CZ281756B6 - DNA sekvence, kodující aminokyselinovou sekvenci lidského erythropoietinu, vektory, obsahující takové DNA sekvence, prokaryotické a eukaryotické hostitelské buňky transformované takovým vektorem, způsob přípravy lidského erythropoietinu, rekombinantní lidský erythropoietin a farmaceutický přípravek, obsahující erythropoietin - Google Patents
DNA sekvence, kodující aminokyselinovou sekvenci lidského erythropoietinu, vektory, obsahující takové DNA sekvence, prokaryotické a eukaryotické hostitelské buňky transformované takovým vektorem, způsob přípravy lidského erythropoietinu, rekombinantní lidský erythropoietin a farmaceutický přípravek, obsahující erythropoietin Download PDFInfo
- Publication number
- CZ281756B6 CZ281756B6 CS858804A CS880485A CZ281756B6 CZ 281756 B6 CZ281756 B6 CZ 281756B6 CS 858804 A CS858804 A CS 858804A CS 880485 A CS880485 A CS 880485A CZ 281756 B6 CZ281756 B6 CZ 281756B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- erythropoietin
- epo
- cells
- sequence
- dna
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
- C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
- C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
- C12N2840/44—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Hematology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Vynález popisuje rekombinantní DNA plasmidový vektor, obsahující cDNA, kodující lidský EPO klonu lambda HEPOFL13 (ATCC 40153) a savčí buňku transformovanou tímto vektorem nebo plasmidem, který obsahuje celou DNA hovězího papilloma viru a cDNA sekvenci z tabulky 3, kodující lidský EPO, které jsou vhodné pro přípravu lidského erythropoietinu, který je charakterizován přítomností O-napojené glykosylace.
ŕ
Description
Oblast techniky
Předložený vynález se týká klonovaných genů pro lidský erythropoietin, které poskytují překvapivě vysoké hladiny exprese, této exprese uvedených genů a in vitro produkce aktivního lidského erythropoietinu.
Dosavadní stav techniky
Erythropoietin (dále označován jako EPO) je cirkulující glykoprotein, který stimuluje tvorbu erythrocytů ve vyšších organismech, viz Carbot a spol., Compt.Rend., 143:384 (1906). Jako takový je EPO někdy označován jako erythropoesis stimulující faktor.
Doba životnosti lidských erythrocytů je asi 120 dnů. Asi 1/120 celkových erythrocytů je denně odbourána v retikulo-endotheliálním systému. Současné je denně produkován relativné konstantní počet erythrocytů, aby byla stále udržena určitá hladina erythrocytů (Guyton, Textbook of Medical Physiology, str. 56 až 60, W.B. Saunders Co., Philadelphia 1976).
Erythrocyty jsou produkovány zráním a diferenciací erythroblastů v kostní dřeni a EPO je faktor, který působí na méně diferencované buňky a indukuje jejich diferenciaci k erythrocytům (Guyton, výše).
EPO je slibným terapeutickým prostředkem pro klinickou léčbu anémie nebo konkrétné renální anémie. V praktické terapii není používání EPO dosud bohužel běžné pro jeho malou dostupnost.
Pro použití EPO jako terapeutického prostředku je třeba uvážit možné problémy antigenicity a proto je výhodné připravovat EPO ze suroviny lidského původu. Je možno například použít lidskou krev nebo moč pacientů, postižených aplastickou anémii nebo podobnými nemocemi, které způsobují vylučování velkého množství EPO. Tyto suroviny však jsou k dispozici v omezeném množství, viz například White a spol., Rec.Progr.Horm.Res., 16; 219 (1960), Espada a spol., Biochem.Med., 3; 475 (1970), Fisher, Pharmacol. Rev., 459 (1972) a Gordon, Vítám.Horm. (N.Y.) 31; 105 (1973), které jsou zde zahrnuty jako odkazy.
Příprava EPO produktů se obvykle prováděla koncentrací a čištěním moči pacientů, vykazujících vysokou úroveň EPO, například pacientů, postižených aplastickou anémii a podobnými nemocemi, viz například patenty USA č. 4397840, 4303650 a 3865801. Omezená zásoba takovéto moči je překážkou praktického použití EPO a tudíž je velmi žádoucí připravovat EPO produkty z moči zdravých osob. Problém použiti moči zdravých lidí spočívá v jejím nízkém obsahu EPO ve srovnání s anemickými pacienty. Moč zdravých jedinců obsahuje určité inhibiční faktory, které v dostatečně vysoké
-1CZ 281756 B6 koncentraci působí proti erythropoese, takže dostatečný terapeutický účinek může být u EPO, získaného z takové moči, dosažen pouze s použitím následujícího významného postupu čištění.
EPO lze rovněž regenerovat z ovčí krevní plazmy a separace EPO z této krevní plazmy poskytla dostatečné potentní a stabilní vodorozpustné preparáty, viz Goldwasser, Control Cellular Dif.Develop., díl A, str. 487 až 494, Alan R.Liss, lne., N.Y. (1981). Lze však očekávat, že ovčí EPO bude pro lidi antigenní.
Běžné izolační a čisticí metody s použitím přírodních zdrojů EPO tedy nejsou adekvátní masové produkci tohoto žádaného terapeutického prostředku.
Sugimoto a spol. v patentu USA č. 4377513 popisují jeden ze způsobů masové produkce EPO, zahrnující multiplikace in vivo lidských lymfoblastoidních buněk, zahrnujících Namalwa, BALL-1, NALL-1, TALL-1 a JBL.
Zprávy o produkci EPO jinými metodami genetického inženýrství se objevily ve standardní literatuře. Nebyl však zatím publikován reprodukovatelný způsob výroby ani chemická charakteristika produktu. Předmět tohoto vynálezu naproti tomu představuje reprodukovatelný způsob masové produkce proteinů, vykazujících biologické vlastnosti lidského EPO. Tímto způsobem je možno rovněž produkovat proteiny, které se mohou chemicky lišit od autentického lidského EPO a současně vykazovat podobné (a v některých případech zlepšené) vlastnosti. Pro jednoduchost jsou zde všechny proteiny, vykazující biologické vlastnosti lidského EPO, označovány jako EPO bez ohledu na to, zda s ním jsou nebo nejsou chemicky identické.
Podstata vynálezu
Předložený vynález se týká klonování genu, který exprimuje překvapivě vysoké hladiny lidského EPO, jeho exprese a masové produkce aktivního lidského EPO in vitro. Jsou také popsány vhodné expresní vektory pro produkci EPO, expresní buňky, schémata čištění a příbuzné procesy.
Jak je podrobněji dále popsáno, byl EPO získán v částečně čištěné formě a byl dále čištěn do homogenity a štěpen trypsinem za vzniku specifických fragmentů. Tyto fragmenty byly čištěny a sekvenovány. EPO oligonukleotidy byly navrženy a syntetizovány na základě těchto sekvencí, tyto oligo byly použity ke screeningu lidské genomické knihovny, ze které byl izolován EPO gen.
EPO gen byl ověřen na základě své DNA sekvence, která odpovídala mnoha ze sekvenovaných tryptických proteinových fragmentů. Část genomického klonu pak byla použita pro demonstraci při hybridizaci, že EPO mRNA by mohla být detegována v lidské fetální mRNA (stáří 20 týdnů). Byla připravena cDNA knihovna jater lidského plodu a byla screenována. Byly získány tři EPO cDNA klony (po screeningu > 750000 rekombinantů). Dva z těchto klonů byly stanoveny jako mající plnou délku podle kompletní kódující sekvence a v podstatě 5-konec a 3-konec netranslatované sekvence. Tyto cDNA byly exprimovány v SV-40 virem transformovaných opičích buňkách (COS-1 buněčná linie; Gluzman, Cell 23:175-182 (1981))
-2CZ 281756 B6 a buňkách vaječníků čínských křečků (buněčná linie CHO; Urlaub G. a Chasin L.A. Proč.Nati.Acad.Sci. USA 77:4216-4280 (1980)). EPO, produkovaný z COS buněk, je biologicky aktivní EPO in vitro a in vivo. EPO, produkovaný z CHO buněk, je také biologicky aktivní in vitro a in vivo.
EPO cDNA klon má zajímavý otevřený čtecí rámeček 14-15 aminokyselin (aminoacids -aa) s iniciátorem a terminátorem ze 20 až 30 nukleotidů (nt) proti směru kódující oblasti. Reprezentativní vzorek E.coli, transfektované klonovaným EPO genem, byl uložen v Američan Type Culture Collection, Rockville, Maryland, který je dostupný pod přírůstkovým číslem ATCC 40153.
Popis obrázků na připojených výkresech
Tabulka 1 je sekvence 87 párů bází exonu lidského EPO genu; obr. 1 ilustruje detekci EPO mRNA v lidské fetální jaterní mRNA; tabulka 2 ilustruje aminokyselinovou sekvenci EPO proteinu, odvozenou z nukleotidové sekvence lambda-HEPOFL13;
tabulka 3 ilustruje nukleotidovou sekvenci EPO cDNA v lambda-HEPOFL13 (uvedena schematicky na obr. 2) a z ní odvozenou aminokyselinovou sekvenci;
obr. 3 ilustruje relativní polohy DNA inzertů čtyř nezávislých lidských EPO genomických klonů;
obr. 4 představuje mapu zjevné intronové a exonové struktury lidského EPO genu;
tabulka 4 ilustruje DNA sekvenci EPO genu, ilustrovanou na obr. 4B;
obr. 5A, 5B a 5C ilustrují konstrukci vektoru 91023(B);
obr. 6 ilustruje SDS polyakrylamidovou gelovou analýzu EPO, produkovaného v COS-1 buňkách, ve srovnání s nativním EPO, tabulka 6 ilustruje nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci EPO klonu, lambda-HEPOFL8;
tabulka 7 ilustruje nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci EPO klonu, lambda-HEP0FL13;
obr. 7 je schematickou ilustrací plasmidu pRKl-4 a obr. 8 je schematickou ilustrací plasmidu pdBPV-MMTneo(342-12).
Předložený vynález se týká klonování EPO genů a produkce EPO in vitro expresí těchto genů.
V patentové a vědecké literatuře je uváděno mnoho způsobů, vhodných pro produkci rekombinantních proteinů. Obecně tyto techniky zahrnují izolaci nebo syntézu požadované genové sekvence a expresi takové sekvence bud v prokaryotické nebo eukaryotické buňce za použití technik běžně odborníkům známých. Jakmile byl gen izolován, čištěn a izertován do transfer vektoru (tj. klonován), je zajištěna dostupnost podstatného množství. Vektor s do néj klonovaným genem je tranferován do vhodného mikroorganismu nebo buněčné linie, například bakterie, kvasinky, savčích buněk, jako jsou COS-1 buňky (opičí ledviny), CHO (vaječniky čínského křečka), hmyzí buněčné linie a podobně, kde se vektor replikuje při proliferaci mikrooganismu nebo buněčné linie a ze kterých vektor může být izolován běžnými prostředky. Je tak poskytnut obnovitelný zdroj genu pro další manipulace, modifikace a transfery do jiných vektorů nebo jiných míst v tomtéž vektoru.
-3CZ 281756 B6
Exprese může být často dosažena transferováním klonovaného genu ve správné orientaci a čtecím rámečku do vhodného místa v transfer vektoru tak, že translační čtecí postup z prokaryotického nebo eukaryotického genu vede k syntéze proteinového prekurzoru, obsahujícího aminokyselinovou sekvenci, kódovanou klonovaným genem, připojeným k Met nebo aminokoncové sekvenci z prokaryotického nebo eukaryotického genu. V obou případech mohou být signály pro iniciaci transkripce a translace dodány vhodným genomickým fragmentem klonovaného genu. Mnoho specifických technik štěpeni proteinů může být použito pro štěpení proteinového prekurzoru, je-li produkován, v požadovaném bodě tak, aby se uvolnila požadovaná aminokyselinová sekvence, která může být pak čištěna obvyklými prostředky. V některých případech je protein, obsahující požadovanou aminokyselinovou sekvenci, produkován bez potřeby specifických technik štěpení a může být také uvolněn z buněk do extracelulárního růstového média.
