UA44882C2 - Фрагмент геномної днк, що кодує еритропоетин, фрагмент кднк, що кодує еритропоетин, спосіб одержання еритропоетину людини (варіанти), спосіб одержання фармацевтичної композиції еритропоетину людини (варіанти) - Google Patents

Фрагмент геномної днк, що кодує еритропоетин, фрагмент кднк, що кодує еритропоетин, спосіб одержання еритропоетину людини (варіанти), спосіб одержання фармацевтичної композиції еритропоетину людини (варіанти) Download PDF

Info

Publication number
UA44882C2
UA44882C2 UA5010104A UA5010104A UA44882C2 UA 44882 C2 UA44882 C2 UA 44882C2 UA 5010104 A UA5010104 A UA 5010104A UA 5010104 A UA5010104 A UA 5010104A UA 44882 C2 UA44882 C2 UA 44882C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
cells
zpo
sto
fact
erythropoietin
Prior art date
Application number
UA5010104A
Other languages
English (en)
Russian (ru)
Inventor
Едвард Фрітч
Родні М. Хьювік
Кеннет Джекобс
Original Assignee
Дженетікс Інстітут, Інк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27418329&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=UA44882(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Дженетікс Інстітут, Інк. filed Critical Дженетікс Інстітут, Інк.
Publication of UA44882C2 publication Critical patent/UA44882C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/44—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Описано клоновані гени еритропоетину людини (ЕПО), одержані з клітин фетальної печінки людини, які характеризуються незвично високим рівнем експресії. Описано також експресію зазначених генів in vitro з метою одержання активного ЕПО людини.

Description

Опис винаходу
Настоящее изобретение касаєтся клонированньїх генов для человеческого зритропозтина, которье 2 обеспечивают необьічайно вьісокиє уровни вніражения, зкспрессии указанньїх генов получения іп міго активного человеческого зритропозтина.
Зритропозтин (далее ЕПО) представляєт собой циркулирующий гликопротеийд, которьій стимулирует образование зритроцита в вьісших организмах. См. Сагтої и др., Сотрі Кепа, 143:384 (1906). Как таковой, ЗПО иногда упоминается как фактор, стимулирующий зритропозз.
Продолжительность жизни человеческих зритроцитов составляет около 120 дней. Таким образом, около 1/120 общего числа зритроцитов разрушаєтся ежедневно в ретикуло-зндотелиальной системе. Однако, относительно постоянное число зритроцитов продуцируется ежедневно для поддержания уровня зритроцитов все время (Сцуюп, Техіроок ої Меадіса! Рпузіоіоду стр. 56 - 60, МУ.В.Зашпаегз Со., Филадельфия (1976).
Зритроцить! продуцируются путем созревания и дифференцировки зритробластов в костном мозге, ий ЗПО 79 являєтся Фактором, которьій воздействует на менее дифференцированное клетки и индуцирует их дифференцировку к зритроцитам (сиуйп, вьіше).
ЗПО представляет собой многообещающее терапевтическое средство для клинического лечения анемийи или, в частности, ренальной анемии. К сожалению, использование ЗПО еще не является общепринять!м в практической терапии вследствие его малой доступности.
Для использования ЗПО в качестве терапевтического средства необходимо тщательно обсудить возможнье вопросьі антигенности, и позтому предпочтительно, чтобьі ЗПО бьл получен из сьірья человеческого происхождения. Например, можно использовать человеческую кровь или мочу от пациентов, страдающих апластической анемией или подобньми болезнями, которье вьіделяют большие количества ЗПО. Зти исходнье материаль, однако, существуют в ограниченном запасе. См., например, МУУгіге и др., Кес. Ргодг. Ногт. с 29 Кезв., 16 - 219 (1960; Езрада и др., Віоспет. Меса, 3:475 (1970); Різпег, Рпигт. Кем., 24:459 (1972) и богаоп, Ге)
Міат. Ногт. (М.М), 31:105 (1973).
Получение продуктов ЗПО, как правило, осуществляется через концентрацией очистку мочи пациентов, обнаруживающих вьісокие уровни ЗПО, таких, как больнье апластической анемии или подобньми заболеваниями. См., например, патенть США МоМо 439780, 4303650 и 3865801, раскрьітие которьїх введено с 30 сюда в качестве ссьлки. Ограниченньйй запас такой мочи служит препятствием практическому использованию 0
ЗПО и позтому чрезвьмайно желательно получать продуктьі ЗПО из мочи здоровьїх людей. Трудность в использованиий мочи от здоровьїх людей заключается в низком содержании в ней ЗПО по сравнению с мочой со пациентов, страдающих анемией. Кроме того, моча здоровьїх людей содержит определеннье тормозящие «І факторь), которне действуют против зритропозза в достаточно вьісокой концентрации, так, что
Зо удовлетворительньій терапевтический зффект может бьть получен от ЗПО только с последующей М значительной очисткой.
ЗПО также может бьть вьіделен из плазми крови овцьї, и отделение ЗПО от такой плазун крови обеспечиваєт создание достаточно сильнодействующих и устойчивьх водорастворимьїх препаратов. См. «
СоІджшавззег СопігоЇї СеїЇшШаг Мі ОемеІор., Часть А, стр. 487 - 494, АЇїап К. 2ів8в, Іпс., Нью-Йорк (1981), З 70 которая введена сюда а качестве ссьілки. ЗПО овцьї, однако, можно бьіло бьі рассматривать антигенньім в с людях. з» Таким образов, в то время как ЗПО является желательньм терапевтическим средством, традиционнье методики вьіделения и очистки, используемье с естественньми источниками снабжения, являются недостаточньіми для массового производства зтого соединения. 45 Зидітоїю и др в патенте США 4377513 описьвают один способ для кассового производства ЗПО, т- содержащий размножения іп мімо лимфобластоидньїх клеток человека, включающих Мотаї/ма, ВАЇ І - І, МАГ І - «їз» І, ТАС - и УВІ.
В специальной литературе появилось описание получения ЗПО с использованием методов генетической со инженерийи другими авторами. Однако еще не опубликовано ни пригодного раскрьітия, ни химической природь! о 20 продукта. В противоположности зтому, настоящая заявка предоставляет пригодное раскрьтие массового производства белков, проявляющих биологические свойства человеческого ЗПО. Также является возможньм о путем зтих методик получить белки, которье могут химически отличаться от аутентичного человеческого ЗПО и все же обнаруживать аналогичнье (и в некоторьїх случаях улучшеннье) сродства. Для удобства все такие белки, проявляющие биологические свойства человеческого ЗПО, могут упомянуться далее как ЗПО, являются ли они химически идентичньми ему или нет.
ГФ) Настоящее изобретение касается клонирования гена, которьій вьтуражаєт необьмчайно вьісокие уровни человеческого ЗПО, его зкспрессии и массового производства іп міго активного человеческого зритропозтина. о Также описьіваются пригодньсе векторь! зкспрессии для получения ЗПО, зкспрессивнье клетки, схемь! очистки и связанньсе с зтим процессь. 60 Как описьівается более подробно ниже, ЗПО бьл получен в частично очищенной форме и бьл подвергнут дальнейшей очистке до гомогенности и превращен трипсином для генерации специфических фрагментов. Зти фрагменть! бьіли очищеньі и подвергнутьії определению последовательностей. Олигонуклеотидьї ЗПО бьіли затем сконструированьй на основе зтих последовательностей и синтезированьі. Зти олигонуклеотидь! бьли использованьї для скрининга человеческой геномной библиотеки, из которой ген ЗПО бьл вьіделен. бо Ген ЗПО бьл проверен на основе его ДНК-последовательности, которая спарила многие секвенированнье фрагменть! триптического белка. Отрезок геномного клопа бьл затем использован для демонстрации путем гибридизации того, что МРНК ЗПО могла бьї бьіть обнаружена в человеческой плодной (в возрасте 20 недель)
МРНК бьіла получена и подвергнута скринингу кКДНК-библиотека печени плода человека. Бьіли получень! три клона КДНК ЗПО (после скрининга ; 750000 рекомбинатов). Два из зтих трех клонов бьіли определень имеющими полную длину, как оценено по полной кодирующей последовательности и значительной 5- и 3- нетранслируемой последовательности. Зти кКДНК бьіли зкспрессированьі как в трансформированньїх клетках вируса 5М-40 обезьяна (клеточная линия СО5-І; СІй2тап, Сеї! 23:175 - 182 (1981), так и в клетку личинка китайского хомячка (клеточная линия СНО; Опіацр. с. и СпНазвзіп, І.А. Ргос. Май). Асад. Зсі. США 77:4216 - 4280 70 (1980). ЗПО, полученньій из клеток СНО, является биологическими активная ЗПО іп мійго и іп мімо. ЗПО, полученньй из клеток СНО, также биологически активен іп мігго и іп мімо
КДНК-клон ЗПО имеет интересную открьїтую рамку считьівания из 14 - 15 аминокислот /аа/ с инициатором и терминатором из 20 - 30 нуклеотидов /пі/ вверх по направленню кодирующей области. Типичньй образец Е.сої, трансформированной клонированньім геном ЗПО, бьіл депонирован Атегісап Туре Сипйиге СоїІесіоп, РоскміЇе,
Магуїапа, где он имеется в наличии под входящим номером АТСС 40153.
Таблица 1 представляет собой последовательность оснований зкзона 87 пар оснований гена ЗПО человека;
Фиг. 1 иллюстрирует обнаружение МРНК ЗПО и мРНК печени плода человека;
Таблица 2 представляет аминокислотную последовательность белка ЗПО, вьіделенную из нуклеотидной последовательности Х-НЕРОРЕ Ї 13;
Таблица З представляєет нуклеотидную последовательность КДНК ЗПО в 5Х-НЕРОБ Ї 13 (Показано схематически на Фиг. 2) и аминокислотную последовательность, вьіделенную из нее;
Фиг. З иллюстрирует относительно положению вставок ДНК четьрех независимьх геномньїх клонов человеческого ЗПО;
Фиг. 4 представляет собой карту очевидной интронной и зкзонной структури гена ЗПО человека; Га
Таблице 4 иллюстрирует ДНК-последовательность гена ЗПО, показанного на Фиг. 48;
Фиг. БА, 58 и 5С иллюстрирует коструировоние вектора 91023/В87; і)
Фиг. 6 изображаєт 505 полиакриламидньй гель-анализ ЗПО, полученного в клетках СО5-Ї по сравнению з нативньм ЗПО.
Таблица 5 иллюстрирует нуклеотидную и аминокислотную последовательности клона ЗПО, Х-НЕРОЕ І. 6; сі
Таблица 6 иллюстрирует нуклеотидную и аминокислотную последовательности клона ЗПО, Х-НЕРОЕ І. 8; со
Таблица 7 иллюстрирует нуклеотидную и аминокислотную последовательность клона ЗПО, Х-НЕРОРЕ І 13;
Фиг. 8 представляет собой схематическое изображение плазмидьі раВРУ-ММТнео (342 - 12). с
Настоящее изобретение касается клонирования генов ЗПО и получение ЗПО путем зкспрессии іп міго зтих « генов.
Патентная и научная литература изобилует способами, являющимися пригодньіми для получения « рекомбинантньїх продуктов. В основном зти методики включают вьіделение или синтез требуемой генной последовательности и зкспрессию зтой последовательности либо в прокариотньїх, либо зукариотньїх клетках используя методики, обьічно приемлемье для специалиста. Как только искомьій ген изолирован, очищен и « вставлен в вектор переноса (т.е. клонирован), его доступность в достаточном количестве обеспечена. Вектор с его клонированньім геном переносится к природному микроорганизму или линии клеток, например, бактериям, т с дрожжам, клетками млекопитающих, таких, как СО5-Ї (почка обезьяньі), СНО (яичник китайского хомячка), в линиям клеток насекомьїх и тому подобному, где вектор реплицируется как микроорганизм или линия клеток ни пролиферирует, и откуда вектор может бьіть вьіделен, при помощи общепринятьїх средств. Таким образом обеспечиваєтся непрерьівно возобновляемьй источник гена для дальнейших манипуляций, модификаций и переносов к другим векторам или другим локусам в пределах того же вектора. ве Зкспрессия часто может бьіть получена путем переноса клонированного гена в должной рамке ориентации и їз считьівания в подходящий сайт в векторе переноса так, что трансляционное считьівание с прокариотного или зукариотного гена завершается синтезом белкового исходного вещества, содержащего аминокислотную (ее) последовательность, кодируемую клонированнм геном, привязанном ок о Меї или амино-концевой о 50 последовательности от прокариотного или зукариотного гена, в других случаях сигналь! для транскрипционной и трндиционной инициации могут подаваться пригодньм геномньм фрагментом клонированного гена. кі» Множество специфических методик белкового расщепления может бьть использовано для ращепления белкового походного вещества, если оно пролудировано, в требуемой точке, с тем, чтобь! вьісвободить желательную аминокислотную последовательность, которую затем можно очистить традиционньіми способами.
В некоторьїх случаях белок, содержащий требуемую аминокислотную последовательность, продуцируется без о необходимости применения специфических методик расщепления и может бьіть также вьісвобожден из клеток в зкстрацеллюлярную питательную среду. ко Вьіделение геномного клона человеческого ЗПО
Человеческий ЗПО бьл очищен до гомогенности от мочи пациентов, страдавших апластической анемией, 60 как описано ниже. Полное переваривание зтого очищенного ЗПО трипсином протеази дало фрагменть, которье бьіли разделень! вьісокоефективной жидкостной хроматографией с обращенной фазой, восстановленьі из градиентньїх фракций и подвергнутьь микросеквеционному анализу. Последовательности триптических фрагментов подчеркнутьь в Таблицах 2 и З обсужденьй более подробно ниже. Две из аминокислотньх последовательностей МаІ-Азп-ЕПпе-Туг-АІа-Ттр-Гузв и / МаїІ-Туг-Зег-Азп-РПпе-І е0-Агу, бьли вьібрань для б5 конструирования олигонуклеотидньїх зондов (заканчивающихся олигонуклеотидньим пулом 17пі длинь и 32-кратньім дегенератом и олигонуклеотидньім пулом 18 пі и длиньї! 128-кратньім дегенератором - из первого триптического фрагмента, а также двумя пулами 14 пі длиньї, каждьй 43-кратньй дегенерат, из второго триптического фрагмента, соответственно. 38-кратньій дегенеративньій 17-мерньй пул бьл использовав для скрининга человеческой геномной ДНК-библиотеки в векторе Сі4 А /22/ с использованием модификации метода ампликации іп віш МУоо и СО МаїІеу /47/ для получения фильтров для скрининга.
Арабские числа в кргьїх скобках, // - /5І/, используется в настоящем описаний для ссьілок на публикации, которье приводятся в числовом порядке в конце описания настоящего изобретения.
Фаг, гибридизирующий к 17мег, бьіл образован, распределен на малье группьі и спробован 14мег и 18мег пулами. Фаг, гибридизирующий к 17мег, 18мег и 14мег пулам, бьіл счищен от пятен, а фрагменть! бьіли 7/0 субклонировань! в векторь! МІЗ для секвенирования путем дидезокси-метода обрьва цепи, описанного Запдег и
Сопівоп, /23/ (1977).
