ｃ）
フィブリン結合試験を行なった場合、全く結合しなかっ
たウロキナーゼと対照的に、新規な活性化物はフィブリ
ンと結合したように思われた。

試験はフィブリノゲンとトロンビンとを活性化物溶液に
加えることによって行なった。３７９Ｃで３０分間イン
キュベートした後に、フィブリンを遠心分離によって除
去し、洗浄し、ヂオンアンカリ（１，６Ｍ）で抽出した
。結果を第２表に要約する。

第　　　　２　　　　表 新規活性化物　ウロキナーゼ （％）　　　　　（％） 非結合　　　　　　ｌＯＯ１２９８±１ＫＳＣＮ抽出物
　　６１±３　　　８±２ｄ）免疫拡散分析にかけた場
合、新規の活性化物は人間のウロキナーゼ（Ｍｒ＝５４
，０００）とは免疫学的に異っているように思われた、
なぜならば新規の活性化物と活性化物に対する抗体との
間にブレンピチンラインズが発現したが、ウロキナーゼ
と同じ活性化物抗体との間にはかようなプレンピチンラ
インズはなかったからである。この免疫拡散分析はオー
キターロニイ、「アレルギーの進歩」第５巻（カロス、
Ｐ、ｅｄ、）第１頁、カーガー、バーセル／ニューヨー
ク、１９５８の方法によって実施した。トウィーン８０
をアガロースに加えて最終濃度が０．１パーセント（容
積比）に達するようにした。

ｅ）プラズミノゲンを含有する牛フィブリン・プレート
についてクエンチング実験をした場合、同様の結果が得
られた。新規なプラズミノゲン活性化物の繊維素形成活
性をその活性化物に対する抗体（ＩｇＧ分画）によって
クエンチしたが、ウロキナーゼ溶液（同一の活性を持つ
もの）の繊維素溶解活性はそれによってクエンチされな
かった。更に、対照の抗血清物のＩｇＧ分画は実験の濃
度範囲において繊維素溶解活性をクエンチしなかった。

クエンヂング実験をアストラップらＡ　ｒｃｈ、　Ｂ　
ｉ。

ｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　、４０．、　３４６−３
５１（１９５２）に従って実施した。プラズミノゲン活
性化物（１４０１Ｕ／ｍｃ）を、０１５ＭのＮ　ａ　Ｃ
Ｑと０，０１％のトウィーン８０を含むｐＨ７、５の０
．０２Ｍトリス／ＣＨＣに溶解さ仕た。

試験（ｄ）及び（ｅ）のために必要とした抗体は下記の
ようにして作成された。即ち、新規なプラズミノゲン活
性化物に対する抗血清体を、０．５ｍ＆の生理食塩水に
溶解しフロイントのコンプリート・アンユヴアント０　
、５　ｍ（ｌで乳化した精製活性化物１００μｇを注射
することによってうさぎに生成さ仕た。５０ｔｔｇのブ
ースター注射を２週間の間隔で行なった。２回目のブー
スターから１週間後に血清を収集した。抗血清体のＩｇ
Ｇ分画がプロティンＡセファロースの親和クロマトグラ
フィ・−によって分離されて、０．１５ＭのＮａＣＱ溶
液に対して透析された。

（ｆ）　　安定性 プラズミノゲン活性化物はドデンル硫酸ナトリウム、尿
素、グアニジンＨＣ（中において完全な変性に対して高
度に低抗性を有する。高濃度のアルギニンはプラズミノ
ゲン活性化物を安定化し、溶液状態に保持する。

Ａ、ｐＨの影響 プラズミノゲン活性化物がｐＨ５，５，６，０，７，０
，７，５および８．５において０．２Ｍのアルギニン−
リン酸緩衝液中で透析された最終的にプラズミノゲン活
性化物の濃度は約０．０８５ｍ９／ｍＣであった。試料
は３５°Ｃで貯蔵され、２週間の間定期的に検定された
実験の全期間にわたって全プラズミノゲン活性化物の活
性はかなり一定であった。ｐ［−１の関数としての全プ
ラズミノゲン活性化物活性の損失速度をみると、最も中
性に近いｐＨにおいて最小であったので、酸−塩基が反
応を触媒したことを示唆する。最悪の場合（ｐＨ５，５
）における分解の程度はわずかにおよそ２０％であった
。