Izolace genomického klonu lidského EPO
Lidský EPO byl čištěn do homogenity z moči pacientů, postižených aplastickou anémii, jak popsáno dále. Úplné štěpení tohoto čištěného EPO proteásovým trypsinem poskytlo fragmenty, které byly odděleny vysokotlakovou kapalinovou chromatografii s reverzní fází, získány z gradientových frakcí a podrobeny mikrosekvenční analýze. Sekvence tryptických fragmentů jsou podtrženy v tabulkách 2 a 3 a jsou podrobněji diskutovány dále. Dvě aminokyselinové sekvence, Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lys a Val-Tyr-Ser-Asn-Phe-Leu-Arg, byly zvoleny pro návrh oligonukleotidových sond (vedoucích k oligonukleotidovém poolu 17 nt dlouhému a 32-krát degenerovanému a oligonukleotidovému poolu 18 nt dlouhému a 128-krát degenerovanému z dřívějšího tryptického fragmentu, jakož i k dvěma poolům 14 nt dlouhým, vždy 48-krát degenerovaným, z pozdějšího tryptického fragmentu). 32-krát degenerovaný 17merový pool byl použit pro screening lidské genomické DNA knihovny v Ch4A vektoru (22) za použití modifikace Woo-a a 0'Malleye v in šitu amplifikačnim postupu (47) pro přípravu filtrů pro screening.
Arabské číslice v závorkách (1) až (81) jsou použity pro označeni publikací, které jsou uvedeny podle čísel na konci tohoto popisu.
Fágy, hybridizující k 17meru, byly vybrány, spojeny do malých skupin a sondovány se 14merovými a ISmerovými pooly. Fágy, hybridizující k 17merových, 18merovým a 14merovým poolům, byly plakově čištěny a fragmenty byly subklonovány do M13 vektorů pro sekvenci dideoxy-řetězec ukončující metodou podle
-4CZ 281756 B6
Tabulka 1 gatcctacgcctgtggecagggccagagcettcagggacccttgactccccgggctgtgtgcatttcag a
| ACG | GGC | TGT | GCT | GAA | CAC | TGC | AGC | TTG | AAT | GAC | ΛΑΓ | ATC |
| Thr | Gly | Cys | Ala | Glu | His | Cys | Ser | Leu | Aen | Glu | Asn | Ile |
| ACT | GTC | CCA | C/»C | ACC | AAA | GTT | AAT | TTC | TAT | GCC | TGG | AAG |
| Thr | Val | Pro | Asp | Thr | tys | Val | Asn | Phe | T yr | Ala | Trp | Lys |
AGG ATG GAGgtgagttcctttttttmtttttcctttcttttggagaatcteamgcgagcctg Arg MET Glu d attt t ggat gaaaggga gaatgatc
-5CZ 281756 B6
Tabulka 2
| o | >· | |||||||||
| az c_ | —J o | o >» | u | e o -? | O S | O o | fa Q | O ei | fa & | e s. X |
| CM *J | <o < | co — | «< | Vj | CT. | u | ||||
| oo | =3 | |||||||||
| >· | UJ | c | c* | tr | ||||||
| o | —J | O | a | a | fa | |||||
| 5 | < | > | = | < | ||||||
| =3 | -J | |||||||||
| _____1 | < | 3 | c | c | C | o | c | o | ||
| L3 | > | O | co < | O | C | < | < | JZ c. | ||
| CZ3 | O | |||||||||
| Qí | 3 | 5 | > | cn | • | fa | ||||
| □3 | 0L | O | X | *· | ||||||
| <u | O | δ | 6 | U | C | |||||
| Z3 | ||||||||||
| UJ | 3 | s | b3 | 91 | c. | |||||
| 0» | 0) | fa | a | X | 00 | |||||
| taj | > | < | < | <u | < | |||||
| >- | >- | |||||||||
| —1 | —J | M | JJ | 3 | 3 | w | c | a | ||
| LO | O | 0 | 0 | |||||||
| taj | o | taJ | > | 5 | < | |||||
| ZD | bz | |||||||||
| CM LU | UJ | fa | Q | u | ||||||
| s: | .J | fa | O | Q | £ | |||||
| < | co | s | > | = | < | b· |
| a: Q_ | 3 | 91 X | to - u £ | a o | X | o | |||
| Ξ | O | < | < | kj | o | ||||
| =□ | fa | ||||||||
| UJ | 3 | v | 91 | 3 | c | 3 | |||
| _j | 0 | X | ti | JS | |||||
| taJ | š | <u | Ό | o | taJ | ||||
| a: | |||||||||
| UJ | s | n. | h | 3 | o | • | b£ | ||
| co | <0 > | o | k | O ta | o U | < | fa < | ||
| =3 UJ | bz | « | c | a | O | O Ϊ | o | 3 | |
| O | *« | © 3 | o 3 | o v | o ·« | S 5 | cn | Φ | |
| w | co < | « < | e- *3 | O O. | k< -c . | taj | |||
| =) UJ _J | fa 0 | « X | W fc > | 3 O | a | 3 O | O fa | ||
| CO | o | f-· | u | 5 | u | a. | |||
| CĚ. | |||||||||
| UJ | fi | X | i e | a | a | a | <3 | ||
| oo | β | w | 1 JS | fa | v | ||||
| < | o | 1 B· | < | ř« | '.kJ | < | |||
| =3 LU _j | 09 > | « k Λ | ' S | a a | Q fa | k s | β | ||
| Q | tu < | u | a· | H | < | ||||
| Ξ3 | 1 | ||||||||
| LU _j | Φ | fa JS | a | X | c | t. s. | fa Φ | ||
| w | H | > | O | S | H | 03 | |||
| O | |||||||||
| UJ | □ | 09 | c | fa | a | CQ | |||
| _J | 0 | © | X | Φ | o | ||||
| taj | U | S | CO | 'k3 | < | ||||
| Q_ ac Ι- | bz fa < | Asn | fa j: | a k | Ser | Ser | a < | ||
| Ο | |||||||||
| LU | O | 3 | & | c | to | o. | |||
| fa | 91 | 3 | (0 | fa | co | ||||
| cu | c | < | > | < | < | < | |||
| CL. | |||||||||
| oc | o | a | O | a | «-« | O | |||
| μ— | fa | ·* | fa | o | fa | ||||
| a. | < | & | 5 | > | kJ | 0« | |||
| i | a | 3 | 3 | 0 | |||||
| • | C3 | a | 0 | fa | |||||
| < | c | > | > | U | fi. |
150 160
Phc Arg Val Tyr Ser Asn Pho Leu Arg Cly Lye Leu Lys Leu Tyr Thr Cly Glu Ala
-6CZ 281756 B6
Tabulka 3 ccqpiu
MMsguee eaccgcgcce gctctgcrccg acaaegcgcc egggatgaggg aeeeeggtge
| •27 xrr | CLT | VAL | lis | CLO | CTS | PIO | |||||
| gacecetgce | «Ucgcu*t | AXG | CCC | CTC | CAC | GAA A | TCT | CCT | |||
| LEU CTC | LEO CTC | SU TCG | US CTC | Pto CCT | LEO CTC | CLT CCC | LEL CTC | PtO CCA | VAL CTC | LEO CTC | CLT CCC |
| —»<r„ | 10 -*£L | Jíl. | Uu | Cla | Are | Ux. | Leu | Civ | Ala | 20 ty· |
ceecggacag cccecetctc *«tacaggecc gtggggctgc ccatgcaeeg ccgagctcaa
| GCC | CCA | CCA | CGC | CTC | AXC | TCT | CAC | ACC | CCA | CTC | CTG | GAG | AGG | TAC | CTC | TTC | CAG | GCC | AAG |
| fflsu | u&Lu | • Jela -A/V | Lit- | Jir . | &C. -řiX. | » Cya | 30 Ala | Clu | Ua | SK Cya | Ser | Lan | Civ | • Ut | Zla | 40 THt | |||
| QAío | GCC | GAG | AAT | AXT | ACC - 1 | ACG | GGC | TCT | CCT | GAA | CAC | TGC | AGG | TTG | AAT | GAG | AAT | AXC | ACT |
| Val | Pra | Aap | Thr | Lya | £11 | Jaa | Jít, | 50 -AU- | -ΓΗ» | «•T· | Arg | Kat | Glu | Val | Cly | Cla | Cla | CO Ala | |
| CTC | CCA | CAC | ACC | AAA | CTT | AAX | TTC | TAX | GCC | TGG | AAG | ACG | AXG | CACj | CTC | GGC | CAG | CAG | CCC |
| Val | Civ | Val | Trp | Gin | Cly | tav | Ala | Lev | 70 Lan | Ser | Glu | Ala | Val | Lea | Arg | Í1T | Cln | Alt | 80 Lau |
| GTA | CAA | CTC | TGG | CAG | . GGC | CTC | GCC | CTC | CTG | TCG | GAA | CCT | CTC | CTC | CCC | GGC | CAG | GCC | CTG |
| L«u | , »*,L | • | Srr | Cla | Frv | Trs | Clu | 90 Pto | Leu | Cln | Wía | Val | Aaa | Lva | Ala | Val | 100 Sas | ||
| TTC | CTC | MC | TCT | TCC | CAG | CCC | TGC | GAG | CCC | CTC | CAG | CTG | CAT | CTC | CAT | AAA | CCC | CTC | AGT |
| Cly | Lau | Arg | Ser | Leu | Thr | Thr | Leu | Lau | 110 *U | Ala | Lev | «Ρ | Ala | Gin | ty· | Clu | Ala | n· | uo Sar |
| CCC | CTT | CCC | AGC | CTC | ACC | Aer | CTG | CTT | CGG | CCT | CTC | CGA | GCC | CAG. | AAG | CAA | CCC | AXC | TCC |
150 Leu řh« ArK Val Tvr Ser Aaa _Ph« Leu Ar* cxc ttc cca gtc tac rcc aax ttc ctc cgg uo Cly Lya Lau Lt« Leu Tyr Thr Cly Clu Ala
GGA AAG CTC AAG CTC TAC ACA GGG GAG GCC
SK 1M
C?» AfA Thr Cly Aap Arg
TCC ACG ACA CQG CAC AGA TGA ceaggtg tgtccacctg ggcatatcca ceacetecct caccaacact gcttgtgcca ccacggacac cccaaggatg ggaeagagce U«U«S· etgtgacste (tugucca caccctcccc ceea«tgcca tcacagggce acgecugaa tctaaetgtc tccaggtctc
Cgaagacau cgccaetect geaargaeac aacttgaggg gacgcetgag tcegeaeeta aegggcatgg •'UXUCtg gaaccccgtc ctcaggggcc eccagageag cccaecegge ccaeeaggga gcactecctt gccCctgget
B«tu<ctce gaagcactea aceetgcaaa caggatgace ggtggcaaga etcatggggt cagcteageg cccagagagc gagageagcc attcgatgce tggagaactt geeeccttga ccaagttctg ccagcctgce aactctgaga etaaacteag aggacccgce •UtU3“l
CKMUI‘1 tgtatcctce aacctcactg acaagaactg aaaceaceM aaaaaaaaaaaa
Sangera a Coulsona (23) (1977). Sekvence regionu, hybridizujícího ke 32násobně degenerovanému 17meru v jednom z klonů, je uvedena v tabulce 1. DNA sekvence obsahuje v otevřeném čtecím rámečku nukleotidy, které by mohly přesné kódovat tryptický fragment, použitý k odvození 17merového poolu oligonukleotidů. Dále analýza DNA sekvence indikuje, že 17merový hybridizující region byl obsažen v 87bp exonu, navázaném v místech potenciálního sestřihu akceptoru a donoru.
Pozitivní potvrzení, že tyto dva klony (zde označené jako lambda-HEPOl a lambda-HEP02) jsou EPO genomické klony, bylo získáno sekvenováním další exonů, obsahujících jiný tryptický fragment, kódující informace.