Таблица 1 гагсегасврссірірвссарцвосаравссісаревасосудасіссссеввсінівівсанісвю -- . - а 15 . п
АсСа пс тТОТ ССТ САА САС ТОС ДОС ТТ ДАТ САС ААТ АТС
Тіг йіу Сузв Ага бій Ніб Сув Бег БПец АБп бі АвБпо Пе
АСТ СТО ССА САС АСС АДАА СТТ ААТ ТТ ТАТ ОСС ТО Ада
ТІіг Ма! Рго Авр Тіпг був Ма! Авп о Рбе Туг Аа Тгр Був я У МВ лІЮ муз
Асо АТО осАбріравнсс НН Несе ісп це рараоагсісві Чрсвавссів
Ат МЕТ Сіш а х . с : о ак ерагїтгазагеваразірас
Таблица 2 -27 Га зо МЕТ ім МА НІ б СУ5 РКО
ДІА ТАР ЕМ ТАР ОБ) ШЕУ БО ЕВ ЩЕ 1ЕУ ЕКО ЇЕО РКО ЩЕ) бу ШЕУ РКО МАС ТЕ бу со . | со 1 юю 20
Аа оо Рго Рго АгЕ ТГец 0 Пе Сув АБр Бег Агро Ма! Пеп біш ДАгя Туг еп Пеш січ Аїа Ту5 «І 5 « 30 . 50
Сіш Ага Сбіш дАвпо Пе Тег, Те о біу оСув Ага бі Нів о Сув Бег о Пемш: Абп о бі Авпо Пе Тпг вн | . « 50 Г)
Уві Рто Авр ТЬг Шув Уві Авп рРпе Туг Аа Ттр Був АгЕ Мей Сіш Уаі Сіу Спо бій о//- лів - с с то Шк во з» Ма! біцш Уа! Ттр о біп бу Без о Ага Пез о Пес о Бег о біш Аа 0 Уві ем АтЕ Фу іп лЛіа Тец п Й Й « 90 . т. - 100
Ге Ма! о АБпо о бего бего Сіпо о Рго Тгр біш о Рго Пе Сіпо Пес Пі5 Уві Ар Буз Ав Меї Бех е 110 120 ї» сСІу Бец АгЕ бег Це о ТЬго ТВго бе о Пец о Агфо Аа Тез о (іу САга біпо Буз біч - Ав Пе Веї со 130 іх 14 со 50 Рго Рго АБр Аа Аа бБег Аа Аа Рго Пец АгЕ о ТЬго Пе Жпго Аа АБр о ТЬг рве АтЕ Бу
Ге 150 16 їз Рве Агро Уві оТуг бег Люп ре Пец АгЕ С1у Був Пси о Буз Тен Туг Тнг (У Сіш А 166 ше 99 Сув стат Тиг бу АБроагр й . Е іФ) Таблица З | І іме) 60 б5 сссддадсс ввоссдевЕс сассрсвссс дсссесосессв асассрсвсе сессррасає оссфссссссс сбссадвссс ВсеЯяВсССВя сесбдсасся оссвавсстсс о секраєравяв сесссевсес с. й . -27
МЕТ СІЛ УА, НІ5 бід; Ст5 РО
ЕВссасссяв сесрссссаф веЕсВссБавЕ дассссевсе авесдснвав АТС бо Сб САС у тстІ сст 70 АїА ТАР ОЇТЕ) ТВЕР ОВО БЕШ БОШ 5ЕК БЕ) ФЕМ ОЗЕВ БЕ)Ш РКО БУ бі ЗЕ РКО Ул, БИ СІЛ ссс тбб сто тоб стт ст сте тсс о стб СІ тоб ст сст ст бо стІС сССА ст сіб сос 5н 10 й 20
Діа. Рко Рто Дія Тем ї1е Суз Азр бет Акф МУМаї Тез Січ Акр Туг Теч Без біз Аза уз
ССС ССА ССА соб Сто АТО тот САС АСС СсА Сто СТО САС Абс ТАС СТО ТТ сСАб ббб АС й зно зо 5н к 40 біч Аїа біч зп І1їе Тьго ТБ б1іу Суз Аїа Сі Ніа Суб бег Пец Авп о біч Ава І1ее Тах
САС ССС САС ААТ АТС АС дл ССС ТсСтТ ССтТ бАА САС ТбС АС ТІС ААТ САС ЛАТ АТС СТ й : 50 60
МУаї Рто Авр Тк Був Уаї зп Ре Тух Аа Тер Був Атя Мебє Сів Уаї Сбіу біп бій іа
СТ СС САС АбСС ААА СІТ ААТ ТІС ТАТ об тоб АС. доб АТО САС сте сб САС сСАб бос . ще 80
Маї біз Уаї Тгр біп Сіу ШПез Аа Теш їез бЗехт біз Аїа ХУаї Тез Асе С1у біп Аа / Теми
СТА бАА СТС тоб САС.СоС СТ сс Сто СтТб тТосС сСАА ССТ Сто СТ сСос о сос САС соссто с й к 90 мою ОО
Тез Маї Азп о бет бек біп Ртго Тгро бім Ркго Теч б)іп Геч, ія. Чаї д5о бує Аза Уаї /-Зек
ТТО ТС АС Ст ТоС сСАб СС тоб бАС ССС СТО САС СТО САТ СІ САТ дААА бсС СІ АТ - по 120 с зо б1у Шеч Агб бек Пси Трт о Тиго Тсч Без Аг Ліа Тез біу Аїа Сіп Був біб да 016 бе бос СТІ Сбо АбС СІ СС АСТ СТ СТІ соб СТ Сто ббА бос СА / ак СА бСС Ат тес (ее) 130 " 140 со
Ріс Рго АБо АїЇа ліа бет Аа АїЇва Рко ен Агро їбг Лів ббт Аа Авро ТБт Бе Агро ув
ССТ ССА САТ сСо ССС тТСА ССтТ сССТ сСсСА Сто сСсСА С АСА АТС АСТ ОСТ САС АСтТ То сос ААА З 150 160 ч
Те Ре Актв о Уаї Туг Бех Авп Ріе Іїе с1у Шув Шеч ув Тем Туг Тпг сі Сіц дів
СТО тТтС бСА Сто ТАС ТоОС ААТ ТТС Сто Сбо ббА ААб СТО АС СТ ТАС АСА ббб сабо сс 5 165 , «
Сує Атя Таг о Сіу Азр Агро, Й -о с ТС АС АСА Сб САС АСА ТСА ссаррсе свсссасссв дЕсасассса - ссасситсссії сассавасасї "» дсгсрегрсса сасссессес сессассссе ваасссесрсс какрваисссе садсесарсе ссадсссрес п сесагрвасас Ессарсрсса всазерасає сесаврвесс арареаасев їссарадарс 0 аасіссрара ї» 395 сссаарраєв ссасавевсс аасеЕсрарвв сесарарсав вгаадсаєсса вакаордсарсх Ссваасессар їз веасарарсс асвсеєряваа / васвсесрав сеЕсасесррс: асессерсага асссраєсрсс аввасасрсг о тЕдваврвсва севассьввв сЕсрсасстга ссаєсарева сарваєрасе тгеЕдадаасис аввгревсаав (ос) 20 серсвасссге Ессавррсссс асервсаєре рсасеісссьє ЕВЕВЕсаарва всесссіггра сассеврвсв ще) вЕрЕргасса геварасаєе ВСЕВРЕЕВсЕВ ксесесррсе сесасевед: ссдларвссссе свсасссесе засеесасєссв асаарвасое авассассав аавававаавлаав
Последовательность области, гибридизирующая к 32-кратному дегенератному 17мег в одном из клонов, показана в Таблице 1. Зта последовательность ДНК содержит внутри открьїтой рамки считьівания нуклеотидь,
Ф) которье могут точно кодировать триптический фрагмент, используемьй для вьведения 17мег пула ко олигонуклеотидов. Кроме того, анализ последовательности ДНК показьювает, что 17мег гибридизирущая область содержалась внутри 87Бр зкзона, соединенная потенциальньмм акцептором сращивания и донорньім бо сайтами.
Положительное подтверждение того, что зти два клона (обозначень! здесь Х-НРО1 и Х-НЕРО2) являются геномньми клонами ЗПО получено путем секвенирования дополнительньїх зкзонов, содержащих другой триптический фрагмент, кодирующий информацию.
Вьіделение клонов КДНК ЗПО 65 Анализ Могійегтт /56/ в отношений человеческой фетальной (возраст 20 недель) печеночной мРНК осуществляли с использованием 95 пі однонитиевого зонда, полученного из клона М13, содержащего участок
87Бр зкзона, описанного в Таблице 1. Как показано на фиг. 1, сильньій сигнал может бьіть обнаружен в мРНК детальной печени. Точная идентификация зтой полосьі как мРНК ЗПО бьїла достигнута о использованием того же зонда для скрининга Х-КДНК библиотеки бактериофага мРНК фатальной печени /25/. Несколько гибридизирующих клопов бьіло получено с частотой приблизительно 1 положительньй на 250 000 подвергнутьх скринингу рекомбинантов. Полная нуклеотидная и вьіведенная аминокислотная последовательности для зтих клонов (Х-НЕРОЕ Ї 13 и Х-НЕРОЕ І 8) представлень в Таблицах 5 и 6. ЗПО-кодирующая информация содержится внутри 594пі в 5-половине кКДНК, включая очень гидрофобньій 27 аминокислотньій лидер и 166 аминокислотньій созревший белок. 70 МИдентификация М-конца созревшего белка бьла основана на М-концевой последовательности белка, вьіделяемого в моче людей с апластической анемией, как проиллюстрировано в Таблице 1 и как описано в работах Соїідмаззег /26/, Зце и Зуїкомузкі /27/ и Мапдама /21/. В настоящее время не известно, представляєт ли зтот М-конец /АІа-Рго-Рго-Аго-/ фактический М-конец, найденньій на ЗПО при кровообращенийи, или проийсходит некоторое расщепление в почке или моче.
Аминокислотнье последовательности, которье подчеркнуть! в Таблице 2 и 3, обозначают те триптические фрагментьі или участок М-конца, для которьїх бьіла получена информация белковой последовательности.
Вьіведенная аминокислотная последовательность точно согласовьивается с триптическими фрагментами, которьсе бьіли секвенировань, подтверждая, что вьіделенньйй ген кодирует человеческий ЗПО.
Структура и последовательность гена ЗПО человека
Относительнье положения вставок ДНК четьрех независимьїх геномньїх клонов ЗПО человека показань! на
Рис. 3. Гибридизационньй анализ зтих клонированньїх ДНК при помощи олигонуклеотидньхх зондов и различньх зондов, полученньїх от двух классов клонов КДНК ЗПО, определил положение гена ЗПО внутри приблизительно 3,3кб области, показанной затемненной линией на фиг. 3. Полньій анализ секвенирования зтой области (см.
Пример 4) и сравнение с клонами кКДНК привели к получению карть! интронной и зкзонной структурь гена ЗПО, с гр; показанной на фиг. 4. Ген ЗПО разделяют на 5 зкзонов. Часть зкзона І, полнье зкзонь ЇЇ, І и ІМ, а также зкзона МУ содержат белок-кодирующую информацию. Оставшиеся части зкзонов І и М кодируют 5- и і) 3З--нетранолируемне последовательности, соответственно.
Неустойчивая зксперссия ЗПО в клетках СО5
Для того, чтобьї наглядно показать, что биологически активньй ЗПО может зкспресспроваться в системе Ге Культурь клеток іп міго, осуществляли исследования, зкспрессии в клетках СО5 /58/. Вектор, используемьй для переходньїх исследований, а именно, р91023 /В/, описан в Примере 5. Зтот вектор содержит основной поздний со промотор аденовируса, последовательность полиадениляции 5М40, 5М40-начало репликации, ген-усилитель ее
ЗМ40 и ген МА аденовируса. Вставка кДНК в Х-НЕРОЕ І 13 (см. Таблицу 6) бьіла вставлена в вектор ро1023 /В/ ниже основного позднего промотора аденовируса. Зтот новьій вектор идентифицирован как рРТЕ - І 13. З
Через двадцать четьіре часа после транфекции зтого построения в штамм Мб клеток СО5-Ї (Ногом/ї2 и др., чІ
Т. Маї Аррі. Сепеї 2:147 - 149 (1983)) клетки промьіли, перевели в свободнье от сьіворотки средь!ї, после чего клетки собрали через 48 часов. Затем с использованием количественного радисиммунного анализа для ЗПО /55/ исследовали уровень вьісвобождения ЗПО в культуральную надосадочную жидкость. В отдельном « зксперименте вектор, содержащий кДНК ЗПО, из Х-НЕРОРЕ Г 13 бьл трансформирован в клетки СО5-Ї, и средь собирали, как описано вьіше. ЗПО в средах бьл затем определен количественно любьім из двух биологических - с анализов, проводимьїх іп міо, а именно, ЗН-тримидин и СРО-Е /12, 29/, и любьїм из двух анализов іп міо, а "» именно гипоксическая мьшь и голодающая крьса /30, 31/ (см. Таблицу 9, Пример 17). Зти результать " доказьшвают, что биологически активньй ЗПО продуцируется в клетках СО5-І. Под блоттингом УУевіегп, с использованием поликлонального антитела анти-ЗПО, зритропозтин, продуцируемьй клетками СО5, имеет подвижность на 5ХО5-полиакриламидньх гелях, которая идентична подвижности нативного ЗПО, полученного из ве человеческой мочи (Пример 8). Таким образом, распространение гликосилирования СО5-І, продуцирующая їх ЗПО, моет бьїть аналогичньї/м тому, что происходит в случає нативного ЗПО.
Различнье векторьії, содержащие другие промоторьі. также могут бьіть использовань! в клетках СО5 или в бо других млекопитающих или зукариотичеоких клетках. Примерь! зтих иньїх промоторов, пригодньїх в практике оо 20 настоящего изобретения, включают ранние и поздние промоторь! ЗМ 40, генньій промотор металлотионеина мьіши, промотор, обнаруживаемьй в длинньїх концевьїх повторах ретровирусов птиц или млекопитающих, ще полиздральньй генньій промотор бакуловируса и другие. Примерами других типов клеток, пригодньїх в практике настоящего изобретения, являются Е.СОЇЇ, дрожжи, клетки млекопитающих, такие как СНО (яичник китайского хомячка), С127 (зпителий обезьяньї), ЗТЗ (мьішИиньй фибробласт), СУ-І (почка африканской зеленой мартьішки) и клетки насекомьїх, такиє, как клетки от Зродоріега Іїтидірегаа и Огозорніїа те(аподавзієег. Зти дополнительнье о промоторьї и/или типьї клеток могут обеспечить возможность регулирования тайминга или уровня зкспрессии
ЗПО, продуцирующей специфичньій к клеткам тип ЗПО, или роста больших количеств ЗПО-продуцирующих о клеток в менее дорогостоящих, более легко контролируемьх условиях.
Зкспрессивная система, которая сохраняет преимущества зкспрессии в млекопитающих, однако, требует 60 меньше времени для продуцирования клеточной линии с вьісоким уровнем зкспрессии, образуется линией клеток насекомьїх и ДНК-вирусом, которьій репродуцируется в зтой клеточной линии. Вирус представляет собой вирус ядерного полиздроза. Он имеет геном двунитевой кольцевой ДНК в 128кб. Цуклеокапсид имеет палочкавидную форму и находится упакованньм в двух формах, а именно, неокклюдированной форме - мембранньй почкующийся вирус, и окклюдированной форме - упакован в белковьій кристалл в зараженном бо клеточном ядре. Зти вирусь! могут бьіть обьічньім путем размножень! іп мйго в культуре клеток насекомьсмх и откорректировань! для всох обьічньїх методов животной вирусологии. Культуральньсе средь! клеток - зто обьічно питательньій солевой раствор и 10956-ная фетальная телячья сьіворотка іп міго, вирусньій рост инициируется, когда неокклюдированньй вирус /НОВ/ входит в клетку и продвигается к ядру, где он реплицируется.
Репликация является ядерной. В течение начальной фазь 8 - 18 часов постинфекции вирусной аппликации Нуклеокапсидь собираются в ядре и впоследствий проходят Через плазменную мембрану как НОВ, распространяя инфекцию по культуре клеток. Кроме того, некоторье нуклеокапсидь! впоследствии (еще 18 часов постинфекции) остаются в ядре и закупориваются в белковой матрице, известной как полиздральное внутриклеточное включение /ЛВВ/. Зта форма не является инфекционной в культуре клеток. Матрица состоит из белка, известного как полиздрин, молекулярньй вес ЗЗкд. Каждое ПВВ имеет приблизительно їмм в /о диаметре, и в ядре могут бьїть до 100ПВВ. Ясно, что большое количество полиздрина продуцируется позже в цикле заражения, и оно составляет до 2595 общего количества клеточного белка.
Так как ПВВ не играет роли в цикле репликации іп міго полиздриновьій ген может бьіть убран из вирусной хромосоми без какого бьі то ни бьіло влияния на жизнеспособность іп мйго. При использований вируса в качестве вектора зкспрессии заявитель заменил область, кодирующую полиздриновьій ген, инородной ДНК, /5 подлежащей зкспрессии, поместив ее под контроль полиздринового промотора. Зто привело к вирусному фенотипу, не образующему ПВВ.
Зта система использовалась несколькими исследователями, найболее известньіми из которьїх являются
Реппоск и др. и Зтійй и др. (ОСгедогу Ю, Репимек, Спагіев ЗПпоетакКкег и Іоів К.МіШШег, МоїІесшаг апа Сеї
Віооду 3:84, стр. 399 - 406) сделали сообщение о вьісокозффективной зкспрессии бактериального белка, В-талактозидазь, когда тот помещен под контроль полиздрилового промотора.
Другой вектор зкспрессии на основе вируса ядерного полиздроза представлен Зтіїй и др. (Саіе Е. Зтійй,
Мах 0. Зиттегв и М.). Егазег, Моіесціаг апа Сеї! Віоіоду, 16 мая 1983, стр. 2155 - 2165. Авторь продемонстрировали зффективность их вектора посредством зкспрессии человеческого В-интерферона.
Синтезированньїй продукт бьіл обнаружен гликосилированньім и вьіделенньім из клеток насекомьїх, как можно с бьіло ожидать. В Примере 14 описаньї модификации полиздр-гена вируса ядерного полиздроза Апіодгарна
Саїйогтіса /"АсМРУ/, которне позволяют осуществить легкую вставку гена ЗПО в плазмиду так, что он может і) находиться под транскрипциональннм контролем полиздринового промотора. Полученную ДНК контрансфецируют с ДНК интактной хромосомь из АсМРУ дикого типа в клетки насекомьїх. Собьтие генетической рекомбинации приводит ок замещению области полиздринового гена АсМ РУС су зо дезоксирибонуплейновой кислотой из плазмидь. Полученньй рекомбинантньй вирус может бьть идентифицирован среди вирусного потомства посредством его обладания последовательностями ДНК гена со
ЗПО. Зтот рекомбинантньй вирус при реинфекции клеток насекомьїх, как ожидается, и продуцирует ЗПО. со
Примерь! зкспрессиий ЗПО в СПО, С127 и 313, а также в клетках насекомьїх представленьі в Примерах 10 и 11 /СНО)/ 13 /С127 и ЗТ3/ и 14 (клетки насекомь!х). «
Рекомбинантньїй ЗПО, полученньй в клетках СНО, как в Примере 11, бьіл очищен традиционньіми методами «Е колоночной хроматографии. Относительнье количества сахаров, присутствующих в гликопротеиде, анализировали двумя самостоятельньми методами /1/ Кеїіпрога Меїйодвз іп Епгутої 50:244 - 249 (Метанолиз) и /11/ Такетоїю, Н. и др. Апа! Віоспет. 145:245 /1985/ (пирил-аминнрование, совместно о самостоятельньм определением сиаловой кислотой). Результатьі, полученньюе каждьм из зтих способов, бьіли в превосходном « сСогласии. Таким образом бьло проделано несколько определений, что дало средние значения, где в с М-ацетил-глюкозамин для сравнительньх целей дан как значение 1: :» в г пи: нс 2 со (ее)
КЗ Примечательно, что значительнье уровни содержания фукозьі и М-ацетилгалактозамина воспроизводимо наблюдались при использований обоих самостоятельньїх методов анализа на сахар. Присутствие
М-ацетилгалактозамина указьівает на наличие О-оцепленного гликосилирования белка. Наличие О-сцепленного дв Гликосилирования далее отмечалось анализом ЗО5-РАСЕ гликопротеида различньми сочетаниями гликозндньїх ферментов. В частности, вслед за ферментативньмм отщеплениям всего М-сцепленного углевода (Ф) на гликопротеидах с использованием зндо М-гликозидазьї пептидного фермента, молекулярная масса белка
Ге еще более снижалась после последовательного переваривания нейраминидазой как определено анализом 5ОЗ-РАОБЕ. во Биологическая активность іп міго очищенного рекомбинантного ЗПО бьіла опробована методом С.Кіузіаїа!,
Ехр. Нетаїйої., 11:649 (1983) (биопроба на пролиферацию клеток селезенки) с детеринациями белка, рассчитанньмми на основе данньх по аминокислотному составу. После многократньїх определений удельная активность іп міго очищенного рекомбинантного ЗПО бьіла найдена составляющей более, чем 20000бединиц/мг белка. Среднее значение находилось в интервале 275000 - зЗ000Обединиц/мг белка. Кроме того, также ве наблюдались значения вьіше, чем 300000. Отношение активности іп мімо (анализ полицитемических мьішей,
Кага! и ЕгвІєеє), Ат. Сіїпісаї ар, Зсі, Том В, стр. 91 (1975)) к активности іп мйго, исследуемье для рекомбинантного материала, находились в интервале 0,7 - 1,3.
Мнтересно сравнять представленную вьше характеристику гликопротеида с характеристикой рекомбинантного СНО-продуцируемого ЗПО, ранее изложенной в Международной заявке на патент Мо У/О 85/02810 (опубликована 20 июня 1985 года). Аналогичньій сравнительньй анализ на сахар, представленньй на стр. 65 данной заявки, показьмшваєт, что значение для фукозьі и М-ацетилгалактозамина равнь! 0, тогда как отношение гексозьі: М-ацетилгалактозамин равно 15,09:1. Отсутствие М-ацетилгалактозамина указьввает на отсутствие О-сцепленного гликосилирования в ранее приведенном гликопротеиде. В противоположность зтому материалу охарактеризованньй вьше рекомбинантньй СНО-продуцируемьій ЗПО настоящего изобретения /о0 содержит значительнье и воспроизводимо обнаруживаємье количества как фукозь, так и
М-ацетилгалактозамина, содержит менее 1/10 относительного количества гексоз и отличается наличием
О-сцепленного гликосилирования. Кроме того, внісокая удельная активность вьішеописанного рекомбинантного
ЗПО на основе СНО может бьїіть непосредственно связана с его отличительньім признаком гликосилирования.
