DE3348289C2 - Verfahren zur Herstellung von Human-Gewebe-Plasminogen-Aktivator - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Humangewebe-Plasminogen-Aktivator, mit dem dieser in homo­ gener Form in therapeutisch erheblichen Mengen hergestellt werden kann.

Die Erfindung beruht zum Teil auf der Ermittlung der DNA- Sequenz und abgeleiteten Aminosäuresequenz von Human-Plasmino­ gen-Aktivator. Diese Ermittlung ermöglichte die Bildung von Human-Plasminogen-Aktivator unter Anwendung der rekombinanten DNA-Technik, die wiederum die Bildung von Material in aus­ reichender Qualität und Menge möglich machte, um Tierversuche und klinische Untersuchungen als Voraussetzung für eine Markteinführung durchzuführen, wobei keine Beschränkungen vorlagen, mit denen bisherige Isolationsverfahren mittels Produktion und Extraktion vorhandener Zellkulturen notwendi­ gerweise behaftet sind.

Druckschriftliche Veröffentlichungen und andere Materialien, die den technischen Hintergrund der Erfindung erläutern und in speziellen Fällen auch zusätzliche Einzelheiten bezüglich der praktischen Durchführung der Erfindung liefern, sind in der nachstehenden Beschreibung mit Nummern gekennzeichnet. Diese Nummern beziehen sich auf die Bibliographie am Ende der Beschreibung.

A. Humangewebe-Plasminogen-Aktivator

Das fibrinolytische System befindet sich in einem dynami­ schen Gleichgewicht mit dem Koagulationssystem, wodurch ein intaktes, offenes Gefäßbett aufrechterhalten wird. Das Ko­ agulationssystem lagert Fibrin als eine Matrix ab, die zur Wiederherstellung eines hämostatischen Zustands dient. Das fibrinolytische System entfernt das Fibrinnetzwerk, nach­ dem der hämostatische Zustand erreicht ist. Der fibrinoly­ tische Prozeß wird durch das proteolytische Enzym Plasmin, das aus dem Plasmaprotein-Vorläuferprodukt Plasminogen ge­ bildet wird, hervorgerufen. Plasminogen wird durch Aktivie­ rung mittels eines Aktivators in Plasmin umgewandelt.

Gegenwärtig sind im Handel zwei Aktivatoren erhältlich, näm­ lich Streptokinase und Urokinase. Beide sind zur Behandlung von akuten Gefäßerkrankungen, wie Myokardinfarkt, Schlagan­ fall, Lungenembolie, tiefe Venenthrombose, peripherer Arte­ rienverschluß und andere venöse Thrombosen, indiziert. Ins­ gesamt stellen diese Krankheiten schwerwiegende Gesundheits­ risiken dar.

Die diesen Krankheiten zugrunde liegenden ätiologische Basis besteht in einem partiellen oder - in schweren Fällen - to­ talen Verschluß eines Blutgefäßes durch ein Gerinnsel, d. h. Thrombus oder Thromboembolus. Bei der herkömmlichen Antiko­ agulationstherapie, zum Beispiel mit Heparin und Cumarin, wird nichts getan, um die Auflösung von Thrombi oder Throm­ boemboli direkt zu fördern. Die vorstehend erwähnten throm­ bolytischen Mittel Streptokinase und Urokinase werden in der Praxis eingesetzt, unterliegen aber beide starken Beschrän­ kungen. Keines der beiden Mittel besitzt eine hohe Affini­ tät für Fibrin, so daß sie zirkulierendes und fibringebun­ denes Plasminogen relativ wahllos aktivieren. Das im zirku­ lierenden Blut gebildete Plasmin wird relativ rasch neutra­ lisiert und ist für die Thrombolyse verloren. Restliches Plasmin baut verschiedene Gerinnungsfaktorproteine ab, zum Beispiel Fibrinogen, Faktor V und Faktor VIII, was ein hä­ morrhagisches Potential verursacht. Ferner ist Streptokinase stark antigen, und Patienten mit hohen Antikörpertitern re­ agieren ungenügend auf die Behandlung und können nicht unter Dauerbehandlung bleiben. Die Urokinasetherapie ist teuer, was auf die Isolierung aus menschlichem Urin oder Gewebekul­ turen zurückzuführen ist, so daß sie sich in der klinischen Praxis nicht allgemein durchgesetzt hat. Urokinase ist Ge­ genstand zahlreicher Untersuchungen gewesen; vgl. zum Bei­ spiel Literaturstellen 1-6.

Sogenannte Plasminogen-Aktivatoren wurden aus verschiedenen Humangeweben, zum Beispiel Uterusgewebe, Blut, Serum (vgl. allgemein Literaturstellen 7-11) und Zellkulturen iso­ liert (94). Zusammensetzungen davon wurden ebenfalls be­ schrieben (vgl. Literaturstellen 12, 13 und 14-18). Die aus diesen Quellen abgeleiteten Plasminogen-Aktivatoren wurden in zwei Hauptgruppen eingeteilt: Plasminogen-Aktivatoren vom Urokinasetyp (u-PA) und Plasminogen-Aktivatoren vom Gewebe­ typ (t-PA), basierend auf Unterschieden in den immunologi­ schen Eigenschaften. (Die Abkürzungen t-PA und u-PA wurden beim XXVIII Meeting of the International Committee on Throm­ bosis and Hemostasis, Bergamo, Italien, 27. Juli 1982, vor­ geschlagen.)

Kürzlich wurde eine Humanmelanomlinie identifiziert, die t-PA sekretiert. Die Charakterisierung dieses Melanom-Plas­ minogen-Aktivators ergab, daß er sich sowohl immunologisch als auch im Hinblick auf die Aminosäurezusammensetzung von aus normalem Humangewebe isoliertem Plasminogen-Aktivator nicht unterscheiden läßt (Literaturstellen 19, 88).

Das Produkt wurde in relativ reiner Form isoliert und cha­ rakterisiert. Es wurde festgestellt, daß es sich um ein hochaktives, fibrinolytisches Mittel handelt (20).

Einige Untersuchungen (vgl. zum Beispiel Literaturstellen 95-98), die aus Melanomzellinien gereinigte t-PA verwendeten, ergaben für dieses Produkt im Vergleich zu Plasminogen-Akti­ vatoren vom Urokinasetyp eine höhere Affinität für Fibrin.

Eingehendere Untersuchungen von Human t-PA als potentielles, thrombolytisches Mittel wurden jedoch durch dessen äußerst niedrige Konzentration in Blut, Gewebeextrakten, Gefäßper­ fusionsprodukten und Zellkulturen behindert.

Man nahm an, daß die Anwendung der rekombinanten DNA-Tech­ nik einen sehr wirksamen Weg zur Bereitstellung der erfor­ derlichen, großen Mengen an qualitativ hochwertigem Plas­ minogen-Aktivator vom Humangewebetyp (vorher als Human-Pla­ minogen-Aktivator bezeichnet), der im wesentlichen frei von anderem Humanprotein ist, darstellt. Diese Materialien soll­ ten vermutlich biologisch aktiv sein, was ihre klinische Verwendung bei der Behandlung verschiedener kardiovaskulärer Zustände oder Krankheiten ermöglichen würde.

B. Rekombinante DNA-Technik

Die rekombinante DNA-Technik hat in letzter Zeit eine er­ hebliche Verfeinerung erfahren. Die Molekularbiologen sind in der Lage, verschiedene DNA-Sequenzen relativ leicht zu rekombinieren und neue DNA-Einheiten zu schaffen, die zur Bildung von erheblichen Mengen an exogenen Proteinprodukten in transformierten Mikroben und Zellkulturen fähig sind. Es stehen allgemeine Mittel und Verfahren zur in vitro-Liga­ tion von verschiedenen DNA-Fragmenten mit stumpfen oder ko­ häsiven Enden zur Verfügung, die zur Bildung von leistungs­ fähigen Expressionsvehikeln führen, mit denen spezielle Organismen transformiert werden können, so daß deren Syn­ theseleistung auf das gewünschte, exogene Produkt gerichtet wird. Bei einzelnen Produkten ist dieses Verfahren jedoch recht umständlich. Die Kenntnisse sind noch nicht so weit fortgeschritten, daß regelmäßige Vorhersagen über die Er­ folgsaussichten gemacht werden können. Versucht man Erfolge ohne entsprechende, experimentelle Basis vorherzusagen, so läuft man Gefahr zu scheitern.

Die DNA-Rekombination der wesentlichen Elemente, d. h. ein Startpunkt der Replikation, eine oder mehrere phänotypi­ sche Selektionscharakteristiken, ein Expressionspromotor, heterologes Geninsert und restlicher Vektor, findet im all­ gemeinen außerhalb der Wirtszelle statt. Das erhaltene, re­ kombinante, replizierbare Expressionsvehikel oder Plasmid werden in die Zellen durch Transformation eingeführt und große Mengen des rekombinanten Vehikels durch Wachstum des Transformanten erhalten. Wird das Gen in bezug auf die Teile, die die Transkription und Translation der einkodierten DNA- Botschaft steuern, in geeigneter Weise mit Inserts versehen, so eignet sich das erhaltene Expressionsvehikel zur tatsäch­ lichen Bildung der Polypeptidsequenz, für die das eingesetzte Gen kodiert; ein Vorgang, der als Expression bezeichnet wird. Das gebildete Produkt kann gegebenenfalls durch Lysis der Wirts­ zelle in mikrobiellen Systemen und Gewinnung des Produkts durch entsprechende Reinigung von anderen Proteinen erhalten werden.

In der Praxis kann die Verwendung der rekombinanten DNA- Technik zur Expression von vollkommen heterologen Polypep­ tiden - sogenannte direkte Expression - oder zur Expression eines heterologen Polypeptids führen, das mit einem Teil der Aminosäuresequenz eines homologen Polypeptids verschmolzen ist. In den letztgenannten Fällen wird das gewünschte, bio­ aktive Produkt gelegentlich innerhalb des verschmolzenen, homolog/heterologen Polypeptids biologisch inaktiv, bis es in einer extrazellulären Umgebung gespalten wird; vgl. (21) und (22).

In ähnlicher Weise ist die Technik von Zell- oder Gewebekul­ turen für genetische und zellphysiologische Untersuchungen gut eingeführt. Mittel und Methoden zur Erhaltung von per­ manenten Zellinien, die durch sukzessive Serienübertragungen von isolierten, normalen Zellen hergestellt werden, stehen zur Verfügung. Für Forschungszwecke werden derartige Zel­ linien auf einem festen Träger in einem flüssigen Medium gehalten oder in Suspension mit einem Gehalt an erhaltenden Nährstoffen gezüchtet. Eine Vergrößerung des Herstellungs­ maßstabs zur Herstellung von großen Präparatemengen scheint nur eine Frage der mechanischen Möglichkeiten zu sein. Zur Vertiefung wird in diesem Zusammenhang auf die Literatur­ stellen (23) und (24) verwiesen.

Ebenso stellt die Proteinbiochemie ein wertvolles, ja not­ wendiges Hilfsmittel in der Biotechnologie dar. Zellen, die das gewünschte Protein bilden, bilden darüber hinaus noch Hunderte von anderen Proteinen, endogenen Produkten des Zellstoffwechsels. Diese verunreinigenden Proteine sowie andere Verbindungen können, wenn sie nicht vom gewünschten Protein abgetrennt werden, bei Verabreichung an Tiere oder Menschen im Verlauf einer therapeutischen Behandlung mit dem gewünschten Protein toxisch wirken. Hier kommen die Me­ thoden der Proteinbiochemie zum Tragen, die die Bereitstel­ lung von Trennungsverfahren ermöglichen, die für das spe­ zielle, in Betracht kommende System geeignet sind und zur Bildung eines für den beabsichtigten Verwendungszweck si­ cheren, homogenen Produkts führen. Die Proteinbiochemie er­ möglicht auch eine Identifizierung und Charakterisierung die­ ses Produkts und stellt sicher, daß die gebildeten Zellen das Produkt ohne Veränderungen oder Mutationen gebildet ha­ ben. Dieser Zweig der Wissenschaft befaßt sich auch mit der Ausarbeitung von Bioassays, Stabilitätsuntersuchungen und anderen Verfahren, die durchgeführt werden müssen, bevor erfolgreiche, klinische Untersuchungen oder eine Marktein­ führung möglich sind.

Die Erfindung beruht auf dem Befund, daß die rekombinante DNA-Technik geeignet ist zur Herstellung von Humangewebe- Plasminogen-Aktivator (t-PA), vorzugsweise in direkter Form und in Mengen, die ausreichen, Tierversuche und klinische Untersu­ chungen, die eine Voraussetzung für eine Marktzulassung sind, zu initiieren und durchzuführen. Der gebildete t-PA eignet sich für alle Formen der prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung des Menschen bei verschiedenen kardiovaskulären Zuständen oder Krankheiten.

Gegenstand der Erfindung ist das in Anspruch 1 angegebene Verfahren zur Herstellung von t-PA. Bevorzugte Ausführungs­ formen dieses Verfahrens sind Gegenstand der Unteransprüche 2 bis 8.

Fig. 1 zeigt das Ergebnis einer 10%-Natriumdodecylsulfat-Poly­ acrylamid-Gelelektrophorese (10% SDS PAGE) von mit t-PA IgG fällbaren, mit ³⁵S-Methionin markierten Proteinen, sekretiert aus Melanomzellen mit und ohne Proteaseinhibitor.

Fig. 2 zeigt die Elektrophorese der immunopräzipitierten Translationsprodukte von aus Melanomzellen abgeleiteten mRNA-Fraktionen.

Fig. 3 zeigt das Hybridisierungsmuster von 96 bakteriellen, mit cDNA trans­ formierten Kolonien unter Verwendung des Pools von ³²P-mar­ kiertem 14-mer als Tracer, hergestellt auf der Basis einer 5-Aminosäuresequenz von Human t-PA.

Fig. 4 zeigt eine Restriktionsendonucleasekarte von Human t-PA cDNA in voller Länge.

Fig. 5a, 5b und 5c zeigen die Nucleotidsequenz und abgelei­ tete Aminosäuresequenz von Human t-PA cDNA in voller Länge.

Fig. 6 zeigt ein Schema des Aufbaus des Expressionsplasmids pΔRIPA°.

Fig. 7 zeigt die Ergebnisse eines Fibrin-Plattentests zur Bestimmung der fibrinolytischen Aktivität der mit pΔRIPA° transformierten E. coli-Zellen.

Fig. 8 ist ein HPLC-Diagramm von Peptiden eines Trypsinver­ dauungsprodukts von Human t-PA.

Fig. 9 zeigt den Aufbau eines für die direkte Expression von reifem Human t-PA in E. coli kodierenden Plasmids.

Fig. 10 zeigt die Ergebnisse eines Fibrin-Plattentests zur Bestimmung der fibrinolytischen Aktivität von Human t-PA, das durch mit pt-PAtrp12 transformiertes E. coli gebildet ist.

Fig. 11 zeigt den Aufbau von DHFR (Mutante oder Wildtyp)/t-PA, das zur Transformation in Säugetiergewebekulturzellen geeignete Plasmide kodiert.

Fig. 12 ist ein schematisches Diagramm des Humangewebe-Plas­ minogen-Aktivators, der gemäß der hier in E.1 erläuterten Methode hergestellt worden ist.