Ｂ、温度の影響 プラズミノゲン活性化物の二つの製剤を４℃、２０°Ｃ
１３７℃および４５℃で３０日間貯蔵した後、それぞれ
−２０℃に貯蔵したものを対照として、その力価を比較
した。これらの二つのプラズミノゲン活性化物は、その
貯蔵中の挙動において次のように変化があった。

貯蔵温度 製剤　　　４°Ｃ２０°Ｃ３７°Ｃ４５°ＣＩ　　　１
０１．７％　１０２．５％　９６．９％　９２６％ＴＩ
　　９３．７％９０．０％８３．８％７３．３％（ｇ）
　　基質特異性 天然基質のそれに類似のアミノ酸配列を有するｐ−ニト
ロアニリンとカプリングされた合成発色性トリペプチド
がプラズミノゲン活性化物活性の検定のために使用され
た。３種のそのようなトリペプチドの反応動力学定数は
次の通りである。

トリペプチド　　　　　Ｋｍ（Ｍ）　　　　Ｖｍａｘ（
ｍｏｌ／ｍｉｎ）Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ＮＡ　
　　１．４Ｘ１０−′Ｊ６．３ＸＩＯ−”（Ｓ−２２２
７） ｐＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ＮＡ　　８．０ＩＸｌ
Ｏ−’　　　２．５ＸｌＯ−８（Ｓ−２２２４） Ｄ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐ−ＮＡ　　２．３ＸＩ
Ｏ−３１，１ＸｌＯ−’（Ｓ−２２８８） （ｈ）　　酵素的性質に影響を与えるプラズミノゲン活
性化物 Ａ、阻害 プラズミノゲン活性化物のフィブリン分解活性はジイソ
ブロビルフルオロフ十−スファート（ＤＦＰ）とと乙に
インキュベートすることによって阻害される。

Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−クロロメチルケトンはプ
ラズミノゲン活性化物とプラズミ、ノゲンの水溶性の不
可逆的阻害剤である。

プラズミノゲン活性化物のアミド分解活性に対する尿素
の影響の検定に直接発色試験法が使用された。尿素濃度
の増加とともに活性の減少が観察された。１Ｍ尿素にお
いて５０％の活性損失が起った。

同様の試験法が活性に対するＰＨの影響を測定するため
に使用された。ｐＨを５〜１０の間で変化さ什たところ
、ｐＨ８，５で最大値が観察された。

プラズミノゲン活性化物製剤は、６．０で本質的に不活
性である。

温度の影響が２５℃から５ピＣで調べられた。

アミド分解活性は温度に直接関係することが見いだされ
た。アレニウス・プロットの傾斜から求められた活性化
エネルギーはプラズミノゲン活性化物に対して１．５６
±０　、１１　Ｋｃａｌ／ｍｏｌであった。

Ｂ、活性 プラズミノゲン活性化物のフィブリン分解活性はリン酸
塩濃度に依存する。ｐ＋−ｒ　７　４リン酸塩層度０．
０６Ｍで、プラズミノゲン濃度に無関係に最高活性が得
られる。低プラズミノゲン濃度では、みかけの活性はリ
ン酸塩濃度の変化に著しく影響される。クロット溶解反
応の強いイオン強度依存性は多分、活性化物とプラズミ
ノゲンとフィブリンの間の相互作用による効果に関係し
ている。このことはプラズミノゲンの種々の濃度におけ
るリン酸濃度の依存性における観察された変化によって
裏付けられる。