Биологически активньійй ЗПО, полученньй прокариотической или зукариотической зкспрессией 7/5 Клонированньїх генов ЗПО настоящего изобретения, может бьїть использован для лечения іп мімо видов млекопитающих врачами и/или ветеринарами. Количество активного компонента, безусловно, будет зависеть от жесткости режима, вьібранного пути введения н удельной активности активного ЗПО, и в конечном счете будет решена лечащим врачом или ветеринаром. Такое количество активного ЗПО, определенное лечащим врачом, упоминается здесь как "зффективное для лечения ЗПО" количество. Например, при лечении индуцированной 2о гипопролиферативной анемии, ассоциированной о хронической почечной недостаточностью в овце, зффективное суточное количество ЗПО найдено равньм 1Оединицам/кг в течение 15 - 40 дней. См. Езспрасі и др., У.Сііп.Іпмеві., 73:434 (1984).
Активньій ЗПО может вводиться любьім путем, подходящим для используемьїх условий. Предпочтительна иньекция ЗПО в кровоток млекопитающего. Специалисту станет ясно, что предпочтительньій путь введения с об Мзменяется с вьібранньм режимом.
В то время как активньй ЗПО можно вводить как чистое или в основном чистое соединение, і) предпочтительно иметь его в виде фармацевтической композиции или препарата.
Композиции настоящего изобретения, как для ветеринарного, так и для человеческого применения, содержат белок активного ЗПО, как описано вьіше, вместе с одним или более фармацевтически приемлемьми су зо носителями его и, по вьібору, другими терапевтическими средствами. Носитель (носители) может бьть "приемлемьм" в смьсле его совместимости с другими компонентами композиции и не вредньм для его со реципиента. Желательно, чтобьі композиция не включала окислитель и другие вещества, с которьми, как со известно, несовместимьї пестицидьі. Композиции могут бьіть представлень! в единичной лекарственной форме и могут бьіть полученьї любьм из способов, хорошо известньїх в области фармацевтики. Все способь! включает -
З5 стадию связьівания активного компонента с носителем, которой составляет один или более вспомогательньмх «г компонентов. В основном, рецептурь! приготавливают путем однородного и тщательного смешения активного компонента с жидкими носителями или тонкоизмельченньмми твердими носителями, или с обоими, после чего, если необходимо, осуществляют формование продукта в желательную композицию.
Композиции, пригодньіе для парентерального введения, включаєт стерильнье воднье растворьї активного « Компонента с растворами, предпочтительно изотоническими с кровью реципиента. Такие композиции можно 7-3) с приготавливать путем растворения твердого активного компонента в воде для получения водного раствора, и
Й придание стерильности указанному раствору может достигаться в одноразовьїх или многодозовьїх контейнерах, а например, запаянньїх ампулах или пробирках.
ЗПО/КДНК, как используется здесь, включаєт созревший ген ЗПО/КДНК, которому предшествует кодон АТО
М ЗПО/КДНК, кодирующая аллельнье вариации белка ЗПО. Один аллель проиллюстрирован в Таблицах 2 и 3. їх Белок ЗПО включаєет производное 1-метионина белка ЗПО (МеЇ-ЗПО) и аллельнье вариации белка ЗПО.
Созревший белок ЗПО показан последовательностью в Таблице 2, и начинается с последовательности АПа.Рго. ве Рго.Агд. начало которой изображено цифрой "1" в Таблице 2. МесзЗПоО одолжен начинаться с
Го! последовательности Ме. Аа. Рго. Рго. Ага...
Следующие примерь! даньі! для содействия в пониманий настоящего изобретения, действительньій обьем со которого изложен в прилагаемой формуле изобретения. Понятно, что в предлагаемьх методах могут бьть
Із вьіполненьії модификации в пределах сущности настоящего изобретения. Все температурь! вьіражень! в градусах по Цельсию и не откорректировань. Знаком для микрона или микро, например, микролитра, микромоля и т.д., служит "мк", например, мкл, мкм и т.д.
Примерь!
Пример 1: (Ф) Вьіделение геномного клона ЗПО ка ЗПО очищают от мочи пациентов, страдающих апластической анемией, в основном, как описано ранее (МіуаКке и др., 9У.Вії! Спет., 252:5558 (1977)), з исключением того, что опускают фенольную обработку и бо Заменяет термообработкой при температуре 80" в течение 5 минут для инактивации нейраминидазь!. Конечной стадией очистки является фракционирование на колонке С-4 Мудас вьісокозффективной жидкостной хроматографии (Группа Сепарации) с использованием от 0 до 9595 ацетонитрального градиента с 0,190 трифторуксусной кислоть! (ТФК) в течение 100минут. Положение ЗПО в градиенте определяют злектрофорезом в геле и анализом М-концевой последовательностью (21, 26, 27) основньїх пиков. ЗПО злюируют при 5390 65 ацетонитрила и обнаруживаєет приблизительно 4095 белка, подвергаемого вьісокозффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой. Фракции, содержащие ЗПО, вьіпаривают до 100мкл, доводят до рН 7,0 бикарбонатом аммония, переваренного до готовности 290-ньім, ТРОК-обработанньім трипсином (УМогіпіпдіоп) в течение 18 часов при температуре 372. Триптическое переваривание затем подвергают ВЗЖХ с обращенной фазой, как описано вьіше. Записьивают оптическую плотность при 280 и 214нм. Хорошо отделеннье пики Вьпаривают почти до сухости и подвергаєт непосредственно анализу М-концевой аминокислотной последовательности /59/, использую газофазннй секвениатор Модели 480А Арріїейа Віозувіетв. Полученнье последовательности приведеньй в Таблицах 2 и 3. Как описано здесь вьше, два из зтих триптических фрагментов отбираеєт для синтеза олигонуклеотидньїх // зондов. Из последовательности,
Ма!І-Авзп-РНе-Туг-АІа-Тгтр-Гуз (аминокислоть 46 - 52 в Таблицах 2 и 3), получают 17ме 32-кратной дегенерации 70 ААА
ТТССАМОСОТАСААСТТ и 18мег 128-кратной дегенерации
ААА
ССАМОСОСТАСААСТТМАС.
Из последовательности, МаІ-Туг-Зег-Авзп-РНе-І ец-Агу (аминокислоть! 144 - 150 в Таблицах 2 и 3), получают два пула 14-меров, каждьйй представляет собой 32-кратньіч дегенерат ттоМтт и тТоМ тт
ТАСАСТААСТТОСТ / ТАСАСТААСТТСТТ которье отличаются в первом положении лейцинового кодона.
Олигонуклеотидьі помечают в 5-конце ЗР, используя полинуклеотидную киназу (Мем Зи!діапіа Віоіабв) и гамма З2Р-АТР (Мем Епдіапа Микієаг)
Удельная активность олигонуклеотидов варьируєется между 1000 и ЗОбОдюйм З/ммол олигонукпеотида. сч
Геномную ДНК-библиотеку человека в бактериофаге лямбда (Гам/п. и др., 22) подвергают скринингу ч использованием модификации методики амплификации іп зіш первоначально описанной Ууоо и др., /47/ (1978). (о)
Приблизительно 3,5 х 10? фаза вьісевают с плотностью 6000 фаза на 150мм чашку Петри (средьї М/СУМ) и инкубируют при температуре 37" до тех пор, пока пятна не станут видимьми, однако маленькими (приблизительно 0,5мм). с зо После охлаждения при температуре 4" в течение 1 часа дупликатнье реплики паттернов пятен переносят к найлоновьім мембранам (Мем Епдіапа Микіеаг) и инкубируют в течение ночи при температуре 372 на чашках со со свежими средами М2СУМ. Затем фильтрь! денатурируют и нейтрализуют дотированием в течение 10 минут со каждого на тонкой пленке 0,5Н Маон - ІМ Масі и 0 5М Ттіз /рН 8/ - ІМ Масі, соответственно. Вслед за вакуумной сушкой при температуре 80" в течение 2 часов фильтрь! промьівают в 5 х З5С, 0,595 ЗОЗ в течение 1 часа, и М
Зв Кклеточнье остатки на поверхности фильтров удаляют путем осторожного соскоба сухой тканью. Зто «І соскабливание снижает фоновое связьшание зонда с фильтрами, фильтрьі затем промьшвают водой и предварительно гибридизируют от 4 до 8 часов при температуре 487 в ЗМ растворе тетраметиламмонийхлорида, 10мММ МаРО, /рН 6,8/, 5 х О-еппагаз, 0,596 5О5 и 70мММ ЗДТК. 17мег, « меченьй З2Р, затем прибавляют при концентрации 0,1пмол/мл и гибридизацию осуществляют при температуре 8" в течение 72 часов. Вслед за гибридизацией фильтрь! промьівают зкстенсивно в 2 х З5С (0,3М Масі - 0.03М ші с щитрат натрия, рН 7) при комнатной температура и затем в течение 1 часа в ЗМ ТМАСІ - 10мММ МагРО,) /рн 6,3/ м при комнатной температуре и от 5 до 15 минут при температуре гибридизации. Приблизительно 120 сильньх » дупликатньїх сигналов обнаруживают вслед за 2-х дневной авторадиографией усиливающим зкраном.
Положительнье сигнальі отбирают, группируют в пульі из 8, перевьсевают и вновь подвергают окринингу в трипликате с использованием 1/2 14мег пула на каждом из двух фильтров и 127мег на третьем фильтре. - Условия и 17мег для вьісевания и гибридизации такие, как описано вьше, за исключением того, что їз гибридизацию для 14мег осуществляют при температуре 37. Вслед за авторадиографией зонд отводят из 17мег фильтра в 50956-ном формамиде в течение 20 минут при комнатной температуре и фильтр повторно со гибридизируют при температуре 522 18мег зондом. Два независимьїх фага гибридизируют ко всем трем зондам. со 50 ДНК из одного из зтих фагов обозначен здесь Х-НЕРОЕ переваривают до готовности с помощью ЗаийзЗА и субклонируют в М1З3 для анализа ДНК-последовательности с использованием дидезокси-метода обрьва цепи, г» предложенного Запдег и Сопівоп, /23/ (1977). Нуклеотидная последовательность и вьіведенная аминокислотная последовательность открьїтой рамки считьшвания, кодирующей триптический фрагмент ЗПО (подчеркнутая область), описаньі здесь. Мнтроннье последовательности дань в строчньх буквах, зкзоннье 5о последовательности /87пі/ дань в прописньїх буквах. Последовательности, которая согласуются с сайтами
ГФ) акцептора сращивания /а/ и донора /а/, подчеркнуть. (См. Таблицу 4).
Таблица 4 іме) 60 б5 авсессевврсссссавасссарстастсгрсвравстсарсаасссараясаєстстдадестссдсссзадасс
ЕЕ вссссесарраврсвЕсССТоварсесарсессЕССсавасавсавстссяссавісссааровсвсвсаа 150 9 сесвессвСастссссісСССвСсвасссаррдсссврварсавсссссаєрасссасасясасвсссосарсаврссс свЕСадссссррарсстсавсссавусвесстрссествстсграссссвявсрессссгасссстдвсдасссс 300 ссасрсасасарсесстсссссассессасссвсрсасвсаяасасатвсавасаасавсессвассесеввссара 70 ВесесававсссстрввссассссобссостосстосСостоСоССсСсСАССССССТоТоССТоСсСссСАСССССАССо 450
ССОССАССССССССССТСТОСТОСССАСАССССССССССТоСАСАСССССССТСТОСТоСАСССссстТоссСстес
СССТОСАССССССАССТТСССооСАТСАСооСССССоСТСТоСТСАСССоСоСооССосАССТооСТоАСобАСС 600
ССОСССАСОСССССАСАТСОСОСТОСАССВ равкасесясяввст ве всЕстсссясесесссв вд ЕсссЕ ве то , о МеєбіууаїНівс . . . кравсевврастссарсяссссярстаствессавваввсввсівявсссаарвассярсвастсрссаавтасес 750 сврааревеваповивв свв савсстссасввссарсевевасттсввреварссст с вЕгваєвксаааазас го еЕБассЕВсвааврревасасавсссяввивстрарряваарааре ссср сЕсЕрсЕвсрссарсврарар 900 ваавсевдасаарстдасаасст рр всвссрдарссассастсассерссараррдезадсстссвесасассаря астрааресерессярараарсярасрсьвутарсстр ВВС и ЕЕ рсасасвесарсавваттвааєраа 1050 дв вессарераресавсасстрарсестсвсагррсгврввасарраваррасварссвввесаравасясувнвагя с аавбваарсерсесЕсссасадссассестсссссстссссусссрасестсарссстрястасстрссстарААтТСТ 1200 о - " . . ". їчо в
ССТоССТоССтСтоСстТтстостотосстостстосстосстстооссстоссАСТОСТоССССсссссАССАСОС
РгодіаТтріешТгріецечТецбегіецГешбетіецчРгоїЇ ечС1уТепРгоУзіГецб1уАТаРгоРгоАге, сч
СТСАТСТСТСАСАССССАСТССТОСАСАССТАССТСТТССАССССААССАСССССАСААТАТСАССресрарассе 1350
ТепІ1еСузАврбЗегАтрУаІТенСіпАтгеТутіечІечсСічА1ТаїтузСіцАТасічАБпІ1етих (се) сесссссавсасастссасараассісасрсісаррвссссарядаастссесссарасссаддаасствесасьх со уВсЕсевявЕввавссриваавссарасастдсссссстасасаараасаавсьяв в вссссаавссасасся 1500 « вдазассаррсазареарсааарссавсаваєссстасьссЕвЕвеЕссазвевссаравест Есадевассессєвасії «І сессвввствсвЕрсаєсссавАСССССтТСтТССТСААСАСТОСАССТТСААТСАСААТАТСАСТСТСССАСАСАС 1650
Тькс1уСсувАТ1асійНівСувбЗетГецАвпсічАвпІЗетьтуа1Руодвртй
САДАСТТААТТТСТАТСССТОСААСАССАТОСАСеєрарсьсссьсссесссссеессссгсссЕсгсеравраає « хувуа1їАвпРіетТукАзаТг різ узАтеМеєсісн І 0 2 с сесасєсвсварсстваєссссррасвааарввараасвассварявааарясавааєррарсавсававаєвавв 1800 ;» сЕВссСЕвгесесаврагестсасресссасаассссаввссрарасввссваваєвяваваавссьсьтвавсссьсв 18 авЕсссарассаассьаресавсагавсраваєсссссабссгссасавасаєссааааазаєсавісаввсвраав 1950 т» сввесвсагсввсвисарссссарасасссврааврсевавесвивавваєсьстсрарсссарвааєсевавесяя ї- савЕвавсевеваєссасассаствсассссарссссадЕвасадавсваресссєдесєсаавааардаазараза 2100 со ававааваасааєравввствсасврвагасвєсссаєваєссаєєсасісасесастісасесаєссаєссаєєсса ге» ШИ сссасссаасаарссстассясасассесссвсесястсавссввисвсЕсвввесевсеваревесаввавква 2250 до)
Ф) ко 6о 65 гагвесвасаєсссесавстдасесссадарсссастссссвсавстоссссАссАесСсССсСтТАСЛАСТСТОССАС
Уаїс1ус1пб1пАТауа1тб1иМа1їТтрбіп
ДОССТСССССТССТСТСССААССТСТОСТОСССССССАСССССТСТТССТСААСТСТТСССАССССТоСссАСССС 2400 б1убецА1абецТеибекбізА1ТауаПечсАгес1уб1пА1ТаГсешеиуа1АвпбехЗекбіпРЕоТгроІшрРко
СТОСАССТОСАТСТОСАТАААССССтТСАСТОСССТІСССАСССТСАССАСІСТоСтТоСоссСтТСтоссАсСссСсСАс
ТечСіпрецНівуа1їАвріувА1ачаїзекс1упесАкеЗекі етика хе епАхвАТаїечс1уАТасіп верадсаврарсррасассесерсєсвсссгсесЕрсаараарееварааря в ссссрссааввавсасввваась 2550 70 ЖЕвесссвсасєссссссесссссвсресассясарсвассьсстясссьстссгсресавААСсСААСССАТСТОСС
Бузбс1уА1ат1ебЗетР "СТОСАСАТОСССССТСАССТОСТССАСТСССААСААТСАСТОСТСАСАСТТТССССАААСТСТТСССАСТСТАСТ 2700 хоРкоАврА1Тал1табегАТадТаРгоїенАатеТВхт1еТЬкА1аАавртисРБедевіувІТеипРнеАкрчаїТух5
ССААТТТССТОСССОСАААОСТОААССТОТАСАСАССОСАСОССТОСАССАСАССССАСАСАТСАССАССТОТСТ
/у5 екАвпРпебечАкес1убувГечГувіезТуктигс1усісА1аСувАтетихС1уАврАкв "
ССАССТОСССАТАТССАССАССТОСССТСАССААСАТТССТТСТОССАСАСССТОСССССССАСТоСТСААСоСССС 2850
ТОСАСССССТСТСАССТСАСССССАСССТСТСССАТССАСАСТССАСТСССАССААТСАСАТСТСАССССССАСА
ССААСТСТССАСАСАССААСТСТСАСАТСТААССАТСТСАСАСССССААСТТСАССССОСАСАССАССААССАТТ 3000 т
САСАСАССАССТТТААДАСТСАСССАСАСАСССАТОСТСССААСАССССТОДОСТСАСТССССАСССТССААЛАТТ
ТСАТСССАССАСАСССТТТОСАСОССАТІТАССТСТТТТСССАССТАССАТСАСССАСАССАТСАССТоСАСААС 3150
ТТАССТСССААССТСТСАСТІСТОСАССТСТСАСССССАТОСССАСТОССТТССТОССААСАССССССТІСАСАС сч СОСССТССТОССААССАТСААСАСАССАТОСССССТССССТСТОССТСТСАТОСОСТССААСТТТТСТСТАТТСТ 3300 о
ТСААССТСАТТСАСАКСААСТОАЛАССАССяасасвасьстьтристссессвс г сеседедзасссссавассес сЕрвсссгрссссасіссЕресарся й й д 3400
Пример 2: Могйпет анализ мРНК человеческой плодной печени с бмкг МРНК человеческой фетальной печени (получена из 20-недельной фетальной печени) и мРНК печени со взрослого подвергают злектрофорезу в 0,896-ном агарозном формальдегидном сгеле и переносят к нитроцелллозе, используя метод ЮОептап и др., СеїЇ, 23:731 (1981). Однонитевьій зонд затем получают из (ее) матрицьі М13, содержащей вставку, показанную в Таблице 1. Праймером является 20мег, происходящий из того « же триптического фрагмента, что и первоначальньй 17мег зонд. Зонд получают, как ранее описано Апдегзоп и др., РМАБ, /50/ (1984), за исключением того, что вслед за отщеплением (которьій продуцирует желательньй (Ж зонд длиной 95пі, содержащий 74пі кодирующей последовательности) мальшй фрагмент очищают от матриць
М13 хроматографией на колонке с Сефарозой С14В8 и 01М Маон - 02М Масі. Фильтр гибридизируют приблизительно до 5 х 109 оточетов в минуту зтого зонда в течение 12 часов при температуре 682, промьвают в « 2 х 55С при температуре 68" и подвергают воздействию в течение 6 дней усиливающего зкрана. Однонитевая З маркерная мРНК из 1200пі (указана стрелкой) движется в примьікающем проходе. (Фиг. 1). с Пример 3: "» КДНК фетальной печени " Зонд, идентичньій описанному в Примере 2, получает и используют для скрининга библиотеки кКДНК фетальной печени, полученной в векторе Х-СП21А (Тооіе и др., Маїшиге, /25/, (1984), используя стандартнье методики скрининга пятом (Вепеп Юамів, Зсіепсе, /54/ (1978). Три самостоятельньїх положительньїх клона е (обозначеньі здесь Х-НЕРОЕ І 6 (1350 пар оснований). А-НЕРОЕ І 8 (700 п.о.) и Х-НЕРОЕ І 13 (1400п.о0.) т» вьіделяют вслед за скринингом 1 х 109 пятен. Полная вставка Х-НЕРОЕ І 13 и Х-НЕРОЕ І 6 секвенируеєтоя со вслед за субклонированием в М13. (Таблиць 7 и 5, соответственно). Только части Х-НЕРОЕ І 8 секвенируют, 5р оставшиеся подразумеваются идентичньми другим двум клонам. (Таблица 7). 5- и 3-нетранслируемье со последовательности представлень строчньми буквами. Кодирующая область представлена прописньіми
Із буквами.