A. Definitionen

Die Ausdrücke "Humangewebe-Plasminogen-Aktivator" oder "Hu­ man t-PA" oder "t-PA" betreffen den durch Mikroorganismen- oder Zellkultursysteme gebildeten, exogenen (Gewebetyp) Plasminogen-Aktivator in bioaktiven Formen, der einen Pro­ teaseteil umfaßt und den für Humangewebe nativen Gewebe- Plasminogen-Aktivatoren entspricht. Das erfindungsgemäß ge­ bildete Humangewebe-Plasminogen-Aktivatorprotein wurde mit­ tels eines bestimmten DNA-Gens und der abgeleiteten Aminosäu­ resequenz definiert. Es ist klar, daß natürliche allele Variationen vorkommen und von Individuum zu Individuum auf­ treten. Diese Variationen können sich durch eine oder meh­ rere unterschiedliche Aminosäuren in der Gesamtsequenz oder durch Deletionen, Substitutionen, Insertionen, Inversionen oder Additionen von einer oder mehreren Aminosäuren dieser Sequenz bemerkbar machen. Ferner hängt die Stellung und das Ausmaß der Glycosylierung von der Natur der Wirtszellenum­ gebung ab.

Bei der Anwendung rekombinanter DNA-Technik besteht die Mög­ lichkeit zur Herstellung verschiedener Humangewebe-Plasmino­ gen-Aktivatorderivate, die in verschiedener Weise durch ein­ fache oder mehrfache Substitution, Deletion, Addition oder Ersatz von Aminosäuren modifiziert sind, beispielweise durch gezielte Mutagenese der zugrunde liegenden DNA. Umfaßt wird auch die Herstellung von Derivaten, bei denen der wesentli­ che "kringle"-Bereich und der Serinprotease-Bereich, die im allgemeinen für den hier speziell beschriebenen Humangewebe- Plasminogen-Aktivator charakteristisch sind, erhalten sind, die aber ansonsten auf die vorstehend beschriebene Weise modifiziert sind. Sämtliche derartigen allelen Variationen und Modifikationen, die zu Derivaten von Humangewebe-Plas­ minogen-Aktivator führen, fallen unter den Gegenstand der Erfindung, desgleichen auch andere verwandte, exogene (Geb­ webetyp) Human-Plasminogen-Aktivatoren, die physikalisch und chemisch ähnlich sind, sofern die wesentliche charak­ teristische Aktivität von Humangewebe-Plasminogen-Aktivator in ihrer Art unbeeinträchtigt bleibt.

Es wird Humangewebe-Plasminogen-Aktivator hergestellt, 1) der Methionin als erste Aminosäure (vorhanden auf Grund der ATG-Startsignalcodoninsertion zu Beginn des Strukturgens) oder 2) der, wenn das Methionin intra- oder extrazellulär gespal­ ten ist, seine normalerweise erste Aminosäure aufweist oder 3) der zusammen entweder mit seinem Signalpolypeptid oder einem sich vom herkömmlichen Signalpolypeptid unterscheiden­ den, konjugierten Protein vorliegt, wobei das Signalpolypep­ tid oder das Konjugat spezifisch in einer intra- oder extra­ zellulären Umgebung abspaltbar sind (vgl. Literaturstelle 21), oder 4) der durch direkte Expression in reifer Form erhältlich ist, ohne daß die Notwendigkeit zur Abspaltung eines nicht dazugehörigen, überflüssigen Polypeptids be­ steht. Das letztgenannte Produkt ist besonders wichtig, wenn ein bestimmter Wirt nicht oder nicht in ausreichendem Umfang zur Entfernung eines Signalpeptids in der Lage ist, sofern das Expressionsvehikel so aufgebaut ist, daß es den Gewebe-Plasminogen-Aktivator zusammen mit dessen Signalpep­ tid exprimiert. Auf jeden Fall wird der auf diese Weise ge­ bildete Human t-PA in seinen verschiedenen Formen gewonnen und soweit gereinigt, daß er sich zur Behandlung verschie­ dener vaskulärer Zustände oder Krankheiten eignet.

Ferner besitzt t-PA Formen, die sowohl das Einzelketten- (1-Kette)-Protein als auch das 2-Ketten-Protein umfassen. Das letztgenannte Produkt leitet sich proteolytisch von der 1-Ketten-Verbindung ab. Es wird angenommen, daß das 2-Ketten-Protein mit dem gebildeten Fibrin assoziiert ist und daß die proteolytische Umwandlung vom 1- in das 2-Ketten- Material am Ort der Umwandlung vom Plasminogen zu Plasmin erfolgt. Die Verabreichung des 1-Ketten-Proteins zur vorstehend beschriebenen in vivo-Umwand­ lung oder die Verabreichung des 2-Ketten-Proteins, das sich ebenfalls als aktiv erwiesen hat, kommt in Frage. Das 2-Ketten- Protein kann durch in vitro-proteolytische Umwandlung her­ gestellt werden, nachdem das 1-Ketten-Material gebildet ist. Ein sogenannter "kringle"-Bereich findet sich oberhalb des Serinproteasebereichs. Es wird angenommen, daß dieser eine wichtige Funktion bei der Bindung des Gewebe-Plasminogen- Aktivators an eine Fibrinmatrix spielt. Darauf beruht die beobachtete, spezifische Aktivität des erfindungsgemäßen Gewebe-Plasminogen-Aktivators gegen fühlbare vorhandene Thromben. Der erfindungsgemäße Gewebe-Plasminogen-Aktivator wird mit einem Gehalt an dem enzymatisch aktiven Bereich gebildet, der dem nativen Material entspricht. Der Ausdruck Humangewebe-Plasminogen-Aktivator definiert Produkte, die diesen Bereich allein oder zusammen mit zusätzlichen Aminosäure­ sequenzen bis zur vollen Länge des Moleküls umfassen.

Zusammenfassend läßt sich für die vorliegende Erfindung Human t-PA folgendermaßen funktionell definieren: Es ist in der Lage, die Umwandlung von Plasminogen zu Plasmin zu katalysieren, geht eine Bindung mit Fibrin ein und wird auf Grund der vorstehend dargelegten immunologischen Eigenschaf­ ten als t-PA klassifiziert.

Der Ausdruck "in im wesentlichen reiner Form" beschreibt den Zustand von erfindungsgemäß gebildetem Human t-PA, das frei von Protein oder anderen normalerweise mit Human t-PA assoziierten Materialien ist, die bei Bildung durch nicht­ rekombinante Zellen, d. h. in der "nativen" Umgebung, ent­ stehen.

Der Ausdruck "DHFR-Protein" bezieht sich auf ein Protein, das die mit Dihydrofolat-reductase (DHFR) assoziierte Akti­ vität entfaltet und das daher von Zellen gebildet werden muß, die in einem Medium mit einem Mangel an Hypoxanthin, Glycin und Thymidin (-HGT-Medium) nicht lebensfähig sind. Im allgemeinen können Zellen mit einem Mangel an DHFR-Pro­ tein auf diesem Medium nicht wachsen, während Zellen mit ei­ nem Gehalt an DHFR-Protein dazu in der Lage sind.

Der Ausdruck "gegenüber MTX empfindliche Zellen" betrifft Zellen, die nicht in der Lage sind, auf Medien, die den DHFR- Inhibitor Methotrexat (MTX) enthalten, zu wachsen. Bei die­ sen "gegenüber MTX empfindlichen Zellen" handelt es sich um solche Zellen, die ohne eine genetische Veränderung oder eine anderweitige Ergänzung nicht in der Lage sind, unter Bedingungen, die für den Zelltyp in bezug auf Umgebung und Medium an sich geeignet sind, zu wachsen, wenn die MTX-Konzentra­ tion 0,2 µg/ml oder mehr beträgt. Einige Zellen, zum Beispiel Bakterien, besitzen keine MTX-Empfindlichkeit, was darauf zurückzuführen ist, daß sie MTX nicht in ihre Zellbegren­ zungen gelangen lassen, selbst wenn sie DHFR enthalten, das ansonsten gegenüber diesem Arzneistoff empfindlich wäre. Im allgemeinen sind Zellen, die als DHFR-Protein Wildtyp-DHFR enthalten, gegenüber Methotrexat empfindlich, wenn sie in bezug auf MTX durchlässig oder zu dessen Aufnahme in der Lage sind.

Der Ausdruck "Wildtyp-DHFR" bezieht sich auf Dihydrofolat­ reductase, wie sie üblicherweise in dem speziellen in Fra­ ge kommenden Organismus gefunden wird. Wildtyp-DHFR ist im allgemeinen in vitro empfindlich gegenüber niedrigen Kon­ zentrationen an Methotrexat.

Der Ausdruck "DHFR-Protein mit geringer Bindungsaffinität für MTX" ist funktionell definiert. Es handelt sich um ein DHFR-Protein, das bei Bildung innerhalb von Zellen das Wachs­ tum von MTX-empfindlichen Zellen in einem Medium mit einem Gehalt an 0,2 µg/ml oder mehr MTX ermöglicht. Es ist ersicht­ lich, daß eine derartige funktionelle Definition von der Leichtigkeit, mit der der Organismus das "DHFR-Protein mit nied­ riger Bindungsaktivität für MTX" bildet sowie vom Protein selbst abhängt. Jedoch sollte im Rahmen der vorliegenden Er­ findung ein derartiger Ausgleich zwischen diesen beiden Me­ chanismen keine Schwierigkeiten bereiten. Erfindungsgemäß wird eine Überlebensfähigkeit bei diesen MTX-Konzentrationen gewährleistet. Es ist belanglos, ob die Fähigkeit hierzu zusätzlich zur vorhandenen Natur des gebildeten DHFR durch erhöhte Expression beeinflußt wird. Ein geeignetes DHFR- Protein, das dieser Definition entspricht, ist in der US- Anmeldung 459 151 vom 19. Januar 1983 beschrieben.

Der Ausdruck "Expressionsvektor" umfaßt Vektoren, die zur Expression von hier in Betracht kommenden DNA-Sequenzen in der Lage sind, wobei diese Sequenzen funktionell mit anderen Sequenzen verknüpft sind, die zur Durchführung von deren Ex­ pression in der Lage sind. Es wird stillschweigend angenom­ men, wenn auch nicht immer ausdrücklich erwähnt, daß diese Expressionsvektoren in den Wirtsorganismen entweder als Epi­ somen oder als integrierender Bestandteil der chromosomalen DNA replizierbar sein müssen. Ein Mangel an Replikationsfä­ higkeit würde sie ganz eindeutig unbrauchbar machen. Zusam­ mengefaßt ist der Ausdruck "Expressionsvektor" funktionell definiert. Jede DNA-Sequenz, die zur Expression eines be­ stimmten, hier in Frage kommenden DNA-Codes in der Lage ist, fällt unter diesen Ausdruck, sofern er auf die bestimmte Sequenz angewandt wird. Im allgemeinen liegen für rekombinan­ te DNA-Techniken geeignete Expressionsvektoren häufig in Form von "Plasmiden" vor, wobei dieser Ausdruck sich auf kreisförmige, doppelsträngige DNA-Schleifen bezieht, die in ih­ rer Vektorform nicht an das Chromosom gebunden sind. In der vorliegenden Beschreibung werden die Ausdrücke "Plasmid" und "Vektor" wechselweise verwendet, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Vektorform ist. Jedoch umfaßt die Erfindung auch solche andere Formen von Expressionsvektoren, die äquivalente Funktionen erfüllen und die noch aufgefunden werden.

Der Ausdruck "rekombinante Wirtszellen" betrifft Zellen, die mit Vektoren, die durch rekombinante DNA-Techniken aufgebaut sind, transformiert sind. Entsprechend der hier gegebenen Definition wird t-PA in den auf Grund dieser Transformation erreichten Mengen gebildet und nicht in den geringen Mengen, die durch den untransformierten Wirt entstehen, die häufig unter der Nachweisgrenze liegen. Durch derartige Zellen gebildeter t-PA kann auch als "rekombinanter t-PA" bezeich­ net werden.

B. Wirtszellkulturen und Vektoren

Die hier beschriebenen Vektoren und Methoden eignen sich zur Anwendung in Wirtszellen innerhalb eines breiten Be­ reichs von prokaryontischen und eukaryontischen Organismen.

Selbstverständlich werden im allgemeinen Prokaryonten zum Klonen von DNA-Sequenzen beim Aufbau der erfindungsgemäß geeigneten Vektoren bevorzugt. Beispielsweise ist E. coli K12 Stamm 294 (ATCC 31446) besonders geeignet. Es können auch andere Mikroorganismenstämme verwendet werden, darun­ ter die E. coli-Stämme E. coli B und E. coli X1776 (ATCC 31537). Diese Beispiele dienen jedoch nur zur Erläuterung und stellen keine Beschränkung dar.

Prokaryonten können ebenfalls zur Expression verwendet wer­ den. Die vorerwähnten Stämme sowie E. coli W3110 (F⁻, λ⁻, prototroph, ATCC 27325), Bazillen, wie Bacillus subtilis und andere Enterobacteriaceae, wie Salmonella typhimurium oder Serratia marcescens und verschiedene Pseudomonas-Spe­ zies können verwendet werden.

Im allgemeinen werden Replikon und Kontrollsequenzen enthal­ tende Plasmidvektoren, die von mit der Wirtszelle verträg­ lichen Spezies abgeleitet sind, in Verbindung mit diesen Wirten verwendet. Der Vektor trägt üblicherweise eine Repli­ kationsstelle sowie markierende Sequenzen, die in der Lage sind, eine phänotypische Selektion in transformierten Zellen zu gewährleisten. Beispielsweise wird E. coli typischerweise unter Verwendung von pBR 322, einem von einer E. coli-Spezies abgeleiteten Plasmid (Bolivar et al., Gene 2 (1977), Seite 95) transformiert. pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz und erlaubt somit eine leichte Identifizierung von transformierten Zel­ len. Das pBR 322-Plasmid oder andere mikrobielle Plasmid muß auch Promotoren enthalten, die vom mikrobiellen Orga­ nismus zur Expression seiner eigenen Proteine verwendet werden können, oder es muß so modifiziert sein, daß es diese Promotoren enthält. Diese Promotoren, die sehr häufig beim rekombinanten DNA-Aufbau verwendet werden, umfassen β-Lactamase (Penicillinase) und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., Nature, Bd. 275 (1978), S. 617; Itakura et al., Science, Bd. 198 (1977), S. 1056; Goeddel et al., Nature, Bd. 281 (1979), S. 544) sowie ein Tryptophan (trp)- Promotorsystem (Goeddel et al., Nucleic Acids Res., Bd. 8 (1980), S. 4057; EP-A-36 776). Neben diesen besonders gebräuchlichen Promotoren wurden auch andere mikrobielle Promotoren aufgefunden und einge­ setzt. Einzelheiten bezüglich der Nukleotidsequenzen dieser Promotoren wurden veröffentlicht, was es dem Fachmann erlaubt, sie funktionell mit Plasmidvektoren zu verknüpfen (Sieben­ list et al., Cell, Bd. 20 (1980), S. 269).

Neben Prokaryonten können auch eukaryontische Mikroben, wie Hefekulturen, verwendet werden. Unter den eukaryontischen Mikroorganismen wird am häufigsten Saccharomyces cerevisiae oder übliche Bäckerhefe verwendet, wenngleich auch zahlrei­ che andere Stämme verfügbar sind. Für die Expression in Saccharomyces wird im allgemeinen das Plasmid YRp7 (Stinch­ comb et al., Nature, Bd. 282 (1979), S. 39; Kingsman et al., Gene, Bd. 7 (1979), S. 141; Tschember et al., Gene, Bd. 10 (1980), S. 157) verwendet. Dieses Plasmid enthält bereits das trp1-Gen, das einen Selektionsmarker für einen Mutanten­ stamm von Hefe, dem die Fähigkeit zum Wachstum in Tryptophan fehlt, zum Beispiel ATCC 44076 oder PEPL-1 (Jones, Genetics, Bd. 85 (1977), S. 12), bereitstellt. Die Anwesenheit der trp1-Läsion als Charakteristikum für das Hefewirtszellen­ genom stellt dann eine wirksame Umgebung zum Nachweis der Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan dar.

