Die Anmeldung betrifft die in den Ansprüchen 1 bis 6 angegebene Polypeptid
mit Human-Gewebe-Plasminogen-Aktivater Eigenschaft, gemäß Anspruch 7 dessen
DNA-Isolat, gemäß Anspruch 8 einen replizierbaren Expressionsvektor
gemäß Anspruch 9 das Plasmid p Δ RIPA°, gemäß Anspruch 10
das Plasmid pt-PAtop 12, gemäß Anspruch 11 das Plasmid p ETPFR
gemäß den Ansprüchen 12 bis 14 einen entsprechenden Mikroorganismus
oder Zellkultur und gemäß Anspruch 16 die Verwendung der Polypeptide.
Die Erfindung beruht zum Teil auf der Ermittlung der DNA-
Sequenz und abgeleiteten Aminosäuresequenz von Human-Plasminogen-
Aktivator. Diese Ermittlung ermöglichte die Bildung
von Human-Plasminogen-Aktivator unter Anwendung der rekombinanten
DNA-Technik, die wiederum die Bildung von Material in
ausreichender Qualität und Menge möglich machte, um Tierversuche
und klinische Untersuchungen als Voraussetzung für
eine Markteinführung durchzuführen, wobei keine Beschränkungen
vorlagen, mit denen bisherige Isolationsverfahren
unter Produktion und Extraktion vorhandener Zellkulturen
notwendigerweise behaftet sind.
Druckschriftliche Veröffentlichungen und andere Materialien,
die den technischen Hintergrund der Erfindung erläutern und
in speziellen Fällen auch zusätzliche Einzelheiten bezüglich
der praktischen Durchführung der Erfindung liefern, sind in
der nachstehenden Beschreibung mit Nummern gekennzeichnet.
Diese Nummern beziehen sich auf die Bibliographie am Schluß
der Beschreibung.
A. Humangewebe-Plasminogen-Aktivator
Das fibrinolytische System befindet sich in einem dynamischen
Gleichgewicht mit dem Koagulationssystem, wodurch ein
intaktes, offenes Gefäßbett aufrechterhalten wird. Das Koagulationssystem
lagert Fibrin als eine Matrix ab, die zur
Wiederherstellung eines hämostatischen Zustands dient. Das
fibrinolytische System entfernt das Fibrinnetzwerk, nachdem
der hämostatische Zustand erreicht ist. Der fibrinolytische
Prozeß wird durch das proteolytische Enzym Plasmin,
das aus dem Plasmaprotein-Vorläuferprodukt Plasminogen gebildet
wird, hervorgerufen. Plasminogen wird durch Aktivierung
mittels eines Aktivators in Plasmin umgewandelt.
Gegenwärtig sind im Handel zwei Aktivatoren erhältlich, nämlich
Streptokinase und Urokinase. Beide sind zur Behandlung
von akuten Gefäßerkrankungen, wie Myokardinfarkt, Schlaganfall,
Lungenembolie, tiefe Venenthrombose, peripherer Arterienverschluß
und andere venöse Thrombosen, indiziert. Insgesamt
stellen diese Krankheiten schwerwiegende Gesundheitsrisiken
dar.
Die diesen Krankheiten zugrunde liegende ätiologische Basis
besteht in einem partiellen oder - in schweren Fällen - totalen
Verschluß eines Blutgefäßes durch ein Gerinnsel, d. h.
Thrombus oder Thromboembolus. Bei der herkömmlichen Antikoagulationstherapie,
zum Beispiel mit Heparin und Cumarin,
wird nichts getan, um die Auflösung von Thrombi oder Thromboemboli
direkt zu fördern. Die vorstehend erwähnten thrombolytischen
Mittel Streptokinase und Urokinase werden in der
Praxis eingesetzt, unterliegen aber beide starke Beschränkungen.
Keines der beiden Mittel besitzt eine hohe Affinität
für Fibrin, so daß sie zirkulierendes und fibringebundenes
Plasminogen relativ wahllos aktivieren. Das im zirkulierenden
Blut gebildete Plasmin wird relativ rasch neutralisiert
und ist für die Thrombolyse verloren. Restliches
Plasmin baut verschiedene Gerinnungsfaktorproteine ab, zum
Beispiel Fibrinogen, Faktor V und Faktor VIII, was ein hämorrhagisches
Potential verursacht. Ferner ist Streptokinase
stark antigen, und Patienten mit hohen Antikörpern reagieren
ungenügend auf die Behandlung und können nicht unter
Dauerbehandlung bleiben. Die Urokinasetherapie ist teuer,
was auf die Isolierung aus menschlichem Urin oder Gewebekulturen
zurückzuführen ist, so daß sie sich in der klinischen
Praxis nicht allgemein durchgesetzt hat. Urokinase ist Gegenstand
zahlreicher Untersuchungen gewesen; vgl. zum Beispiel
Literaturstellen 1-6.
Sogenannte Plasminogen-Aktivatoren wurden aus verschiedenen
Humangeweben, zum Beispiel Uterusgewebe, Blut, Serum (vgl.
allgemein Literaturstellen 7-11) und Zellkulturen isoliert
(94). Zusammensetzungen davon wurden ebenfalls beschrieben
(vgl. Literaturstellen 12, 13 und 14-18). Die aus
diesen Quellen abgeleiteten Plasminogen-Aktivatoren wurden in
zwei Hauptgruppen eingeteilt: Plasminogen-Aktivatoren vom
Urokinasetyp (u-PA) und Plasminogen-Aktivatoren vom Gewebetyp
(t-PA), basierend auf Unterschieden in den immunologischen
Eigenschaften. (Die Abkürzungen t-PA und u-PA wurden
beim XXVIII Meeting of the International Committee on Thrombosis
and Hemostasis, Bergamo, Italien, 27. Juli 1982, vorgeschlagen).
Kürzlich wurde eine Humanmelanomlinie identifiziert, die
t-PA sekretiert. Die Charakterisierung dieses Melanom-Plasminogen-
Aktivators ergab, daß er sich sowohl immulogisch
als auch im Hinblick auf die Aminosäurezusammensetzung von
aus normalen Humangewebe isoliertem Plasminogen-Aktivator
nicht unterscheiden läßt (Literaturstellen 19, 88).
Das Produkt wurde in relativ reiner Form isoliert und charakterisiert.
Es wurde festgestellt, daß es sich um ein
hochaktives, fibrinolytisches Mittel handelt (20).
Einige Untersuchungen (vgl. zum Beispiel Literaturstellen
95-98), die aus Melanomzellinien gereinigte t-PA verwendeten,
ergaben für dieses Produkt im Vergleich zu Plasminogen-Aktivatoren
vom Urokinasetyp eine höhere Affinität für Fibrin.
Eingehendere Untersuchungen von human-t-PA als potentielles,
thrombolytisches Mittel wurden jedoch durch dessen äußerst
niedrige Konzentration in Blut, Gewebeextrakten, Gefäßperfusionsprodukten
und Zellkulturen behindert.
Man nahm an, daß die Anwendung der rekombinanten DNA-Technik
einen sehr wirksamen Weg zur Bereitstellung der erforderlichen,
großen Mengen an qualitativ hochwertigen Plasminogen-
Aktivator vom Humangewebetyp (vorher als Human-Plasminogen-
Aktivator bezeichnet), der im wesentlichen frei von
anderem Humanprotein ist, darstellt. Diese Materialien sollten
vermutlich biologisch aktiv sein, was ihre klinische
Verwendung bei der Behandlung verschiedener kardiovaskulärer
Zustände oder Krankheiten ermöglichen würde.
Zufriedenstellende Mengen an Human-t-PA werden von Zellkulturen
gebildet, wobei jedoch weitere Verfeinerungen unter
Anwendung einer sekundären, kodierenden Sequenz dazu dienen,
die Produktionsmengen noch weiter zu erhöhen. Die sekundäre,
kodierende Sequenz umfaßt Dihydrofolat-reduktase (DHFR), die
durch einen extern gesteuerten Parameter, wie Methotrexat,
beeinflußt wird, wodurch die Steuerung der Expression durch
Steuerung der Methotrexat (MTX)-Konzentration ermöglicht
wird.
B. Rekombinante DNA-Technik
Die rekombinante DNA-Technik hat in letzter Zeit eine erhebliche
Verfeinerung erfahren. Die Molekularbiologen sind
in der Lage, verschiedene DNA-Sequenzen relativ leicht zu
rekombinieren und neue DNA-Einheiten zu schaffen, die zur
Bildung von erheblichen Mengen an exogenen Proteinprodukten
in transformierten Mikroben und Zellkulturen fähig sind. Es
stehen allgemeine Mittel und Verfahren zur in vitro-Ligation
von verschiedenen DNA-Fragmenten mit stumpfen oder kohäsiven
Enden zur Verfügung, die zur Bildung von leistungsfähigen
Expressionsvehikeln führen, mit denen spezielle
Organismen transformiert werden können, so daß deren Syntheseleistung
auf das gewünschte, exogene Produkt gerichtet
wird. Bei einzelnen Produkten ist dieses Verfahren jedoch
recht umständlich. Die Kenntnisse sind noch nicht so weit
fortgeschritten, daß regelmäßig Vorhersagen über die Erfolgsaussichten
gemacht werden können. Versucht man Erfolge
ohne entsprechende, experimentelle Basis vorherzusagen, so
läuft man Gefahr zu scheitern.
Die DNA-Rekombination der wesentlichen Elemente, d. h. ein
Startpunkt der Replikation, eine oder mehrere phänotypische
Selektionscharakteristiken, ein Expressionspromotor,
heterologes Geninsert und restlicher Vektor, findet im allgemeinen
außerhalb der Wirtszelle statt. Das erhaltene, rekombinante,
replizierbare Expressionsvehikel oder Plasmid
wird in die Zellen durch Transformation eingeführt und
große Mengen des rekombinanten Vehikels werden durch Wachstum des
Transformanten erhalten. Wird das Gen in Bezug auf die Teile,
die die Transkription und Translation der einkodierten DNA-
Botschaft steuern, in geeigneter Weise mit Inserts versehen,
so eignet sich das erhaltene Expressionsvehikel zur tatsächlichen
Bildung der Polypeptidsequenz, für die das eingesetzte Gen
kodiert; ein Vorgang der als Expression bezeichnet wird. Das
gebildete Produkt kann gegebenenfalls durch Lysis der Wirtszelle
in mikrobiellen Systemen und Gewinnung des Produkts
durch entsprechende Reinigung von anderen Proteinen erhalten
werden.
In der Praxis kann die Verwendung der rekombinanten DNA-
Technik zur Expression von vollkommen heterologen Polypeptiden
- sogenannte direkte Expression - oder zur Expression
eines heterologen Polypeptids führen, das mit einem Teil der
Aminosäuresequenz eines homologen Polypeptids verschmolzen
ist. In den letztgenannten Fällen wird das gewünschte, bioaktive
Produkt gelegentlich innerhalb des verschmolzenen,
homolog/heterologen Polypeptids biologisch inaktiv, bis es in
einer extrazellulären Umgebung gespalten wird; vgl. (21) und
(22).
In ähnlicher Weise ist die Technik von Zell- oder Gewebekulturen
für genetische und zellphysiologische Untersuchungen
gut eingeführt. Mittel und Methoden zur Erhaltung von permanenten
Zellinien, die durch sukzessive Serienübertragungen
von isolierten, normalen Zellen hergestellt werden, stehen
zur Verfügung. Für Forschungszwecke werden derartige Zellinien
auf einem festen Träger in einem flüssigen Medium
gehalten oder in Suspension mit einem Gehalt an erhaltenden
Nährstoffen gezüchtet. Eine Vergrößerung des Herstellungsmaßstabs
zur Herstellung von großen Präparatemengen scheint
nur eine Frage der mechanischen Möglichkeiten zu sein. Zur
Vertiefung wird in diesem Zusammenhang auf die Literaturstellen
(23) und (24) verwiesen.
Ebenso stellt die Proteinbiochemie ein wertvolles, ja notwendiges
Hilfsmittel in der Biotechnologie dar. Zellen, die
das gewünschte Protein bilden, bilden darüber hinaus noch
Hunderte von anderen Proteinen, endogenen Produkten des
Zellstoffwechsels. Diese verunreinigenden Proteine sowie
andere Verbindungen können, wenn sie nicht vom gewünschten
Protein abgetrennt werden, bei Verabreichung an Tiere oder
Menschen im Verlauf einer therapeutischen Behandlung mit
dem gewünschten Protein toxisch wirken. Hier kommen die Methoden
der Proteinbiochemie zum Tragen, die die Bereitstellung
von Trennungsverfahren ermöglichen, die für das spezielle,
in Betracht kommende System geeignet sind und zur
Bildung eines für den beabsichtigten Verwendungszweck sicheren,
homogenen Produkts führen. Die Proteinbiochemie ermöglicht
auch eine Identifizierung und Charakterisierung dieses
Produkts und stellt sicher, daß die gebildete Zellen
das Produkt ohne Veränderungen oder Mutationen gebildet haben.
Dieser Zweig der Wissenschaft befaßt sich auch mit der
Ausarbeitung von Bioassays, Stabilitätsuntersuchungen und
anderen Verfahren, die durchgeführt werden müssen, bevor
erfolgreiche, klinische Untersuchungen oder eine Markteinführung
möglich sind.
Die Erfindung beruht auf dem Befund, daß die rekombinante
DNA-Technik geeignet ist zur Herstellung von Humangewebe-Plasminogen-
Aktivator (t-PA), vorzugsweise in direkter Form und
in Mengen, die ausreichen, Tierversuche und klinische Untersuchungen,
die eine Voraussetzung für eine Marktzulassung
sind, zu initiieren und durchzuführen. Der gebildete Human-
t-PA eignet sich für alle Formen der prophylaktischen oder
therapeutischen Behandlung des Menschen bei verschiedenen
kardiovaskulären Zuständen oder Krankheiten. Demzufolge
stellt die Verwendung von t-PA und von geeigneten pharmazeutischen
Zusammensetzungen davon bei der Behandlung vaskulärer
Störungen beim Menschen einen wichtigen Gesichtspunkt
der Erfindung dar.
Gegenstand der Erfindung ist ferner im wesentlichen reiner
Humangewebe-Plasminogen-Aktivator. Das durch genetische Manipulation
von Mikroorganismen oder Zellkulturen gebildete
Produkt eröffnet die Möglichkeit, Humangewebe-Plasminogen-
Aktivator effizienter als bisher herzustellen, wodurch die
bisher schwer durchgeführbare, wirtschaftliche Verwertung
ermöglicht wird. Ferner kann der erfindungsgemäße Humangewebe-
Plasminogen-Aktivator je nach Art der Wirtszelle im
Vergleich zu nativem Material in größerem oder geringerem
Umfang assozierte Glycosylierung enthalten. Auf jeden Fall
ist das t-PA frei von Verunreinigungen, von denen es normalerweise
in nicht-rekombinanter, zellulärer Umgebung begleitet
ist.
Gegenstand der Erfindung sind ferner replizierbare DNA-Expressionsvehikel,
die Gensequenzen beherbergen, welche Humangewebe-
Plasminogen-Aktivator in expressionsfähiger Form
kodieren. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Mikroorganismenstämme
oder Zellkulturen, die mit den vorstehenden
Expressionsvehikeln transformiert sind, sowie Mikroben- oder
Zellkulturen von derart transformierten Stämmen oder Kulturen,
die zur Bildung von Humangewebe-Plasminogen-Aktivator
in der Lage sind.
Fig. 1 zeigt das Ergebnis einer 10%-Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
(10% SDS, PAGE) von mit t-PA IgG fällbaren, mit ³⁵S-Methionin markierten
Proteinen, sekretiert aus Melanomzellen mit und ohne Proteaseinhibitor.
Fig. 2 zeigt die Elektrophorese der immunopräzipitierten
Translationsprodukte von aus Melanomzellen abgeleiteten
mRNA-Fraktionen.
Fig. 3 zeigt das Hybridisierungsmuster von 96 bakteriellen, mit cDNA transformierten
Kolonien unter Verwendung des Pools von ³²p-markiertem
14-mer als Tracer, hergestellt auf der Basis einer
5-Aminosäuresequenz von Human-t-PA.
