UA54363C2 - Виділена молекула днк, яка кодує людський еритропоетин (варіанти), біологічно функціональний кільцевий плазмідний або вірусний днк-вектор, штам еукаріотичних клітин-хазяїв (варіанти), спосіб одержання поліпептиду, фармацевтична композиція - Google Patents

Abstract

Описані нові поліпептиди, що мають часткову або повну первинну структурну конформацію і одну або більше з біологічних властивостей еритропоетину ссавців (ЕПО), які відрізняються в переважних формах тим, що є продуктом експрессії послідовності екзогенної ДНК прокаріотного або єукаріотного хазяїна. Послідовності геномної ДНК, кДНК і зконструйованої ДНК, кодуючі частково або цілком послідовність амінокислотних залишків ЕПО або його аналогів, введених в плазмиди, що самореплікуються або вірусні вектори, застосовуються для трансформування або трансфектування придатних кліток прокаріотного або еукаріотного хазяїна, таких як клітки бактерій, дріжджів або хребетних в культурі. При виділеннні з культуральних середовищ, або кліткових лізатів, або фрагментів продукти експресії ДНК-послідовностей проявляють, наприклад, імунологічні властивості і біологичну активність еритропоетину людини і мавпи in vitro і in vivo. Описані хімічно синтезовані поліпептиди, що мають біологічні і імунологічні властивості ЕПО, вдосконалені способи виявлення специфічних одноланцюгових полінуклеотидів в гетерологічному клітковому або вірусному зразку, подержаному, наприклад, з ДНК, яка присутня в плазмиді, або вірус-несучої кДНК, або "бібліотеці" геномної ДНК.

Description

Опис винаходу

Данное является частичньмм продолжением находящихся в процессе одновременного рассмотрения заявок 9 на патент США Мо561024, поданной 13 декабря 1983 года; 582185, поданной 21 февраля 1984 года, и 655841, поданной 28 сентября 1984 года.

Настоящее изобретение относится к манипуляции генетическими материалами и, в частности, к рекомбинантньм методикам, позволяющим получить полипептидьї, обладающие частично или полностью первичной структурной конформацией и/или одним или более из биологических свойств встречающегося в 710 природе зритропозтина.

А. Манипуляция генетическими материалами

Генетические материальь можно в широком смьісле определить как те химические вещества, которье программируют и управляют производством компонентов клеток и вирусов и направляют ответь! клеток и вирусов. Длинноцепочечное полимерное вещество, известное как дезоксирибонуклеийновая кислота (ДНК), 79 содержат генетический материал всех живьх клеток и вирусов, за исключениєм некоторьх вирусов, программируемьїх рибонуклеийновой кислотой (РНК). Структурньми звеньями в ДНК-полимерах являются четьіре различньїх нуклеотида, каждьй из которьїх состоит из пурина (аденин или гуанин) или из пиримидина (тимин или цитозин), связанньїх с дезоксирибозо-сахаром, к которому присоединена фосфатная группа.

Присоединение нуклеотидов в форме линейного полимера происходит путем слияния 5'-фосфата одного нуклеотида с 3-гидроксильной группой другого нуклеотида. Функциональная ДНК встречаєтся в форме устойчивьїх двунитевьїх сообществ одиночньїх нитей нуклеотидов (известньїх как дезоксиолигонуклеотидьї), чьи сообщества образуются путем водородной связи между пуриновьіми и пиримидиновьми основаниями (|т.е. "комплементарнье" сообщества, существующие или между аденином (А) и тимином (Т), или между гуанином (0) и цитозином (С)). По конвенции принято нуклеотидь! назьівать по названиям составляющих их пуриновьїх или с пиримидиновьїх оснований, а комплементарнье сообщества нуклеотидов в двунитевой ДНК (те. А-Т и 5-С). (3 назьшвать как "парьі оснований". Рибонуклеиновая кислота представляет собой полинуклеотид, содержащий аденин, гуанин, цитозин и урацил (/)), скорее, чем тимин, связанньй с рибозой и фосфатной группой.

Короче говоря, программирующая функция ДНК осуществляется главньім образом посредством процесса, в котором специфические последовательности нуклеотидов ДНК (геньї) "транскрибируются" в относительно о неустойчивье полимерьї информационной РНК (мРНК). В свою очередь, мРНК служит в качестве матриць для Ге) образования структурньїх, регуляторньїх и каталитических белков из аминокислот. Зтот процесс "трансляции"

МРНК включаєет функционирование мелких нитей РНК (тРНК), которье транспортируют и вьравнивают о индивидуальнье аминокислотьї вдоль нитей мРНК, разрешая образование нуклеотидов в надлежащих «І последовательностях аминокислот. "Информация" мРНК, исходящая от ДНК и создающая основание для 325 подачи тРНК и ориентации любой из двадцати аминокислот для "зкспрессии" полилептида, находится в форме о триплетньїх "кодонов" - последовательньїх группирований трех нуклеотидньїх оснований. В известном смьсле, образование белка является окончательной формой "зкспрессии" программированной генетической информации, обеспечиваемой нуклеотидной последовательностью гена. « "Промоторнье" последовательности ДНК обьчно "предшествуют гену в ДНК-полимере и обеспечивают З 50 участок для инициирования транскрипции в РНК. "Регуляторнье" последовательности ДНК обьічно также с "расположеньі вьіше по течению" (те. предшествуют) гена в данном ДНК-полимере, связьвая белки, з» определяющие частоту (или скорость) транскрипционального инициирования. Совместно назьмваемье как "промоторная/регуляторная" или "управляющая" последовательность ДНК, зто такие последовательности, которье предшествуют отобранному гену (или ряду генов) в функциональном ДНК-полимере, способствуют определению того, произойдет ли транскрипция и, в конце концов, зкспрессия гена. Последовательности ДНК, і-й которье "сопровождают" ген в ДНК-полимере и обеспечивают подачу сигнала для окончания транскрипции в «» МРНК, назьіваются как "терминаторнье" последовательности транскрибирования.

В фокусе микробиологической технологии последнего десятилетия находится попьітка индустриального о производства и фармацевтически важньх веществ с использованием микроорганизмов, которье или б 20 первоначально не имеют генетически кодированной информации, относящейся к желаємому продукту, включенному в их ДНК, или (в случае с клетками млекопитающих в культуре) не вьіражают обьічньім путем с» хромосомньй ген на заметном уровне. Проще говоря, ген, устанавливающий структуру желаемого полипептидного продукта, или вьіделяют от "донорного" микроорганизма, или химически синтезируют и затем устойчиво интродуцируют в другой микроорганизм, предпочтительно, самореплицирующийся одноклеточньй 25 микроорганизм, такой как бактерии, дрожжи или клетки млекопитающих в культуре. Существующеє машинноє

ГФ) оборудование для зкспрессии сгенов в "трансформированньїх или "трансфектированньіїх" микробньх клетках-хозяевах работает для создания желаемого продукта с использованием зкзогенной ДНК в качестве о матриць для транскрипции мРНК, которая затем транслируєется в непрерьшвную последовательность аминокислотньїх остатков. 60 Данная область техники представлена широко в патентньїх и литературньїх публикациях, относящихся к методологиям "рекомбинантной РНК" для вьіделения, синтеза, очистки и амплификации генетических материалов, используемьїх при трансформации отобранньїх микроорганизмов хозяина. Патент США Мо4237224, вьіданном Сопеп, еї аіІ., например, относится к трансформации одноклеточньїх микроорганизмов хозяина с "гибридной" вирусной или кольцевой плазмидной ДНК, включающей оотобраннье последовательности бо зкзогенной ДНК. Методики патента Сопеп, еї аі. впервье включают получение вектора трансформации посредством ферментативно отщепляющейся вирусной или кольцевой плазмидной ДНК для образования нитей линейной ДНК. Отобраннье инородньсе ("зкзогенньюе" или "гетерологические") нити ДНК, обьічно включающие последовательности, кодирующие желательньй продукт, получают в линейной форме путем использования

СХОДНЬх ферментов. Линейную вирусную или плазмидную ДНК инкубируют с инородной ДНК в присутствий сшивающих ферментов, способньїх осуществлять процесс восстановления, а "гибриднье" векторь! образуются содержащими отобранньй сегмент зкзогенной ДНК, "сплетенньій" в плазмиду вирусной или кольцевой ДНК.

Трансформация совместимьх одноклеточньх микроорганизмов хозяина с огибридньм вектором заканчивается образованием многократньїх копий зкзогенной ДНК в популяции клеток-хозяев. В некоторьх 7/0 спучаях желаемьм результатом является просто амплификация инородной ДНК, и собранньй, вніращенньй в культуре "продукт" представляет собой ДНК. Более часто целью трансформации является зкспрессия, осуществляемая при помощи клеток-хозяев зкзогенной ДНК в форме крупномасштабного синтеза вьіделяемьсх количеств промьішленно важньїх фрагментов белка или полипептида, кодируемьхх инородной ДНК. См. также, например, патентьї США МоМо4264731 (вьіданньйй Зпіпе), 4273875 (вьіданньій Мапіз), 4293652 (вьіданньій Сопеп) у5Б М Европейскую патентную заявку Мо093619, опубликованную 9 ноября 1983 года.

Развитие специфических последовательностей ДНК для сплетения в векторьї ДНК достигаєтся путем применения целого ряда технических приемов, зависящих в значительной мере от степени "инородности" "донора" по отношению к проектируемому хозяину, а также от размера полипептида, виіражаемого в хозяине.

Опасаясь чрезмерного упрощения, можно утверждать, что существуют три основньїх альтернативньх способа:

М) "вьіделение" двунитевой ДНК-последовательности от геномной ДНК донора; (2) химическое получение

ДНК-последовательности, создающей код для представляющего интерес полипептида и (3) синтез іп мйго двунитевой ДНК-последовательности посредством ферментативной "обратной транскрипции" мРНК, вьіделенной из донорских клеток. Указаннье вьше способь, которье включают образование

ДНК-комплемента" мРНК, обьічно назьівают как "к«ДНК" способь. сч

Получение последовательностей ДНК часто является методом вьібора, когда известна полная последовательность аминокислотньїх остатков желаемого полипептида. Методики получения ДНК, описанньсе в і) одновременно рассматриваемой заявке на патент США Мо483451, АГоп, еї а!. (поданной 15 апреля 1983 года, и соответствующей заявке РСТ 0583/00605, опубликованной 24 ноября 1983 года под номером У/083/04053), например, создают средства для достижения таких чрезвьічайно желаемьїх результатов, как: предусмотрение со зо наличия чередующихся кодонов, часто встречающихся в микроорганизме хозяина, отобранном для зкспрессий (например, предусмотрение "предпочтительньїх" кодонов дрожжей или Е, сої); избежание присутствия ісе) нетранслированньїх "бинтронньїх" последовательностей (обьчно онаходящихся в геномньх со

ДНК-последовательностях млекопитающих и их мРНК-матрицах), которне не без труда обрабатьваются прокариотическими клетками-хозяевами; избежание нежелательньїх "ведущих полипептидньх - последовательностей, обьічно кодируемьх геномньми ДНК и кДНК-последовательностями, однако, часто не ю легко отщепляемьх от представляющего интерес полипептида при помощи бактериальньїх или дрожжевьх клеток-хозяев; предусмотрение легкой вставки ДНК в подходящие зкспрессивнье векторь! в сообществах с желаемьми промоторньіми/регуляторньми и терминаторньми последовательностями; и предусмотрение легкого построения генов, кодирующих полипептиднье фрагменть и аналоги желательньїх полипептидов. «

Когда полная последовательность аминокислотньх остатков желаемого полипептида не известна, в с непосредственное получение последовательностей ДНК невозможно и вьіделение последовательностей ДНК, кодирующих полипептидьії при помощи кДНК-способа, становится методом отбора, несмотря на возможнье ;» недостатки в легкости сборки векторов зкспрессии, способньх обеспечить вьсокие уровни микробной зкспрессивности, указанной вьше. Среди стандартньїх методик для вьіделения кДНК-последовательностей находится получение плазмидонесущих КДНК-"библиотек", происходящих от обратной транскрипции мРНК, с часто встречающейся в донорских клетках, отобранньїх в качестве ответственньїх за зкспрессию генов вьІсокого уровня (например, библиотеки кКДНК, происходящие от гипофизарньїх клеток, которье виіражают относительно о большие количества продуктов гормонов роста). Где известньь значительнье части аминокислотной оо последовательности полипептидов, там меченье, зондовье последовательности ооднонитевой ДНК, дуплицирующей последовательность, предположительно находящуюся в "плановой" кДНК, можно использовать

Ме, в методиках ДНК/ДНК-гибридизации, проводимьїх на клональньїх копиях кКДНК, которая бьіла денатурирована в сю однонитевую форму. |(См., главньім образом, раскрьітие и обсуждения данной области техники, представленнье в патенте США 4394443, вьіданном на имя У/еіззетанп, еї аі. и последние показьї использования длинньїх зондов олигонуклеотидной гибридизации, сообщеннье в работах УУаїЇасе, еї аіЇ., Мис. Асідз Кезв., 6, рр. 3543 - 3557 дв (1979), Кеуев, еї аї., Р.М.А.5. (0,5.А.), 79, рр. 3270 - 3274 (1982) и Уауе, еї аі., Мис. Асійз Кев., 11, рр. 2325 - 2335 (1983). См. таюке патент США Мо4358535, вьіданньій на имя РаїКому, еї аЇ., касающийся методик

Ф) ДНК/ДНК-гибридизации при проведений диагностики; опубликованнье Европейские патентнье заявки ка Мо0070685 и Мо0070687, относящиеся к светоиспускающим меткам на однонитевьїх полинуклеотидньх зондах; работу БРаміз, ей аі,, "А Мапиа! їог Сепеїйіс Епдіпеегіпу, Адмапсед Васіегіаї Сепеїйісв", Соїй Зргіпд Нагрог бо Гарогаюгу, Со Зргіпд Нагрог, М.У. (1980) аг рр. 55 - 58 апа 174 - 176, касающуюся методик гибридизации колоний и зпидемических заболеваний; и Мем Епдіапа Мисіеаг (Возіоп, Мавзг5в.) брошюрь по "Сепе Зсгееп"

Нубгіаіганйоп Тгапзїег Метбргапе таїйегіаїзх, дающие руководства для переноса и гибридизаций ДНК и РНК,

Каталог МоМЕР-9721.

Среди наийболее значительньїх последних достижений в методиках гибридизации для зкранирования 65 рекомбинантньїх клонов является использование меченьїх смешанньїх олигонуклеотидньїх зондов, каждьй из которьїх потенциально является полньім комплементом специфической последовательности ДНК в вьіборке гибридизации, включающей гетерогенную смесь однонитевьїх ДНК и РНК. Зти методики признаются особенно полезньіми при вніявлений кДНК-клонов, получаемьїх из источников, которье создают крайне малье количества последовательностей мРНК для представляющего интерес полипептида. Короче говоря, использование строгих условий гибридизации, направленньх на избежание неспецифического связьшвания, может позволить, например, авторадиографическую визуализацию специфического клона кКДНК на исходе гибридизации плановой

ДНК тому единственному зонду в смеси, которьій является ее полньім комплементом. См., главньім образом,

УУаМасе, ей аІ. , Мис. Асідз Кев., 9, рр. 879 - 897 (1981); Бцдов, еї аі., Р.М.А.5. (О.5.А. ), 78, рр. 6613 - 6617 (1981); Споо, еї аїЇ.,, Майте, 299, рр. 178 - 180 (1982); Кигаснпі, еї аіІ., Р.М.А.5. (О.5.А. ), 79, рр. /о0 585461 - 6464 (1982); ОпКкиро, еї а. Р.М.А.5. (0.5.А. ), 80, рр. 2196 - 2200 (1983); и Котріїнн, ей а).

Р.М.А.5. (0.5.А.), 80, рр. 3218 - 3222 (1983). Вообще, методики смешанньїх зондов в работе УМаїЇїасе, еї аї. (1981) вьіше, бьіли расширень! различньми разработчиками до момента, когда сообщалось о получений достоверньїх результатов в вьіделений кДНК-клонов с использованием 32--ленного смешанного "пула" олигонуклеотидньїх зондов длиной в 16 оснований (16-тег) равномерно изменяющихся последовательностей

ДНК вместе с одиночньїм 11-тег для вьіполнения двухпозиционного "положительного" подтверждения наличия

КДНК, представляющей интерес. См. работу біпдег-Зат, еї аІ., Р.М.А.5. (0.5.А.), 80, рр. 802 - 806 (1983).

Мспользование изолятов геномной ДНК является найменее распространенньім из трех указанньїх вьіше способов развития специфических последовательностей для использования в рекомбинантньїх методиках. Зто особенно верно в области рекомбинантньїх методик, направленньїх на обеспечение микробной зкспрессивности полипептидов млекопитающих, и обусловлено, главньім образом, сложностью геномной ДНК млекопитающих.

Таким образом, хотя и существуют надежнье методики для развития фаг-несущих библиотек геномной ДНК человека и других видов млекопитающих (|см., например, работу І ам/п, еї а!., СеїЇ, 15, рр. 1157 - 1174 (1978), относящуюся к методикам для генерирования геномной библиотеки человека, обьічно назьваемой как "Библиотека Мапіаїйів"; работу Кат, еї а. Р.М.А.85. (0.5.А.), 77, рр. 5172 - 5176 (1980), касающуюся сч оре геномной библиотеки человека на основе методики альтернативного ограничения зндонуклеазной фрагментации; работу Віайцпег, еї аїЇ., Зсіепсе, 196. рр. 161 - 169 (1977), описьвающую построение бьічьей і) геномной библиотеки), предпринято несколько относительно успешньїх попьток использования методик гибридизации в вьіделений геномной ДНК при отсутствий далеко идущего предвидения аминокислотньїх или

ДНК-последовательностей. В качестве одного примера можно привести работу Ріддевз, еї аї., 9). Мої, апа Арр. с зо Зепейсв, 1, рр. З - 18 (1981), где сообщается об успешном вьіделении гена, кодирующего альфа-субьединицу гипофизарньїх гликопротеийдньіїх гормонов человека из Библиотеки Мапіайз путем использования "предельно ісе) длинного" зонда, включающего полньій фрагмент 621 парь! азотистьїх оснований предварительно вьіделенной (се

КДНК-последовательности для альфа-субьединиць. В качестве другого примера, в работе Раз, ей аї., Р.М. А. 5. (О.5.А. ), 80, рр. 1531 - 1535 (1983) сообщается о вьіделенийи геномньїх клонов человека для НІ А-ОК человека с «

З5 йспользованием синтетического олигонуклеотида со 175 парами оснований. И, наконец, в работе Апаегзоп, еї ю аі,, Р.М.А.5. (0.5.А.), 80, рр. 6838 - 6842 (1983) сообщаєтся о вьіделений геномного клона для бьічьего панкреатического трипсинового ингибитора (ВРТІ) с использованием одиночного зонда, имеющего 86 пар оснований в длину и построенного в соответствии с известной аминокислотной последовательностью ВРТІ.

Авторьі отмечают определение скромньх перспектив для вьіделения мРНК, пригодной для синтеза «

КДНК-библиотеки, ввиду очевидньїх низких уровней мРНК в первоначально нацеленньїх источниках околоушной 7-3) с железьй и тканей легкого. Вьіражая затем надеждь на успех в зондирований геномной библиотеки с использованием смеси меченьїх зондов, они констатируют: "Большей частью, олигодезоксинуклеотиднье зондь! ;» смешанньїх последовательностей применялись для вьделения белковьх генов неизвестной последовательности из библиотек кДНК. Такие зондьй обьчно представляют собой смесь 8 - 32 олигонуклеотидов и имеют длину 14 - 17 нуклеотидов, являясь типичньіми представителями каждой возможной с комбинации кодонов для небольшого растяжения (5 - б остатков) аминокислотной последовательности. В жестких условиях гибридизации, которье ставят в худшее положение зондьі с неправильно спаренньіми о азотистьмми основаниями, зти смеси способнь! локализовьівать специфические последовательности генов в оо клональньїх библиотеках малой сложности. Тем не менее, ввиду их незначительной длиньі и неоднородности, 5р смешаннье зондьі часто лишень специфичности, необходимой для зондирования таких сложньх

Ме. последовательностей, как геном млекопитающих. Зто делает такой способ непрактичньмм для вьіделения 4) белковьїх генов млекопитающих, когда соответственнье мРНК недоступнь!." (Ссьілки опущеньї).

Таким образом, в данной области техники продолжает оставаться необходимость в совершенствований способов вьіполнения бьістрого и зффективного вьіделения кДНК-клонов в тех случаях, когда мало что известно об аминокислотной последовательности и когда "обогащеннье" источники ткани мРНК не очень доступнь,, чтобьі их можно бьіло использовать в построении библиотек кКДНК. Такие усовершенствованнье способь! бьіли (Ф, бьі особенно полезнь, если бьі они применялись для вьіделения геномньїх клонов млекопитающих, где доступна ка неплотная информация относительно аминокислотньхх последовательностей полипептида, кодируемого искомьІМ геном. 60 В. Зритропозтин как представляющий интерес полипептид

Зритропозз, образование красньїх кровяньїх телец, осуществляется непрерьівно на протяжении всей жизни человека для компенсации разрушенньх клеток. Зритропозз представляет собой чрезвьчайно точно регулируемьій физиологический механизм, позволяющий вьірабатьваться в крови достаточному количеству красньїх кровяньїх телец для правильной оксигенации ткани, но не настолько большому, чтобь! клетки 65 Воспрепятствовали кровообращению. Образование красньїх кровяньїх телец пройсходит в костном мозге под контролем гормона, зритропозтина.

Зритропозтин, кислотньій гликопротеид с молекулярньм весом приблизительно 34000 Дальтон, может встречаться в трех формах: со, р и асиало. Формь! о и Д отличаются незначительно в углеводньїх компонентах, однако, имеют одинаковую потенцию, биологическую активность и молекулярньй вес. Форма асиало представляєт собой о, или Д-форму с отщепленньм концевьм углеводом (сиаловая кислота). Зритропозтин присутствует в очень низких концентрациях в плазме, когда тело находится в здоровом состоянии, при котором ткани получают достаточную оксигенацию от существующего количества зритроцитов. Зта нормальная низкая концентрация достаточна для стимулирования замень! красньїх кровяньїх телец, которьіе обьічно теряются в процессе старения. 70 Количество зритропозтина в кровообращений возрастает в условиях гипоксии, когда снижается перенос кислорода кровяньми клетками при кровообращении. Гипоксия может вьізьшваться потерей большого количества крови при кровотечении, разрушением красньїх кровяньїх телец вследствие радисактивного облучения, снижением потребления кислорода из-за больших вьісот или продолжительного бессознательного состояния, а также различньми формами анемии. Под влиянием тканей, подверженньїх гипоксическому стрессу, 75 зритропозтин начинает увеличивать образование красньїх кровяньїх телец путем стимулирования конверсийи первичньїх предшествующих клеток в костном мозге в прозритробластьі, которне впоследствий доводят до созревания, синтезируют гемоглобин и реализуются в кровообращений в качестве красньїх кровяньїх телец.

Когда число красньїх кровяньїх телец в кровообращенийи больше, чем необходимо для нормальной потребности тканей в кислороде, зритропозтин в кровообращений снижается.

См., главньм образом, работь! Тевіа, ей аЇ., ЕХР. Нетаїйо!., 8в(Зирр. 8), 144 - 152 (1980); Топа, еї аї.,

У. Віої. Спет., 256(24), 12666 - 12672 (1981); Соіджаззег, У. СеїЇ. РПувзіоІї., 110(Зирр. 1) , 133 - 135 (1982); Ріпсп, Віооса, 60(6), 1241 - 1246 (1982); ЗуюмувКкі, ей аЇ., Ехрі. Нетаїйо!., 8(Зирр. 8), 52 - 64 (1980); Мацдніоп, Апп. Сііп. ар. зЗсі.,, 13 (5), 432 - 438 (1983); МУеївв, ей а), Ат. У. Меї. Кез., 44(10), 1832 - 1835 (1983); ІГарріп, еї а, Ехр. Нетаїйої!., 11(7), 661 - 666 (1983); Васім, еї а, Апп. М.М. Асай. су р; зЗсі, 414, 66 - 72 (1983); Мигрпу, еї аї.,, Асіа. Наетаїйоіодіса Оаропіса, 46(7), 1380 - 1396 (1983);

Оезвзургів, еї аіІ., Вгй 9. Наетацо!., 56, 295 - 306 (1984); и Еттапоцеї, ей аКі. , Ат. .). РПувіоі., 247 (1 РІ о 2), Е168-76 (1984).

Так как зритропозтин важен в процессе образования красньїх кровяньїх телец, гормон имеет потенциальное полезное применение как в диагностике, так и при лечений нарушений крови, характеризующихся низким или со несовершенньім образованием красньїх кровяньїх телец. См., главньім образом, работьі! Реппайпиг-Оав, еї аї.,

Віоса, 63 (5), 1168-71 (1984) и Надау, Ат. дог, Ред. Нетацо/і./Опсої., 4, 191 - 196, (1982) , касающиеся о зритропозтина в возможньїх терапиях серповидно-клеточньїх болезней, а также Езспраси, еї аї. , 9. Сііп. со

Іпмеві., 74(2), рр. 434 - 441, (1984), в которой описан терапевтический режим для уремической овцьі на оснований реакции іп мімо на вливание плазмьії, обогащенной зритропозтином, и предложена дозировка 10 | З

ЕРО/Ккг в день в течение 15 - 40 дней как поправка анемии такого типа, которьій ассоциируется с хронической юю почечной недостаточностью. См. также работу Кгапе, Непгу Рога Нагр. Меа. ., 31(3), 177 - 181 (1983).