プラズミノゲン活性化物によって誘起されるクロット溶
解はｐ　Ｈに依存する。０．０６Ｍリン酸緩衝液中で、
最適りＨは７４てあり、ＰＨ６，・１でし最高活性の５
０％は残り、ｐ＋−１８，２でら最大活性の７０％残る
。

実施例４　アプロチニンの存在下での方法アプロチニン
（ドイツ連邦共和国、レーフエルクーセンのバイエル）
を血清含有及び無血清の成育培体（最終濃度２０　Ｋ　
Ｉ　Ｕ／ｍＱ、即ちｍｆ２当り２０力リクライン阻止剤
単位）に共に加えたほかは、実施例１の方法に従って黒
色腫細胞を培養した。

各日の終りに培養液を収集ならびに取替して連続３日間
インキュベートさせた後に、結合培養液は約［８０μｇ
／ｍＱの蛋白質含有量と約６０ｔＵ／ｍｃ（あるいは約
３３０１０／ｍｇ）のプラズミノゲン活性化物を持って
いた。

液の蛋白質含有量及びプラズミノゲン活性化物の活性は
前実施例で行なったと同じ方法で測定したが、プラズミ
ノゲン活性化物溶液中に存在するアプロチニンはフィブ
リン板上の応答を減じるように思われたので、適当な量
のアプロチニン（この場合は最終濃度が２０　Ｋ　Ｉ　
Ｕ／ｍｃになるまで）をアストラツプらの方法における
標準として用いるウロキナーゼ溶液に加えた。

アプロチニンを第１及び第２の精製段階の緩衝液（最終
濃度１０１　ＵＫ／′ｍ（２）に加えるほかは、実施例
２と同様にして結合培養液を３段階精製方法にかけた。

アプロチニンのない最終製品を得るために、このアプロ
チニンは第３段中では省いた。

アプロチニンの存在はクロマトグラフィー上の挙動にも
プラズミノゲン活性化物の収率及び特殊活性に６影響し
なかった。そしてこのことは実施例２におけると同様の
結果が得られたことを意味した。

精製されたプラズミノゲン活性化物溶液を実施例３と同
様にいくつかの特徴化試験にかけた。

ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた場合
、活性化物は想定分子ｆｉ７２，０００で１帯域を示し
た。ジチオトレイトールで還元した後には再び想定分子
量約７２，０００を持ったｌ帯域が観察された。これは
天然の非劣化物であることを示して居り、これに対し実
施例３において試験した製品は蛋白質分解の劣化物であ
るかもしれない。

６ＭのＨＣＣで真空中で１１０℃で２０時１謂加水分解
し、続いてアミノ酸測定した場合、本実施例の活性化物
は下記のアミノ組成を示した（合計のパーセントで表わ
す）。

アスパラギン酸　　　　　　　　　　　９．８トレオニ
ン　　　　　　　　　　　　　　５．４セリン　　　　
　　　　　　　　　９．２グルタミン酸　　　　　　　
　　　　　　１３．１プロリン　　　　　　　　　　　
　　　　７．１グリシン　　　　　　　　　　　　　１
０．４アラニン　　　　　　　　　　　　　　　６．６
ンステイン　　　　　　　　　　　　　未測定ヴアリン
　　　　　　　　　　　　　　　４．１メヂオニン　　
　　　　　　　　　　　０．９イソロイシン　　　　　
　　　　　　　３．０ロイシン　　　　　　　　　　　
　　　８．１ヂロノン　　　　　　　　　　　　　　４
，０フエニルアラニン　　　　　　　　　　　３．７ヒ
スチジン　　　　　　　　　　　　　３．３リジン　　
　　　　　　　　　　　　　５．５アルギニン　　　　
　　　　　　　　　５．９トリプトフアン　　　　　　
　　　　未測定更に、本実施例の活性化物はフィブリン
に対する充分な結合能力を持っているように思われ、そ
して免疫拡散分析及びクエンチング実験に付した場合、
実施例２の製品と同様に挙動した。