Beispiele für geeignete Promotorsequenzen in Hefevektoren sind die Promotoren für 3-Phosphoglycerat-kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., Bd. 255 (1980), S. 12073) oder ande­ re glycolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., Bd. 7 (1968), S. 149; Holland et al., Biochemistry, Bd. 17 (1978), S. 4900), wie Enolase, Glycerinaldehyd-3-phosphat­ dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat-decarboxylase, Phospho­ fructokinase, Glukose-6-phosphat-isomerase, 3-Phosphogly­ cerat-mutase, Pyruvat-kinase, Triosephosphat-isomerase, Phosphoglucose-isomerase und Glucokinase. Beim Aufbau von geeigneten Expressionsplasmiden werden die mit diesen Genen assoziierten Terminationssequenzen ebenso in den Expressions­ vektor 3′ der gewünschten, zu exprimierenden Sequenz ligiert, um für die Polyadenylierung von mRNA und Termination zu sor­ gen. Weitere Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil der durch die Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkrip­ tion aufweisen, sind die Promotorbereiche für Alkohol-de­ hydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, mit dem Stickstoffstoffwechsel assoziierte, abbauende Enzyme und die vorer­ wähnten Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase sowie Enzyme, die für die Verwertung von Maltose und Lactose verantwort­ lich sind (Holland a.a.O.). Beliebige Plasmidvektoren mit einem Gehalt an hefeverträglichen Promotor-Replikationsstart­ stellen- und Terminationssequenzen sind geeignet.

Neben Mikroorganismen können auch Kulturen von Zellen, die sich von mehrzelligen Organismen ableiten, als Wirte ver­ wendet werden. Im Prinzip sind beliebige, derartige Zell­ kulturen geeignet, unabhängig davon, ob sie von Wirbeltieren oder wirbellosen Tieren stammen. Das größte Interesse be­ steht jedoch für Wirbeltierzellen. Die Vermehrung von Wir­ beltierzellen in Kulturen (Gewebekulturen) ist in den letz­ ten Jahren zu einem routinemäßigen Verfahren geworden (Tissue Culture, Academic Press, Herausgeber Kruse und Pat­ terson, 1973). Beispiele für derartige, geeignete Wirtszel­ linien sind VERO- und HeLa-Zellen, Zellinien aus den Ovarien des Chinesischen Hamsters (CHO) und W138-, BHK-, COS-7- und MDCK-Zellinien. Expressionsvektoren für derartige Zellen umfassen im allgemeinen (soweit erforderlich) eine Repli­ kationsstartstelle, einen vor dem zu exprimierenden Gen be­ findlichen Promotor zusammen mit eventuell erforderlichen Ribosomenbindungsstellen, RNA-Spleißstellen, eine Polyade­ nylierungsstelle und transkriptionale Terminatorsequenzen.

Bei Säugetierzellen werden die Kontrollfunktionen an den Expressionsvektoren häufig durch virales Material bereitge­ stellt. Beispielsweise leiten sich üblicherweise Promotoren von Polyoma, Adenovirus 2 und sehr häufig von Simian Virus 40 (SV 40) ab. Die frühen und späten Promotoren des SV 40- Virus sind besonders geeignet, da sie beide leicht aus dem Virus als ein Fragment erhalten werden, das auch die SV 40- virale Replikationsstartstelle enthält (Fiers et al., Natu­ re, Bd. 273 (1978), S. 113). Kleinere oder größere SV 40- Fragmente können ebenfalls verwendet werden, vorausgesetzt es ist die etwa 250 bp umfassende Sequenz von der Hind III- Stelle bis zur Bgl I-Stelle, die sich in der viralen Repli­ kationsstartstelle befindet, vorhanden. Ferner ist es auch möglich und häufig erwünscht, Promotor- oder Kontrollsequen­ zen zu verwenden, die normalerweise mit der erwünschten Gen­ sequenz assoziiert sind, vorausgesetzt diese Kontrollsequen­ zen sind mit den Wirtszellsystemen verträglich.

Eine Replikationsstartstelle kann entweder durch Aufbau des Vektors einer exogenen Startstelle, abgeleitet beispiels­ weise von SV 40 oder einer anderen viralen Quelle (zum Bei­ spiel Polyoma, Adeno, VSV, BPV und dergleichen), oder durch den chromosomalen Replikationsmechanismus der Wirtszelle bereitgestellt werden. Ist der Vektor in das Wirtszellen­ chromosom integriert, ist dieses Chromosom häufig ausrei­ chend.

Bei der Auswahl einer bevorzugten Wirtszelle für die Trans­ fektion durch die erfindungsgemäßen Vektoren, die sowohl t-PA als auch DHFR-Protein kodierende DNA-Sequenzen umfas­ sen, ist es angebracht, den Wirt entsprechend dem Typ des verwendeten DHFR-Proteins auszuwählen. Wird Wildtyp-DHFR- Protein verwendet, wählt man vorzugsweise eine Wirtszelle mit einem Mangel an DHFR, was die Verwendung der DHFR kodieren­ den Sequenz als Marker für die erfolgreiche Transfektion im selektiven Medium mit Mangel an Hypoxanthin, Glycin und Thymidin ermöglicht. Eine geeignete Wirtszelle in diesem Fall ist die Zellinie aus den Ovarien des Chinesischen Ham­ sters (CHO) mit einem Mangel an DHFR-Aktivität. Diese Zel­ linie läßt sich gemäß Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), Bd. 77 (1980), S. 4216, herstellen und vermehren.

Wird andererseits DHFR-Protein mit niedriger Bindungsaffinität für MTX als Kon­ trollsequenz verwendet, ist es nicht erforderlich, Zellen mit DHFR-Mangel zu verwenden. Da die mutante DHFR gegen Methotrexat resistent ist, können Medien mit einem Gehalt an MTX als Selektionsmittel verwendet werden, vorausgesetzt die Wirtszellen sind selbst gegen Methotrexin empfindlich. Die meisten eukaryon­ tischen Zellen, die zur Absorption von MTX fähig sind, scheinen gegenüber Metho­ trexat empfindlich zu sein. Eine geeignete derartige Zellinie ist ein CHO-Linie, CHO-K1 ATCC CCL 61.

Zufriedenstellende Mengen an Human-t-PA werden von Zellkulturen gebildet, wobei jedoch weitere Verfeinerungen unter Anwendung einer sekundären, kodierenden Se­ quenz dazu dienen, die Produktionsmengen noch weiter zu erhöhen. Die sekundäre, kodierende Sequenz kodiert für Dihydrofolat-reduktase (DHFR), die durch einen extern gesteuerten Parameter, wie Methotrexat, beeinflußt wird, wodurch die Steuerung der Expression durch Steuerung der Methotrexat (MTX)-Konzentration ermöglicht wird.

Die nachstehenden Beispiele beschreiben die Verwendung von E. coli mit dem lac-trp- Promotorsystem und CHO-Zellen als Wirtszellen und von Expressionsvektoren, die die SV 40-Replikationsstartstelle als Promotor enthalten. Der Fachmann kann jedoch auf Grund seines Fachwissens analoge Techniken anwen­ den, um Expressionsvektoren zur Expression der gewünschten Proteinsequenzen in anderen prokaryontischen oder eukaryon­ tischen Wirtszellkulturen aufzubauen.

C. Angewandte Verfahren

Werden Zellen ohne erhebliche Zellmembranbarrieren als Wirts­ zellen verwendet, wird die Transfektion gemäß dem Calcium­ phosphat-Fällungsverfahren nach Graham und Van der Eb, Vi­ rology, Bd. 52 (1973), S. 456 durchgeführt. Doch können auch andere Verfahren zur Einführung von DNA in Zellen zum Bei­ spiel durch nukleare Infektion oder durch Protoplasten­ fusion angewandt werden.

Werden prokaryontische Zellen oder Zellen, die wesentliche Zellwand­ konstruktionen enthalten, verwendet, so besteht die bevor­ zugte Transfektionsmethode in der Calciumbehandlung unter Verwendung von Calciumchlorid gemäß F. N. Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), Bd. 69 (1972), S. 2110.

Beim Aufbau von geeigneten Vektoren mit einem Gehalt an die­ sen Kodierungs- und Kontrollsequenzen werden übliche Ligati­ onstechniken angewandt. Isolierte Plasmide oder DNA-Frag­ mente werden zur Bildung der gewünschten Form der erforder­ lichen Plasmide gespalten, geschnitten und religiert.

Die Spaltung wird durch Behandlung mit Restriktionsenzym (oder Enzymen) in einem geeigneten Puffer durchgeführt. Im allgemeinen werden etwa 1 µg Plasmid oder DNA-Fragmente mit etwa 1 unit Enzym in etwa 20 µl Pufferlösung verwendet. (Entsprechende Puffer und Substratmengen für bestimmte Re­ striktionsenzyme werden vom Hersteller angegeben.) Inkuba­ tionszeiten von etwa 1 Stunde bei 37°C sind geeignet. Nach der Inkubation wird das Protein durch Extraktion mit Phenol und Chloroform entfernt. Die Nucleinsäure wird aus der wäß­ rigen Fraktion durch Fällung mit Äthanol gewonnen.

Sind stumpfe Enden erforderlich, wird das Präparat 15 Minu­ ten bei 15°C mit 10 units Polymerase I (Klenow) behandelt, mit Phenol/Choroform extrahiert und mit Äthanol gefällt.

Die Auftrennung der gespaltenen Fragmente nach der Größe wird unter Verwendung von 6prozentigem Polyacrylamidgel gemäß D. Goeddel et al., Nucleic Acids Res., Bd. 8 (1980), S. 4057 durchgeführt.

Zur Ligation werden etwa äquimolare Mengen der gewünschten Komponenten, die am Ende in geeigneter Weise geschnitten sind, um eine korrekte Übereinstimmung zu gewährleisten, mit etwa 10 units T4 DNA-Ligase pro 0,5 µg DNA behandelt. (Wenn gespaltene Vektoren als Bestandteile verwendet wer­ den, kann zur Verhinderung der Religation des gespaltenen Vektors eine Vorbehandlung mit bakterieller, alkalischer Phosphatase durchgeführt werden.)

Für eine Analyse zur Bestätigung der korrekten Sequenzen in den aufgebauten Plasmiden werden die Ligationsgemische zur Transformation von E. coli K12-Stamm 294 (ATCC 31446) ver­ wendet. Erfolgreiche Transformanten werden gegebenenfalls auf Grund von Ampicillin- oder Tetracyclinresistenz ausgewählt. Von den Trans­ formanten werden Plasmide hergestellt, durch Restriktion analysiert und/oder nach dem Verfahren von Messing et al., Nucleic Acids Res., Bd. 9 (1981), S. 309 oder nach dem Ver­ fahren von Maxam et al., Methods in Enzymology, Bd. 65 (1980), S. 499 sequenziert.

Die Amplifikation von DHFR-Protein kodierenden Sequenzen wird durchgeführt, indem man Wirtszellkulturen in Gegen­ wart von Methotrexat, einem kompetitiven Inhibitor der DHFR- Ativität in Konzentrationen von etwa 20-500 000 nanomolar züchtet. Der wirksame Konzentrationsbereich hängt natür­ lich stark von der Art des DHFR-Gens, dem Protein und den Eigenschaften des Wirts ab. Im allgemeinen lassen sich klar definierte obere und untere Grenzen nicht feststellen. Es können auch geeignete Konzentrationen von anderen Folsäure­ analogen oder anderen Verbindungen, die DHFR hemmen, ver­ wendet werden. MTX selbst ist jedoch besonders zweckmäßig, leicht zugänglich und wirksam.

D. Allgemeine Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen

Humangewebe-Plasminogen-Aktivator wurde auf folgende Weise erhalten:

• 1. Humanmelanomzellen, die aktiv Gewebe-Plasminogen-Aktiva­ tor bildeten, wurden bis zur Konfluenz gezüchtet.
• 2. Zellpellets aus diesen Zellkulturen wurden in Gegenwart von Ribonuclease-Inhibitoren gezüchtet, um die gesamte zytoplasmatische RNA zu isolieren.
• 3. Eine oligo-dT-Säule isolierte die gesamte messenger-RNA (mRNA) in polyadenylierter Form. Diese mRNA wurde der Größenfraktionierung unter Anwendung der Säure-Harnstoff- Agarosegel-Elektrophorese unterzogen.
• 4. Die Gelfraktion mit einem Gehalt an Gewebe-Plasminogen- Aktivator-spezifischer RNA wurde auf folgende Weise identifiziert: Die RNA der einzelnen Gelfraktionen wurde in einem Kaninchen-Reticulocytenlysat-in vitro-System, ergänzt mit Hundepankreas-Mikrosomen, translatiert. Die erhaltenen Translationsprodukte wurden dann mit Humange­ webe-Plasminogen-Aktivator-spezifischem IgG-Antikörper immunopräzipitiert.
• 5. Die geeignete RNA (21 bis 24S) wurde in die entsprechende einzelsträngige, komplementäre DNA (cDNA) übergeführt, aus der doppelsträngige cDNA gebildet wurde. Nach poly­ dC-Schwänzen wurde es in einen Vektor eingesetzt, bei­ spielsweise in ein Plasmid, das einen oder mehrere phä­ notypische Marker trug.
• 6. Die auf diese Weise hergestellten Vektoren wurden zur Transformation von Bakterienzellen unter Bildung einer geklonten cDNA-Bibliothek verwendet. Ein Pool von radio­ aktiv markierten, synthetischen Desoxyoligonucleotiden, die komplementär zu den Kodons für bekannte Aminosäure­ sequenzen in t-PA waren, zum Beispiel der Pool von 8 14-meren (komplementär zu den Sequen­ zen, die für die bekannte (vgl. unten) Aminosäuresequenz: Tryptophan-Glutaminsäure-Tyrosin-Cystein-Asparaginsäure (W-E-Y-C-D) kodieren) wurde hergestellt und zur Markie­ rung der Koloniebibliothek verwendet.
• 7. Aus den positiven cDNA-Klonen wurde Plasmid-DNA isoliert und sequenziert.
• 8. Die sequenzierte t-PA kodierende DNA wurde dann in vitro zur Insertion in ein geeignetes Expressionsvehikel, das zur Transfor­ mation einer geeigneten Wirtszelle verwendet wurde, ge­ schnitten. Die Wirtszelle wurde in einer Kultur gezüch­ tet, wodurch der gewünschte Humangewebe-Plasminogen-Ak­ tivator gebildet wurde.
• 9. Der auf diese Weise gebildete Humangewebe-Plasminogen- Aktivator weist in seinem enzymatischen Serinprotease­ teil etwa 251 Aminosäuren auf. Ferner besitzt er ober­ halb davon eine einen "kringle" enthaltende Sequenz, von der zur Zeit angenommen wird, daß sie für die Fibrin­ bindung verantwortlich ist. Das reife Protein zuzüglich dessen Signalpräsequenz weist insgesamt 562 Aminosäuren auf.

Das vorstehende Verfahren selbst gewährleistet die erfolg­ reiche Bildung von reinem t-PA. Erfindungsgemäße Verfahren unter Anwendung einer zusätzlichen kodierenden, gegenüber Methotrexat empfindlichen Sequenz erlauben die Bildung von antigenaktivem t-PA-Protein in Wirtszellkulturen in Mengen von mehr als 0,1 pg pro Zelle pro Tag. Bei entsprechender Anwendung von amplifizierenden Bedingungen können Mengen von mehr als 20 pg pro Zelle pro Tag erhalten werden. Mit anderen Worten, es lassen sich Genexpressionsgrade erreichen, die zur Bildung von mehr als 9 × 10^-6 Plough-Einheiten pro Zelle pro Tag oder bei entsprechen­ der Amplifikation von mehr als 18 × 10^-4 Plough-Einheiten pro Zelle pro Tag an t-PA-Aktivität führen.

Gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung bedient man sich des Arzneistoffs Methotrexat, der zwar normalerweise für zur Aufnahme dieses Wirkstoffs fähige Zellen tödlich ist, der in Gegenwart von kontrollierten Konzentrationen an MTX durch Amplifikation des Gens, das für die DHFR-kodierende Sequenz kodiert, Zellwachstum ermöglicht (R. T. Schimke et al., Science, Bd. 202 (1978), S. 1051; J. L. Biedler et al., Cancer Res., Bd. 32 (1972), S. 153; S. E. Chang et al., Cell, Bd. 7 (1976), S. 391).

Diesbezüglich ist der Befund von Bedeutung, daß die Ampli­ fikation des Gens für DHFR die Amplifikation von assoziier­ ten Sequenzen, die für andere Proteine kodieren, verursachen kann. Dies erscheint der Fall zu sein, wenn es sich beim assoziierten Protein um Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBsAg) (J. Christman et. al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 79 (1982), S. 1815), E. coli-Protein XGPRT (G. Ringold et al., J. Molec. and Appl. Gen., Bd. 1 (1981), S. 165) und eine endogene Sequenz aus einer DHFR/SV 40-Plasmidkombination (R. F. Kaufman et al., J. Molec. Biol., Bd. 159 (1982), S. 601) handelt.

Andere Mechanismen, durch die eine Methotrexat-Resistenz verliehen werden kann, umfassen die Verminderung der Bin­ dungsaffinität für das DHFR-Protein, so daß es gegenüber Methotrexat weniger empfindlich wird (W. F. Flintoff et al., Somat. Cell Genet., Bd. 2 (1976), S. 245), aber in diesem Fall Amplifikation ebenfalls stattfindet.

Es scheint, daß die Gene für Wildtyp-DHFR und für DHFR, die gegenüber MTX resistent ist, auf Grund ihrer eigenen verminderten Bindungskapazität durch die Gegenwart von MTX amplifiziert werden. Somit wird gemäß dieser Ausführungs­ form der Erfindung die Einwirkung der DHFR-Sequenzamplifi­ kation auf assoziierte, proteinkodierende Sequenzen ange­ wendet, um einen Kontrollmechanismus bereitzustellen, der verstärkte Expressionsgrade von t-PA-Sequenzen in Gegenwart von MTX oder aufgrund einer vorherigen Behandlung von trans­ formierten Zellen mit MTX erlaubt.

E. Beispiele

Die nachstehenden Beispiele erläutern die Erfindung, stellen aber keine Beschränkung dar. In den Beispielen wurden eine E. coli-Wirtskultur und eine CHO-Zellinie, die sich für den Typ der einzuführenden DHFR-proteinkodierenden Sequenz eig­ net, als Wirtszellkultur verwendet. Jedoch eignen sich auch andere eukaryontische und prokaryontische Zellen für das er­ findungsgemäße Verfahren.

E.1 Expression von Human t-PA-Gen in E. coli E.1.A Beschreibung der Figuren

Fig. 1 ist ein Autoradiogramm eines 10prozentigen SDS-PAGE, das das oder die immunopräzipitierte(n) [³⁵S]-Methionin-markierte(n) Protein(e), darstellt, die aus Humanmelanomzellen in vivo während 3 Stunden sekretiert wurden, und zwar in Gegenwart (Reihe b) oder Abwesenheit (Reihe a) des Proteaseinhibitors Aprotinin. Nach der Immuno­ präzipitation mit Gewebe-Plasminogen-Aktivator-spezifischem IgG wurden drei Banden beobachtet (Reihe a), die Molekular­ gewichte von etwa 65 000, 63 000 bzw. 35 000 aufwiesen. In Gegenwart des Proteaseinhibitors wurde jedoch die Spezies mit einem Molekulargewicht von 35 000 nicht festgestellt. Durch die Immunopräzipitation wurden keine Produkte ausge­ fällt, wenn Präimmunserum verwendet wurde (Reihe c). Die Wanderungen und die Molekulargewichte von ¹⁴C-markierten Proteinstandards sind links von Reihe a wiedergegeben.

Fig. 2 zeigt die Gelelektrophorese der immunopräzipitierten Translationsprodukte von aus einem Säure-Harnstoff-Agarose­ gel isolierten RNA-Fraktionen. Eine Hauptbande wurde in den Fraktionen 7 und 8 nach Translation in Gegenwart von Hunde­ pankreas-Mikrosomen unter anschließender Immunopräzipita­ tion mit Gewebe-Plasminogen-Aktivator spezifischem IgG beo­ bachtet. Diese Bande weist ein Molekulargewicht von etwa 63 000 Dalton auf. Die Größe der in den Fraktionen 7 und 8 wandernden mRNA beträgt etwa 21 bis 24 S. Die Positionen der ribosomalen RNA-Marker, die nach Elektrophorese am RNA-Harn­ stoff-Gel bestimmt und durch Färben mit Ethidiumbromid sicht­ bar gemacht wurden, sind über den entsprechenden Gelreihen angegeben.

Fig. 3 zeigt das Hybridisierungsmuster von 96 Kolonien mit dem

96 indi­ viduelle Transformanten wurden auf einer Mikrotiterplatte gezüchtet, replikaplattiert und auf einer Nitrocellulose­ membran gezüchtet. Die Kolonien wurden sodann lysiert, die bakterielle DNA fixiert und die Filter mit ³²P-14-mer (W- E-Y-C-D)-Markern hybridisiert. Die Filter wurden zur Entfer­ nung von nicht-hybridisiertem Marker gewaschen und auf Rönt­ genfilm aufgelegt. Das Autoradiogramm stellt die Muster von 48 einzelnen Filtern (4600 unabhängige Kolonien) dar. Ein Beispiel für einen positiven Gewebe-Plasminogen-Aktivator- cDNA-Klon auf Filter Nummer 25 ist als E10 (Pfeil) gekenn­ zeichnet.

Fig. 4 ist eine Restriktionsendonuclease-Karte der vollen Länge von Humangewebe-Plasminogen-Aktivator-cDNA. Die An­ zahl und die Größe der durch die Spaltung mit Restriktions­ endonuclease gebildeten Fragmente wurde durch Elektrophore­ se an 6prozentigen Acrylamidgelen bestimmt. Die Positionen der Stellen wurden durch Nucleinsäuresequenz (in Fig. 5 wiedergegeben) bestätigt. Der kodierende Bereich des größ­ ten offenen Leserasters ist durch ein Kästchen gekennzeich­ net. Der schraffierte Bereich stellt die mutmaßliche Sig­ nalpeptidsequenz dar, während der punktierte Bereich die mutmaßliche Sequenz von reifem Gewebe-Plasminogen-Aktivator (527 Aminosäuren) wiedergibt. Das 5′-Ende von mRNA befindet sich auf der linken Seite und das 3′-Ende auf der rechten Seite.

Die Fig. 5A, 5B und 5C erläutern die Nucleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz von Humangewebe-Plasmino­ gen-Aktivator-cDNA in voller Länge. Die der reifen Sequenz vorhergehenden 35 Aminosäuren (-35 bis -1) sind als ununter­ brochene Sequenz dargestellt. Es wird angenommen, daß die­ se Sequenz mit 35 Aminosäuren aus einer hydrophilen "pro"- Sequenz mit etwa 12 bis 15 Aminosäuren, die dem Serin (+1) des reifen Proteins vorausgeht, und einem dieser "pro"-Se­ quenz vorausgehenden "herkömmlichen" hydrophoben Signal (sich erstreckend von 5′ bis -35) besteht. Dieser Typ von prä-pro-Struktur an sekretierten Proteinen wurde bereits früher beschrieben, zum Beispiel für Präproalbumin. Gemäß dieser Theorie beginnen sämtliche sekretierten Gewebe-Plas­ minogen-Aktivator-Moleküle mit dem Serin (+1) als Aminoende. Eine zweite Theorie besteht darin, daß die hydrophile Se­ quenz an der Funktion von Gewebe-Plasminogen-Aktivator auf analoge Weise beteiligt sein kann, wie sie ein bei Plasmino­ gen, bei dem ein Peptid mit 10 000 Dalton vom aminotermina­ len Bereich des nativen Plasminogen (Glu-Plasminogen, be­ nannt nach dem aminoterminalen Ende) gespalten werden kann, beobachtet wurde, wodurch ein kleineres Molekül mit einem neuen Aminoende, bezeichnet als Lys-Plasminogen, erhalten wird. Lys-Plasminogen wird leichter zu Plasmin aktiviert und hat auch eine größere Affinität für Fibrin als Glu- Plasminogen. Es wurde gezeigt, daß Plasmin die Umwandlung von Glu- in Lys-Plasminogen katalysiert. Diese Art von Kontrollmechanismus bewirkt einen "positiven feedback"- Mechanismus. Die ersten Mengen an gebildetem Plasmin bewir­ ken neben dem Abbau von Fibrin auch eine Bildung von Plas­ minogenmolekülen, die leichter aktiviert werden, und gehen auch eine festere Bindung mit ihrem Substrat als natives Plasminogen ein. Es ergibt sich ein rascherer Abbau von Fi­ brin. Das hydrophile Peptid des Gewebeplasminogen-Aktivators könnte an einem ähnlichen Mechanismus beteiligt sein, so daß dessen Spaltung eine modifizierte Bindung des Enzyms an Fibrin ergibt. In jedem Fall wird die 35-Aminosäuresequenz als Präsequenz für das reife Protein angesehen.

Fig. 6 ist ein schematisches Diagramm des Aufbaus eines Gewebeplasminogen-Aktivators-Expressionsplasmids pΔRIPA°. Das Ausgangsplasmid pPA25E10 wurde zunächst mit PstI ver­ daut, um ein 376 bp-Fragment zu isolieren, das sodann ge­ mäß den Angaben dieser Figur verdaut wurde.

Fig. 7 zeigt das Ergebnis eines Fibrinplattentests zur Be­ stimmung der fibrinolytischen Aktivität des über pΔRIPA° in transformierten Zellen erhaltenen Expressionsprodukts.

Fig. 8 ist ein HPLC-Diagramm von Peptiden aus einem Trypsin- Verdauungsprodukt von Gewebe-Plasminogen-Aktivator (Absorp­ tion bei 210 nm). Der Pfeil identifiziert den Peak, der dem Peptid entspricht, das zur Bezeichnung des bei der Kolo­ niebibliothek verwendeten Nucleotid-Markers verwendet wurde. Das diesem Peak entsprechende Peptid wies folgende voll­ ständige Sequenz auf: L-T-W-E-Y-C-D-V-P-S-C-S-T-C-G-L. Die anderen Hauptpeaks wurden in ähnlicher Weise sequenziert und führten zu einer Bestätigung der korrekten Aminosäure­ sequenz von Humangewebe-Plasminogen-Aktivator. Zur Bezeich­ nung der Aminosäuren in den Peptiden wurden folgende, ein­ buchstabige Symbole verwendet:

Fig. 9 zeigt den Aufbau eines für die direkte Expression von reifem Humangewebe-Plasminogen-Aktivator in E. coli ko­ dierenden Plasmids. 50 µg Plasmid pPA17 wurden mit Sau3AI, HincII und HhaI verdaut und der Elektrophorese an 6prozen­ tigem Polyacrylamidgel unterworfen. Etwa 0,5 µg des 55 bp Sau3AI-HhaI-Fragments wurden gewonnen. In ähnlicher Weise wurden etwa 3 µg des 263 bp HhaI-NarI-Fragments aus 80 µg des Klons pPA25E10 gereinigt, indem zunächst ein 300 bp PstI-NarI-Fragment isoliert und dieses Fragment mit HhaI verdaut wurde. Sämtliche Verdauungsvorgänge wurden 1 Stunde bei 37°C durchgeführt. Die Reaktionsprodukte wurden aufge­ trennt und der Elektroelution an 6prozentigem Polyacrylamid­ gel unterworfen. Die beiden angegebenen Desoxyoligonucleoti­ de 5′ dAATTCATGTCTTATCAAGT (I) und 5′ GATCACTTGATAAGACATG (II) wurden nach der Festphasen-phosphotriester-Methode (51) synthetisiert. 100 pMol des Oligonucleotids II wurden in einem 30 µl fassenden Reaktionsgemisch mit einem Gehalt an 60 millimolar Tris (pH-Wert 8), 10 millimolar MgCl₂, 15 mil­ limolar β-Mercaptoäthanol und 50 µCi [³²P] ATP (5000 Ci mMol^-1) phosphoryliert. 12 units T4-Polynucleotid­ kinase wurden zugesetzt. Die Umsetzung wurde 15 Minuten bei 37°C durchgeführt. 1 µl 10 millimolar ATP und 12 units T4- Kinase wurden sodann zugesetzt und die Umsetzung wurde wei­ tere 30 Minuten fortgesetzt. Nach Phenol/CHCl₃-Extraktion wurden das phosphorylierte Oligomer II und das 5′-Hydroxyl­ oligomer I mit 0,5 µg des eluierten 55 bp Sau3AI-HhaI-Frag­ ments und 2 µg des 263 bp HhaI-NarI-Fragments vereinigt und mit Äthanol gefällt. Diese Fragmente wurden 4 Stunden bei Raumtemperatur in 60 µl 20 millimolar Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 millimolar MgCl₂, 10 millimolar Dithiothreit, 0,5 milli­ molar ATP und 1000 units T4-DNA-Ligase verknüpft. Das Ge­ misch wurde 1 Stunde mit 48 units NarI, 20 units EcoRI und 40 units BglII (zur Beseitigung der Polymerisation durch Ligation von kohäsiven Sau3AI-Enden) verdaut und der Elek­ trophorese an 6prozentigem Gel unterworfen. Das 338 bp- Produkt (etwa 0,1 µg) wurde durch Elektroelution gewonnen. Der Rest der t-PA-kodierenden Sequenzen (Aminosäuren 111 bis 528) wurden an einem 1645 bp-Fragment durch Verdauen des Plasmids pPA25E10 mit NarI und BglII isoliert. Das Plasmid pLeIFAtrp103 ist ein Derivat des Plasmids pLeIFA25 (52), bei dem die EcoRI-Stelle distal zum LeIF A-Gen entfernt worden ist (53). 3 µg pLeIFAtrp103 wurden mit 20 units EcoRI und 20 units BglII 90 Minuten bei 37°C verdaut, der Elektro­ phorese an 6prozentigem Polyacrylamidgel unterworfen. Das große Vektorfragment (4200 bp) wurde durch Elektroelution gewonnen. Für den endgültigen Aufbau wurden 80 ng EcoRI- BglII pLeIFAtrp103 mit 100 ng des 1645 bp-NarI-BglII-Frag­ ments und 20 ng des 338 bp-EcoRI-NarI-Fragments 10 Stunden bei Raumtemperatur verknüpft. Dieses Verknüpfungsgemisch wurde zur Transformation von E. coli K-12 Stamm 294 verwen­ det. Plasmid-DNA wurde aus 38 dieser Transformanten herge­ stellt mit EcoRI verdaut. 10 dieser Plasmide enthielten die gewünschten 600 bp- und 472 bp-EcoRI-Fragmente. Die DNA-Se­ quenzanalyse bestätigte, daß eines dieser Plasmide (pt-PAtrp12) die gewünschte Nucleotidsequenz an den Ver­ bindungen zwischen trp-Promotor, synthetischer DNA und cDNA aufwies.