Недавно бьіло оценено, что наличие зритропозтина в большом количестве позволит лечить каждьйй год анемии у 1600000 человек только в США. См., например, Могтізоп, "Віоргосезвіпд іп Зрасе - ап Омегміем", рр. « 557 - 571 іп Те Ууопа Віоїесн Керогі 1984, Моіїште 2:О5А, (Опіїпе Рибіїсайопе, Мем МогКк, М.М. 1984). Последние исследования создали основание для предсказания зффективности зритропозтиновой терапийи в - с разнообразии состояний болезни, расстройств и состояний гематологического нарушения: Медоумай, еї аї!., Асіа. ц Наетаїйо!., 71, 211 - 213 (1984) (бета-талассемия); МіспіпеКку, еї аЇ. , у. Реаіаїг., 105(1), 15 - 21 (1984) "» (кистозньій фиброз); Соїевз, еї а). , Вгй. 9. ОБзвіеї Супеасо!ї., 90(4), 304 - 311. (1983) (беременность, расстройства менструаций); Нада, еї аї., Асіа. Реадіаїг. Зсапа., 72, 827 - 831 (1983) (ранняя анемия преждевременности); Сіаиз-МУаїКег, ес а! , Агсй. РІіуз. Меа. КенпНарбії., 65, 370 - 374 (1984) (повреждение с спинного мозга); Юипп, ей аї., Еиг. 9. Аррі. РНузіоІ., 52, 178 - 182 (1984) (космический полет); МіМег, еї аі!., Вій. 9. Наептаїйо!)., 52, 545 - 590 (1982) (острая потеря крови); Одира, еї аї., 9. ар. Сіїп. Меад., т 103(4), 574 - 580 и 581 - 588 (1984); и Іірзспй», еї аї., Віосда, 63(3), 502 - 509 (1983) (старениеє); и

ОО ОаїпіаК, еї аїЇ., Сапсег, 51(6), 1101 - 1106 (1983) и Зспмагіл, еї аїЇ.,, Оюіагуподоі., 109, 269 - 272 (1983) (различнье неопластические состояния болезни, сопровождаемье аномальньім зритропоззом).

Ф Предьідущие попьітки получить зритропозтин с хорошим вьіходом вьіработки из плазмь! крови или из мочи се» доказаньі как относительно неудачнье. Усложненная и утонченная лабораторная техника, неизбежно и, как правило, приводит к сбору очень мальх количеств загрязненньїх и неустойчивьїх зкстрактов, содержащих зритропсзтин.

В патенте США Мо3033753 описан способ частичной очистки зритропозтина от плазмь! крови овць, что обеспечивает получение мальх вьіходов общего беспримесного зкстракта, содержащего зритропозтин. і) Первоначальнье попьітки вьіделить зритропозтин из мочи привели к неустойчивьм, биологически ко неактивньім препаратам гормона. В патенте США Мо3865801 описан способ стабилизации биологической активности общего вещества, содержащего зритропозтин, восстановленньй из мочи. Получаемьй препарат, 6о содержащий зритропозтин, сдерживает 9095 активности зритропозтина и является устойчивьм.

Другой способ очистки зритропозтина человека от мочи пациентов, страдающих апластической анемией, описан в работе МіуаКе, еї аї., 9У. Віої. Спет., МоЇ. 252; Мо15 (Айцдиві 10, 1977), рр. 5558 - 5564. Ота семизтапная методика включает ионообменную хроматографию, осаждение зтанола, гель-фильтрацию, адсорбционную хроматографию и вьірабатьіваєт чистьій зритропозтин с потенцией 70400 единиц/мг белка при 65 Вьіходе 2195.

В патенте США Мо4397840, вьіданном ТаКегаула, еї аї., описаньі! способьї получения "зритропозтинового продукта" из образцов мочи здорового человека со слабо основньмми ионньіми изменениями и утверждается, что полученнье продуктьї с низким молекулярньм весом "не имеют ингибирующих действий против зритропозтина".

В заявке на патент Великобритании Мо2085887, Зидітой, еї аІ., опубликованной б мая 1982 года, описан способ получения гибридньїх лимфобластоидньїх клеток человека и сообщается, что уровни продуцирования находятся в пределах от З до 420 единиц зритропозтина на мл суспензии клеток (распределенньх в культурах после размножения хозяином млекопитающего с содержанием до 107 клеток на мл). На самьх вьсоких уровнях продуцирования, которьіе, как утверждается, должнь бьіть достигнуть!, скорость продуцирования зритропозтина 70 может бьть расчитана, чтобьі составить от 40 до 4000 единиц/109 клеток/48 часов в культуре іп мйо с последующим переносом клеток из систем размножения іп мімо (См. также зквивалентную патент США

Мо4377513). Бьіли сделаньі! многочисленньіе предложения в отношений вьіделения зритропозтина из тканевьсмх источников, включающих неопластические клетки, однако вьїходьі вьіработки бьіли совершенно низкими. См., например, работь! ОеїКтап, еї аїЇ.,, Ехрі. Нетаїйо!., 11(7), 581 - 588 (1983); Татроигіп, еї аї., Р.М.А.5. 75 (0.5.А. ), 80, 6269 - 6273 (1983); КаївиоКка, еї аЇ.,, СбСапп, 74, 534 - 541 (1983); Надіжага, еї аї., Віоса, 63 (4), 828 - 835 (1984); и Спорріп, е! а/!., Віосад, 64 (2), 341 - 347 (1984).

Другие технологии вьіделения, применяемье для получения очищенного зритропозтина, включали в себя иммунологические методики. Поликлональное, являющееся производньім сьіворотки антитело, направленное против зритропозтина, развивается путем иньецирования животного, предпочтительно, крьісьії или кролика, человеческим зритропозтином. Иньецированньй зритропозтин человека распознается как инородное антигенное вещество иммунной системой животного и вьізьівает продуцирование антител против антигена.

Различнье клетки, реагирующие на стимулирование посредством антигенного вещества, продуцируют и вьісвобождают в кровообращениий антитела, отличающиеся слегка от тех, которне продуцируются другими реагирующими клетками. Активность антител остается в сьіворотке животного, когда его кровь зкстрагирована. «М

М хотя неочищенная сьворотка или препаратьь антител, очищеннье как сьвороточная фракция о иммуноглобулина С, могут бьіть затем использованьь в пробах для обнаружения комплексообразозания с человеческим зритропозтином, вещества испьтьвают главное неудобство. Зто сьвороточное антитело, состоящее из всех различньїх антител, продуцированньїх отдельньмми клетками, по природе является поликлональньм и образует комплексьь с компонентами в общих зкстрактах иначе, чем одиночньй «9 зритропозтин.

Интерес для предпосьлок настоящего изобретения представляют последние достижения в области і разработки целостньїх культур клеток, способньх продуцировать одиночньй вид оантитела, которьй «о специфически иммунологически активен с одиночной антигенной детерминантой отобранного антигена. См., глазньім образом, работу Спізпо!т, Нідй Тесппоіоду, Мої. 3, Мої, 57 - 63 (1983). Предпринимались попьїтки ч употребить слияние клеток и методики гибридизации для развития "моноклональньїх антител кзритропозтинуи М применить зти антитела в вьіделений и количественном определении зритропозтина человека. В качестве одного примера можно привести сообщение, появившееся в аннотированной форме в работе І ее-Нцапо,

Арзігасі Мо1463 ої Рей. Ргос., 41, 520 (1982), в которой говорится об успешной разработке линий клеток « гибридомь! мьішь-мьішШь, вбіделяющих моноклональнье антитела к человеческому зритропозтину. В качестве другого примера, подробное описание получения и использования моноклонального, противозритропозтинового - с антитела появилось в работе МУеїзв, еї аіЇ., Р.М.А.5. (0.5.А.), 79, 5465 - 5469 (1982). См. также работь а зЗазакі, Віотей. Віоспіт. Асіа., 42 (11/12), 5202 - 5206 (1983); Мападамжа, еї аї., Віосд, 64(2), 357 - 364 "» (1984); Хападауча, еї аї., 9. Віої. Спет., 259(5), 2707 - 2710 (1984); и патент США Мо4465624.

Для предпосьлок изобретения также представляют интерес сообщения об иммунологической активности синтетических пептидов, которье по существу дуплицируют аминокислотную последовательность, 1 сохранившуюся в встречающихся в природе белках, гликопротеидах и нуклепротеидах. Более конкретно, їз полипептидь! с относительно низким молекулярньм весом показаньь участвующими в иммунньїх реакциях, сходньїх по продолжительности и протяженности с иммунньми реакциями физиологически важньїх белков, (95) таких как вируснье антигеньі, полипептиднье гормоньй и тому подобное. Среди иммунньіїх реакций таких б» 50 полипептидов включено и провоцирование образования специфических антител в иммунологически активньх животньїх. См., например, работь! І егпег, еї аї., СеїЇї, 23, 309 - 310 (1981); Ковв, еї аїЇ., Маїйге, 294, 654 - сю» 656 (1981); УУаМег, ей аЇ, Р.М.А.5. (0.5.А.), 77, 5197 - 5200 (1980); Іегпег, еї аЇ., Р.М.А.5. (0.5.А.), 78, 3403 - 3407 (1981); УУанег, ей аїЇ.,, Р.М.А.5. (0.5.А.), 78, 4882 - 4886 (1981); Муопд, еї аї., Р.М.А.5. (О.5.А.), 78, 7412 - 7416, (1981); Огееп, еї аї.,, СеїЇ, 28, 477 - 487 (1982); Мідд, еї аї., Р.М.А.5. (Ш.5.А.), 79, 5322 - 5326 (1982); Вагоп, еї аїі., СеїЇї, 28, 395 - 404 (1982); Югеезтап, еї аї., Маїшге, 295, 158 - 160 (1982); и Іегпег, Зсіепійіс Атегісап, 248, Мо2, 66 - 74 (1983). См. также работу Каїзег, еї аї., о Зсіепсе, 223, рр. 249 - 255 (1984), касающуюся биологической и иммунологической активности синтетических іме) пептидов, которне приблизительно обладают вторичньми структурами пептидньїх гормонов, однако, могут не обладать их первичной структурной конформацией. Вьішеуказаннье исследования касаются, конечно, бо аминокислотньїх последовательностей белков, иньїх, нежели зритропозтин, вещество, для которого не бьіло опубликовано существенной информации об аминокислотной последовательности. В совместной заявке на патент США Мо463724, поданной 4 февраля 1983 года .). Едгіе, опубликованной 22 августа 1984 года как европейская заявка на патент Мо0116446, описана линия клеток гибридомь! мьішь-мьішь (А.Т.С.С. МонВ8209), которая продуцирует крайне специфическое моноклональное, противозритропозтиновое антитело, которое б5 является также специфически иммунонеактивньм с полипептидом, содержащим следующую последовательность аминокислот:

МН»о-Аїа-Рго-Рго-Ага-І еш-Пе-Сувз-Авзр-Зег-Ага-Ма!-Ї еи-с1ІШ-Аго- Туг-І еш-Ї ец-с1Ш-Аїа-Ї ув-СООН.

Полипептидной последовательностью является та последовательность, которая закреплена за первьіми двадцатью аминокислотньіми остатками созревшего зритропозтина человека, изолированного в соответствий до со способом, описанньм в работе Міуаке, еї аї., 9. Віої. Спет., 252, 5558 - 5564 (1977), и над которой провели аминокислотньій анализ посредством газофазового секвенсера (Аррієєй Віозувіетв, Іпс.) в соответствии с методикой НемісК, М., еї аї., У. Віої. Спет., 256, 7990 - 7997 (1981). См. такке работу Зие, еї аї,, Ргос. Маї. Асад. Зсі. (О5А), 80, рр. 3651 - 3655 (1983), касающуюся развития поликлональньх антител против синтетического 26б-тег на основе отличающейся аминокислотной последовательности, и работу 7/0 ЗУЮМузКі, еї а|., у). Іттипої. Меїпоадв, 69, рр. 181 - 186 (1984).

Хотя поликлональнье или моноклональнье антитела, как описано вьіше, располагают весьма полезньми материалами для использования в иммуноиспьтаниях для обнаружения и количественного определения зритропозтина и могут бьіть пригоднь! в сродственной очистке зритропозтина, кажется маловероятньм, что зти материаль! для крупномасштабного вьіделения могут обеспечить количества зритропозтина млекопитающих /5 МсточниКов, достаточнье для проведения дальнейшего анализа, клинического обследования и возможного широконаправленного терапевтического использования вещества при лечении, например, хронической болезни почек, при которой пораженнье ткани не в состояний поддерживать продуцирование зритропозтина. Позтому предполагается, что найлучшие перспективьі для полной характеристики зритропозтина млекопитающих и создания больших количеств его для возможной диагностики и клинического применения содержит го употребление рекомбинантньх методик для осуществления крупномасштабного микробного синтеза соединения.

Несмотря на то, что в попьітке вбіделить последовательности ДНК, кодирующие зритропозтин человека или других видов млекопитающих, бьіли предпринятьї значительньсе усилия, ни одно из них не бьіло успешньм. Зто обусловлено, главньім образом, дефицитом тканевьїх источников, особенно человеческих тканевьх источников, с обогащенньх в мРНК так, чтобь! позволить построение кКДНК-библиотеки, из которой посредством применения известньїх методик можно вьіделить последовательность ДНК, кодирующую зритропозтин. Кроме того, мало что і) известно о непрерьівной последовательности аминокислотньїх остатков зритропозтина, а позтому невозможно построить, например, длиннье подинуклеотиднье зондь, подходящие для надежного использования в скрининге ДНК/ДНК-гибридизации кДНК и особенно геномньїх библиотек ДНК. Иллюстративно с зо последовательность двадцати аминокислот, применяемая для генерирования вьішеуказанного моноклонального антитела, продуцированного А.Т.С.С. МоНВ8209, не допускает построения однозначного ікс, бО-основного олигонуклеотидного зонда способом, описанньм Апдегзоп, еї аїЇ., вьше. Найдено, что с человеческий ген для зритропозтина может проявляться как "тен одиночной копии" в геноме человека, и так или иначе, генетический материал, кодирующий зритропозтин человека, вероятно, составляет менее 0,0000590 - общей геномной ДНК человека, которая должна присутствовать в геномной библиотеке. ю

На сегодняшний день найболее успешньсе из известньїх попьіток в рекомбинантньїх способах для создания последовательностей ДНК, пригодньїх при использований в микробной зкспрессии изолируемьх количеств зритропозтина млекопитающих, далеко не достигли цели. В качестве примера можно привести работу Рагрег, еї аІ.,, ЕХР. Нетаїйо!., 11, З(,рр. 14, АБрзігасі 101 (1983), в которой сообщается об зкстракциий мРНК из почечньх « тканей бабуинов, обработанньїх фенилгидразином, и иньецирований мРНК в ооцить! Хепорив Іаемів с доОвольно пла) с временньїм результатом получения іп мйго смеси "трансляционньїх продуктов", которне имели проявляющиеся биологические свойства зритропозтина. Совсем недавно Рагрег, еї а!., Віоод, 62, Мо5, Зурр. Мо1, Абрвзігасі, 392, ;» аг раде 122а (1983) доложили о трансляции іп міго мРНК почки человека лягушечьими ооцитами. Полученная смесь продукта трансляции бьіла оценена как содержащая порядка 220 ту продукта трансляции, имеющего активность зритропозтина на микрограмм введенной мРНК. И хотя такие уровни трансляции іп мйго зкзогенной с МРНК, кодирующей зритропозтин, бьіли признаньй совершенно низкими (по сравнению даже с ранее сообщенньми уровнями трансляции мРНК бабуина в искомьй продукт), посчитали, что результать о подтверждают существование почки человека в качестве участка зкспрессивности зритропозтина, оо позволяющей построение кДНК-библиотеки обогащенной почки человека, из которой можно вьіделить желаемьій ген. (См. также Рагбрег, Сіїіп. Кев., 31(4), 769А (1983). ме) С тех пор как бьіли подань заявки на патенть США МоМо561024 и 582185, появилось единственное 4) сообщение о клонированиий и зкспрессии того, что признано кКДНК зритропозтина человека в Е. соїї. Короче говоря, цельй ряд клонов кКДНК бьл внесен в плазмидь! Е. соїї, и продукть! слияния р-лактамазь! бьіли отмечень! как иммунореактивнье с моноклональньмм антителом к неустановленному "зпитопу" зритропозтина человека.

См. Гее-Ниапо, Ргос. Маї. Асад. зсі. (ОА), 81, рр. 2708 - 2712 (1984).

Предлагаются впервье нове очищеннье и вьіделеннье полипептиднье продуктьї, имеющие частично иди іФ) полностью первичную структурную конформацию (те. непрерьвную последовательность аминокислотньх ко остатков) и одно или более биологических свойств (например, иммунологические свойства и биологическая активность іп мімо и іп міго) встречающегося в природе зритропозтина, включая его аллельнье варианть!. Зти бо полипептидьі также однозначно отличаются тем, что являются продуктом зкспрессии прокариотического или зукариотического хозяина (например, бактериальньми, дрожжевьми и клетками млекопитающих в культуре) последовательностей зкзогенной ДНК, полученньїх путем геномного или кКДНК-клонирования, или путем генного синтеза. Продуктьї микробной зкспрессии в клетках позвоночньїх (например, млекопитающих и птиц) могут, кроме того, отличаться тем, что свободньі от сообщества с белками человека или другими загрязнителями, б5 Которне могут ассоциироваться с зритропозтином в его естественной для клеток млекопитающих окружающей среде или в зкстрацеллюлярньїх текучих средах, таких как плазма крови или моча. Продукть! типичньх дрожжевьх (например, Зассаготусевз сегемізідез или прокариотических (например, Е. соїї) клеток-хозяев свободньі от сообщества с любьми белками млекопитающих. В зависимости от применяемого хозяина предлагаемье полипептидь! могут бьіть гликозилированьь млекопитающими или другими зукариотическими углеводами, или могут бьіть негликозилированньми. Предлагаемье полипептидьі могут также включать аминокислотньй остаток начального метионина (в положении -1).

Предлагаемье новье гликопротейновье продуктьії включают те, которние имеют первичную структурную конформацию, достаточно дуплицирующую конформацию встречающегося в природе (например, человеческого) зритропозтина для того, чтобь! дать возможность обладать одним или более из биологических 7/0 свойств последнего, и те, которье имеют среднюю углеводную композицию, отличающуюся от композиции встречающегося в природе (например, человеческого) зритропозтина.

Клетки позвоночньїх (например, СО5-1 и СНО), предлагаемье в настоящем изобретении, содержат первье клетки, всегда доступньсе, которье могут размножаться непрерьвно іп міго и которье во время роста в культуре способньі продуцировать в среде их роста более 100) (предпочтительно, более 500) и наиболее 75 предпочтительно, более 10000 - 5000))) зритропозтина на 106 клеток за 48 часов, как определено радисиммуноисследованием.

Предлагаются также синтетические полипептидьі, полностью или частично дуплицирующие непрерьівнье последовательности аминокислотньїх остатков зритропозтина, которье здесь впервье разьяснень!. Зти последовательности путем разделения первичньїхх, вторичньїх или третичньїх структурньїх и конформационньх характеристик со встречающимся в природе зритропозтином могут обладать биологической активностью и/или иммунологическими свойствами совместно со встречающимся в природе продуктом так, что они могут применяться как биологически активнье или иммунологические заместители зритропозтина в терапевтических и иммунологических процессах. Соответственно, предлагаются моноклональнье и поликлональнье антитела, вьірабатьшаємьсе стандартньми способами, которье иммунореактивньії с такими ополипептидами и, см предпочтительно, также иммунореактивнь! со встречающимся в природе зритропозтином.

Настоящее изобретение иллюстрируют клонированнье последовательности ДНК видовьїх начал обезьянь! и і) человека, а также полипептиднье последовательности, удобно вьіведеннье оттуда и представляющие, соответственно, первичную структурную конформацию видовьїх начал обезьянь и человека.

Предлагаются также новье, биологически функциональньсе векторь! вирусной и кольцевой плазмидной ДНК, се охватьвающие последовательности ДНК изобретения, и микробнье (например, бактериальнье, дрожжевье и клетки млекопитающих) организмь! хозяина, устойчиво трансформируемье или трансфектируемье такими і-й векторами. Соответственно, предлагаются нове способь! получения полезньїх полипептидов, включающие со культивируемое вьіращивание таких трансформируемьїх или трансфектируемьїх микробньїх хозяев в условиях, облегчающих крупномасштабную зкспрессию зкзогенньїх, вектор-несущих последовательностей ДНК и З

Вьіделение желаемьх полипептидов из питательной средь), клеточньх лизатов или фракций клеточньїх ( мембран.

Вьіделение и очистку микробиально вьіраженньїх полипептидов, предлагаемьїх настоящим изобретением, можно осуществить при помощи традиционньїх способов, включающих, например, разделение препаративной « хроматографией и иммунологическое разделение препаратов, содержащих моноклональньюе и/или 70 поликлональнье антитела. - с Разьяснив последовательность аминокислотньх остатков зритропозтина, настоящее изобретение й предлагает полное и/или частичное построение ДНК-последовательностей, кодирующих зритропозтин и "» содержащих такие благоприятнье характеристики, как внедрение кодонов, "предпочитаемьіх" для зкспрессии отобранньми хозяевами не млекопитающих, обеспечение участков для расщепления посредством ограничительньїх зндонуклеазньїх ферментов и обеспечение дополнительньхх начальньїх, конечньїх или с промежуточньїх ДНК-последовательностей, которье способствуют построению легко вьіражаєемьх векторов.

Соответственно, предлагается построение (и развитие посредством специфического мутагенеза кКДНК и ве геномной ДНК) ДНК-последовательностей, кодирующих микробную зкспрессию полипептидньїх аналогов или о производньїх зритропозтина, которье отличаются от встречающихся в природе форм с точки зрения идентичности и местоположения одного или более аминокислотньїх остатков (те. аналогов делеции, б содержащих меньшее количество всех остатков, определенньїх для ЕРО, и/или аналогов замещения, в которьх с» один или более установленньїх остатков замененьй другими остатками, и/или дополнительньхх аналогов, в которьїх один или более аминокислотньїх остатков добавленьі к конечной или средней части полипептида); и которье обладают некоторьіми или всеми свойствами встречающихся в природе форм.

Предлагаемье новье ДНК-последовательности включают все последовательности, пригоднье в обеспечениий зкспрессии в прокариотических или зукариотических клетках-хозяевах полипептидньїх продуктов, о имеющих, по меньшей мере, часть первичной структурной конформации и одно или более из биологических ко свойств зритропозтина, которне охватьіваются: (а) ДНК-последовательностями, приведенньіми в Таблицах М и

МІ, или их комплементарньми нитями; (Б) ДНК-последовательностями, которье гибридизируют (в условиях бо гибридизации, иллюстрируемьїх здесь, или более жестких условиях) к ДНК-последовательностям, которье определеньі в (а), или их фрагментам; и (с) ДНК-последовательностями, которьше вследствие дегенерации генетического кода должнь! гибридизирозать к ДНК-последовательностям, определенньмм в (а) и (Б) вьіше.

Особенно охвачень в части (б) геномньіе ДНК-последовательности, коюодирующие формьї аллельньїх вариантов обезьяньего и зритропозтина человека и/или кодирующие зритропозтин других видов млекопитающих. 65 Особенно охваченьі! в части (с) построеннье ДНК-последовательности, коюодирующие ЕРО, ЕРО-фрагменть и

ЕРО-аналоги, чьи ДНК-последовательности могут включать кодонь, способствующие трансляции информационной РНК в хозяевах беспозвоночньїх.

Охвачен предлагаемьм изобретением тот класс полипептидов, которьй кодируется частями

ДНК-комплемента в верхнюю часть последовательности геномной ДНК, приведенной в Таблице МІ, т.е. "комплементарно инвертированньсе белки", как описано в работе Тгатопіапе, еї а!., Мисівїс Асіаз Кезеагсі, 12, рр. 5048 - 5059 (1984).

Также охваченьі изобретением фармацевтические композиции, содержащие зффективнье количества полипептидньїх продуктов настоящего изобретения вместе с пригодньіми разбавителями, стимуляторами и/или носителями, позволяющими создание зритропозтиновой терапии, особенно при лечении анемических 7/0 болезненньх состояний и, более всего, таких анемических состояний, которье приводят к хронической почечной недостаточности.

Предлагаемье полипептиднье продуктьї можно "метить" ковалентной ассоциацией с обнаруживаемьм маркерньм веществом (например, радиомеченньюе 129І) для обеспечения реагентами, пригодньмми при обнаружений и количественном определений зритропозтина в твердой ткани и жидкостньїх образцах, таких как 75 Кровь или моча. ДНК-продуктьї можно также метить обнаруживаемьми маркерами (как, например, радиометки и неизотопнье метки, такие как биотин) и использовать в процессах ДНК-гибридизации для локализации положения зритропозтинового гена и/или положения любого родственного генного семейства в хромосомной карте человека, обезьянь! и других видах млекопитающих. Их также можно использовать для идентификации нарушений зритропозтинового гена на ДНК-уровне и использовать в качестве генньїх маркеров для

Мдентификации соседних генов и их нарушений.