実施例５　繊維素溶解、フィブリノゲン溶解、及び血栓
溶解効果 新規のプラズミノゲン活性化物及びウロキナーゼの関係
繊維素溶解効果を新鮮な冷凍ｌ１ｌｌｌ液銀行面漿で構
成された塊溶解方式で比較した。二重試験管中で、０　
、４　ｍＱの血漿を合わせて５０μＱの活性化物溶液（
最終濃度は１ｍＣにつきｌＯ乃至２００ＩＵに亘る）及
び５０ｍＣの人間のトロンビン（Ｑ終濃度は１ｍ１２に
つきＩ　Ｎ　Ｉ　１−１単位ＸＮ　Ｉ　Ｈとは米国メリ
ーランド州ベセスダのナンヨナル・インステイテユート
・才ブ・ヘルスをいう）と混合しｌ二。

活性化物は一方の系統においては実施例２から生成した
新規なプラズミノゲン活性化物であり、池の系統の実験
においてはウロキナーゼであった。

商魂形成後、混合物を３７℃でインキュベートし、そし
て完全に商魂が溶解するのに要した時間を記録した。

この方式においては、フィブリンの塊が血漿フィブリノ
ゲンに加えたトロンビンの作用によって形成され、そし
て血漿プラズミノゲンのプラスミンへの転化を生じさせ
る加えられた活性化物によって商魂の溶解が行なわれ得
る。この商魂の溶解は血漿中にアンチプラスミンを存在
させることによって拮抗させてもよい。

両店性化物とも商魂の溶解を生じさせ、そしてそれゆえ
繊維素溶解の効果をもつように見えたが、しかしこれら
の効果の性格は異っていた。活性化物の濃度の高い場合
は溶解の時間は匹敵し得るものであったが、低濃度の場
合は新規のプラズミノゲン活性化物はウロキナーゼより
もはるかに効果が大きかった。１ｍ１２当り８０単位の
ウロキナーゼ濃度においては血漿塊は２４時間で溶解し
なかったが、新規なプラズミノゲン活性化物２０単位で
生じさけた溶解時間は２時間未満であった。

ｂ）新規なプラズミノゲン活性化物とウロキナーゼとの
フィブリノゲン溶解効果を血漿系において比較した。１
．８ｍ１２の人間の血漿に０　、２　ｍ（ｌの活性化物
溶液（最終濃度は５乃至２００　Ｉ　Ｕ／ｍｆ２に亘る
）を加えた。異った時間々隔で、０　、２　ｍｉ２の試
料を採って、ヴアーミレンらによるＣｌ１ｎ、Ｃｈｉｍ
、Ａｃｔａ、８，４１８−４２４．（１９６３）の方法
によってそのフィブリノゲン準位を測定した。

ウロキナーゼと新規な活性化物との間には挙動において
差があるように思われた。Ｉｍｆ２につき１００ユニツ
トにおいて、僅かな程度のフィブリノゲン破断がウロキ
ナーゼについては認められたが、新規なプラズミノゲン
活性化物については認められなかった。

Ｃ）新規なプラズミノゲン活性化物とウロキナーゼとの
血栓溶解効果を、活性化物を徐々に注入した循環する血
液の血漿の１にけん濁させた放射性の人間の血栓から成
る人工の系について測定した。

古株化物の注入開始面と８−１２時間の時間間隔て血漿
の試料を採取した。血栓溶解の程度を放出された放射能
から推定してパーセントで表わした。

血漿１ｍＱ当りＩＯ単位以上の新規プラズミノゲン活性
化物では１２時間で著しい血栓溶解が得られｒ二か、１
ｎ（２当り２０単位のウロキナーゼではこれが得られな
いようであった。この系におけろ新規な活性化物の特殊
血栓溶解効果はウロキナーゼの効果よりも約１０倍高い
。更に、活性化物注入が終わった後はウロキナーゼによ
る血栓溶解の速度は低下する傾向にあるのに対して、新
規なプラズミノゲン活性化物によって生起させた血栓溶
解はこれよりもずっと進行性がある。