Fig. 10 zeigt das Ergebnis eines Fibrinplattentests zur Be­ stimmung der fibrinolytischen Aktivität des erfindungsgemäßen Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Expressionsprodukts. Eine über Nacht gezüchtete Kultur von E. coli W3110/pt-PAtrp12 in Luria-Brühe mit einem Gehalt an 5 µg ml^-1 Tetracyclin wurde 1 : 100 in M9-Medium mit einem Gehalt an 0,2 Prozent Glucose, 0,5 Prozent Casaminsäuren und 0,5 µg ml^-1 Tetra­ cyclin verdünnt. Die Zellen wurden bei 37°C bis zu einem A₅₅₀-Wert von 0,2 gezüchtet. Indolacrylsäure wurde in einer Endkonzentration von 20 µg/ml zugesetzt. Die Proben wurden bei einem A₅₅₀-Wert von 0,5 bis 0,6 (∼2×10⁸ Zellen ml^-1) durch Zentrifugation gewonnen und sofort eingefroren. Die Zellpellets wurden in 6m Guanidin-hydrochlorid in einer Konzentration von 5 × 10⁸ Zellen/ml suspendiert, 10 Sekun­ den mit Ultraschall behandelt, 30 Minuten bei 24°C inkubiert und sodann 4 Stunden gegen 25 millimolar Tris-HCl vom pH- Wert 8,0 mit einem Gehalt an 250 millimolar NaCl, 0,25 mil­ limolar EDTA und 0,01 Prozent Polyoxyalkylensorbitanmonooleat dialysiert. Nach der Dialyse wurden die Proben 2 Minuten bei 13 000 g zentrifu­ giert und 10 µl der Überstände wurden jeweils auf ihre Ak­ tivität an Gewebe-Plasminogen-Aktivator analysiert. Gemäß dem Verfahren von Granelli-Piperno und Reich (87) wurde die Platte 3,5 Stunden bei 37°C inkubiert, und die Lysiszonen wurden gemessen. Ein quantitativer Befund wurde durch Ver­ gleich mit Verdünnungen einer Lösung von gereinigtem Mela­ nomgewebe-Plasminogen-Aktivator erhalten.

E.1.B Quelle für Gewebe-Plasminogen-Aktivator-mRNA

Es wurden Humanmelanomzellen (Bowes) verwendet. Die Melanom­ zellen wurden bis zur Bildung von konfluenten Monolayers in 100 ml Earles-Minimal-Essentiell-Medien, die mit Natrium­ hydrogencarbonat (0,12 Prozent Endkonzentration), 2 milli­ molar Glutamin und 10 Prozent wärmeinaktiviertes, fötales Kälberserum ergänzt waren, gezüchtet. Zur Bestätigung, daß die Melanomzellen in bezug auf die Bildung von Humangewebe- Plasminogen-Aktivator aktiv waren, wurden die Humanmelanom­ zellen bis zur Konfluenz in einer 24 Vertiefungen aufweisen­ den Mikrotiterplatte entweder in Gegenwart oder Abwesenheit von 0,33 mikromolar Protease-Inhibitor Aprotinin gezüchtet. Die Zellen wurden einmal mit gepufferter Kochsalzlösung ge­ waschen und mit 0,3 ml serumfreiem, methioninfreiem Medium versetzt. 75 µCi [³⁵S]-Methionin wurden zugesetzt. Die Zel­ len wurden 3 Stunden bei 37°C markiert. Nach der dreistün­ digen Markierungsdauer wurden die Medien von den Zellen ab­ getrennt und zur Immunopräzipitation entweder mit Gewebe- Plasminogen-Aktivator-spezifischem IgG oder Präimmunserum behandelt (54). Die immunopräzipitierten Produkte wurden der Elektrophorese an einem 10prozentigen SDS-Acrylamidgel unterworfen. Das Scheibengel wurde fixiert, getrocknet und der Fluorigraphie unterworfen.

E.1.C Isolierung und Größenfraktionierung von Messenger- mRNA

Die gesamte RNA aus Melanomzellkulturen wurde im wesentli­ chen nach dem Verfahren von Ward et al. (55) extrahiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation pelletisiert und sodann in 10 millimolar NaCl, 10 millimolar Tris-HCl vom pH-Wert 7,5, 1,5 millimolar MgCl₂ resuspendiert. Die Zellen wurden durch Zugabe von NP-40 (Endkonzentration 1 Prozent) lysiert. Die Kerne wurden durch Zentrifugation pelletisiert. Der die gesamte RNA enthaltende Überstand wurde durch mehrfache Phenol- und Chloroform-Extraktionen weiter gereinigt. Die wäßrige Phase wurde auf eine NaCl-Konzentration von 0,2 m gebracht. Anschließend wurde die gesamte RNA durch Zugabe von 2 Volumina Äthanol ausgefällt. Zur Reinigung von mRNA aus den Gesamt-RNA-Präparaten wurde die oligo-dT-Cellulose­ chromatographie angewandt (54). Typische Ausbeuten aus 10 g gezüchteten Melanomzellen betrugen 5 bis 10 mg Gesamt-RNA und 50 bis 200 µg Poly(A)⁺-mRNA.

Die Fraktionierung von PolyA⁺-mRNA (200 µg) (56) wurde durch Elektrophorese an Harnstoff-Agarosegelen durchgeführt. Das Scheibenagarosegel (57, 58) bestand aus 1,75 Prozent Aga­ rose, 0,025 m Natriumcitrat, pH-Wert 3,8 und 6 m Harnstoff. Die Elektrophorese wurde 7 Stunden bei 25 mA und 4°C durch­ geführt. Das Gel wurde sodann mit einer Rasierklinge frak­ tioniert. Die einzelnen Scheiben wurden bei 70°C geschmol­ zen und zweimal mit Phenol und einmal mit Chloroform extra­ hiert. Die Fraktionen wurden sodann mit Äthanol gefällt und anschließend durch in vitro-Translation in einem Kaninchen- Reticulocytenlysat-System, Bethesda Research Lab. (59, 60), ergänzt mit Hundepankreas-Mikrosomen folgendermaßen ge­ testet: Translationen wurden unter Verwendung von 25 µCi an [³⁵S]-Methionin und 500 ng der einzelnen Gelscheiben- RNA in einem Endvolumen von 30 µl mit einem Gehalt an 25 mil­ limolar HEPES, 48,3 millimolar KCl, 10 millimolar Kreatinphosphat, 19 Aminosäuren jeweils 50 millimolar, 1,1 millimolar Magnesiumchlorid, 16,6 millimolar EDTA, 0,16 millimolar Dithiothreit, 8,3 mil­ limolar Hämin, 16,6 µg/ml Kreatin-kinase, 0,33 millimolar Calciumchlorid, 0,66 millimolar EGTA, 23,3 millimolar Na­ triumchlorid durchgeführt.

Die Inkubationen wurden 90 Minuten bei 30°C durchgeführt. Hundepankreas-Mikrosomenmembranen, die aus rohen Mikroso­ men unter Verwendung von EDTA zur Entfernung der Ribosomen hergestellt waren (61), wurden gemäß (62) mit Nuclease be­ handelt. Sie lagen im Translationsgemisch in einer Endkonzen­ tration von 7A₂₆₀ units/ml vor. Die Translationsprodukte oder immunopräzipitierten Translationsprodukte wurden durch Elektrophorese an 10prozentigen Polyacrylamidgelen gemäß den nachstehenden Angaben in Natriumdodecylsulfat analysiert (63). Die ungefärbten Plattengele wurden fixiert, getrocknet und der Fluorigraphie unterworfen (64).

Die erhaltenen Translationsprodukte aus den einzelnen Gel­ fraktionen wurden mit Kaninchen-anti-Humangewebe-Plasmino­ gen-Aktivator-spezifischem IgG immunopräzipitiert. Eine immunopräzipitierte Polypeptidhauptbande wurde bei der Translation der RNA-Fraktionsnummern 7 und 8 (Wanderung von 21 bis 24 S) mit einem Molekulargewicht von etwa 63 000 Dal­ ton beobachtet. Diese Bande wurde nicht beobachtet, wenn Präimmun-IgG zur Immunopräzipitation verwendet wurde, was darauf schließen ließ, daß diese Polypeptide für Gewebe- Plasminogen-Aktivator spezifisch waren.

E.1.D Herstellung einer Koloniebibliothek mit einem Gehalt an Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Sequenzen

5 µg gelfraktionierte mRNA (Gelscheibe 7 mRNA) wurden zur Herstellung von doppelsträngiger cDNA nach üblichen Verfah­ ren (52, 65, 66) verwendet. Die cDNA wurde an 6prozentigem Polyacrylamidgel der Größenfraktionierung unterworfen. cDNA mit mehr als 350 bp Länge (125 ng) wurde der Elektroelu­ tion unterzogen. 30 ng cDNA wurden mit desoxy(C)-Resten un­ ter Verwendung von terminaler Desoxynucleotidyl-transferase (67) erweitert und mit 300 ng Plasmid-pBR322 (68), das in ähnlicher Weise mit desoxy(G)-Resten an der Pst I-Stelle ge­ schnitten war (67), verschweißt. Das verschweißte Gemisch wurde sodann in E. coli K12 Stamm 294 (ATCC 31446) trans­ formiert. Es wurden etwa 4600 Transformanten erhalten.

E.1.E Herstellung eines DNA-Markers

Gereinigter Humangewebe-Plasminogen-Aktivator wurde gemäß dem Verfahren der Literaturstellen 19 und 20 erhalten.

Das Molekül wurde zur Feststellung der Bereiche, die sich am besten zur Herstellung von synthetischen Markern eigneten, auf folgende Weise zerlegt:

Um die Proteine gegenüber einer Verdauung durch Trypsin empfindlich zu machen, wurden sie reduziert und carboxy­ methyliert. Eine 2 µg-Probe an Gewebe-Plasminogen-Aktivator wurde zunächst über Nacht bei Raumtemperatur gegen 0,01 Pro­ zent Tween 80 dialysiert. Das lyophilisierte Protein wurde sodann in 12 ml 0,56 m Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 8,6) mit einem Gehalt an 8 m Harnstoff und 5 millimolar EDTA gelöst. Die Disulfidbindungen wurden durch Zugabe von 0,1 ml β-Mer­ captoäthanol reduziert. Diese Reaktion wurde 2 Stunden bei 45°C unter Stickstoff durchgeführt. Die reduzierten Disul­ fide wurden sodann durch Zugabe von 1,0 ml 1,4 m Jodessig­ säure in 1 m NaOH zum Carboxymethylderivat alkyliert. Nach 20 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Umsetzung durch 18­ stündige Dialyse bei Raumtemperatur gegen 0,01 Prozent Tween 80 gestoppt. Sodann wurde lyophilisiert.

Das erhaltene, lyophilisierte, carboxymethylierte Protein wurde in 3 ml 0,1 m Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 7,5) ge­ löst. Trypsin (TPCK) wurde in einem Verhältnis von 1 : 50 zu­ gesetzt. Die Verdauung wurde bei 37°C durchgeführt. Nach 3, 6 bzw. 12 Stunden wurden jeweils Aliquotanteile (0,1 ml) entnommen. Eine zweite Trypsinzugabe erfolgte nach 12 Stunden. Nach 24 Stunden wurde die Umsetzung durch Einfrieren ge­ stoppt. Sie wurde bis zur Injektion in die HPLC-Vorrichtung in gefrorenem Zustand gehalten. Der Verdauungsablauf wurde durch SDS-Gele der Aliquotanteile ermittelt. Sämtliche Gele waren leer mit Ausnahme einer schwachen Bande am 3-Stunden- Aliquotanteil. Dies zeigt, daß das 24-Stunden-Verdauungs­ produkt vollständig war und keine großen Peptide enthielt.

Eine Probe (etwa 0,5 ml) wurde in eine hochauflösende Altex C-8-Ultrasphere ® 5 µ-Säule mit zwei Durchläufen injiziert. Ein Acetonitrilgradient (1 bis 5 Prozent in 5 Minuten, 5 bis 35 Prozent in 100 Minuten, 35 bis 50 Prozent in 30 Minuten) wurde angewandt. In einer der beiden präparativen Durchläufe wurde das eluierte Produkt bei zwei Wellenlängen (210 und 280 nm) überprüft. Das Verhältnis der Absorptionen bei den beiden Wellenlängen wurde als Maß für den Tryptophangehalt der Peptide herangezogen.

Die Peptidpeaks, bei denen ein Tryptophangehalt am wahr­ scheinlichsten war, oder solche Peaks, die aus anderen Grün­ den als geeignet erschienen, wurden zuerst sequenziert. Dies ermöglichte die Bestimmung der Sequenz um die meisten der Tryptophanreste. Nach Sequenzieren von etwa 25 der bestge­ eigneten Peptidpeaks wurden sämtliche zusammenpassenden Sequenzdaten zu einem vorläufigen Modell der Primärstruktur von Gewebe-Plasminogen-Aktivator vereinigt. Aus diesen Daten und dem Modell konnten mehrere mögliche Tracer festgestellt werden.

E.1.F Identifikation von Bakterienklonen mit einem Gehalt an Gewebe-Plasminogen-Aktivator-cDNA-Sequenzen

Die Kolonien wurden einzeln in Vertiefungen von Mikrotiter­ platten mit einem Gehalt an LB (93) + 5 µg/ml Tetracyclin gebracht und nach Zugabe von DMSO auf eine Konzentration von 7 Prozent bei -20°C gelagert. Zwei Kopien der Koloniebiblio­ thek wurden auf Nitrocellulosefiltern gezüchtet. Die DNA einer jeden Kolonie wurde gemäß dem Grunstein-Hogness-Ver­ fahren (69) am Filter fixiert.

Der

wurde gemäß den vorstehenden Ausführungen aus dem synthetischen Oligo­ meren (W-E-Y-C-D) 14-mer-Pool hergestellt. Filter mit einem Gehalt an 4600 Transformanten wurden 2 Stunden bei Raum­ temperatur in 50 millimolar Natriumphosphat vom pH-Wert 6,8 5x SSC (80), 150 µg/ml mit Ultraschall behandeltes Lachs­ sperma-DNA, 5x Denhardt-Lösung (85), 10 Prozent Formamid prähybridisiert und anschließend mit 50x 10⁶ cpm des mar­ kierten Tracers in der gleichen Lösung hybridisiert. Nach Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur 30 Minuten in 6x SSC, 0,1 Prozent SDS, einmal in 2x SSC gewaschen und sodann 16 Stunden auf Röntgenfilm unter Verwendung von Verstärkungsfiltern gelegt.

Plasmid-DNA wurde aus sämtlichen Kolonien nach einem Schnellverfahren (71) isoliert, wobei sich eine positive Hybridisierungsreaktion ergab. Die cDNA-Inserts auf diesen Klonen wurden sodann nach Subklonierung von Fragmenten in den M13-Vektor mp 7 (73) und nach dem chemischen Verfahren gemäß Maxam Gilbert (74) sequenziert. Fig. 3 zeigt, daß Filter Nummer 25 das Hybridisierungsmuster eines positiven Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Klons aufweist. Das cDNA-In­ sert im Klon 25E10 erwies sich als DNA-kodierend für Gewebe- Plasminogen-Aktivator, was durch einen Vergleich von dessen Aminosäuresequenzen der Peptidsequenz (vgl. oben) von ge­ reinigtem Gewebe-Plasminogen-Aktivator und durch dessen in E. coli gemäß den vorstehenden, näheren Angaben gebildetes Expres­ sionsprodukt gezeigt wurde. Das DNA-Insert von Klon 25E10 (Plasmid pA25E10) war 2304 Basenpaare lang, wobei der längste, offene Ableseraster ein Protein von 508 Aminosäuren (Molekulargewicht 56 756) kodier­ te und einen 772 bp-3′-nicht-translatierten Bereich enthielt. Diesem cDNA-Klon fehlten die N-terminalen, kodierenden Se­ quenzen.