Таблица 5
Ф) іме) 60 б5 дасалпдая васрарсіря дасарадася Свевваєваа . . щи сх5 РКО реаавсевЕс себєссасарс / сасесесссс сесессересс сврасесегсав сесердссасс сксеЕссавлА ТбТІ СС
АцА ТАВРО БЕ) ТАБ О БЕ БШЕШ БЕ ЗЕ МОМБШ ШЕ) БЕ БЕ РКО ГБО СУ СЕУ РКО УА, Ту еп ссс о тос сто тбб сттТ ст Сто тоб сто сто тТСо ст сСтТ Сто сбсб Сто сСсА сто сто сос а с вн 10 ! 20
А1їа Рго Рго Атв Ше 112 Суз Авр бего Агв о Уа! Без бі Агб о Ту о бе Ге бі Аїа 0/0 Гуз
ССС ССА ССА сСоС Сто АТС тТсотТ САС АСС сССбА сто Сто бАб АС ТАС СТС ТТ Ас сос Адо
Ж 5Н 3О 5 Ж 0 біо Ліа Сів олЛеп о 116 Таг о Тйтг о біу Суз ліа Січ Нів Суб бЗег о Бец о Абп о бів А5зп о 116 Тег
САС ССС баб ААТ АТС АС АС бос ТСТІ ОСТ САА САС ТоС АБС ТТС ААТ САС ЛАТ АТС АСтТ 50 60
Маї Рго АБр о ТВт Був Маї Абпо Ре Тут о Ліа Тгтр о Гуз Атф о Меє біц о Уаї Сб1у бід біпо/ліа
СТС ССА САС ДСС АЛЛА СТІ АЛІ ТІС ТАТ бСС Тбо0 АЛб АС АТС бАб бІС боб САб сСАб бо 70 во
Уаії біч Уа1і1! Тгр біп біу Пец Аїа ШБеч БГешп о бехг біз АТа Маї Бе о Атвобіу біп о Аїа 0 Ге
СТА САлЛ сто тТбо сло сб сто бос Сто Сто тТСб сСАА бсСтТ ст Сто сб обо САС сс сто х й 90 100
Теч о Маї Авп о бек о бет біп о Рко Тгр біб Рго Шбеч бій Без о Нів Уаї А5зр о Був А1а 0 У«і 0 бег Ге
ТТ бтТС дАС тТСтТ то о сСлб ССС тоС САб ССС Сто САб Сто САТ Ст САТ ААА сос тс АСТ 5) 110 120 біу БПеч Атр о бег еп о Тбт о ТВї Пец о Кеш Агф Аїа Пец біу Аза бій Гуз Січ Аа І1е бБег бос сСтТтТ Сбо АСС Ст АСС АСтТ сто СтІтТ Сб ССтТ СТ сСсА ССС САС ААб САА осо АТО тос 130 140 сч
Рго Рго АБр ДЛіа Ліа бег Аїа Афа Рго Гео о Лгф о Тіго Т1е Тс о Аїа Авро ТБго Ре Аг; Туз со
ССТ ССА САТ Сб ССС тТСА бСтТ ост сСсСА СТ ССА АСА АТС АСТ бСтТ САС о АСТО ТС сос АДА їдою ; 160 їец Рце Аге Уаїі Тух бек Ап о Рбе Теч кб біу Пув Теш Буз Теч Луг Сак біу біч Ада «
СТС ТТС ббА Ст ТАС ТоС ААТ ТТ СІ Сб ОСА АС СТ Ай СТ ТАС АСА сос САС о ссс вн бо 0 . З
Суз Ак; Лак о біу АбБр Ах . ,
То Або АСА боб баб АСА ТСА ссавввся сЕсссасесв двсасассса ссасесссесе сассаасаєї вссЕвЕвсса сасссесссе сдссасесеє ваасесерес даввввсесЕ садсесарся ссадссерсс « ссасвеасас тссавсясса всааєвасає сЕсарярвсс авареаасев єссарававрсе засескрара З с Е . єссааврваєв гсасарррвсе аассерваєре сесаравсав ваарсассса даваксався / ссааасссав т . " ввасававсе аєвссвреяваа васевссгвав сЕсасссввс асссевсааа аксеєраєрсе аввасасвсє
Есдвардсва тсвасссвсє сссрсассга ссаєсавева савраєвасе єввадаассє аввсвесав» їз» : сексдассгс сссаврссес асренсасвв ясасссессес Все всаавра дсссссеЕсва сассяррвгв
ЧК» вЕВЕваасса Єваавасаве асревввсев всссссввсе сесасевввє ссаавсьсся свбасссьвс (ее) | . аасесєсаєєсв асаараассв ааассассаа аваазаадзааааза (ее)
Таблица 6
Ко) іме) 60 б5
. . сссрессе сСЕСЕСЕрсСесС грсрсесвсас сесесСсрссс Єсесеварсс ррассевевс сассрсяссс рсессесссся асассрсесс сссЕрвасар ссессссстс ссссаряссс вСЯреясСсСре сессвсасся ссрарсіссс серудасрарея сссссевЕвЕ : -43
МЕТ СХ МАї. НІ5 СІ Суб РКО двЕСсасссев сесрссссар вЕСВССваво вдассссевсс авгсесдраг АТО 600 ТІ САС бАА тот сст
АГА ТЕРО ГБШ ТЕР О БЕ) ПЕ БЕ ЕКО ББО ПЕО БЕК БЕ РКО ББО бІЖ СЕО РО ХАБО ОБЕО су ссс тбо сто тоб стт сто сто тоб сто сто тоб сто сст сто бос сто ССбА сто сто сос 1 - 5Н 10, 20
А1а Рто Рго Акб5 Шен І1Те Сув АБро бек о Атб Ма! Пец бі Акя Тук о Ббец о їбйеш бі Аза 0 Був
ССС ССА ССА СбС Сто АТС ТСТ САС АСС ССА Сто СТ САб АС ТАС СТ ТІб сСАб ббб 0 ААс ж Но. 30 5н Ж 50
Січ Аїа Сі Азп о Т1е ТІ ТЬБг біу Сув Аа біц Нів був бет Пе А5по бі АБпо ІЇ1е Те
САС бСС бАС ААТ АТС АС АСС сб ТСТ ост САА САС То Або ТТ АТ САС ААТ АТС О0ОАСТ 50 60
Уаї Рго Авр Тіт Ффуз Ма1ї Азп РБе Тут Аїа Тер ПШуб о Атб5 Мес бі УМаї сС1іу біп Сіп о Аза
СТО ССА САС АСС ААА СТТ ААТ тТтТС ТАТ оСС тоб ААб о АСС АТС САС сто б0б САС СсАб бос 70 во
Уа1 Сіш о Уаї Тер біп сС1іу Пец о Аїа Теч о Бе о бек біб Аїа Уаї Тез о Атв о біу біп Аза Те»
СТА бАА сто тТбо сСАб бос сто бос сто Сто тТСо сАА ост сто. сто соб бо САС ссс сте
Ж , 90 100 см 29 Те Уаї Авп его бег Сіп Рго Ттр Сі Рго Тез Сбіп Те Нів Ма! Авр о їСув Аза 0 УМаї /-бег Ге)
ТТ СТС ААС ТСТ о ТоС САС СОС ТосС САС СОС Сто САС СТ САТ СТС САТ ААА бос сто АС : 110 | 120
С1у Теч Ак бек їШец Тк о Твж Тец о Печ Аг5 Аза Іезч Сбіу Аа біб Був Сі Ага І1е /-5ег сч ссС стІ СбС АбсС СтС АСС АСТ Сто СТІТ Сбб ост СТ ббА Сб САС ААб САЛА бос АТС тес . 130 150 со
Ркго Рго Авр Аїа Аіа бет Аїа Аїа Рго Пец Агф о ТВг о І1е Тв о Аза Азро ТВх Ре Аг ув со
ССТ ССА САТ ббб ССС ТСА ССТ ССТ ССА Сто ССА АСА АТС АСТ бСТ САС АС ТІ Сб АлА 150 | М їцеч Рве Аг Уаї Тук бог Люп о Рйе Бенц Агро біу уз Ге Був Тем Тут Тв о біу біч «Е
СТО ТТ СбА СТ ТАС ТоС ДАТ ТІС СТ Сбб СА АС Сто АС СТО ТАС АСА Сбб 0 бАс
Таблица 7 - с . ит
ЧК»
ЧК» (ог) со 50
І» (Ф, ко бо 65 сссдварсс рдассвдвас 0 сассдсдесс вессевсеіссуя асзссдсдес ссесвдасая ссвсессссс сбсесарвссс ЯСрЛВВСЕВВ ссссвсасся ссвавссссс среласрарвя сссессевіве я -27 7
МЕТ бу УА НІБЄ С су5 РКО васслессря сдедесессар ВЕсАсЕВравЕ дассесресс аввсвсвррав АТС боб Сто САС А тст сст
АГА ТР ТЕ ТАРО СЕУ БЕ ДЕ ОБ5КА БЕ МЕ) 5 ШЕУ РО БЕ СО БЕ) РО УЛ, СО с ссс о тоб о сто тос, сттТ стТС сто тос сто сто тоб сто ссСТ Сто со Сто сССА ст сто сос 1 5 10 - 20
АІа Рко Рго Агро Бе ЇІ1Тее Су5 Лер о бег о Акв о Уа! БПеп о бій Агро Туг о бе без біб Ліа Гу
ССС ССА сССА Соо Сто АТО ТОЇ бас лоб сббА Сто Сто баб Або ТАС Сто ТТ баб сс пе ж 5 30 5Н Ж 40
Січ Аїа біц о леп о Те Тіт Тік Сіу Суз ДЛіа біз НІб5 Субз бБег о бе о Абзп о біз о л5п 116 тТвс
САС ССС баб ААТ лтТС Асб у чи ССС ТСТ СТ САА САС ТС АСС ТІС ДАТ САС ААТ АТС АСТ 50 6о
УМа1ї Рго Абр ТБт Туз о Уаі вп о Ре Туго Ліда Тгр Губ Атдо Меє бі о УМаї1ї Сіу Сіп о біпо Аа
СТО ССА САС АСС ААА СТ АЛЕ ТІ ТАТ бос Тбб АЛоО Або АТО сАо дете бо САС о сабо ссс 70 й во
Ма1 бій Маї Тгр о біп біу си Аіа Беч о КПси бек о біц Аза Уаї Гей Аг; о біу Сіп Лія 0 Гец сч в СТА бла СтТС тб САС бос Сто ССС Сто Сто ТСб о сСАА СТ Сто сто соб бос Сас бос сто х 90 100 їец МУаї лап, бек бек (іп Ркго ТЧЛкр Сі Рго Шец бій Ген о Нів Уа! Або БШуб5 АїЇа 0 Уаі /бег
ТТ Сто ААС ТСТ тТОС САС ССО То баб сс Сто САС СТО САТ Сто бАТ АлА ССС сто АСсТ по і2го см
СІу Сеп о Лів о Бегт Се Тако Тато Пси без Лгр о лЛіа ТЇвеч о Сіу Аїа Сіп о Буб5 біч Аа І1е бог со
СОС СТІ Сб АбС Сто АС АСТ СТО СТТ сбб бсСтТ Ст сбА ССС Сас у Ас САА бсо АТС то . 130 ще 140 со
Рто Рго АБр Аа іа бехг Ліа Ліа Рто Геч Люр Тк 11е ЛЬ Аа Ар Тс Ре Акя цу «
ССТ ССА САТ ССС бсС ТСА ОСТ ССтТ сССА СТІС ССЛ АСА АТС АСТ бСТ САС АСТ ТІ Сб АлА ; | . - . 150 І6во0 їсч Рис Аг о Маї Туг о бег Авп о Ре Іси Агл о біу уз еп Був Се Тук Льг біу біч Аа
СтТС о ТІС сСсСА СТС ТАС ТОб АТ ТІ СТ ССС СсА ААС Сто ААС СТ ТАС АСА боб СА сс «
Би 166 | шщ
Суз Ага Тако біу зр Агв . с ТСС АбО АСА Сб САС АСА ТСА ссавдев гдгЕссассгв васасассса ссассесссс сассаасасєх ц . ,» дсесвсдсса сасессессссе сессассссеє ваассссвес ваввввессся сарсесався ссавсеслсс 15 ссасетрасас сссадсрсса всаасрасає сесадеввсе ававевассе сссарадавс аассссрзва ве ссгдадкаєв ссасадядсе аасссраввв сссарадсар Ваавсдссса вававсавсє « Есазасесар ве двасарарсс асвсеввваа васвсседав сесасесерс ассссрсааа ассесвраєсрсс: аврасасевсе
Со 5 севдарвсва сесассевсє сесвсасесса ссаєсаєрвра савваєвасе кряаваасес аквсввсзат со ; і ' ' ' сЕдедасссс єссадвдессе асвкрсасвй всасесссес ВЕгсвесаада - Дсссссісра. / сассввервся о) І вгряваасса сеаавасаряе агрлввлвсЕв ВеСЕСЕВЕсСЕ сесасеввве о ссвавссесь сдсастсссс апсессаєср асааваасегв азассассаа аалаааааааав | що Ще щ | . й І і
В отношении Таблиц 2 и З следует упомянуть, что вьіведенная аминокислотная последовательность,
ГФ) показанная ниже нуклеотидной последовательности, пронумерована, начиная с цифрь для первой г) аминокислоть! созревшего белка. Мнимьій лидерньй пептид указан во всех верхушках для аминокислотньх обозначений. Остатки цистерна в созревшем белке дополнительно указань! 5Н, и потенциальнье М-оцепленнье во сайть! гликосилирования обозначеньі звездочкой. Аминокислоть!ї, которне подчеркнутьі, отмечают те остатки, идентифицированньюе секвенированием М-концевого белка или секвенированием триптических фрагментов
ЗПО, которне описаньії в Примере 1. Частичное подчеркивание указьіваеєт на остатки в аминокислотной последовательности определенньїх триптических фрагментов, которьіе не могли бьіть определеньї однозначно.
КДНК-клоньї Х-НЕРОЕ Г. 6, Х-НЕРОБК І 8 и Х-НЕРОБЕ І 13 депонировань и доступньі из Атегісап Туре Сийшге 65 СоПесіоп, КоскКмШе, Магуїапа под входящими номерам АТСС 40156, АТСС 40152 и АТСС 40153, соответственно.
Пример 4:
Геномная структура гена ЗПО
Относительнье размерьі и положения четьірех самостоятельньїх геномньїх клонов ( Х-НЕРОЇ, 2, З и б) из библиотеки НаейП/Аїші проиллюстрировань! перекривающимися линиями на Фиг. 3. Утолщенная линия указьіваєт положение гена ЗПО. Масштаб (в Кб) и положения известньїх сайтов расщепления зндонуклеазами рестрикции приводятся. Область, содержащая ген ЗПО, подлостью секвенирована из обоих тяжей с использованием направленньх зкзонуклеаза ІП-генерированньїх рядов делеций через зту область. Схематическое изображение пяти зкзонов, кодирующих МРНК ЗПО, показано на фиг. 4. Точная 5-граница зкзона 1 в настоящее время 7/0 неизвестна. Белок - коюодирующее участки зкзонов затемненьі. Полная нуклеотидная последовательность зкзонов показана в Таблице 4. Известнье предель! каждого зкзона очерченьї сплошньіми вертикальньіми полосами.
Геномньсе клоньї Х-НЕРО1, Х-НЕРОЗ2, Х- НЕРОЗ и Х-НЕРОбЄ деполировань и доступнь! из Атегісап Туре СиПйиге
СоПесійоп, КоскмйПе, Магуїапа, под входящими номерами АТСС 40154, АТОС 40155, АТСС 40150 и АТСС 40151 соответственно.
Пример 5:
Конструирование вектора р91023 /В/
Вектором трансформации является рдар2гбзмрА /З3/, описанньїй Кашцїтап и др., Мої. Сеї! Віо!., 2:1304 (1982).