Izolace EPO cDNA klonů
Byla provedena Northern analýza (56) lidské fetálni (20 týdnů staré) jaterní mRNA za použití 95nt jednořetězcové sondy, připravené z Ml3 klonu, obsahujícího část 87bp exonu, popsaného v tabulce 1. Jak je ilustrováno na obr. 1, bylo možno detegovat silný signál ve fetálni jaderné MRNA. Přesná identifikace tohoto pásu jako EPO mRNA byla provedena za použití stejné sondy ke screeningu bakteriofágové lambda cDNA knihovny fetálni jaterní mRNA (25). Bylo získáno několik hybridizujících klonů při frekvenci přibližné 1 pozitivní na 250 000 rekombinantů. Kompletní nukleotid a odvozené od těchto klonů (lambda-HEPOFL13 a lambda-HEPOFL8) jsou uvedeny v tabulkách 5 a 6. EPO kódující informace je obsažena v 594nt v 5-konec polovině cDNA, zahrnující velmi hydrofobní 27 aminokyselinový leader a 166 aminokyselinového zralého proteinu.
Identifikace N-konce zralého proteinu byla založena na N-koncové sekvenci proteinu, sekretovaného do moči osob s aplastickou anémií, viz tabulka 1, a jak publikoval Goldwasser (26), Sue a Sytkowski (27) a Yangawa (21). Zda tento N-konec (Ala-Pro-Pro-Arg-) představuje skutečný N-konec, navázaný na EPO v oběhu, nebo zda probíhá nějaké štěpení v ledvinách nebo moči, není v současné době známo.
Aminokyselinové sekvence, které jsou podtrženy v tabulkách 2 a 3, označují ty tryptické fragmenty nebo části, ze kterých byla získána proteinová sekvence. Dedukovaná sekvence přesné souhlasí s tryptickými fragmenty, které byly sekvenovány, což potvrzuje, že izolovaný gen kóduje lidský EPO.
Struktura a sekvence lidského EPO genu
Relativní polohy DNA inzertů čtyř nezávislých lidských EPO genomických klonů jsou uvedeny na obr. 3. Hybridizační analýza těchto klonů s oligonukleotidovými sondami a s různými sondami, připravenými ze dvou tříd EPO cDNA klonů, umísťuje EPO gen do přibližné 3,3 kb oblasti, znázorněné na obr. 3 tmavou čárou. Kompletní sekvenční analýza této oblasti (viz příklad 4) a porovnání s cDNA klony vede k mapě intronové a exonové struktury EPO genu, uvedené na obr. 4. EPO gen je rozdělen do 5 exonů. Část exonu I, celé exony II, III a IV a část exonu V, obsahují protein, kódující informaci. Zbylé exony I a V kódují 5-konec a 3-konec netranslatované sekvence.
-8CZ 281756 B6
Přechodná exprese EPO v COS buňkách
K demonstrování, že biologicky aktivní EPO by mohl být exprimován v in vitro buněčném systému, byla provedena COS buněčná expresní studie (58). Vektor, použitý pro přechodné studie, p91023 (B), je popsán v příkladu 5. Tento vektor obsahuje adenovirový hlavní pozdní promotor, SV40 polyadenylační sekvenci, SV40 původ replikace, SV40 enhancer a adenovirový VA gen. cDNA inzert v lambda-HEPOFL13 (viz tabulka 6) byla inzertována do p91023(B) vektoru po směru od hlavního pozdního promotoru. Tento nový vektor je označen jako PPTFL13.
Dvacetčtyři hodin po transfekci tohoto konstruktu do M6 kmene COS-1 buněk (Horowitz a spol., J.Mol.Appl.Genet.2:147-149 (1983)) byly buňky promyty, přemístěny do séra prostého média a buňky byly sklizeny o 48 hodin později. Hladina uvolnění EPO do supernatantu kultury pak byla hodnocena za použití kvantitativní radioimunoeseje pro EPO (55). Jak je uvedeno v tabulce 8 (příklad 6), byl exprimován imunologicky reaktivní EPO. Biologická aktivita EPO, produkovaného z COS-1 buněk, byla také hodnocena. V odděleném pokusu byl vektor, obsahující EPO cDNA z lambda-HEP0FL13, transfektován do COS-1 buněk a médium bylo sklizeno jak popsáno výše. EPO v médiu byl pak kvantifikován bud ve dvou in vitro biologických zkouškách, 3H-thymidinem a CFU-E (12, 29) a pak dvěma in vivo zkouškami, hypoxickou myší a vyhladovělou myší (30, 31) (viz tabulka 9, příklad 7). Tyto výsledky demonstrují, že biologicky aktivní EPO je produkován v COS-1 buňkách. Při Western-blottingu za použití polyklonální anti-EPO protilátky, EPO produkovaný COS buňkami má mobilitu na
SDS-polyakrylamidových gelech, která je identická s mobilitou nativního EPO, připraveného z lidské moče (příklad 8). Rozsah glykosylace EPO, produkovaného COS-1, může být podobný jako u nativního EPO.
Různé vektory, obsahující jiné promotory, mohou být také použity v COS buňkách nebo v jiných savčích, nebo eukaryotických buňkách. Příklady takových jiných promotorů, vhodných při provedení vynálezu, zahrnuji SV40 časné a pozdní promotory, promotor myšího metallothioneinového genu, promotor, nalezený v dlouhých terminálních opakováních ptačích nebo savčích retrovirů, promotor bakulovirového polyhedron genu a jiné. Příklady typů jiných buněk, vhodných v praktickém provedení tohoto vynálezu, zahrnují E.coli, kvasinkové, savčí buňky, jako jsou CHO (vaječník čínského křečka), C127 (opičí epithel), 3T3 (myší fibroblast), CV-1 (ledviny africké opice - Afričan green monkey kidney) a hmyzí buňky, jako jsou buňky ze Spodoptera frugiperda a Drosophila melangaster. Tyto alternativní promotory a/nebo buněčné typy mohou umožňovat regulaci načasováni nebo hladiny EPO exprese, produkce buněčné specifických typů EPO nebo růstu velkých množství EPO produkujících buněk za méně nákladných, snadněji kontrolovatelných podmínek.
Expresní systém, který si zachovává výhody savčí exprese, ale vyžaduje kratší dobu pro produkci vyšší hladiny exprese buněčné linie, se skládá z hmyzí buněčné linie a DNA viru, který se reprodukuje v této buněčné linii. Virus je virus jaderné polyhedrózy. Má dvojvláknový cirkulárni DNA genom o velikosti 128 kb.
-9CZ 281756 B6 nalézá se obalen ve dvou viru, prorůstajícího membránou,
Nukleokapsid je tyčkovitě tvarován a formách, neokludované formé a okludované formě, obalené v proteinovém krystalu v jádru infikované buňky. Tyto viry mohou být rutinně propagovány v in vitro ' ' ~~ ; kultuře a jsou přizpůsobivé všem rutinním virovým : typicky živný solhmyzí buněčné metodám u živočichu. Médium buněčné kultury je ný roztok a 10% fetální telecí sérum.
In vitro je růst viru iniciován, jestliže neokludovaný virus (NOV) vstupuje do buňky a přechází do jádra, kde se replikuje. Replikace je jaderná. Během počáteční fáze (8-18 h po infekci) virové aplikace jsou nukleokapsidy shromážděny v jádře a následně prorůstají plazmovou membránou jako NOV a rozšiřují infekci v buněčné kultuře. Navíc některé nukleokapsidy následně (18+ h po infekci) zůstávají v jádře a jsou okludovány v proteinové matrici a jsou známy jako polyhedrální inkluzní tělísko (PIB). Tato forma není v buněčné kultuře infekční. Matrice je složena z proteinu, známého jako polyhedrin, mol. hmotnost 33 kd. Každý PIB má přibližně 1 mm v průměru a v jádře může být až 100 PIB. V pozdní fázi infekčního cyklu je produkován tak velký podíl polyhedrinu, činící až 25 % celkového buněčného proteinu.
Protože PIB nehraje žádnou roli v in vitro replikačním cyklu, může být polyhedrinový gen deletován z virového chromozomu bez ovlivnění životaschopnosti in vitro. Při použití viru jako expresního vektoru byla nahrazena polyhedrinový gen kódující oblast cizí DNA, která má být exprimována, a byla tak umístěna pod kontrolou polyhedrin promotoru. Výsledkem je virový fenotyp, netvořící PIB.
Tento systém byl použit několika výzkumníky, z nichž jsou nejčastěji uváděni Pennock a spol. a Smith. a spol. Pennock a spol. (Gregory D.Pennock, Charles Shoemaker a Lois K. Miller, Molecular and Cell Biology 3:84, str. 399-406) popisují vysokou hladinu exprese bakteriálního proteinu, β-galaktosidázy, jestliže je umístěn pod kontrolou polyhedrinového promotoru.
Jiný expresní vektor, odvozený od jaderného polyhedrozního viru, byl popsán Smithem a spol. (Gale E.Smith, Max D.Summers a M.J.Fraser, Molecular nad Cell Biology, 16.května 1983, str. 2156-2165). Tito autoři demonstrovali účinnost svého vektoru v expresi lidského B-interferonu. Syntetizovaný produkt byl shledán glykosylovaným a sekretovaným z hmyzích buněk, jak bylo očekáváno. V přikladu 14 jsou popsány modifikace plasmidu, obsahujícího Autographa californica jaderný polyhedrosis virový (AcNPV) polyhedronový gen, které umožňují snadnou inzerci EPO genu do plasmidu, takže může být pod transkripční kontrolou polyhedrinového promotoru. Výsledná DNA je ko-transfektována intaktni chromosomovou DNA ze standardního typu AcNPV do hmyzích buněk. Genetická rekombinace vede k nahrazení AcNPVC oblasti polyhedrinového genu DNA z plasmidu. Výsledný rekombinantní virus může být identifikován mezi virovým potomstvem tím, že vykazuje DNA sekvence EPO genu. Tento rekombinantní virus má po reinfekci hmyzích buněk produkovat EPO.
Příklady EPO exprese v CHO, C127 a 3T3 a hmyzích buňkách jsou uvedeny v příkladech 10 a 11 (CHO), 13 (C127 a 3T3) a 14 (hmyzí buňky).
-10CZ 281756 B6
Rekombinantní EPO, produkovaný v CHO buňkách jako v příkladu 11, byl čištěn běžnými metodami sloupcové chromatografie. Relativní množství cukrů, přítomných v glykoproteinu, byla analyzována dvěma nezávislými metodami [(I) Reinold, Methods in Enzymol. 50:244-249 (Methanolysis) a (II) Takemoto H. a spol., Anal. Biochem. 145:245 (1985) (pyridylaminace, spolu s nezávislým stanovením kyseliny sialové)]. Výsledky, získané v každé metodě, byly ve vynikajícím souladu. Bylo provedeno několik stanovení, poskytujících následující průměrné hodnoty, kde N-acetylglukosamin je pro
| srovnávací účely označen hodnotou 1: | |
| Cukr | relativní molární hladina |
| N-acetylglukosamin | 1 |
| hexózy: | 1,4 |
| galaktóza | 0,9 |
| mannóza | 0,5 |
| kyselina N-acetyluraminová | 1 |
| fukóza | 0,2 |
| N-acetylgalaktosamin | 0,1 |
Je třeba uvést, že významné hladiny fukózy a N-acetylgalaktosaminu nyly reprodukovatělně pozorovány za použití obou nezávislých metod analýzy cukrů. Přítomnost N-acetylgalaktosaminu indikuje přítomnost O-napojené glykosylace na proteinu. Přítomnost O-napojené glykosylace byly dále indikována SDS-PAGE analýzou glykoproteinu s následujícím štěpením glykoproteinu s různými kombinacemi glykosidických enzymů. Po enzymatickém odštěpení všech N- napojených karbohydrátů na glykoproteinech za použití enzymu peptid endo F N-glykosidáza, byla molekulová hmotnost proteinu dále snižována následujícím štěpením s neuraminidázami, jak bylo stanoveno pomocí SDS-PAGE analýzy. In vitro biologická aktivita čištěného rekombinantního EPO byla zkoušena metodou G.Krystala, Exp.Hematol. 11:649 (1983) (bioesej proliferace slezinných buněk) s proteinovými ukončeními, vypočtenými na základě údajů o aminokyselinovém složeni. Po vícenásobných ukočeních byla in vitro specifická aktivita čištěného rekombinantního EPO vypočtena jako vyšší než 200.000 jednotek/mg proteinu. Průměrná hodnota byla v rozmezí asi 275.000 - 300.000 jednotek/mg proteinu. Navíc byly také pozorovány hodnoty vyšší než 300.000. Poměry in vivo/polycytemická esej na myších, Kazal a Erslev, Am.Clinical Lab.Sci., Vcl.B, str. 91 (1975)/in vitro aktivity, pozorované pro rekombinantní materiál, byly v rozmezí 0,7 až 1,3.