E.1.G Direkte Expression von Humangewebe-Plasminogen-Akti­ vator-Klon in E. coli

Bezugnehmend auf Fig. 6 wurden 50 µg pPA25E10 (vgl. oben) mit PstI verdaut. Das 376 bp-Fragment wurde durch Elektro­ phorese an 6prozentigem Polyacrylamidgel isoliert. Etwa 3 µg dieses Fragments wurden durch Elektroelution aus dem Gel isoliert, mit 30 units Dde I 1 Stunde bei 37°C verdaut, mit Phenol und Chloroform extrahiert und mit Äthanol ge­ fällt. Die erhaltenen Dde I-kohäsiven Enden wurden durch Zusatz von 5 units DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) und jeweils 0,1 millimolar dATP, dCTP, dGTP, dTTP zum Reaktions­ gemisch und 8stündige Inkubation bei 4°C zu stumpfen Enden erweitert. Nach Extraktion mit Phenol und Chloroform wurde die DNA 2 Stunden mit 15 units Nar I verdaut. Das Reaktions­ gemisch wurde der Elektrophorese an 6prozentigem Polyacryl­ amidgel unterworfen. Etwa 0,5 µg des gewünschten 125 bp- stumpfendigen Nar I-Fragments wurden gewonnen. Dieses Frag­ ment kodiert für die Aminosäuren Nummer 69 bis 110 von rei­ fem Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Protein voller Länge.

Zur Isolation des 1645 bp-Nar I - Bgl II-Fragments wurden 30 µg pPa25E10 mit 30 units Nar I und 35 units Bgl II 2 Stunden bei 37°C verdaut. Das Reaktionsgemisch wurde der Elektrophorese an 6prozentigem Polyacrylamidgel unterwor­ fen. Etwa 6 µg des gewünschten 1645 bp-Nar I - Bgl II-Frag­ ments wurden gewonnen.

Das Plasmid pΔRlSRC ist ein Derivat des Plasmids pSRCex16 (79), bei dem die Eco RI-Stellen proximal zum trp- Promotor und distal zum SRC-Gen durch Reparatur mit DNA- Polymerase I (28) entfernt waren. Das selbst-komplementäre Oligodesoxynucleotid AATTATGAATTCAT (hergestellt nach dem Phosphortriester-Verfahren (75)) wurde in die verbleibende Eco RI-Stelle unmittelbar neben der Xba I-Stelle einge­ setzt. 20 µg pΔRISRC wurden vollständig mit Eco RI ver­ daut, mit Phenol und Chloroform extrahiert und mit Äthanol gefällt. Das Plasmid wurde sodann mit 100 units Nuclease SI 30 Minuten bei 16°C in 25 millimolar Natriumacetat (pH- Wert 4,6) mit einem Gehalt an 1 millimolar ZnCl₂ und 0,3 m NaCl verdaut, um ein stumpfes Ende mit der Sequenz ATG zu schaffen. Nach Extraktion mit Phenol und Chloroform und nach Äthanolfällung wurde die DNA mit Bam HI verdaut, der Elek­ trophorese an 6prozentigem Polyacrylamidgel unterworfen, und das große Vektorfragment (4300 bp) wurde durch Elektro­ elution gewonnen.

Das Expressionsplasmid wurde durch 7stündige Ligation bei Raumtemperatur von 0,2 µg Vektor, 0,06 µg des 125 bp-stumpf­ endigen Nar I-Fragments und 0,6 µg des 1645 bp-Nar I - Bgl II-Fragments mit 10 units T₄-DNA-Ligase aufgebaut. Die­ ses wurde zur Transformation von E. coli Stamm 294 (ATCC 31446) zur Verleihung von Ampicillinresistenz verwendet. Plasmid-DNA wurde aus 26 der Kolonien hergestellt und mit Xba I und Eco RI verdaut. 12 dieser Plasmide enthielten die gewünschten 415 bp Xba I-Eco RI- und 472 bp-Eco RI-Fragmen­ te. Die Analyse der DNA-Sequenz ergab, daß einige dieser Plasmide ein ATG-Initiationscodon aufwiesen, das korrekt am Start der Aminosäure Nummer 69 (Serin) plaziert war. Eines dieser Plasmide, pΔRIPA°, wurde untersucht. Es ergab den gewünschten Gewebe-Plasminogen-Aktivator (Fig. 7).

E.1.H Gewebe-Plasminogen-Aktivator-cDNA von voller Länge a) Herstellung einer Koloniebibliothek mit einem Gehalt an N-terminalen Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Sequenzen

0,4 µg des synthetischen Oligonucleotids 5′-TTCTGAGCACAGGGCG-3′ wurden zum "Primen" von 7,5 µg Gelfraktion Nummer 8 mRNA (vgl. oben) verwendet, um nach üblichen Verfahren (65, 66) doppelsträngige cDNA herzustellen. Die cDNA wurde der Größenfraktionierung an 6 prozentigem Polyacrylamidgel unterworfen. Eine Fraktion von mehr als 300 bp (36 ng) wurde der Elektro­ elution unterworfen. 5 ng cDNA wurden mit desoxy(C)- Resten unter Verwendung von terminaler Desoxycytidyl­ transferase (67) erweitert und mit 50 ng des Plasmids pBR322 (68), das in ähnlicher Weise mit desoxy(G)-Resten an der Pst I-Stelle geschnitten war (67), verschweißt. Das verschweißte Gemisch wurde sodann in E. coli K12 Stamm 294 transformiert. Es wurden etwa 1500 Transfor­ manten herhalten.

b) Southern-Hybridisierung von Humangenom-DNA

Da die cDNA-Primer-Reaktion unter Verwendung eines syn­ thetischen Fragments, das 13 bp vom N-Ende des Klons pPA25E10 hybridisierte, durchgeführt worden war, stand in diesem 29 bp-Bereich (der die 16-mer Sequenz umfaßt) kein geeignetes Restriktionsfragment zum Screening der cDNA-Klone zur Verfügung. Daher war es erforderlich, ein Humangewebe-Plasminogen-Aktivator-Genom-Klon zu isolie­ ren, um alle Primer-erweiterten cDNA-Klone mit einem Gehalt an N-terminalen Gewebe-Plasminogen-Aktivator- kodierenden Sequenzen zu identifizieren.

Bei der ersten Stufe dieses Verfahrens wurde festgestellt, daß in Humangenom-DNA nur ein einziges, homologes Ge­ webe-Plasminogen-Aktivator-Gen vorhanden ist. Um dies festzustellen, wurde eine Southern-Hybridisierung durch­ geführt. Bei diesem Verfahren (77) wurden 5 µg hochmo­ lekulare Humanlymphocyten-DNA (hergestellt gemäß 80) vollständig mit verschiedenen Restriktionsendonucleasen verdaut, der Elektrophorese an 1,0prozentigen Agarose­ gelen unterworfen (81) und auf ein Nitrocellulosefilter geblottet (77). Ein ³²P-markierter DNA-Tracer wurde aus dem 5′-Ende des cDNA-Iserts von pPA25E10 (ein 230 bp-Hpa II-Rsa I-Fragment) hergestellt (76) und mit dem Nitrocellulosefilter hybridisiert (82). 35 × 10⁶ cpm des Tracers wurden 40 Stunden hybridisiert und sodann gemäß (82) gewaschen. Zwei Endonuclease- Verdauungsmuster zeigen nur ein einziges, hybridisieren­ des DNA-Fragment: Bgl II (5,7 Kbp) und Pvu II (4,2 kbp) Zwei hybridisierende DNA-Fragmente wurden mit Hinc II (5,1 Kbp und 4,3 Kbp) beobachtet. Zusammen lassen diese Daten den Schluß zu, daß im Humangenom nur ein einzi­ ges Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Gen vorhanden ist und daß dieses Gen mindestens eine Zwischensequenz (inter­ vening sequence) enthält.

c) Screening der Human-λ-Phagenbibliothek auf Plasminogen- Aktivator-Gene

Die zur Identifizierung der λ-Phagenrekombinanten, die die Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Gene tragen, angewandte Strategie bestand im Nachweis der Nucleotidhomologie mit einem aus dem Ge­ webe-Plasminogen-Aktivator-cDNA von pPA25E1 hergestellten, radioaktiven Tracers. 1 Million rekombinante λ-Phagen wurden in einer Dichte von 10 000 pfu/15 cm Platte auf DP 50 Sup F ausgestrichen. Nitrocellulosefilter-Repli­ kaplattierungen wurden von jeder Platte gemäß dem Ver­ fahren von Benton und Davis (78) hergestellt. Eine ³²P-markierte DNA-Probe wurde nach üblichen Verfahren (83) aus einem 239 bp-Hpa II - Rsa I-Fragment, das sich in einer Entfernung von 34 bp vom 5′-Ende des Plasmids pPA25E10 befand, hergestellt. Jeder Nitrocellulosefilter wurde bei 42°C zwei Stunden in 50 millimolar Natrium­ phosphat (pH-Wert 6,5), 5x SSC (77), 0,05 mg/ml mit Ultraschall behandelter Lachssperma-DNA, 5x Denhardt- Lösung (84), 50 Prozent Formamid prähybridisiert und so­ dann mit 50 × 10⁶ cpm der markierten Probe in der glei­ chen Lösung mit einem Gehalt an 10 Prozent Natriumdex­ transulfat hybridisiert (85). Nach Inkubation über Nacht bei 42°C wurden die Filter viermal bei 50°C 30 Minuten in 0,2x SSC, 0,1 Prozent SDS, einmal bei Raumtemperatur in 2x SSC gewaschen und sodann über Nacht auf Röntgenfilme unter Verwendung von Verstärkungsfiltern aufgelegt. Insgesamt wurden 19 mit dem Tracer hybridisierte Klone erhalten. Phagen-DNA wurde gemäß den vorstehenden Angaben (86) aus 6 Re­ kombinanten hergestellt. Der λ-Klon C wurde zur Herstel­ lung eines Pvu II-Fragments zum Kolonienscreening ver­ wendet. 30 µg DNA wurden 1 Stunde bei 37°C mit Pvu II verdaut und der Elektrophorese an 1,0prozentigem Aga­ rosegel unterworfen. Ein 4,2 Kbp-Fragment, in dem vor­ her der Gehalt an Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Sequen­ zen nachgewiesen worden war, wurde der Elektroelution unterworfen und gereinigt. Ein ³²P-markierter Tracer wurde nach üblichen Verfahren (83) für Kolonienhybri­ disierungen gemäß den vorstehenden Angaben hergestellt.

d) Screening der Koloniebibliothek für 5′-Gewebe-Plasmino­ gen-Aktivator-Sequenzen

Die Kolonien wurden von Platten übertragen und auf Nitro­ cellulosefiltern gezüchtet. Die DNA der einzelnen Kolo­ nien wurden am Filter gemäß dem Verfahren von Grunstein- Hogness (69) fixiert. Ein ³²P-markierter Tracer wurde durch Kalbsthymus-Primen (83) eines 4,2 kbp-Pvu II-Frag­ ments aus einem isolierten Gewebe-Plasminogen-Aktivator- λ-Genomklon hergestellt. Filter mit einem Gehalt an 1500 Transformanten wurden mit 112 × 10⁶ cpm des ³²P- Genom-Pvu II-Fragments hybridisiert.

Die Hybridisierung wurde 16 Stunden unter den Bedingun­ gen gemäß Fritsch et al. (82) durchgeführt. Die Filter wurden gründlich gewaschen und sodann 16 bis 48 Stunden auf Röntgenfilme unter Verwendung von Verstärkungsfiltern aufgelegt. 18 Koloni­ en hybridisierten klar mit der Genomprobe. Plasmid-DNA wurde aus jeder dieser Kolonien isoliert, an Nitrocel­ lulosefilter gebunden und mit den für die ursprüngliche Primer-Reaktion verwendeten ³²P-markierten, synthetischen Oligonucleotid (16-mer) hybridisiert. Von den 18 Klonen hybridisierten 7 mit dem der Kinasebehandlung unterwor­ fenen 16-mer. Bei der Sequenzanalyse nach Subklonierung der Fragmente in den m13-Vektor mp⁷ (73) ergab sich für einen Klon (pPA17), daß er den korrekten 5′-N-termina­ len Bereich von Gewebe-Plasminogen-Aktivator, eine Sig­ nalleitsequenz (signal leader sequence) und einen 84 bp-5′-nicht-translatierten Bereich enthielt. Aus den beiden Klonen pPA25E10 und pPA17 wurde die vollständige Nucleotidsequenz gemäß Fig. 5 und das Restriktionsmu­ ster (Fig. 4) von Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Klon von voller Länge bestimmt.

Beim nativen Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Molekül be­ steht die Möglichkeit zur Stabilisierung durch 17 Di­ sulfidbrücken, basierend auf der Homologie mit anderen Serinproteasen. Es gibt vier potentielle N-Glykosylie­ rungsstellen, drei in den "kringle"-Bereichen bei asn₁₁₇, asn₁₈₄, asn₂₁₈ und eine potentielle Stelle im gleichen Kettenbereich bei asn₄₄₈. Variationen in der Struktur der Oligosaccharid-Liganden können für die unterschied­ lichen molekularen Formen (mit Molgewichten von 65 000 bzw. 63 000) verantwortlich sein.

E.1.I Direkte Expression von Gewebe-Plasminogen-Aktivator- cDNA-Klon voller Länge in E. coli

Eine Rekonstruktion der gesamten kodierenden Sequenz war unter Verwendung der gemeinsamen Hha I-Restriktionsendo­ nuclease-Stelle, die beide partiellen Klone pPA17 und pPA25E10 gemeinsam besitzen, möglich. Ein 55 bp-Sau3AI- HhaI-Restriktionsfragment, das den Aminosäuren 5-23 ent­ sprach, wurde aus dem Plasmid pPA17 isoliert. Die Sau3AI- Restriktionsstelle befand sich am Kodon 4 der angenommenen reifen, kodierenden Sequenz und wurde zur Entfernung des das Signalpeptid kodierenden Bereichs verwendet. Ein 263 bp- HhaI - NarI-Fragment (kodierend für die Aminosäuren 24-110) wurde ebenfalls aus dem Plasmid pPA25E10 isoliert. Zwei synthetische Desoxyoligonucleotide wurden hergestellt, die die Kodons für die Aminosäuren 1-4 wiederherstellen, ein ATG- translationales Initiationskodon einverleiben und ein Eco RI-kohäsives Ende schaffen. Diese drei Fragmente wurden so­ dann unter Bildung eines für die Aminosäuren 1-110 kodieren­ den 338 bp-Fragments miteinander verknüpft. Dieses Fragment und ein 1645 bp-Nar I - Bgl II-Fragment aus pPA25E10 wurden sodann zwischen den Eco RI- und Bgl II-Stellen des Plasmids pLeIFAtrp 103 (53) unter Bildung des Expressionsplasmids pt-PAtrp12 verknüpft. Das geklonte t-PA-Gen wurde unter der Kontrolle eines 300 bp-Fragments von E. coli-trp-Operon, das den trp-Promotor, Operator und die Shine-Dalgarno-Se­ quenz des trp-Leitpeptids enthält, aber das Leitpeptid ATG-Initiationskodon nicht enthält, transkribiert (52).