Как подробно описано ниже, настоящее изобретение, кроме того, обеспечивает значительнье усовершенствования в способах обнаружения специфических однонитевьхх полинуклеотидов неизвестной последовательности в гетерогенном клеточном или вирусном образце, включающем кратнье однонитевье полинуклеотидь, в котором: с (а) получают смесь меченьх зондов однонитевьх полинуклеотидов с равномерно изменяющимися последовательностями оснований, причем каждьй из указанньїх зондов является потенциально специфически і) комплементарньм к последовательности оснований, которая предположительно уникальна для обнаруживаемого полинуклеотида, (Б) фиксируют образец на плотном субстрате, со (с) обрабатьшваєт субстрат, имеющий фиксированньй на нем образец, для ослабления дальнейшего связьвания с ним полинуклеотидов, за исключением пути гибридизации к полинуклеотидам в указанном і-й образце, со (4) обработанньй субстрат, имеющий фиксированньй на нем образец, временно приводят в соприкосновение с указанной смесью меченьїх зондов в условиях, способствующих гибридизации только между З полностью комплементарньіми полинуклеотидами, и ою (е) специфический полинуклеотид обнаруживают мониторингом на наличие реакции гибридизации между ним и полностью комплементарньм зондом внутри указанной смеси меченьїх зондов, как доказано наличием найвьсшей плотности меченого материала на субстрате в локусе специфического полинуклеотида по « сравнению с плотностью фона меченого материала, виітекающей из неспецифического связьівания меченьх 70 ЗзонДдОовВ с субстратом. - с Данньсе способьї особенно зффективнь! в ситуациях, диктующих использование 64, 128, 256, 512, 1024 или ц более смешанньх полинуклеотидньїх зондов, имеющих длину от 17 до 20 оснований в ДНК/ДНК, или РНЮ/РНК, "» или ДНК/РНК-гибридизациях.

Как описано ниже, указаннье вьіше усовершенствованнье способь! наглядно позволили идентифицировать КДНК-клоньі, кодирующие зритропозтин обезьян в пределах библиотеки, полученной из мРНК почечньїх клеток с анемических обезьян. Более конкретно, смесь 128 равномерно изменяющихся 20-тег зондов, основанньїх на информации аминокислотной последовательности, вьітекающей из чередующихся фракций, зритропозтина ве человека, использовали в методиках гибридизации колоний для идентификации семи "положительньмх" оз КДНК-клоноз зритропозтина в пределах совокупности 200000 колоний. Даже более того, практика применения усовершенствованньх способов настоящего изобретения позволила бьістро вьіделить три положительньх б клона из пределов зкранирования 1500000 стерильньїх пятен, составляющих геномную библиотеку человека. с» Зто бьіло вьіполнено посредством использования указанной вьіше смеси 128 20-тег зондов вместе со вторьім набором 128 17-тег зондов на оснований аминокислотного анализа отличающейся непрерьівной последовательности зритропозтина человека.

Указаннье вьіше иллюстративнье способь! составляют первьій известньій пример использования кратньх смешанньїх олигонуклеотидньїх зондов в процессах ДНК/ДНК-гибридизации, направленньїх на вьіделение о геномньїх клонов млекопитающих, и первьій известньй пример использования смеси более чем 32 ко олигонуклеотидньїх зондов в вбіделений кДНК-клонов.

Многочисленньюе аспектьї и преимущества изобретения станут очевидньми для специалистов в данной бо области при рассмотрении следующего подробного описания изобретения, создающего пример практического применения изобретения в предпочтительньїх вариантах его осуществления.

В соответствии с настоящим изобретением бьіли вьіделеньї и охарактеризованьі! ДНК-последовательности, кодирующие частично или полностью полипептидную последовательность вида зритропозтина человека и обезьянь!ї (в дальнейшем "ЕРО"). Кроме того, ДНК обезьяньі и человека стала предметом зукариотической и 65 прокариотической зкспрессии, создающей вьіделяеємье количества полипептидов, проявляющих биологические (например, иммунологические) свойства встречающегося в природе ЕРО, а также биологические активности іп мімо и іп міго ЕРО.

Видовьне ДНК обезьян сначала вьіделяли из кКДНК-библиотеки, построенной мРНК, которая происходила от почечной ткани обезьяньї в химически индуцированном анемическом состоянии и чья сьіворотка, как бьло установлено иммунологическим путем, содержала более вьісокие уровни ЕРО по сравнению с сьівороткой нормальной обезьянь. Вьіделение требуемьх кДНК-клонов, содержащих ЕРО-кодирующую ДНК, осуществлялось путем использования гибридизации колоний ДНК/ДНК с применением пула 128 смешанньх, радиомеченньх, 20-тег олигонуклеотидньїх зондов, и включало бьістрое зкранирование 200000 колоний. Расчет олигонуклеотидньїх зондов бьіл основан на информации аминокислотной последовательности, представленной 7/0 ферментативной фрагментацией и определением последовательности малой пробь! человеческого ЕРО.

ДНК человека бьіла вьіделена из библиотеки геномной ДНК человека. Вьіделение клонов, содержащих

ЕРО-кодирующую ДНК, осуществляли путем использования гибридизации бляшек ДНК/ДНК с применением указанньїх вьіше 128 смешанньїх 20-тег олигонуклеотидньїх зондов, а также второго пула 128 радиомеченньх 17-тег зондов, чьи последовательности основьівались на информации аминокислотной последовательности, полученной из отличающегося ферментативного фрагмента ЕРО человека.

Положительнье колонии и бляшки бьли провереньь при помощи дидеокси-программирования последовательности клональной ДНК с использованием набора 16 последовательностей в пределах пула 20-тег зондов, и отобраннье клонь бьіли подвергнутьь анализу на нуклеотидную последовательность с окончательной дедукцией первичной структурной конформации ЕРО-полипептидов, кодируемьмх ею. Дедуцированнье полипептиднье последовательности проявляли вьісокую степень гомологий по отношению друг к другу и к частичной последовательности, генерированной аминокислотньмм анализом фрагментов ЕРО человека.

Отобранньій положительньй кДНК-клон обезьян и отобранньй положительньй геномньй клон человека бьіли внесеньї в "челночньій" ДНК-вектор, которьій амплифицировали в Е. соїї и применяли для трансфекции сч об Кклеток млекопитающих в культуре. Культурньй рост трансфектированньх клеток-хозяев вьражался в препаратах, плавающих на поверхности культуральной средьі, содержащих по оценке до 3000 ту ЕРО на мл і) культуральной жидкости.

Следующие примерь! представлень!ї с целью иллюстрации изобретения и особенно направлень на способь, осуществленнье ранее для идентификации ЕРО, кодирующего кДНК-клоньії обезьяньі и геномнье клонь с зо человека, на способьі, являющиеся результатом зтой идентификации, а также на последовательности, развитие систем зкспрессии и иммунологическое подтверждение зкспрессии ЕРО в таких системах. ікс,

Более конкретно, Пример 1 о направлен на определение аминокислотной последовательности (є

ЕРО-фрагментов человека и построение смесей радиомеченньх зондов на оснований результатов зтого определения последовательностей. Пример 2 направлен, главньм образом, на способь), включеннье в - з5 идентификацию положительньїх кКДНК-клонов обезьян, и таким образом обеспечивает получение информации, ю касающейся лечения животньїх и предварительного анализа радисиммуноисследования (КІА) сьівороток животньіїх. Пример З направлен на получение кДНК-библиотеки, зкранирование гибридизации колоний и проверку положительньїх клонов, определение последовательности ДНК положительного кДНК-клона, а также генерирование информации первичной структурной конформации (аминокислотной последовательности) « полипептидов ЕРО обезьян. Пример 4 направлен на способь, включеннье в идентифицирование з с положительньх геномньїх клонов человека, и обеспечивает, таким образом, информацией, относящейся к источнику геномной библиотеки, способам гибридизации бляшек и проверке положительньїх клонов. Пример 5 ;» направлен на определения последовательности ДНК положительного геномного клона и генерирование информации аминокислотной последовательности полипептидов ЕРО человека, включая сравнение с информацией последовательности ЕРО обезьянь. Пример б направлен на способь! построения вектора, с включающего ЕРО-кодирующую ДНК, произошедшую от положительного кДНК-клона обезьянь, использование вектора для трансфектирования клеток СО5-1 и культурного роста трансфектированньїх клеток. Пример 7 ве направлен на способьі построения вектора включающего ЕРО- кодирующую ДНК, произошедшую от оо положительного геномного клона человека, использование вектора для трансфектирования клеток СО5-1 и

Культурного роста трансфектированньх клеток. Пример 8 направлен на способьі иммуноисследований,

Ме. проводимьїх на надосадочньїх жидкостях сред, полученньїх из культурного роста трансфектированньїх клеток в 4) соответствии с Примерами б и 7. Пример 9 направлен на биологическую активность іп мйго и іп мімо микробиально вніраженного ЕРО Примеров би 7.

Пример 10 направлен на развитие систем зкспрессии хозяина млекопитающих для кКДНК ЕРО видов обезьян дв М геномной ДНК человека, включая клетки яичника китайского хомяка (СНО") и на иммунологическую и биологическую активности продуктов таких систем зкспрессии, а также характеристику таких продуктов. Пример

Ф) 11 направлен на получение генов, коюодирующих ЕРО человека и аналоги ЕРО, геньі! которьїх включают ряд ка предпочтительньїх кодонов для зкспрессии в Е. соїї и дрожжевьїх клетках-хозяевах, а также на системь! такой зкспрессии. Пример 12 относится к профилям иммунологической и биологической активностей вьіраженньх бо продуктов систем, приведенньхх в Примере 11.

ПРИМЕР 1

А. Определение аминокислотной последовательности фрагмента ЕРО человека

ЕРО человека вьіделяют из мочи и подвергают триптическому расщеплению, приводящему к развитию и вьіделению 17 раздельньїх фрагментов в количествах, приближенно внраженньх в 100 - 150 пикомолей. 65 Фрагментам произвольно приписьвают номера и анализируют на аминокислотную последовательность микроанализом с использованием газофазового секвенсера (Арріїей Віозузвіетв) для получения информации о последовательности, приведенной в Таблице 1 ниже, где примененьї буквенньсе кодь и "Х" обозначаєт остаток, однозначно не определенньй.

Таблица І

Фрагмент ї Результат анализа последовательности тав А-Р-Р-В тав в-к-щ-к те д-І.-6-А-9-К т13 М-1-Е-в8 т16 д-у-5-6-1-К тів с-Е-К т21 к--К-К 125 у-14-1-Е-А-К т2ва 1-1-с0-0-5-К т26в Ш-у-т-6-Е-А-С-В 127 Т-І-Т-А-0-Т-5-К т28 Е-А-І-5-Р-Р.-0-А-А-М-Д-Д-Р-І-Я тзо Е-д-Е-Х-1-Т-1-6-Х-А-Е-Н-Х-5-1-

М-Е-Х-1І-Т-У-Р 131 У-у-5-М-Е-(-8 тз3 5-0 -Т-1-4-4-К т35 М-М-к-Х-А-Н-К т38 б-0-А-1 -І -У-Х-5-5-0-8-К-

Е-Р-І-0-(-Н-У-0-К

В. Расчет и построение смесей олигонуклеотидньїх зондов

Аминокислотнье последовательности, приведеннье в Таблице І, рассматриваются в смьісле дегенерации генетического кода с целью вьіяснения того, можно ли применять методики смешанньїх зондов к приемам с

ДНК/ДНК-гибридизации на кКДНК и/или библиотеках геномной ДНК. Зтот анализ вьіявляет, что в пределах фрагмента МоТ35 существует ряд из 7 аминокислотньїх остатков (МаІ-Азп-РНе-Туг-АІа-Тгр-І ув), которьій можно і) однозначно охарактеризовать как кодируемьй оодной из 128 возможньх ДНК-последовательностей, охватьвающей 20 пар оснований. Позтому синтезируют первьій набор из 123 20-тег олигонуклеотидов с использованием стандартньїх фосфоамидитньїх способов см., например, работу Веаийсаде, еї аї., Тегйгапедгоп с зо І ебегв, 22, рр. 1859 - 1862 (1981) на твердом носителе, в соответствии с последовательностью, приведенной ниже в Таблице ІІ. ісе)

Таблица ІЇ со

Остаток - Уаї - д8п Ре т 818 Ігр Туз ч;Е

З" са ттб ААб АТ СА 0 АССО ТТ 0-5 т А А А й Іо) с с

Дополнительньй анализ вьіявляет, что в пределах фрагмента МоТ38 существует ряд из б аминокислотньх остатков (Сіп-Рго-Тгтр-СІШ-Рго-їеш), на основе которого можно ополучить пул из 128 смешанньх « олигонуклеотидньх 17-тег зондов, как показано в Таблице ЇЇ ниже.

Таблица ІІІ - - Остаток - біп Ртго їв бів рто ев ' и? з' сту ссА Асс стт сс А 5 с б

Го с с 175 Олигонуклеотидньюе зондь метят в 5-конце гамма- З2Р-АТР, 7500 - 8000 Сі/ммоль (ІСМ) , используя полинуклеотидную киназу Т., (МЕМ). пи ПРИМЕР 2 с А. Методики обработки обезьян и КІА-анализ

Самок СупотоіЇдиз обезьян Масаса Газісцагіаз (2,5 - Зкг, 1,5 - 2 года) обрабатьшают путем подкожного б» введения раствора гидрохлорида фенилгидразина (рН 7,0) в дозировке 12,5мг/кг на 1, З и 5 день. Гематокрит «сю контролируют перед каждьм введением. На 7 день, или как только уровень гематокрита опускается ниже 2595 от первоначального уровня, собирают сьіворотку и почки после введения гидрохлорида кетамина в дозировке 25мг/кг. Собраннье материаль! немедленно замораживают в жидком азоте и хранят при температуре -707С.

В. КІА для ЕРО

Применяют радисиммунологическое исследование для количественного определения ЕРО в образцах в (Ф. соответствии со следующими методиками: г Стандарт зритропозтина или неизвестньій образец инкубируют вместе с антисьівороткой в течение двух часов при температуре 37"С. После двухчасового инкубирования пробирки с образцами охлаждают на льду, бр добавляют зритропозтин, меченньй 125), и пробирки инкубируют при температуре 02С, по крайней мере, еще 15 часов. Каждая исследуемая пробирка содержит 500мкл инкубацонной смеси, содержащей 5Омкл разведенной иммунной сьіворотки, 10000 срт 125І-зритропозтина, 5мкл трасилола и 0 - 250мкл или стандарта ЕРО, или неизвестного образца, а также РВ5, содержащий 0,195 В5БА для восполнения оставшегося обьема.

Используемой сьівороткой является спущенная во второй пробе кровь кролика, иммунизированного 1905-ньІ/мМ 65 чистьІм препаратом мочевого зритропозтина человека. Конечное разведение антисьворотки регулируют так, чтобь! содержание 129І-зритропозтина, связанного с антителом, не превьішало 10 - 2095 от общих входньх количеств. В общем, зто соответствует конечному разведению антисьіворотки от 1 : 50000 до 1 : 100000. 125|-зритропозтин, связанньій с антителом, осаждают добавлением 150мкл біарп А. После 40-минутного инкубирования образцьі! центрифугируют и осадки в пробирке промьївают два раза 0,75мл раствором 10ММ

Тів-НСІЇ, имеющим рН - 8,2, содержащим 0,15М Масі, 2иМ ЕОТА и 0,05905 Ттйоп Х-100. Определяют количество промьттьх остатков при помощи счетчика гамма-квантов для определения процента связи 125І-зритропозтина.

Количества, связаннье пре-иммунньі!ми сьіворотками, вьічитают из всех конечньїх значений для корректировки неспецифического осаждения. Содержание зритропозтина неизвестньїх образцов определяют путем сравнения со стандартной кривой.

Приведенную вьше методику применяют на сьіворотке обезьян, полученной вьіше, в части А, а также на сьіворотке обработанньїх обезьян. Уровни нормальной сьіворотки, как определено, составляют приблизительно 36 тОи/мл, тогда как для сьіворотки обработанньїх обезьян они составляют от 1000 до 1700 тИ/мл.

ПРИМЕР З

А. Построение кКДНК-библиотеки обезьян

Информационную ДНК вьіделяют из почек нормальньїх и анемических обезьян посредством методики с использованием тиоцианата гуанидиния, описанной в работе СпПігом/п, еї аї!., Віоспетівігу, 18, р. 5294 (1979), и поли (А)" МРНК очищают, пропуская дваждь! через хроматографическую колонку с олиго(ат)-целлюлозной, как описано на стр. 197 - 198 в работе Мапіаїйів, еї аїЇ., "Моіесшаг Сіопіпд, А І арогаїогу Мапиа!" (Соїд Зргіпод5

Нарбог І арогайогу, Соїа бргіпоз, Нагрог, М.У., 1982). Библиотеку кДНК строят в соответствии с видоизменением основньїх методик, изложенньїх в работе ОКауата, ей а. , Мої. апа Сей. ВіоіІ., 2, рр. 161 - 170 (1982).

Ключевьми моментами предпочтетаемьх теперь методик являются следующие: (1) рОС8 используют в качестве подошвенного вектора, разрезают Рв и затем снабжают хвостом длиною в 60 - 80 оснований при помощи олиго аТ; (2) расщепление НіпсіЇ используют для отщепления олиго аТ-хвоста от одного конца вектора; (3) синтез первой нити и присоединение хвоста при помощи олиго дб осуществляют в соответствии с с опубликованной методикой; (4) расщепление ВатНі применяют для отщепления олиго д4О-хвоста от одного о конца вектора; и (5) замену РНК-нити на ДНК производят в присутствий двух связующих звеньев (САТСТАААСАССОТССССССССС и АСОСТСТТТА) при трехкратном молярном избьтке по отношению к вектору с олиго до-хвостом.

В. Методики гибридизации колоний для просеивания кКДНК-библиотеки обезьян со

Трансформированньсе Е. соїї разбрасьвшвают с плотностью 9000 колоний на 10 х 10см питательньїх чашках, «со содержащих БОмкг/мл амлициллина. Сепебсгееп фильтрь! (Мем/ Епдіапа Мисієаг Сайаіод МоМЕР-972) предварительно увлажняют на ВНІ-САМ чашке (37г/л бактозкстракта мозг/сердце, 2г/л кислот Сазатіпо и 15г/л. (о агара, содержащего 50О0мкг/мл хлорамфеникола) и используют для поднятия колоний с чашки. Колоний « вьращивают в той же среде в течение 12 часов или более для амплифицирования численности плазмидной копии. Амплифицированнье колониий (бока колоний) обрабатьвают серийно, помещая фильтрь! над двумя Іс) кусками ЗММ ватмана, насьіщщенного следующими растворами: (1) БОММ глюкоза - 25мМ Ттгів-НСЇІ (рН 8,0) - 1ММ ЕОТА (рн 8,0) в течение 5 минут, (2) О0,5М Масон в течение 10 минут, и « (3) 1,0М Ттгів-НСЇІ (рН 7,5) в течение трех минут.

Фильтрь! затем сушат на воздухе в вакууме в течение двух часов при температуре 807С. т с Затем фильтрь! подвергают расщеплению Протейиназой К через обработку раствором, содержащим 5Омкг/мл ч протеазного фермента в Буфере К (0,1М Ттіз-НСІ (рН 8,0) - 0,15М Масі - 10ММ ЕОТА (рН 8,2) - 0,296 5О5І. » Конкретно, добавляют к каждому фильтру 5мл раствора и расщепление продолжают при температуре 557С в течение 30 минут, после чего раствор удаляют.

Фильтрь!ї затем обрабатьввают 4мл буфера предварительной гибридизации (5 х З5РЕ - 0,595 505 - 100мкг/мл 1 З Е. соїї ДНК - 5 х ВЕР). Предварительную гибридизационную обработку осуществляют при температуре 557С, їз как правило, в течение 4 часов или более, после чего раствор удаляют.

Процесс гибридизации проводят следующим образом. В каждьй фильтр добавляют Змл гибридизационного о буфера (5 х 55РЕ - 0,595 505 - 100мкг/мл дрожжевой тРНК), содержащего 0,025 пикомолей каждой из 128 б 50 последовательностей зондов, представленньїх в Таблице І (полная смесь обозначена как смесь ЕРМ), и фильтрь! вьідерживают при температуре 48"С в течение 20 часов. Зта температура на 2"С ниже, чем нижнее из с» значений температурь! диссоциации (Та), определенной для любого из зондов.

По окончании гибридизации фильтрь! промьівают три раза в течение 10 минут на качалке раствором 6 х 55 - 0,196 805 при комнатной температуре и промьівают от двух до трех раз раствором б х З5С - 195 505 при температуре гибридизации (487).

Ге! Авторадиографией фильтров вьфіявляют семь положительньїх клонов среди скринированньїх 200000 колоний.

Анализ начальной последовательности одного из мнимьїх кКДНК-клонов обезьянь! (обозначен как клон 83) ко проводят для проверки результатов путем видоизменения методики, описанной УмМаїІасе, еї аі!., Сепе, 16, рр. 21 - 26 (1981). Короче, ДНК-плазмиду из кДНК-клона 83 обезьяньі линеаризуют путем расщепления Есокі и 60 денатурируют посредством нагревания в ванне с кипящей водой. Нуклеотидную последовательность определяют дидеокси-способом, описанньм Запдег, еї аї!., Р.М.А.5. (0.5.А.), 74, рр. 5463 - 5467 (1977).

Набор из ЕРМ-смеси зондов, состоящих из 16 последовательностей, используют в качестве затравки для реакций последовательностей.

С. Определение кКДНК-последовательности ЕРО) обезьянь! 65 Анализ нуклеотидньїх последовательностей клона 83 осуществляют посредством методик, описанньх

Меззіпо, Меїййподз іп Епгутоіоду, 101, рр. 20 - 78 (1983). В таблице ІМ представлень! результать! анализа карть предварительного ограничения для ЕсокКіІ/Ніпа! клонированного фрагмента клона 83 с приблизительно 1600 парами оснований. Приближеннье местоположения участков распознавания ограничительньїх зндонуклеазньх ферментов вніражень!ї числом оснований 3 и участку Е. соїї в 5 конце фрагмента. Определение нуклеотидной последовательности осуществляют нахождением последовательности отдельньх ограничительньх фрагментов, с целью спаривания перекрьвающихся фрагментов. Например, перекрьвание информации последовательности, представленное анализом нуклеотидов в ограничительном фрагменте, обозначено С113 (ЗаийзЗА при «111/5та! при 324), а определение последовательности с обратньм порядком обозначено С7З (АЇші при «424/В8ЕЇЇ при 203).

Таблица їУ участок распознавания ограничительного фермента Приблизительноє нахождение (я)

ЄсоВІ 1

БвизА 11

БтвІ 180

ВЗЕЕ1І 205

Зкаї 32А

Краї зті вві 312

Віш ага

РВЕ А26 діш 430 нваї 1 д101 546

РБК 601

РІ вод сі 191 605 ді 782 о 2191 788

К881 792

РЕ 807 віч 81 (зе)

А1чІ 927 нсої заб |се)

Звизд 1014 со дії 1072 дів 1115 « лічі 1225

ВЗ 1301 ІС о) язаї 1343 я 1384 ніпотІЇ 1449 лі 1850 «

МніпатІ1ї 1585 З 70 Определение последовательности приблизительно 1342 пар оснований (в пределах области от участка 3 с заизА до участка ЕсокіІ и участка Ніпайї|ї) и анализ всех возможньїх систем считьівания способствуют развитию :з» ДНК и информации аминокислотной последовательности, представленной в Таблице М. В таблице мнимьй первоначальньїй аминокислотньїй остаток аминоконца созревшего ЕРО (как проверено путем корреляции ранее указанного анализа последовательности двадцати остатков аминоконцов) обозначен числом ї1. Присутствие сл 15 определяющего метионин АТС-кодона (обозначен -27), "направленного против течения" конечного аланинового остатка первоначального амина, как первого остатка, обозначенного для аминокислотной последовательности т. созревшего белка, является показателем правдоподобия того, что ЕРО первоначально вьіражен в цитоплазме в с форме предшественника, включающей "ведущую" область из 27 аминокислотньїх остатков, которая внірезаєтся до вхождения созревшего ЕРО в кровообращение. Участки потенциального гликозилирования в пределах (22) 50 полипептида обозначень! звездочками. Вьічисленньій молекулярньїй вес области трансляции составляет 21117 с» дальтон, а молекулярньй вес 165 остатков полипептида, составляющих созревший ЕРО обезьянь, равен 18236 дальтон.