Je zajímavé porovnat glykoproteinové charakteristiky, uvedené výše pro rekombinantní CHO-produkovaný EPO materiál, dříve uvedený v mezinárodní patentové přihlášce č. WO 85/02610 (publikované 20. června 1985). Odpovídající srovnatelná analýza cukrů, popsaná na str. 65 této přihlášky udává nulovou hodnotu pro fukózu a pro N-acetylgalaktosamin a poměr hexózy:N-acetylgalaktosamin 15,09:1. Nepřítomnost N-acetylgalaktosaminu indikuje nepřítomnost O-napojené glykosylace ve dříve uváděném glykoproteinu. Na rozdíl od tohoto materiálu, rekombinantní CHO-produkovaný EPO podle tohoto vynálezu, který je charakterizován výše, obsahuje významná a reprodukovatelná pozorovatelná množství jak fukózy, tak N-acetylgalaktosaminu, obsahuje méně než jednu desetinu relativního množství hexóz a je charakterizován přítomností O-napojené glykosylace. Dále může být vysoká specifická aktivita výše popsa
-11CZ 281756 B6 něho CHO-získaného rekombinantního EPO podle tohoto vynálezu přímo vztažena ke svému charakteristickému glykosylačnímu uspořádání.
Biologicky aktivní EPO, produkovaný prokaryotickou nebo eukaryotickou expresí klonovaných EPO genů podle předloženého vynálezu, může být použit pro in vivo léčbu savčích druhů lékaři a/nebo veterináři. Množství účinné složky bude samozřejmě záviset na intenzitě léčené choroby, zvoleném způsobu podání a specifické aktivitě aktivního EPO, a v konečné podobě bude stanoveno příslušným lékařem nebo veterinářem. Takové množství aktivního EPO, stanovené příslušným lékařem, je zde také označeno jako léčebně účinné EPO množství. Například v léčbě indukované hypoproliferativní anémie, spojené s chronickým selháním ledvin u ovce, bylo účinné denní množství EPO nalezeno 10 jednotek/kg po 15 až 40 dnů. Viz Eschbach a spol., J.Clin.Invest., 74:434 (1984).
Účinný EPO může být podáván jakýmkoliv způsobem vhodným pro stav, který je léčen. Výhodně je EPO injektován do krevního proudu léčeného savce. Odborníkovi v oboru bude zřejmé, že preferovaný způsob podáni se bude měnit podle léčeného stavu.
U účinného EPO je možné, aby byl podáván jak jako čistá, tak v podstatě čistá sloučenina, je výhodné ho podávat ve formé farmaceutické formulace nebo preparátu.
Formulace podle předloženého vynálezu jak pro veterinární tak humánní použití obsahují účinný EPO protein, jak je popsán výše, spolu s jedním nebo více jeho farmaceuticky přijatelnými nosiči a popřípadě další terapeutické složky. Nosič(e) musí být přijatelné v tom smyslu, že jsou kompatibilní s jinými složkami formulace a neškodí jejímu příjemci. Je žádoucí, aby formulace neobsahovala oxidační činidla a jiné substance, o kterých je známo, že nejsou s peptidy kompatibilní. Formulace může být výhodně ve formé jednotkové dávkové formy a může být připravena jakoukoliv metodou, známou v oboru farmacie. Všechny metody zahrnují stupeň uvedeni do spojení účinné složky s nosičem, který tvoří jedna nebo více pomocných složek. Obecné jsou formulace připraveny homogenním a dokonalým spojením účinné složky s kapalnými nosiči nebo jemně dělenými pevnými nosiči, nebo oběma typy nosičů a pak jsou, je-li to nezbytné, tvarovány produkty do požadovaného tvaru.
Formulace, vhodné pro parenterální podání, obvykle zahrnují sterilní vodné roztoky účinné složky s roztoky, které jsou výhodně isotonické s krví příjemce. Takové formulace mohou být výhodně připraveny rozpuštěním pevné účinné složky ve vodě za vzniku vodného roztoku a sterilizací roztoku v jedno nebo vícedávkových nádobkách, například zatavených ampulích nebo lahvičkách.
Zde používaný EPO/cDNA zahrnuje zralý EPO/cDNA gen, jemuž předchází ATG kodon a EPO/cDNA kódující alelické variace EPO proteinu. Jedna alela je ilustrována v tabulkách 2 a 3. EPO protein zahrnuje 1-methioninový derivát EPO proteinu (Met-EPO) a alelické variace EPO proteinu. Zralý EPO protein, ilustrovaný sekvencemi v tabulce 2, začíná sekvencí Ala-Pro-Pro-Arg..., jejíž začátek je v tabulce 2 označen číslem 1. Met-EPO by začínal sekvencí Met-Ala-Pro-Prc-Arg... .
-12CZ 281756 B6
Následující příklady slouží lepšímu porozumění vynálezu, jehož rozsah je dán připojenými nároky. Je pochopitelné, že modifikace mohou být provedeny v uvedených postupech, aniž by byl překročen rozsah vynálezu. Všechny teploty jsou udávány ve stupních Celsia a nejsou korigovány. Symbol mikron nebo mikro, např. mikrolitr, mikromol atd., je u, např. ul, um atd.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Izolace genomického klonu EPO
EPO byl čištěn z moči pacientů s aplastickou anémií v podstatě jak bylo popsáno dříve (Miyake a spol., J.Biol.Chem., 252:5558 (1977)) s tím rozdílem, že bylo vynecháno zpracování s fenolem a nahrazeno tepelným zpracováním při 80 stupních po 5 min pro inaktivaci neuraminidázy. Konečným stupněm čištěni byla frakcionace na C-4 Vydac HPLC koloně (The Separation Group) s použitím 0 až 95% acetonového gradientu s 0,1% kyselinou trifluoroctovou (TFA) během 100 minut. Poloha EPO v gradientu byla stanovena gelovou elektroforézou a N-terminální sekvenční analýzou (21, 26, 27) hlavních píků. EPO byl eluován přibližné 53% acetonitrilem a představuje přibližně 40 % proteinu, podrobeného HPLC s reverzní fází. Frakce, obsahující EPO, byly odpařeny na 100 μΐ, upraveny na pH 7,0 hydrogenuhličitanem amonným, dokonale štěpeny 2% TPCK-zpracovaným trypsinem (Wořthington) po 18 hodin při 37 stupních. Produkt tryptického štěpení byl pak podroben HPLC s reverzní fází, jak je popsáno výše. Byla sledována optická hustota jak při 280, tak 214 nm. Dobře oddělené píky byly odpařeny téměř dosucha a podrobeny přímo N-terminální aminokyselinové sekvenční analýze (59) za použiti Applied Biosystems Model 480Ab sekvenátoru v plynné fázi. Získané sekvence jsou v tabulkách 2 a 3 podtrženy. Jak je zde uvedeno výše, byly dva z těchto tryptických fragmentů zvoleny pro syntézu oligonukleotidových sond. Ze sekvence Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lys byly připraveny (aminokyseliny 46 až 52 v tabulkách 2 a 3)
17mer 32násobné degenerace TTCCANGCGTAGAAGTT a 18 mer 128násobné degenerace CCANGCGTAGAAGTTNAC.
Ze sekvence Val-Tyr-Ser-ASn-Phe-Leu-Arg (aminokyseliny 144 až 150 v tabulkách 2 a 3) byly připraveny dva pooly 14merů, každý 32násobné degenerován
TACACCTAACTTCCT a TACACCTAACTTCTT, které se liší v první poloze připraveného leucinového kodonu. Oligonukleotidy jsou značeny na 5-konec konci pomoci 32P použitím polynukleotid-kinázy (New England Biolabs) a gamma 32P-ATP (New England Nuclear). Specifická aktivita oligonukleotidů se měnila mezi 1000 a 3000 Ci/mmol oligonukleotidů. Lidská genomická DNA knihovna v bakteriofágu lambda (Laen a spol., 22) byla screenována za použití modifikace in sítu amplifikačního postupu, původně popsaného Woo-em a spol. (47) (1978). Přibližně 3,5 x 105 fágů bylo umístěno v hustotě 6000 fágů na 150 mm Petriho misku (NZCYM médium) a inkubováno při 37 stupních do viditelných plaků, které
-13CZ 281756 B6 jsou však malé (přibližně 0,5 mm). Po 1 hodině chlazení při 4 stupních byly duplikátové kopie vzorků plaků přeneseny na nylonové membrány (New England Nuclear) a inkubovány přes noc při 37 stupních na čerstvých NZCYM plotnách. Filtry pak byly denaturovány a neutralizovány 10minutovým pobytem po 10 min na tenkém filmu 0,5N NaOH - 1M NaCl a 0,5M Tris (pH 8) - 1M NaCl. Po vakuovém sušeni při 80 stupních po 2 hodiny byly filtry promyty v 5 x SSC, 0,5% SDS po 1 h a buněčné zlomky na povrchu filtru byly odstraněny mírným škrabáním vlhkou tkaninou. Toto škrabání redukuje podstatnou vazbu sondy k filtrům. Filtry pak byly promyty vodou a prehybridizovány po 4 až 8 hodin při 48 stupních ve 3M tetramethylamoniumchloridu, 10 mM NaPO4 (pH 6,8), 5 x Denhardtově roztoku, 0,5% SDS a 10 mM EDTA. 32P značený 17mer byl pak přidán v koncentraci 0,1 pmol/ml a hybridizace byla provedena při 48 stupních po 72 h. Po hybridizaci byly filtry intenzivně promyty 2 x SSC (0,3M NaCl - 0,03M Na-citrát, pH 7) při teplotě místnosti a pak 1 h ve 3M TMAC1 - 10 mm NaPO4 (pH 6,8) při teplotě místnosti a od 5 do 15 min při hybridizační teplotě. Přibližně 120silných duplikátových signálů bylo detegováno 2 dny po autoradiografii za intenzifikačního screeningu. Pozitiva byla vybrána, shromážděna po 8 a znovu třikrát rescreenována za použití jedné poloviny 14merového poolu na každém ze dvou filtrů a 127meru na třetím filtru. Podmínky a 17mer pro umístění na plotnu jsou popsány výše s výjimkou, že hybridizace pro 14mer byla při 37 stupních. Po autoradiografii byly sondy odstraněny ze 17merového filtru v 50% formamidu po 20 min při teplotě místnosti a filtr byl rehybridizován při 52 stupních s ISmerovou sondou. Dva nezávislé fágy hybridizuji ke všem třem sondám. DNA z jednoho z těchto fágů (zde označen lambda HEPO1) byla dokonale štěpena pomocí Sau3A a subklonována do M13 pro DNA sekvenční analýzu za použití dideoxy řetězec terminující metody podle Sangera a Coulsona, (23) (1977). Nukleotidová sekvence a odvozená aminokyselinová sekvence otevřeného čtecího rámečku, kódující pro EPO tryptický fragment (podtržená oblast), jsou zde popsány. Intronové sekvence jsou uvedeny malými písmeny, exonové sekvence (87nt) velkými písmeny. Sekvence, které souhlasí s místy akceptorového (a) a donorového (d) střihu, jsou podtrženy (viz tabulka 4).