Fig. 4 zeigt eine Restriktionsendonucleasekarte von Human-
t-PA cDNA in voller Länge.
Fig. 5a, 5b und 5c zeigen die Nucleotidsequenz und abgeleitete
Aminosäuresequenz von human t-PA cDNA in voller Länge.
Fig. 6 zeigt ein Schema des Aufbaus des Expressionsplasmids
p Δ RIPA°.
Fig. 7 zeigt die Ergebnisse eines Fibrin-Plattentests zur
Bestimmung der fibrinolytischen Aktivität der mit p Δ RIPA°
transformierten E. cole-Zellen.
Fig. 8 ist ein HPLC-Diagramm von Peptiden eines Trypsinverdauungsprodukts
von human t-PA.
Fig. 9 zeigt den Aufbau eines für die direkte Expression
von reifem Human-t-PA in E. coli kodierenden Plasmids.
Fig. 10 zeigt die Ergebnisse eines Fibrin-Plattentests zur
Bestimmung der fibrinolytischen Aktivität von Human-t-PA,
das durch mit pt-PAtrp12 transformiertes E. coli gebildet
ist.
Fig. 11 zeigt den Aufbau von DHFR (Mutante oder Wildtyp)/
t-PA, das zur Transformation in Säugetiergewebekulturzellen
geeignete Plasmide kodiert.
Fig. 12 ist ein schematisches Diagramm des Humangewebe-Plasminogen-
Aktivators, der gemäß der hier in E. 1 erläuterten
Methode hergestellt worden ist.
A. Definitionen
Die Ausdrücke "Humangewebe-Plasminogen-Aktivator" oder "Human-
t-PA" oder "t-PA" betreffen den durch Mikroorganismen-
oder Zellkultursysteme gebildeten, exogenen (Gewebetyp)
Plasminogen-Aktivator in bioaktiven Formen, der einen Proteaseteil
umfaßt und den für Humangewebe nativen Gewebe-
Plasminogen-Aktivatoren entspricht. Das erfindungsgemäß gebildete
Humangewebe-Plasminogen-Aktivatorprotein wurde mittels
eines bestimmten DNA-Gens und der abgeleiteten Aminosäuresequenz
definiert. Es ist klar, daß natürliche alle
Variationen vorkommen und von Individuum zu Individuum auftreten.
Diese Variationen können sich durch eine oder mehrere
unterschiedliche Aminosäuren in der Gesamtsequenz oder
durch Deletionen, Substitutionen, Insertionen, Inversionen
oder Additionen von einer oder mehreren Aminosäuren dieser
Sequenz bemerkbar machen. Ferner hängt die Stellung und das
Ausmaß der Glycosylierung von der Natur der Wirtszellenumgebung
ab.
Bei der Anwendung rekombinanter DNA-Technik besteht die Möglichkeit
zur Herstellung verschiedener Humangewebe-Plasminogen-
Aktivatorderivate, die in verschiedener Weise durch einfache
oder mehrfache Substitution, Deletion, Addition oder
Ersatz von Aminosäuren modifiziert sind, beispielsweise durch
gezielte Mutagenese der zugrunde liegenden DNA. Umfaßt wird
auch die Herstellung von Derivaten, bei denen der wesentliche
"kringle"-Bereich und der Serinprotease-Bereich, die im
allgemeinen für den hier speziell beschriebenen Humangewebe-
Plasminogen-Aktivator charakterisiert sind, erhalten sind,
die aber ansonsten auf die vorstehend beschriebene Weise
modifiziert sind. Sämtliche derartigen alle Variationen
und Modifikationen, die zu Derivaten von Humangewebe-Plasminogen-
Aktivator führen, fallen unter den Gegenstand der
Erfindung, desgleichen auch andere verwandte, exogene (Gewebetyp)
Human-Plasminogen-Aktivatoren, die physikalisch
und chemisch ähnlich sind, sofern die wesentliche charakteristische
Aktivität von Humangewebe-Plasminogen-Aktivator
in ihrer Art unbeeinträchtigt bleibt.
Es wird Humangewebe-Plasminogen-Aktivator hergestellt, (1)
der Methionin als erste Aminosäure (vorhanden auf Grund der
ATG-Startsignalcodoninsertion zu Beginn des Strukturgens) oder
(2) der, wenn das Methionin intra- oder extrazellulär gespalten
ist, seine normalerweise erste Aminosäure aufweist oder
(3) der zusammen entweder mit seinem Signalpolypeptid oder
einem sich vom herkömmlichen Signalpolypeptid unterscheidenden,
konjugierten Protein vorliegt, wobei das Signalpolypeptid
oder das Konjugat spezifisch in einer intra- oder extrazellulären
Umgebung abspaltbar sind (vgl. Literaturstelle
21), oder (4) der durch direkte Expression in reifer Form
erhältlich ist, ohne daß die Notwendigkeit zur Abspaltung
eines nicht dazugehörigen, überflüssigen Polypeptids besteht.
Das letztgenannte Produkt ist besonders wichtig,
wenn ein bestimmter Wert nicht oder nicht in ausreichendem
Umfang zur Entfernung eines Signalpeptids in der Lage ist,
sofern das Expressionsvehikel so aufgebaut ist, daß es den
Gewebe-Plasminogen-Aktivator zusammen mit dessen Signalpeptid
exprimiert. Auf jeden Fall wird der auf diese Weise gebildete
Human-t-PA in seinen verschiedenen Formen gewonnen
und soweit gereinigt, daß er sich zur Behandlung verschiedener
vaskulärer Zustände oder Krankheiten eignet.
Ferner besitzt t-PA Formen, die sowohl das Einzelketten-
(1-Kette)-Protein als auch das 2-Ketten-Protein umfassen.
Das letzt genannte Produkt leitet sich proteolytisch von
der 1-Ketten-Verbindung ab. Es wird angenommen, daß das 2-
Ketten-Protein mit dem gebildeten Fibrin assoziiert ist und
daß die proteolytische Umwandlung von 1- in das 2-Ketten-
Material am Ort der Umwandlung vom Plasminogen zu Plasmin
erfolgt. Erfindungsgemäß kommt die Verabreichung des 1-
Ketten-Protein zur vorstehend beschriebenen in vivo-Umwandlung
oder die Verabreichung des 2-Ketten-Proteins, das sich
ebenfalls als aktiv erwiesen hat, in Frage. Das 2-Ketten-
Protein kann durch in vitro-proteolytische Umwandlung hergestellt
werden, nachdem das 1-Ketten-Material gebildet ist.
Ein sogenannter "kringle"-Bereich findet sich oberhalb des
Serinproteasebereichs. Es wird angenommen, daß dieser eine
wichtige Funktion bei der Bindung des Gewebe-Plasminogen-
Aktivators an eine Fibrinmatrix spielt. Darauf beruht die
beobachtete, spezifische Aktivität des erfindungsgemäßen
Gewebe-Plasminogen-Aktivators gegen fühlbare vorhandene
Thromben. Der erfindungsgemäße Gewebe-Plasminogen-Aktivator
wird mit einem Gehalt an dem enzymatisch aktiven Bereich
gebildet, der dem nativen Material entspricht. Der Ausdruck
Humangewebe-Plasminogen-Aktivator definiert Produkte, die diesen
Bereich allein oder zusammen mit zusätzlichen Aminosäuresequenzen
bis zur vollen Länge des Moleküls umfassen.
Zusammenfassend läßt sich für die vorliegende Erfindung
Human-t-PA folgendermaßen funktionell definieren: Es ist
in der Lage, die Umwandlung von Plasminogen zu Plasmin zu
katalysieren, geht eine Bindung mit Fibrin ein und wird auf
Grund der vorstehend dargelegten immunologischen Eigenschaften
als t-PA klassifiziert.
Der Ausdruck "in im wesentlichen reiner Form" beschreibt
den Zustand von erfindungsgemäß gebildetem Human-t-PA, das
frei von Protein oder anderen normalerweise mit human t-PA
assoziierten Materialien ist, die bei Bildung durch nichtrekombinante
Zellen, d. h. in der "nativen" Umgebung, entstehen.
Der Ausdruck "DHFR-Protein" bezieht sich auf ein Protein,
das die mit Dihydrofolat-reductase (DHFR) assoziierte Aktivität
entfaltet und das daher von Zellen gebildet werden
muß, die in einem Medium mit einem Mangel an Hypoxanthin,
Glycin und Thymidin (-HGT-Medium) nicht lebensfähig sind.
Im allgemeinen können Zellen mit einem Mangel an DHFR-Protein
auf diesem Medium nicht wachsen, während Zellen mit einem
Gehalt an DHFR-Protein dazu in der Lage sind.
Der Ausdruck "gegenüber MTX empfindliche Zellen" betrifft
Zellen, die nicht in der Lage sind, auf Medien, die den DHFR-
Inhibitor Methotrexat (MTX) enthalten, zu wachsen. Bei diesen
"gegenüber MTX empfindlichen Zellen" handelt es sich um
solche Zellen, die ohne eine genetische Veränderung oder
eine anderweitige Ergänzung nicht in der Lage sind, unter
Bedingungen, die für den Zelltyp in bezug auf Umgebung und Medium
an sich geeignet sind, zu wachsen, wenn die MTX-Konzentration
0,2 µg/ml oder mehr beträgt. Einige Zellen, zum Beispiel
Bakterien, besitzen keine MTX-Empfindlichkeit, was darauf
zurückzuführen ist, daß sie MTX nicht in ihre Zellbegrenzungen
gelangen lassen, selbst wenn sie DHFR enthalten, das
ansonsten gegenüber diesem Arzneistoff empfindlich wäre. Im
allgemeinen sind Zellen, die als DHFR-Protein Wildtyp-DHFR
enthalten, gegenüber Methotrexat empfindlich, wenn sie in
bezug auf MTX durchlässig oder zu dessen Aufnahme in der
Lage sind.
Der Ausdruck "Wildtyp-DHFR" bezieht sich auf Dihydrofolatreductase,
wie sie üblicherweise in dem speziellen in Frage
kommenden Organismus gefunden wird. Wildtyp-DHFR ist im
allgemeinen in vitro empfindlich gegenüber niedrigen Konzentrationen
an Methotrexat.
Der Ausdruck "DHFR-Protein mit geringer Bindungsaffinität
für MTX" ist funktionell definiert. Es handelt sich um ein
DHFR-Protein, das bei Bildung innerhalb von Zellen das Wachstum
von MTX-empfindlichen Zellen in einem Medium mit einem
Gehalt an 0,2 µg/ml oder mehr MTX ermöglicht. Es ist ersichtlich,
daß eine derartige funktionelle Definition von der
Leichtigkeit, mit der der Organismus das "DHFR-Protein mit niedriger
Bindungsaktivität für MTX" bildet sowie vom Protein
selbst abhängt. Jedoch sollte im Rahmen der vorliegenden Erfindung
ein derartiger Ausgleich zwischen diesen beiden Mechanismen
keine Schwierigkeiten bereiten. Erfindungsgemäß
wird eine Überlebensfähigkeit bei diesen MTX-Konzentrationen
gewährleistet. Es ist belanglos, ob die Fähigkeit hierzu
zusätzlich zur vorhandenen Natur des gebildeten DHFR durch
erhöhte Expression beeinflußt sind. Ein geeignetes DHFR-
Protein, das dieser Definition entspricht, ist in der US-
Anmeldung 459 151 vom 19. Januar 1983 beschrieben.
Der Ausdruck "Expressionvektor" umfaßt Vektoren, die zur
Expression von hier in Betracht kommenden DNA-Sequenzen in
der Lage sind, wobei diese Sequenzen funktionell mit anderen
Sequenzen verknüpft sind, die zur Durchführung von deren Expression
in der Lage sind. Es wird stillschweigend angenommen,
wenn auch nicht immer ausdrücklich erwähnt, daß diese
Expressionvektoren in den Wirtsorganismen entweder als Episomen
oder als integrierender Bestandteil der chromosomalen
DNA replizierbar sein müssen. Ein Mangel an Replikationsfähigkeit
würde sie ganz eindeutig unbrauchbar machen. Zusammengefaßt
ist der Ausdruck "Expressionvektor" funktionell
definiert. Jede DNA-Sequenz, die zur Expression eines bestimmten,
hier in Frage kommenden DNA-Codes in der Lage ist,
fällt unter diesen Ausdruck, sofern er auf die bestimmte
Sequenz angewandt wird. Im allgemeinen liegen für rekombinante
DNA-Techniken geeignete Expressionsvektoren häufig in
Form von "Plasmiden" vor, wobei dieser Ausdruck sich auf
kreisförmige, doppelsträngige DNA-Schleifen bezieht, die in ihrer
Vektorform nicht an das Chromosom gebunden sind. In der
vorliegenden Beschreibung werden die Ausdrück "Plasmid"
und "Vektor" wechselweise verwendet, da das Plasmid die am
häufigsten verwendete Vektorform ist. Jedoch umfaßt die
Erfindung auch solche andere Formen von Expressionsvektoren,
die äquivalente Funktionen erfüllen.
Der Ausdruck "rekombinante Wirtszellen" betrifft Zellen, die
mit Vektoren, die durch rekombinante DNA-Techniken aufgebaut
sind, transformiert sind. Entsprechend der hier gegebenen
Definition wird t-PA in den auf Grund dieser Transformation
erreichten Mengen gebildet und nicht in den geringen Mengen,
die durch den untransformierten Wirt entstehen, die häufig
unter der Nachweisgrenze liegen. Durch derartige Zellen
gebildeter t-PA kann auch als "rekombinanter t-PA" bezeichnet
werden.
B. Wirtszellkulturen und Vektoren
Die hier beschriebenen Vektoren und Methoden eignen sich
zur Anwendung in Wirtszellen innerhalb eines breiten Bereichs
von prokaryontischen und eukaryontischen Organismen.
Selbstverständlich werden im allgemeinen Prokaryonten zum
Klonen von DNA-Sequenzen beim Aufbau der erfindungsgemäß
geeigneten Vektoren bevorzugt. Beispielsweise ist E. coli
K12 Stamm 294 (ATCC 31 446) besonders geeignet. Es können
auch andere Mikroorganismenstämme verwendet werden, darunter
die E. coli-Stämme E. coli B und E. coli X1776 (ATCC
31 537). Diese Beispiele dienen jedoch nur zur Erläuterung
und stellen keine Beschränkung dar.
Prokaryonten können ebenfalls zur Expression verwendet werden.
Die vorerwähnten Stämme sowie E. coli W3110 (F-, i-,
prototroph, ATCC 27 325), Bazillen, wie Bacillus subtilis
und andere Enterobacteriaceae, wie Salmonella typhimurium
oder Serratia marcescens und verschiedene Pseudomonas-Spezies
können verwendet werden.
Im allgemeinen werden Replikon und Kontrollsequenzen enthaltende
Plasmidvektoren, die von mit der Wirtszelle verträglichen
Spezies abgeleitet sind, in Verbindung mit diesen
Wirten verwendet. Der Vektor trägt üblicherweise eine Replikationsstelle
sowie markierende Sequenzen, die in der Lage
sind, eine phänotypische Selektion in transformierten Zellen
zu gewährleisten. Beispielsweise wird E. coli typischerweise
unter Verwendung von pBR 322, einem von einer E. coli-Spezies
abgeleiteten Plasmid (Bolivar et al., Gene 2, [1977], Seite
95) transformiert. pBR 322 enthält
Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz und erlaubt
somit eine leichte Identifizierung von transformierten Zellen.
Das pBR 322-Plasmid oder andere mikrobielle Plasmide
muß auch Promotoren enthalten, die vom mikrobiellen Organismus
zur Expression seiner eigenen Proteine verwendet
werden können, oder es muß so modifiziert sein, daß es
diese Promotoren enthält. Diese Promotoren, die sehr häufig
beim rekombinanten DNA-Aufbau verwendet werden, umfassen
β-Lactamase (Penicillinase) und Lactose-Promotorsysteme
(Chang et al., Nature, Bd. 275 [1975], S. 617; Itakura et
al., Science, Bd. 198 [1977], S. 1056; Goeddel et al.,
Nature, Bd. 281 [1979], S. 544) sowie ein Tryptophan (trp)-
Promotorsystem (Goeddel et al., Nucleic Acids Res., Bd. 8
[1980], S. 4057; EP-A 36 776).