Ф) іме) 60 б5

Таблица У

Трансляция кДНК ЕРО обезьяни

База

САТСССОоСССССССтТебАСАСССОСССТоТосСТосАСбСССстососстобссстоссс

СОСТСДАСТТССССССАТСДССАСТСССССТОТОСТСАССССССОССТАБСТСССТОАС

-27 -20

Меї біу Маї Ні бі Суз Рто А1в ТІр

ССАССССССССАСССССССАСАТО обо Сто САС о бАА тот сстТ бос тоб -10

Сеч Ттр Се Сец Се бег без Маї 5ег Ге Рто Ге біу Ме Рго сто тоб стт сто Сто тст сто ст тс сто сст сто об сто ссА -15:1 10

Маї бго біу діа Ргто Рго Дгу се 112 Суз дзр бет Агу Ма1ї Се стС ссСо бос сс сСсА ССА СОС сСтТС АТС ТСТ САС АбсС ссА ст сто 20 ж

СІ Аго Тут чеше бід АТа Суб біо А1а бі Азп ма) Твг Меє

САС АСС ТАС СТС о ТТо бАб бСС дАб САС бСС бАС АдТ сСТС АСС Ат зо ж 40 біу Суз Зег бі 5ег Суз бег їеу Аб5п бі дзп І1е ТнІ Уаї Рго

БОС ТСТ ТСС о бАА АС ТОоС дос ТтТо ДАТ САС ДАТ АТС дсС СТ ссА

Таблица У (продолжание) 50 азр таІ Суз Маії Авп Ріе Туг Аіа Тгтр уз Аго Меє Сі Маї Сіу бАС АСС о ддд Сстт АдС ттС ТАТ ССС тоб ААб АСб АТб бАб ТС боб во 70 біп біп діа Маї бі маї Тгр біп біу ес діа Се бе 5ег бі

САС Сас бсСТ СТА бдд бтсС тоб САС СоС сто ос сто СТ ТСА САдА во - діа маї Се дто біу біп діа Маї Се діа Азп 5ег 5ег біп Рто сст сто сто сбо бос сСАб осс сто тто осС дАС ТСтТ тТосС сАб СС с 90 100 рРне біс Рго (еу біп це нів Меї Ад5р уз діа Ії 5ег б3)у (Ге о

ТТС бАб ССС Сто САб Сто САС АТО САТ АдДА ССС дтС АСТ обС ст 110

Атго бег І1е ТНг Таг Ге Гео Дт Аїіа сем сіу Аїв біп бі діа

СОС АБС АТС АСС АСТ Сто стт Сб бсо Сто ббА ССС сСАб сАА бос 120 150 1126 5ег Ме Рго Азр діа діа бег діа Аїа Рго (ве Аг Тнтг І1е о зо АТС ТС Сто ССА бАТ особ ссСс тТСо ОСТ ОСТ ССА СТ САД дес тс 180 (Се)

Тит А1а Азр Тнг Рйе Суз Суз Ме РМе Ату Уві Туг 5ег Азп Рне

АСТ СТ БАС дСтТ ТТС ТоС Ада СтТС ТТС сСсА сСТС ТАС ТоС о ддт о ттТе

Таблица У (продолжанив) о «І 150 1в6а и мес Агу Сіу суб Ге Суб Се Тут Тртг біу 619 А1а Су АгО Аго 325 сте ее СбА Ал Сто дАс сто ТАС дСС боб баб бос ТоС Абб АбА ІФ) 165 біу Ар Аг ОР

СОС БАС ДСА ТСА ССАБСТОССТОСАВСТОБССАСАТССАССАССТОССТСАССААСА

СТОССТОТОССАСАСССТСССТСАССАСТОСССААССССАТССАВССОСТСТСАССТААС «

СОССАБССТОСТСССАТОСАСАСТССАСТОССАБСААТСАСАТСТСАССССССАСАССААС в с ТСТССАСАССАСАДСТСТСАСАТСТААССАТСТСОСАСССССААСТТСАССОСССАСАСС

АССАДОСАТТСАСАСАССАССТТТААДАСТСАССАССДСАСАСААТОСАСОСААДДАСАССТ

; - САССТСАСТССОССАССТОСАДААТТТСАТОСАССАСАСССТТТОБАСССААДТТТАССТо

ТТТТТССАССТАССАТСАСОСАСАССАТСАСТССАСААДСТТАССТСССАДОСТСТСАСТТ

СТСААССССТСАСОСССАСТСССТТССТОССААСАССССССТТСАСАСТСАСАСААТАТТ сл ТТОСАДТСТОССАССАССДДАААДТТАСССАСАССТТТТОСАССТТССАСССТАСТТСАСА

СТСТОСТОСССААССАССССССТАССССТОСАССТОССАТОССАСТСАСААСССТСАДСАС с» ДОСАТОобОоСоСстТеСсСсСТсСтТобттТСстТоСстТОбосСтТосСААССТТ ніаЗтІ (95) Полипептидная последовательность в Таблице М может бьїіть без труда подвергнута анализу на присутствие б 50 Чрезвьчайно гидрофильньх областей и/или вторичньх конформационньїх характеристик, являющихся показателем возможно очень иммуногенньїх областей, например, при помощи способов, предложенньйх Норр, еї

Фе а, Р.М.А.5. (О0.5.А. ), 78, рр. 3824 - 3828 (1981), и Кує, ей а). , 9. Мої. ВіоїЇ., 157, рр. 105 - 132 (1982), и/или Спои, еї аї., Віоспет., 13, рр. 222 - 245 (1974) и Айдмапсез іп Епгутоіоду, 47, рр. 45 - 47 (1978) . Компьютеризация анализа в соответствии со способом Норр, еї аіІ., возможна благодаря программе, обозначенной РЕР Кеїегепсе бБесіоп 6.7, представленной |ІпіейПдепеїйісв, Іпс., 124 МОпімегейу Амепие, Раїо о А, Саїйогпіа.

ПРИМЕР 4 ко А. Геномная библиотека человека

Геномную библиотеку фетальной печени человека, несущей фаг СНИ4А, полученную в соответствии с 60 методиками Гамп, еї аї., СеїЇ, 18, рр. 533 - 543 (1979), сохраняют для использования в исследований гибридизации бляшек.

В. Методики гибридизации бляшек для просеивания геномной библиотеки человека

Фаговье частицьії подвергают лизису и ДНК фиксируют на фильтрах (50000 бляшек на фильтр) в соответствии с методиками, описанньіми МУсо, Меїпоаз Іп Епгутоіоду, 68, рр. 389 - 395 (1979), за исключением 65 того, что использовали СепебЗсгееп Рів фильтрь! (Мем/ Епдіапа Мисіеаг Сагаіод МоМЕР-976) и МАМАМ чашки (масі, 5г; МасСіІ»-6НьЬоО, 2г; М2А-Амин А, 10г; дрожжевой зкстракт, 5г; кислоть! сазатіпо, 2г; мальтоза, 2г,; и агар, 15г на литр).

Вьісушеннье на воздухе фильтрь! обжигают при температуре 80"С в течение 1 часа и затем расщепляют протеиназой К, как описано в Примере 3, часть В. Предварительную гибридизацию осуществляют с

Мспользованием 1М Масі - 195 5О5-буфера при температуре 55"С в течение 4 часов или более, после чего буфер удаляют. Гибридизационнье и постгибридизационнье промьівки осуществляют, как описано в Примере 3, часть В. Применяют как смесь 128 20-тег зондов, обозначенньх ЕРУ, так и смесь 128 17-тег зондов Таблицьї

І (обозначена как смесь ЕРО). Гибридизацию осуществляют при температуре 487С с использованием смеси зондов ЕРМ. Гибридизацию с использованием смеси зондов ЕРО осуществляют при температуре 46"С, т.е. на 4 /о градуса ниже найменьшей вьічисленной Та для членов смеси. Удаление гибридизированньїх зондов для повторной гибридизации вьіполняют кипячением в 1 х З55С - 0,196 5О5 в течение двух минут. Авторадиография фильтров вьіявляет три положительньїх клона (активньїх с обеими смесями зондов) среди скринированньх 1500000 фаговьїх бляшек. Проверку положительньїх клонов на ЕРО-кодирование достигают посредством определения последовательности ДНК и злектронной микрографической визуализации гетеродуплексной 7/5 формации с кКДдНК обезьяньії Примера 3. Зта методика также дает доказательство присутствия кратньїх интронов в геномной ДНК-последовательности.

ПРИМЕР 5

Осуществляют анализ нуклеотидньїх последовательностей положительньїх клонов (обозначень! 7ПЕЇ), и результатьї, полученнье на сегодняшний день, приведень! в Таблице МІ.

Таблица МІ

ДАССТТСТССОСТТССАСАСССАССТАСТТТССОСАДСТСАССААСССАСССАТСТСТоАСТСТеСоСССА

АСАСССОбАТОССССССАССССАОСТОТСССООАССССАСССТТТСССАСАТАССАСССТОССССАСТССС

ААбССТОСССААССОССТОСАСТССССТОССССПВАСССАВСССССОСАССАБСССССАТСАСССАСАСОС

АСОТСТаСАССАСССССОСТСАСОСССССоСсСАСССТСАдСссАСоССТоСсТОССесТтостТеТвАсссссо с

СТОСССССТАССССТОБССАССССТСАСССАСАСАСССТСТСССССАСССССАСССССССАСОСАСАСАТО (8)

САСАТАДАСАСССССВАСССССССССАСАССССХАСАСТОССТоСОССАССССОСССоСТССССТОССбСсТе

СОССССАССССОСТСТССТОССбСАСССССАССССООССАССОСОСССХОСТСТоСТеСвАСАССОоСОоССС (зе)

СТТОСАСАСССОСССТСТССТСТАССССССТООСОСТОБСССТОСАССССССАССТТСССОССАТСАССХХ

-27 -24 І«о)

Меб біу МУа1ї нів

СССоСТСАССОБСОССССССААСТСОСТСАСССАССССССССААССоСССАЄ АТе боб сто САС с

СТОАСТАСТСССССССТОСОССОСТоССвОСОобССосстТтТсстоТТтсАСССоССсАТтТТАССОССССОССТ со

Таблица УІ (продолжение) «г

АТТССССААСАССТСССТОССТТСАДОСАССОСССАСТТСТСААССАССССобААССоСссАСсоСооТосо ю

ССАСССТССАССТОССОСОСОСАСТТССССБАСТТСТТОСССАТСССАДАДАССТОСССТОТТСАСССССА

САСТТТососттососАССАСстттсвосттстостотосасттететесттотсаАстетстоо (1.5.1

ТТССАСАСССАСАСАТСААТААСССАСАСССАССАССТОАСТОСТТССАТОСТТСССАСАССААОСАССАС

СТОБСССАСАСАССТОСССАТСДАБСДАССТОТССТТССАСАСССАСССТТСТоСССсССсссбостедеТСТ « -23 -20 скосстесстатстоттстао бла тт сет СОС то СТ тоб ТТ ТС ст ТС СТ 8 с це бет цво Рго (ву 91у цец Рго Мві Те су дІа Рго Рго дгд сеч це Су» сто тсо сто сст сто бос Сто сСсА СТС СтТС бос ССС ССА ССА СОС СТ АТС Тест и 10 20 т и - Азр бег Аго Уаї цем Сі Агу Тут це се Сі Аїа їу5 бі Аїа бі деп І12

СДС АБС СоА стТС СТО САС ДСС ТАС ст тТТо бАб ССС ААС САС ССС САС ДАТ АТС ти дсе СТСАСАССССТТССССАССАСАТТССАСАСААСТСАСОСТСАСОССТТСАСССААСТОСТОССАСАТ 1 ССАСОАДССТОССАСТТССТТТОСОСТОСАСТТОССАДОСТАСАСАСТОССССССТАСАТААСААТААСТС

Таблица МІ (продолжение)

ЧК»

ТОСТССССССАДАССАТАССТСАААСТАСССААССАССАДАСССАССАСАТССТАССССТСТоСОССАСбО 7 зо о тат біу Суз Аїа Січ

ССАБАСССТТСАБССАСССТТСАСТОСССССССТОТСТеСАТТТСАС АсСс СОС тот ссСТ САД (о) . 40 ні Суз бет Ге доп бі Азп 112 Тиг Ма1ї Рго Азр Тпг (ув Маї два Рпє Туг

Сас тТоС дес ТТ АДдТ САС ДАТ АТС АСТ стос ССА САС АСС ААА СТТ ААТ о ТТС ТАТ « ю» 50 55

А1в Тгр Гуз дк9 Меї 0619 бСС тоб ДАС АСб АТС САС СТСАСТТССТТТТТТТТТТТТТТТССТТТСТТТТОСАСААТСТСАТТ

ТОССАОССТОАТТТТОССАТОДДАСССАСААТСАТССОСССАДАССТААААТОСАССАССАСАСАТСАСССТ

25 СССТООССОСАСАСОСТСАССТСТАТААТСССАСССТСАСАТОССССАСАТОССАСААТТоСсТТсАССССТ (Ф) ССАСТЕТСАСАССАДССТАСССАВСАТАСТСДСАТСССССАТСТСТАСАДАСАТТТААДААААТТАСТСАС ке СТСААСТОСТССАТССТОСТАСТСССАСАТАТТТОСАДСССТОСАСССССВАССАТСССТТСАССССАССАА

ТТТОАСССТОСАСТСАССТСТОАТСАСАССАСТОСАСТССАСССТСАСТСАСАСАСТСАСССССТОТСТСА

60 б5

Таблица УІ (продолжаниа)

АДАДАСААДАСАДААДАСАДАДАТААТСАССОСТОТАТОСААТАСАТТСАТТАТТСАТТСАСТСАСТСАСТ

САСТСАТТСАТТСАТТСАТТСАТТСААСААСТСТТАТТОСАТАССТІСТОТТТОСТСАССТТеСсТоСТтоо

СОСТОСТСАСОСССАССАВОВАСАСССТСАСАТСОСТСАССТСОАСТСССАСАСТССАСТСССТОТАС

56 во 7

Ууаї біу біп біп А1іа Уаї біу уаї Тгр біб б1у їеу Аїа Ге Се 5ет бі дів

СТС боб САС САС СС о бТА САА СтсС тоб САб бос сто сс сто Сто ТСб бАА ост во

Маї цес Аго біу біп діа Сем Се Уаї доп Зег Зег біп Рго Тгр 619 РгО іїео стс сто соб бос Сас бсс сто тт стс о дАС о тст ТссС САС ссб тоб САС сес сто 100 710 біп це Ніз уаї Азр Гуз А1а Уаї бег біу їеч Аго ех їеу Трг Тиг Ге їв

САС СТО САТ СТО САТ ддд СС сто дст сбС Стт СОС дос СтТС АС АСТ сте СТ 110 115

Ату Аїа Ген біу діа біп соб ссСтТ Сто СА ССС САб СТСАСТАССДССССАСАСТТСТОСТТОСССТТТСТСТААСАДАОСССА

СААСССТСТТССТААССАСТАСАССААСТОТСССТАТТССТТСССТТТСТеТОССАСТОСАСССАССТОСТ 116 120

Гуз біо А1їа І16 5ег Рго Ртго Азр Діа ДІіа бетг Дів дів сттттстосТтТоосАС ААС САА ОСС АТС ТСС ССТ ССА САТ бсб бсс тсА ст ост

Таблица МІ (продолжение) 130 150

Рго Мем Агу Тиг ЇІ)1е Тнт діа дзр Тйг Ре го Гуз Се Рпе дго Маї Туг ех

ССА СТС ССд ДСА дДТС дСТ ССТ САС АСТ ТТ СОС АДА СТС ТТС СоА бтс ТАС тес 150 160 дзп РИе (ви Аго б1іу Муз це цуз (Се туг тпг біу бім А1в Суз дгуд ТІ біу

ДАТ тТТС Сто соб СА АС Сто АДС СТС тТдС АСА боб баб ОСС тТбС АС АСА боб 166 др дго ОР

САС ДСА ТА ССАССТОТОТССАССТОООСАТАТССАССАССТСССТСАССААСАТТОСТТСТСССАСА

СССТСССССоССАСТССТСААСССССТССАСОСОСТСТСАБСТСАСССССАСССТОТСССАТОСАСАСТСС

ДОТОССАССААТСАСАТСТСАСССОССАСАССДАСТСТССАСАСАССАДСТСТСАСАТСТААССАТСТСАС с

АСБОССАДСТТСААССССССаСАССАССЛАССАТТСАСАСАССАССТ ТТ АААСТСАСССАСАСАСССАТОС

ТОСОДАСАССССТОСДАССТСАСТССОССАСССТОСАДААТТТСАТОССАССАСАСССТТТОСАСОССАТТТАС о

СТОТТТТСОСАССТАССАТСАСССАСАССАТОАССТОСАСААСТТАССТОССААССТСТСАСТТСТССАСС

ТСТСАСССССАТССОСАСТОССТТОСТОСССААСАССССССТТОАСАССССССТОСТСССААССАТСААСАС со

АХСАТХОСООСТОСССТСТООСТСТСАТОСОСТССАДСТТТТСТСТАТТСТСААССТАТТСАСАСАСТСАА

АСАСВАТАТСАС Фо

В таблице МІ первоначальная непрерьівная ДНК-последовательность обозначаєт верхнюю нить 620 с оснований в том, что, по-видимому, является нетранслированной последовательностью, немедленно предшествующей транслированной части гена ЕРО человека. Более конкретно, последовательность содержит - зв З-КОНец гена, которьій ведет к транслированной области ДНК, кодирующей первье четьіре аминокислоть! (от ю -27 до -24) последовательности-лидера ("пре-последовательность"). Четьюре парь оснований в последовательности, предшествующей последней, кодируют начало лидера, однако, еще не определень однозначно и позтому обозначень "Х". Затем следует интрон из приблизительно 639 пар оснований (из которьйх у 439 пар оснований определена последовательность, а оставшиеся 200 пар оснований обозначень "1.5.7, « немедленно предшествуя кодону для глутамина, которьій обозначен как остаток -23 транслированного з с полипептида. Следующая немедленно зкзон-последовательность кодирует аминокислотнье остатки через аланиновьій остаток (обозначенньй как остаток ї-1 аминокислотной последовательности созревшего ЕРО ів - - а человека) до кодона, определяющего треонин в положений 26, после чего следует второй интрон, состоящий из 256 оснований, как специфически и обозначено. Следующая за зтим интроном зкзон-последовательность для аминокислотньїх остатков 27 - 55 продолжается третьим интроном, содержащим 612 пар оснований. с Последующий зкзон кодирует остатки 56 - 115 ЕРО человека, затем идет четвертьій нитрон из 134 пар оснований, которьій продолжаєется зкзоном, кодирующим остатки 116 - 166 и кодон "остановки" (ТА). Наконец, ве в Таблице МІ идентифицируется последовательность 568 пар оснований в том, что составляет 2) нетранслированную область 3 гена ЕРО человека, две парьі оснований которой ("Х") еще не определень 5р однозначно на последовательность.

Ме, Таблица МІ служит для идентификации первичной структурной конформации (аминокислотной 4) последовательности) созревшего ЕРО человека, включающей 166 установленньїх аминокислотньїх остатков (с вьічисленньім молекулярньїм весом - 18399). В Таблице также вніявлена ДНК-последовательность, кодирующая последовательность-лидер из 27 остатков вместе с ДНК-последовательностью 5 и 3, которье могут бьть важньми для функций промотора/оператора, осуществляемьх генньім опероном. Участки для потенциального гликозилирования полипептида созревшего ЕРО человека обозначеньі в Таблице звездочками. Необходимо (Ф, отметить, что специфическая аминокислотная последовательность в Таблице МІ, вероятно, составляет ка последовательность встречающейся в природе аллельной формь! зритропозтина человека. Основание для такого положения найдено в результатах непрерьівньїх попьіток определения последовательностей мочевьсх бо Мзолятов зритропозтина человека, которье позволили располагать информацией относительно того, что значительное количество молекул зритропозтина имеют метионин в остатке 126 в противоположность серину, как показано в Таблице.

Таблица МІ, ниже, иллюстрирует степень гомологий полипептидной последовательности между ЕРО человека и обезьянь. В верхней непрерьвной линии Таблиць буквеннье обозначения применень! для 65 представления дедуцированньїх транслированньх последовательностей ЕРО человека, начиная с остатка -27, а нижняя непрерьівная линия показьівает дедуцированную полипептидную последовательность ЕРО обезьянь,

начиная от числа -27, обозначающего остаток. Звездочки применяются для вьіделения гомологии последовательностей. Следует отметить, что дедуцированнье последовательности ЕРО человека и обезьянь ввІяЯВвляют "дополнительньй" остаток лизина (К) в положений 116 (для человека). Ссьілка к Таблице МІ означаєт, й что зтот остаток находится на краю мнимого мРНК-соединения в геномной последовательности. Присутствие остатка лизина в полипептидной последовательности человека проверяют путем определения последовательности клона кКДНК человека, полученной из мРНК, вьіделенной из клеток СО5-1, которье трансформировань с геномной ДНК человека в Примере 7, ниже.

Таблица УТІ

Сравнение полипептидов ЕРО человека и обезьянн -20 -10 «1 10 20 зо Го) 79 Человек МОМНЕСРАМІ МІ. О.І РІБІРМІ.САРРВІІСОЗАМЕ ЕМ С ЕАКЕАЕМІТ ТОСАЄНСЗІМЕМІТМРОТК жк ЕКижкикижижж жкжЖжжжжЕ ЖКЖККижККкКжКККЕжКККжккий Кк ка й века кавивих

Обезьяна МОУНЕСРАМІМІ ЦІ.5І.М5ІРІСІ РУРСАРРЕСІСОЗАМІ ЕМ СЕАКЕДЕМУТМОСЗЕ5СЗІМЕМІТМУРОТК 50 6о 70 во 90 100 110

Человек УМЕХАМКАМЕУСОДФАМЕММОСТЬ АТГІ. ЗЕАМІ КСОДІ І. УМЗ5ОРМЕРІОЇ НМОКАУБСІАЗСТТ А САКЕ жк КИККЕКККЖКЕЖЖККЖЖЖЕКЖЕ Ж ЖжЖЕКЖЖ ЖжЖИЖжЕж ЖЖ жижеж кжавижжеиж Кк

Обезьяна МУМЕУХАМКАМЕМСОДАМЕМУМОВІ А ЗЕАМІ АСОАМІАМЗ5ОРРЕРІ ОЇ НМОКАІ5СІ БІТ ВА САО-є 120 130 180 150 160 с

Человек АтТ5РРОДАБААРІНТІТАОТЕНКІАМУ5МРІ АСК КІ УТСЕАДСАТСОН жЖжж ККЕКЖЖЕКЖЕКЕКЖЕКА ЖЕЖЖЖКЖЖжЖежЕЖККЖжКкжкжКК ЖЖ о

Обезьяна ДІБІ РОДАЗАДРІ ЯТІТАОТЕСКІ ЕВМУ5МЕІ ВОК КІ УТ СЕАсСААСсОоВ

ПРИМЕР 6

При первоначальньх попьтках микробиологического синтеза изолируемьх количеств зритропозтина полипептидного материала, кодируемого КДНК обезьяньі, получаемого по методике примера 3, вьібранная со система зкспрессии представляет собой систему, содержащую клетки-хозяева млекопитающего (например, клетки СО5-1, А.Т.С.С., МоСкКІ -1650). Указаннье клетки осуществляют трансфекцию посредством "челночного" і вектора, обладающего способностью к спонтанной репликации в хозяине Е. соїї (благодаря присутствию со

ДНК-производньїх от плазмид рВК322) и хозяевах млекопитающих (благодаря присутствию ДНК-производньмх от вирусов 5М40). З

Более конкретно, вектор зкспрессии строят в соответствий со следующими методиками. Клон плазмид 83, Іо) полученньй в примере З, амплифицируют в бактерии Е. соїї и при расщеплений ЕсокіІ и Ніпай вьіделяют приблизительно 1,4 т.п.н. ДНК обезьяньії, коюодирующую зритропозтин. Из плазмидь! рРВК322 отдельно вьіделяют 4,0 т.п.н. фрагмента Ніпаїп/заїІ. Из ДНК, содержащей повторьї МіЗтр10 КЕ ДНК (Р и Г. лаборатории), получают « около 30 пар оснований фрагмента "линкера" Есокі/ЗаїЇ. Указанньй "линкер" включаєт последовательно ЕсоКі-липкий конец, за которьім следуют участки распознавания 55іЇ, Зтаї, Ватні и Хваї и липкий конец заї. - с Указаннье вьіше три фрагмента сшивают с получением примерно 5,4 т.п.н. промежуточной плазмидь ("РЕКЗ"), а ЕРО-ДНК которой граничит с одной стороной при использовании "банк' полезньїх участков ограничения "» распознавания зндонуклеазь. После зтого плазмиду рЕКЗ расщепляют НіпампйШ и Ба с получением зритропозтина ДНК и трансформацией Есокі в "линкер" ЗаїІ (МІЗтр10). Указанньій вьіше фрагмент ДНК длиной 1,4 т.п.н, сшивают с участком ВатнНі/За! приблизительно длиной 4,0 т.п.н.. плазмидьї рВК322 и другим 1 "линкером" фрагмента М1Зтр10 Ніпа!Пп/Ватні КЕ, имеющий также приблизительно 30 пар оснований. Фрагмент 1» "линкера" М13 представляет собой НіпаП-липкий конец, после чего следуют участки узнавания Рзїї, заї!, Хбаї и липкий конец ВатнНі. Продуктом сшивки вновь становится полезная промежуточная плазмида ("РВК-ЕРО"), (95) содержащая ЕРО-ДНК, которая ограничена с обеих сторон "накопленньіми рядами" ограничительного участка. б 50 Вьібранньїй для зкспрессий ЕРО-ДНК в клетках СО5-1 ("РрОБМІ 1") вектор строят заранее для возможности осуществления отбора и аутодупликации в Е. соїї. Указанньїх характеристик достигают за счет начала сю» репликации и порядка следований генов ДНК, стойких к действию ампициллина, которье присутствуют в области, осуществляющей стягивание нуклеотидов 2448 до 4362 плазмидьй рВК322. Указанньй порядок следования структурно модифицируют посредством введения "линкера", обеспечивающего распознавание

Ніпацй сразу же при примькании нуклеотида 2448 до включения в указанньій вектор. Наряду с подбором векторов для зкспрессим ЕРО-ДНК к другим полезньім свойствам относятся способность к аутодупликации в о клетках СО5-1 и наличие последовательности, действующей как вирусньій промотор в клетках млекопитающих. іме) Указанньх характеристик достигают посредством начала порядка следования ДНК-репликациий и последовательности "позднего" гена ДНК, являющегося вирусньім усилителем, которьій присутствует в цепи, 60 содержащей 342 парьі оснований, стягивающую число нуклеотидов от 5171 до 270 генома 5М40. Уникальньй ограничительньйй участок (Ватні) образуется на векторе и сразу же примьїкаєт к ряду вирусного промотора благодаря использованию коммерчески доступной последовательности "линкера" (СоПарогаїйме Кезеагсп).