Příklad 2
Northern analýza mRNA jater lidského plodu ug mRNA jater lidského plodu (připravené z jater 20týdenního lidského fetu) a mRNA jater dospělého člověka bylo elektroforezováno v 0,8% agarosovém formaldehydovém gelu a transferováno na nitrocelulózu za použití metody Dermana a spol., Cell, 23:731 (1981). Jednořetězcová sonda pak byla připravena z M13 templátu, obsahujícího inzert, ilustrovaný v tabulce 1. Primer byl 20mer, získaný ze stejného tryptického fragmentu, jako původní 17merová sonda. Sonda byla připravena, jak popsal Anderson a spol., PNAS, (50) (1984), s tím rozdílem, že následující štěpení pomocí Amal (které produkuje požadovanou sondu délky 95nt, obsahující 74nt kódující sekvence), malý fragment byl čištěn z ml3 templátu chromatografii na sloupci sepharózy C14B
-14CZ 281756 B6
Tabulka 4 agcttcEgggcttccagaccc.igctactttgcggaacEcagcancccaggcatctctgagtctccgcccaagacc gggat gccccccaggaggtgEecgcgagcccagccEttcccagnt agcagctccgccagtcccaagggtgcgcaa 150 ccggct gcactcccctcccgcgacccap.ggcccgggagcagcccccatgacccacacgcacgtctgcagcagccc cp.tcngccccggíigectcaacccaggcgtcctgcccctgcEctgrtccccgggtggcccctacccctggcgacccc 300 tcacgcacacagccectcccccaeccccacccgcgcacgcacacatgcagataacagccccgacccccggccaga RccgcagagtccctgggccarCCCGGCCCCTCGCTGCGCTGCGCCGCACCGCGCTGTCCTCCCGGAGCCCCACCG 450 GGCCCACCGCGCCCGCTCTCCTCCGACACCCCGCCCCCTCGACACCCCCCCTCTCCTCCACCCCCGTGGCGCTCC CCCTCCACCCCCCAGCTTCCCGGGATGACGGCCCCCGGTCTCGTCACCCCGCCCCCCCCAGGTCCCTGACGGACC 600 CCGCCCAGCCGCCGACATCGCGGTGCACGgtgngtactcgcgggctgggcgctcccgcccgcccgggtccctgtt
MctGlyValllisG tgagcggggatttagcgccccggctactggccaggaggtggctgggcccaaggaccggcgacttgtcaaggaccc 750 cggaagggggap,gggggtggggcagcCtccacgtgccagcggggacttgggggagEccEtggggatggcaaaaac ctgacctgtgaaggggacacageecgggggtccnggggaagaaggttcggggggcectgctgtgccagtggagag 900 gaagcEgaCaagctgataacctgggcgcCggagccaccncttatctgccagaggggaagcctcEgtcacaccagg attgaagtttggccggagaagtggatgctggtngcctgggggtggggEgtgcacacggcagcnggntEgaatgaa 1050 RCCcngggnggcagcaccEgagEgcttgcatggtEggggacaggaaggacgagctggggcagagacgEggggatg aaggaagctgtcctcccacagccacccEtcEccctccccgcctgactctcagcctggctatctgttctagAATCT 1200 CCTGCCTCGCTGTCGCTTCTCCTGTCCCTCCTGTCGCTCCCTCTCCCCCTCCCACTCCTCGCCCCCCCACCAC^C ProAlaTrpLeuTrpLcuLetiLeuSerLeuLcuSerLeuProLeuClyLeuProValLeuClyAlaProProArg C.TCATCTGTCACACCCGAGTCCTGCAGACCTACCTCrrCGACCCCAAGGAGCCCGACAATATCACGgtgBRnccc 1350 Leu 11cCysAapScrArgVaILeuGluArgTyrLeuLeuGluAlaLysCluAlnCluAsnl1eThr c ttccccngcncnttccacagaautcnrgctcagggc11 cngggonetect cccagacccaggaacctggcact E ggtctggggtggagtEgggaagctagacactgccccccCacataagaataegtctggrggccccaaaccatacet 1500 ggaaactaggcaaggagcaaagccagcagatcctacgccEgtggccagggccagagccttcagggacccEtgact ccccgggctgtgtgcatttcagACGGCCTGTGCTCAACACTGCACCTTGAATGAGAATATCACTGTCCCAGACAC 1650 ThrGlyCysAlaGluHíflCyeScrLeuAsnGLuAsnIleThrValProAspTh CAAAGTTAATTTCTATCCCTGGAAGAGCATGCACg tgngCtcctttttEEttttttttcctttcttttggagaat rLysValAanPheTyrAlaTrpLysArgMecGLu ctcattEgcgagccEgaEEEEggatgaaagggagaaEgatcgngggaaaggtaaaaEggagcagcagagatgagg 1800 ctgcctgggcgcagaggcEcacgtctacaatcccaggctgngatggccgagatgggagaattgcttgagccctgg agCttcagaccaacccaggcagcaeagtgagatcccccatcCctacaaacatttaaaaaaattagtcaggtgaag 1950 tggtgcntggtggtagtcccagatnttcggaaggctgaggcgggaggatcgcttgagcccaggaatttgaggctg cagtgagctgtgatcncaccactgcactccagcctcagtgacagagtgaggccctgtctcaaaaaagaaangaaa 2100 aaagaaaaataatgagggctgtatggnatacgt tcar tat tcattcactcactcactcactcaCtcattcattca ttcattcaacaagtcttactgcat.iccttctgtttgctcagcttggtgcttggggctgctgaggggcaggaggga 2250
-15CZ 281756 B6
Tabulka 4 (pokračování) gagggtgacatccctcagctgacCcccagagtccactccctgCagCTCCGCCAGCAGGCCCTACAACTCTGCCAC
ValGlyGlnGlnAlaValCluValTrpCln (CCCCTCGCCCTCCTGTCCGAAGCTGTCCTGCCGGGCCAGGCCCTGTTGGTCAACTCTTCCCAGCCGTGCGACCCC 2400 GlyLeuAlaLcuLeuSerG LuAlaValLeuArgClyGlnAlaLeuLeuValAanSerSerClnProTrpGluPro CTGCAGCTGCATCTCCATAAACCCGTCAGTGGCCTTCGCAGCCTCACCACTCTCCTTCCGGCTCTGGGACCCCAG LeuGlnLeuIl IsValAspLysAlaValSerClyLeuArgSerLeuThrThrLeuLeuArgAlaLeuGlyAlaGln c ··«««* gtgagtaggagcggacacttctgcttgccctCCctgtaagaaggggagaagggtcttgctaoggagtacaggaac 2550 tgtccgtattccttccctttctgtggcactgcagcgacctcctgtcctccccctggcagAACCAAGCCATCTCCC LysGlyAlalleSerP OTCCAGATGCGGCCTCACCTGCTCCACTCCGAACAATCACTGCTGACACTTTCCCCAAACTCTTCCGACTCTACT roProAspAlaAlaSerAlaAlaProLeuArgThrlleThrAlaAspThrPheArgLysLeuPheArgValTyrS CCAATTTCCTCCCCGGAAACCTGAAGCTGTACACAGCGGACCCCTCCAGGACAGCCGACACATCACCACGTGTGT erAsnPheLeuArgClyLysLeuLysLcuTyrThrClyGluAlaCysArgThrGlyAepArg
CCACCTCGCCATATCCACCACCTCCCTCACCAACATTCCTTCTCCCACACCCTCCCCCGCCACTCCTGAACCCCG
2700
2850
TCCACCCGCTCTCAGCTCACCCCCAGCCTCTCCCATCGACACTCCACTCCCACCAATGACATCTCACGCCCCAGA
CGAACTCTCCACAGACCAACTCTGAGATCTAAGGATCTCACAGCGCCAACTTGAGGGCCCAGACCAGCAAGCATT 3000 cagagagcacctttaaactcacggacagacc.catgctcgcaacacccctcagctcactcgccaccctccaaaatt
TGATCCCAGGACACCCTrTGGACGCCATTTACCTCTTrTCGCACCTACCATCACGGACACGATGACCTCGAGAAC 3150 ··*····
TTAGGTCCCAACCTGTGACTTCTCCAGCTCTCACGGGCATCGCCACTCCCTTCCTCCCAACAGCCCCCTTGACAC CCCCGTCGTGCCAACCATCAAGACAGCATCGCCGCTGCCCTCTCGCTCTCATGCGCTCCAACTTTTCTCTATTCT 3300 • · · a · « - *
TCAACCTCATTCACAAGAACTCAAACCACCaataCgactcttggctttcctgttttctgggaacctccaaatccc ctggctctgtcccactcctggcagca 3400 v 0 1N NaOH-O,2M NaCl. Filtr byl hybridizován k přibližně 5x10 cpm této sondy po 12 hodin při 68 stupních, promyt ve 2 x SSC pri stupních a vystaven 8 dnů intenzivnímu screeningu. Jediná markerová mRNA o 1200 nt (označeno šipkou) probíhala v sousední draze (obr. 1).
-16CZ 281756 B6
Příklad 3 cDNA z jater plodu
Byla připravena sonda shodná se sondou, popsanou v příkladu a byla použita ke screeningu cDNA knihovny jater plodu, při(Toole a spol., Nátuře, (25) (Benton Davis, Tři nezávislé pozitivní klony
2, pravené ve vektoru lambda-Ch21A (1984) za použití standardního screeningového Science, (54) (1978)) postupu.
(označené zde lambda-HEP0FL6 (1350 bp), lambda-HEPOFLS (700 bp) a lambda-HEPOFL3 (1400 bp) byly izolovány po screeningu 1 χ 106 plaků. Celý inzert lambda-HEPOFL13 a lambda-HEPOFL6 byly sekvenovány po subklonování do M13. (Tabulka 7 a 5). Pouze části lambda-HEPOFL8 byly sekvenovány a zbytek byl považován za shodný s ostatními dvěma klony (tabulka 6). 5-konec a 3-konec netranslatované sekvence jsou uváděny malými písmeny. Kódující oblast je zapsána písmeny velkými.