Neben diesen besonders gebräuchlichen Promotoren wurden
auch andere mikrobielle Promotoren aufgefunden und eingesetzt.
Einzelheiten bezüglich der Nukleotidsequenzen dieser
Promotoren wurden veröffentlicht, was es dem Fachmann erlaubt,
sie funktionell mit Plasmidvektoren zu verknüpfen (Siebenlist
et al., Cell, Bd. 20 [1980], S. 269).
Neben Prokaryonten können auch eukaryontische Mikroben, wie
Hefekulturen, verwendet werden. Unter den eukaryontischen
Mikroorganismen wird am häufigsten Saccaromyces cerevisiae
oder übliche Bäckerhefe verwendet, wenngleich auch zahlreiche
andere Stämme verfügbar sind. Für die Expression in
Saccharomyces wird im allgemeinen das Plasmid YRp 7 (Stinchcomb
et al., Nature, Bd. 282 [1979], S. 39; Kingsman et al.,
Gene, Bd. 7 [1979], S. 141; Tschember el al., Gene, Bd. 10
[1980], S. 157) verwendet. Dieses Plasmid enthält bereits
ds trp1-Gen, das einen Selektionsmarker für einen Mutantenstamm
von Hefe, dem die Fähigkeit zum Wachstum in Tryptophan
fehlt, zum Beispiel ATCC 44 076 oder PEP4-1 (Jones, Genetics,
Bd. 85 [1977], S. 12) bereitstellt. Die Anwesenheit der
trp1-Läsion als Charakteristikum für das Hefewirtszellengenom
stellt dann eine wirksame Umgebung zum Nachweis der
Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan
dar.
Beispiele für geeignete Promotorsequenzen in Hefevektoren
sind die Promotoren für 3-Phosphoglycerat-kinase (Hitzeman
et al., J. Biol. Chem., Bd. 255 [1980], S. 12 073) oder andere
glycolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg.,
Bd. 7 [1968], S. 149; Holland et al., Biochemistry, Bd. 17
[1978], S. 4900), wie Enolase, Glycerinaldehyd-3-phosphat-
dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat-decarboxylase, Phosphofructokinase,
Glukose-6-phosphat-isomerase, 3-Phosphoglycerat-
mutase, Pyruvat-kinase, Triosephosphat-isomerase,
Phosphoglucose-isomerase und Glucokinase. Beim Aufbau von
geeigneten Expressionsplasmiden werden die mit diesen Genen
assozierte Terminationssequenzen ebenso in den Expressionsvektor
3′ der gewünschten, zu exprimierenden Sequenz ligiert,
um für die Polyadenylierung von mRNA und Termination zu sorgen.
Weitere Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil der
durch die Wachstumbedingungen kontrollierten Transkription
aufweisen, sind die Promotorbereiche für Alkohol-dehydrogenase
2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, mit dem
Stickstoffwechsel assozierte, abbauende Enzyme und die vorerwähnten
Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase sowie Enzyme,
die für die Verwertung von Maltose und Lactose verantwortlich
sind (Holland a.a.O.). Beliebige Plasmidvektoren mit
einem Gehalt an hefeverträglichen Promotor-Replikationsstartstellen-
und Terminationssequenzen sind geeignet.
Neben Mikroorganismen können auch Kulturen von Zellen, die
sich von mehrzelligen Organismen ableiten, als Wirte verwendet
werden. Im Prinzip sind beliebige, derartige Zellkulturen
geeignet, unabhängig davon, ob sie von Wirbeltieren
oder wirbellosen Tieren stammen. Das größte Interesse besteht
jedoch für Wirbeltierzellen. Die Vermehrung von Wirbeltierzellen
in Kulturen (Gewebekulturen) ist in den letzten
Jahren zu einem routinemäßigen Verfahren geworden
(Tissue Culture, Academic Press, Herausgeber Kruse und Patterson,
1973). Beispiele für derartige, geeignete Wirtszellinien
sind VERO- und HeLa-Zellen, Zellinien aus den Ovarien
des Chinesischen Hamsters (CHO) und W138-, BHK-, COS-7-
und MDCK-Zellinien. Expressionsvektoren für derartige Zellen
umfassen im allgemeinen (soweit erforderlich) eine Replikationsstartstelle,
einen vor dem zu exprimierenden Gen befindlichen
Promotor zusammen mit eventuell erforderlichen
Ribosomenbindungsstellen, RNA-Spleisstellen, eine Polyadenylierungsstelle
und transkriptionale Terminatorsequenzen.
Bei Säugetierzellen werden die Kontrollfunktionen an den
Expressionsvektoren häufig durch virales Material bereitgestellt.
Beispielsweise leiten sich üblicherweise Promotoren
von Polyoma, Adenovirus 2 und sehr häufig von Simian Virus
40 (SV 40) ab. Die frühen und späten Promotoren des SV 40-
Virus sind besonders geeignet, da sie beide leicht aus dem
Virus als ein Fragment erhalten werden, das auch die SV 40-
virale Replikationsstartstelle enthält (Fiers et al., Nature,
Bd. 273 [1978], S. 113). Kleinere oder größere SV 40-
Fragmente können ebenfalls verwendet werden, vorausgesetzt
es ist die etwa 250 bp umfassende Sequenz von der Hind III-
Stelle bis zur Bgl I-Stelle, die sich in der viralen Replikationsstartstelle
befindet, vorhanden. Ferner ist es auch
möglich und häufig erwünscht, Promotor- oder Kontrollsequenzen
zu verwenden, die normalerweise mit der erwünschten Gensequenz
assoziiert sind, vorausgesetzt diese Kontrollsequenzen
sind mit den Wirtszellsystemen verträglich.
Eine Replikationsstartstelle kann entweder durch Aufbau des
Vektors einer exogenen Startstelle, abgeleitet beispielsweise
von SV 40 oder einer anderen viralen Quelle (zum Beispiel
Polyoma, Adeno, VSV, BPV und dergleichen), oder durch
den chromosomalen Replikationsmechanismus der Wirtszelle
bereitgestellt werden. Ist der Vektor in das Wirtszellenchromosom
integriert, ist dieses Chromosom häufig ausreichend.
Bei der Auswahl einer bevorzugten Wirtszelle für die Transfektion
durch die erfindungsgemäßen Vektoren, die sowohl
t-PA als auch DHFR-Protein kodierende DNA-Sequenzen umfassen,
ist es angebracht, den Wirt entsprechend dem Typ des
verwendeten DHFR-Proteins auszuwählen. Wird Wildtyp-DHFR-
Protein verwendet, wählt man vorzugsweise eine Wirtszelle
mit einem Mangel an DHFR, was die Verwendung der DHFR kodierenden
Sequenz als Marker für die erfolgreiche Transfektion im
selektiven Medium mit Mangel an Hypoxanthin, Glycin und
Thymidin ermöglicht. Eine geeignete Wirtszelle in diesem
Fall ist die Zellinie aus den Ovarien des Chinesischen Hamsters
(CHO) mit einem Mangel an DHFR-Aktivität. Diese Zellinie
läßt sich gemäß Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad.
Sci. (USA), Bd. 77 [1980], S. 4216) herstellen und vermehren.
Wird andererseits DHFR-Protein mit niedriger Bindungsaffinität für MTX als Kontrollsequenz
verwendet, ist es nicht erforderlich, Zellen mit DHFR-Mangel zu
verwenden. Da die mutante DHFR gegen Methotrexat resistent ist, können Medien
mit einem Gehalt an MTX als Selektrionsmittel verwendet werden, vorausgesetzt
die Wirtszellen sind selbst gegen Methotrexin empfindlich. Die meisten eukaryontischen
Zellen, die zur Absorption von MTX fähig sind, scheinen gegenüber Methotrexat
empfindlich zu sein. Eine geeignete derartige Zellinie ist eine CHO-Linie
CHO-K1 ATCC CCL 61.
Zufriedenstellende Mengen an Human-t-PA werden von Zellkulturen gebildet, wobei
jedoch weitere Verfeinerungen unter Anwendung einer sekundären, kodierenden Sequenz
dazu dienen, die Produktionsmengen noch weiter zu erhöhen. Die sekundäre,
kodierende Sequenz kodiert für Dihydrofolat-reduktase (DHFR), die durch einen extern
gesteuerten Parameter, wie Methotrexat, beeinflußt wird, wodurch die Steuerung
der Expression durch Steuerung der Methotrexat (MTX)-Konzentration ermöglicht wird.
Die nachstehenden Beispiele beschreiben die Verwendung von E. coli mit dem lac-trp-
Promotorsystem und CHO-Zellen als Wirtszellen und von Expressionsvektoren, die
die SV 40-Replikationsstartstelle als Promotor enthalten. Der Fachmann kann
jedoch auf Grund seines Fachwissens analoge Techniken anwenden,
um Expressionsvektoren zur Expression der gewünschten
Proteinsequenzen in anderen prokaryontischen oder eukaryontischen
Wirtszellkulturen aufzubauen.
C. Angewandte Verfahren
Werden Zellen ohne erhebliche Zellmembranbarrieren als Wirtszellen
verwendet, wird die Transfektion gemäß dem Calciumphosphat-
Fällungsverfahren nach Graham und Van der Eb, Virology,
Bd. 52 (1973), S. 456 durchgeführt. Doch können auch
andere Verfahren zur Einführung von DNA in Zellen zum Beispiel
durch nukleare Injektion oder durch Protoplastenfusion
angewandt werden.
Werden prokaryontische Zellen oder Zellen, die wesentliche Zellwandkonstruktionen
enthalten, verwendet, so besteht die bevorzugte
Transfektionsmethode in der Calciumbehandlung unter
Verwendung von Calciumchlorid gemäß F. N. Cohen et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), Bd. 69 (1972), S. 2110.
Beim Aufbau von geeigneten Vektoren mit einem Gehalt an diesen
Kodierungs- und Kontrollsequenzen werden übliche Ligationstechniken
angewandt. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente
werden zur Bildung der gewünschten Form der erforderlichen
Plasmide gespalten, geschnitten und religiert.
Die Spaltung wird durch Behandlung mit Restriktionsenzym
(oder Enzymen) in einem geeigneten Puffer durchgeführt. Im
allgemeinen werden etwa 1 µg Plasmid oder DNA-Fragmente mit
etwa 1 unit Enzym in etwa 20 µl Pufferlösung verwendet.
(Entsprechende Puffer und Substratmengen für bestimmte Restriktionsenzyme
werden vom Hersteller angegeben). Inkubationszeiten
von etwa 1 Stunde bei 37°C sind geeignet. Nach
der Inkubation wird das Protein durch Extraktion mit Phenol
und Chloroform entfernt. Die Nucleinsäure wird aus der wäßrigen
Fraktion durch Fällung mit Äthanol gewonnen.
Sind stumpfe Enden erforderlich, wird das Präparat 15 Minuten
bei 15°C mit 10 units Polymerase I (Klenow) behandelt,
mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Äthanol gefällt.
Die Auftrennung der gespaltenen Fragmente nach der Größe
wird unter Verwendung von 6 prozentigem Polyacrylamidgel
gemäß D. Goeddel et al., Nucleic Acids Res., Bd. 8 (1980),
S. 4057 durchgeführt.
Zur Ligation werden etwa äquimolare Mengen der gewünschten
Komponenten, die am Ende in geeigneter Weise geschnitten
sind, um eine korrekte Übereinstimmung zu gewährleisten,
mit etwa 10 units T4 DNA-Ligase pro 0,5 µg DNA behandelt.
(Wenn gespaltene Vektoren als Bestandteile verwendet werden,
kann zur Verhinderung der Religation des gespaltenen
Vektors eine Vorbehandlung mit bakterieller, alkalischer
Phosphatase durchgeführt werden.)
Für eine Analyse zur Bestätigung der korrekten Sequenzen in
den aufgebauten Plasmiden werden die Ligationsgemische zur
Transformation von E. coli K12-Stamm 294 (ATCC 31 446) verwendet.
Erfolgreiche Transformanten werden gegebenenfalls
auf Grund von Ampicillinresistenz ausgewählt. Von den Transformanten
werden Plasmide hergestellt, durch Restriktion
analysiert und/oder nach dem Verfahren von Messing et al.,
Nucleic Acids Res., Bd. 9 (1981), S. 309 oder nach dem Verfahren
von Maxam et al., Methods in Enzymology, Bd. 65
(1980), S. 499 sequenziert.
Die Amplifikation von DHFR-Protein kodierenden Sequenzen
wird durchgeführt, indem man Wirtszellkulturen in Gegenwart
von Methotrexat, einem kompetitiven Inhibitor der DHFR-
Aktivität in Konzentrationen von etwa 20-500 000 nanomolar
züchtet. Der wirksame Konzentrationsbereich hängt natürlich
stark von der Art des DHFR-Gens, dem Protein und den
Eigenschaften des Wirts ab. Im allgemeinen lassen sich klar
definierte obere und untere Grenzen nicht feststellen. Es
können auch geeignete Konzentrationen von anderen Folsäureanalogen
oder anderen Verbindungen, die DHFR hemmen, verwendet
werden. MTX selbst ist jedoch besonders zweckmäßig,
leicht zugänglich und wirksam.
D. Allgemeine Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen
Humangewebe-Plasminogen-Aktivator wurde auf folgende Weise
erhalten:
- 1. Humanmelanomzellen, die aktiv Gewebe-Plasminogen-Aktivator
bildeten, wurden bis zur Konfluenz gezüchtet.
- 2. Zellpellets aus diesen Zellkulturen wurden in Gegenwart
von Ribonuclease-Inhibitoren gezüchtet, um die gesamte,
zytoplasmatische RNA zu isolieren.
- 3. Eine oligo-dT-Säule isolierte die gesamte messenger-RNA
(mRNA) in polyadenylierter Form. Diese mRNA wurde der
Größenfraktionierung unter Anwendung der Säure-Harnstoff-
Agarosegel-Elektrophorese unterzogen.
- 4. Die Gelfraktion mit einem Gehalt an Gewebe-Plasminogen-
Aktivator-spezifischer RNA wurde auf folgende Weise
identifiziert: Die RNA der einzelnen Gelfraktionen wurde
in einem Kaninchen-Reticulocytenlysat- in vitro-System,
ergänzt mit Hundepankreas-Mikrosomen, translatiert. Die
erhaltenen Translationsprodukte wurden dann mit Humangewebe-
Plasminogen-Aktivator-spezifischem IgG-Antikörper
immunopräzipitiert.
- 5. Die geeignete RNA (21 bis 24 S) wurde in die entsprechende
einzelsträngige, komplementäre DNA (cDNA) übergeführt,
aus der doppelsträngige cDNA gebildet wurde. Nach poly-
dC-Schwänzen wurde es in einen Vektor eingesetzt, beispielsweise
in ein Plasmid, das einen oder mehrere phänotypische
Marker trug.
- 6. Die auf diese Weise hergestellten Vektoren wurden zur
Transformation von Bakterienzellen unter Bildung einer
geklonten cDNA-Bibliothek verwendet. Ein Pool von radioaktiv
markierten, synthetischen Desoxyoligonucleotiden,
die komplementär zu den Kodons für bekannte Aminosäuresequenzen
in t-PA waren, zum Beispiel der Pool von
8 14-meren
(komplementär zu den Sequenzen,
die für die bekannte (vgl. unten) Aminosäuresequenz:
Tryptophan-Glutaminsäure-Tyrosin-Cystein-Asparaginsäure
(W-E-Y-C-D) kodieren) wurde hergestellt und zur Markierung
der Koloniebibliothek verwendet.
- 7. Aus den positiven cDNA-Klonen wurde Plasmid-DNA isoliert
und sequenziert.