Дополнительно в вектор вводят последовательность 237 пар оснований (производная как нуклеотидное число от 2553 до 2770 вируса ЗМ40), содержащий сигнал полиаденилирования "позднего гена" вирусной меНК 65 (обьічно известньй как терминатор транскрипции). Указанньій фрагмент располагают в векторе в соответствующей ориентации относительно вирусного промотора "позднего гена" через уникальньій участок

Ватні. В указанном векторе также представлен другой ген млекопитающего, находящийся в положениий не материальном относительно возможной транскрипции гена, которьій помещен на указанном уникальном участке между последовательностями вирусного промотора и терминатора. (Указанньій ген млекопитающего содержал

В себе приблизительно 2500 пар оснований дигидрофолатредуктазь! (ОНЕК)-минигена мьіши, вьіделенного из плазмидьі рМоО-1, (заззег, еї а. Р.М.А.5. (0.5.А.), 79, рр. 6522 - 6526, (1982)) МИ опять большинство действующих компонентов плазмидьі! РОЗМІ 1 состоит из 2448 - 4362 нуклеотидов плазмидь! рВК322 наряду с нуклеотидами 5171 - 270 (342 парьі оснований) и 2553 - 2770 (237 пар оснований) вирусной ДНК, содержащей вирус 5М40. 70 В соответствии с методиками, описанньіми ранее, например, Мапіаїйів, ег аї., вьіше, зритропозтин-кодирующую ДНК вьіделяют из плазмидьії РВК-ЕРО в качестве фрагмента Ватні и вшивают в плазмиду РОЗМІ 1, виірезанную Ватні. Для удостоверения введения ЕРО-гена в правильной ориентации в двух из полученньїх клонированньїх векторов (дуплицированньсе векторь! Н и І) проводят анализ с использованием ограничительного фермента (см. фиг.2, иллюстрирующую плазмиду рОЗМІ 1-МКЕ. Векторьї с неправильной /5 ориентацией ЕРО-генов оставляют в качестве регуляторов отрицательньх величин в зкспериментах трансфекции, предназначенньїх для определения »уровней зкспрессии ЕРО в хозяевах, которье трансформируются посредством векторов с правильной ориентацией ЕРО-ДНК.

Векторь Н, І, Е, Х и б обьєдиняют с носителем ДНК (ДНК печени и селезенки мьіши). Для осуществления трансфекции используют дуплетнье бомм пластинки, используя методь! микроосаждения фосфатом кальция. Дулликатнье бОмм пластинки также трансфектируют ДНК-носителем в качестве "имитации" управления трансформацией негативньїх величин. Через 5 дней всю культуральную среду подвергают испьітанию на присутствие полипептидов, которне обладают иммунологическими свойствами зритропозтина природного происхождения.

ПРИМЕР 7 с

А. Система зкспрессии исходного ЕРО с использованием клеток СО5-1

Вьібранная на первоначальном зтапе микробиологического синтеза подвергаемьїх вьіделению количеств і) полипептидного материала зритропозтина человека, кодируемого посредством ЕРО-клона геномной ДНК человека, система также включает в себя зкспрессию в клетках-хозяевах млекопитающих (например, клетки

Со5-1, А.Т.С.С. МоСКІ-1650). ЕРО-ген человека первоначально субклонируют в "Челночньій" вектор, которьй с зо обладает способностью к автономной репликации в обоих хозяевах бактерий Е. сої! (благодаря

ДНК-производной от плазмидь! рВК322) и в клетке линий СО5-1 млекопитающего (благодаря наличию вируса ісе)

ЗМ-40 вирус-производньїх ДНК). Челночньій вектор, содержащий ЕРО-ген затем трансфектируют в клетки с

Со5-1. ЕРО-полипептидньій материал образуется в трансфектированньїх клетках и вьіделяется в клеточную культуральную среду. -

Более конкретно, вектор зкспрессии признаков строят в соответствии со следующими методиками. ДНК, ю вьіделенная из клона ЛЛЕ! барашка, содержащего геномньйй ЕРО-ген, расщепляют Ватні и Ніпайі ограничительньїх зндонуклеаз и вьіделяют 5,6 т.п.н. ДНК-фрагмента, как обнаружено, содержащего полньй

ЕРО-ген. Указанньій фрагмент ДНК смешивают и сшивают с бактериальной плазмидой рисв8 (ВейПезаа

Кезеагсі І арогайогіев, Іпс.), которую аналогичньм образом расщепляют, создавая промежуточную плазмиду « 40. "рОС8-Ниє", образуя, таким образом, подходящий источник ограничивающего фрагмента. шщ с Вьібранньєе векторь!ї для зкспрессий ЕРО-ДНК в клетках СО5-1 строят заранее. Плазмида ремМ4зЕї, которая й содержит ДНК-последовательности, дает возможность вьбора и аутодупликации в ЕЕ. соїї. Указанньх "» характеристик достигают началом возникновения репликации и порядком следования гена ДНК, устойчивого к ампициллину, которьій присутствует в области, стягивающей нуклеотидь от 2448 до 4362 бактериальной плазмидьі рВК322. Изменяют структуру указанной последовательности путем введения линкера, обеспечивая сл участок распознавания Ніпаї! сразу же при прилеганий к нуклеотиду 2448. Плазмида ромМ45Еї также способна к аутодупликации в клетках СО5-1. Указанной характеристики достигают посредством использования фрагмента ть 342 пар оснований, содержащего вирусное начало репликации с помощью вируса 5М40 (количество

Ге) нуклеотидов от 5171 до 270). Указанньій фрагмент модифицируют при введений линкера, которьій обеспечиваєт 5р участок распознавания ЕсоКІ, прилегающий к нуклеотиду 270, и линкера, обеспечивающего участок

Фо распознавания заїЇ, примькающий к нуклеотиду 5171. В данном векторе также присутствует фрагмент 1061 се» парьі оснований вируса ЗМ40 (число нуклеотидов от 1711 до 2772 с дополнительньім линкером, которьй обеспечивает участок распознавания зЗаїЇ, прилегая к следующему нуклеотиду 2772). В пределах указанного фрагмента имеется уникальная последовательность распознавания Ватні. Суммируя вьішесказанное, плазмида ремМАЗЕЇ содержит в себе уникальнье участки распознавания Ватні и Ніпаїї, давая возможность введения гена ЕРО человека. Указаннье последовательности дают возможность осуществления репликации и іФ) избирательного отбора в Е. соїї и репликации в клетках СО5-1. ко Для введения ЕРО-гена в плазмиду рОМ45ЕїЇ, плазмиду рОС8-НиЄ расщепляют Ватні и Ніпаїй до ограничивающей зндонуклеазьі и вьіделяют 5,6 т.п.н. ЕРО, кодирующего ДНК фрагмента. Плазмиду раем4ЗзЕїЇ бо также расщепляют Ватні и Ніпай и основную часть фрагмента, содержащую 2513 пар оснований, вьбіделяют (сохраняя при зтом все необходимье функции). Указаннье фрагментьіь смешивают и сшивают, образуя конечньій вектор "РЗМОНИиЕРО" (см. фиг.3). Зтот вектор разводят в Е. соїї, а вектор ДНК вьіделяют. Для подтверждения ввода ЕРО-гена проводят анализ ограничительного фермента.

ДНК плазмидьь реМаНиЕєЕРО используют для вьіражения признаков ЕРО-полипептидного материала в 65 Кклетках СО5-1. Детально излагая, ДНК плазмидьї РЗУМОНиЕРО обьединяют с ДНК-носителем и трансфектируют в трипликатнье бОмм пластинки клеток СО5-1. В качестве контроля ДНК носитель один трансфектируют в клетках СО5-1. Клеточную культуральную среду отбирают спустя 5 и 7 дней и подвергают испьітанию на присутствие полипептидов, которьше обладают иммунологическими свойствами, характерньми для встречающегося в природе ЕРО человека.

В. Вторая система зкспрессии признаков ЕРО в клетках СО5-1.

Еще одну систему зкспрессийи применяют для получения улучшенньїх продуктов человеческого зритропозтин-полипептидного материала, кодируемого с помощью клона геномной ДНК человека, образующей

ЕРО в клетках СО5-1 (А.Т.С.С. МОСТІ -1650).

В предшествующей системе признаки ЕРО вьражают в клетках СО5-1 с использованием своего 7/0 собственного промотора, которьій присутствует в пределах ограничительного фрагмента Ватні относительно

НіпайШ, имеющего длину 5,6 т.пл.н. В следующем построений ЕРО-ген чередуют с получением зкспрессийи признаков, используя поздний промотор вируса 5М40.

Более конкретно, ограничительньій фрагмент геномного ЕРО человека, представляющий клонированньй 5,6 т.п.н. Ватні относительно НіпаїїЇ модифицируют в соответствии со следующей методикой. Как описьівается /5 Вьіше, плазмиду рОС8-НиЕ расщепляют Ватні и ограничительной зндонуклеазой Вз5іЕЇЇ. Ограничительная зндонуклеаза ВвіЕЇЇ расщепляет в пределах 5,6 т.п.н. ЕРО-ген в положенийи, которое представляет 44 парь оснований 5 до инициирующих АТО, кодируя предшественник-пептид и примерно 680 пар оснований 3 до ограничительного участка Ніпаї. Затем вьіделяют фрагмент, включающий приблизительно 4900 пар оснований.

Фрагмент ДНК с синтетическим линкером, содержащий ЗаїЇ и Вз8еїЕїЇ липкие концьй и внутренний участок 2о распознавания Ватні, подвергают синтезу и очистке. Указаннье два фрагмента смешивают и сшивают с плазмидой рВКЗ322, которую вьірезают с помощью За и ВатНі для получения промежуточной плазмидь!

РВЕКОНЕ. Геномньй ген ЕРО человека можно вьіделить из нее в виде фрагмента расщепления Ватні с 4900 пар оснований, несущего полную структуру гена с одиночной АТО 44 парьі оснований 3 относительно участка

Ватні, прилегающего к области окончания кодирования аминогрупп. с

Полученньій фрагмент вьіделяют и вводят как фрагмент Ватні в плазмиду РОЗМІ 1 расщепленного вектора зкспрессии Ватні (см. пример 6). Получающуюся в результате зтого плазмиду ром 90НиЕРО, как показано на і) фиг.4, используют для вьіражения признаков ЕРО полипептидного материала из клеток СО5-1, как описано в примерах б и 7А.

ПРИМЕР 8 со зо Культуральную среду, виіращенную из 6 трансфектированньїх культур клеток СО5-1 примера 6, анализируют с помощью радисиммунологического анализа согласно методике, изложенной в примере 2, часть В. Каждьй ікс, образец анализируют при значениях аликвотной пробь! 250, 125, 50 и 25мкл. Надосадочнье слои из роста с клеток, "имитационно" трансфектированньїх или трансфектированньїх с помощью векторов с неправильной ориентацией генов ЕРО, имели отрицательнье значения на иммунореактивность. Для каждого образца двух - зв надосадочньїх слоев жидкости, полученньїх из роста клеток СбОо5-1, трансфектированьїх векторами (Н и І) с ю правильной ориентацией ДНК ЕРО, 95 ингибирования 729І-ЕРО, связанного с антителом, колебался в пределах от 72 до 8895, все значения которьїх размещень в верхнем положении стандартной кривой. Позтому нельзя точно рассчитать истинную концентрацию зритропозтина в плавающих слоях культурьі. Попредварительньм « расчетам она составляла 300 тИ/мл, однако, вьіполненньім при значениях самой большой аликвотной пробь (250Ммкл). - с Образец культуральной жидкости, полученной согласно примеру б, и 5 и 7-дневнье культуральнье й жидкости, описаннье в примере 7А, подвергали радисиммунологическому анализу для сравнения активности "» рекомбинантньїх ЕРО-материалов обезьяньії и человека относительно встречающегося в природе ЕРО человека, отвечающего стандарту. Полученнье результатьь представлень в графической форме на фиг.1. Короче говоря, представленнье результатьь неожиданно показали, что рекомбинантньй ЕРО обезьянь с существенно конкурентен для антитела анти-ЕРО человека, хотя не удалось полностью ингибировать связующее в условиях испьтания. Максимальньй 90 значений ингибирования для рекомбинантного ве зритропозтина человека, тем не менее, почти приближается к стандартньм показателям. Параллельньй о характер кривой доза-зффект предполагает иммунологическую идентичность последовательностей (зпитопов) в общем. Перед вьіполнением расчетов концентрациий ЕРО обезьяньй в культуральньх жидкостях бьли б проведень! повторнье оценки при указанньїх вьісоких значениях разведения и бьло обнаружено, что они с» колебались в интервале от 2,91 до 3,12 О/мл. Вьічисленнье уровни продуцирования ЕРО человека установлень соответственно при значениях 392 тШ/мл для образца с 5-дневньимм ростом и 567 тШ/мл для образца с семидневньм ростом. Расчетнье уровни продуцирования ЕРО обезьяньі в примере 7В системь! зкспрессийи бьли аналогичньми или лучшими.

ПРИМЕР 9

Ф, Культуральнье жидкости, полученнье согласно примерам б и 7, подвергали анализу іп мйго для ко определения активности ЕРО в соответствии с методикой Соіфмаззег, еї аІ., Епдосгіпоіоду, 97, 2, рр. 315 - 323 (1975). Вьічисленнье значения ЕРО обезьяньй для испьітуемьїх культуральньїх жидкостей колебались в бо пределах от 3,2 до 4,3 О/мл. Культуральнье жидкости ЕРО человека также проявляли активность в полученньйх расчетах при анализе іп мйго и, кроме того, указанную активность можно нейтрализовать под действием антитела "анти-ЕРО". Культуральнье жидкости рекомбинантного ЕРО обезьянь! по примеру 6 также подвергали количественному определению іп мімо биологической активности согласно общему методу Соїез, еї аї., Майиге, 191, рр. 1065 - 1067 (1961), и Наттопа, еї аіЇ., Апп. М.У. Асайд. зЗсі., 149, рр. 516 - 527 (1968). Указаннье 65 уровни активности колебались от 0,94 до 1,24 О/мл.

ПРИМЕР 10

В предьдущих примерах рекомбинантньйй ЕРО-материал человека или обезьяньі получают от векторов, которье используются для трансфектирования клеток СО5-1. Указаннье векторьї осуществляют репликацию в клетках СО5-1 благодаря присутствию Т-антигена вируса 5ЗМ40 внутри клетки начала возникновения

Депликации ЗМ40 на указанньїх векторах. Хотя полученнье векторь! воспроизводят полезнье качества ЕРО в клетках СО5-1, их вьіраженность является только временной (в течение 7 - 14 дней) из-за возможньїх потерь вектора. Кроме того, только незначительньй 956 воспроизведений СО5-1 становится продуктивно трансфектированньм указанньми векторами. Настоящий пример описьівает системь! зкспрессии признаков, использующих клетки ЮОНЕК яичника китайского хомячка (СНО) и селектируемьй маркер, ОНЕК. |Для 70 обсуждения родственньх систем зкспрессии см. патент США Мо4399216 и заявки на вьідачу Европейского патента Мо117058, 117059 и 117060, опубликованньсе 29 августа 1984Гг).

В клетках СНО ОНЕК (Бих-ВІ) СНО Кт, Опацйб, еї аїЇ.,, Ргос. Маї. Асай. Зсі. (О0О.5.А.), Мої. 77, 4461 (1980), не хватает фермент дигидрофолатредуктазь! (ОНЕК) из-за мутаций, происходящих в структурньх генах, и, следовательно, необходимо наличие глицина, гипоксантина и тимидина в культуральной среде. Плазмидь! рОБМІ-МКЕ (пример 6) или рОБМІ --НОЕРО (пример 7В) трансфектируют вместе с ДНК носителем в ОНЕК:" клетки СНО, которье вьіращивают в среде, содержащей гипоксантин, тимидин и глицин в бОмм культуральньмх пластинах. Плазмиду РМОНиЕРО (пример 7А) смешивают с плазмидой рМо2, содержащей ген мьіши на основе дигидрофолатредуктазьі!, клонированньй в вектор бактериальной плазмидьі! рВК322 (по Савгзег, еї аї., вьіше).

Смесь плазмид и ДНК носителя трансфектируют в клетки ОНЕК" СНО. (Клетки, которье захватьшвают одну плазмиду, обьічно также захватят вторую плазмиду). Через З дня полученнье клетки диспергируют посредством трипсинизирования на нескольких 100мм культуральньїх пластинах в среде, в которой не хватает гипоксантина и тимидина. Только те клетки, которье трансформируются в устойчивое состояние, посредством гена ОНЕК, проявляют вьїживание в данной среде гена ЕРО. Через 7 - 21 день становятся видньі! колониий живущих клеток.

Указаннье колонии трансформантов после диспергирования путем трипсинизирования могут непрерьівно с размножаться в среде с недостаточностью гипоксантина и тимидина, создавая нове штаммь! клеток о (например, СНО рОБМІ-МКЕРО, СНО реМаниєЕРО, СНО роБМІ -9НиЕРО).

Культуральнье жидкости, полученнье из вьшеуказанньх клеточньїх штаммов, подвергают радисиммунологическому анализу на наличие рекомбинантного ЕРО обезьяньй или человека. Среда для штаммов СНО роОзМІ-МКЕРО содержит ЕРО с такими же иммунологическими свойствами, как и ЕРО, со полученньй из клеток СО5-1, трансфектированньїх плазмидой рОЗМІ -МКЕРО. Образец культуральной жидкости «со с 65-часовой вьідержкой содержит 0,60 О/мл ЕРО обезьянь.

Культуральнье жидкости, полученнье из СНО р5МОНИЕРО и СНО рорамі-ЯниЕРО, содержат рекомбинантньй ЕРО человека, обладающий такими же иммунологическими свойствами, как и ЕРО, « полученньй из клеток СО5-1, трансфектированньїх плазмидой реМаНиЕєРО или рОБМІ-9НиЕРО. Образец культуральной жидкости с З-дневной вьідержкой, полученньій из СНО р5МОоНиЕРО, содержит 2,99 /мл ЕРО М человека, а образец с 5,5-дневной вьідержкой, полученньій из СНО рОБМІ -ЯОНИЕ РО, содержит 18,2 О/мл ЕРО человека, как показьівают результатьї радисиммунологического анализа.

Качество ЕРО, получаемого посредством вьшеуказанньїх штаммов клеток, можно повьсить за счет « усиления генов, создавая новье штаммь! клеток, обладающие большей зффективностью. Фермент дигидрофолатредуктазьі! (ОНЕК), которьій представляет собой продукт, кодируемьй геном ОНЕК, может бьть т с ингибирован с помощью метотрексата (МТХ). В частности, клетки, размножаемье в среде с недостаточностью в гипоксантина и тимидина, ингибируются или убиваются метотрексатом. В соответствующих условиях ни (например, при минимальной концентрации МТХ) можно получить клетки, устойчивье и способнье к росту в

МТХ. Обнаружено, что указаннье клетки становятся устойчивьми к МТХ благодаря усилению ряда их ОНЕК генов, в результате чего повьішаєтся продуцированиг ОНЕК фермента. Живущие клетки можно, в свою о очередь, обработать повьішенньми концентрациями метотрексата, в результате чего в штаммах клетки їз увеличиваєтся количество генов ЮОНЕК. "Мимолетнье гень (например, ЕРО), переносимье на вектор зкспрессии вместе с геном ОНЕК или трансформируемьсе с ним, как часто обнаруживается, повьішают число о своих воспроизведений. б 20 В качестве примера практической реализации системьї амплификации штамм клетки СНО розМІ-МКЕ обрабатьшают метотрексатом путем повьшения его концентраций (ОНМ, ЗОНМ и ЛООнНМ). Образць, с» представляющие бб-часовую среду культивирования на каждом зтапе амплификации, по данньм радисиммунологического анализа содержат 0,60, 2,45 и 6,10 Ш/мл зритропозтина, соответственно. Штамм клеток СНО роОБМІ-д9НиЕРО подвергают обработке метотрексатом (МІХ) с серийньїмм повьшением его концентраций: ЗОНМ, 5ОнНМ, 10ОнНМ, 20ОнНМ, їмкМ и 5мкМ. Образец, представляющий 3-дневную надосадочную

Ге! жидкость, на зтапе его обработки метотрексатом (МІХ) с концентрацией ЛО0нНМ содержит по данньм радисиммунологического анализа 3089 ж 129 МО/мл зритропозтина человека. Образцьі, представляющие де 48-ч-асовую культуральную среду, обработаннье метотрексатом с концентрацией ТО0ОНМ и 1мкМ, содержат по данньм радисиммунологического анализа 46б и 1352 ОМ/мл озритропозтина человека, соответственно 60 (усредненное число, полученное в результате З-разового испьітания образцов). По указанной методике в бОмм чашки Петри, содержащие 5мл средь, вьсевают по 1 х 109 клеток. Спустя 24 часа среду удаляют, заменяя ее на бБмл свежей средьі, в которой отсутствует сьіворотка (ОМЕМ с вьісоким содержанием глюкозьі, в которую дополнительно добавляют 0,1нМ не-основньїх аминокислот и І-глутамин. Зритропозтину дают возможность накапливаться в течение 48 часов в среде, не содержащей сьіворотки. Затем среду собирают для испьттания бо посредством радисиммунологического анализа, а клетки трипсинизируют и затем подсчитьвают. Средние значения образцов в результате радисиммунологического анализа составляют порядка 467 и 1352 МО/мл зритропозтина для клеток, вьіращенньїх при обработке метотрексатом с концентрацией ТО0НМ и мкм, соответственно, обеспечивают фактический вьїход зритропозтина порядка 2335 и 6750 у на чашку. Среднее

Количество клеток на чашку составляеєт 1,94 х 106 и 3,12 х 109 клеток, соответственно. Таким образом, скорость зффективного продуцирования в указанньїх условиях культивирования имеет значения 1264 и 2167 010. 5 клеток за 48 часов.

Описаннье вьіше клеточнье культурь! представляет собой генетически разнородную популяцию. С целью вьіделений генетически неоднородньїх клонов, обладающих наийвьісшей способностью к продуцированию, 70 Мспользуют стандартнье методьі отбора (см. раздел А, часть 2 "Роіпів Ю Сопвідег іп (пе СВагасіегігайоп ої

СеїЇ Гіпез Овей (о Ргодисе Віоіодіев", 1 июня 1984г, Отдел по научной проверке биопрепаратов, Центр по лекарственньїм и биопрепаратам, Управление по пищевь/м и лекарственньім продуктам США.

Описанную вьіше продуктивность линий клеток СНО, продуцирующих зритропозтин, можно улучшить при использований соответствующих методик культивирования клеток. Размножение клеток млекопитающих 75 Животньїх в культуральной среде обьічно требует наличия сьіворотки в ростовой среде. Способ получения зритропозтина из клеток СНО в бессьівороточной среде в значительной степени облегчает ректгификацию зритропозтина из культуральной средьі. Описьмшваемьй ниже способ дает возможность зкономного получения зритропозтина в больших количествах в бессьівороточной среде, достаточньїх для производства.

Клетки линимй СНО рОБМІ-Я9НиЕРО, вьіращеннье в стандартньїх условиях культивирования клеток, для 2о посева используют флаконьі с перевиваемой клеточной культурой. Указаннье клетки размножаются в виде суспензионной клеточной линии во флаконах, содержащих перевиваемую клеточную культуру, в среде, которая состоит из 50 : 50 смеси ЮОМЕМ с вьісоким содержанием глюкозьі и Е12 Нат, в которую дополнительно добавлено 595 сфетальной бьчьей сьіворотки (БС5), І-глутамин, пенициллин и стрептомицин, 0,О05нМ не-основньїх аминокислот и метотрексат с соответствующей концентрацией. Клеточнье культурь в виде су суспензии дают возможность для бьістрого размножения до больших обьемов зритропозтину, полпучающемуся из клеток СНО. Клетки СНО, вьіращиваемьсе в суспензии, используют для их посева во вращающиеся сосудь! і9) при первоначальной плотности засевания 1,5 х 10" жизнеспособньїх клеток на 850см? указанного сосуда, содержащего 200мл средьі. В течение З-дневного периода указанньм клеткам дают возможность для раста до образования монослоя относительно плотно прилегающей линии клеток. Применяемая в данной фазе роста Го) клеток среда аналогична среде, используемой для культивирования клеток в суспензии. К концу З-дневного периода роста клеток среду, содержащую сьіворотку, отделяют и заменяют ее на 100мл бессьівороточной і средьі. Бессьівороточная среда содержит 50 : 50 смеси ОМЕМ с вьісоким содержанием глюкозьі и Е12 Нат, в Гео) которую дополнительно введено 0,05мММ не-основньїх аминокислот и І-глутамин. Вращающиеся сосудь! с приготовленной средой помещают на 2 - З часа в инкубатор и затем ее вновь удаляют, заменяя 100мл свежей, ч не содержащей сьіворотки средь!. При 1 - З часовой инкубации в бессьівороточной среде происходит снижение М) концентрации загрязнения белков сьівороткой. Затем вращающиеся сосудьі опять помещают на 7 дней в инкубатор, в течение которьїх происходит накопление зритропозтина в бессьівороточной культуральной среде.