Конструкция зтого вектора показана на фиг. 5А. Короче говоря, зта плазмида содержит кДНК-ген дигидрофолятредуктазьї мьіши /ЮОЕМЕ/, которьій находится под транокрипциональньм контролем основного го позднего промотора аденовируса 2 /Ай2/. 5-сайт сращивания указан в аденовирусной ДНК, и 3'-сайт сращивания, проийсходящий от гена иммуноглобулина, присутствует меду основньім поздним промотором аденовируса 2 и ОРЕНР-кодирующей последовательностью. Ранний сайт полиаденилирования 540 присутствует по направлению ниже от ЮОЕНР-кодирующей последовательности. Участок прокариотического происхождения рдаз2б5мурА /3/ исходит от резуОа/Меїйоп и др., СеїЇ, 27:279 (1981) и не содержит Га последовательности рВК322, нзвестнье тем, что они ингибируют репликацию в клетках млекопитающих (І изКку и др., Майте, 293:79 (1981)) рдар2б рА /3/ превращают в плазмиду рСУМ5М | 2, как показано на фиг. 5А і) рдар2г2гбу5 рА /3/ превращают в плазмиду рдара2гб 5мрА /3/ /а/ деленной одного из двух сайтов Рзїї в плазмиде раар2б ЗурА /3/. Зто осуществляют путей частичного переваривания Рвзії используя недостаточность фермента таким образом, что получают субпопуляцию линеаризованньїх плазмид, в которой только один сайт с
Рей расщеплен, о последующей обработкой ферментом Кленова, сшиванием для рециркуляризации и скринингом для делеции сайта Рзії, расположенного 3' к полиадениляционной последовательности ЗМ10. со
Трех раздельньйй лидер аденовируса и геньї, ассоциированнье с вирусом (УА геньі), вставляют в плазмиду (о рдарг2б65МрА/З/ /а/, как показано на фиг. БА. Во-вторьіх рдар2гб5ЗмМрА/З/ /а/ расщепляют РиціЇ для создания линейной молекульі, открьітой внутри 3-части трех злементов, содержащих трехраздельньй лидер. Затем З рРОАМУ 43 (7ап и др., СеїЇ, 16:851 (1979)) переваривают Хпої, обработанньм фрагментом Кленова, переваривают «Ж руш, и фрагмент из 140 п.о., содержащий вторую часть третьего лидера, вьіделяют злектрофорезом в акриландо геле /6/ в буфере бората Тіз; Мапіайв и др., вьіше. Фрагмент 140п.о. затем сшивают с
Руші-переваренной плазмидой рдар2бзмМрА/З/ /а/. Продукт сшивания используют для трансформации Е.сої в « устойчивость к тетрациклину, и колониий подвергают окринингу о использованием методики Сгишзіеїп - Нодпезв, применяя зонд, меченьй ЗР, гибридизирующий к Фрагменту из 140п.о. ДНК получают из положительно - с гибридизирующих колоний для испьітания того, является ли реконструированньй сайт РушіІ 5-или 3 - и вставленной ДНК из 140п.о., специфичной ко второму и третьему поздним лидерам аденовируса. Правильная ,» ориентация сайта Руці! - на 5'-стороне вставки 140п.о. Зта плазмида обозначена ітрі на фиг. 5.
Фрагмент Ама І О вируса 5М40, содержащего последовательность знхансера 5М40, получают путем переваривания ДНК ЗМ40 фрагмента Ама ІІ. затупления концов фрагментом Кленова РоїІЇ, сшивания Хпо т» 1-линкеров с Фрагментами, переваривания Хпо 1 для открьвания сайта Хпо 1 и вьіделения четвертого, ї» найбольшего фрагмента /0/ посредством злектрофореза в геле. Зтот фрагмент затем сшивают с ртРі. разрезом Хпо 1, получая плазмиду рРСУБУІ. 2-ТРІ. Ориентация фрагмента О5М10 в рСУзУї 2-ТРІ. такова,, что (ее) поздний промотор вируса 5М40 находится в такой же ориентации, что и основной поздний промотор со 50 аденовируса.
Для интродуцирования генов, связанньїх о аденовірусом /генов ХА/, в рСУБУ І. 2-ТРІ,, вначале конструируют що) плазмиду рВРЗ22, которая содержит фрагмент в Ніпа ПШ аденовируса типа 2. ДНК аденовируса типа 2 переваривают Ніпа Ії и фрагмент В вьіделяют злектрофорезом в геле. Зтот Фрагмент вставляют в плазмиду рВРЗ22, которая предварительно бьіла переварена Ніпа ПІ. После трансформации Е.соїї в устойчивость к ампициллину рекомбинантьі подвергают скринингу для вставки фрагмента В Ніпа І, и вставленную о ориентировку определяют путем переваривания рестрикционньмм ферментом. рвВРЗ22 - Аа Ніпа І В содержит фрагмент В Ніпа Ії аденовируса типа 2 в ориентация, изображенной на фиг. іме) 5В.
Как показано на фиг. 5Б, геньі МА удобно получает из плазмидь! рВР322 - Аа Ніпа ІІІ В путем переваривания бо Нра І, добавления линкеров ЕсоКіІ и переваривания ЕсоКіІ о последующим восстановлением фрагмента 1,4кб.
Фрагмент, имеющий липки конць! ЕсоКіІ, затем вшивают в ЕсоКіІ-сайт РТІ, ранее переваренной ЕсокКіІ. После трансформирования НВІОЇІ Е.соїї и отбора для устойчивости к тетрациклину, колониий подвергают скрянингу посредством фильтр-гибридизации в ДНК, специфичную для генов УА. ДНК получают из положительно гибридизирующих клонов и охарактеризовьнвают перевариванием рестрикционной зндонуклеазой. Полученная 65 плазмида обозначена р9о1023.
Как показано на фиг. 50, два сайта ЕсокК!І в плазмиде рОо1023 отщепляют путем разрезания ро1023 до готовности при помощи ЕсокКіІ, восстановления двух ДНК-фрагментов, один около 7кб и другой около 1,3кКб.
Последний фрагмент содержит геньі УА. Концьі обоих фрагментов заполняют с использованием фрагмента
Кленова РоїЇ и два фрагмента затем сшивают один к другому. Плазмиду ро1023/А/. содержащую геньі УА и являющуюся аналогичной плазмиде р91023, однако потерявшую интерстициальньй фрагмент для двух сайтов
ЕсоКІ, идентифицируют посредством скрининга Сгипвівїпй - Нодпез5з о фрагментов гена УА, а также традиционного анализа рестрикционного соайта.
Один Рв 1-сайт в плазмиде ро1023/А/ отщепляет и заменяют на ЕсоКі-сайт. р91023/А/ разрезают до готовности при помощи Рвзії и обрабатьшают фрагментом Кленова Роїї для генерации прорастающих концов. 7/0 ЕсокКіІ-линкерьі сшивают с тупоконечньїм сайтом Рзїї плазмидьі ро1023/А/. Линейную плазмиду ре1023/А/ о
ЕсоКіІ-линкерами, присоединенньми в тупоконечном сайте Рвїї отделяют от несшившихся линкеров и переваривают до готовности ЕсокКіІ, после чего повторно сшивают. Плазмиду р91023/В/, как изображено на фиг. 5С, восстанавливают и идентифицируют как имеющую структуру, аналогичную плазмиде ро102390/А/, но вместо прежнего сайта Рвїї содержится сайт ЕсоКІ. Плазмида ро1023/В/ депонирована и доступна из Атегісап Туре
Сипйиге СоПесіоп, КоскКміПе, Магуїапа, под входящим номером АТСС 39754.
Пример 6.
КДНК-клонь (Х-ЕРОРЕ І 6 и Х-ЕРОЕ І. 13, Пример 3) вставляют в плазмиду р9о1023/В/, образуя рРРТЕ І 6 и рЕТ
Е І. 13, соответственно. мкг каждой из очищенньх ДНК затем используют для трансфекции 5 х 105 клеток СО5, используя ЮОЕАЕ-декотран-метод (ниже). Через 12 часов клетки промьвают и обрабатьвают Хлорохином (0О1ММ) в точение 2 часов, промьівают вновь и вьідерживают в течение 24 часов в 1Омл средах, содержащих 1096-ную фетальную телячью сьіворотку. Средьі меняют на 4мл средьі, свободнье от сьіворотки, и собирают через 48 часов.
Получение иммунологическя активного ЗПО определит количественно радисиммунннм анализом, как описано Зпегмоод и Сіодмжавззег /55/. Антитело поставлено Доктором Уцайй Зпепмоод. Кодированньй изотопньй с индикатор получают из гомогенного ЗПО, как описано в Примере 1. Чувствительность пробь! составляет о приблизительно нг/мл. Результать! приводили ниже в Таблице 8. сч зо со с
АТ Г 13 депонирована и доступна из Атегісап Туре Сийиге Соесіоп, КоскуШе, Магуїапа под входящим номером АТСС 39990. «
Пример 7, «
КДНК ЗПО (Х-НЕРОРЕ І. 13) вставляют в плазмиду р9о1023 /В/, трансформируют в клетки СО5-1 и собирают, как описано вьіше (Пример б), за исключением того, что хлорохинную обработку опускают.
Биологически активньій іп міо ЗПО измеряют с использованием либо колониеобразующей пробь о клетками фатальной печени мьши в качестве источника СЕМ-Е, либо пробь! поглощения ЗН-тимидином, « используя клетки селезенки от мьішей, иньекцированньїх фенилгидразином. Чувствительности зтих анализов с составляют приблизительно 25мМЕдиниц/мл. Биологически активньй іп міго ЗПО измеряют о использованием ц либо метода гипоксической мьіши, либо метода голодающей крьісь. Чувствительность зтих анализов "» составляет приблизительно 100мЕдиниц/мл. Никакой активности не обнаружено ни в одном из зтих опьтов с имитированной кондиционированной средой. Результать ЗПО, зкопресомрованного клоном ЕРОБ | 13, показань ниже в Таблице 9, где приведеннье активности вьіражень! в единицах/мл, с использованием ьч торгового, количественно определенного ЗПО (Тоуобо, І пс.) в качестве стандарта. 2 со я. со АГ 10ямту го 7 ппоюжеоеямншє, 11 Едмл, 111 толодающаякрьсі///// 21777771 Едімо!
Ф) Пример 8: Гель-анализ полиакриламида ЗО5 ЗПО из клеток СО5 180нг ЗПО, вьісвобожденного в средь! ко клеток СО5, трансфекцированньх кКДНК ЗПО (Х-НЕРОЕ | 13) в векторе 91023 /В/ (вьіше), подвергают злектрофорезу на 10956-ном геле полиакриламида І аетіїї 5О5 и злектропередают нитроцеллюлозной бумаге 60 «Томбіп и др., Ргос. Маїі. Асай сі США, 76:4350 (1979)). Фильтр зондируют антителом анти-ЗПО, как описано в
Таблице 8, промьіввают и повторно зондируют белком А 722І-стаф. Фильтр авторадиографируют в течение двух дней. Нативньй гомогенньій ЗПО описан в Примере 1, и его подвергают злектрофорезу или перед (проход В), или после йодирования (проход С) (см. Фиг. 6). Используемье маркерьі включают метионин, меченьй 958, сьівороточньїй альбумин (68000д) и яйичньїй альбумин (45000д). 65 Пример 9:
Конструирование ККІ-4
Фрагмент Ват НІ-РмШЇ из плазмидьі РОМ2 НГР (З!цргатапі й др., Мо! СеїІ.Віої. 1:854 - 864 (1981), содержащий ранний промотор 5М40, смежньй с гном дигидрофолятредуктазь! мьіши (ОНЕК), знхансер 8540, мальй антигенньій интрон Її и последовательность полиаденилирования 5М40 вьіделяют (фрагмент А).
Оставшиеся Фрагменть! получают из вектора ро1023/А/ (вниіше) следующим образом, ро1023/А/ переваривают
Рзі! в единственном сайте РвїЇ около промотора аденовируса для линеаризации плазмидь, и либо сшивают с синтетическими конвертерами Реї | - ЕсоКІ и рециркулизуют (создавая сайтьі! Рв | Есок!І - Рв | в первоначальном сайте Рвї І; 91023/8В'/, либо обрабатьвают большим фрагментом ДНК-полимеразь! | для разрушения сайтов Рв І и сшивают о синтетическим ЕсокКіІ -линкером и рецеркулизуют (создавая ЕсокКіІ-сайт в 7/0 первоначальном сайте Рваї І; 91023/8В/. Каждую из двух полученньїх плазмид 91023/В/ и 91023/8'/ переваривают хра и ЕСОКІ для получения двух фрагментов (Е и б). Путем соединения фрагмента С из плазмидьї рО1023/В/ и фрагмента Е из плазмидьї р9о1023/В'/, а также фрагмента С из плазмидь! рО1023/В/ и фрагмента Е из плазмидь! ро1023/В'/ создают две новьіе плазмидь, которье содержат либо сайт Есокі - Рв І, либо сайт Рай! - ЕсокКіІ, где
Ра - сайт, являющийся найболее близким к основному позднему промоторе аденовируса назван ро1025/С/,
Вектор ро1023/С/ переваривают Хпої! до готовности, и полученную линеаризованную ДНК с липкими концами затупляют путем реакции наполнения концов большим фрагментом Е.соїї ДНК-полимеразь !. К зтой ДНК пришивают фрагмент Ніпа ПІ - ЕсоКіІ из 340п.с., содержащий знхансер 5М40, полученньій следующим образом:
Фрагмент Ніпа ПІ - РмушіІ из вируса 5М40, которьій содержит основу 5440 или репликации, а также знхансер вставляют в плазмиду в ІасЛіШе и др., Мо/!.Віої.Мейд., 1:473 - 488 (1983)) Вектор с Іас получают 2о перевариванием ДНК с Іас с Ватні, наполнением липкого конца большим фрагментом ДНК-полимеразь І и перевариванием ДНК Ніпа ІІ. Полученная плазмида (с зУНРІас) регенерирует ВатНі-сайт путем сшивания с тупьім концом Руи ІІ. Фрагмент ЕсокКіІ-Ніпа ІІЇ получают из с зУНРіас и пришивают к фрагменту ЕсокіІ - Ніпа Ш Р зМод/Мегїоп и др., вьіше), которьій содержит плазмидную основу репликации, и отбирают полученную плазмиду рУНРОЗ. Затем получают фрагмент Есокі -- Ніпа Ії из 340п.о. плазмидьї РАМНРОЗ, содержащий основу 5М40 сч ов (знхансер, затупляют с обоих концов при помощи большого фрагмента ДНК-полимеразьі І и сшивают с
Хпо!І-переваренньім, тупоконечньм вектором р9о1023/С/, описанньм вьіше. Полученную плазмиду /рео1023/С/ і) (Хпо) плюс ЕсокіІ/Ніпа Ш/тупая основа 5М40 плюс знхансер/, в которой ориентация фрагмента Ніпа І! -ЕсокіІ такова, что ВатНі-сайт внутри фрагмента является близлежащим к гену МА, назьвают рЕ5105. Плазмиду
РЕБІО5 переваривают ВатНі и Рми ІІ, а, также отдельно РушіЇ, и вьіделяют Фрагмент ВатНі - Рми ЇЇ, с зо содержащий основной поздний промотор аденовируса (фрагмент В), и фрагмент Рми ІЇ, содержащий плазмиду в течение периода устойчивости гена (устойчивости к тетрациклину), а также другие последовательности со (фрагмент С), Фрагментьї А, В и С сшивают и полученную плазмиду, показанную на фиг. 7, вьіделяют и со обозначают РКІ-4. Плазмида РКІ-4 депонирована Атегісап Сийиге СоПесіоп КоскКмйе, Магуїапа, где она доступна под входящим номером АТСС 39940. «
Пример 10: «Е
Зкспрессия ЗПО в клетках СНО - Метод 1
ДНК (2Омкг) из плазмидь рРТЕ І. 13, описанной вьіше (Пример 5), отщепляют рестрикционной зндонуклеазой
Сіа І для линеаризации плазмидь и сшивают с Сіа І-отщепленной ДНК из плазмидьі рдар2гб5змр/А/ І (2мкг), которая содержит интактньій ген дигидрофолятредуктазьі! (ОНЕК), приводимьїй в действие основньїм поздним « промотором аденовируса Кашїтап и зЗпагр, Мої.апа Сеї! Віоі., 2:1304 - 1319 (1982)). Зту сшитую ДНК используют Ше) с для трансфекции ОО НЕ К-отрицательньїх клеток СНО (БШКХ-ВІЇ, Спавіп Г.А. и Опаб о. (1980) РМАЗ 77:4216 - . 4220/, и после двухдневного вьіращивания клетки, которье приняли в себя по крайней мере один ген О НЕ Кк, а отбирают в альфа-средах, не имеющих нуклеотидь, и пополняют 10956-ной диализированной фотальной бьічьей сьівороткой. Вслед за ростом в течение двух недель в избирательньх средах, колониий извлекают из первоначальньх чашек, обьєединяет по группам из 10 - 100 колоний на пул, повторно вьісевает вниращивают до ї5» слияния в альфе-средах, не имеющих нуклеотидь». Отстоявшиеся среди из пулов, вьіращенньїх до метотрексатной селекции, опробуют на ЗПО опосредством радисиммуноанализа (КІА). Пуль, которье ве показьвают положительное ЗПО-получение, вьіращивают в присутствиий метотрексата (0,02мМкМ) и затем
Го! субклонированньй из пула Сіа 4,4,02 ЗПО, вьісвобождает 46бОнг/мл ЗПО в средьі, содержащие 0,02мкМ МТХ (Таблица 10). сіа 4 4,02 - 7 ЗПО представляєт собой клеточную линию вьібора для получения ЗПО и со депонирован Атегісап Туре Сийиге СоПесіоп под входящим номером АТСС СКІ 8695. Зтот клон подвергают
Із позтапному отбору при возрастающих концентрациях МТХ и, по-видимому, он будет продуцировать клетки, которье обнаруживают даже более вьісокие уровни содержания ЗПО. Для пулов, которве являются отрицательньми при КІА, метотрексат-устойчивье колонии, полученнье из зквивалентньїх культур, растущих в ов присутствиий метотрексата (0,02мМкМ), вновь подвергают проверке в пулах для ЗПО путем КІА. Те культурні, которье не являются положительньми, субклонируют и подвергают культивированию при еще более возросших (Ф, концентрациях метотрексата. ка Ступенчатая селекция с метотрексатом (МТХ) достигается повторньмми циклами культивирования клеток в присутствий возрастающих концентраций метотрексата и селекций для вьживших микроорганизмов. При бо Ккаждом цикле ЗПО измеряют в надосадочном слое культурь! посредством КІА и биологической активности іп міго. Уровни используемого метотрексата в каждой ступенчатой амплификации составляют 0,02мМкМ, 0,1мМкМ и 0О,5мкМ. Как показано в Таблице 10, после первого цикла селекции при 0,02мМкМ МТХ в культуральньсе средь! вьісвобождаются значительнье уровни ЗПО. й
Уровень вьісвобождаємого в средьії ЗПО да Клонединичной колонии (0027) ВА! 77011111 абономл) й Пример 11: Зкспрессия ЗПО в клетках СПО - Метод 11
ДНК из клона Х-НЕРОРЕ І 13 переваривают Есокі, и мальіїй Фрагмент КІ, содержащий ген ЗПО, субклонируют в ЕсоКіІ-сайт плазмидьі ККІ-4 (см. Пример 10). Зту ДНК (ККЕ І 13) пат используют для трансфекции ОНЕ
К-отрицательньїх клеток СНО прямо (без переваривания), и селекцию и амплификацию осуществляют, как 7/0 описано в Примере 10 вьіше.