- 8. Die sequenzierte DNA wurde dann in vitro zur Insertion
in ein geeignetes Expressionsvehikel, das zur Transformation
einer geeigneten Wirtszelle verwendet wurde, geschnitten.
Die Wirtszelle wurde in einer Kultur gezüchtet,
wodurch der gewünschte Humangewebe-Plasminogen-Aktivator
gebildet wurde.
- 9. Der auf diese Weise gebildete Humangewebe-Plasminogen-
Aktivator weist in seinem enzymatischen Serinproteaseteil
etwa 251 Aminosäuren auf. Ferner besitzt er oberhalb
davon eine einen "kringle" enthaltende Sequenz, von
der zur Zeit angenommen wird, daß sie für die Fibrinbindung
verantwortlich ist. Das reife Protein zuzüglich
dessen Signalpräsequenz weist insgesamt 562 Aminosäuren
auf.
Das vorstehende Verfahren selbst gewährleistet die erfolgreiche
Bindung von reinem t-PA. Erfindungsgemäße Verfahren
unter Anwendung einer zusätzlichen kodierenden, gegenüber
Methotrexat empfindlichen Sequenz erlauben die Bildung von
antigenaktivem t-PA-Protein in Wirtszellkulturen in Mengen
von mehr als 0,1 pg pro Zelle pro Tag. Bei entsprechender
Anwendung von amplifizierenden Bedingungen können Mengen
von mehr als 20 pg erhalten werden. Mit anderen Worten, es
lassen sich Genexpressionsgrade erreichen, die zur Bildung
von mehr als 9×10-6 Plough-Einheiten oder bei entsprechender
Amplifikation von mehr als 18×10-4 Plough-Einheiten an
t-PA-Aktivität führen.
Gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung bedient man sich
des Arzneistoffs Methotrexat, der zwar normalerweise für
zur Aufnahme dieses Wirkstoffs fähige Zellen tödlich ist,
der in Gegenwart von kontrollierten Konzentrationen an MTX
durch Amplifikation des Gens, das für die DHFR-kodierende
Sequenz kodiert, Zellwachstum ermöglicht (R. T. Schimke et
al., Science, Bd. 202 [1978], S. 1051; J. L. Biedler et al.,
Cancer Res., Bd. 32 [1972], S. 153; S. E. Chang et al., Cell,
Bd. 7 [1976], S. 391).
Diesbezüglich ist der Befund von Bedeutung, daß die Amplifikation
des Gens für DHFR die Amplifikation von assoziierten
Sequenzen, die für andere Proteine kodieren, verursachen
kann, Dies erscheint der Fall zu sein, wenn es sich beim
assoziierten Protein um Hepatitis B-Oberflächenantigen
(HBsAg) (J. Christman et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 79
[1982], S. 1815), E. coli-Protein XGPRT (G. Ringold et al.,
J. Molec. and Appl. Gen., Bd. 1 [1981], S. 165) und eine
endogene Sequenz aus einer DHFR/SV 40-Plasmidkombination
(R. F. Kaufman et al., J. Molec. Biol., Bd. 159 [1982],
S. 601) handelt.
Andere Mechanismen, durch die eine Methotrexat-Resistenz
verliehen werden kann, umfassen die Verminderung der Bindungsaffinität
für das DHFR-Protein, so daß es gegenüber
Methotrexat weniger empfindlich wird (W. F. Flintoff et al.,
Somat. Cell Genet., Bd. 2 [1976], S. 245), aber in diesem
Fall Amplifikation ebenfalls stattfindet.
Es scheint, daß die Gene für Wildtyp-DHFR und für DHFR,
die gegenüber MTX resistenz ist, auf Grund ihrer eigenen
verminderten Bindungskapazität durch die Gegenwart von MTX
amplifiziert werden. Somit wird gemäß dieser Ausführungsform
der Erfindung die Einwirkung der DHFR-Sequenzamplifikation
auf assoziierte, proteinkodierende Sequenzen angewendet,
um einen Kontrollmechanismus bereitzustellen, der
verstärkte Expressionsgrade von t-PA-Sequenzen in Gegenwart
von MTX oder aufgrund einer vorherigen Behandlung von transformierten
Zellen mit MTX erlaubt.
E. Beispiel
Die nachstehenden Beispiele erläutern die Erfindung, stellen
aber keine Beschränkung dar. In den Beispielen wurden eine
E. coli-Wirtskultur und eine CHO-Zellinie, die sich für den
Typ der einzuführenden DHFR-proteinkodierenden Sequenz eignet
als Wirtszellkultur verwendet. Jedoch eignen sich auch
andere eukaryontische und prokaryontische Zellen für das erfindungsgemäße
Verfahren.
E. 1 Epression von human t-PA-Gen in E. coli
E. 1. A Beschreibung der Figuren
Fig. 1 ist ein Autoradiogramm eines 10prozentigen SDS-
Acrylamidgels, das das oder die immunopräzipitierte(n)
[-35S]-Methionin-markierte(n) Protein(e), darstellt, die
aus Humanmelanomzellen in vivo während 3 Stunden sekretiert
wurden, und zwar in Gegenwart (Reihe b) oder Abwesenheit
(Reihe a) des Proteaseinhibitors Aprotinin. Nach der Immunopräzipitation
mit Gewebe-Plasminogen-Aktivator-spezifischem
IgI wurden drei Banden beobachtet (Reihe a), die Molekulargewichte
von etwa 65 000, 63 000 bzw. 35 000 aufwiesen. In
Gegenwart des Proteaseinhibitors wurde jedoch die Spezies
mit einem Molekulargewicht von 35 000 nicht festgestellt.
Durch die Immunopräzipitation wurden keine Produkte ausgefällt,
wenn Präimmunserum verwendet wurde (Reihe c). Die
Wanderungen und die Molekulargewichte von ¹⁴C-markierten
Proteinstandards sind links von Reihe a wiedergegeben.
Fig. 2 zeigt die Elektrophorese der immunopräzipitierten
Translationsprodukte von aus einem Säure-Harnstoff-Agarosegel
isolierten RNA-Fraktionen. Eine Hauptsache wurde in den
Fraktionen 7 und 8 nach Translation in Gegenwart von Hundepankreas-
Mikrosomen unter anschließender Immunopräzipitation
mit Gewebe-Plasminogen-Aktivator-spezifischem IgG beobachtet.
Diese Bande weist ein Molekulargewicht von etwa
63 000 Dalton auf. Die Größe der in den Fraktionen 7 und 8
wandernden mRNA beträgt etwa 21 bis 24 S. Die Positionen der
ribosomalen RNA-Marker, die nach Elektrophorese am RNA-Harnstoff-
Gel bestimmt und durch Färben mit Ethidiumbromid sichtbar
gemacht wurden, sind über den entsprechenden Gelreihen
angegeben.
Fig. 3 zeigt das Hybridisierungsmuster von 96 Kolonien mit
dem
96 individuelle
Transformanten wurden auf einer Mikrotiterplatte
gezüchtet, replikaplattiert und auf einer Nitrocellulosemembran
gezüchtet. Die Kolonien wurden sodann lysiert, die
bakterielle DNA fixiert und die Filter mit ³²p-14-mer (W-
E-Y-C-D)-Markern hybridisiert. Die Filter wurden zur Entfernung
von nicht-hybridisiertem Marker gewaschen und auf Röntgenfilm
aufgelegt. Das Autoradiogramm stellt die Muster von
48 einzelnen Filtern (4600 unabhängige Kolonien) dar. Ein
Beispiel für einen positiven Gewebe-Plasminogen-Aktivator-
cDNA-Klon auf Filter Nummer 25 ist als E10 (Pfeil) gekennzeichnet.
Fig. 4 ist eine Restriktionsendonuclease-Karte der vollen
Länge von Humangewebe-Plasminogen-Aktivator-cDNA. Die Anzahl
und die Größe der durch die Spaltung mit Restriktionsendonuclease
gebildeten Fragmente wurde durch Elektrophorese
an 6prozentigen Acrylamidgelen bestimmt. Die Positionen
der Stellen wurden durch Nucleinsäuresequenz (in Fig. 5
wiedergegeben) bestätigt. Der kodierende Bereich des größten
offenen Leserasters ist durch ein Kästchen gekennzeichnet.
Der schraffierte Bereich stellt die mutmaßliche Signalpeptidsequenz
dar, während der punktierte Bereich die
mutmaßliche Sequenz von reifem Gewebe-Plasminogen-Aktivator
(527 Aminosäuren) wiedergibt. Das 5′-Ende von mRNA befindet
sich auf der linken Seite und das 3′-Ende auf der rechten
Seite.
Die Fig. 5A, 5B und 5C erläutern die Nucleotidsequenz und
die abgeleitete Aminosäuresequenz von Humangewebe-Plasminogen-
Aktivator-cDNA in voller Länge. Die der reifen Sequenz
vorhergehenden 35 Aminosäuren (-35 bis -1) sind als ununterbrochene
Sequenz dargestellt. Es wird angenommen, daß diese
Sequenz mit 35 Aminosäuren aus einer hydrophylen "pro"-
Sequenz mit etwa 12 bis 15 Aminosäuren, die dem Serin (+1)
des reifen Proteins vorausgeht, und einem dieser "pro"-Sequenz
vorausgehenden "herkömmlichen" hydrophoben Signal
(sich erstreckend von 5′ bis -35) besteht. Dieser Typ von
prä-pro-Struktur an sekretierten Proteinen wurde bereits
früher beschrieben, zum Beispiel für Präproalbumin. Gemäß
dieser Theorie beginnen sämtliche sekretierten Gewebe-Plasminogen-
Aktivator-Moleküle mit dem Serin (+1) als Aminoende.
Eine zweite Theorie besteht darin, daß die hydrophile Sequenz
an der Funktion von Gewebe-Plasminogen-Aktivator auf
analoge Weise beteiligt sein kann, wie sie ein bei Plasminogen,
bei dem ein Peptid mit 10 000 Dalton vom aminoterminalen
Bereich des nativen Plasminogen (Glu-Plasminogen, benannt
nach dem aminoterminalen Ende) gespalten werden kann,
beobachtet wurde, wodurch ein kleineres Molekül mit einem
neuen Aminoende, bezeichnet als Lys-Plasminogen, erhalten
wird. Lys-Plasminogen wird leichter zu Plasmin aktiviert
und hat auch eine größere Affinität für Fibrin als Glu-
Plasminogen. Es wurde gezeigt, daß Plasmin die Umwandlung
von Glu- in Lys-Plasminogen katalysiert. Diese Art von
Kontrollmechanismus bewirkt einen "positiven feedback"-
Mechanismus. Die ersten Mengen an gebildeten Plasmin bewirken
neben dem Abbau von Fibrin auch eine Bildung von Plasminogenmolekülen,
die leichter aktiviert werden, und gehen
auch eine festere Bindung mit ihrem Substrat als natives
Plasminogen ein. Es ergibt sich ein rascher Abbau von Fibrin.
Das hydrophile Peptid des Gewebeplasminogen-Aktivators
könnte an einem ähnlichen Mechanismus beteiligt sein, so
daß dessen Spaltung eine modifizierte Bindung des Enzyms an
Fibrin ergibt. In jedem Fall wird die 35-Aminosäuresequenz
als Präsequenz für das reife Protein angesehen.
Fig. 6 ist ein schematisches Diagramm des Aufbaus eines
Gewebeplasminogen-Aktivators-Expressionsplasmids p Δ IPA°.
Das Ausgangsplasmid pPA25E10 wurde zunächst mit PstI verdaut,
um ein 376 bp-Fragment zu isolieren, das sodann gemäß
den Angaben dieser Figur verdaut wurde.
Fig. 7 zeigt das Ergebnis eines Fibrinplattentests zur Bestimmung
der fibrinolytischen Aktivität des über p Δ IPA°
in transformierten Zellen erhaltenen Expressionsprodukts.
Fig. 8 ist ein HPLC-Diagramm von Peptiden aus einem Trypsin-
Verdauungsprodukt von Gewebe-Plasminogen-Aktivator (Absorption
bei 210 nm). Der Pfeil identifiziert des Peak, der
dem Peptid entspricht, das zur Bezeichnung des bei der Koloniebibliothek
verwendeten Nucleotid-Markers verwendet wurde.
Das diesem Peak entsprechende Peptid wies folgende vollständige
Sequenz auf: L-T-W-E-Y-C-D-V-P-S-C-S-T-C-G-L. Die
anderen Hauptpeaks wurden in ähnlicher Weise sequenziert
und führten zu einer Bestätigung der korrekten Aminosäuresequenz
von Humangewebe-Plasminogen-Aktivator. Zur Bezeichnung
der Aminosäuren in den Peptiden wurden folgende, einbuchstabige
Symbole verwendet:
Fig. 9 zeigt den Aufbau eines für die direkte Expression
von reifem Humangewebe-Plasminogen-Aktivator in E. coli kodierenden
Plasmids. 50 µg Plasmid pPA17 wurden mit Sau3AI,
HincII und HhaI verdaut und der Elektrophorese an 6prozentigem
Polyacrylamidel unterworfen. Etwa 0,5 µg des 55 bp
Sau3AI-HhaI-Fragments wurden gewonnen. In ähnlicher Weise
wurden etwa 3 µg des 263 bp HhaI-NarI-Fragments aus 80 µg
des Klons pPA25E10 gereinigt, indem zunächst ein 300 bp
PstI-NarI-Fragment isoliert und dieses Fragment mit HhaI
verdaut wurde. Sämtliche Verdauungsvorgänge wurden 1 Stunde
bei 37°C durchgeführt. Die Reaktionsprodukte wurden aufgetrennt
und der Elektroelution an 6prozentigem Polyacrylamidgel
unterworfen. Die beiden angegebenen Desoxyoligonucloeotide
5′ dAATTCATGTCTTATCAAGT (I) und 5′ GATCACTTGATAAGACATG
(II) wurden nach der Festphasen-phosphotriester-Methode
(51) synthetisiert. 100 pMol des Oligonucleotids II wurden in
einem 30 µl fassenden Reaktionsgemisch mit einem Gehalt an
60 mmillimolar Tris (ph-Wert 8), 10 millimolar MgCl₂, 15 millimolar
β-Mercaptoäthanol und 50 µCi [-32p] ATP
(5000 CimMol-1) phosphoryliert. 12 units T4-Polynucleotidkinase
wurden zugesetzt. Die Umsetzung wurde 15 Minuten bei
37°C durchgeführt. 1 µl 10 millimolar ATP und 12 units T4-
Kinase wurden sodann zugesetzt und die Umsetzung wurde weitere
30 Minuten fortgesetzt. Nach Phenol/CHCl₃-Extraktion
wurden das phosphorylierte Oligomer II und das 5′-Hydroxyloligomer
I mit 0,5 µg des eluierten 55 bp Sau3AI-HhaI-Fragments
und 2 µg des 263 bp HhaI-NarI-Fragments vereinigt und
mit Äthanol gefällt. Diese Fragmente wurden 4 Stunden bei
Raumtemperatur in 60 µl 20 millimolar Tris-HCl (pH-Wert 7,5),
10 millimolar MgCl₂, 10 millimolar Dithiothreit, 0,5 millimolar
ATP und 1000 units T4-DNA-Ligase verknüpft. Das Gemisch
wurde 1 Stunde mit 48 units NarI, 20 units EcoRI und
40 units BglII (zur Beseitigung der Polymerisation durch
Ligation von kohäsiven Sau3AI-Enden) verdaut und der Elektrophorese
an 6prozentigem Gel unterworfen. Das 338 bp-
Produkt (etwa 0,1 µg) wurde durch Elektroelution gewonnen.