К концу 7-дневной фазьї продуцирования зритропозтина старую среду удаляют, заменяя ее свежей, не « содержащей сьіворотки средой, необходимой для проведения второго цикла продуцирования. В виде примера практической реализации указанной системь! продуцирования представлен образец, находящийся в течение 7 - с дней в бессьівороточной среде, которьій по данньімм радисиммунологического анализа содержит 3892 ж 409 ч» Ш/мл зритропозтина. Принимая во внимание данньєе расчета плотности клеток порядка 0,9 - 1,8 х 109 клеток на " см, в каждом вращающемся сосуде обьемом 850см 2 содержится от 0,75 до 1,5 х 108 клеток, и исходя из зтого, таким образом, скорость продуцирования зритропозтина в течение 7 дней в 100мл культурь! достигает значений в пределах от 750 до 1470 Ш0/1059 клеток за 48 часов. і-й Надосадочнье жидкости из клеточной линий СНО рОЗМІ-МКЕРО амплифицированнье в метотрексате с «» концентрацией 1ОНМ, подвергают радисиммунологическому анализу для испьітания активности зритропозтина іп міго и іп мімо. Образец, приготовленньій в концентрированной среде при радисиммунологическом анализе, о содержит 41,2 1,44 МО/мл; 41,2 - 0,064 О/мл МкК-зритропозтина, как определено по данньм анализа на

Ге») 20 биологическую активность іп міо, и 42,5 ї- 5 О/мл по данньім анализа определения биологической активности Т/л мімо. При определений последовательности аминокислотньїх остатков полипептидньїх продуктов с» обнаруживаєется наличие зритропозтиновьіїх продуктов, причем доминантньй вид включаєт З остатка "лидирующей" последовательности, примькающей к предполагаемому завершению аминогрупп аланином. В настоящее время не ясно, является ли зто результатом неправильной обработки ядра полипептида в клетках 25 СНО, или отражаєт различие в структуре конечного завершения аминогрупп зритропозтина обезьянь

ГФ) относительно зритропозтина человека. кю Надосадочную жидкость, приготовленную из линии клеток СНО розМІ-9НиЕРО, подвергают трем испьітаниям. По данньім радисиммунологического анализа 5,5-дневньій образец содержит порядка 18,2 ШО/мл рекомбинантного зритропозтина человека в указанной среде; при анализе іп міїго 15,8 - 4,6 О/мл и при анализе 60 іп мімо 16,8 ж 3,0 О/мл.

Надосадочную жидкость, приготовленную из линии клеток СНО роБзМІ-ЯОНиЕРО со постепенньім амплифицированием метотрексатом с концентрацией 100нМ, подвергают трем испьтаниям. По данньм радисиммунологического анализа, З-дневньій образец содержит 3089 ж 129 ЦПМ/мл рекомбинантного зритропозтина человека; при испьітаний образца іп міго 2589 ж 71,5 О/мл и при испьітаний образца іп мімо 2040 бо т 160 Ш/мл. Последовательность аминокислот показьваеєт завершение аминогрупп, соответствующее представленному в таблице МІ.

Клеточную кондиционированную среду, приготовленную из клеток СНО, которая трансфектирована плазмидой рРОЗМІ -МКЕ в метотрексате с концентрацией 1ОнНМ, обьединяют и метотрексат подвергают диализу в

Течение нескольких дней, в результате чего образуется культура с активностью зритропозтина порядка 221 ж 5,1 Ш/мл (зритропозтин-клеточная кондиционированная среда) (ЕРО-ССМ). Для определения действия

ЕРО-ССМ на уровень гематокрита в линии Ваїр/С обьічной мьіши іп мімо проводят следующий зксперимент.

Клеточную кондиционированную среду, приготовленную из нетрансфектированньхх клеток СНО (ССМ) и

ЕРО-ССМ, регулируют, используя забуференньій фосфором раствор (РВ5). Клеточную кондиционированную 7/0 среду применяют на контрольной группе животньїх (З мьішь)), а для зкспериментальньх групп (2 мьішь на группу) используют 2 уровня дозировки ЕРО-ССМ: 4 единицьі на иньекцию и 44 единицьі на иньекцию. В течение 5-недельного курса 7 мьшам вводят внутрибрюшинно иньекции по З раза в неделю. После 8-ой иньекции средние показатели гематокрита у контрольной группьї, как установлено, составляют 50,495, для группьї при введений 4 единиц ЕРО-ССМ они составляют 55,1905 и при введений 44 единиц ЕРО-ССМ - 67,9905.

Продуктьі зкспрессии клеток млекопитающих животньїх можно без затруднения извлекать в довольно очищенном виде из культуральной средьй с использованием ВОЖХ (С/) с озтанольньм градиентом, предпочтительно при значений рн - 7.

Бьіла проведена предварительная попьїтка по определению свойств рекомбинантньїх гликопротеиновьх продуктов, полученньїх из кондиционированной средьі зкспрессии клеток СО5-1 и СНО гена зритропозтина из го Мочи человека, при использований как анализа УУевіегп ріої (окрашивания), так и анализа ЗО5-РАСЕ.

Указаннье исследования показьівают, что зритропозтиновьій материал, продуцируемьй клетками СНО, имеет несколько больший молекулярньй вес, чем продуктьі зкспрессии клеток СО5-1, которьій, в свою очередь, немного больше мочевого зкстракта человека пулового источника. Все продуктьі в некоторой степени гетерогенньі. Обработка ферментом нейраминидазь! для удаления сиаловой кислоть! приводит к тому, что в с ов результате рекомбинантнье продуктьі клеток СО5-1 и СНО имеют примерно одинаковьй молекулярньй вес, которьй, тем не менее, как один, так и другой, больше молекулярного веса получающегося мочевого зкстракта і) человека, содержащего азиалогруппь. Обработка ферментом Е-зндоглюкозидазь! (ЕС 3.2.1) рекомбинантного продукта клеток СНО и продукта мочевого зкстракта (для полного удаления углеводов из обоих продуктов) приводит в результате к получению почти гомогенньїх продуктов, которьіе, в основном, имеют одинаковьй (у зо Молекулярньй вес.

Очищенньй зритропозтин, полученньй из мочи человека и рекомбинантньй, продуцируемьй из клеток СНО, ікс, зритропозтин согласно настоящему изобретению подвергают анализу на определение углеводного состава по / (У методике, описанной іедееп, еї аїЇ.,, Меїодз іп Еплутоіоду, 83 (Рай 0, 139 - 191 (1982), которая модифицирована при использовании метода гидролиза, описанного Меззег, еї аї., Апа)ї. Віоспет., 142, 58 - 67 « (1984). Определенньюе зкспериментальньм путем показатели углеводного состава для мочевого изолята ю (вьіраженнье в виде молярньїх отношений в указанньїх продуктах) имеют следующие значения: гексоза, 1,73;

М-ацетилглюкозамин, 1; М-ацетилнейраминовая кислота, 0,93; фукоза, 0; и М-ацетилгалактозамин, 0.

Соответствующие значения для рекомбинантньїх продуктов (производньїх от линии клеток СНО рОЗМІ -Я-УНОЕ РО

З-дневной культуральной средь), усиленной метотрексатом при концентрации 1ООНМ) имеет следующие « показатели: гексоза, 15,09; М-ацетилглюкозамин, 1; М-ацетилнейраминовая кислота, 0,998; фукоза, 0; и з с М-ацетилгалактозамин, 0.

Полученнье результать! совпадают с результатами описанньїх вьіше анализов УУевіегп Біої и 505-РАСЕ. ;» Гликопротеиновье продуктьї, получаемье согласно настоящему изобретению, таким образом, представляют собой достижимье продуктьї, первичная структурная конформация которьх в достаточной степени

Воспроизводит конформацию зритропозтинов естественного происхождения для придания им одного или с нескольких биологических свойств, и количественньй состав углеводов которьїх отличаєтся от состава зритропозтинов природного происхождения. т- ПРИМЕР 11 оо Предлагаемьй пример относится ко всему циклу получения зритропозтинов посредством сборки нуклеотидньїх оснований двух структурньїх генов, кодирующих последовательность зритропозтина человека,

Ме. представленньїх в таблице МІ и содержащих, соответственно, "предпочтительнье" кодоньі для зкспрессий 4) признаков в Е. соїї и дрожжевьїх клетках (5. сегемівіае).

В указанном примере дополнительно описана конструкция генов, кодирующих аналоги зритропозтина.

Короче говоря, используемье протокольі, в общем представлень! в указанном вьіше описаний Ап, еї аї. (М/о ов 83/04053). Указаннье геньі сконструировань! для первоначальной сборки составляющих олигонуклеотидов в сложном дуплексе, которье, в свою очередь, собрань! в три дискретнье части. Указаннье части построень! для (Ф, амплификации и при удалений из системьї амплификации могут бьіїть собрань! последовательно или через ка лигатуру фрагмента со сложной структурой в подходящий вектор зкспрессии.

В таблицах МІП - ХІМ показана схема и сборка полученного гена, кодирующего продукт трансляции бо Зритропозтина человека, в котором отсутствует какая-либо лидирующая или предшествующая последовательность, но содержится исходньїй остаток метионина в положений -1. Более того, ген, введенньй в основную часть клетки Е. соїї, отдает предпочтение кодонам и, таким образом, указанную конструкцию назьівают "ЕСЕРО" ген. б5

Таблица МІЇЇ

Олигонуклеотидн части 1 ЕСЕРО 1. ДААТТСТАСАДАССАТСАСССТААТАДААТА 2. ССАТТАТТТТАТТАСССТСАТОСТТТСТАС з. АТобСТОСоССССоТсСтТоАТСТоССАС 4. СТССАСТСССАСАТСАСАССССССССАС 70 5. ТССАСАСТТСТССААССТТАССТОСТС 6. СТТССАССАССТААССТТССАСААСТ 7. САДССТАДАСААССТСААААСАТС в. СТОСТСАТСТТТТСАССТТСТТТАС 9. АССАСТОСТТСТОСТСААСАСТСТТС 10. САДАСААСАСТСТ ТСАССАСААССА 11. ТТТСААССААААСАТТАСССТАССС 12. САТССССТАСССТААТСТТТТССТТ

Таблица ІХ

Часть 1 ЕСЕРО

Хбаї

ЕсСоВІ 1 3 с 285 ААТТСТАС АААССАТСАС ССТААТАДАА ТАДТОбСТСС бССсссТСТо

САТС ТТТССТАСТС ССАТТАТТТТ АТТАСОСАЄС ССССССАСАС Го) 2 4 2

АТСТСССАСІ ССАСАСТТСТ ССААССТТАС СТОСТОВААС СТАААСААСС

ТАСАСССТС СААБА ССТТССААТС САССАССТТО САТТТСТТСС со 6 7 9 й со тТеААААсАтТс ДССАСТОСТТ СТОСТОААСА СТСТТСІТТО ААССАЙДАСА

АСТТТТСТАС СВССАА САССАСТТСТ САСААС ттесттттет 8 10 со

КрпІ Ватні ттасостАСс ГУД з

ААТСССАТоС ССТАС 12 І в) - с . а 1 с» (95)

Ге») с» ко 60 65

Таблица Х

Олигонуклеотидь части 2 ЕСЕРО

Й і. ДАТТСССТАССАСАСАССААССТ 2. СТТААССТТОСТОТСТОоСТАССС 70 з. ТААСТТСТАСССТТССАДАССТАТ 4. ТТССАТАССТТТССААСССТАСАД 25. ССААСТТССТСААСАДССАСТТСААСТ 6. ССЛДАСТТСААСТОСТТСТТСАССАдС 7. ТТВБСАСССТСТОССАСТОСТСАСсССо 8. СССТСОСТСАССАСТОССАСАСССТо 9. АБОСТОТАСТОССТОБССАСССА 10. ССАСТОССТОСССАССЬСАСТАСА 11. СТОСТОСТАДАСТССТСТСАССССТ сч 7 із. ТТСССАССССТСАСАССАСТТТАССА о 15. СОСДАССОСТОСАССТОСАТОТТОАС 14. ССТІТТСТСААСАТоСАССТоСАССоС со 7 15, ДАДССАСТАТСТОБССТСАСАТСТО іш 16. САТССАСАТСТСАСВССАСАТАСТ їй

Й оте з всю і

ЯКЕ: пискеме оіемех песеем после злтеетсйне змоснєттох етртееко Тететенеє Тестеносі їх 5 в 7 я Верес віє СТБдесдеех Еш стсесеАвее

МЕН ем помру МЕ т 16 1 г» (95)

ФО 50 бе» о іме) 60 б5

Іаблица ХІЇ

Часть 3 ЕСЕРО і. САТССАСАТСТСТСАСТАСТОТоС 2. АСОСАССАСАСТАСТСАСАСАТСТо 170 5. ТОССТОСТСТОССТОоСАСАСАДАСАСС 4. САТАСССТСТТТСТОТОСАСССАСАДОС 5. СТАТСТСТССОССССАТОСТОСАТСТ 6. САССАСАТССАССАТССООСССАСА 7. ССТОСАССОСТОССТАССАТСАСТо 8, ДТСАССАСТОАТОСТАСОСАССаСсТ о 7 в, СТСАТАССТТССССАААСТСТТТСС 10. АТАСАССАДАСАСТТТОСССААССТ 11. ТСТАТАСТСТААСТТССТСССТОСТА се 25 12. САСТТТАССАСОСАССААДСТТАСАСТ о 15. ДАСТСАААСТСТАТАСТОСССАдоС 18. СССАТОСТТССССАСТАТАСАСТТТ о (Се) 15. АТОСССТАСТОСТСАССССТААТАС со 16. ТСБАСТАТТАССССТСАССАСТАС «т

Таблица ХІТІ

Часть 3 ЕСЕРО о

БА тссАВАтстсто

СТСТАСАСАС « то АСТАСТСТОС Кесстестст естесасс АААСАССЕТА теїстссесс не с ТСАТВАСАСе ВАСА сесасототе тттстес сАССсес г» й ї Я т Т Ат т

ССтАССАСС нн воАсосАт ват ся к-реЯ ТеСААсс 5 Е й АААСТСТТ ТССЕСТАТАС тстайсттсс тесетост АСТЕААСТ ї» СТТ ТАС АССКЕАТДТ МАТТЕАНо АЕССАССАИ Кит (95) 15 заїї

ТАТАСТСССС ААССДТСССС ТАСТССТСАС СССТААТАС о 50 АтТАТСДАССбС тесег лет АТСАССАСТо СССАТТАТС дост 1 16 сю» (Ф. ко бо б5

Таблица ХІУ

Тен ЕСЕРО 4 і 9 Хба1 меєд1а

СТАЄ АААССАТСАС ССТААТАААА ТААТоССТосС сссссстстс

ТТТОбТАСТС ССАТТАТТТТ АТТАСССАСС СОбСССАСАС

АТСТОССАСТ ССАСАСТТСТ ССААССТТАС СТССТССААС СТАААСАДСС

ТАСАСССТОА ССТСТСДАСА ССТТССААТС САССАССТТС САТТТСТТСС

ТбААААСАТС АССАСТОСТТ СТОСТСААСА СТСТТСТТТС ААССААААСА

АСТТТТСТАС ТССТСАССАД САССАСТТСТ САСААСАААС ТТОСТТТТСТ

ТТАСССТАСС АСАСАССААС СТТААСТТСТ АСССТТССАА АССТАТССАА

ДАТОССАТСС ТСТСТОСТТС СААТТСДАСА ТОССАДССТТ ТОСАТАССТТ

79 ттІбстсААС ААССАСТТСА АСТТТСССАС ССТСТСССАС ТОСТСАСССА

СААССАСТТС ТТССТСААСТ ТСАААСССТС ССАСАСССТО АССАСТСССТ

СССТСТАСТС ССТОСССАСС САСТОСТССТ АААСТССТСТ САбССОТобо

СССАСАТСАС ССАССССТССЄ СТСАССАССА ТТТСАССАСА СТССССАССС

20 ддсссстосА СстТоСАТСТТ САСАДАССаС ТАТСТоСССТ САСАТСТСТО

ТТОбСбАССТ ССАССТАСАА СТСТТТССТС АТАСАССССА СТСТАСАСАС

АСТАСТСТОС ТоССТОСТСТ бОСТССАСАС АДААСАСОСТА ТСТСТоСССС

ТСАТСАСАСС АСССАССАСА СССАССТСТС ТТТСТОССАТ АСАСАССССС с 25 ббАТОСТССА ТСТОСТОСАС СССТОССТАС САТСАСТОСТ САТАССТТСС

ССТАССАССТ АСАССАССТО СССАСССАТС СТАСТСАССА СТАТССААСС о

ССАДАСТСТТ ТССТЄТАТАС ТСТААСТТСС ТСССТССТАА АСТСАААСТС

ССТТТСАСАА АССАСАТАТС АСАТТСААСС АСССАССАТТ ТСАСТТТСАС

5аїї (зе) 30 ЛАТАСТОССС ААССАТСССЄ ТАСТОСТСАС СОСТАДТАЄ

АТАТСАСССС ТТССТАСССС АТСАССАСТо СССАТТАТСА ССТ Ге)

Более детально, Таблица МІ иллюстрирует применение олигонуклеотидов для генерирования Части 1 гена со

ЕСЕРО, кодирующего амино концевье остатки человеческого полипептида. Олигонуклеотидьі собирают в дуплексь (1 и 2, З и 4, и т.д.), которне затем сшивают для получения Части 1 ЕСЕРО, как в Таблице ІХ. Следует «І 35 отметить, что собранная часть включает соответственнье липкие концьї конечньїх ЕсоКіІ и Ватні, причем "по ою потоку" липкого конца ЕсоК! направлен участок распознавания ограничительного фермента Хваї, а "против потока" липкого конца Ватні направлен участок распознавания Крпі. Часть 1 можно без труда амплифицировать, используя вектор фага М13, применяемьй для проверки последовательности данной части.

Некоторье трудности неожиданно возникают при вьіделении части в качестве фрагмента Храї/Крпі из ДНК КЕ, « дю генерированной в Е. соїї, вероятно, из-за метилирования оснований участка распознавания Крпі в пределах -о хозяина. Позтому вьіделяют ДНК фага и воспроизводят в двунитевой форме іп міго посредством растяжения с праймером, и затем вьіделяют требуемьй двунитевьій фрагмент. :з» Части 2 и З гена ЕСЕРО (Таблицьї; ХІ и ХІЇЇ) строят подобньім образом из олигонуклеотидов Таблиц Х и ХІЇ, соответственно. Каждую часть амплифицируют на векторе М13, применяемом для проверки последовательности, и вьіделяют из ДНК фага. Как явствует из Таблиць ХІ, Часть 2 ЕСЕРО строится с липкими сл концами Есокі и Ватні и может бьїть вьіделена в качестве фрагмента Крпі/Ваоі. Точно так же Часть З ЕСЕРО получена с липкими концами ВатНі и За и может бьть вьіделена из ДНК КЕ как фрагмент ВоаїПзаїЇ. т. Полученнье таким образом три части можно без труда собрать в непрерьівную последовательность ДНК с (Таблица ХІМ), коюдирующую полипептид полного ЕРО человека с метиониновьім кодоном аминоконца (АТО) для трансляционного инициирования Є. соїї. Следует отметить, что "против потока" первоначального АТО (о) направлен ряд пар оснований, достаточно дуплицирующий последовательность участка связьивания рибосомь! с» сильно вьіраженного ОМР-Ї гена Е. сої.

Для переноса ЕСЕРО можно использовать любой подходящий вектор зкспрессии. Специфическим вектором, вьібранньм для зкспрессии гена ЕСЕРО в качестве "температурно-чувствительной" плазмидьї рСЕМ536, является производное плазмидьі рСЕМА14 (А.Т.С.С. 40076), как описано в одновременно рассматриваеємой заявке на патент США Моб36727, поданной б августа 1984г, Спапез ЕР. Моїтіз. Более конкретно, РСЕМ536

ГФ) расщепляют Хбваї и Ніпан; большой фрагмент вьіделяют и используют в двухстороннем сшиваний с геном 7 ЕСЕРО. Части 1 (Хваї/КрпіІ), 2 (Крпі/Ваї) и З (ВопП/За!І) предварительно собирают в правильном порядке в

М13 и вьіделяют оттуда ген ЕРО как одиночньій фрагмент Хваї/Ніпа!й. Зтот фрагмент включаєет часть во полилинкера из М13 тро-фага, стягивающего в нем участки заї| и Ніпа. Контроль за зкспрессией в получаемой плазмиде зкспрессии, ро5Зб, вьіполняют при помощи опромотора лямбда Р |, которьій сам может контролироваться репрессорньм геном С-вб57 (таким как тот, которьій получен в К12АНІігр нити Е. соїї).

Построенньй ген ЕСЕРО может бьіть модифицирован различньм образом для кодирования аналогов зритропозтина, таких как (Азп2, дев-Рго? по ПеУНЕРО и (Нів ЛПНЕРО, как описано ниже. в5 А. |(Азп2, дев-Рго? по ПеЯпЕРО

Плазмиду 536, несущую построенньйй ген ЕСЕРО Таблиць ХІМ как вставка Хваї в Ніпаїйї, расщепляют Ніпай|Ї и

Хпої. Зндонуклеазой последнего разрезают ген ЕСЕРО в уникальном участке распознавания, имеющем 6 пар оснований, стягивая последнее основание кодона, кодирующего Азр З со вторьім основанием кодона Агу У,

Строят последовательность линкера Хвраї/ХпоЇ, имеющую следующую последовательность:

Хваї 1 2 Щщ 78 9

Мек діа Азп Суз Ар , ХПОЇ 5'-СТАб АТС ССТ ДАТ ТС бАС-5 , з'-тАс сСбА ТТА АСС сто АбСТ-5

Линкер ХваїЇ/Хної! и фрагмент последовательности гена ЕСЕРО Хпо//НіпаїІЇ вставляют в большой фрагмент, 70 получающийся в результате расщепления Хваї и Ніпаї плазмидьії РСЕМ526 - производное плазмидь! РСЕМ414

ТА,Т.С.С. 40076) - как описано в одновременно рассматриваемой заявке на патент США Моб636727, поданной 6 августа 1984 года СПагпез Р. Мо!гтіз, для генерирования плазмида-несущей ДНК-последовательности, кодирующей зкспрессию Е. соїї формь Ме! желаемого аналога.

В. (ІНіз ПЕРО

Плазмиду 536 расщепляют НіпаїїЇ и Хпої, как в части А вьіше. Линкер Храї/Хпо! построен со следующей последовательностью: хваїЇ ч1 2 З а 5 6 7 8 9 Хпої 77 Меф дів Рго Рго Агд сечу І1е НІі5 д5ро, 5'-СТАб АТО бСТ ССб СсСА СсТ Сто АТС САТ бАС-Х з зЗ'-ТАС СбА бос бот бСА САС ТАС СТА СТ АССТ-5

Линкер и фрагмент последовательности ЕСЕРО Хпо//Ніпа затем вставляют в РСЕМ526 для генерирования плазмида-несущей ДНК-последовательности, кодирующей зкспрессию Е. соїї формь! Ме! желаємого аналога.

Построение изготовленного гена (ЗСЕРО"), включающего в себя дрожжевье предпочтительнье кодонь, происходит, как описано в следующих Таблицах ХМ - ХХІ. Так же как и в случае с геном ЕСЕРО, полное построение содержит образование трех наборов олигонуклеотидов (Таблицьй ХМ, ХМІЇ и ХІХ), которье сформировань! в дуплексьі и собраньі в части (Таблицьі ХМІ, ХМ и ХХ). Следует отметить, что синтез сч облегчаєтся частично использованием некоторьх субоптимальньїх кодонов в обоих ЗСЕРО и ЕСЕРО Ге) построениях, т.е. олигонуклеотидьи 7 - 12 части 71 обоих генов бьли идентичньі), как бьіли идентичнь олигонуклеотидьії 1 - б части 2 в каждом гене.