ДНК ККЕ Г. 13 также вставляют в клетки СНО путем слияния протопластов и микроиньекции. Плазмлда ККЕ
І 13 депонирована и доступна из Атегісап Туре Сийиге СоПесіоп КокКмйПШе, Магуїапа, под входящем номером
АТСС 33989.
І
0 пвонмліюом го нин ЕТ НЕ: По я 1000 векдму туя сч о
Предпочтительньій клон единичной колонии депонирован и доступен Атегісап Туре Сийиге СоПесіоп
КокКміїе, Магуїапа, под входящим номером АТСС СК. 8695.
Пример 12:
Зкспрессия гоночного клона ЗПО в клетках СО5-І с
Лектором, используемь!м для зкспрессии геномного клона ЗПО, является ремОа (Меїоп др., вьіше). ДНК из со рзМО (переваривают до готовности при помощи Ніпа І и затупляет большим фрагментом ДНК-полимеразь! І.
Геномньїй клон ЗПС, Х-НЕРСЗ, переваривают до готовности Есокі и Ніпа ПП, и 4,0кб фрагмент, содержащий ген (ее)
ЗПО, вьіделяют и затупляет, как описано вьіше. Нуклеотидная последовательность зтого фрагмента из Ніпа «
Пі-сайта до области, находящейся вьіше сигнала полиадениляции, показана на фиг. 4 и в Таблице 4. Фрагмент гена ЗПО вставляют в плазмидньій Фрагмент ремМОа, и правильно построеннье рекомбинанть! в обеих « ориентирах вьіделяют и проверяют. Плазмида С55-І имеет ген ЗПО и ориентации "а" (те. с 5-концом ЗПО, самьм ближайшим к началу 5М40) и плазмида С71-3 находится в противоположной ориентации (ориентация "в. «
Плазмдьі С2І-3 и С72-І трансекцируют в клетки СО5-І как описано в Примере 7, и средьі собирают и анализирует на иммунологиески реактивньій ЗПО. Приблизительно Зімг/мл ЗПО обнаружено в отстоявшихся ші с культурах от С22-Ї и 12 - Зінг/мл от С21І-3. ч Геномнье клоньї НЕРОЇ, НЕРО?2 и НЕРОЄБ могут бьїіть вставленьї в клетки СО5 для зкспрессии аналогичном я образом.
Пример 13:
Зкспрессия в клетках С127 и ЗТЗ Конструирование РВРУЕРО ї- Плазмиду, содержащую кДНК-последовательность ЗПО под о транскрипциональньм // контролем ї» металлотионеийнового промотора мьіши и привязанную к полной ДНК вируса бьічьей папилломьі, получают следующим образом: (ее) РЕРО49Г со 50 Плазмида 5 Рб/5 приобретена у Рготеда Віоїес. Зту плазмиду перевариваєт до готовности с Есокі, и фрамент ЕсокКі из 1340 п.о. из Х-НЕРОЕ І 13 вставляют при помощи ДНК-лигазьі. Полученную плазмиду, в о) которой 5'-конец гана ЗПО является ближайшим к промотору 5Рб (как определено перевариванием Ваї! и Ніпа
І), обозначают рЕРО49Р. В зтой ориентации сайт Ватні в полидинкере РЗРб/5 непосредственно примькаєт к 5-концу гена ЗПО. рРММТпес ВРУ
ГФ! Плазмиду равРУ-ММтТпео (342 - 12) (І ам и др., МоїЇ.апа Сеї! Віої., 3:2110 - 2115 (1983)), показанную на фиг. 8, переваривают до готовности Ватні для получения двух фрагментов большого фрагмента ; 8кб в длину, о содержащего геном ВРУ, и меньшего фрагмента, ; 6,5кб в длину, содержащего рМІ2 начало репликации и ампициллин-устойчивого гена, металлотионейнового промотора, неомицин-устойчивого гена и сигнала 60 полиаденилирования 5М40. Переваренную ДНК рециркулизуют ДНК-лигазой, и плзамидь;, которьіе содержат только 6,8кб фрагмент, идентифицируют перевариваниями рестрикционньіми зндонуклеазами ЕсокКіІ и Ватні.
Одна такая плазмида обозначена РММТпео ВРУ. рРЕРО15а рРММТпео ВРМ переваривают до готовности Ва. РЕРО49Г переваривают до готовности Ватні и ВоаїЇЇ, и бо приблизительно 700п.о. фрагмент, содержащий целую ЗПО-кодирующую область, получают гель-изоляцией.
Кап-переваренпую РММТпео ВРУ и фрагмент ВатнНі/Ваї! ЗПО из 700п.о. сшивают, и полученнье плазмидьі,
содержащие КДНК ЗПО, идентифицируют гибридизацией в колониях при помощи олигонуклеотидного а/вОТСАТСТОТССССТОТСС/ зонда, являющегося специфичньїм к гену ЗПО. Из плазмид, которніе являются положительньми под гибридизационньім анализом, одна /рРЕРО15а/, которая имеет КДНК ЗПО в ориентация, так, что 5-конецд КДНК ЗПО является близлежащим к металлотнонеиновому промотору, идентифицируется путем переваривания Есокі и Крпі.
РВРУ-З3ПО
Плазмиду рЕРОТ5А опереваривают до сготовности Ватні длл линеаризации плазмидь». Плазмаду равРУ-ММтТпео /342 - 12/ также переваривают до готовности Ватні для получения двух фрагментов длиной 6,5 ую и 8кб. фрагмент, которьій содержит цельй геном вируса бьічьей папилломьї!, вьіделяют в геле. РЕРО15а/ Ватні. и Фрагмент ВатнНі длиной 8кб сшивают друг с другом, и плазмиду /"РВРУ-ЗПО/, которая содержит Фрагмент
ВРУ, иидентифицируют гибридизацией в кКолонияЯх с о использованием олигонуклеотидного зонда а/Р-ССАСАСССОСТАСАСА-ОНУІ, которьйй является специфичньїм к геному ВРУ. Переваливание ДНК рРВРУ-ЗПО с Ніпа Ії указьівает на то, что направление транскрипции генома ВРУ является таким же, как и направление 7/5 транскрипции металлотионейнового промотора (как в равРМ-ММ'тТпео /342 - 12/, см. фиг. 9). Плазмида равРМ-ММтТпео /342 - 12/ доступна из Атегіса Туре Сийиге, СоПесіоп, КоскКмійе, Магуїапа под входящим номером АТСС 37224.
Зкспрессийи
Следующие методьі используются для зкспрессии ЗПО.
Метод 1
Получают ДНК рВРУ-ЗПО и приблизительно 25кг используют для трансфекии 1 х 109 клеток С127 Лому ий др., уУ.ої.Міо!., 26:291 - 298 (1978) СНО, используя стандартнье методики осаждения фосфата кальция (Стайт и др., Мігоїюду 52:456 - 457 (1973)). Через пять часов после трансфекции трансфекционньсе средьі удаляют, клетки шокируют глизерином, промьівают и прибавляют свежую о-среду, содержащую 1090-ную фетальную бьчью су
Ссьіворотку. Через сорок восемь часов. клетки трипоинизируют и расщепляют в отношений 1:10 в ОМЕ среде, о содерашей 50Омкг/мл С 413 (Зоційегп и др., Мої. Аррі. Сепеї., 1:327 - 341 (1982)), и клетки вьиіращиваєт в течение двух-трех недель. 5418-устойчивье колоний затем вьіделяют индивидуально в микротитровьїй колодец и вьращивают до суболивания в присутствиий 53418. Клетки затем промьївают, прибавляют свежие средь, содержащее 1095-ную фетальную бьчью сьіворотку, и средьі собирают через 24 часа. Кондиционированное «СМ средь! испьітьївают, и они являются положительньіми для ЗПО под радио-имунньім анализом и биологической пробой іп мікго. 09
Метод ІІ Ге
Клетки С127 и ЗТЗ котрансфецируют 25мкг РВРУ-ЗПО и 2мкг реМ2пео (Зоційетп и др., вьіше), как описано в
Методе І. Зто составляет приблизительно 10-кратньій мольньій избьток рРВРУ-ЗПО. Вслед за транофекцией т применяют методику, анологичную описанной в Методе |. чу
Метод ПІ
Клетки С127 трансфецируют ЗОмкг рРВРУ-ЗПО, как описано в Методе І. Вслед за трансфекцией и расщеплением (1:10) свежие средьі меняют каждьсе три дня. Приблизительно через 2 недели появляются очаги «
ВРУ-трансформироварньїх клеток. Отдельнье очаги собирают в їсм колодцьі микротитровой чашки, Вніращивают до субсливающегося монослоя и анализируют на активность ЗПО или его активность в - с кондиционированньх средах. ц Пример 14: ,» Зкспрессия в клетках насекомьїх Конструирование рІУЕУ ЕРОБК І 13
Плазмидньій вектор рІУЕУ депонирован и доступен из Атегіса Туре Сийиге, СоїПесіоп, КоскКмПШе, Магуїапа под ВходяЩщИиИМ номером АТСС 39991. Вектор модифицирует следующим образом: щ» рІУЕУМ І їз рІУЕУ переваривают ЕсокіІ для линеаризации плазмидь, затупляют с использованием большого Фрагмента
ДНК-полимеразь 1, и одиночньй линкер Мо І. (ее) свссооссосс ссоссоособ (ее) вставляют сщиванием с тупьім концом. Полученную плазмиду обозначают ріУЕУ М І.
Ко) рІМЕМ БІ рІУЕУ переваривают Зтаї! для линеаризации плазмидь, и одиночньй линкер 51 ввоСсСсСсАСоооСссс сссоовостосссСосо вставляют сшиванием с тупьім, концов. Полученную плазиду обозначают ріІУЕУ5І. о РІУЕУЗІ ВоКр ко Плазмиду рІУЕУ5БІ переварчгают КрпІ для линеаризации плазмидь, и приблизительно от 0 до 100п.о. отщепляют от каждого конца путем переваривания двунитевой зндонуклезой Ваї 31. Любье полученнье концьї, бо которне не совсем тупье, затупляют с использованием большого фрагмента ДНК-полмеразь! І, и полилинкер б5
Хкої Хзої гол рол
І ' І І
В СЕ. пев пиши ши 1 Й 1 і І ! | | |!
АСАТСТОСАСААТТСТАСАТООАТООТАОо 2 ТОСТАбАОСТСТТААСАТОТАССТАОСАТОоСЯ вставляют сшиванием с тупьім концом. Полилинкер вставляют в обеих ориентациях. Плазмиду, в которой ориентировал полилинкер таким образом, что сайт Во внутри полилинкера является близлежащим к полиздральному генному промотору, назьшают ріУЕУЗІВаоКр. Плазмиду, в которой сайт Крпі внутри /5 полилинкера является близлежащем к полиздральному генному промотору, назьівают рІУЕУЗІКрВа. Число пар оснований, которье бьіли потеряньії между первоначальньм Крпі-сайтом в ріУЕУ5І и полиздральньм промотором, не определено. рІУЕУ5БІВОКр депонирована и доступна из Атегісап Туре Сийиге, СоПесііоп,
КоскКміе, Магуїапа, под входящим номером АТСС 39988.
РІЕУЗІВОКр М І
РІУЕУ М І переваривают до готовности Крпі и РаіЇ для продуцирования двух фрагментов. Больший фрагмент, которьій содержит плазмидное начало репликации и 3-кзнец полиздрального гена, получают вьіделением в геле (фрагмент А). рІУЕУБІВОКр переваривают до готовности Рв и Крп для получения двух фрагментов, и меньший фрагмент, которьій содержит полиздральньй генньій промотор и полиллнкер, получают вьіделениями в геле (фрагмент В). Фрагментьї А и В затем обьединяют ДНК-лигазой для образования новой плазмидь! сч дв ВІХЕХЗІВОКр М І, которая содержит частично потерянньйй полиздральньй ген, в которой вставлен полилинкер, а такюке содержит Мої-сайт (замещая разрушенньй ЕсокКі-сайт) и ЗПІ-сайт, которьій прикрьіваєт фланг і) полиздрального генного участка.
РІМЕРО рІМЕМ5І ВОКрММ І переваривают до готовности ЕсоКІ для линеаризации плазмидь;, и вставляют фрагмент с зо ЕсокіІ длиной 1340 пар оснований из 9-НЕРОЕ ГІ 13. Плазмидьі, содержащие ген ЗПО в ориентации так, что 5-конец гена ЗПО является близлежащим к полиздральному промотору н 3- концу полиздрального гена, со идентифицируют путем переваривания ВаїїІ. Одну из зтих плазмид в ориентации, описанной вьіше, обозначают о как рІУЕРО.
Зкспрессия ЗПО в клетках насекомьсмх в
Большие количества плазмидь! рІУЕРО получают трансформацией штампа УМІОІ-ЮІЕ.соїї. Плазмидную ДНК -(«ф вьіделяют посредством методики осветленного лизата (Мапіайв и Егівївс!, Соїй Зргіпд Нагрог Мапиаї) й подвергают дальнейшей очистке СзСІ-центрифугированием. ДНК птама І - І вируса полиздроза Апіодгарна саїйогпіа дикого типа (АСМРУ) получает фенольной зкстракцией вирусньїх частиц, и последующей очисткой вирусной ДНК. «
Зти две ДНК затем контрасфецируют в клетки ІРІ В-5Е-21 Зродоріега Ітидірегаа Л/ацдни и др.,іп мйго, ТОМ -е- с В, стр. 213 - 217 (1977), используя методику трансфекции с фосфатом кальция (Роцег и МіПег, 1977). Для й каждой чашки контрансфецируемьїх клеток используют хомутик ДНК АсМРУ дикого типа и 1Омкг рІУЕРО. Чашки "» инкубируют при температуре 272С в течение 5 дней. Затем собирают надосадочную жидкость, и зкспрессию
ЗПО в надосадочном слое подтверждают радисиммунньїм анализом и биологической пробой іп мйго
Пример 15: ьч Счистка ЗПО
Кондиционированньюе средь клеток СО (121) концентрациями ЗПО до 200Омкг/литр концентрируют до е бООмл с использованием ультрафильтрационньїхх мембран с молекулярньм весом 10000, таких как МіШіроге (оо) Реїїсап, снабженньій Ббкв, фут (0,4б65кв.м) мембраной. Опьїтьі осуществляют КІА как описано в Примере 6. Удерживатель из ультрафильтрации диафильтруют против 4мл 10ММ буферного раствора фосфата натрия при со рН 7. Концентрированнье и диафильтрованнье кондиционированньюе средь содержат 2,5мг ЗПО в З8Омг
ІЗ общего белка. Раствор ЗПО дополнительно концентрируют до 18бмл, и осажденнье белки извлекают центрифугированием при 110000хг в течение 30 минут.
Надосадочньй слой, которьій содержат ЗПО (2,О0мг) приводят к рН 5,5 5095-ной уксусной кислотой, позволяет перемешаться при температуре 42С в течение ЗОминут, осадок извлекают центрифугированием при 13000 х г в течений 30 минут. о Хроматография на карбонилметильной сефарозе іме) Отстоявшийся слой от центрифугирования (20мл), содержащий 200мкг ЗПО (24мг общего белка), подводят к колонке, упакованной СМ-Сефарозой (20мл), уравновешенней в 10мММ ацетате натрия, рН 5,5, прорьівают 40мл 60 того же буферного раствора. ЗПО, связанньій с СМ-Сефарозой, злюируют 100мл градиента Мам (0 - 1) в 10ММ растворе фосфата натрия, рН 5,5. Фракции, содержащие ЗПО (общее количество 5Омкг в 2мг общих белков, обьединяют по группам и концентрируют до 2мл с использованием ультрафильтрационной мембраньі Атісоп
УМІО.
ВЗЖХ с обращенной фазой 6Е Концентрированнье Фракции из СМ-Сефарозьі, содержащие ЗПО, подвергают дальнейшей очистке ВЗЖХ с обращенной фазой, используя колонку Мудас С - 4. ЗПО подают на колонку, уравновешенную в 1095-гом растворителе В (Растворитель А представляют собой 0,195 СН 3СО5Н в воде; растворитель В представляет собой 0,196 СНЗСО»Н в СНУСМ), с низкой степенью подачи їмл/мин.
Колонку промьівают 1095 В в течение 1б0минут и ЗПО злюируют линейньм градиентом В (10 - 7095 в течение 60 минут). Фракции, сожержащие ЗПО,
обьединяют по группам (40мг ЗПО в 120мкг общих белков) и лиофизируют.
Диофилизированньй ЗПО повторно структорируют в 0,1М растворе Ігів-НсІ при рН 7,5, содержащем 0,15М Масі, и повторно хроматографируют ВОЗЖХ с обращенной фазой.
Фракции, содержащие ЗПО, обьединяют по группам и анализируют злектрофорезом в 5ЮО5-полиакриламидом (1095) геле (латеїй ОО К., Майшге). Обьединеннье фракции ЗПО содержат 15,5мкг ЗПО в 25мкг общего протеийна.
70 Изобретение описано подробно, включая предпочтительнье вариантьі его существования.
Специалист, однако, поймет, сто при рассмотрении описания изобретения и чертежей могут возникнуть варианть! и усовершенствования в пределах обьема и сущности настоящего изобретения, заключенньїх в прилагаемой формуле изобретения.