Der Rest der t-PA-kodierenden Sequenzen (Aminosäuren 111 bis
528) wurden an einem 1645 bp-Fragment durch Verdauen des
Plasmids pPA25E10 mit NarI und BglII isliert. Das Plasmid
pLeIFAtrp103 ist ein Derivat des Plasmids pLeIFA25 (52),
bei dem die EcoRI-Stelle distal zum LeIF A-Gen entfernt
worden ist (53). 3 µg pLeIFAtrp103 wurden mit 20 units EcoRI
und 20 units BglII 90 Minuten bei 37°C verdaut, der Elektrophorese
an 6prozentigem Polyacrylamidgel unterworfen. Das
große Vektorfragment (4200 bp) wurde durch Elektroelution
gewonnen. Für den endgültigen Aufbau wurden 80 ng EcoRI-
BglII pLeIFAtrp103 mit 100 ng des 1645 bp-NarI-BglII-Fragments
und 20 ng des 338 bp-EcoRI-NarI-Fragments 10 Stunden
bei Raumtemperatur verknüpft. Dieses Verknüpfungsgemisch
wurde zur Transformation von E. cole K-12 Stamm 294 verwendet.
Plasmid-DNA wurde aus 38 dieser Transformanten hergestellt
mit EcoRI verdaut. 10 dieser Plasmide enthielten die
gewünschten 600 bp- und 472 bp-EcoRI-Fragmente. Die DNA-Sequenzanalyse
bestätigte, daß eines dieser Plasmide
(pt-PAtrp12) die gewünschte Nucleotidsequenz an den Verbindungen
zwischen trp-Promotor, synthetische DNA und cDNA
aufwies.
Fig. 10 zeigt das Ergebnis eines Fibrinplattentests zur Bestimmung
der fibrinolytischen Aktivität des erfindungsgemäßen
Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Expressionsprodukts. Eine
über Nacht gezüchtete Kultur von E. coli W3110/pt-PAtrp12
in Luria-Brühe mit einem Gehalt an 5 µg ml-1 Tetracyclin
wurde 1 : 100 in M9-Medium mit einem Gehalt an 0,2 Prozent
Glucose, 0,5 Prozent Casaminsäuren und 0,5 µg ml-1 Tetracyclin
verdünnt. Die Zellen wurden bei 37°C bis zu einem
A₅₅₀-Wert von 0,2 gezüchtet. Indolacrylsäure wurde in einer
Endkonzentration von 20 µg/ml zugesetzt. Die Proben wurden
bei einem A₅₅₀-Wert von 0,5 bis 0,6 (∼2×10⁸ Zellen ml-1)
durch Zentrifugation gewonnen und sofort eingefroren. Die
Zellpellets wurden in 6 m Guanidin-hydrochlorid in einer
Konzentration von 5×10⁸ Zellen/ml suspendiert, 10 Sekunden
mit Ultraschall behandelt, 30 Minuten bei 24°C inkubiert
und sodann 4 Stunden gegen 25 millimolar Tris-HCl vom pH-
Wert 8,0 mit einem Gehalt an 250 millimolar NaCl, 0,25 millimolar
EDTA und 0,01 Prozent Tween 80 dialysiert. Nach der
Dialyse wurden die Proben 2 Minuten bei 13 000 g zentrifugiert
und 10 µl der Überstände wurden jeweils auf ihre Aktivität
an Gewebe-Plasminogen-Aktivator analysiert. Gemäß
dem Verfahren von Granelli-Piperno und Reich (87) wurde die
Platte 3,5 Stunden bei 37°C inkubiert, und die Lysiszonen
wurden gemessen. Ein quantitativer Befund wurde durch Vergleich
mit Verdünnungen einer Lösung von gereinigtem Melanomgewebe-
Plasminogen-Aktivator erhalten.
E. 1. B Quelle für Gewebe-Plasminogen-Aktivator-m-RNA
Es wurden Humanmelanomzellen (Bowes) verwendet. Die Melanomzellen
wurden bis zur Bildung von konfluenten Monolayers
in 100 ml Earles-Minimal-Essentiell-Medien, die mit Natriumhydrogencarbonat
(0,12 Prozent Endkonzentration), 2 millimolar
Glutamin und 10 Prozent wärmeinaktiviertes, fötales
Kälberserum ergänzt waren, gezüchtet. Zur Bestätigung, daß
die Melanomzellen in bezug auf die Bildung von Humangewebe-
Plasminogen-Aktivator aktiv waren, wurden die Humanmelanomzellen
bis zur Konfluenz in einer 24 Vertiefungen aufweisenden
Mikrotiterplatte entweder in Gegenwart oder Abwesenheit
von 0,33 mikromolar Protease-Inhibitor Aprotinin gezüchtet.
Die Zellen wurden einmal mit gepufferter Kochsalzlösung gewaschen
und mit 0,3 ml serumfreies, methioninfreies Medium
versetzt. 75 µCi [-35S]-Methionin wurden zugesetzt. Die Zellen
wurden 3 Stunden bei 37°C markiert. Nach der dreistündigen
Markierungsdauer wurden die Medien von den Zellen abgetrennt
und zur Immunopräzipitation entweder mit Gewebe-
Plasminogen-Aktivator-spezifischem IgG oder Präimunserum
behandelt (54). Die immunopräzipitierten Produkte wurden
der Elektrophorese an einem 10prozentigen SDS-Acrylamidgel
unterworfen. Das Scheibengel wurde fixiert, getrocknet und
der Fluorigraphie unterworfen.
E. 1. C Isolierung und Größenfraktionierung von Messenger-
mRNA
Die gesamte RNA aus Melanomzellkulturen wurde im wesentlichen
nach dem Verfahren von Ward et al. (55) extrahiert. Die
Zellen wurden durch Zentrifugation pelletisiert und sodann
in 10 millimolar NaCl, 10 millimolar Tris-HCl von pH-Wert
7,5, 1,5 millimolar MgCl₂ resuspendiert. Die Zellen wurden
durch Zugabe von NP-40 (Endkonzentration 1 Prozent) lysiert.
Die Kerne wurden durch Zentrifugation pelletisiert. Der die
gesamte RNA enthaltende Überstand wurde durch mehrfache
Phenol- und Chloroform-Extraktionen weiter gereinigt. Die
wäßrige Phase wurde auf eine NaCl-Konzentration von 0,2 M
gebracht. Anschließend wurde die gesamte RNA durch Zugabe
von 2 Volumina Äthanol ausgefällt. Zur Reinigung von mRNA
aus den Gesamt-RNA-Präparaten wurde die oligo-dT-Cellulose-
chromatographie angewandt (51). Typische Ausbeuten aus 10 g
gezüchteten Melanomzellen betrugen 5 bis 10 mg Gesamt-RNA
und 50 bis 200 µg Poly(A)⁺-mRNA.
Die Fraktionierung von PolyA⁺-nRNA (200 µg) (56) wurde durch
Elektrophorese an Harnstoff-Agarosegelen durchgeführt. Das
Scheibenagarosegel (57, 58) bestand aus 1,75 Prozent Agarose,
0,025 M Natriumcitrat, pH-Wert 3,8 und 6 M Harnstoff.
Die Elektrophorese wurde 7 Stunden bei 25 mA und 4°C durchgeführt.
Das Gel wurde sodann mit einer Rasierklinge fraktioniert.
Die einzelnen Scheiben wurden bei 70°C geschmolzen
und zweimal mit Phenol und einmal mit Chloroform extrahiert.
Die Fraktionen wurden sodann mit Äthanol gefällt und
anschließend durch in vitro-Translation in einem Kaninchen-
Reticulocytenylsat-System, Bethesda Research Lab. (59, 60),
ergänzt mit Hundepankreas-Mikrosomen folgendermaßen getestet:
Translationen wurden unter Verwendung von 25 µCi
an [-35S]-Methionin und 500 ng der einzelnen Gelscheiben-
RNA in einem Endvolumen von 30 µl mit einem Gehalt an 25 millimolar
HEPES, 48,3 millimolar KCl, 10 millimolar Kreatinphosphat, 19
Aminosäuren jeweils 50 millimolar, 1,1 millimolar Magnesiumchlorid,
16,6 millimolar EDTA, 0,16 millimolar Dithiothreit, 8,3 millimolar
Hämin, 16,6 µg/ml Kreatin-kinase, 0,33 millimolar
Calciumchlorid, 0,66 millimolar EGTA, 23,3 millimolar Natriumchlorid
durchgeführt.
Die Inkubationen wurden 90 Minuten bei 30°C durchgeführt.
Hundepankreas-Mikrosomenmembranen, die aus rohen Mikrosomen
unter Verwendung von EDTA zur Entfernung der Ribosomen
hergestellt waren (61), wurden gemäß (62) mit Nuclease behandelt.
Sie lagen im Translationsgemisch in einer Endkonzentration
von 7A₂₆₀ units/ml vor. Die Translationsprodukte
oder immunopräzipitierten Translationsprodukte wurden durch
Elektrophorese an 10prozentigen Polyacrylamidgelen gemäß den
nachstehenden Angaben in Natriumdodecylsulfat analysiert (63).
Die ungefärbten Plattengele wurden fixiert, getrocknet und
der Fluorigraphie unterworfen (64).
Die erhaltenen Translationsprodukte aus den einzelnen Gelfraktionen
wurden mit Kaninchen-anti-Humangewebe-Plasminogen-
Aktivator-spezifischem IgG immunopräzipitiert. Eine
immunopräzipitierte Polypeptidhauptbande wurde bei der
Translation der RNA-Fraktionsnummern 7 und 8 (Wanderung von
21 bis 24 S) mit einem Molekulargewicht von etwa 63 000 Dalton
beobachtet. Diese Bande wurde nicht beobachtet, wenn
Präimmun-IgG zur Immunopräzipitation verwendet wurde, was
darauf schließen ließ, daß diese Polypeptide für Gewebe-
Plasminogen-Aktivator spezifisch waren.
E. 1. D Herstellung einer Koloniebibiliothek mit einem Gehalt
an Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Sequenzen
5 µg gelfraktionierte mRNA (Gelscheibe 7 mRNA) wurden zur
Herstellung von doppelsträngiger cDNA nach üblichen Verfahren
(52, 65, 66) verwendet. Die cDNA wurde an 6prozentigem
Polyacrylamidgel der Größenfraktionierung unterworfen. cDNA
mit mehr als 350 bp Länge (125 ng) wurde der Elektroelution
unterzogen. 30 ng cDNA wurden mit desoxy(C)-Resten unter
Verwendung von terminaler Desoxynucleotidyl-transferase
(67) erweitert und mit 300 ng Plasmid-pBR322 (68), das in
ähnlicher Weise mit desoxy(G)-Resten an der Pst-I-Stelle geschnitten
war (67), verschweißt. Das verschweißte Gemisch
wurde sodann in E. coli K12 Stamm 294 (ATCC 31 446) transformiert.
Es wurden etwa 4600 Transformanten erhalten.
E. 1. E Herstellung eines DNA-Markers
Gereinigter Humangewebe-Plasminogen-Aktivator wurde gemäß
dem Verfahren der Literaturstellen 19 und 20 erhalten.
Das Molekül wurde zur Feststellung der Bereiche, die sich am
besten zur Herstellung von synthetischen Markern eigneten,
auf folgende Weise zerlegt:
Um die Proteine gegenüber einer Verdauung durch Trypsin
empfindlich zu machen, wurden sie reduziert und carboxymethyliert.
Eine 2-µg-Probe an Gewebe-Plasminogen-Aktivator
wurde zunächst über Nacht bei Raumtemperatur gegen 0,01 Prozent
Tween 80 dialysiert. Das lyophilisierte Protein wurde
sodann in 12 ml 0,56 M Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 8,6) mit
einem Gehalt an 8 M Harnstoff und 5 millimolar EDTA gelöst.
Die Disulfidbindungen wurden durch Zugabe von 0,1 ml β-Mercaptoäthanol
reduziert. Diese Reaktion wurde 2 Stunden bei
45°C unter Stickstoff durchgeführt. Die reduzierten Disulfide
wurden sodann durch Zugabe von 1,0 ml 1,4 M Jodessigsäure
in 1 M NaOH zum Carboxymethylderivat alkyliert. Nach
20 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Umsetzung durch 18-
stündige Dialyse bei Raumtemperatur gegen 0,01 Prozent
Tween 80 gestoppt. Sodann wurde lyophilisiert.
Das erhaltene, lyophilisierte, carboxymethylierte Protein
wurde in 3 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 7,5) gelöst.
Trypsin (TPCK) wurde in einem Verhältnis von 1 : 50 zugesetzt.
Die Verdauung wurde bei 37°C durchgeführt. Nach
3, 6 bzw. 12 Stunden wurden jeweils Aliquotanteile (0,1 ml)
entnommen. Eine zweite Trypsinzugabe erfolgte nach 12 Stunden.
Nach 24 Stunden wurde die Umsetzung durch Einfrieren gestoppt.
Sie wurde bis zur Injektion in die HPLC-Vorrichtung
in gefrorenem Zustand gehalten. Der Verdauungsablauf wurde
durch SDS-Gele der Aliquotanteile ermittelt. Sämtliche Gele
waren leer mit Ausnahme einer schwachen Bande am 3-Stunden-
Aliquotanteil. Dies zeigt, daß das 24-Stunden-Verdauungsprodukt
vollständig war und keine großen Peptide enthielt.
Eine Probe (etwa 0,5 ml) wurde in eine hochauflösende Altex
C-8-Ultrasphere®-5-µ-Säule mit zwei Durchläufen injiziert.
Ein Acetonitrilgradient (1 bis 5 Prozent in 5 Minuten, 5 bis
35 Prozent in 100 Minuten, 35 bis 50 Prozent in 30 Minuten)
wurde angewandt. In einer der beiden präparativen Durchläufe
wurde das eluierte Produkt bei zwei Wellenlängen (210 und
280 nm) überprüft. Das Verhältnis der Absorptionen bei den
beiden Wellenlängen wurde als Maß für den Tryptophangehalt
der Peptide herangezogen.
Die Peptidpeaks, bei denen ein Tryptophangehalt am wahrscheinlichsten
war, oder solche Peaks, die aus anderen Gründen
als geeignet erschieden wurden, zuerst sequenziert. Dies
ermöglichte die Bestimmung der Sequenz um die meisten der
Tryptophanreste. Nach Sequenzieren von etwa 25 der bestgeeigneten
Peptidpeaks wurden sämtliche zusammenpassenden
Sequenzdaten zu einem vorläufigen Modell der Primärstruktur
von Gewebe-Plasminogen-Aktivator vereinigt. Aus diese Daten
und dem Modell konnten mehrere mögliche Tracer festgestellt
werden.
E. 1. F Identifikation von Bakterienklonen mit einem Gehalt
an Gewebe-Plasminogen-Aktivator-cDNA-Sequenzen
Die Kolonien wurden einzeln in Vertiefungen von Mikrotiterplatten
mit einem Gehalt an LB (93) +5 µg/ml Tetracyclin
gebracht und nach Zugabe von DMSO auf eine Konzentration von
7 Prozent bei -20°C gelagert. Zwei Kopien der Koloniebibliothek
wurden auf Nitrocellulosfiltern gezüchtet. Die DNA
einer jeden Kolonie wurde gemäß dem Grunstein-Hogness-Verfahren
(69) am Filter fixiert.
Der ³²p-markierte
wurde gemäß
den vorstehenden Ausführungen aus dem synthetischen Oligomeren
(W-E-Y-C-D) 14-mer-Pool hergestellt. Filter mit einem
Gehalt an 4600 Transformanten wurden 2 Stunden bei Raumtemperatur
in 50 millimolar Natriumphosphat vom pH-Wert 6,8
5×SSC (80), 150 µg/ml mit Ultraschall behandeltes Lachssperma-
DNA, 5×Denhardt-Lösung (85), 10 Prozent Formamid
prähybridisiert und anschließend mit 50×10⁶ cpm des markierten
Tracers in der gleichen Lösung hybridisiert. Nach
Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur 30 Minuten in 6×
SSC, 0,1 Prozent SDS, einmal in 2×SSC gewaschen und sodann
16 Stunden auf Röntgenfilm unter Verwendung von
Verstärkungsfiltern gelegt.