参考例　薬剤 ０００１％のトウィーン８０とｏ、ｏｔ−ｔ％のアルブ
ミンまたはマンニトールを含む燐酸塩緩衝生理食塩水溶
液に入れた新規活性化物の溶液を静脈内注射用剤として
用いろことができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、血栓溶解活性を有し、ウロキナーゼとは免疫学的に
   異なり、かつフィブリンに対する結合能力を有する、純
   化されたヒトプラズミノゲン活性化物。 ２、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によっ
   て測定された分子量が約７２，０００であることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載のプラズミノゲン活性
   化物。 ３、非劣化分子である特許請求の範囲第２項記載のプラ
   ズミノゲン活性化物。 ４、１．６Ｍチオシアンカリ及びトウィーン８０非イオ
   ン性界面活性剤０．０１％（Ｖ／Ｖ）を含有するｐＨ７
   ．５の０．０１Ｍリン酸塩緩衝液の溶液として、架橋結
   合したデキストラン粒子（セファデックスＧ−１５０）
   のゲル濾過にかけた場合、単一の濾過蛋白ピークを与え
   る特許請求の範囲第２項又は第３項記載のプラズミノゲ
   ン活性化物。 ５、少なくとも約９０，０００ＩＵ／ｍｇ（検定標準と
   してウロキナーゼの世界保健機構第１国際参考製剤を使
   用）の特異活性を与える特許請求の範囲第１項乃至第４
   項記載のプラズミノゲン活性化物。 ６、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によっ
   て測定された場合還元形態においてそれぞれ約３３，０
   ００及び３９，０００の分子量を持つ二つのバンドを与
   える特許請求の範囲第２項記載のプラズミノゲン活性化
   物。 ７、人間の黒色腫細胞から得られ、ＳＤＳ−ポリアクリ
   ルアミドゲル電気泳動法によって測定された分子量が約
   ７２，０００であり、かつ特異活性が少なくとも約９０
   ，０００ＩＵ／ｍｇ（検定標準としてウロキナーゼの世
   界保健機構第１国際参考製剤を使用）である純化された
   プラズミノゲン活性化物に対して形成された抗血清と反
   応する特許請求の範囲第１項乃至第６項記載のプラズミ
   ノゲン活性化物。 ８、該血清のＩｇＧ分画と反応する特許請求の範囲第７
   項記載のプラズミノゲン活性化物。 ９、人間の黒色腫細胞から得ることが出来る特許請求の
   範囲第１項乃至第８項記載のプラズミノゲン活性化物。 １０、第１表によるアミノ酸組成を有する特許請求の範
   囲第１項乃至第９項記載のプラズミノゲン活性化物。 １１、第３表によるアミノ酸組成を有する特許請求の範
   囲第１項乃至第９項記載のプラズミノゲン活性化物。 １２、人間の黒色腫細胞培養液を配位子交換クロマトグ
   ラフィー、親和クロマトグラフィー及びゲル濾過の各工
   程を経て精製することを特徴とする特許請求の範囲第１
   項乃至第１１項記載のプラズミノゲン活性化物の製造方
   法。 １３、アガロースの金属キレートを用いて配位子交換ク
   ロマトグラフィーを行なうことを特徴とする特許請求の
   範囲第１２項記載の方法。 １４、レクチン・アガロースを用いて親和クロマトグラ
   フィーを行なうことを特徴とする特許請求の範囲第１２
   項記載の方法。 １５、架橋結合したデキストラン粒子を用いてゲル濾過
   を行うことを特徴とする特許請求の範囲第１２項記載の
   方法。 １６、全ての精製工程を非イオン性界面活性剤の存在下
   に行なうことを特徴とする特許請求の範囲第１２項乃至
   第１５項記載の方法。 １７、精製工程をアプロチニンの存在下に行うことを特
   徴とする特許請求の範囲第１２項乃至第１５項記載の方
   法。