Claims (1)

19 Формула винаходу
1. Фрагмент геномной ДНК, кодирующий зритропозтин человека и имеющий нуклеотидную последовательность от кодона СС кодирующего АЇїа!0 до кодона АСА, кодирующего концевой Аг9166 в приведенной ниже полинуклеотидной последовательности формульі 1: с (8) с со с « « ші с ;» щ» щ» (ее) о 50 Ко) Ф) іме) 60 б5 арсесссвввсгсссавасссавсстастссрсядаасісадсаасссаресаєсссуаресстссясссааеавсс веврагсдсссссесаврарясвсссявяаврсссарсессссссавасавсавссссяссаргсссаалоевсрсясаа 150 ссевссвсасесессеЕсссвсвасссарвдсссврваврсавсссссавсрасссасасьсаяасвссстрсавдсавссс свесавссссввавсстсаасссарвсьссссвссссерсЕсСЕрассссяввсвессестассестврсдасссс 300 ссасрсасасарсстстсессссасесесасссесвсасвсаяасасаєрсадасаасадссссяасссссввссара : всессававссествевссарсссосссостоостосостТоссссссСАССССССТСТСсСТосСсСсАССсссАССс 450. то СССССАССоСоСССоСтТСтТосСтТоССАСАСсосоСССсстТоСЛелЛоССоссстТостосСтТесСАСосссстТосоостТоо СССТОССАССОСССАССТІССССОСАТОЛОСОСССССССТСТОСТСАССССОоСССоССосСАССТоОСТСАСССАСсС ОС 600 ССООССАСОСССССАСАТОССССТОСАССвЕварсасссьсявествЕВСЕсСЕСССЯСССсесссевЕЕССССВСс . МессіуУаї НівСс М . Й ц т5 срадвсрвряасссарсесессевстастевссарварясяистсвввсссаарвассявсвасесвссавазасес 750 севаавевеваквеввесввовсавсстссасяєвссавсрвидасстввгивавссстсввввасевсааааас севасствтвааєвевасасавссся вия встраврсвраавааля ссср вис сс севсяссаргврарар 900 вааєствасаавстратаассявврсрссгввавссассасе сассерссаварврраарсеєст с ссасассаве астеаавсссеессввараарсярасвсстнисарссервЕсоввВсвсвсасасерсавсаррастврааєраа 1050 вессаврадавресавсасствавсеясстгвсасрвссввввасавравррасяарссввувсаравасвсевевагв завуаавстгвсссстсссасадссассесстсстсессссссесстрасесссарссеряссасстрссстарААтСТ 1200 с м " А М М 1шсСув ССстТоССтТоСстстТоосттстостотосстостстоостосстТстТососстоссАСТоСТоСсссссссАССАСКС о РтоА1аТгріеиТтріецісиеибетТецІеибетіезРгоїечСіуГезРгоуа1ТечС1уАТаРгоРгодге СТСАТСТСТСАСАССССАСТОСТССАСАССТАССТСТТССАССССААССАСССССАСААТАТСАССВ сварассс 1350 ТечІ1еСувАзрбекАтеЕУаПеосічАгетТугіечечсічА1агсузСсіцАТабіцаБаїт1еТЬг с сеЕсссесаврслевссссасараасссасьсссавврвссгсавядаастестсссарасссаддвасестясассс г) вясссввгвсвеавссявязаєстарасаствссссссстасасзарвасаарссурктввссссваассасасої 1500 - г) геавастаресазввавсааавссарсарассстасрссу всввссавевссававссєссавввасссссьяся й ссссвввсЕвевсвсастссавАССоССтоСтТоСтТОААСАСТОСАССТТСААТСАСААТАТСАСТСТОССАСАСАС 1650 325 Тагб1іуСсувА1абічНівСувбетіецАвпб1чАвпІ1еТнтУа1РтоАвртй « САААСТТААТТТСТАТОССТОСААСАССАТОСАСЕсвавсссссессссЕСЕсЕЕсссссссссесссвваваг с тГувтуа1АзпРнеТутА1аТтріузАтеМессіЧ сЕсасесвсвавсстрасстсврасваазввкарвасвассвароваааввсаваасьвавсавсававасваво 1800 « 70 седсссввЕсавсавадесстсасевсстасаассссарвстдаивасввссвавасввеаваасявсссвавсссствв т с авссссарассядассгаррсарсасадсдаврассссссасесстасавасастсалаваааставссяввсвгав 1950 . " » еЕВсвсасевсвясавссссавасає геЕвааввсеславясввЕваняассясссвавсессавиаасссваввстя 415 савсвавссвсвассасассастрсассссарссеісарсивсававтравессссрссссааазаарвавнрада 2100 е ааавававасаасвавевстрсасьваасасьстсастаєссаєессастсасссасесастсатєсаєєсаєєсся т» ЕЕсасессаасаарістєакЕрсатассесссесствсссарсствисвссісвЕеЕсгяссваввявсавварвва 2250 (ог) бо о І»
(Ф, ко 60 65 давхксяасассссссавсівасстсссавравтссасссссге са СоСоСсАССАСССССТАСЛАСТСТОССАС що . Маї1с1убіасіпАтаУа1січУзіТербіай ССССтТООСССТОСТСТСбСААССТОТОСТОСССССССАСССССТСТТССТСААСТСТТСССАССССТоСсАСССС ОО 2400 біуСецАТаГецтеибетсівАтаузіТечАтесі1уСІпАТаїситеоуазїАвйбзекбексіпртоттроішР то СТОСАССТОСАТОТОСАТАААССССТСАСТОСССТТСССАСССТСАССАСТСТОСТІСВООСТСТОобАССССАС ГечбіпіечНівУатАєргувАТауга15екс1убечАтебеті ех ТВ сГагцечАтеАкаГсгцбіуАТасіп вевадсаввавсвкасастсствсссясссссеседсааваадевваваавдв тот Ессвавваєсасавя вас 2550 ЕвЕсСсвтасеіссттссесессгвтерсаствсарсвасстоствс с кЕсСТссссевсаВААССААСССАТСТ ССС 70 СузсіуАтаттвабетр "«СТССАСАТССССССТСАОСТОСТССАСТОССААСААТСАСТССТСАСАСТТТССССАЛАСТСТТСССАСІСТАСТ 2700 тоРгоАзрА1аДі1абетА1талй1ТаРтоїечАтаТвгІ1етТпгА1аавртнеРпеагасувтецпеАтема1Туто І ССААТТТССТССССССАЛАССТОААССТСТАСАСАССССАССССТОСАССАСАССССАСАСАЦСАССАССТСТСТ екАазпРІеїечАгес1усузсечцувзГештТухтнгбіусічАтТасСузАгеТпгбіуАвраги т5 ССАССТОСССАТАТССАССАССТОССТСАССААСАТІССТТСТОСССАСАСССТССССССССАСТССТСААССССС 2850 ТССАССОССТСТСАССТСАСССССАСССТСТСССАТССАСАСТОСАСТОССАССАЛТСАСАТСТСАСОООССАСА ССААСТСТССАСАСАССААСТСТОАСАТСТААССАТСТСАСАСССССДАСТТСАССССССАСАССАССААССАТТ 3000 САСАСАССАССТІТТАЛАСТСАСССАСАСАСССАТОСТОСССЛАСАССССТСАССТСАСТССССАСССТОСААЛАТТ ТОСАТОССАССАСАСССТІТССАССССАТІТАССТСТТІТСССАССТАССАТСАСССАСАССАТбАССТОСАСААС 3150 ТІАССТОССААССТСТСАСТІСТССАССТСТСАСССССАТССССАСТОССТТОСТОССААБАССССССТТСАСАС ссоостост СССААССАТСААСАСАС САТОСОООСТОСССТСТСССТСТСАТССССІССААСТТТТСТСТАТІСТ 3300 с з ТСААССІСАТТСАСААСААСТСАЛАССАССаасзерастетсарстссессяссстсєвяязасстссаяадатссс (о) стевстседссссастссевресадса 3400
2. Фрагмент ДНК по п. 1, отличающийся тем, что имеет нуклеотидную последовательность от кодона АТО Га Кодирующего начальньй метионин Меї-27 до кодона АСА кодирующего концевой Аг9166 в полинуклеотидной последовательности формульі!. со
З. Фрагмент кКДНК, кодирующий зритропозтин человека и имеющий последовательность от кодона АТО (3 кодирующего начальньй Меї27 до кодона АСА кодирующего концевой Аг916б6 в приведенной ниже полинуклеотидной последовательности формульі 2: З « « ші с з щ» щ» (ее) о 50 Ко) Ф) іме) 60 б5
І сесесрдавсе ддасерддядс соссзсоссс бссгсспессся асасевсвсс сессодзсаї сесуч«естссс сгссадассс ся сг34 сссеусассе сстаксЕссе седваставія сссгсцсвс МЕ СІ ЧАЇ, НІ5 СІ Сї5 0 РО дассасссії сасяссссав вссоссдадя двссссеясс агясостява АТО 000 тб САС уч тб0І ст АІА ТВВ СЕУ ТЕР ВУ ЦЕ) ОЦЕ) 5ЕВ ЕМ ОЦЕ) 5ЕВ ОЦЕ) РВО ЕП СІ ВБЕО РКО УА ТБ сл ссс тоб сто тбо остІт сто сто СС о сІб стс тТсо Сто сст Сто бб0 СІ сСсСА бІС сіб обс 1 І ЕТ 10 й т . 10 ї І1е Суз дав бат Агя Маї Твеч Січ лк т Тез беу біз Аза Туз бСсС ССА сСсСА Сб СІС АТС ІСТ САС Або СА сТС Сто САС Со ТАС СТС Іо САС 0600 АС й 088300. ви я «0 біз Аїа біз лов, лІе Ту ТВх, бу. Суб Аїа біз із Сузв Бех Таз ва бі Ага Це -ТВх.О САС ССС баб ЛАТ АС Асо ул СОС ТСТ ССТ САА САС о ТосС АС ТІС АТ САС СААТ АТС СТ
Й . Що 50 Й Й ще мн 60 Маї Рто Авр ТВх Мув Уві Азп Ре Тух Аїз Тго ув Аг' Ме біз Чаї біу біп біз Аа СТО ССА САС АСС А СТІТ ААТ ТІС ТАЇ ОСС тб АС Або АТ бас сте со са сабо сс
, . 70 . 80 Уаї біз Уаї Тгр біа Сіу Тсз Аїа Тез ваз Зех біш Аа Уаї ви Ак; 1 Іпннийіа СТА бАА стсС Тбо САб.СосС Сто сс сто стІб То САЛА ОСТ бІС СТ бо боб САС бос сто с - т тт о іі 90 100 цеч Маї Ап, бет бет Сіп Ртхо Тв. Сіш Рго Геу Сбіп' Тез На Чаї до бпує Аа Уаї бек ТІС ІС ААС ТСТ ІСС САС СС То САС СосС СІ САб СІб САТ СІ САТ ААА бос 610 СТ - по 120 Ге зо С1у Шеч Атб бБет Таз Тато Твго без о без Ахко й1іа Тез біу Аа бій фув Сів Аа 0 ТП ех ссс сті сбс Або СТ АСС ас ст ст, сос бст сто ббА бос СА у Шк САА бСС АТС тес (со)
І . (ее) 130 - 150 Рто Рто АБо із Аїз 5ег Аза Аз Рго їеч АхЕ, ТВг Т1є Тбг АЇз дво ТІ Ре лаг уз Й ССТ ССА САТ 000 боб тТСЛ ОСТ ОСТ ССА СІ СбАСАСА АТС АСТ СТІ САС АС ТС Со АХА « 150 160 цез Ра Агй Уа! Туг Бех зп РН Беу. Адрб С1іу Тує Шеу Був ПЦез Тух ТІ. С1у біш лів СІС ТІС бСА бТС ТАС ТОС ААТ ТІС СІС Сб ббА АС СТО АС СТО ТАС АСА 000 САС осо вн 166 . « Суз Ат Тк біу Азр дгв , ; шщ с ТСС АС СА Сб САС СА ТСА ссавесь сесссасссв Жксасассса -- ссасссссс: сассзасасєс ч» Бессвсвсса сасссссссс сессассссс ввоссссесе еаЕВЕВССсС саксссавсе ссарсесвсс п - сесасрдвасас сссавсвсса Есазасвасає сесаговвсс акаввалесь - сесаваряс - засесЕвада ч 45 сссаадват ксасацевсс авсесвавев І сесадарсав вазрсаєсса Еавовсавсс С 7 сСезакессав їм Ехасавадсс асвсстудза дасесссгад, сесастсвЕс 00 асссерсяза асссваєрсе С ардасасесс со терезвЕсва сссасссясс 0 сессусассга 0 ссзссарвка сакеасвасс свдадойссс 0 аресввсазв со 50 севсвасссс сесаввсссс асееесасях Есассссссї «Есексаава Есессссств сассятис Кз Есвгвгасса сеазрасаде асевевЕссв вссессевсе сесасеввЕс севавсссср сесасссссс азссесссаст: асаарзаастй авассассав аазавдазавава
5 4. Фрагмент кДНК по п. 3, отличающийся тем, что дополнительно включаєт нуклеотидьі, которье входят в состав 50 нуклеотидов, предшествующих кодону АТО, кодирующему Меї(27, до кодона ТОА, следующего за Ф) ко кодоном АСА кодирующим, Аго9166 в полинуклеотидной последовательности формульі 2.
5. Способ получения зритропозтина человека, предусматривающий культивирование в подходящей среде бо Зукариотических хозяйских клеток, отличающийся тем, что хозяйские клетки содержат последовательность ДНК по любому из пп. 1-2, оперативно присоединенную к последовательности, контролирующей зкспрессию, отделение полученного таким образом зритропозтина от клеток и культуральной средні.
6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что культуральная среда содержит фетальную сьіворотку.
7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что упомянутьій зритропозтин представляет собой рекомбинантньй б5 Ззритропозтин.
8. Способ по любому из пп. 5-7, отличающийся тем, что хозяйскими клетками являются клетки млекопитающих.
9. Способ по п. 8, отгличающийся тем, что хозяйские клетки млекопитающих представляют собой клетки СО5 СНО, СІ27 или 313.
10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что хозяйские клетки млекопитающих представляют собой клетки
33.
11. Способ по п. 9, отличающийся тем, что хозяйские клетки млекопитающих представляют собой клетки яичника китайского хомячка СНО.
12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что клетки СНО способньї продуцировать рекомбинантньй зритропозтин, которьій является гликозилированньм по М- и О-положениям с включением фукозь! и М-ацетилгалактозамина после чего полученньій рекомбинантньйй зритропозтин отделяют от клеток и средні.
13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что рекомбинантньій зритропозтин человека имеет структуру гликозилирования, включающую соответствующие молярнье уровни гексозьі и М-ацетилглюкозамина в 75 соотношениий 1,411, а именно галактозьь и М-ацетилглюкозамина в соотношениий 0,9:1 и маннозь и М-ацетилгалактозамина в соотношении 0,5:1.
14. Способ по п. 7, отличающийся тем, что упомянутая последовательность ДНК включена в вектор, дополнительно содержащий ДНК вируса папилломь! биька.
15. Способ получения зритропозтина человека, предусматривающий культивирование в подходящей среде зукариотических хозяйских клеток, отличающийся тем, что хозяйские клетки содержат последовательность ДНК по любому из пп. 3-4, оперативно присоединенную к последовательности, контролирующей зкспрессию, отделение полученного таким образом зритропозтина от клеток и культуральной средні.
16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что культуральная среда содержит фетальную сьіворотку.
17. Способ по п. 15, отличающийся тем, что упомянутьй зритропозтин представляєт собой рекомбинантньй су Ззритропозтин.
18. Способ по любому из пп. 15-17, отличающийся тем, что хозяйскими клетками являются клетки о млекопитающих.
19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что хозяйские клетки млекопитающих представляют собой клетки СО5, СНО, СІ27 или 313. с
20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что хозяйские клетки млекопитающих представляют собой клетки 09
33. (ее)
21. Способ по п. 19, отличающийся тем, что хозяйские клетки млекопитающих представляют собой клетки яичника китайского хомячка (СНО). З
22. Способ по п. 21, отличающийся тем, что клетки СНО способньї продуцировать рекомбинантньй оч зритропозтин, которьій является гликозилированньм по М- и О-положениям с включением фукозь! и М-ацетилгалактозамина, после чего полученньій рекомбинантньйй зритропозтин отделяют от клеток и средні.
23. Способ по п. 22, отличающийся тем, что рекомбинантньій зритропозтин человека имеет структуру « гликозилирования, включающую соответствующие молярнье уровни гексозьі и М-ацетилглюкозамина в - с соотношении 1,41, а именно галактозьь и М-ацетилглюкозамина в соотношении 0,9:1 и маннозьї и ч М-ацетилглюкозамина в соотношении 0,5:1. -» 24. Способ по п. 14, отличающийся тем, что упомянутая последовательность ДНК включена в вектор, дополнительно содержащий ДНК вируса папилломь! биька.
25. Способ получения фармацевтической композиции зритропозтина человека, предусматривающий ї- культивирование в подходящей среде зукариотических хозяйских клеток, трансформированньх їз последовательностью ДНК, кодирующей зритропозтин человека по любому из пп. 1-2, причем упомянутая последовательность оперативно присоединена к последовательности, контролирующей зкспрессию, отделение (о) полученного таким образом зритропозтина человека от клеток и культуральной средь), приготовление о 50 упомянутого зритропозтина в сочетаниий с фармацевтически приемлемь!м носителем.