Таблица ХМ пн со 3о Олигонуклеотидь ЗСЕРО части 1 (Се) со 1. АДТТСАДССТТССАТААААСАССТ їй за 2. СТОСАССТСТТТТАТССААССТТС ю з. ССАССААСАТТСАТСТСТСАСТС й, ТСТСБАСТСАСАСАТСААТСТТо « ес 70 5. САСАСТТТТССАДАСАТАСТТСТ То в) "» 6. СТТССААДСААСТАТСТТТССААААС п 7. СААССТАДАСАДОСТСААААСАТС 1 8. СТОСТСАТСТТТТСАССТТСТТ ТАС т 9. АССАСТОСТТСТОСТОААСАСТСТТС (95) 10. САДАСАДСАСТОТ ТСАССАСААССА (22) сю» 11. ТТТСДАССААДАСАТТАСССТАССС 12. САТССССТАСССТААТОТТТТССТТ

Ф) іме) 60 б5

Таблица ХУТ

Часть 1 БСЕРО

ЕсойІ ніпацПІ 1

ВАТІСА ДОСТТОСАТА ст ТСВААССТАТ з

ЕН Мрмекме МЕТ ФВ ЕМАХ й 710 в т ,

ССАААСАТАС ТТСТТОБААС СТДААСААСС ТСАААДАСАТС ВССАСТОСТТ сетттетАте Мерма сдтттеттее АСТТТТСТАС КЕЕТЕссх

З її КрпІ ВатнІ

СсТоСтодАСА СТСТТСІТТо ААССАДААСА ТТАСССТАСС С 7/5 САССАСТТСТ я ТтбСттттот ААТОССАТО ССтАС

Таблица ХУІї

Олигонуклеотидн БСЕРО части 2 20 і. ААДТТСССТАССАСАСАССААССТ 2. СТТААССТТоСТСТСТоСТАССС з. ТААСТТСТАСССТТССАДАССТАТ с 25 о а. ТТССАТАССТТТССАДСССТАСАА 5. ССААСТТССТСААСАДССАСТТСДАСТ зо 6. ССАДАСТТСААСТОСТТСТТСАССАДС о (Се) 7. ТТОБСАДоСТТТСОССТТСТТАТСТо со 8. ССТТСАСАТААСААСОССАААССТТо « 35 9. АДОСТСТТТТСАСАССТСАдСССТ ю 10. ААСАДСОСТТСАССТСТСДАААСАД 11. ТОТТОСТТААСТСТТСТСААССАТОСС « зо іг. ТОСТТСССАТОСТТСАСААСАСТТАДСС - с й 15. ААССАТТССААТТОСАССТССАТ а 14. СТТТАТССАССТОСААТТОСАА сл 45 15. ДАДОСССТСТСТОСТТТСАСАТСТо їх 16. САТССАСАТСТСАААССАСАСАСоС

Таблица ХМУІІїЇ о ч. 2 БСЕРО асть

Ф " Крпї с» ЕсоКІ р

А АТТСбСТАСсС АСАСАССААС бССАТСС тететостт 55 стрвясттст АСбСТТОСАА всстатодя сттостЕААс ААОСТСТТСА о СА АСА тоСбАВССТТ ТОСАТА СААССАСТТС ТТССАСААСТ о АСТЕТОСССАД остттеосст ТеТТАТСТС достстттте АСАССТСАДС

ТСАКАЕТр ССАВАССССА они кое ТСТесАСТТе 0 60 11 Й із сстксттост ТААСТСТТСТ СААССАТооС ДасслттосА АттосАСотС

Сб. СА АттеАсААт СстТосТАССС АССТ тАдестесАє

В9111 Ватні сатвААсссс ТСТстосттт САСАТСТо 65 стАерее АСАСАССАМА СТСТАСАССТА б

Таблица ХІХ

Олигонуклеотидь БСЕРО части 3 1. САТССАСАТСТТТСАСТАСТТТСТТ 2. ТСТСАДСААДАСТАСТСАААСАТСТС 0 з. САСАССТТТСССТОСТСААААССААС а. АТСОСТТССТТТТСАССАСССАДАСС 5. ССАТТТССССАССАСАСОСТОСТТ й 6. ССАСААССАСССТСТОСТОСССАА 7. СТСССССТССАТТСАСААССАТС в. САСТСАТОСТТСТСААТОоСАбСО 9. АСТОСТСАТАССТТСАСАДАСТТ 10. САДТААСТТТСТСДАССТАТСАС се )1. АТТСАСАСТТТАСТССААСТТСТ о 12. СТСДДАСААСТТССАСТАААСТСТ 15. ТСАСАССТАААТТСААСТТСТАСАС о 0 16, АССССТСТАСААСТТСААТТТАССТ й 15. ССПСТСАДСССТСТАСААСТОСТ со 16. СТСТСАССАСТТСТАСАСССТТС «І ою 17. САСАСАТАДСССССАСТСАТАА 18. СТТСТТАТСАСТСССОСТТАТ « ло 19. САДСАСТСТАСАТСТААСАААб - - 20, ТССАСТТТСТТАСАТСТАСАСТ :» Таблица ХХ часть З 5БСЕРО і-й ВАТ т АБВТСТттЕ АСТАСТТТСТ Трасарсти

СТСТАСАААС ТСАТСАЛАСА А САДА шк 2

Мамі осстестсяА пассвасроя тоскно АсАСестТост тстоссесТе

ФО 50 сссАссАстт ттсстте ши ТСТоСсАСсСА АБАСССССАС с» сАттсАЯАс САТеВСТоСТ САТАЙСТТСА САДАСТТАТТ САСАТттАС стААстстте стор сАера СтАТОСАДСТ стслААХ ВустслАт - - 12 59 ТесААСТТСТ о АСАССТАЖ АТТСААСТТС тАСАСТССТе ААБССТОТАС

АССТТСАдСА КетврссАтт ТААСТТСААС Керн ТТСбСАСАТС о г са о ААСТССТБАС АСАТАдсССс САСТСАТААГ. А, в пе не т САТ ВСАА 60 їв заії

АТСТААСААА С

ТАСАТТСТТТ САССТ

20 б5

Таблица ХХІ

Ген Б5СЕРО -1-41 ніпбІтїІ АгоА1в

АБСТТССАТА АААСАССТСС АССААСАТТС АТСТСТСАСТ ССАСАСТТТТ

АССТАТ ТТТСТССАСС ТССТТСТААС ТАСАСАСТСА бСТСТСАААА

ССАДАСАТАС ТТСТТССААС СТАДАСААСС ТСАДААСАТС АССАСТССТТ

ССТТТСТАТС ААСААССТТС САТТТСТТСС АСТТТТОТАС ТОСТСАССАА

70 стостсдасА стсттстттс ААССААААСА ТТАСССТАСС АСАСАССААС

САССАСТТСТ САСААСАДАС ТТССТТТТсТ ААТеССАТОС ТСТСТоСТТС

СТТААСТТСТ АСССТТССАА АССТАТССАА СТТбСТСААС ДАССТСТТСА

СААТТСАДСА ТОССААССТТ ТССАТАССТТ СААССАСТТС ТТССАСААСТ

75 АСТТТббСАА бСТТТСбССТ ТСТТАТСТСА АССТСТТТТС АСАССТСААС

ТСАААСССТТ ССАААССССА ДСААТАСАСТ ТССАСААААС ТСТоСАСТТС

ССТТСТТбСТ ТААСТСТТСТ САДССАТССС ААССАТТССА АТТОСАССТС

ССААСАДССА АТТСАСААСА СТТССТАССС ТТССТААССТ ТААССТССАС бАТАААСССС ТСТСТССТТТ САСАТСТТТС АСТАСТТТСТ ТСАСАССТТТ

СТАТТТССОС АСАСАССААА СТСТАСАДАС ТСАТСАААСА АСТСТССАДА ббСТССТСАА ААССААСССА ТТТССССАСС АСАСоСТоСТ ТстТоссесте

СССАССАСТТ ТТССТТСССТ АДАССССТоС ТСТОССАССА АСАСССССАС с

САТТСАСАДС САТСАСТОСТ САТАССТТСА БАААСТТАТТ САСАСТТТАС

СтТАДСТСТТС СТАСТСАСВА СТАТССААСТ СТТТСААТАА СТСТСАААТС (5)

ТССААСТТСТ ТСАСАССТАА АТТСААСТТо ТАСАССОСТС ААСССТОоТАС

АССТТСААСА АСТСТССАТТ ТААСТТСААС АТСТОСССАС ТТССбАСАТС

ААСТССТСАС АСАТАДСССС САСТСАТААС ААСАСТСТАС і. тТтеАССАСТО ТСТАТТСОбо СТСАСТАТТО ТТСТСАСАТС со заії

АТСТААСАДА С с

ТАСАТТСТТТ САССТ

Собраннье части ЗСЕРО вьістраивают в ряд в М1ІЗ и Части 1, 2 и З вьіделяют из фага в качестве «І фрагментов НіпапиКрпї, Крпі/Вай! и Вопузаї!. ою

Предпочитаемой сейчас системой зкспрессии для продуктов гена ЗСЕРО является система секреции на основе секреции о-фактора 5. сегемізіае, как описано в находящейся в процессе одновременного рассмотрения заявке на патент США Мо487753, поданной 22 апреля 1983 года Огапі А. Віцег, опубликованной 31 октября 1984 года как заявка на европейский патент 0123294. Короче говоря, система включаєет конструкции, где ДНК, «

Ходирующая ведущую последовательность гена ос-фактора дрожжей, располагается сразу за 5 к кодирующей з с области вьіражаемого зкзогенного гена. В результате чего транслируемьй генньій продукт включает ведущую или сигнальную последовательность, которая "обрабатьваєтся" зндогенньм ферментом дрожжей в :з» направлений секреции оставшейся части продукта. Так как конструкция дает возможность использования кодона инициирования трансляции о-фактора (АТО), не бьіло необходимости в созданиий такого кодона в Пположений -4 гена ЗСЕРО. Как можно озаключить из Таблицьй ХХІ, аланин (ї41), кодирующий г последовательность, стоит за последовательностью линкера, что позволяет осуществить непосредственную вставку в плазмиду, включающую ДНК для первьїх 80 остатков проводника у-фактора, следующего за т- промотором о-фактора. Специфическое предпочитаемое построение для зкспрессии гена ЗСЕРО содержит оз четьтрехстороннее сшивание, включая указаннье вьше фрагментьь части ЗСЕРО и большой фрагмент

Ф 50 расщепления Ніпаїї/Заї! плазмидьї реаСЗ3. Из получаемой плазмидной раСЗ/5СЕРО вьіделяют промоторную и лидирующую последовательности о-фактора, а также ген 5СЕРО путем расщепления ВатНі и сшивания сю расщепленную Ватні в плазмиду рУЕ с образованием плазмидной рУуЕ/5СЕРО зкспрессии.

ПРИМЕР 12

Настоящий пример относится к зкспрессии рекомбинантньїх продуктов построенньїх ЕСЕРО и ЗСЕРО-генов в пределах системь! зкспрессии Примера 11. о При использований системь! зкспрессии, рассчитанной для применения в клетках-хозяевах Е. сої), плазмиду ро3б6 Примера 11 трансформируют в клетках Е. соїї АМ7, ранее трансформированнье с пригодной плазмидой, іме) РМУМІ, принявшей к себе ген Свсу. Культурь! клеток в В бульоне (ампициллин 5Омкг/мл и канамицин 5мкг/мл, предпочтительно с 10ММ МазО)) вьідерживают при температуре 28"С и во время роста клеток в культуре до бо О.О.600 5 01, зкспрессию ЕРО индуцируют, повьішая температуру до 42"С. Клетки растут до приблизительно 40

О.0., обеспечивая получение ЕРО (оценено гелем) около 5мг/О0 л.

Клетки собирают, подвергают лизису, разбивают французским прессом (10000 рзі) и обрабатьввают лизоцимом и детергентом МР-40. Осадок, полученньій в результате центрифугирования 24000хад, растворяют в

НС гуанидине и подвергают дальнейшей одноразовой очистке при помощи С; (Мудас) ВЗЖХ с обращенной 65 фазой (ЕН, 0 - 8095, 5Б0ОММ МНААс, рН 4,5). Определение последовательности оснований белка вьіявляет, что продукт чист более чем на 9595, а полученнье продукть! ввіявляют два разньїх аминоконца, А-Р-Р-К... и Р-Р-К..,

при относительном количественном отношений, равном З : 1. Зто последнее наблюдение ПЕРО и (дез

Аа |ПНЕРО-продуктов означаєт, что "обработка" аминоконцов в пределах клеток-хозяев служит для удаления конечного ометионина и, в некоторьїх случаях, начального аланина. Активность, определенная радисоиммуноисследованием, для изолятов находится на уровне 150000 - 160000 Ш/мг; активность, ввіявленная іп міго, составляет порядка 30000 - 62000 О/мг; и активность, вьіявленная іп мімо, варьируется в пределах от 120 до 720 ШО/мг. (Сравнено со стандартом человеческого мочевого изолята - 70000 ШО/мг, в каждом испьтаний).

Кривая доза-зффект для рекомбинантного продукта в испьітаний іп мімо значительно отличается от кривой стандарта мочевого ЕРО человека. 70 Плазмидьї ЕРО-аналога, образованнье в частях А и В Примера 11, каждая трансформируется в рМУМІ-трансформированньєе клетки Е. соїї АМ7, и клетки культивируют, как описано вьіше. Очищеннье изолять! испьітьіваєт как КІА, так и анализами іп міго. Значения, полученнье при испьтаниях КІА и іп міо, для продуктов зкспрессии (Азп2, дев-Рго?2 по ІеЧпЕРО, составляют приблизительно 11000 Ш/мг и 6000 О/мг белка, соответственно, тогда как значения анализа для |Нів ЦиЕРО составляют около 41000 Ш/мг и 14000 О/мг белка, 75 соответственно. Зто означаєт, что продуктьї аналогов являются на 1/4 - 1/10 "активньіми", так же как продукт зкспрессии "родителя" в испьітаниях.

В системе зкспрессии, предназначенной для использования в клетках-хозяевах 5. сегемізіае, плазмиду

РУЕ/5СЕРО трансформируют в два различньхх штамма, У5ОРА (генотип о, рер4-3 ігрІ) и ККВ1 (генотип со, рер4-3 грі). Трансформированньїх хозянев У5ОРА вьуращивают в среде 50 (Методь! генетики дрожжей, Соїд Зрііпуд Нагброг І арогаїогу, Соїд Зргіпд Нагрог, М.М., р. 62 (1983)), пополняємой кислотами сазатіпо 0,596, рн 6,5 при температуре 30"С. Средь,, собранньое, когда клетки вьірастают до 36 О.0О., содержат продукть! ЕРО на уровне около 244 О/мл (97мк/О0О л, что вьіявлено посредством КІА). Трансформированнье клетки ККа1, виіращенньєе до 6,5 О.О. или 60 О.0., обеспечивают создание сред с концентрациями ЕРО около 80 - 90 О/мл (З4мк/ОО л, что вьіявлено КІА). Предварительнье анализьії вьіявляют значительную гетерогенность в с продуктах, полученньїх посредством применения системь зкспрессии, что, по-видимому, обусловлено о изменениями в гликозилирований вьіраженньїх белков, а также относительно вьісоким содержанием маннозь присоединенного углевода.

Плазмидь! РоСЗ и руУЕ в клетках Е. соїї НВ101 бьіли сдань!і для регистрации в соответствии с Правилами производства дел Патентного ведомства США от 27 сентября 1984 года американской коллекцией типовьїх ме) культур, 12301 Рагкіамп Огіме, КосКмПе, Магуїапа, под депозитньмми номерами А.Т.С.С. 39881 и А.Т.С.С. 39882 «я соответственно. Плазмидьії РСЕМ526 в клетках АМ7, рРСЕМ536 в клетках /М103 и рмМУМІ в клетках /М103 бьіли зарегистрировань!ї подобньім образом 21 ноября 1984 года как А.Т.С.С. 33932, 33934 и 33933, соответственно. і,

Штаммь! У5РО4 и КК81 Засспаготусез сегемізіде бьіли зарегистрированьі 21 ноября 1984 года как А.Т.С.С. « 20734 и 20733, соответственно.

Должно стать очевидньїм из рассмотрения представленньїх виіше иллюстративньїх примеров, что настоящее юю изобретение в его многих аспектах предлагает исключительно ценнье продукть! и способь.

Предлагаемье полипептидьй являются заметно полезньми материалами, будь они микробиально вьіраженньіми продуктами или синтетическими продуктами, первичная, вторичная или третичная конформация « которьїх стала впервье известна благодаря настоящему изобретению.

Как отмечалось вьіше, рекомбинантно продуцируемье и синтетические продукть! изобретения обладают в в с различной степени биологической активностью іп мйго изолятов ЕРО из натуральньїх источников и позтому » проектируются с тем, чтобьі иметь пригодность в качестве заместителей изолятов ЕРО в культуральньх средах, применяемьх для роста клеток зритропозтина в культуре. Также, поскольку полипептиднье продукть! настоящего изобретения обладают активностью іп мімо натуральньїх изолятов ЕРО, они являются заметно пригодньми для использования в методиках зритролозтиновой терапии, применяеємьх к млекопитающим, о включая человека, для разработки любого или всех зффектов, присущих ЕРО іп мімо, например, їх стимулирование ответа ретикулоцитов, развитие феррокинетических зффектов (таких как зффекть кругооборота железа в плазме и зффекть! времени перехода в мозговое вещество), массообмень! зритроцита, о стимулирование синтеза гемоглобина С (см. Езспбаси, еї аі!., вьіше) и, как отмечается в Примере 10, увеличение

Ге» 20 уровней гематокрита у млекопитающих. В группу людей, обрабатьваемьх предлагаемьми продуктами, включали пациентов, как правило, нуждающихся в переливаний крови, включая жертв травм, хирургических с» больньїх, больньіх-почечников, включая диализньїх больньїх, и пациентов с разновидностью состава крови, вьізьївающего нарушения, такие как гемофилия, серповидно-клеточная болезнь, физиологический анемиаз и тому подобное. Минимизация необходимости в терапиий с переливанием крови благодаря использованию 22 терапии зритропозтином, можно ожидать, приведет к пониженному переносу возбудителей инфекционного

ГФ) заболевания. Предлагаемье продукть! благодаря их получению при помощи рекомбинантньїх способов, надо полагать, не содержат пирогеньі, натуральнье угнетающие вещества и тому подобное, и позтому несомненно о должнь! обеспечивать повьішенную общую отдачу в терапевтических методах по отношению к природньм продуктам. Зритропозтиновая терапия с использованием предлагаемьх продуктов также должна стать 60 полезной в повьішений кислородопропускающей способности индивидуумов, сталкивающихся с гипоксическими условиями внешней средь и, возможно, в обеспечениий благоприятньїх сердечно-сосудистьїх зффектов.

Предпочтительнь!м способом введения предлагаемьх полипептидньїх продуктов являются парентеральнье (например, внутривенньєе, внутримьшшечньсе, подкожнье или внутрибрюшинньсе) пути, и введеннье композиции должнь, как обьічно, содержать терапевтически зффективнье количества продукта в сочетании с приемлемьми бо разбавителями, носителями и/или стимуляторами. Предварительнье фармакокинетические исследования отмечают более длительньій период полураспада іп мімо для продуктов ЕРО обезьяньі при введений их внутримьшечно, скорее, нежели внутривенно. Как предполагается, зффективнье дозировки могут изменяться в значительной степени в зависимости от условий, однако, терапевтические дозьї, как сейчас ожидают, должнь! варьироваться в пределах от 0,1 (-7У) до 100 (-7000))мкг/кг веса тела активного материала. Стандартнье разбавители, такие как сьвороточньй альбумин человека, предполагаются для использования в фармацевтических композициях настоящего изобретения наряду со стандартньмми носителями, такими как физиологический раствор.

Стимулирующие материальі, пригоднье для использования в предлагаемьх композициях, включают 7/0 соединения, указаннье самостоятельно для зритропозтических стимулирующих зффектов, как например, тестостероньї, стимуляторьі предшествующих клеток, фактор роста инсулиноподобньїх, простагландинь, серотонин, циклический АМФ, пролактин и триидотиронин, а также средства, обьічно применяемьсе при лечений апластической анемии, такие как метенолен, станозол и нандролон |(см., например, Кезедойі, еї аї.,

Раптіпегула Меадіса, 23, 243 - 248 (1981); Мсбопідіе, еї аї., Кідпеу !пї, 25 (2), 437 - 444 (1984); /5 Раміоміс-Капіега, еї а! Ехрі. Нетайо!., 8(Зирр. 8), 283 - 291 (1980); и Кипг, РЕВЗ І ецегв, 14а(1), 105 - 108 (1982)). Такке предполагается в качестве стимуляторов использовать вещества, увеличивающие действия или синергизирующие зритропозтин или асиало-ЕРО, такие как адренергические агонистьі, тироиднье гормонь, андрогеньї и ВРА |см. Юипп, "Сцитепі Сопсерів іп Егу(Пгороіевів", дойп УУйПеу апа Бопз (Спіспезіег, Епадіапа, 1983); МУейапа, еф аї!.,, Вішб 44(3), 173 - 175 (1982); Каїтапії, Кіадпеу Іпї, 22, 383 - 391 (1982); ЗПанпійаі,

Мем. Епо. У. Мей., 289, 72 - 80 (1973), Рівпег, еї аїЇ., Єіегоіїдз, 30(6), 833 - 845 (1977); Огабре, еї аї., 9.

Ехр. Меа., 149, 1314 - 1325 (1979); и ВіМйаї еї аїЇ., Ехрі. Нетаїйо!., 10(1), 133 - 140 (1982)) а также классьі соединений, обозначающие "гепатические зритропозтические факторь" |см. Мацдніоп, еї аї., Асіа.

Наетаї., 69, 171 - 179 (1983)) и "зритротропинь" |как описано Соподоїе, еї аїЇ., іп Арзігасі 364, Ргосеедіпдов 7 |пігепайопа! Сопдгевв ої Епдосгіпоюду (СОцерес Су, Смерес, ОшШу 7 - 7, 1984); Сопдоїє, Віоспет. Га

Віорпув. Кев. Сотт., 115(2), 447 - 483 (1983) и Соподоїе, Апа)Ї. Віоспет., 140, 428 - 433 (19843) и "зритрогениньі" |как описано в работе Коїптанп, еї аї., У. Зи!иго. Опсої., 20, 105 - 108 (1982))Ї. Предварительнье і9) скрининги, предназначеннье для измерения зритропозтических ответов зко-гипоксических полицитемических мьшей, предварительно обработанньх либо 5-5-дигидротестостероном, либо нандролоном, а затем предлагаемьм зритропозтином, проявляли сомнительньсе результать. со

Диагностические использования предлагаемьх полипептидов также обширньй и включают применение меченьх и немеченьх форм в разнообразиий методик иммуноисследования, включая КІА, ЕГІЗА и тому шо подобное, а также в разнообразии анализов, проводимьїх для вьіявления активности іп міо и іп мімо. См., со например, работьії Юипп, еї аі., Ехрі. Нетаїйо!., 11(7), 590 - 600 (1983); (зірзоп, еї аї., РаїйоІоду, 16, 155 - 156 (1984); КгузвіаІ, Ехрі. Нетаїйо!., 11(7), 649 - 660 (1983); Зайо, еї аїЇ., дар. 9. Меа., 23(1), 16 - 21 З (1984); Маїйап, еї аІ., Мем. Епа. У). Меа., 308(9), 520 - 522 (1983); и различнье ссьілочнье материальі, имеющие отношение к упоминаемьм в зтих работах исследованиям. Предлагаемье полипелтидьі), включающие синтетические пептидьі, которье содержат последовательности остатков впервье вьіявленного ЕРО, также располагают чрезвьмчайно полезньми чистьми материалами для производства поликлональньїх антител и « "банков" моноклональньїх антител, специфических для отличающихся непрерьівньїх и прерьівистьїх зпитопов 470 ЕРО. В качестве одного примера, предварительньй анализ аминокислотньїх последовательностей Таблицьі Мі в пе с смьісле водолечимости в соответствии с Норр, еї аїІ., Р.М.А.5. (О.5.А.), 78, рр. 3824 - 3828 (1981) и вторичньйх ц структур в соответствии с Спо, еї аіЇ.,, Апп. Кему. Віоспет., 47, р. 251 (1978) вьіявил, что синтетические "» пептидьї, дуплицирующие непрерьівнье последовательности остатков, стягивающих позиции 41 - 57, включительно, 116 - 118, включительно, и 144 - 166, включительно, вероятно, должнь! продуцировать

Чрезвьмчайно антигенную реакцию и вьірабатьшвать полезнье моноклональнье и поликлональнье антитела, 1 иммунореактивнье как с синтетическим пептидом, так и цельм белком. Такие материальі, как ожидается, должнь бьїіть полезньі при обнаружений и сродственной очистке ЕРО и связанньх с ним продуктов. е Иллюстративно бьіли получень три синтетических пептида: с (1) ВЕРО 41-57, М-Р-0-Т-К-У-М-Р-Т-А-М-К- бу 70 в-м-Е-У-6; (23 вЕРО 116-128, К-Є-А-І-5-Р-Р-0-А-А-5-А-А; с» (3) ВЕРО 144-166, У-У-5-М-Е-І.-8-6-К--К--- т-6-Е-4-С-8-Т-6-0-8.

Предварительнье исследования иммунизации с применением вьшеуказанньїх полипептидов, вьІявили 99 относительно слабую положительную реакцию на ПЕРО 41 - 57, не поддающуюся оценке реакцию на ПЕРО 116 -

ГФ) 128 и сильную положительную реакцию на ПЕРО 144 - 166, как определено способностью сьівороточньх г) антител кролика иммуноосаждать изолятьї мочевого ЕРО человека, меченного 1292І, Предварительнье исследования активности іп мімо, проведеннье на трех пептидах, не ввіявили значительной активности как до /Каждого в отдельности, таки в комбинации.