V tabulkách 2 a 3 je dedukovaná aminokyselinová sekvence uvedena pod nukleotidovou sekvencí a je číslována tak, že číslo 1 platí pro první aminokyselinu maturovaného proteinu. Předpokládaný vedoucí peptid (leader peptid) je označen zápisem celých zkratek pro zápis aminokyselin. Cysteinové zbytky ve zralém proteinu jsou dále označeny SH a potenciální N-napojená glykosylačni místa hvězdičkou. Aminokyseliny, které jsou podtrženy, označuji ty zbytky, identifikované N-terminálním proteinovým sekvenováním nebo sekvenováním tryptických fragmentů EPO, jak je popsáno v
-17CZ 281756 B6
Tabulka 5 gacaggaag gacgagctgg gacagagacg Cggggacgae
LU CTS P10 ggaagetgtc cttccacage cacccctctc ccccccegcc cgactetcag ectggecace tgecetagAA TCT CCT
| • AU | TIP | tEB | TIP | LED | LEU | LEU | SE1 | LEU | LEU | SE1 | LEU | ΡΙ0 | LEU | CLT | LEU | PSO | VAL | LEU | CLT |
| ccc | TCC | CTC | TCC | CTT | CTC | CTC | TCC | CTC | CTC | TCC | CTC | CCT | CTC | CCC | CTC | CCA | CTC | CTC | CCC |
| 1 | SH | 10 | 20 | ||||||||||||||||
| Ala | Pro | Pro | Arg | Leu | 11« | Cys | Aap | Ser | Arg | Val | Leu | Clu | Arg | Tyr | Leu | Leu | Clu | Ala | Lya |
| CCC | CCA | CCA | CCC | CTC | ATC | TCT | CAC | ACC | CCA | CTC | CTC | CAC . | ACC | TAC | CTC | TTC | CAC | CCC | AAC |
| • | SH | 30 | SH | a | 40 | ||||||||||||||
| Clu | Ala | Clu | Aan | 11« | Thr | Thr | Cly | Cy« | Ala | Clu | Kle | Cy· | Ser | Leu | Aan | Clu | Aan | 11« | Thr |
| CAG | CCC | CAC | AAT | ATC | ACC | ACC | CCC | TCT | CCT | CAA | CAC | TCC | ACC | TTC | AAT | CAC | AAT | ATC | ACT |
| 30 | 40 | ||||||||||||||||||
| Val | Pro | Aap | Thr | Lya | Val | Aan | Phe | Tyr | Ala | Trp | Lya | Arg | Kec | Clu | Val | cly | Cla | Cla | Ala |
| CTC | CCA | CAC | ACC | AAA | CTT | AAT | TTC | TAT | CCC | TCC | AAC | ACC | ATC | CAC | CTC | CCC | CAC | CAC | CCC |
| 70 | «0 | ||||||||||||||||||
| Val | Clu | Val | Trp | Cln | cir | Leu | Ala | Leu | Leu | Ser | Clu | Ala | Val | Leu | Arg | Cly | Cln | Ala | Leu |
| CTA | CAA | CTC | TCC | CAS | ccc | CTC | CCC | CTC | CTC | TCC | CAA | CCT | CTC. | CTC | CCC | CCC | CAC | CCC | CTC |
| a | 90 | 100 | |||||||||||||||||
| Leu | Val | Aan | Ser | Sar | Cln | Pro | Trp | Clu | Pro | Leu | Cla | Leu | Hla | Val | Aap | Lya | Ala | Val | Ser |
| TTC | CTC | AAC | TCT | TCC | CAC | CCC | TCC | CAC | CCC | CTC | CAC | CTC | CAT | CTC | CAT | AAA | CCC | CTC | ACT |
| 110 | 120 | ||||||||||||||||||
| Cly | u« | Arg | Ser | Uu | Thr | Thr | Leu | Leu | Arg | Ala | Leu | Cly | Ala | Cln | Lya | Clu | Ala | 11a | Ser |
| CCC | CTT | CCC | ACC | CTC | ACC | ACT | CTC | CTT | CCC | CCT | CTC | CGA | CCC | CAC | AAC | CAA | CCC | ATC | TCC |
| 130 | 140 | ||||||||||||||||||
| Pro | Pro | *·? | Ala | Ala | Ser | Ala | Ala | Pro | Leu | Arg | Thr | Ile | Thr | Ala | Aap | Thr | Phe | Arg | Lya |
| CCT | CCA | CAT | CCC | CCC • | TCA | CCT | CCT | CCA | CTC | CCA | ACA | ATC | ACT | CCT | CAC | ACT | TTC | CCC | AAA |
| Leu Phe Arg CTC TTC CCA | Val Tvr Ser CTC TÁC TCC | Aan Phe Leu AAT TTC CTC | 150 Arg Cly Lya CCC CCA AAC | Leu Lye Leu CTG AAC CVC | Tyr Thr Cly TAC ACA CGC | 160 Clu Ala CAC CCC |
| SH Cya Arg Thr TCC ACC ACA | 166 Cly Aap Arg CCC CAC AGA | TCA ccaggtg | tgcceacctg - | ggcacatcca | ccacctccct | caccaacate |
| gcctgcgcca | eaccetccce | cgccactccc | g-itccccgCc | ťCMXCtct | cagctcagcg | ccageccgte |
| ccacggacac | tccagtgcca | gcaatgacac | cteaggggcc | agaggaaetg | tccagagagc | aactctgaga |
| tctaaggacg | ccacagggee | aacttgaggg | eteagageag | gaagcactca | g.igagcagct | ttaaactcag |
| ggacagagcc | atgctgggaa | garfcctgag | ctcactcggc | aceetgeaaa | atttgatgcc | aggacacgct |
| ttSC>UC*· | tttacctgct | ctcgcaccca | ccaceeggg* | eaggatgacc | tggagaactt | aggtggcaag |
| ctgtgacttc | tccaggtctc | acgggcatgg | gcactccctt | Ε6««=··»Μ | gcccecttga | caceggggtg |
| Stg«aac«a | tgaagacagg | gectctggct | eccacggggc | ccaagttttg | tgtactcttc | |
| aacctcattg | acaageaclg | aaaccaccaa |
Tabulka 6 ccctggacag ccgccctctc ctccaggccc gtggggctgg ccctgcaccg ccgagctccc cgggatgaggg cccccggtgt
| O | w | X CJ | a o | fe H | a | |||
| ac | CJ | -J CJ | O | O X CJ | o | M | ||
| Ae | CJ | CJ CJ | CM | -4 5 | *T H < | Ό | < | |
| ca | H | X CJ | a CJ | a o | G | |||
| > | CJ | Μ H | * CJ | ·“< ř- | ||||
| CJ | H | •4 CJ | < CJ | *- < | CJ | |||
| 3 | < | U CJ | 3 CJ | C H | c | |||
| U | < H | « a < | ||||||
| CJ | CJ | > CJ | CJ CJ | < 3 | CJ | |||
| ca | CJ | O < | 3 O | 3 CJ | X | |||
| M | < | X CJ | « H | •M ·< | ||||
| X | CJ | Ae CJ | -J H | CJ CJ | CJ | |||
| 3 | CJ | X CJ | 3 CJ | G H | rM | |||
| H | Ui H | « H | a | a | ||||
| > | CJ | U CJ | U | > | ||||
| CJ | X CJ | fe CJ | 3 CJ | 3 | ||||
| •J | CJ | eU CJ | X< | « K | ||||
| CJ | CJ | CJ CJ | Η H | U H | CJ | |||
| > | h | CJ | a cj | 00 CJ | fe CJ | 44 | ||
| ca | H | CU H | fe CJ | O CJ | a | |||
| 1 | X | U CJ | < < | ca < | X | |||
| O H | 3 O | 9 CJ | oo | |||||
| 00 | OS CJ | *·* < | X XCJ | fe | ||||
| a 00 | A. CJ | CJ CJ | ca cj w | < | ||||
| 00 y | a cj | 3 CJ | « cj | a | ||||
| o0 | ca H | a H | nM < | x | ||||
| u 00 | -a cj | -I CJ | X CJ | •J | ||||
| 00 4 | atí cj Q cj | p-í CJ | 3 < | a> | ||||
| 4 W | «-Μ < | fe | ||||||
| ca w | > CJ | CJ CJ | H | |||||
| O | ||||||||
| u | a cj | oo< | O H | a | ||||
| 00 | M H | O | fe CJ | O CJ | o | |||
| 00 | U CJ | M | < CJ | m < cj | <A | < | ||
| u | ||||||||
| u | ||||||||
| u | Bg | fe CJ | a H | fe | ||||
| u | » CJ | X XCJ | X | |||||
| «V 00 | CJ | ca < | <a cj H | H | ||||
| S 8 | CUCJ a < | « X | ||||||
| oo M | ca w | < CJ | CJ CJ | 0« | ||||
| w 4 | ||||||||
| oo | Bg | • H | fe CJ | a | ||||
| w | s | XCJ | X CJ | |||||
| u | U CJ | ca | CJ H | H < | ||||
| u | ||||||||
| 4J | a cj | ® CJ | M CJ | ^4 | ||||
| 00 | ca h | X O | a | |||||
| ^4 CJ | * < | H < | r> | |||||
| 00 | a r | 3 CJ | a cj | a | ||||
| a | ca w | V H | •M H | X | ||||
| u | •J CJ | U CJ | w « | u | ||||
| u | ||||||||
| u | ||||||||
| u | S?8 | eocj | C f-> | w | ||||
| 00 | M CJ | « « < | e | |||||
| u | Η H | < CJ | < < | |||||
| 00 | ||||||||
| Q | a cj | o < | 3 CJ | |||||
| ια h | u CJ | *M < | a | |||||
| -4 CJ | As CJ | CJ CJ | < | |||||
| 00 | ||||||||
| u | Cfe CJ | O < | fS CJ | o | ||||
| u | ac o | fe CJ | ~ CJ | |||||
| o | K H | Ae <J | < CJ | Ae | ||||
| M | ||||||||
| u | ||||||||
| w | *1 <-> | a cj | 3 CJ | |||||
| 00 | -4 CJ | CJ | —* «< | a | ||||
| OQ | < CJ | < CJ | CJ CJ | > |
| CJ | 3 CJ | o | u H | O | u | CJ | o a | |
| CJ | a o h- | o | O CJ | ť»4 | □ | CJ | X | |
| CJ | X U CJ | ca *c | Vi | H | «α | |||
| CJ | a cj | O | 0 | CJ | oo | CJ | ||
| < | -M CJ | a e- | ř- | u | Cj | |||
| CJ | < a | > CJ | X | < | < | CJ | ||
| CJ | e cj | a cj | c | CJ | a | CJ | ||
| *5 | < | CJ | CJ | JS | u* | |||
| CJ | CJ CJ | < CJ | < | CJ | A« | H | ||
| CJ | XCJ | 3 | 3 | < | u | H | ||
| CJ | -4 CJ | X < | < | X | Cj | |||
| CJ | CJ CJ | u < | CJ | CJ | H | < | ||
| CJ | aecj | • | CJ | &CJ | ||||
| H | M CJ | a < | X | < | a | < | ||
| CJ | < CJ | < O | u | •c | < | CJ | ||
| CJ | 3 CJ | *-4 Q | G | CJ | a | H | ||
| < | a H | a h | a | CJ | ||||
| CJ | *4 CJ | > CJ | CJ | CJ | < | CJ | ||
| C5 | 4 CJ | « H | a | CJ | u | H | ||
| H | a H | ** < | CJ | X | O | |||
| < | > u | X CJ | < | CJ | H | < | ||
| CJ | a h | 3 CJ | x< | a | CJ | |||
| CJ | rf | a H | CJ | 0H | H | |||
| «< | 3 Q | U CJ | CJ | CJ | W | |||
| CJ | 3 3 | * | A CJ | 3 | CJ | fe | <C | |
| < | —4 < | RM < | a | H | X | CJ | ||
| < | CJ C3 | CJ Q | «4 | CJ | W | < | ||
| CJ | U CJ | 5 CJ | a | H | 00 < | |||
| CJ | a cj | a H | M | O | fe | CJ | ||
| H | ca é* | 4 CJ | 3 | CJ | < | CJ | ||
| CJ | Λ 3 CJ | 0 CJ | O | Q0CJ | O 3 | CJ | ||
| CJ | o a | o | M CJ | u | CJ | <n a | ||
| CJ | ř- 4 O | cn | A· CJ | < | CJ | -* «4 | CJ | |
| H | 3 P | 3 CJ | 3 | O | ||||
| < | a H | a | P | fe | u | |||
| H | U CJ | C3 CJ | CJ | Ae | CJ | |||
| CJ | a cj | au | 5 | CJ | a | H | ||
| H | *“< CJ | M CJ | a | H | CJ | |||
| H | << CJ | H é* | U | CJ | CJ | |||
| 3 9 | O C3 . | H | a | H | ||||
| a Η» | U CJ | X | CJ | CJ | ||||
| < | *4 CJ | A« CJ | H | < | < | CJ | ||
| H | C CJ | M | CJ | fe | ||||
| H | —» CJ | ·< | X | CJ | a | CJ | ||
| CJ | CJ CJ | CJ CJ | P | < | ca | H | ||
| r cj | M CJ | 3 | CJ | a | CJ | |||
| —4 < | a cj | a | H | CJ | ||||
| CJ CJ | V) H | -j | CJ | < | CJ | |||
| CJ | OtoCJ | u ř-> , | M | CJ | a | CJ | ||
| CJ | u Cj | a cj | Cl | CJ | CJ | |||
| < | Η H | W H | ca | < | < | CJ | ||
| o | -4 CJ | e ω | MCJ | cu | H | |||
| < | a | « | a < | ks | CJ | a | < | |
| CJ | > CJ | < «ί | < | u | < | CJ | ||
| < CJ | -4 CJ a Η» | 3 a | £ | o u | x! CJ | |||
| CJ | CJ U | > CJ | «4 | CJ | Ae | CJ | ||