26. Способ получения фармацевтической композиции зритропозтина человека, предусматривающий Із культивирование в подходящей среде зукариотических хозяйских клеток, трансформированньх последовательностью ДНК, кодирующей зритропозтин человека по любому из пп. 3-4, причем упомянутая последовательность оперативно присоединена к последовательности, контролирующей зкспрессию, отделение полученного таким образом зритропозтина человека от клеток и культуральной средьі), приготовление о упомянутого зритропозтина в сочетаний с фармацевтически приемлемьїм носителем. ко бо б5
UA5010104A 1984-12-04 1991-11-15 Фрагмент геномної днк, що кодує еритропоетин, фрагмент кднк, що кодує еритропоетин, спосіб одержання еритропоетину людини (варіанти), спосіб одержання фармацевтичної композиції еритропоетину людини (варіанти) UA44882C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US67781384A 1984-12-04 1984-12-04
US68862285A 1985-01-03 1985-01-03
US69325885A 1985-01-22 1985-01-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA44882C2 true UA44882C2 (uk) 2002-03-15

Family

ID=27418329

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UA5010104A UA44882C2 (uk) 1984-12-04 1991-11-15 Фрагмент геномної днк, що кодує еритропоетин, фрагмент кднк, що кодує еритропоетин, спосіб одержання еритропоетину людини (варіанти), спосіб одержання фармацевтичної композиції еритропоетину людини (варіанти)

Country Status (24)

Country Link
EP (2) EP0411678B2 (uk)
JP (4) JPH02104284A (uk)
KR (1) KR890001011B1 (uk)
AT (2) ATE71408T1 (uk)
AU (1) AU621535B2 (uk)
CA (1) CA1341502C (uk)
CZ (3) CZ281756B6 (uk)
DE (3) DE3585161D1 (uk)
DK (4) DK172953B1 (uk)
ES (1) ES8800049A1 (uk)
FI (2) FI104261B1 (uk)
GE (1) GEP19970775B (uk)
GR (1) GR852890B (uk)
HK (2) HK105693A (uk)
HU (1) HU216079B (uk)
IL (1) IL77081A (uk)
LV (2) LV10505B (uk)
MD (1) MD1639C2 (uk)
NO (1) NO304469B1 (uk)
PL (2) PL157926B1 (uk)
PT (1) PT81590B (uk)
SK (2) SK281799B6 (uk)
UA (1) UA44882C2 (uk)
WO (1) WO1986003520A1 (uk)

Families Citing this family (79)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR850004274A (ko) * 1983-12-13 1985-07-11 원본미기재 에리트로포이에틴의 제조방법
NZ210501A (en) * 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
US4703008A (en) * 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
US4677195A (en) * 1985-01-11 1987-06-30 Genetics Institute, Inc. Method for the purification of erythropoietin and erythropoietin compositions
EP0236059B1 (en) * 1986-02-27 1994-04-27 Snow Brand Milk Products Co. Ltd. Preparation of erythropoietin-producing cells and production process of erythropoietin using same
DK173067B1 (da) * 1986-06-27 1999-12-13 Univ Washington Humant erythropoietin-gen, fremgangsmåde til ekspression deraf i transficerede cellelinier, de transficerede cellelinier sa
DE3730599A1 (de) * 1986-09-12 1988-07-07 Genentech Inc Verfahren zur kontinuierlichen herstellung von heterologen proteinen in eukaryontischen wirtszellen
US4954437A (en) * 1986-09-15 1990-09-04 Integrated Genetics, Inc. Cell encoding recombinant human erythropoietin
US4835260A (en) * 1987-03-20 1989-05-30 Genetics Institute, Inc. Erythropoietin composition
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US5888774A (en) * 1994-12-19 1999-03-30 Cangene Corporation Recombinant DNA molecules and expression vectors for erythropoietin
IL122614A0 (en) 1995-06-15 1998-08-16 Introgene Bv Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy
EP0752474A1 (en) 1995-07-07 1997-01-08 Boehringer Mannheim Gmbh Nucleic acid coding for CMP-N-acetyl-neuraminic acid hydroxylase and its use for the production of modified glycoproteins
EP0837942A1 (en) * 1995-07-07 1998-04-29 Boehringer Mannheim Gmbh Nucleic acid coding for cmp-n-acetyl-neuraminic acid hydroxylase and its use for the production of modified glycoproteins
DE19535571A1 (de) 1995-09-14 1997-03-20 Boehringer Mannheim Gmbh Pharmazeutische Kombinationspräparate und deren Verwendung zur Behandlung von Hämodialysepatienten
US5952226A (en) * 1996-11-05 1999-09-14 Modex Therapeutiques Hypoxia responsive EPO producing cells
SI0977582T1 (en) 1997-03-18 2002-12-31 Roche Diagnostics Gmbh Pharmaceutical combined preparations containing erythropoietin and iron preparations
EP0885613A1 (de) 1997-06-21 1998-12-23 Roche Diagnostics GmbH Verwendung von modifizierten Hämoglobinen zur Behandlung von Anämien und Kombinationspräparate umfassend Erythropoietin und modifiziertes Hämoglobin
KR100641969B1 (ko) 1997-07-23 2006-11-06 로셰 디아그노스틱스 게엠베하 내인성 유전자 활성화에 의한 에리트로포이에틴의제조방법
ATE341625T1 (de) * 1997-07-23 2006-10-15 Roche Diagnostics Gmbh Herstellung von erythropoietin durch endogene genaktivierung mit viralen promotoren
US6548296B1 (en) 1997-07-23 2003-04-15 Roche Diagnostics Gmbh Methods for identifying human cell lines useful for endogenous gene activation, isolated human lines identified thereby, and uses thereof
DK1000154T3 (da) 1997-07-23 2007-06-18 Roche Diagnostics Gmbh Identificering af humane cellelinjer til produktion af humane proteiner ved endogen genaktivering
KR100622203B1 (ko) 1997-07-23 2006-09-07 로셰 디아그노스틱스 게엠베하 내인성 유전자 활성화에 의해 사람 단백질을 생성시키는 사람 세포주를 확인하는 방법
ATE255634T1 (de) * 1997-09-01 2003-12-15 Aventis Pharma Gmbh Rekombinantes humanes erythropoietin mit vorteilhaftem glykosylierungsmuster
AR019025A1 (es) 1998-04-09 2001-12-26 Roche Diagnostics Gmbh Uso de eritropoyetina en bajas dosis para producir un preparado farmaceutico para el tratamiento de hemocromatosis, preparado farmaceutico combinadoutilizado segun dicho uso y envase farmaceutico unitario que contiene al referido preparado farmaceutico combinado
BR9905867A (pt) 1998-11-06 2001-01-23 Bio Sidus S A Linhagem celular produtora de eritropoietina humana recombinante e a eritropoietina humana recombinante produzida por esta célula
BR9917606A (pt) 1998-11-06 2002-12-31 Bio Sidus S A Procedimento para a purificação de eritropoetina humana recombinante a partir de sobrenadantes de cultivo de células e eritropoetina humana recombinante obtida com tal procedimento
BR9905868A (pt) 1998-11-06 2001-01-23 Bio Sidus S A Procedimento de cultivo massivo de células de mamìfero para a obtenção de eritropoetina humana, recombinante e a eritropoetina humana recombinante obtida com tal procedimento
US6777205B1 (en) 1998-11-06 2004-08-17 Sterrenbeld Biotechnologie North America, Inc. Host cells expressing recombinant human erythropoietin
DE19857609A1 (de) 1998-12-14 2000-06-15 Hannelore Ehrenreich Verwendung von Erythropoietin zur Behandlung von cerebralen Ischämien des Menschen
US7604960B2 (en) 1999-04-15 2009-10-20 Crucell Holland B.V. Transient protein expression methods
US7297680B2 (en) 1999-04-15 2007-11-20 Crucell Holland B.V. Compositions of erythropoietin isoforms comprising Lewis-X structures and high sialic acid content
US6855544B1 (en) 1999-04-15 2005-02-15 Crucell Holland B.V. Recombinant protein production in a human cell
US8236561B2 (en) 1999-04-15 2012-08-07 Crucell Holland B.V. Efficient production of IgA in recombinant mammalian cells
US7527961B2 (en) 1999-11-26 2009-05-05 Crucell Holland B.V. Production of vaccines
US7192759B1 (en) 1999-11-26 2007-03-20 Crucell Holland B.V. Production of vaccines
US7521220B2 (en) 1999-11-26 2009-04-21 Crucell Holland B.V. Production of vaccines
AU2002233230B2 (en) 2000-12-20 2007-02-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Erythropoietin conjugates
DE10112825A1 (de) 2001-03-16 2002-10-02 Fresenius Kabi De Gmbh HESylierung von Wirkstoffen in wässriger Lösung
KR100505152B1 (ko) * 2001-09-10 2005-08-03 (주)가이아진 아스코르브산을 이용한 에리트로포이에틴의 생산방법
US6930086B2 (en) 2001-09-25 2005-08-16 Hoffmann-La Roche Inc. Diglycosylated erythropoietin
ATE384785T1 (de) 2001-12-07 2008-02-15 Crucell Holland Bv Herstellung von viren, virusisolaten, und impfstoffen
EP2277910A1 (en) 2001-12-21 2011-01-26 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
DE10209821A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10209822A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10234192B4 (de) 2002-07-26 2009-11-26 Epoplus Gmbh Co.Kg Verwendung von Erythropoetin
US7459435B2 (en) 2002-08-29 2008-12-02 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment of disturbances of iron distribution
RU2329274C2 (ru) 2002-09-11 2008-07-20 Фрезениус Каби Дойчланд Гмбх Способ получения производных гидроксиалкилкрахмала
EP1681303B1 (en) 2002-09-11 2013-09-04 Fresenius Kabi Deutschland GmbH HASylated polypeptides, especially HASylated erythropoietin
ES2314238T3 (es) 2002-10-08 2009-03-16 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugados de oligosacaridos farmaceuticamente activos.
US7459436B2 (en) 2002-11-22 2008-12-02 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment of disturbances of iron distribution
DK1623023T3 (da) 2003-05-09 2009-03-02 Crucell Holland Bv Kulturer af E1-immortaliserede celler og fremgangsmåder til dyrkning deraf til forögelse af produktudbytter derfra
WO2005014655A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
CA2539440A1 (en) 2003-09-29 2005-04-14 Warren Pharmaceuticals, Inc. Tissue protective cytokines for the treatment and prevention of sepsis and the formation of adhesions
DK1699915T3 (da) 2003-12-30 2010-09-13 Augustinus Bader Anvendelse af erythropoietin til levervævsregenerering
DE102004063927A1 (de) 2004-01-23 2005-12-15 Epoplus Gmbh Co.Kg Einsatz von niedrig dosiertem Erythropoietin zur Stimulation endothelialer Vorläuferzellen sowie zur Organregeneration und Progressionsverlangsamung von Endorganschäden
EP1732609B1 (en) 2004-03-11 2012-07-11 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
TWI417303B (zh) 2004-03-11 2013-12-01 Fresenius Kabi De Gmbh 經由還原胺化作用製得之羥烷基澱粉及蛋白質的接合物
GB0507123D0 (en) * 2005-04-08 2005-05-11 Isis Innovation Method
EP1762250A1 (en) 2005-09-12 2007-03-14 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyalkyl starch and an active substance, prepared by chemical ligation via thiazolidine
AR053416A1 (es) * 2005-11-10 2007-05-09 Protech Pharma S A Combinacion de glicoisoformas para el tratamiento o prevencion de la septicemia, linea celular transgenica productora de glicoformas de eritropoyetina, composicion farmaceutica que comprende a dicha combinacion, procedimientos para obtener la linea celular, procedimiento para producir dicha combinac
TW200804415A (en) 2006-01-18 2008-01-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method of removing sialic acid and process for producing asialoerythropoietin
DE102006004008A1 (de) 2006-01-27 2007-08-02 Hannelore Prof. Dr. Dr. Ehrenreich Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Multipler Sklerose, sowie Verwendung von Erythropoietin zur Herstellung eines Arzneimittels zur intermittierenden Behandlung und/oder intermittierenden Prophylaxe von Multipler Sklerose
EP1991569A4 (en) * 2006-03-07 2009-12-23 Regenetech Inc MAMMALIAN BIOLOGICAL MOLECULES WITH NATURAL GLYCOSYLATION PRODUCED BY ELECTROMAGNETIC STIMULATION OF LIVING MAMMALIAN CELLS
JP5553506B2 (ja) 2006-03-22 2014-07-16 中外製薬株式会社 エリスロポエチン溶液製剤
CA2659990C (en) 2006-08-04 2016-03-22 Prolong Pharmaceuticals, Inc. Polyethylene glycol erythropoietin conjugates
WO2009010107A1 (en) 2007-07-19 2009-01-22 Hannelore Ehrenreich Use of epo receptor activation or stimulation for the improvement of the edss score in patients with multiple sclerosis
EP2070950A1 (en) 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Hydroxyalkyl starch derivatives and process for their preparation
EP2095829A1 (en) 2008-02-27 2009-09-02 LEK Pharmaceuticals D.D. Selenium containing modifying agents and conjugates
DE102008002209A1 (de) 2008-06-04 2009-12-10 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Aufreinigung von Erythropoietin
DE102008002210A1 (de) 2008-06-04 2009-12-10 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur fermentativen Herstellung von Erythropoietin
ES2435272T3 (es) 2008-09-23 2013-12-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Purificación de la eritropoyetina
DE102008054716A1 (de) 2008-12-16 2010-06-17 Evonik Degussa Gmbh Inprozesskontrolle in einem Verfahren zur Herstellung von EPO
US20100272816A1 (en) 2009-04-27 2010-10-28 Wolfgang Rudinger Microcapsules comprising liver cells and erythropoietin, methods for preparing said microcapsules and methods for treating a patient comprising applying said microcapsules to the patient
CN102712688B (zh) 2009-09-23 2015-06-24 通益制药有限公司 重组人红细胞生成素(epo)的纯化方法、由此纯化的epo以及包含纯化的epo的药物组合物
WO2017068051A1 (en) 2015-10-21 2017-04-27 Lek Pharmaceuticals D.D. Peg-based dendron and process for producing the same
CN106906359B (zh) 2015-12-22 2018-12-11 理查德.亨威克 从硅酸盐矿物收取锂
JP2020511499A (ja) 2017-03-20 2020-04-16 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 赤血球生成刺激タンパク質のインビトロでの糖鎖改変のための方法
WO2022159414A1 (en) 2021-01-22 2022-07-28 University Of Rochester Erythropoietin for gastroinfestinal dysfunction

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US439780A (en) * 1890-11-04 Method of and apparatus for casting ingots
US3865801A (en) * 1973-06-15 1975-02-11 Atomic Energy Commission Stabilization of urinary erythropoietin using sodium p-aminosalicylate and extracting into phenol
JPS5455790A (en) * 1977-10-05 1979-05-04 Tomoyuki Tajima Production of erythropoetin
JPS5653696A (en) * 1979-10-09 1981-05-13 Ajinomoto Co Inc Isolation of erythropoietin by adsorption
JPS6045849B2 (ja) * 1980-08-25 1985-10-12 林原 健 ヒトエリトロポエチンの製造方法
US4419446A (en) * 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
JPS6043395A (ja) * 1983-08-19 1985-03-07 Sumitomo Chem Co Ltd エリスロポエチンの製造法
NZ210501A (en) * 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
IT1185503B (it) * 1984-01-11 1987-11-12 Univ New York Cloni di odna di eritropietina umana
JPS60215632A (ja) * 1984-04-12 1985-10-29 Japan Found Cancer エリスロポエチンの製造法
US4732889A (en) * 1985-02-06 1988-03-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition for the treatment of the anemia of rheumatoid arthritis
JPH062070B2 (ja) * 1988-07-06 1994-01-12 農林水産省食品総合研究所長 ▲ｏ下−▼アシルアミノ酸の製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
SK168799A3 (en) 2001-08-06
LV10505B (en) 1996-04-20
KR890001011B1 (en) 1989-04-18
PL256589A1 (en) 1986-10-21
CZ281756B6 (cs) 1997-01-15
CA1341502C (en) 2006-03-21
SK281799B6 (sk) 2001-08-06
GR852890B (uk) 1986-04-03
JPH02442A (ja) 1990-01-05
JPH02104284A (ja) 1990-04-17
PL154180B1 (en) 1991-07-31
EP0205564A4 (en) 1987-12-14
DK173254B1 (da) 2000-05-22
DK173293B1 (da) 2000-06-13
EP0205564A1 (en) 1986-12-30
DK95197A (da) 1997-08-20
DK368786A (da) 1986-08-01
DE3582732D1 (de) 1991-06-06
ATE71408T1 (de) 1992-01-15
FI863044A0 (fi) 1986-07-24
FI104261B (fi) 1999-12-15
MD1639C2 (ro) 2001-10-31
GEP19970775B (en) 1997-01-27
HK105593A (en) 1993-10-15
EP0411678B1 (en) 1992-01-08
DK200000527A (da) 2000-03-29
HK105693A (en) 1993-10-15
LV10507A (lv) 1995-02-20
AU621535B2 (en) 1992-03-19
IL77081A0 (en) 1986-04-29
EP0411678A1 (en) 1991-02-06
SK880485A3 (en) 1999-03-10
MD1639B2 (en) 2001-03-31
EP0411678B2 (en) 2000-01-12
ATE63137T1 (de) 1991-05-15
DK199901147A (da) 1999-08-20
DE3585161D1 (de) 1992-02-20
FI105347B (fi) 2000-07-31
HUT40706A (en) 1987-01-28
IL77081A (en) 1999-10-28
CZ880485A3 (en) 1996-08-14
CZ287620B6 (cs) 2001-01-17
LV10507B (lv) 1996-06-20
SK279765B6 (sk) 1999-03-12
DK175826B1 (da) 2005-03-14
FI19992064A (fi) 1999-09-27
FI104261B1 (fi) 1999-12-15
PT81590B (pt) 1987-10-20
MD940371A (en) 1996-06-28
NO863050D0 (no) 1986-07-28
ES549539A0 (es) 1987-10-16
WO1986003520A1 (en) 1986-06-19
JPH0655144B2 (ja) 1994-07-27
EP0205564B1 (en) 1991-05-02
DK368786D0 (da) 1986-08-01
ES8800049A1 (es) 1987-10-16
NO304469B1 (no) 1998-12-21
CZ127496A3 (cs) 2000-02-16
AU5313486A (en) 1986-07-01
JPH01257480A (ja) 1989-10-13
JPH07184681A (ja) 1995-07-25
PL157926B1 (pl) 1992-07-31
DE411678T1 (de) 1991-10-17
PT81590A (en) 1986-01-01
HU216079B (hu) 1999-04-28
FI863044A (fi) 1986-07-24
KR870700099A (ko) 1987-02-28
DK172953B1 (da) 1999-10-18
NO863050L (no) 1986-07-28
CZ286557B6 (cs) 2000-05-17
LV10505A (lv) 1995-02-20
EP0205564B2 (en) 2000-06-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA44882C2 (uk) Фрагмент геномної днк, що кодує еритропоетин, фрагмент кднк, що кодує еритропоетин, спосіб одержання еритропоетину людини (варіанти), спосіб одержання фармацевтичної композиції еритропоетину людини (варіанти)
Paolo Dotto et al. Specific growth response of ras-transformed embryo fibroblasts to tumour promoters
EP0787200B1 (en) Improved adenovirus and methods of use thereof
EP0702084B1 (en) Recombinant retroviruses
US6048724A (en) Method of producing clonal cell strains which express exogenous DNA encoding glucagon-like peptide 1
EP0255231B1 (en) Human erythropoietin gene: high level expression in stably transfected mammalian cells
Claycomb et al. Proto-oncogene expression in proliferating and differentiating cardiac and skeletal muscle
JP2852515B2 (ja) ベクターウイルスおよびベクターウイルスを含む薬用組成物
Meakin et al. γ-Crystallins of the human eye lens: expression analysis of five members of the gene family
JPH03503718A (ja) 修飾された肝細胞およびその用途
JPH08502901A (ja) 真核細胞における、治療を目的とした遺伝子の移入と発現のためのレトロウィルスベクター
US5876714A (en) Human glycosyltransferase gene, compounds and method for inhibiting cancerous metastasis
US6524851B1 (en) Hybrid nucleic acid molecules and vectors including β-globin regulatory elements
JP2002538182A (ja) 新脈管形成を阻害するための方法および試薬
Faller et al. Immortalization of human endothelial cells by murine sarcoma viruses, without morphologic transformation
KR970005049B1 (ko) 바쿨로비루스 발현 시스템, 이 벡터 시스템을 포함하는 이종성 무척추동물 숙주세포, 상기 시스템에 의해 생산되는 가용성의 정제된 야생형 망막아세포종 폴리펩티드 및 이 폴리펩티드의 생산 방법
Freedman et al. Variations in viral gene expression in Friend virus-transformed cell lines congenic with respect to the H-2 locus
RU2229309C2 (ru) МОДИФИЦИРОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА FSHβ С ПОМОЩЬЮ ГОМОЛОГИЧНОЙ РЕКОМБИНАЦИИ
Giese et al. Expression and purification of biologically active v-sis/platelet-derived growth factor B protein by using a baculovirus vector system
JPH03503721A (ja) 酵素的に活性な組換えグルコセレブロシダーゼ
Waterfield et al. [52] Expression and properties of epidermal growth factor receptor expressed from baculovirus vectors
JP2001517064A (ja) トランスフォーミング増殖因子アルファｈｉ
RU2129613C1 (ru) Способ получения эритропоэтина человека
WO2000056368A1 (fr) Therapeutique genique
Durban et al. Influence of mammary cell differentiation on the expression of proteins encoded by endogenous BALB/c mouse mammary tumor virus genes