Несмотря на то, что вьіведеннье последовательности аминокислотньїх остатков ЕРО млекопитающих, представленнье в иллюстративньїх примерах, по существу определяет первичную структурную конформацию созревшего ЕРО, следует понять, что специфическая последовательность 165 аминокислотньіїх остатков ЕРО обезьяньї в Таблице М и 166 остатков ЕРО человека в Таблице МІ не ограничивает обьема полезньх б полипептидов, предлагаемьх изобретением. Охватьяваются настоящим изобретением те различнье свободно встречающиеся аллельнье формь! ЕРО, которне в прошлом вошли в исследования биологически активньх полипептидов млекопитающих, как например, у интерферон человека. (Срав., например, иммунньій интерферон человека, имеющий остаток аргинина в положении Мо140 в ЕРО, о котором сообщалось в опубликованной заявке на патент 0077670, и вид, имеющий глутамин в положений Мо140, как сособщалось в работе Огау, еї аї., Маїшге, 295, рр. 503 - 508 (1982). Оба вида отличаются тем, что составляют последовательности "созревшего" у интерферона человека). Аллельнье формь! полипептидов созревшего ЕРО могут отличаться друг от друга и от последовательностей, представленньїх в Таблицах М и Мі, в отношений длиньі и последовательности и/или в отношений делеций, замещений, вставок или добавлений аминокислот в последовательность наряду с логически вьитекающими вариациями в способности для гликозилирования. Как отмечалось вьіше, одна 70 предположительная аллельная форма ЕРО человека, как кажется, должна включать остаток метионина в положений 126. Предположительно, встречающиеся в природе аллельнье формь! последовательностей кДНК и

ЕРО-кодирующей геномной ДНК, вероятно, также должнь! встретиться, причем кодирующими вьішеуказаннье типьї аллельньїх полипептидов или просто использующими отличающиеся кодонь! для обозначения таких же полипептидов, которне указань.

В дополнение к встречающимся в природе аллельньім формам созревшего ЕРО настоящее изобретение также включает в себя другие "продукть ЕРО", такие как полипептиднье аналоги ЕРО и фрагменть "созревшего" ЕРО. Следуя методикам указанной вьше опубликованной заявки на патент Айоп, еї а). (МУО/83/04053), можно без труда рассчитать и изготовить геньї, кодирующие микробиальную зкспрессию полипептидов, имеющих первичную конформацию, которая отличается от конформации, указанной здесь для созревшего ЕРО, с точки зрения идентичности или местоположения одного или более остатков (например, замещения, конечньіе или промежуточнье добавления и делеции). Альтернативно, модификации кДНК и генов геномного ЕРО могут бьіть легко осуществленьії посредством хорошо известньїх методик сайт-направленного мутагенеза и использовань! для генерирования аналогов и производньїх ЕРО. Такие продуктьї ЕРО должнь! обладать, по крайней мере, одним из биологических свойств ЕРО, но могут отличаться в других свойствах. Как су примерьї, проектируемье продуктьї ЕРО настоящего изобретения включают те, которье сокращень! путем, о например, делеции (Азп2, дев-Рго? по Пе"йпЕРО, Ідев-Тиг193 по Аго ЯНЕРО и "д27-55ПЕРО", причем последняя имеет остатки, кодируемье удаленньм цельм зкзоном; или которье более устойчивь! Кк гидролизу (и, следовательно, могут иметь более вніраженнье или дольше продолжающиеся влияния, чем встречающийся в природе ЕРО); или которье бьіли измененьії для удаления одного или более потенциальньїх участков для со гликозилирования (которое может привести к вьісокой активности для продуктов, продуцируемьїх дрожжами); с или которне имеют один или более остатков цистеина, удаленньїх или замененньїх, например, остатками гистидина или серина (как например, аналог (Нів ПЕРО), и потенциально более легко вьіделяются в активной і форме из микробиальньх систем; или которье имеют один или более остатков тирозина, замененньх « фенилаланином (как например, аналоги (Рпе "ПЕРО, |Рпе""йЕРО и |Рпе 7ЯПЕРО) и могут связьіваться более или менее легко с рецепторами ЕРО на клетках-мишенях. Также охваченьі полипептиднье фрагменти, о дуплицирующие только часть непрерьівной аминокислотной последовательности или вторичньїх конформаций в пределах созревшего ЕРО, причем фрагментьї могут обладать одной активностью ЕРО (например, рецепторньім связьіванием) и не другими (например, зритропозтическая активность). Особенно важнь! в зтом « отношений те потенциальнье фрагментьї ЕРО, которье обьясненьі при рассмотрениий последовательности З геномной ДНК человека, представленной в Таблице Мі, т.е. "фФрагменть" полной непрерьівной с ЕРО-последовательности, которая очерчена интронньмми последовательностями и которая может составить

Із» резко виіраженнье "доменьі" биологической активности. Примечательно, что отсутствие активности іп мімо для любого одного или более "продуктов ЕРО" настоящего изобретения в целом не препятствует терапевтической полезности (см. МУейапа, е( аЇ., вьіше) или полезности в других контекстах, таких как ЕРО-испьтания или

ЕРО-антагонизм. Антагонисть! зритропозтина могут бьіть очень полезньі при лечений полицитемиаза или в і-й случаях перепроизводства ЕРО |см., например, Адатвзоп, Нозр. Ргасіісе, 18(12), 49 - 57 (1983) и Неїтапп, еї «їз» а!., Сііп. Гаю. Наетаї., 5, 335 - 342 (1983)).

Другой особенностью настоящего изобретения является то, что клонированнье ДНК-последовательности, о описаннье здесь, которне кодируют полипептидь! ЕРО человека и обезьяньії, весьма ценньі! для информации, б 20 которую они предлагают в отношений аминокислотной последовательности зритропозтина млекопитающих, которьій до сих пор бьіл недоступен, несмотря на десятилетиями проводившуюся аналитическую обработку с» изолятов встречающихся в природе продуктов. ДНК-последовательности также весьма ценньі как продукть, пригоднье в осуществлений крупномасштабного микробиального синтеза зритропозтина при помощи разнообразия рекомбинантньїх методик. Кроме того, предлагаемье ДНК-последовательности полезнь! в 25 ввірабатьшваний новьх и пригодньїх векторов вирусной и кольцевой плазмидной ДНК, новьїх и полезньх

ГФ) трансформированньїх и трансфектированньїх микробиальньх прокариотических и зукариотических клеток-хозяев (включая бактериальнье и дрожжевье клетки и клетки млекопитающих, виіращенньє в культуре), о а также новье и пригодньіе способьї культивируемого роста таких микробиальньїх клеток-хозяев, способньх обеспечивать зкспрессию ЕРО и продуктов ЕРО. ДНК-последовательности предлагаемого изобретения также 60 являются весьма пригодньіми материалами для использования в качестве меченьїх зондов в вбьіделениий ЕРО и связанного с ним белка, кодирующего последовательности КДНК и геномной ДНК млекопитающих, других, нежели человек и обезьяна, иллюстрируемье здесь специфически. Степень возможного использования

ДНК-последовательностей в различньїх альтернативньїх способах белкового синтеза (например, в клетках насекомьх) или в генетической терапий людей и других млекопитающих, еще невозможно определить. бо Предлагаємье ДНК-последовательности, как ожидаєтся, должнь! стать полезньіми в разработке трансгенньх видов млекопитающих, которье могут служить в качестве зукариотньїх "хозяев" для получения зритропозтина и продуктов зритропозтина в большом количестве. См., главньм образом, работу Раїті(ег, еї аї., Зсіепсе, 222(4625), 809 - 814 (1983).

В свете рассмотренного здесь, конкретное описание иллюстративньх примеров, несомненно, не ограничивает обьема настоящего изобретения, и специалистам в данной области будут очевиднь многочисленнье модификации и о вариантььї его осуществления. В качестве одного примера, хотя

ДНК-последовательности, предлагаемье иллюстративньми примерами, включают последовательности кКДНК и геномной ДНК, данная заявка обеспечивает информацию об аминокислотной последовательности, 7/0 Существенной для конструирования ДНК-последовательности, изобретение таюке предполагаєт такие изготовленнье ДНК-последовательности, которье можно сконструировать на оснований знания об аминокислотньїх последовательностях ЕРО. Они могут кодировать ЕРО (как в Примере 12), а также фрагменть!

ЕРО и полипептиднье аналоги ЕРО (т.е. "продуктьї ЕРО"), которье могут обладать одним или более из биологических свойств встречающегося в природе ЕРО, однако, не обладать другими (или обладать другими в /5 различной степени).

ДНК-последовательности, предлагаемье настоящим изобретением, таким образом, должнь! охватьвать все

ДНК-последовательности, пригодньіе для использования в обеспечении зкспрессии в прокариотической или зукариотической клетке хозяина полипептидного продукта, имеющего, по крайней мере, часть первичной структурной конформации и одно или более из биологических свойств зритропозтина, и отбираются из: (а)

ДНК-последовательностей, представленньїх в Таблицах М и Мі; (Б) ДНК-последовательностей, которье гибридизируют Кк ДНК-последовательностям, определенньм в (а), или их фрагментам; (с)

ДНК-последовательностей, которье из-за дегенерации генетического кода должнь гибридизировать к

ДНК-последовательностям, определенньм в (а) и (Б). В зтой связи заслуживает внимания, например, то, что существующие последовательности генов аллельного ЕРО человека и обезьяньі и последовательности генов с ов других видов млекопитающих, как ожидается, должнь! гибридизировать к последовательностям в Таблицах М и

МІ или их фрагментам. Кроме того, из-за дегенерации генетического кода геньі ЗСЕРО и ЕСЕРО и полученнье і) или мутагенизированнье последовательности кКДНК или геномной ДНК, кодирующие различнье фрагменть

ЕРО и его аналоги, должньії также гибридизировать к указанньм вьіше ДНК-последовательностям. Такие гибридизации можно без труда осуществить в условиях гибридизации, описанньїх здесь в отношений со зо первоначального вьіделения ДНК, кодирующей ЕРО человека и обезьянь, или более строгих условиях, если желательно снизить гибридизацию фона. ікс,

Подобньм образом, хотя вьішеуказаннье примерьї иллюстрируют изобретение в отношений микробиальной (су зкспрессии продуктов ЕРО в контексте зкспрессий ДНК клеток млекопитающих, вставленной в гибридньй вектор бактериальньїх плазмидньх и вирусньїх геномньїх видов, в обьем изобретения входит большое - разнообразие систем зкспрессии. Особенно охвачень! системь! зкспрессии, включающие векторь! гомогенньх ю видов, относящихся к разнообразию бактериальньх, дрожжевьїх и клеток млекопитающих в культуре, а также к системам зкспрессии, не включающим векторь (как например, трансфекция клеток фосфорнокисль!м кальцием).

В зтой связи станет понятно, что зкспрессия, например, ДНК обезьянь! в клетках-хозяев обезьянь в культуре и клетках-хозяев человека в культуре действительно составляет пример зкспрессии "зкзогенной" ДНК, так как « ДНКЕРО, чью зкспрессию вьсокого уровня пьітаются найти, не будет иметь своих источников в геноме хозяина. у с Системь! зкспрессии настоящего изобретения, кроме того, предполагают зти действия, вьтекающие в цитоплазматическое образование продуктов ЕРО и накапливание гликозилированньїх и негликозилированньх ;» продуктов ЕРО в цитоплазме клетки-хозлина или мембранах (например, накапливание в бактериальньх пространствах периплазмь!), или в надосадочньїх жидкостях культуральньїх сред, как пояснено вьіше, или в

Ддовольно редких системах, как например, системах зкспрессии Р. аегидіпоза (описанньїх в работе Огау, еї а|., с Віогїесппоіоду, 2, рр. 161 - 165 (1984).

Усовершенствованнье методологии гибридизации настоящего изобретения, хотя и бьіли иллюстративно ве примененьі вьіше к скринингу ДНК/ДНК-гибридизации, в равной степени применимь! к скринингу РНК/РНК и 2) РНК/ДНК. Методики смешанньїх зондов, как проиллюстрировано здесь, главньім образом составляют ряд усовершенствований в процессах гибридизации, позволяя осуществить более бьістрое и надежное вьіделение

Ме. полинуклеотидов. Зти многие отдельнье усовершенствования обработки включают: улучшенньій перенос сю колоний и методики сохранения; использование фильтров на основе нейлона, таких как Сепебсгееп и

Сепебсгееп Рій, разрешающих повторное зондирование зтими же фильтрами и повторное использование фильтра, применение новьїх методов лечения протеазой |срав., например, с Таишб, еї аї!., Апаї. Віоспет., 126, дво рр. 222 - 230 (1982)); использование очень низких отдельньйхх концентраций (порядка 0,025 пикомоля) большого числа смешанньх зондов (например, более чем 32); и проведение циклов гибридизации и пост-гибридизации в (Ф, строгих температурньїх интервалах, близко приближающихся (те. в пределах 4"С и, предпочтительно, в ка пределах 27"С) к наименьшей расчитанной температуре диссоциации любого из применяемьх смешанньх зондов. Зти усовершенствования обьединяются с получением результатов, которьїх нельзя бьіло ожидать. Зто бор В полной мере поясняется тем, что методики смешанньх зондов, включающие 4 разовое число зондов, которое, как прежде сообщалось, всегда с успехом использовалось даже в ситах кКДНК на видах информационной ДНК относительно малой численности, бьіли успешно применень! к вбіделению гена уникальной последовательности в скрининге геномной библиотеки из 1500000 стерильньхх пятен. Зтот легко бьіло осуществлено, по существу, одновременно с публикацией мнения Апдегзоп, еї аЇ,, вьше, что способьй скрининга с использованием б5 смешанньх зондов бьіли "...непрактичньь для вьіделения белковьїх генов млекопитающих, когда соответственнье ДНК недоступнь!".

Отличительнье признаки изобретения, раскрьітье в предшествующем описаний, в следующей формуле изобретения и/или в прилагаемьїх чертежах, могут отдельно и в любой комбинации их стать материалом для осуществления изобретения в разнообразньх его формах.

Claims (26)

Формула винаходу

1. Вьіделенная молекула ДНК, кодирующая человеческий зритропозтин и имеющая следующую /0 ЧУуклеотидную последовательность: ОСС ССА СсСА СОС СТО АТС тТОТ САС АОС СбА сто СТО бАб лоб ТАС СТО тТТО САС ССС ААС о ОАО ССС СА ААТ АТС дсо дос о сосС тот ост САА САС ТОС АОС ТТ ААТ САС ААТ АТС АСТ ОТО ССА САС АСС ААА СТТ ААТ ТТС ТАТ ОСС ТО ААС АС АТО САС сто боб САС САС ОСС то СТА САА сто тоб САб соС сто СС сто Сто ТОб сАА ост сто сто соб сосС САС ССС Сто ТТОо СТС ААС ТСТ тТСС САС соб о тоб о сАо ССС СТО САС СТО САТ сто САТ ААА ОСС Ото АСТ бос сСтТтТ СОС дос сте АСС СТ сте стт сСо0 ОСТ СТО ОБА ССС САС ААС о САА ССС АТО ТоС 720 сСст о ссА сАТ бсо ссС тТсА ССТ ОСТ ССА СТО СОА АСА АТС АСТ ОСТ САС АСТ ТТС СОС ААА СТО ТТС СбА СТС ТАС ТСС ААТ тТтТС сто са ОСА ААС СТО ААс Сто ТАС АСА обо баб осо ТОоС АС АСА сб САС.

2. Вьіделенная молекула ДНК, кодирующая человеческий зритропозтин и имеющая следующую с нуклеотидную последовательность: о ССС ССА ССА СОС СТО АТС ТСТ САС дос СОА СТО СТО САС о АСО ТАС СТО тТтТОо САС ССС ААб САС ССС САС ААТ АТС АСС АСо сосС тот ост САА САС ТОС АОС тТТО ААТ САС ААТ АТС АСТ СТО ССА САС АСС ААА с СТТ ААТ ТІС ТАТ ССС ТОб ААб Або АТО САб сто боб САб САС ОСС СТА САА сто тоб САС сооС сто бСС сто СТО ТО о бАА ост ото сто о ССО СОС САС о сСС сто ТТОо ОТО ААС о ТСТ о ТоС САС соб тоб о бдо ССС о СТО САС СТО САТ СТО САТ ААА бос сто АСТ СОС Стт о соС дос сте «ЕЕ ВСС АСТ СТО СТТ СОб ОСТ СТО ОСА ССС САС ААС САА сс АТС ТОС ю ССТ ССА САТ Со ССС ТСА ОСТ ССТ ССА Сто ССА АСА АТС о АСТ ост САС АСТ ТТС СОС ААА СТО ТТС СОА сто ТАС ТОС ААТ ттТс сто сос СБА ААС о СтТо Ада сто ТАС АСА бас о сАс ОСС тТоС АС АСА соб БАС « 700 ВСА. -в с

3. Вьіделенная молекула ДНК, кодирующая человеческий зритропозтин и имеющая следующую нуклеотидную последовательность: ;» САА тот Ссст осс тос сто тоб сттТ сто сто тТоС осто сто тоб сте сст сто бос сто сСсА сто Сто бос ОСС сСсСА ССА СОС сто АТС тот сл 75 САС АСС ССА СТО СТО САС АСС ТАС СТО ОТТО САС ОСС ААС о сСАб сс САС ААТ АТС АСО АСо сосС ТсТ ОСТ о САА САС ТОС АОС ОТТО ААТ САС ь ААТ АТО АСТ СТО ССА САС АСС дАА сОТТ ААТ о ТТС ТАТ ОСС тоб ААб Мн АСО АТО САб сто бо САС САС СС сТА САА сто тоб САС бос сто (22) 20 сс сто сто ТСОо бАА ост сто сто соб бос СА ос ста тто сто се» ААС ОТСТ тТоС САС ССО тТОоС САС ССС Сто САС СТО САТ СТО САТ ААА сс сто АСТ соС сСтТтТ СОС дос Сто АСС СТ сто СстТ особ ост сто ОСА ССС САС ААС САА СОС АТС тТоС ССтТ о ССА САТ осо ССС о тТсА ост 25 ОСТ ССА СТО СОА АСА АТС АСТ ОСТ САС АСТ ОТТО СОС ААА сто тт Ф, СА СТО ТАС ТОС ААТ ТТ СТС СО ОбА ААС СТО ААС СТО ТАС АСА іме) ССО САС ССС ТОС АОС АСА соб САС АбА.

4. Вьіделенная молекула ДНК, кодирующая человеческий зритропозтин и имеющая следующую 60 нуклеотидную последовательность: б5

АТО со СТО САС ОСАА тот сстТ о ссс о тТос сто тосостто сто сто тес ста сто тоа сто сстосто СОС сто ССА сто сто пос ССС СсСА СсА СОС Сто АТС ТТ САС АОС СОА СТО СТО САб Ас ТАС СТО ТТ СА 9 ССС ААС САС ССС САС о ААТ АТС АСО Со СОС ТсТ ОСТ САА САС ТОС АСС ТТсС ААТ САС ААТ АТС АСТ СТО ССА САС АСС ААА СТТ ААТ То ТАТ ССС тоб ААС АОС АТО САС сто боб САС САС ОСС СТА САА сте тоб САС бос сто сСС сто Сто ТСО САА ост сто сто сс о сос САС 70 СОС о сто тт СТО ААС о тТстТ о тТоС о САС ссо тоб бас ссс сто САС сто САТ СТО САТ ААА соС сто АСТ о сСоС сСтТтТ СОС АОС СТО АСС АСтТ сте СтТтТ соб ост Сто СбА ССС САС АЛ САА ОСС АТО ТОС ССТ ССА САТ сСО СОС о тТсСА ОСТ ссСтТ о ССА СТО СОА АСА АТС АСТ ОСТ САС АСТ ТТ СОС ААА СТО ТТС СА СТ ТАС ТОС ААТ ОТТО СТО СОб ССА Ас сто ААС СТО ТАС АСА боб САС ССС ТОоС Або АСА Обб САС АбА.

5. Молекула ДНК, комплементарная последовательности ДНК, охарактеризованной в любом из пп. 1-4.

6. Молекула ДНК по п. 5, отличающаяся тем, что ковалентно связанная с определяемой меткой.

7. Молекула ДНК по п. 6, отличающаяся тем, что определяемая метка является радисактивной меткой.

8. Молекула ДНК по п. 6 или 7, отличающаяся тем, что представляет собой одноцепочечную ДНК.

9. Молекула ДНК, которая гибридизуется в жестких условиях с кодирующей белок областью молекуль! ДНК, охарактеризованной в любом из пп. 1-4.

10. Молекула ДНК по п. 9, отличающаяся тем, что ковалентно связана с определяемой меткой.

11. Молекула ДНК по п. 10, отличающаяся тем, что определяемая метка является радисактивной меткой. с

12. Молекула ДНК по п. 10 или 11, отличающаяся тем, что представляет собой одноцепочечную ДНК. г)

13. Биологически функциональньйй кольцевой плазмидньй или вирусньій ДНК-вектор, содержащий молекулу ДНК, охарактеризованную в любом из пп. 1-4.

14. Штамм зукариотических клеток-хозяев, трансформированньїх или трансфецированньїх молекулой ДНК, охарактеризованной в любом из пп. 1-4, таким образом, что клетка-хозяин способна зкспрессировать і, кодируемьй указанной молекулой ДНК человеческий зритропозтин. «о

15. Штамм по п. 14, отличающийся тем, что указанная клетка-хозяин способна гликозилировать указанньй полипептид. о

16. Штамм по п. 15, отличающийся тем, что указанная клетка-хозялин представляет собой клетку «г млекопитающего. Зо

17. Штамм по п. 16, отличающийся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой клетку СО5. о

18. Штамм по п. 16, отличающийся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой клетку СНО.

19. Штамм зукариотических клеток-хозяев, стабильно трансформированньїх или трансфецированньх ДНК-вектором, охарактеризованньм в п. 13 таким образом, что клетка-хозяин способна зкспрессировать « кодируемьїй указанной молекулой ДНК человеческий зритропозтин. З

20. Полипептид, включающий часть или полную первичную структурную конформацию зритропозтина с человека, имеющего следующую аминокислотную последовательность: "» Ме с1у Уа1ї1ї Нів сі СувБ Рко Аза Ткр Пе Ткр Пеш Пец Гец бек п Пец Пец бек Пец Рко Пец Сіу Гец Рко Уа! Пец с1у А1ї1а Рго Рко АкЧч Пец І1е Суб Авр бехт Акд Уа1! Пе Сі Ак Тук пе Пец б1и 1 А1ї1а Ппув бі Аїа Сі АБп о І1е Тк Тк сіу Сув А1їа сі нів Сув ег ей вп ц вп е ва а хто вр ХЕ ув а ви е ї5» 5 І А с1ч А Ііе тіх уа1 Р А трпх чаї А РО. с тТух А1їа Тер Пув Акуд Меє Сі уаї сіу сіп сіп А1а Уа1 Сі Уаї1ї Ф 50 Ткр біп сіу Ге Аї1а Ппей Геп бек бі Аза Уаі! Пе Аку а1і1у сіп А1ї1а Пец Пейп Уа1ї Авп бек бек сіп Рхго Ткр бі Рко пе сіп Гец м ; « Нів Уа1 Авр Гуз А1їа Уа1ї Бек с1у Пец Ака Бек Пец Тік Тіт Пей Теч Ак А1а теп с1у Аїа сіп Гув Сі Аїа І1їе бек Рко Рко Авр А1їа Аїа Бек А1ї1а А1ї1а Рко Пец Аку Тпх І1е ТПх А1їа АБр ТПх РБе ГФ! АкЧ о Ппув Ппеп Рре Ак Уа1! Тук Бек АБп РПпе Пеп Акд с1у Пув Пец т цув реп Тук Тк Сіу січ А1їа Суб Агу Тк б1у АБр Ага, обладающий биологической активностью увеличивать продукцию ретикулоцитов и зритроцитов клетками бо Костного мозга и увеличивать синтез гемоглобина или потребление железа, и характеризующийся тем, что является продуктом зкспрессии зкзогенной молекульі ДНК по любому из пп.1-4 в зукариотических клетках, и которьій обладает более вьісокой молекулярной массой по данньім ЗОЗ-РАСЕ, чем зритропозтин, вьіделенньй из мочи.

21. Полипептид по п. 20, отличающийся тем, что является продуктом зкспрессии в клетках млекопитающего. 65

22. Полипептид по п. 20, отличающийся тем, что указанньій полипептид является гликопротеидом, имеющим среднее значение содержания углеводов, отличное от такового у зритропозтина человека, вьіделенного из мМОчи.

23. Полипептид по любому из пп. 20-22, отличающийся тем, что указанная зкзогенная последовательность ДНК содержится в автономно реплицируемой кольцевой ДНК-плазмиде или вирусном векторе.

24. Полипептид по любому из пп. 20-23, отличающийся тем, что представляет собой продукт зкспрессийи молекуль! ДНК, охарактеризованной в любом из пп. 1-4, в клетке млекопитающего.

25. Способ получения полипептида, охарактеризованного в любом из пп. 20-24, предусматривающий культивирование в подходящей питательной среде зукариотической клетки-хозяина, охарактеризованной в любом из пп. 14-19, таким образом, что указанная клетка-хозяин способна зкспрессировать указанньй 7/0 полипептид, и вьіделение указанного полипептида.

26. Фармацевтическая композиция, содержащая полипептид, охарактеризованньій в любом из пп. 20-24, и фармацевтически приемлемьй разбавитель, адьювант или носитель. с щі 6) (зе) (Се) (зе) « І в)

- . и? 1 щ» (95) (о) сю» іме) 60 б5