E. coli K12 Stamm W3110 (ATCC 27325) mit einem Gehalt am Plasmid pt-PAtrp12 wurde gezüchtet. Extrakte wurden zur Be­ stimmung der fibrinolytischen Aktivität hergestellt. Eine Methode zur Messung der Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Akti­ vität war der Fibrinplattentest (87). Dabei wird die Menge an gebildetem Plasmin gemessen, indem man das Ausmaß der Plasminverdauung von Fibrin in einer Agaroseplatte mit einem Gehalt an Plasminogen und Fibrin bestimmt. Plasmin ruft eine klare Lysiszone in der Fibrinplatte hervor. Aus der Fläche dieser Zone kann die Menge an in der Probe vorhandenem Ge­ webe-Plasminogen-Aktivator ermittelt werden. Werden Extrak­ te von pt-PAtrp12-Klonen auf die Gewebe-Plasminogen-Akti­ vator-Aktivität unter Anwendung des Fibrinplattentests ge­ testet, so ergibt sich eine klare Lysiszone. Diese fibrino­ lytische Aktivität wird durch anti t-P-A-IgG, aber nicht durch Präimmun-IgG oder anti-Urokinase-IgG gehemmt. Keine Aktivität ergibt sich bei einem Extrakt, der aus Zellen her­ gestellt ist, die zur Kontrolle das Leukocyteninterferon­ plasmid pLeIFAtrp103 enthalten. Unter Anwendung einer Eich­ kurve von gereinigtem t-PA läßt sich berechnen, daß etwa 20 units an extrahierter Aktivität pro 10⁹ Zellen erhalten wurden (für gereinigtes t-PA: 90 000 Plough-units = 1 mg) (Fig. 10).

E.1.J Sequenzanalyse

Die Sequenzanalyse beruhte auf dem Edman-Abbau (83b). Die Probe wurde in das Probengefäß des Beckman 890B- oder 890C- Sequenziergerät mit drehendem Probengefäß gegeben. Poly­ brene^R (Poly-N,N,N¹,N¹-tetramethyl-N-trimethylenhexamethylen­ diammonium-diacetat) wurde als Träger im Gefäß verwendet (63C). Das Sequenziergerät war mit einer Kühlfalle und mit einigen Programmveränderungen zur Verringerung von Hinter­ grundpeaks modifiziert. Als Reagentien wurden die Beckman- Reagentien für Sequenzierzwecke 0,1 m Quadrol-Puffer, Phe­ nylisothiocyanat und Heptafluorbuttersäure verwendet.

Die gesammelten Edman-Zyklen wurden manuell zu 2-Anilino- 5-thiazolinonderivaten umgesetzt. Das 1 Chlorbutan wurde unter Stickstoff getrocknet. Sodann wurde 1,0 n HCl in Was­ ser zum 2-Anilino-5-thiazolinon gegeben und 10 Minuten auf 70°C erwärmt, um eine Umwandlung in das 3-Phenyl-2-thio­ hydantoin (PTH-Derivat) durchzuführen. Der PTH-Aminosäure­ rest wurde sodann in 50prozentigem Acetonitril in Wasser gelöst und in eine Hochdruck-Flüssigchromatographievorrich­ tung mit Phasenumkehr injiziert. Die einzelnen PTH-Amino­ säuren wurden durch Vergleich der Retentionszeiten eines Standardgemisches von PTH-Aminosäuren, die in die Konver­ sionsflasche eingeführt und wie ein Zyklus des Sequenzier­ geräts behandelt wurden, identifiziert.

E.1.K Tests zum Nachweis der Expression von Gewebe-Plasmino­ gen-Aktivator 1. Direkter Test der Plasminbildung a. Theorie

Ein empfindlicher Test für Gewebe-Plasminogen-Aktivator läßt sich durchführen, indem man die durch den Gewebe-Plas­ minogen-Aktivator katalysierte Umwandlung von Plasminogen zu Plasmin ermittelt. Plasmin ist ein Enzym, für das chro­ mogene Substrattests zur Verfügung stehen. Diese Tests be­ ruhen auf der proteolytischen Spaltung eines Tripeptids von einer chromophoren Gruppe. Die Spaltungsgeschwindigkeit ist direkt proportional zur Spezifität und zur Konzentration der zu untersuchenden Protease. Die Grundlage für diesen Test ist die Bestimmung der Menge an Plasmin, die nach Inkubation der den Gewebe-Plasminogen-Aktivator enthaltenden Lösung mit einer Plasminogenlösung entsteht. Je größer die Aktiva­ tormenge ist, desto größer ist die Menge an gebildetem Plasmin. Plasmin wird auf Grund der Spaltung des chromogenen Substrats S2251 gemessen.

b. Verfahren

Ein Aliquotanteil der Probe wird mit 0,10 ml 0,7 mg/ml Plas­ minogen (in 0,05 m Tris-HCl, pH-Wert 7,4 mit einem Gehalt an 0,012 in NaCl) vermischt. Das Volumen wird auf 0,15 ml ein­ gestellt. Das Gemisch wird 10 Minuten bei 37°C inkubiert und mit 0,35 ml S2251 (1,0 millimolare Lösung im vorgenannten Puffer) versetzt. Die Umsetzung wird 30 Minuten bei 37°C fortgesetzt. Zur Beendigung der Reaktion werden 25 µl Eis­ essig zugesetzt. Die Proben werden zentrifugiert. Die Ab­ sorbtion bei 405 nm wird gemessen. Die quantitative Bestim­ mung der Aktivität erfolgt mittels eines Vergleichs mit ei­ ner Urokinase-Eichlösung. Die Testbedingungen zum Nachweis des Gewebe-Plasminogen-Aktivators der vollen Länge werden durch Zugabe von 0,2 mg Fibrinogen zur Lösung modifiziert. Fibrinogen bewirkt eine Stimulierung der Aktivität des Ge­ webe-Plasminogen-Aktivators, wodurch sich eine etwas erhöh­ te Aktivität ergibt. Die Aktivität wird in Plough-units fest­ gehalten, wobei 90 000 Plough-units der Aktivität von 1 mg gereinigtem Gewebe-Plasminogen-Aktivator entsprechen.

2. Indirekter-Test der Plasminbildung a. Theorie

Es wurde ein empfindlicher Test auf die Aktivität an Gewebe- Plasminogen-Aktivator entwickelt (87). Der Test beruht auf der Bestim­ mung der Plasminbildung durch Messung des Grads der Verdau­ ung von Fibrin durch Plasmin in einer Agarplatte mit einem Gehalt an Fibrin und Plasminogen. Plasmin bildet eine klare Lysiszone in der Fibrinplatte. Die Fläche dieser Lysiszone korreliert mit der Menge an Gewebe-Plasminogen-Aktivator in der Probe.

b. Verfahren

Gemäß dem Verfahren von Granelli-Piperno und Reich (87) werden die Platten 3,5 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Ly­ siszonen werden gemessen. Eine quantitative Bestimmung er­ gibt sich durch Vergleich mit einer Urokinase-Eichlösung.

E.1.L Nachweis der Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Aktivität 1. Bakterielles Wachstum und Probenvorbereitung

Eine Kolonie von E. coli mit einem Gehalt an dem Plasmid (pΔRIPA°) wurde in ein Teströhrchen mit einem Gehalt an 5 ml LB-Wachstumsmedium mit einem Gehalt an 20 µg/ml Ampi­ cillin überimpft. Die Zellen wurden über Nacht bei 37°C ge­ züchtet. Eine Aliquotmenge dieser Kultur wurde 1 : 100 in 300 ml M-9-Medium mit einem Gehalt an 20 µg/ml Ampicillin verdünnt. Die Zellen wurden 4 Stunden bei 37°C in einem Schüttelkolben gezüchtet, wobei sich eine Absorbtion bei 550 nm von 0,419 ergab. Die tryptophananaloge Indolacryl­ säure wurde in einer Konzentration von 30 µg/ml zugesetzt. Die Zellen wurden 90 Minuten inkubiert, wobei sich eine Ab­ sorption bei 550 nm von 0,628 ergab. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und in 0,8 ml 0,01 m Tris vom pH- Wert 8,0 mit einem Gehalt an 0,01 m EDTA resuspendiert. Die erhaltene Suspension wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur rasch gerührt. Die Probe wurde zentrifugiert. Der Überstand wurde auf die Aktivität an Gewebe-Plasminogen-Aktivator ge­ testet.

Bezüglich der Expression von pt-PAtrp12 wird auf die aus­ führliche Erläuterung zu Fig. 10 verwiesen.

2. Aktivitätsnachweis

Die Tabellen I und II zeigen die Ergebnisse der Aktivierung von Plasminogen durch entsprechende E. coli-Extrakte. Es bildet sich eine Aktivität, die von der Anwesenheit von Plas­ minogen abhängig ist (Tabelle I). Diese Aktivität wird nicht durch Präimmunserum von Kaninchen beeinflußt, wird aber durch Antiserum, das gegen aus gereinigten Melanomzellen abgeleiteten Gewebe-Plasminogen-Aktivator hergestellt wurde (88), deutlich gehemmt (Tabellen I und II). Dies zeigt, daß E. coli-Extrakte eine Plasminogen aktivierende Aktivität erzeugen, die durch Antikörper gegen den Gewebe-Plasminogen- Aktivator gehemmt wird.

Fig. 7 zeigt das Ergebnis eines Fibrinplattentests auf fi­ brinolytische Aktivität. Eine Standardmenge an Urokinase wurde in die Mittelreihe in Konzentrationen (von links nach rechts) von 0,24, 0,14, 0,10, 0,05 und 0,02 Plough-units ge­ geben. Die untere Reihe enthält Proben von natürlichem Gewe­ be-Plasminogen-Aktivator mit der gleichen Enzymmenge in je­ der Vertiefung. Die Vertiefungen enthalten (von links nach rechts) Gewebe-Plasminogen-Aktivator, anti-Plasminogen-Akt­ vator plus Präimmunserum und Gewebe-Plasminogen-Aktivator plus Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Antikörper. Die Vertiefun­ gen in der oberen Reihe enthalten jeweils 8 µl der rekombi­ nanten Gewebe-Plasminogen-Aktivator-E. coli-Extrakte. Die erste Vertiefung enthält das Extrakt allein, in der zweiten Vertiefung ist Präimmunserum zugesetzt und in der dritten Vertiefung sind Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Antikörper zu­ gesetzt. Es ist offensichtlich, daß das Präimmunserum na­ türlichen oder rekombinanten Gewebe-Plasminogen-Aktivator nicht beeinflußt und daß Gewebe-Plasminogen-Aktivator- Antikörper die Aktivität von natürlichen und von E. co­ li-Extrakten hemmen. Bezogen auf die Urokinase-Standards enthalten die Extrakte geringfügig weniger als 2,5 Plough- units pro ml. Dies braucht den Vergleich mit dem in Tabelle I erhaltenen Wert von 1,3 Plough-units pro ml nicht scheuen.

In den Tabellen I und II sind die Ergebnisse der in E.1.K. 1.b. durchgeführten Tests zusammengestellt.

Tabelle I

Plasminogenaktivierung durch E. coli-Extrakte von Kulturen mit einem Gehalt an pΔRIPA

Tabelle II

Plasminogenaktivierung durch E. coli-Extrakte von Kulturen von pt-PAtrp12

Fig. 10 gibt die Ergebnisse eines Fibrinplattentests wieder, der mit Extrakten aus 10 Liter Fermentationskulturen von E. coli mit einem Gehalt an Gewebe-Plasminogen-Aktivator exprimierendem Plasmid durchgeführt wurde. Die fibrinolyti­ sche Aktivität des Gewebe-Plasminogen-Aktivators mit einem Gehalt an dem Extrakt ist in Fig. 10 durch die Vertiefung A wiedergegeben. Diese fibrinolytische Aktivität wird durch anti-t-PA-IgG (Vertiefung C), aber nicht durch Präimmun-IgG (Vertiefung B) oder durch anti-Urokinase-IgG (Vertiefung D) gehemmt. Keine Aktivität ergibt sich bei einem Extrakt, der aus Zellen hergestellt ist, die als Kontrolle das Leukocyten­ interferonplasmid pLeIFAtrp103 enthalten (Vertiefung H).

E.2 Herstellung von t-PA unter Verwendung von DHFR-Protein mit geringer Bindungsaffinität für MTX E.2.A Vektoraufbau

Die Humangewebe-Plasminogen-Aktivator (t-PA) kodierende Se­ quenz wird in ein Expressionsplasmid mit einem Gehalt an mutanter DHFR mit geringer Bindungsaktivität für MTX (be­ schrieben in EP-A-117060) gemäß folgendem Verfahren (vgl. Fig. 11) eingesetzt:

Drei Fragmente von überlappenden t-PA-Plasmiden, nämlich pPA25E10, pPA17 und pt-PAtrp12 (vgl. oben) wurden folgender­ maßen hergestellt: Plasmid pPA17 wurde mit Dde I verdaut, unter Verwendung von Klenow DNA-Polymerase I gefüllt und mit PstI geschnitten. Das auf diese Weise gebildete Fragment mit etwa 200 bp mit einem Gehalt an der 5′-terminalen t-PA-Se­ quenz wurde isoliert. Das zweite t-PA-Fragment wurde durch Verdauen von pt-PAtrp12 mit PstI und NarI und Isolieren des Fragments mit etwa 310 bp erhalten. Das dritte t-PA-Fragment wurde durch Verdauen von pPA25E10 mit NarI und BglII und Isolieren des etwa 1645 bp aufweisenden Fragments, das zusätzlich zum einem Großteil des t-PA-kodierenden Bereichs einige 3′- nicht-translatierte Sequenzen enthält, erhalten.

Das Plasmid pE342, das HBV-Oberflächenantigen exprimiert (auch bezeichnet als pHBs348-E) ist in EP-A-73 656 beschrieben. Kurz zusam­ mengefaßt, wurde die Startstelle des Simian-Virus SV 40 durch Verdauen von SV 40-DNA mit HindIII und Umwandeln der HindIII-Enden zu Eco RI-Enden durch Zugabe eines Konverters (AGCTGAATTC) isoliert. Diese DNA wurde mit PvuII geschnitten und mit RI-Linkern versetzt. Durch anschließende Verdauung mit Eco RI wurde das 348 bp-Fragment, das die Startstelle umspannt, durch Elektrophorese an Polyacrylamidgel und Elek­ troelution isoliert und in pBR322 geklont. Das Expressions­ plasmid pHBs348-E wurde durch Klonen des 1986 bp-Fragments, das durch Eco RI- und BglII-Verdauung von HBV (Animal Virus Genetics, (Ch. 5) Acad. Press, N.Y., 1980) (das das HBsAg kodierende Gen umspannt) erhalten worden ist, in das Plas­ mid pML (Lusky et al., Nature, Bd. 293 (1981), S. 79) an den Eco RI- und Bam HI-Stellen aufgebaut. (pML ist ein Deri­ vat von pBR322, das eine Deletion unter Weglassen von Se­ quenzen, die eine Hemmung der Plasmidreplikation in Affen­ zellen bewirken, aufweist.) Das erhaltene Plasmid (pRI-Bgl) wurde dann mit Eco RI linearisiert, und das 348 bp-Fragment, das den SV 40-Startbereich repräsentiert, wurde in die Eco RI-Stelle von pRI-Bgl eingeführt. Das Startstellenfragment kann in beliebiger Orientierung eingesetzt werden. Da dieses Fragment sowohl die frühen als auch die späten SV 40-Promo­ toren zusätzlich zur Replikationsstartstelle kodiert, konn­ ten HBV-Gene unter der Kontrolle beider Promotoren je nach dieser Orientierung (pHBS348-E repräsentiert HBs, das unter der Kontrolle des frühen Promotors exprimiert ist) expri­ miert werden. pE342 ist durch teilweise Verdauung mit Eco RI, Füllen der Spaltungsstelle unter Verwendung von Klenow- DNA-Polymerase I und Rückligation des Plasmids modifiziert, wodurch die Eco RI-Stelle, die der SV 40-Ursprungsstelle in pE342 vorausgeht, entfernt wird. Das erhaltene Plasmid, als pE342ΔRI bezeichnet, wird mit Eco RI verdaut, unter Ver­ wendung von Klenow-DNA-Polymerase I gefüllt und mit Bam HI geschnitten. Nach Elektrophorese an Acrylamidgel wird das Fragment mit etwa 3500 bp auf die vorstehend erläuterte Wei­ se der Elektroelution unterworfen, mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Äthanol gefällt.