Plasmid-DNA wurde aus sämtlichen Kolonien nach einem
Schnellverfahren (71) isoliert, wobei sich eine positive
Hybridisierungsreaktion ergab. Die cDNA-Inserts aus diesen
Klonen wurden sodann nach Subklonierung von Fragmenten in
den M13-Vektor mp 7 (73) und nach dem chemischen Verfahren
gemäß Maxam Gilber (74) sequenziert. Fig. 3 zeigt, daß
Filter Nummer 25 das Hybridisierungsmuster eines positiven
Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Klons aufweist. Das cDNA-Insert
im Klon 25E10 erwies sich als DNA-kodierend für Gewebe-
Plasminogen-Aktivator, was durch einen Vergleich von dessen
Aminosäuresequenzen der Peptidsequenz (vgl. oben) von gereinigtem
Gewebe-Plasminogen-Aktivator und durch dessen in
E. coli gemäß den vorstehenden, näheren Angaben gebildetes Expressionsprodukt
gezeigt wurde. Das DNA-Insert von Klon 25E10 (Plasmid pA25E10) war
2304 Basenpaare lang, wobei der längste, offene Ableseraster ein
Protein von 508 Aminsoäuren (Molkulargewicht 56 756) kodierte
und einen 772 bp-3′-nicht-translatierten Bereich enthielt.
Diesem cDNA-Klon fehlten die N-terminalen, kodierenden Sequenzen.
E. 1. G Direkte Expression von Humangewebe-Plasminogen-Aktivator-
Klon in E. coli
Bezugnehmend auf Fig. 6 wurden 50 µg pPA25E10 (vgl. oben)
mit PstI verdaut. Das 376-bp-Fragment wurde durch Elektrophorese
an 6prozentigem Polyacrylamidgel isoliert. Etwa
3 µg dieses Fragments wurden durch Elektroelution aus dem
Gel isoliert, mit 30 units Dde I 1 Stunde bei 37°C verdaut,
mit Phenol und Chloroform extrahiert und mit Äthanol gefällt.
Die erhaltenen Dde I-kohäsiven Enden wurden durch
Zusatz von 5 units DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) und
jeweils 0,1 millimolar dATP, dCTP, dGTP, dTTP zum Reaktionsgemisch
und 8stündige Inkubation bei 4°C zu stumpfen Enden
erweitert. Nach Extraktion mit Phenol und Chloroform wurde
die DNA 2 Stunden mit 15 units Nar I verdaut. Das Reaktionsgemisch
wurde der Elektrophorese an 6prozentigem Polyacrylamidgel
unterworfen. Etwa 0,5 µg des gewünschten 125-bp-
stumpfendigen Nar I-Fragments wurden gewonnen. Dieses Fragment
kodiert für die Aminosäuren Nummer 69 bis 110 von reifem
Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Protein voller Länge.
Zur Isolation des 1645-bp-Nar I - Bgl II-Fragments wurden
30 µg pPa25E10 mit 30 units Nar I und 35 units Bgl II
2 Stunden bei 37°C verdaut. Das Reaktionsgemisch wurde der
Elektrophorese an 6prozentigem Polyacrylamidgel unterworfen.
Etwa 6 µg des gewünschten 1645 bp-Nar I - Bg II-Fragments
wurden gewonnen.
Das Plasmid p Δ RlSRC ist ein Derivat des Plasmids
pSRCex16 (79), bei dem die Eco RI-Stellen proximal zum trp-
Promotor und distal zum SRC-Gen durch Reparatur mit DNA-
Polymerase I (28) entfernt waren. Das selbst-komplementäre
Oligodesoxynucleotid AATTATGAATTCAT (hergestellt nach dem
Phosphortriester-Verfahren (75) wurde in die verbleibende
Eco RI-Stelle unmittelbar neben der Xba I-Stelle eingesetzt.
20 µg p Δ RISRC wurden vollständig mit Eco RI verdaut,
mit Phenol und Chloroform extrahiert und mit Äthanol
gefällt. Das Plasmid wurde sodann mit 100 units Nuclease
SI 30 Minuten bei 16°C in 25 millimolar Natriumacetat (pH-
Wert 4,6) mit einem Gehalt an 1 millimolar ZnCl₂ und 0,3 M
NaCl verdaut, um ein stumpfes Ende mit der Sequenz AT zu
schaffen. Nach Extraktion mit Phenol und Chloroform und nach
Äthanolfällung wurde die DNA mit Bam HI verdaut, der Elektrophorese
an 6prozentigem Polyacrylamidgel unterworfen,
und das große Vektorfragment (4300 bp) wurde durch Elektroelution
gewonnen.
Das Expressionsplasmid wurde durch 7stündige Ligation bei
Raumtemperatur von 0,2 µg Vektor, 0,06 µg des 125-bp-stumpfendigen
Nar I-Fragments und 0,6 µg des 1645-bp-Nar I-
Bgl II-Fragments mit 10 units T₄-DNA-Ligase aufgebaut. Dieses
wurde zur Transformation von E. coli Stamm 294 (ATCC
31 446) zur Verleihung von Ampicillinresistenz verwendet.
Plasmid-DNA wurde aus 26 der Kolonien hergestellt und mit
Xba I und Eco RI verdaut. 12 dieser Plasmide enthielten die
gewünschten 415-bp-Xba I-Eco RI- und 472-bp-Eco RI-Fragmente.
Die Analyse der DNA-Sequenz ergab, daß einige dieser
Plasmide ein ATG-Initiationscodon aufwiesen, das korrekt
am Start der Aminosäure Nummer 63 (Serin) plaziert war.
Eines dieser Plasmide, p-RIPA°, wurde untersucht. Es ergab
den gewünschten Gewebe-Plasminogen-Aktivator (Fig. 7).
E. 1. H Gewebe-Plasminogen-Aktivator-cDNA von voller Länge
a) Herstellung einer Koloniebibliothek mit einem Gehalt an
N-terminalen Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Sequenzen
0,4 µg des synthetischen Oligonucleotids
5′-TTCTGAGCACAGGGCG-3′ wurden zum "Primen" von 7,5 µg
Gelfraktion Nummer 8 mRNA (vgl. oben) verwendet, um
nach üblichen Verfahren (65, 66) doppelsträngige cDNA
herzustellen. Die cDNA wurde der Größenfraktionierung
an 6prozentigem Polyacrylamidgel unterworfen. Eine
Fraktion von mehr als 300 bp (36 ng) wurde der Elektroelution
unterworfen. 5 ng cDNA wurden mit desoxy(C)-
Resten unter Verwendung von terminaler Desoxycytidyltransferase
(67) erweitert und mit 50 ng des Plasmids
pBR322 (68), das in ähnlicher Weise mit desoxy(G)-Resten
an der Pst I-Stelle geschnitten war (67), verschweißt.
Das verschweißte Gemisch wurde sodann in E. coli K12
Stamm 294 transformiert. Es wurden etwa 1500 Transformanten
erhalten.
b) Southern-Hybrisierung von Humangenom-DNA
Da die cDNA-Primer-Reaktion unter Verwendung eines synthetischen
Fragments, das 13 bp vom N-Ende des Klons
pPA25E10 hybridisierte, durchgeführt worden war, stand
in diesem 29-bp-Bereich (der die 16-mer Sequenz umfaßt)
kein geeignetes Restriktionsfragment zum Screening der
cDNA-Klone zur Verfügung. Daher war es erforderlich, ein
Humangewebe-Plasminogen-Aktivator-Genom-Klon zu isolieren,
um alle Primer-erweiterten cDNA-Klone mit einem
Gehalt an N-terminalen Gewebe-Plasminogen-Aktivator-
kodierenden Sequenzen zu identifizieren.
Bei der ersten Stufe dieses Verfahrens wurde festgestellt,
daß in Humangenom-DNA nur ein einziges, homologes Gewebe-
Plasminogen-Aktivator-Gen vorhanden ist. Um dies
festzustellen, wurde eine Southern-Hybridisierung durchgeführt.
Bei diesem Verfahren (77) wurden 5 µg hochmolekulare
Humanlymphocyten-DNA (hergestellt gemäß 80)
vollständig mit verschiedenen Restriktionsendonucleasen
verdaut, der Elektrophorese an 1,0prozentigen Agarosegelen
unterworfen (81) und auf ein Nitrocellulosefilter
geblottet (77). Ein ³²p-markierter DNA-Tracer wurde aus
dem 5′-Ende des cDNA-Iserts des cDNA-Klons pPA25E10
(ein 230-bp-Hpa II-RSA I-Fragment) hergestellt (76)
und mit dem Nitrocellulosefilter hybridisiert (82).
35×10⁶ cpm des Tracers wurden 40 Stunden hybridisiert
und sodann gemäß (82) gewaschen. Zwei Endonuclease-
Verdauungsmuster zeigen nur ein einziges, hybridisierendes
DNA-Fragment: Bgl II (5,7 Kbp) und Pvu II (4,2 Kbp)
Zwei hybridisierende DNA-Fragmente wurde mit Hinc II
(5,1 Kpb und 4,3 Kbp) beobachtet. Zusammen lassen diese
Daten den Schluß zu, daß im Humangenom nur ein einziges
Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Gen vorhanden ist und
daß dieses Gen mindestens eine Zwischensequenz (intervening
sequence) enthält.
c) Screening der Human-λ-Phagenbibliothek auf Plasminogen-
Aktivator-Gene
Die zur Identifizierung der λ-Phagenrekombinanten, die die
Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Gene tragen, angewandte Strategie bestand
im Nachweis der Nucleotidhomologie mit einem aus dem Gewebe-
Plasminogen-Aktivator-cDNA von pPA25E10 hergestellten,
radioaktiven Tracers. 1 Million rekombinante λ-Phagen
wurden in einer Dichte von 10 000 pfu/15 cm Platte auf
DP 50 Sup F ausgestrichen. Nitrocellulosefilter-Replikaplattierungen
wurden von jeder Platte gemäß dem Verfahren
von Benton und Davis (78) hergestellt. Eine
³²p-markierte DNA-Probe wurde nach üblichen Verfahren
(83) aus einem 230-bp-Hpa II - Rsa I-Fragment, das sich
in einer Entfernung von 34 bp vom 5′-Ende des Plasmids
pPA25E10 befand, hergestellt. Jeder Nitrocellulosefilter
wurde bei 42°C zwei Stunden in 50 millimolar Natriumphosphat
(pH-Wert 6,5), 5×SSC (77), 0,05 mg/ml mit
Ultraschall behandelter Lachssperma-DNA, 5× Denhardt-
Lösung (84), 50 Prozent Formamid prähybridisiert und sodann
mit 50°×10⁶ cpm der markierten Probe in der gleichen
Lösung mit einem Gehalt an 10 Prozent Natriumdextransulfat
hybridisiert (85). Nach Inkubation über Nacht
bei 42°C wurden die Filter viermal bei 50°C 30 Minuten
in 0,2×SSC, 0,1 Prozent SDS, einmal bei Raumtemperatur
in 2×SSC gewaschen und sodann über Nacht auf
Röntgenfilme unter Verwendung von
Verstärkungsfiltern aufgelegt. Insgesamt wurden 19 mit
dem Tracer hybridisierte Klone erhalten. Phagen-DNA
wurde gemäß den vorstehenden Angaben (86) aus 6 Rekombinanten
hergestellt. Der λ-Klon C wurde zur Herstellung
eines Pvu II-Fragments zum Kolonienscreening verwendet.
30 µg DNA wurden 1 Stunde bei 37°C mit Pvu II
verdaut und der Elektrophorese an 1,0prozentigem Agarosegel
unterworfen. Ein 4,2-Kbp-Fragment, in dem vorher
der Gehalt an Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Sequenzen
nachgewiesen worden war, wurde der Elektroelution
unterworfen und gereinigt. Ein ³²p-markierter Tracer
wurde nach üblichen Verfahren (83) für Kolonienhybridisierungen
gemäß den vorstehenden Angaben hergestellt.
d) Screening der Koloniebibliothek für 5′-Gewebe-Plasminogen-
Aktivator-Sequenzen
Die Kolonien wurden von Platten übertragen und auf Nitrocellulosefiltern
gezüchtet. Die DNA der einzelnen Kolonien
wurden am Filter gemäß dem Verfahren von Grunstein-
Hogness (69) fixiert. Ein 32p-markierter Tracer wurde
durch Kalbsthymus-Primen (83) eines 4,2 kbp-Pvu II-Fragments
aus einem isolierten Gewebe-Plasminogen-Aktivator-
λ-Genomklon hergestellt. Filter mit einem Gehalt an
1500 Transformanten wurden mit 112×10⁶ cpm des ³²p-
Genom-Pvu II-Fragments hybridisiert.
Die Hybridisierung wurde 16 Stunden unter den Bedingungen
gemäß Fritsch et al. (82) durchgeführt. Die Filter
wurden gründlich gewaschen und sodann 16 bis 48 Stunden
auf Röntgenfilme unter Verwendung von
Verstärkungsfiltern aufgelegt. 18 Kolonien
hybridisierten klar mit der Genomprobe. Plasmid-DNA
wurde aus jeder dieser Kolonien isoliert, an Nitrocellulosefilter
gebunden und mit den für die ursprüngliche
Primer-Reaktion verwendeten 32p-markierten, synthetischen
Oligonucleotid (16-mer) hybridisiert. Von den 18 Klonen
hybridisierten 7 mit dem der Kinasebehandlung unterworfenen
16-mer. Bei der Sequenzanalyse nach Subklonierung
der Fragmente in den m13-Vektor mp⁷ (73) ergab sich für
einen Klon (pPA17), daß er den korrekten 5′-N-terminalen
Bereich von Gewebe-Plasminogen-Aktivator, eine Signalleitsequenz
(signal leader sequence) und einen
84-bp-5′-nicht-translatierten Bereich enthielt. Aus den
beiden Klonen pPA25E10 und pPA17 wurde die vollständige
Nucleotidsequenz gemäß Fig. 5 und das Restriktionsmuster
(Fig. 4) von Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Klon von
voller Länge bestimmt.
Beim nativen Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Molekül besteht
die Möglichkeit zur Stabilisierung durch 17 Disulfidbrücken,
basierend auf der Homologie mit anderen
Serinproteasen. Es gibt vier potentielle N-Glykosylierungsstellen,
drei in den "kringle"-Bereichen bei Asn₁₁₇,
Asn₁₈₄, Asn₂₁₈ und eine potentielle Stelle im gleichen
Kettenbereich bei Asn₄₄₈. Variationen in der Struktur
der Oligosaccharid-Liganden können für die unterschiedlichen
molekularen Formen (mit Molgewichten von 65 000
bzw. 63 000) verantwortlich sein.
E. 1. I Direkte Expression von Gewebe-Plasminogen-Aktivator-
cDNA-Klon voller Länge in E. coli
Eine Rekonstruktion der gesamten kodierenden Sequenz war
unter Verwendung der gemeinsamen Hha I-Restriktionsendonuclease-
Stelle, die beide partiellen Klone pPA17 und
pPA25E10 gemeinsam besitzten, möglich. Ein 55-bp-Sau3AI-
Hha-I-Restriktionsfragment, das den Aminosäuren 5-23 entsprach,
wurde aus dem Plasmid pPA17 isoliert. Die Sau3AI-
Restriktionsstelle befand sich am Kodon 4 der angenommenen
reifen, kodierenden Sequenz und wurde zur Entfernung des das
Signalpeptid kodierenden Bereichs verwendet. Ein 263-bp-
HhaI - NarI-Fragment (kodierend für die Aminosäuren 24-110)
wurde ebenfalls aus dem Plasmid pPA25E10 isoliert. Zwei
synthetische Desoxyoligonucleotide wurden hergestellt, die
die Kodons für die Aminosäuren 1-4 wiederherstellen, ein ATG-
translationales Initiationskodon einverleihen und ein Eco
RI-kohäsives Ende schaffen. Diese drei Fragmente wurden sodann
unter Bildung eines für die Aminosäuren 1-110 kodierenden
338-bp-Fragmente miteinander verknüpft. Dieses Fragment
und ein 1645-bp-Nar I - Bgl II-Fragment aus pPA25E10 wurden
sodann zwischen den Eco RI- und Bgl II-Stellen des Plasmids
pLeIFAtrp 103 (53) unter Bildung des Expressionsplasmids
pt-PAtrp12 verknüpft. Das geklonte t-PA-Gen wurde unter der
Kontrolle eines 300-bp-Fragments von E. coli-trp-Operon,
das den trp-Promotor, Operator und die Shine-Dalgarno-Sequenz
des trp-Leitpeptids enthält, aber das Leitpeptid
ATG-Initiationskodon nicht enthält, transkribiert (52).