| CJ | *4 < | 5 CJ | X CJ | O | ||||
| H· | <S F- | a h· | CJ | fe | ||||
| CJ | > CJ | H | CJ | CJ | A« | CJ |
CJ
O CJ
CJ
Tabulka 7
| CCCggagCC | ggaccggggc | caecgcgccc | *etct*cccc* | acaccgcgce |
| ccccggacag ccgccccctc ctccaggece gtggggctgg | ecctgcaccg | ccgagcttcc | C€M«ta*CU | cccccggcgC |
| MET | CLT | VAL | BtS | GLU | crs | no | ||||||||||
| **tcaccc*( c*c*cccca* | *Cc*ct*a** | *aCCCC**CC | •Učte* | •1 | ATC | CGG | CTC | CAC | CAA ▲ | TCT | CCT | |||||
| ALA | TRP LEU TRP LEU | LEU | LEU | SE* | LEU | LED | SE* | LEU | PRO | LEU | CLT | LEU | PRO | VAL | LEU | CLT |
| ccc | TCC CTG TGC CTT | CTC | CTG | TCC | CTG | CTG | TCG | CTC | ccr | CTG | CCC | CTC | CCA | CTC | CTG | CGC |
| 1 | Sl | 10 | 20 | |||||||||||||||
| Ala | Pra | Pro | Ar* | Uu | 11« Cy. | Aap | Ser | Ar* | Val | Lea | Glu | Arj | Tyr | Leu | Leu | Clu | Ala | Ly. |
| GCC | CCA | CCA | CGC | CTC | ATC TGT | GAC | AGC | CGA | CTC | CTG | GAG | AGG | TAC | CTC | ttg | GAG | GCC | AAG |
| a | » | 30 | SB | o | «0 | |||||||||||||
| Clu | Ala | Glu | A.n | 11· | ThrThr | Clx. | Cy. | Ala | Glu | Kla | Cy. | Ser | Leu | Aau | Clu | Aae | Ila | Thr |
| CAC | GCC | GAC | ΑΛΤ | ATC | AGC^aCC | ccc | TCT | CCT | GAA | CAC | TGC | ACC | TTG | AAX | GAC | AAT | ATC | ACT |
| 30 | 60 | |||||||||||||||||
| Val | Pra | Aap | TUr | Ly· | Val Aan | Phe | Tvr | Ala | Trp | ty· | Ar* | Mac | Clu | Val | Cly | Cln | Cln | Ala |
| CTC | CCA | ACC | AAA | CTT ΑΛΤ | TTC | TAX | GCC | TCG | AAC | AGC | ATG | GAG .CTC | GCC | CAC | CAC | GCC | ||
| Glý Leu | 70 | 80 | ||||||||||||||||
| Val | Glu | Val | Trp | Cln | Ala | Leu | Leu | Ser | Clu | Ala | Val | Lau | Ar* | Cly | Cln | Ala | Leu | |
| CTA | GAA | CTC | TGC | CAC | GCC CTC | GCC | CTG | CTG | TCC | GAA | GCT | CTC | CTG | CGG | GCC | CAG | CCC | CTC |
| o | M | 100 | ||||||||||||||||
| Lea | -6<<L_5*£- | Í£I | Cln Pro | Tra | Clu | Pro | JáBL. | Cln | -L«t- | Hl« | Va? | ASE | -Li». | Ala | Val | Ser | ||
| TTC | CTC | AAC | TCT | TCC | CAC CCC | TCG | GAC | CCC | CTG | CAC | CTG | CAT | GTC | GAT | AAA | CCC | CTC | ACT |
| no | 120 | |||||||||||||||||
| Cly | Leu | Ar* | Ser | Leu | Thr Thr | Lea | Lea | Ar* | Ala | Leu | ciy | Ala | Cla | Ly. | Clu | Ala | Ile | Ser |
| CCC | CTT | CCC | ACC | CTC | ACC ACT | CTC | CTT | CGG | CCT | CTG | CGA | GCC | CACj^AAC | GAA | CCC | ATC | TCC | |
| 130 | 140 | |||||||||||||||||
| Pro | Pro | Aap | Ala | Ala | Ser Ala | Ala | Pro | Leu | Arg | Thr | 11. | Thr | Ala | *»P | Thr | Phe | Arp | Ly. |
| CCT | CCA | GAT | GCC | GCC | TCA GCT | ccr | CCA | CTC | CCA | ACA | ATC | ACT | CCT | GAG | ACT | TTC | CGC | AAA |
| Leu Phe Ar. | »el Tyr Ser | Aaa Phe Leu | 150 Ar* Cly Lya | Leu Ly. Leu CTG AAC CTG | Tyr Thr Cly | 160 Clu Ala |
| CTC TTC CGA | GTC TAC TCC | AAT TTC CTC | CGC CCA AAC | TAC ACA GGG | GAG GCC | |
| SK Cy. Ar* Thr TLC ACZ! ACA | 16« Cly Aap Ar* CGC GAC ACA | TCA cca**C* | c*eccacct* | **cataccca | ccacctcccc | caccaacacc |
| *ctt*c*cca | eacceteccc | cgccaccccc | *aacccc*tc | (•CXXXCtct | ca*ctea*e* | ccagcccgtc |
| ccat**acae | tcca*tgcca | *eaac*acac | cec«ms«c | *8*88“«et« | teca*a*a*c | aactct*a*a |
| tccaa**at* | tcacag**cc | aa<-t*a*** | ceca*a*ca* | *aa*cactc. | pa*a*ca*ec | tcaaactca* |
| **aca*a*cc | C*ctuZ«a | *ac*ect*a* | ctcacce**c | accctfcaaa | attt*ac*cc | a**ac.ac(ct |
| ttu*UC(a | tttacct*cc | ctcgcaccca | ceaccaggga | ea**ac*acc | tggagaactc | •ITU'“* |
| ct*t*ectte | tcca**tcce | ae***cac** | geactccctt | W*8<e«M· | *ccccctr*a | caccg***t* |
| 8ttM«acea | tcaafaca** | •tUU*ct* | *cctct**ct | ctcat****c | ccaagcrtc* | tgcatcctec |
| aacctc.ct* | acaa*aact* | aaaccaecaa |
příkladu 1. Částečné podtržení označuje zbytky v aminokyselinové sekvenci určitých tryptických fragmentů, které nemohly být stanoveny jednoznačně. cDNA klony lambda-HEP0FL8 a lambda-HEP0FL13 byly screenovány, uloženy a jsou dostupné z Američan Type Culture Collection, Rockville, Maryland pod přírůstkovým číslem ATCC 40156, ATCC 40152 a ATCC 40153.
Příklad 4
Genomická struktura EPO genu
Relativní velikosti a polohy čtyř nezávislých genomických klonů (lambda-HEPOl, 2, 3 a 6) z knihovny Haelll/Alul jsou ilustrovány překrývajícími se čarami na obr. 3. Silná čára označuje polohu EPO genu. Je uvedena stupnice (v kb) a polohy známých míst štěpení restrikční endonukleázou. Oblast, obsahující EPO gen, byla kompletně sekvenována z obou řetězců za použití řízené série delecí v této oblasti. Schematické znázornění pěti exonů, kódujících EPO mRNA, je uvedeno na obr. 4. Přesná 5-koncová vazba exonu I je v současnosti neznámá. Protein kódující podíly exonů jsou tmavší. Kompletní nukleotidová sekvence oblasti je uvedena v tabulce 4. Známé hranice každého exonu jsou označeny pomocí silných vertikálních čar. Genomické klony lambda-HEPOl, lambda-HEPO2, lambda-HEPO3 a lambda-HEPO6 byly uloženy a jsou dostupné z Američan Type Culture Collection, Rockville, Maryland pod přírůstkovým číslem ATCC 40154, ATCC 40155 a ARCC 40150 a ATCC 40151.
Příklad 5
Konstrukce vektoru p91023(b)
Transformačním vektorem byl pAdD26SVpA(3), popsaný Kaufmanem a spol., Mol.Cell Biol., 2:1304 (1982). Struktura tohoto vektoru je uvedena na obr. 5A. Stručné, tento plasmid obsahuje gen cDNA myší dihydrofolát reduktázy (DFHR), který je pod transkripční kontrolou adenovirus 2 (Ad2) hlavního pozdního promotoru. 5-konec střihové místo je indikováno v adenovirové DNA a 3-konec střihové místo, odvozené od imunoglobulinového genu, je přítomno mezi Ad2 hlavním pozdním promotorem a DFHR kódující sekvencí. SV40 časné polyadenylační místo je přítomno za DHFR kódující sekvencí. Prokaryoticky odvozená sekce pAdD26SVpA(3) je z pSVOd (Mellon a spol., Cell, 27:279 (1981)) a neobsahuje pBR322 sekvence, o nichž je známé, že inhibují replikaci v savčích buňkách (Lusky a spol., Nátuře, 293:79 (1981)).
pAdD26SVpA(3) byl převeden na plasmid pCVSVL2, jak je ilustrováno na obr. 5A. pAdD26SVpA(3) byl převeden na plasmid pAdD26SVpA(3) (d) delecí jednoho ze dvou Pstl míst v pAdD26SVpA(3). Toto bylo provedeno parciálním štěpením pomocí Pstl za použiti deficitu enzymu tak, aby byla získána subpopulace linearizovaných plasmidů, ve kterých bylo štěpeno pouze jedno Pstl místo, s následujícím zpracováním Klenowem, ligací pro recirkulaci a screeningem na delecí Pstl místa umístěného 3-konec k SV40 polyadenylační sekvenci.
-21CZ 281756 B6
Adenovirový trojdílný leader a s virem spojené geny (VA geny) byly inzertovány do pAdD26SVpA(3) (d), jak je ilustrováno na obr. 5A. Nejprve byl pAdD26SVpA(3) (d) štěpen pomocí PvuII pro získání lineární molekuly otevřené ve 3-konec části tří elementů, tvořících trojdílný leader. Potom byl pJAW 43 (Zain a spol., Cell, 16:851 (1979)) zpracován s Klenowem, štěpen pomocí PvuII a 140bp fragment, obsahující druhou část třetího leaderu, byl izolován elektroforézou na akrylamidovém gelu (6% ve Tris borátovém pufru; Maniatis a spol., supra). 140bp fragment byl pak ligován do PvuII štěpeného pAdD26SVpA(3) (d). Ligační produkt byl použit ke transformaci E.coli na tetracyklinovou rezistenci a kolonie byly screenovány za použití Grunstein-Hognessova postupu za použití 32P značené sondy, hybridizujicí ke 140 bp fragmentu. DNA byla připravena z pozitivně hybridizujících kolonií pro test, zda PvuII rekonstruované místo bylo 5-konec nebo 3-konec inzertované 140bp DNA, specifické ke druhému a třetímu adenovirovému pozdnímu leaderu. Správná orientace PvuII místa je na 5-koncové straně 140bp inzertu. Tento plasmid je označen tTPL na obr. 5A.
Ava II D fragment SV40, obsahující SV40 enhancerovou sekvenci, byl získán štěpením SV40 DNA pomocí Ava II, zatupením konců Klenowým fragmentem pol I, ligací Xho 1 linkerů k fragmentům, štěpením s Xho 1 pro otevření Xho 1 místa a izolací čtvrtého největšího (D) fragmentu gelovou elektroforézou. Tento fragment byl pak ligován k Xho 1 štěpenému pTPL za vzniku plasmidu pCVSVL2-TPL. Orientace SV40 D fragmentu v pCVSVL2-TPL byla taková, že SV40 pozdní promotor byl ve stejné orientaci jako adenovirový hlavní pozdní promotor.
Pro zavedení s adenovirem spojených (VA) genů do pCVSVL2-TPL byl nejprve konstruován plasmid pBR322, který obsahuje adenovirus typ 2 Hind III B fragment. Adenovirus typ 2 DNA byl štěpen s Hind III a B fragment byl izolován gelovou elektroforézou. Tento fragment byl inzertován do pBR322, který byl předem štěpen pomocí Hind III. Po transformaci E.coli na ampicilinovou rezistenci, byly rekombinanty screenovány na inzerci Hind III B fragmentu a orientace inzertu byla stanovena štěpením restrikčním enzymem. pBR322-Ad Hind III B obsahuje adenovirus typ 2 Hind III B fragment v orientaci, znázorněné na obr. 5B.