Der auf diese Weise hergestellte p342E-3500 bp-Vektor und die vorstehend beschriebenen t-PA-Fragmente mit etwa 2160 bp werden unter Anwendung von üblichen Techniken miteinan­ der ligiert. Ein Plasmid mit einem Gehalt an den drei t-PA kodierenden Fragmenten in richtiger Orientierung wurde iso­ liert, charakterisiert und als pE342-t-PA bezeichnet. Dieses Plasmid wurde mit Sac II verdaut und mit bakterieller alka­ lischer Phosphatase (BRL) behandelt. Zur Erzeugung der DHFR-Sequenz (zusammen mit Kontrollsequenzen für dessen Ex­ pression) wurde ein Fragment mit etwa 1700 bp durch SacII- Verdauung von pEHER erzeugt (pEHER ist ein Plasmid das mutante DHFR exprimiert; vgl. EP-A-117 060 a.a.O.). Dieses Fragment wurde in das pE342-t-PA-Plasmid unter Bildung von pETPAER400, einem Plasmid, das analog zu pEHER ist, mit der Ausnahme, daß der HBsAg kodierende Be­ reich durch die cDNA-Sequenzen aus t-PA ersetzt ist, ligiert.

E.2.B Expression und Amplifikation der t-PA-Sequenz

pETPAER400 (pETPER) wurde gemäß dem Verfahren von Graham und Van der Eb (vgl. oben) sowohl in dhfr⁻ CHO-DUX B11-Zel­ len als auch in DHFR⁺ CHO-K1 (ATCC CCL61) transfiziert. Transformierte dhfr⁻-Zellen wurden durch Züchtung in einem Medium mit einem Mangel an Glycin, Hypoxanthin und Thymidin ausgewählt. Transformierte DHFR⁺-Zellen wurden durch Züch­ tung in 100 nanomolar MTX ausgewählt. Kolonien, die im ent­ sprechenden Selektionsmedium entstanden, wurden unter Ver­ wendung von Klonierungsringen isoliert und im gleichen Me­ dium auf mehrere Generationen vermehrt.

Zur Amplifikation wurden die Zellen aus den Kolonien in Me­ dien mit einem Gehalt an 5 × 10⁴, 10⁵, 2,5 × 10⁵, 5 × 10⁵ und 10⁶ nanomolar MTX aufgeteilt und mehrmals passagiert. Die Zellen wurden in sehr niedrigen Zelldichten (10²-10³ Zellen/Platte) in 10-cm-Schalen ausgestrichen. Die erhalte­ nen Kolonien wurden isoliert.

E.2.C Testmethoden

Die Expression von t-PA in den transfizierten, amplifizier­ ten Kolonien kann zweckmäßigerweise nach ähnlichen Verfah­ ren bestimmt werden, wie sie vorstehend unter E.1.K.1.b an­ gegeben sind.

Die Koamplifikation von DHFR- und t-PA-Sequenzen wird durch Isolierung von DNA aus konfluenten Monolayers von amplifi­ zierten Kolonien folgendermaßen bestimmt: Konfluente Mono­ layers in 150 mm Platten werden mit 50 ml steriler PBS ge­ waschen und durch Zugabe von 5 ml 0,1 Prozent SDS, 0,4 m CaCl₂, 0,1 m EDTA, pH-Wert 8 lysiert. Nach 5 bis 10 Minuten wird das Gemisch entfernt, mit Phenol und Chloroform extra­ hiert und mit Äthanol gefällt. Die DNA wird in 1 ml (pro 150-mm-Platte) 10 millimolar Tris-HCl, pH-Wert 8,1 millimo­ lar EDTA (TE) resuspendiert. 0,1 mg/ml RNase werden zuge­ setzt und die Lösung wird 30 Minuten bei 37°C inkubiert. So­ dann wird 0,1 Prozent SDS und 0,5 mg/ml Pronase zu­ gegeben. Nach 3- bis 16stündiger Inkubation bei 37°C wird die Lösung wieder mit Phenol und Chloroform extrahiert und mit Äthanol gefällt. Das DNA-Pellet wird in 0,5 ml Wasser resuspendiert und mit Restriktionsenzymen verdaut. Etwa 5 bis 10 µg der verdauten DNA werden der Elektrophorese in einem Agarosegel (1 Prozent Agarose in Tris-Acetat-Puffer (40 millimolar Tris, 1 millimolar EDTA, mit Essigsäure auf den pH-Wert 8,2 eingestellt)) unterworfen; vgl. Crouse et al., J. Biol. Chem., Bd. 257 (1982), S. 7887. Nachdem Brom­ phenolblau-Farbstoff im Gel 2/3 der Strecke nach unten ge­ wandert ist, wird das Gel entfernt und mit Ethidiumbromid gefärbt. Nach Sichtbarmachen der DNA mit UV-Licht wird die DNA gemäß dem Verfahren von Southern, J. Mol. Biol., Bd. 98 (1975), S. 503, auf Nitrocellulosefilter übertragen. Die Filter werden sodann mit einem der Nick-Translation unter­ worfenen Tracer, der aus dem 1700 bp-SacII-Fragment von pEHER (hergestellt und hybridisiert auf die vorstehend be­ schriebene Weise) oder aus dem etwa 1970 bp umfassenden BglII-Fragment von pETPER hergestellt worden ist, unterzo­ gen.

E.3 Herstellung von t-PA in Konjunktion mit Wildtyp-DHFR- Protein E.3.A Vektoraufbau

Au 12776 00070 552 001000280000000200012000285911266500040 0002003348289 00004 12657f analoge Weise wie beim Aufbau von pETPER wird ein Plas­ mid mit einem Gehalt an der DNA-Sequenz, die Wildtyp-DHFR kodiert, nämlich pETPFR, aufgebaut. Der Aufbau erfolgt ge­ mäß Beispiel E.2.A mit der Ausnahme, daß an Stelle des Plasmids pEHER als Quelle für die DHFR-Protein-Gensequenz das Plasmid pE342.HBV.E400.D22 (vgl. EP-A-117 058) verwendet wurde. Das Plasmid pE342.HBV.E400.D22 ist das gleiche wie pEHER, mit Ausnahme eines Unterschieds bezüglich eines einzigen Basen­ paars zwischen Wildtyp- und Mutanten-DHFR. Somit ist das erhaltene Plasmid pETPFR in jeder Weise zu pETPER analog, mit der Ausnahme, daß die für Wildtyp-DHFR kodierende DNA- Sequenz durch die Sequenz der Mutante ersetzt ist.

E.3.B Expression der t-PA-Sequenz

pETPFR wurde zur Transfektion von CHO-Zellen mit DHFR-Mangel (Urlaub und Chasin, a.a.O.) unter Verwendung des Calcium­ phosphat-Fällungsverfahrens gemäß Graham und Van der Eb verwendet. 21 Kolonien, die auf dem selektiven Medium (-HGT) entstanden, wurden durch Nachweis der Plasminbildung be­ stimmt. Dieser Nachweis erfolgte auf Grund der Verdauung von Fibrin in einer Agarplatte mit einem Gehalt an Fibrin und Plasminogen gemäß Granelli-Piperno et al., J. Exp. Med., Bd. 148 (1978), S. 223.

Vier der am stärksten positiven Klone wurden dann quantitativ auf Plasminbildung pro Zelle gemäß dem in E.1.K.1.b. erläuterten Verfahren getestet.

Auf Grund dieser quantitativen Bestimmung wurde festgestellt, daß die vier untersuchten Klone bei der Bestimmung von units/Zelle/Tag die gleiche oder eine vergleichbare Sekre­ tion von t-PA in das Medium aufwiesen. Subklone wurden her­ gestellt, indem Inocula aus zwei der Klone in getrennte Platten mit einem Gehalt an -HGT-Medium übertragen wurden. Zwei der erhaltenen Subklone, 18B und 1, wurden für die weitere Analyse herangezogen.

E.3.C Amplifikation und Grad der t-PA-Bildung

Die vorerwähnten Subklone wurden in einer Menge von 2 × 10⁵ Zellen pro 100-mm-Platten in 50 nanomolar MTX ausgestrichen, um die Amplifikation zu fördern. Die überlebenden Zellen ergaben bei der vorstehend beschriebenen Bestimmung in sämt­ lichen Fällen im Vergleich zur unverstärkten Menge an Gewe­ be-Plasminogen-Aktivator-Aktivität die 10fache Aktivität. Zwei dieser Klone wurden für die weitere Untersuchung aus­ gewählt und als 1-15 und 18B-9 bezeichnet.

Der Subklon 1-15 wurde weiter durch Überimpfen von 2 × 10⁵ Zellen in 100-mm-Platten mit einem Gehalt an 500 nanomolar MTX verstärkt. Die Bestimmung der auf diese Weise amplifi­ zierten Zellen ergab einen weiteren Anstieg (etwa um das 3fache) in bezug auf die t-PA-Bildung. Bei quantitativer Bestimmung gemäß dem Verfahren von C.1.C ergaben sich Men­ gen im Bereich von 7 × 10^-4 units/Zelle/Tag. Ein Teil dieser amplifizierten Zellen wurde sodann übertragen und in Gegen­ wart von 10 000 nanomolar MTX erhalten. Subklone von 1-15 und 18B-9 wurden, nachdem sie etwa 1 bis 2 Monate unter den in Tabelle 3 angegebenen Bedingungen gehalten worden waren, weiter getestet.

Tabelle III

Es handelte sich um folgende Zellinien: Zellinie "1" ist ein nicht-amplifizierter Klon aus dem ursprünglichen Satz von vier Klonen. "1-15₅₀₀" ist ein amplifizierter Subklon der Zellinie "1", die zunächst in 50 nanomolar MTX unter Bildung von 1-15 amplifiziert und sodann zur weiteren Ampli­ fikation in 500 nanomolar MTX übertragen worden ist. 1-15_{10 000} ist ein Subklon von 1-15₅₀₀, der weiter in Gegen­ wart von 10 000 nanomolar MTX amplifiziert worden ist. Die Zellinie 18B-9 ist ein Subklon von einem der ursprünglichen vier nachgewiesenen Klone, der mit 50 nanomolar MTX ampli­ fiziert worden ist.

Sämtliche amplifizierten Zellen zeigen eine erhöhte t-PA- Bildung im Vergleich zur nicht-amplifizierten Zellkultur. Auch die nicht-amplifizierte Kultur bildet t-PA-Mengen von mehr als 0,5 pg/Zelle/Tag. Durch Amplifikation nähert man sich der Menge von 50 pg/Zelle/Tag.

F. Ausführliche Beschreibung von rekombinanter Human t-PA

Die Struktur des gemäß den Beispielen hergestellten Human t-PA wurde näher untersucht, und zwar sowohl durch Aufklä­ rung der Genkodierungssequenz und durch biochemische Pro­ teinuntersuchungstechniken. Gegenwärtig nimmt man die in Fig. 12 dargestellte Proteinstruktur an.

Durch Collen et al. (88) wurde auch nachgewiesen, daß zwei­ kettiger Human t-PA durch proteolytische Spaltung des ein­ kettigen Moleküls in zwei durch Disulfidbindung verbundene Polypeptide erfolgt. Die gegenwärtigen Befunde erlauben den Schluß, daß die schwere Kette (Molekulargewicht 30 882) sich vom NH₂-terminalen Teil ableitet und die leichte Kette (Molekulargewicht 28 126) den COOH-terminalen Bereich um­ faßt. Die N-terminale Sequenzierung des zweikettigen Mole­ küls legt den Schluß nahe, daß die zweikettige Form durch Spaltung einer einzigen Arginyl-Isoleucin-Bindung entsteht (Fig. 12, Pfeil).

Die primäre Struktur eines Teils des Bereichs der schweren Kette von Human t-PA (Fig. 12) zeigt ein hohes Ausmaß an Sequenzhomologie mit den "kringle"-Bereichen von Plasmino­ gen (89) und Prothrombin (40, 41). Der "kringle"-Bereich bezieht sich auf eine charakteristische, dreifache Disulfid­ struktur im "pro"-Fragment von Prothrombin, was zunächst von Magnusson et al. (91, 92) näher beschrieben wurde. In der Primärsequenz von t-PA sind zwei sogenannte "kringle"-Berei­ che von jeweils 82 Aminosäuren erkennbar, die ein hohes Aus­ maß an Homologie mit den 5 "kringle"-Bereichen von Plasmi­ nogen zeigen. Die restlichen N-terminalen 91 Aminosäuren zeigen wenig Homologie mit dem üblichen "kringle"-Bereich. Es läßt sich jedoch vermuten, daß dieser Bereich ebenfalls eine Struktur mit einem Gehalt an mehrfachen Disulfidbin­ dungen annehmen kann, da dort 11 weitere Cysteinreste vor­ handen sind.

Das katalytische Zentrum der leichten Kette von Human t-PA, der sogenannte Serinproteasebereich ist wie bei anderen Se­ rinenzymen vermutlich aus den Resten Histidin₃₂₂, Aspara­ ginsäure₃₇₁ und Serin₄₇₈ gebildet. Ferner zeigen die diese Reste umgebenden Aminosäuresequenzen eine starke Homologie zu entsprechenden Teilen anderer Serinproteasen, wie Tryp­ sin, Prothrombin und Plasminogen.

Zusammenfassung Verfahren zur Herstellung von Humangewebe-Plasminogen-Aktivator

Humangewebe-Plasminogen-Aktivator (t-PA) wird in brauchba­ ren Mengen unter Verwendung von Rekombinationstechniken ge­ bildet. Erfindungsgemäß ist die Bildung von t-PA möglich, der frei von Verunreinigungen ist, mit denen er in seiner nativen zellulären Umgebung assoziiert ist. Ferner werden Verfahren, Expressionsvehikel und verschiedene Wirtszellen, die sich zur Herstellung von t-PA eignen, beschrieben.

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Claims (8)

1. Verfahren zur Herstellung von Human-Gewebe- Plasminogen-Aktivator, dadurch gekennzeichnet, daß man in einer transformierten Wirtszelle eine Expression einer in den Fig. 5A, 5B, 5C, welche Bestandteil dieses Anspruchs sind, dargestellten DNA- Sequenz, deren Allelvariationen oder Modifikationen, die zu Derivaten von Human-Gewebe-Plasminogen Aktivator führen, durchführt und den erhaltenen Human-Gewebe-Plasminogen-Aktivator gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Expression in einem transformierten E. coli-Stamm durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Expression in einer transformierten Säugetier-Zellinie durchführt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Expression in transformierten Zellinien aus den Ovarien des Chinesischen Hamsters (CHO- Zellinie) durchführt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man

• a) einen replizierbaren Expressionsvektor herstellt, der zur Expression der für Human-Gewebe- Plasminogen-Aktivator kodierenden DNA-Sequenz in einer geeigneten Wirtszelle fähig ist,
• b) eine Wirtszellenkultur zur Bildung einer rekombinanten Wirtszelle transformiert und
• c) die transformierten Wirtszellen unter Bedingungen züchtet, die eine Expression der für Human- Gewebe-Plasminogen-Aktivator kodierenden DNA- Sequenz erlauben.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Expressionsvektor das Plasmid pΔRIPA° mit der in Fig. 6 dargestellten Struktur verwendet, wobei Fig. 6 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Expressionsvektor das Plasmid pt-PAtrp 12 mit der in Fig. 9 dargestellten Struktur verwendet, wobei Fig. 9 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Expressionsvektor das Plasmid pETPFR mit der in Fig. 11 dargestellten Struktur verwendet, wobei Fig. 11 Bestandteil dieses Anspruchs ist.