E. coli K12 Stamm W3110 (ATCC 27 325) mit einem Gehalt am
Plasmid pt-PAtrp12 wurde gezüchtet. Extrakte wurden zur Bestimmung
der fibrinolytischen Aktivität hergestellt. Eine
Methode zur Messung der Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Aktivität
war der Fibrinplattentest (87). Dabei wird die Menge
an gebildetem Plasmin gemessen, indem man das Ausmaß der
Plasminverdauung von Fibrin in einer Agaroseplatte mit einem
Gehalt an Plasminogen und Fibrin bestimmt. Plasmin ruft eine
klare Lysiszone in der Fibrinplatte hervor. Aus der Fläche
dieser Zone kann die Menge an in der Probe vorhandenem Gewebe-
Plasminogen-Aktivator ermittelt werden. Werden Extrakte
von pt-PAtrp12-Klonen auf die Gewebe-Plasminogen-Aktivator-
Aktivität unter Anwendung des Fibrinplattentests getestet,
so ergibt sich eine klare Lösung. Diese fibrinolytische
Aktivität wird durch anti t-PA-IgG, aber nicht
durch Präimmun-IgG oder anti-Urokinase-IgG gehemmt. Keine
Aktivität ergibt sich bei einem Extrakt, der aus Zellen hergestellt
ist, die zur Kontrolle das Leukocyteninterferonplasmid
pLeIFAtrp103 enthalten. Unter Anwendung einer Eichkurve
von gereinigtem t-PA läßt sich berechnen, daß etwa
20 units an extrahierter Aktivität pro 10⁹ Zellen erhalten
wurden (für gereinigtes t-PA: 90 000 Plough-units = 1 mg)
(Fig. 10).
E. 1. J Sequenzanalyse
Die Sequenzanalyse beruhte auf dem Edman-Abbau (83b). Die
Probe wurde in das Probengefäß des
Sequenziergerät mit drehendem Probengefäß gegeben. Polybrene®
(Poly-N,N,N¹,N¹-tetramethyl-N-trimethylenhexamethylen-
diammonium-diacetat) wurde als Träger im Gefäß verwendet
(63 C). Das Sequenziergerät war mit einer Kühlfalle und mit
einigen Programmveränderungen zur Verringerung von Hintergrundpeaks
modifiziert. Als Reagentien wurden die Beckman-
Reagentien für Sequenzierzwecke 0,1 M Quadrol-Puffer, Phenylisothiocyanat
und Heptafluorbuttersäure verwendet.
Die gesammelten Edman-Zyklen wurden manuell zu 2-Anilino-
5-thiazolinonderivaten umgesetzt. Das 1 Chlorbutan wurde
unter Stickstoff getrocknet. Sodann wurde 1,0 n HCl in Wasser
zum 2-Anilino-5-thiazolinon gegeben und 10 Minuten auf
70°C erwärmt, um eine Umwandlung in das 3-Phenyl-2-thiohydantoin
(PTH-Derivat) durchzuführen. Der PTH-Aminosäurerest
wurde sodann in 50prozentigem Acetonitril in Wasser
gelöst und in eine Hochdruck-Flüssigchromatographievorrichtung
mit Phasenumkehr injiziert. Die einzelnen PTH-Aminosäuren
wurden durch Vergleich der Retentionszeiten eines
Standardgemisches von PTH-Aminosäuren, die in die Konversionsflasche
eingeführt und wie ein Zyklus des Sequenziergeräts
behandelt wurden, identifiziert.
E. 1. K Tests zum Nachweis der Expression von Gewebe-Plasminogen-
Aktivator
1. Direkter Test der Plasminbildung
a) Theorie
Ein empfindlicher Test für Gewebe-Plasminogen-Aktivator
läßt sich durchführen, indem man die durch den Gewebe-Plasminogen-
Aktivator katalysierte Umwandlung von Plasminogen
zu Plasmin ermittelt. Plasmin ist ein Enzym, für das chromogene
Substrattests zur Verfügung stehen. Diese Tests beruhen
auf der proteolytischen Spaltung eines Tripeptids von
einer chromophoren Gruppe. Die Spaltungsgeschwindigkeit ist
direkt proportional zur Spezifität und zur Konzentration der
zu untersuchenden Protease. Die Grundlage für diesen Test
ist die Bestimmung der Menge an Plasmin, die nach Inkubation
der den Gewebe-Plasminogen-Aktivator enthaltenden Lösung
mit einer Plasminogenlösung entsteht. Je größer die Aktivatormenge
ist, desto größer ist die Menge an gebildetem
Plasmin. Plasmin wird auf Grund der Spaltung des chromogenen
Substrats S2251 gemessen.
b) Verfahren
Ein Aliquotenanteil der Probe wird mit 0,10 ml 0,7 mg/ml Plasminogen
(in 0,05 M Tris-HCl, pH-Wert 7,4 mit einem Gehalt
an 0,012 M NaCl) vermischt. Das Volumen wird auf 0,15 ml eingestellt.
Das Gemisch wird 10 Minuten bei 37°C inkubiert und
mit 0,35 ml S2251 (1,0 millimolare Lösung im vorgenannten
Puffer) versetzt. Die Umsetzung wird 30 Minuten bei 37°C
fortgesetzt. Zur Beendigung der Reaktion werden 25 µl Eisessig
zugesetzt. Die Proben werden zentrifugiert. Die Absorbtion
bei 405 nm wird gemessen. Die quantitative Bestimmung
der Aktivität erfolgt mittels eines Vergleichs mit einer
Urokinase-Eichlösung. Die Testbedingungen zum Nachweis
des Gewebe-Plasminogen-Aktivators der vollen Länge werden
durch Zugabe von 0,2 mg Fibrinogen zur Lösung modifziert.
Fibrinogen bewirkt eine Stimulierung der Aktivität des Gewebe-
Plasminogen-Aktivators, wodurch sich eine etwas erhöhte
Aktivität ergibt. Die Aktivität wird in Plough-units festgehalten,
wobei 90 000 Plough-units der Aktivität von 1 mg
gereinigtem Gewebe-Plasimogen-Aktivator entsprechen.
2. Indirekter Test der Plasminbildung
a) Theorie
Es wurde ein empfindlicher Test auf die Aktivität an Gewebe-
Plasminogen-Aktivator entwickelt (87). Der Test beruht auf der Bestimmung
der Plasminbildung durch Messung des Grads der Verdauung
von Fibrin durch Plasmin in einer Agarplatte mit einem
Gehalt an Fibrin und Plasminogen. Plasmin bildet eine klare
Lysiszone in der Fibrinplatte. Die Fläche dieser Lysiszone
korreliert mit der Menge an Gewebe-Plasminogen-Aktivator in
der Probe.
b) Verfahren
Gemäß dem Verfahren von Granelli-Piperno und Reich (87)
werden die Platten 3,5 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Lysiszonen
werden gemessen. Eine quantitative Bestimmung ergibt
sich durch Vergleich mit einer Urokinase-Eichlösung.
E. 1. L Nachweis der Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Aktivität
1. Bakterielles Wachstum und Probenvorbereitung
Eine Kolonie von E. coli mit einem Gehalt an dem Plasmid
(p Δ RIPA°) wurde in ein Teströhrchen mit einem Gehalt an
5 ml LB-Wachstumsmedium mit einem Gehalt an 20 µg/ml Ampicillin
überimpft. Die Zellen wurden über Nacht bei 37°C gezüchtet.
Eine Aliquotmenge dieser Kultur wurde 1 : 100 in
300 ml M-9-Medium mit einem Gehalt an 20 µg/ml Ampicillin
verdünnt. Die Zellen wurden 4 Stunden bei 37°C in einem
Schüttelkolben gezüchtet, wobei sich eine Absorption bei
550 nm von 0,419 ergab. Die tryptophananaloge Indolacrylsäure
wurde in einer Konzentration von 30 µg/ml zugesetzt.
Die Zellen wurden 90 Minuten inkubiert, wobei sich eine Absorption
bei 550 nm von 0,628 ergab. Die Zellen wurden durch
Zentrifugation geerntet und in 0,8 ml 0,01 M Tris vom pH-
Wert 8,0 mit einem Gehalt an 0,01 M EDTA resuspendiert. Die
erhaltene Suspension wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur
rasch gerührt. Die Probe wurde zentrifugiert. Der Überstand
wurde auf die Aktivität an Gewebe-Plasminogen-Aktivator getestet.
Bezüglich der Expression von pt-PAtrp12 wird auf die ausführliche
Erläuterung zu Fig. 10 verwiesen.
2. Aktivitätsnachweis
Die Tabellen I und II zeigen die Ergebnisse der Aktivierung
von Plasminogen durch entsprechende E. coli-Extrakte. Es
bildet sich eine Aktivität, die von der Anwesenheit von Plasminogen
abhängig ist (Tabelle I). Diese Aktivität wird nicht
durch Präimmunserum von Kaninchen beeinflußt, wird aber
durch Antiserum, das gegen aus gereinigten Melanomzellen
abgeleiteten Gewebe-Plasminogen-Aktivator hergestellt wurde
(88), deutlich gehemmt (Tabellen I und II). Dies zeigt, daß
E. coli-Extrakte eine Plasminogen aktivierende Aktivität
erzeugen, die durch Antikörper gegen den Gewebe-Plasminogen-
Aktivator gehemmt wird.
Fig. 7 zeigt das Ergebnis eines Fibrinplattentests auf fibrinolytische
Aktivität. Eine Standardmenge an Urokinase
wurde in die Mittelreihe in Konzentrationen (von links nach
rechts) von 0,24, 0,14, 0,10, 0,05 und 0,02 Plough-units gegeben.
Die untere Reihe enthält Proben von natürlichen Gewebe-
Plasminogen-Aktivator mit der gleichen Enzymmenge in jeder
Vertiefung. Die Vertiefungen enthalten (von links nach
rechts) Gewebe-Plasminogen-Aktivator, anti-Plasiminogen-Aktivator
plus Präimmunserum und Gewebe-Plasminogen-Aktivator
plus Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Antikörper. Die Vertiefungen
in der oberen Reihe enthalten jeweils 8 µl der rekombinanten
Gewebe-Plasminogen-Aktivator E. coli-Extrakte. Die
erste Vertiefung enthält den Extrakt allein, in der zweiten
Vertiefung ist Präimmunserum zugesetzt und in der dritten
Vertiefung sind Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Antikörper zugesetzt.
Es ist offensichtlich, daß das Präimmunserum natürlichen
oder rekombinanten Gewebe-Plasminogen-Aktivator
nicht beeinflußt und daß Gewebe-Plasminogen-Aktivator-
Antikörper die Aktivität von natürlichen und von E. coli-
Extrakten hemmen. Bezogen auf die Urokinase-Standards
enthalten die Extrakte geringfügig weniger als 2,5 Plough-
units pro ml. Dies braucht den Vergleich mit dem in Tabelle
I erhaltenen Wert von 1,3 Plough-units pro ml nicht scheuen.
In den Tabelle I und II sind die Ergebnisse der in E. 1. K.
1. b. durchgeführten Tests zusammengestellt.
Plasminogenaktivierung durch E. coli-Extrakten von Kulturen
mit einem Gehalt an p
Δ R1PA
Plasminogenaktivierung durch E. coli-Extrakte von Kulturen
von pt-PAtrp12
Fig. 10 gibt die Ergebnisse eines Fibrinplattentests wieder,
der mit Extrakten aus 10 Liter Fermentationskulturen von
E. coli mit einem Gehalt an Gewebe-Plasminogen-Aktivator
exprimierendem Plasmid durchgeführt wurde. Die fibrinolytische
Aktivität des Gewebe-Plasminogen-Aktivators mit einem
Gehalt an dem Extrakt ist in Fig. 10 durch die Vertiefung A
wiedergegeben. Diese fibrinolytische Aktivität wird durch
anti-t-PA-IgG (Vertiefung C), aber nicht durch Präimmun-IgG
(Vertiefung B) oder durch anti-Urokinase-IgG (Vertiefung D)
gehemmt. Keine Aktivität ergibt sich bei einem Extrakt, der
aus Zellen hergestellt ist, die als Kontrolle das Leukocyteninterferonplasmid
pLeIFAtrp103 enthalten (Vertiefung H).
E. 2 Herstellung von t-PA unter Verwendung von DHFR-Protein
mit geringer Bindungsaffinität für MTX
E. 2. A Vektoraufbau
Die Humangewebe-Plasminogen-Aktivator (t-PA) kodierende Sequenz
wird in ein Expressionsplasmit mit einem Gehalt an
mutanter DHFR mit geringer Bindungsaktivität für MTX (beschrieben
in der US-Anmeldung 459 151 vom 19. Januar 1983)
gemäß folgendem Verfahren (vgl. Fig. 11) eingesetzt:
Drei Fragmente von überlappenden t-PA-Plasmiden, nämlich
pPA25E10, pPA17 und p Δ RIPA° (vgl. oben) wurden folgendermaßen
hergestellt: Plasmid pPA17 wurde mit Dde I verdaut,
unter Verwendung von Klenow DNA-Polymerase I gefüllt und mit
PstI geschnitten. Das auf diese Weise gebildete Fragment mit
etwa 200 bp mit einem Gehalt an der 5′-terminalen t-PA-Sequenz
wurde isoliert. Das zweite t-PA-Fragment wurde durch
Verdauen von p Δ RIPA° mit PstI und NarI und Isolieren des
Fragments mit etwa 310 bp erhalten. Das dritte t-PA-Fragment wurde
durch Verdauen von pPA25E10 nit NarI und BglII und Isolieren
des etwa 1645 bp aufweisenden Fragments, das zusätzlich zu
einem Großteil des t-PA-kodierenden Bereichs einige 3′-
nicht-translatierte Sequenzen enthält, erhalten.
Das Plasmid pE342, das HBV-Oberflächenantigen exprimiert
(auch bezeichnet als pHBs348-E) ist in der US-Patentanmeldung
3 26 980 vom 03. Dezember 1981 beschrieben. Kurz zusammengefaßt,
wurde die Startstelle des Simian-Virus SV 40
durch Verdauen von SV 40-DNA mit HindIII und Umwandeln der
HindIII-Enden zu Eco RI-Enden durch Zugabe eines Konverters
(AGCTGAATTC) isoliert. Diese DNA wurde mit PvuII geschnitten
und mit RI-Linkern versetzt. Durch anschließende Verdauung
mit Eco RI wurde das 348 bp-Fragment, das die Startstelle
umspannt, durch Elektrophorese an Polyacrylamidgel und Elektroelution
isoliert und in pBR322 geklont. Das Expressionsplasmid
pHBs348-E wurde durch Klonen des 1986 bp-Fragments,
das durch Eco RI- und BgIII-Verdauung von HBV (Animal Virus
Genetics, (Ch. 5) Acad. Press, N. Y., 1980) (das das HBsAg
kodierende Gen umspannt) erhalten worden ist, in das Plasmid
pML (Lusky et al., Nature, Bd. 293 (1981), S. 79) an
den Eco RI- und BamHI-Stellen aufgebaut. (pML ist ein Derivat
von pBR322, das eine Deletion unter Weglassen von Sequenzen,
die eine Hemmung der Plasmidreplikation in Affenzellen
bewirken, aufweist). Das erhaltene Plasmid (pRI-Bgl)
wurde dann mit Eco RI linearisiert, und das 348 bp-Fragment,
das den SV 40-Startbereich repräsentiert, wurde in die Eco
RI-Stelle von pRI-Bgl eingeführt. Das Startstellenfragment
kann in beliebiger Orientierung eingesetzt werden. Da dieses
Fragment sowohl die frühen als auch die späten SV 40-Promotoren
zusätzlich zur Replikationsstartstelle kodiert, konnten
HBV-Gene unter der Kontrolle beider Promotoren je nach
dieser Orientierung (pHBS348-E repräsentiert HBs, das unter
der Kontrolle des frühen Promotors exprimiert ist) exprimiert
werden. pE342 ist durch teilweise Verdauung mit Eco
RI, Füllen der Spaltungsstelle unter Verwendung von Klenow-
DNA-Polymerase I und Rückligation des Plasmids modifiziert,
wodurch die Eco RI-Stelle, die der SV 40-Ursprungsstelle
in pE342 vorausgeht, entfernt wird. Das erhaltene Plasmid,
als pE342 Δ RI bezeichnet, wird mit Eco RI verdaut, unter Verwendung
von Klenow-DNA-Polymerase I gefüllt und mit Bam HI
geschnitten. Nach Elektrophorese an Acrylamidgel wird das
Fragment mit etwa 3500 bp auf die vorstehend erläuterte Weise
der Elektroelution unterworfen, mit Phenol/Chloroform
extrahiert und mit Äthanol gefällt.
Der auf diese Weise hergestellte p342E-3500-bp-Vektor und
die vorstehend beschriebenen t-PA-Fragmente mit etwa 2160
bp werden unter Anwendung von üblichen Techniken miteinander
ligiert. Ein Plasmid mit einem Gehalt an den drei t-PA
kodierenden Fragmenten in richtiger Orientierung wurde isoliert,
charakterisiert und als pE342-t-PA bezeichnet. Dieses
Plasmid wurde mit Sac II verdaut und mit bakterieller alkalischer
Phosphatase (BRL) behandelt. Zur Erzeugung der
DHFR-Sequenz (zusammen mit Kontrollsequenzen für dessen Expression)
wurde ein Fragment mit etwa 1700 bp durch SacII-
Verdauung von pEHER erzeugt. (pEHER ist ein Plasmid, das
mutante DHFR exprimiert; vgl EP-A 117 060
a.a.O.). Dieses Fragment wurde in das pE342-t-PA-Plasmid
unter Bildung von pETPAER400, einem Plasmid, das analog zu
pEHER ist, mit der Ausnahme, daß der HBsAg kodierende Bereich
durch die cDNA-Sequenzen aus t-PA ersetzt ist, ligiert.
E. 2. B Expression und Amp 19048 00070 552 001000280000000200012000285911893700040 0002003316297 00004 18929lifikation der t-PA-Sequenz
pETPAER400 (pETPER) wurde gemäß dem Verfahren von Graham
und Van der Eb (vgl. oben) sowohl in dhfr- CHO-DUX B11-Zellen
als auch in DHFR⁺ CHO-K1 (ATCC CCL61) transfiziert.
Transformierte dhfr--Zellen wurden durch Züchtung in einem
Medium mit einem Mangel an Glycin, Hypoxanthin und Thymidin
ausgewählt. Transformierte DHFR⁺-Zellen wurde durch Züchtung
in 100 nanomolar MTX ausgewählt. Kolonien, die im entsprechenden
Selektionsmedium entstanden, wurden unter Verwendung
von Klonierungsringen isoliert und im gleichen Medium
auf mehrere Generationen vermehrt.
Zur Amplifikation wurden die Zellen aus den Kolonien in Medien
mit einem Gehalt an 5×10⁴, 10⁵, 2,5×10⁵, 5×10⁵
und 10⁶ nanomolar MTX aufgeteilt und mehrmals passagiert.
Die Zellen wurden in sehr niedrigen Zelldichten (10²-10³
Zellen/Platte) in 10-cm-Schalten ausgestrichen. Die erhaltenen
Kolonien wurden isoliert.
E. 2. C Testmethoden
Die Expression von t-PA in den transfizierten, amplifizierten
Kolonien kann zweckmäßigerweise nach ähnlichen Verfahren
bestimmt werden, wie sie vorstehend unter D.1.K.1.b angegeben
sind.
Die Koamplifikation von DHFR- und t-PA-Sequenzen wird durch
Isolierung von DNA aus konfluenten Monolayers von amplifizierten
Kolonien folgendermaßen bestimmt: Konfluente Monolayers
in 150 mm Platten werden mit 50 ml steriler PBS gewaschen
und durch Zugabe von 5 ml 0,1 Prozent SDS, 0,4 M
CaCl₂, 0,1 M EDTA, pH-Wert 8 lysiert. Nach 5 bis 10 Minuten
wird das Gemisch entfernt, mit Phenol und Chloroform extrahiert
und mit Äthanol gefällt. Die DNA wird in 1 ml (pro
150-mm-Platte) 10 millimolar Tris-HCl, pH-Wert 8,1 millimolar
EDTA resuspendiert. 0,1 mg/ml RNase werden zugesetzt
und die Lösung wird 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Sodann
wird 0,1 Prozent SDS und 0,5 mg/ml Pronase zugegeben.
Nach 3- bis 16stündiger Inkubation bei 37°C wird
die Lösung wieder mit Phenol und Chloroform extrahiert und
mit Äthanol gefällt. Das DNA-Pellet wird in 0,5 ml Wasser
resuspendiert und mit Restriktionsenzymen verdaut. Etwa 5
bis 10 µg der verdauten DNA werden der Elektrophorese in
einem Agarosegel (1 Prozent Agarose in Tris-Acetat-Puffer,
40 millimolar Tris, 1 millimolar EDTA, mit Essigsäure auf
den pH-Wert 8,2 eingestellt) unterworfen; vgl. Crouse et
al., J. Biol. Chem., Bd. 257 (1982), S. 7887. Nachdem Bromphenolblau-
Farbstoff im Gel ²/₃ der Strecke nach unten gewandert
ist, wird das Gel entfernt und mit Ethidiumbromid
gefärbt. Nach Sichtbarmachen der DNA mit UV-Licht wird die
DNA gemäß dem Verfahren von Southern, J. Mol. Biol., Bd. 98
(1975), S. 503, auf Nitrocellulosefilter übertragen. Die
Filter werden sodann mit einem der Nick-Translation unterworfenen
Tracer, der aus dem 1700-bp-Sac-II-Fragment von
pEHER (hergestellt und hybridisiert auf die vorstehend beschriebene
Weise) oder aus dem etwa 1970 bp umfassenden
BglII-Fragment von pETPER hergestellt worden ist, unterzogen.
E. 3 Herstellung von t-PA in Konjunktion mit Wildtyp-DHFR-
Protein
E. 3. A Vektoraufbau
Auf analoge Weise wie beim Aufbau von pETPER wird ein Plasmid
mit einem Gehalt an der DNA-Sequenz, die Wildtyp-DHFR
kodiert, nämlich pETPER, aufgebaut. Der Aufbau erfolgt gemäß
Beispie C.1.A mit der Ausnahme, daß an Stelle des
Plasmids pEHER als Quelle für die DHFR-Protein-Gensequenz
das Plasmid pE342.HBV.E400.D22
verwendet wurde. Das
Plasmid pE342.HBV.E400. D22 ist das gleiche wie pEHER, mit
Ausnahme eines Unterschieds bezüglich eines einzigen Basenpaars
zwischen Wildtyp- und Mutanten-DHFR. Somit ist das
erhaltene Plasmid pETPFR in jeder Weise zu pETPER analog,
mit der Ausnahme, daß die für Wildtyp-DHFR kodierende DNA-
Sequenz durch die Sequenz der Mutante ersetzt ist.
E. 3. B Expression der t-PA-Sequenz
pETPFR wurde zur Transfektion von CHO-Zellen mit DHFR-Mangel
(Urlaub und Chasin, a.a.O.) unter Verwendung des Calciumphosphat-
Fällungsverfahrens gemäß Graham und Van der Eb
verwendet. 21 Kolonien, die auf dem selektiven Medium (-HGT)
entstanden, wurden durch Nachweis der Plasminbildung bestimmt.
Dieser Nachweis erfolgte auf Grund der Verdauung von
Fibrin in einer Agarplatte mit einem Gehalt an Fibrin und
Plasminogen gemäß Granelli-Piperno et al., J. Exp. Med.,
Bd. 148 (1978), S. 223.
Vier der besten positiven Klone wurden dann quantitativ auf
Plasminbildung pro Zelle gemäß dem in D.2.C erläuterten
Verfahren getestet.
Auf Grund dieser quantitativen Bestimmung wurde festgestellt,
daß die vier untersuchten Klone bei der Bestimmung von
units/Zelle/Tag die gleiche oder eine vergleichbare Sekretion
von t-PA in das Medium aufwiesen. Subklone wurden hergestellt,
indem Inocula aus zwei der Klone in getrennte
Platten mit einem Gehalt an -HGT-Medium übertragen wurden.
Zwei der erhaltenen Subklone, 18B und 1, wurden für die
weitere Analyse herangezogen.
E. 3. C Amplifikation und Grad der t-PA-Bildung
Die vorerwähnten Subklone wurden in einer Menge von 2×10⁵
Zellen pro 100-mm-Platten in 50 nanomolar MTX ausgestrichen,
um die Amplifikation zu fördern. Die überlebenden Zellen
ergaben bei der vorstehend beschriebenen Bestimmung in sämtlichen
Fällen im Vergleich zur unverstärkten Menge an Gewebe-
Plasminogen-Aktivator-Aktivität die 10fache Aktivität.
Zwei dieser Klone wurde für die weitere Untersuchung ausgewählt
und als 1-15 und 18B-9 bezeichnet.
Der Subklon 1-15 wurde weiter durch Überimpfen von 2×10⁵
Zellen in 100-mm-Platten mit einem Gehalt an 500 nanomolar
MTX verstärkt. Die Bestimmung der auf diese Weise amplifizierten
Zellen ergab einen weiteren Anstieg (etwa um das
3fache) in bezug auf die t-PA-Bildung. Bei quantitativer
Bestimmung gemäß dem Verfahren von C.1. C ergaben sich Mengen
im Bereich von 7×10-4 units/Zelle/Tag. Ein Teil dieser
amplifizierten Zellen wurde sodann übertragen und in Gegenwart
von 10 000 nanomolar MTX erhalten. Subklone von 1-15
und 18B-9 wurden, nachdem sie etwa 1 bis 2 Monate unter den
in Tabelle 3 angegebenen Bedingungen gehalten worden waren,
weiter getestet.
Es handelte sich um folgende Zellinien: Zellinie "1" ist
ein nicht-amplifizierter Klon aus dem ursprünglichen Satz
von vier Klonen. "1-15₅₀₀" ist ein amplifizierter Subklon
der Zellinie "1", die zunächst in 50 nanomolar MTX unter
Bildung von 1-15 amplifiziert und sodann zur weiteren Amplifikation
in 500nanomalor MTX übertragen worden ist.
1-15₁₀₀₀₀ ist ein Subklon von 1-15₅₀₀, der weiter in Gegenwart
von 10 000 nanomolar MTX amplifiziert worden ist. Die
Zellinie 18B-9 ist ein Subklon von einem der ursprünglichen
vier nachgewiesenen Klone, der mit 50 nanomolar MTX amplifiziert
worden ist.
Sämtliche amplifizierten Zellen zeigen eine erhöhte t-PA-
Bildung im Vergleich zur nicht-amplifizierten Zellkultur.
Auch die nicht-amplifizierte Kultur bildet t-PA-Mengen von
mehr als 0,5 pg/Zelle/Tag. Durch Amplifikation nähert man
sich der Menge von 50 pg/Zelle/Tag.
F. Arzneimittel
Die Verbindungen der Erfindung können nach an sich bekannten
Verfahren zu Arzneimitteln formuliert werden, wobei das erfindungsgemäße
Humangewebe-Plasminogen-Aktivator-Produkt
mit einem pharmakologisch verträglichen Träger vermischt
wird. Entsprechende Träger und deren Herstellung, unter Einschluß
von anderen Humanproteinen, wie Humanserumalbumin,
sind zum Beispiel in Remington's Pharmaceutical Sciences,
E. W. Martin, erläutert. Diese Arzneimittel enthalten eine
wirksame Menge des erfindungsgemäßen Proteins zusammen mit
einer entsprechenden Trägerstoffmenge, so daß pharmakologisch
verträglich Arzneimittel, die sich zur wirksamen Verabreichung
an einen Wirt eignen, gebildet werden.
Beispielsweise kann der erfindungsgemäße Humangewebe-Plasminogen-
Aktivator parenteral an Patienten, die an kardiovaskulären
Krankheiten oder Zuständen leiden, verabreicht
werden. Die Dosierung bei Patienten mit Pulmonarembolie kann
entsprechend der gegenwärtigen Praxis bei klinischen Untersuchungen
von anderen kardiovaskulären, thrombolytischen
Mitteln erfolgen, zum Beispiel durch eine intravenöse Anfangsdosis
von etwa 440 IU/kg Körpergewicht, gefolgt von
einer 12stündigen, kontinuierlichen, intravenösen Infusion
von etwa 440 IU/kg/Stunde.
Ein Beispiel für eine entsprechende Dosierungsform für im
wesentlichen homogenen Humangewebe-Plasminogen-Aktivator
zur parenteralen Verabreichung sind Fläschchen mit einem
Gehalt an 25 000 IU Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Aktivität,
25 mg Mannit und 45 mg NaCl, die für die intravenöse Verabreichung
mit 5 ml sterilem Wasser für Injektionszwecke rekonstituiert
und mit einem entsprechenden Volumen an 0,9
prozentiger Natriumchloridlösung oder 5prozentiger Dextroselösung
für Injektionszwecke vermischt werden können.
G. Ausführliche Beschreibung von rekombinanter human-t-PA
Die Struktur des gemäß den Beispielen hergestellten Human-
t-PA wurde näher untersucht, und zwar sowohl durch Aufklärung
der Genkodierungssequenz und durch biochemische Proteinuntersuchungstechniken.
Gegenwärtig nimmt man die in
Fig. 12 dargestellte Proteinstruktur an.
Durch Collen et al. (88) wurde auch nachgewiesen, daß zweikettiger
human t-PA durch proteolytische Spaltung des einkettigen
Moleküls in zwei durch Disulfidbindung verbundene
Polypeptide erfolgt. Die gegenwärtigen Befunde erlauben den
Schluß, daß die schwere Kette (Molekulargewicht 30 882)
sich vom NH₂-terminalen Teil ableitet und die leichte Kette
(Molekulagewicht 28 126) den COOH-terminalen Bereich umfaßt.
Die N-terminale Sequenzierung des zweikettigen Moleküls
legt den Schluß nahe, daß die zweikettige Form durch
Spaltung einer einzigen Arginyl-Isoleucin-Bindung entsteht
(Fig. 12, Pfeil).
Die primäre Struktur eines Teils des Bereichs der schweren
Kette von human t-PA (Fig. 12) zeigt ein hohes Ausmaß an
Sequenzhomologie mit den "kringle"-Bereichen von Plasminogen
(89) und Prothrombin (40, 41). Der "kringle"-Bereich
bezieht sich auf eine charakteristische, dreifache Disulfidstruktur
im "pro"-Fragment von Prothrombin, was zunächst von
Magnusson et al. (91, 92) näher beschrieben wurde. In der
Primärsequenz von t-PA sind zwei sogenannte "kringel"-Bereiche
von jeweils 82 Aminosäuren erkennbar, die ein hohes Ausmaß
an Homologie mit den 5 "kringle"-Bereichen von Plasminogen
zeigen. Die restlichen N-terminalen 91 Aminosäuren
zeigen wenig Homologie mit dem üblichen "kringle"-Bereich.
Es läßt sich jedoch vermuten, daß dieser Bereich ebenfalls
eine Struktur mit einem Gehalt an mehrfachen Disulfidbindungen
annehmen kann, da dort 11 weitere Cysteinreste vorhanden
sind.
Das katalytische Zentrum der leichten Kette von Human-t-PA,
der sogenannte Serinproteasebereich ist wie bei anderen Serinenzymen
vermutlich aus den Resten Histidin₃₂₂, Asparaginsäure₃₇₁
und Serin ₄₇₈ gebildet. Ferner zeigen die diese
Reste umgebenden Aminosäuresequenzen eine starke Homologie
zu entsprechenden Teilen anderer Serinproteasen, wie Trypsin,
Prothrombin und Plasminogen.
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