Jak je ilustrováno na obr. 5B, jsou VA geny výhodně získány z plasmidu pBR322-Ad Hind III B štěpením s Hpa I, přídavkem EcoRI linkerů a štěpením pomoci EcoRI a následujícím odstraněním 1,4 kb fragmentu. Fragment, mající EcoRI lepivé konce, se pak liguje do EcoRI místa PTL, předem štěpeného s EcoRI. Po transformaci E.coli HB101 a selekci na tetracyklinovou rezistenci, byly kolonie screenovány filtrovou hybridizací k DNA, specifické pro VA geny. DNA byla připravena z pozitivně hybridizujících klonů a charakterizována štěpením restrikční endonukleázou. Výsledný plasmid je označen p91023.
Jak je ilustrováno na obr. 5C, byla dvě EcoRI místa v p91023 odstraněna úplným rozštěpením p91023 pomoci EcoRI za vzniku dvou DNA fragmentů, jeden asi 7kb a druhý asi l,3kb. Posledně uváděný fragment obsahuje VA geny. Konce obou fragmentů pak byly vzájemně k sobě ligovány. Plasmid p91023(A), obsahující VA geny a podobné p91023, ale s delecí dvou EcoRI míst, byly
-22CZ 281756 B6 identifikovány pomoci Grunstein-Hognessova screeningu s VA genovým fragmentem a běžnou analýzou restrikčnich míst.
Jediné Pstl místo v p91023(A) bylo odstraněno a nahrazeno EcoRI místem. p91023(a) byl úplně rozřezán pomocí Pstl a zpracován s Klenowým fragmentem Poli pro vytvoření vyrovnaných konců. EcoRI linkery byly ligovány k zatupenému Pstl místu p91023(A). Lineární p91023(A) s EcoRI linkery, připojenými k zatupenému Pst místu, byly odděleny od neligovaných linkerů a plně rozštěpeny pomocí EcoRI a religovány. Byl získán plasmid p91023(B), jak je znázorněn na obr. 5C, a byl identifikován jako mající strukturu, podobnou p91023(A), ale s EcoRI místem dřívějšího Pstl místa. Plasmid p91023(B) byl uložen a je dostupný z Američan Type Culture Collection, Rockville, Maryland pod přírůstkovým číslem ATCC 39754.
Příklad 6 cDNA klony (lambda-EP0FL6 a lambda-EP0FL13, příklad 3) byly inzertovány do plasmidu p91023(B) za vzniku PPTFL6 a PPTFL13. 8 ug každé z čištěných DNA bylo pak použito k transfektování 5 x 106 COS buněk za použití DEAE-dextranové metody (infra). Po 12 hodinách byly buňky promyty a zpracovávány s chloroquinem (0,1 mm) po 2 h, opět promyty a vystaveny 10 ml média, obsahujícího 10 % fetálního telecího sera po 24 hodin. Médium bylo zaměněno za 4 ml sera prostého média a sklizeno o 48 hodin později.
Produkce imunologicky aktivního EPO byla kvantifikována radioimunozkouškou, jak popsali Sherwood a Goldwasser (55). Protilátka byla poskytnuta Dr. Judth Sherwood. Jodovaný značkovač byl připraven z homogenního EPO, popsaného v příkladu 1. Citlivost zkoušky je přibližné 1 ng/ml. Výsledky jsou uvedeny dále v tabulce 8.
Tabulka 8
Vektor hladina EPO, uvolněného do média (ng/ml) pPTFL13 330 pPTFL6 31
PTFL13 byl uložen a je dostupný z Američan Type Culture Collection, Rockville, Maryland pod přírůstkovým číslem ATCC3990.
Příklad 7
EPO cDNA (lambda-HEPOFL13) byla inzertována do p91023(B) vektoru a byla transfektována do COS-1 buněk a sklizena, jak popsáno výše (příklad 6) s tím rozdílem, že bylo vypuštěno zpracování chloroguinem.
-23CZ 281756 B6
In vitro byl stanoven biologicky aktivní EPO pomocí zkoušky tvorby kolonií s buňkami jater myšího plodu jako zdroje CFU-E, nebo zkoušky příjmu 3H-thymidinu za použití buněk sleziny myší, kterým byla předem podána injekce fenylhydrazinu. Citlivosti těchto zkoušek jsou přibližně 25 mílijednotek/ml. In vivo byl biologicky aktivní EPO měřen použitím metod bud s hypoxickou myší, nebo vyhladovělou krysou. Citlivost těchto zkoušek je přibližně 100 milijednotek/ml. Nebyla detegována žádná aktivita u obou zkoušek ani v kontrolním pokusu. Výsledky EPO, exprimovaného klonem EPOFL13, jsou uvedeny dále v tabulce 9, kde uváděné aktivity jsou vyjádřeny v jednotkách/ml za použití komerčního kvantifikovaného EPO (Toyobo, Inc.) jako standardu.
Tabulka 9
EPO exprimovaný z COS buněk, transfektovaných EPO cDNA typ I
Zkouška
RIA
CFU-E 3H-Thy hypoxická myš vyhladovělá krysa aktivita
100 ng/ml
20,5 j./ml
3,1 1,8 j./ml
j./ml
j./ml
Příklad 8
Analýza EPO z COS buněk na polyakrylamidovém gelu
180 ng EPO, uvolněného do média COS buněk, transfektovaných EPO (lambda-HEPOFL13) cDNA ve vektoru 91023(B) (viz výše), bylo elektroforezováno na 10% SDS Laemli polyakrylamidovém gelu a elektrotransferováno na nitrocelulózový papír (Towbin a spol., Proč.Nati.Acad.Sci.USA 76:4350 (1979)). Filtr byl sondován s anti-EPO protilátkou, jak je popsána v tabulce 8, promyt a znovu prohledán pomocí 125I-staph A proteinem. Filtr byl zpracováván autoradiografií po dva dny. Nativní homogenní EPO, popsané v příkladu 1, buď před (dráha B) nebo po jodaci (dráha C) byly podrobeny elektroforéze (viz obr. 8). Použité markéry zahrnují 35S značený methionin, sérový albumin (68.000 d) a ovalbumin (45.000 d).
Příklad 9
Konstrukce RK1-4
Bam HI-PvuII fragment z plasmidu PSV2DHFR (Subramani a spol., Mol.Cell.Biol. 1:854-864 (1981)), obsahující oblast časného promotoru SV40, připojeného ke genu myší dihydrofolát reduktázy (DHFR), SV40 enhancer, malý intron t antigenu a SV40 polyadenylační sekvenci, byl izolován (fragment A). Zbývající fragmenty byly získány z vektoru p91023(B) (viz výše) následovně: p91023(A) byl štěpen pomocí Pst I v jediném Pst I místě, blízkém
-24CZ 281756 B6 adenovirovému promotoru pro linearizaci plasmidu a bud ligován k syntetickým Pst I až EcoRI konverterům a recirkulován (vytvoření míst Pst I - EcoRI - Pst I na původním Pst I místě; 91023(B’) nebo zpracován s velkým fragmentem DNA polymerázy I k rozrušení Pst I míst a ligován k syntetickému EcoRI linkeru a recirkularizován (vytvořením EcoRI místa na původním místě Pst I; 91023(B). Každý ze dvou výsledných fragmentů 91023(B) a 91023(B’) byl štěpen pomocí Xba a EcoRI za vzniku dvou fragmentů (F a G). Spojením F fragmentu z p91023(B) a fragmentu G z p91023(B') a fragmentu G z p91023(B) a fragmentu F z p91023(B') byly vytvořeny dva nové plasmidy, které obsahují budí EcoRI - Pst I místo nebo Pst I - EcoRI místo na původním Pst I místě. Plasmid, obsahující Pst I - EcoRI místo, kde Pst I místo je nejblíže adenovirovému hlavními pozdnímu promotoru, byl nazván p91O23(C).
Vektor p91023(C) byl kompletně štěpen pomocí Xhol a výsledná linearizovaná DNA s lepivými konci byla zatupena reakcí zaplnění konců s velkým fragmentem E.coli z DNA polymerázy I. K této DNA byl ligován 340 bp Hind III EcoRI fragment, obsahující SV40 enhancer, připravený následovně:
Hind III - Pvu II fragment ze SV40, který obsahuje SV40 počátek replikace a enhancer, byl inzertován do plasmidu c lac (Little a spol., Mol.Biol.Med. 1:473-488 (1983)). c lac vektor byl připraven štěpením c lac DNA pomocí BamHI, zaplněním na lepivých koncích velkým fragmentem DNA polymerázy I a štěpením DNA pomocí Hind III. Výsledný plasmid (c SVHPlaC) regeneroval BamHI místo při ligaci k Pvu II tupému konci. Fragment EcoRI-Hind III byl připraven z c SVHPlac a ligován k EcoRI-Hind III fragmentu pSVOd (Mellon a spol., supra), který obsahuje plasmidový počátek replikace a byl selektován výsledný plasmid PSVHPOd. Pak byl připraven 340 bp EcoRI-Hind III fragment z PSVHPOd, obsahující SV40 počátek/enhancer, zatupen na obou koncích pomocí velkého fragmentu DNA polymerázy I a ligován k Xhol štěpenému, zatupenému p91023(c) vektoru, popsanému výše. Výsledný plasmid (p91023(C)/Xho/zatupený plus EcoRI/Hind III/zatupený SV40 počátek plus enhancer), ve kterém byla orientace Hind III - EcoRI fragmentu taková, že BamHI místo v tomto fragmentu bylo co nejblíže VA genu, byl označen pES105. Plasmid Pesl05 byl štěpen pomoci Bam HI a PvuII a také PvuII samotným a byl izolován BamHI-PvuII fragment, obsahující adenovirový hlavní pozdní promotor (fragment B) a PvuII fragment, obsahující plasmid trvání rezistence genu (tetracyklinová resistence) a jiné sekvence (fragment C). Fragmenty A, B a C byly ligovány a výsledný plasmid je uveden na obr. 7 a byl izolován a nazván RK1-4. Plasmid RK1-4 byl uložen v Američan Type Culture Collection, Rockville, Maryland, kde je dostupný pod přírůstkovým číslem ATCC 399940.
Příklad 10
Exprese EPO v CHO buňkách - metoda I
DNA (20 ug) z plasmidu pPTFL13, popsaného výše (příklad 6), byla štěpena restrikčni endonukleázou Cla I k linearizaci plasmidu a byla ligována k Cla I-štépené DNA z plasmidu pAdD26SVP(A) 1 (2 ug), který obsahuje intaktní dihydrofolát reduktázový (DHFR) gen, řízený adenovirovým hlavním pozdním promotorem (Kaufman
-25CZ 281756 B6 a Sharp, Mol. and Cell.Biol. 2:1304-1319 (1982)). Takto ligovaná DNA byla použita k transfektováni DHFR-negativních CHO buněk (DUKS-BII, Chasin L.A. a Urlaub G. (1980) PNAS 77 4216-4220) a ponechána růst dva dny, buňky, které inkorporovaly alespoň jeden DHFR gen, byly selektovány v alfa médiu, postrádajícím nukleotidy a doplněném 10 % dialyzovaného fetálního hovězího séra. Po dvou týdnech růstu v selektivním médiu byly kolonie odstraněny z originálních ploten, spojeny do skupin 10-100 kolonií na skupinu, znovu umístěny na plotnu a ponechány růst do slití v médiu, postrádajícím nukleotidy. Supernatanty média ze skupin, rostlých před methotrexátovou selekcí, byly zkoušeny na EPO pomocí RIA. Skupiny, které vykazují pozitivní EPO produkci, rostly za přítomnosti methotrexátu (0,02 uM) a pak byly subklonovány a znovu zkoušeny. EPO Cla 4 4.02-7, jediný subklonovaný z EPO Cla 4 4.02 skupiny, uvolňuje 460 ng/ml EPO do média, obsahujícího 0,02 uM MTX (tabulka 10). EPO Cla 4 4.02-7 je buněčná linie volby pro produkci EPO a byla uložena v Američan Type Culture Collection pod přírůstkovým číslem ATCC CRL8695. V současnosti je tento klon podroben potupné selekci ve zvyšujících se koncentracích MTX a bude pravděpodobně poskytovat buňky, které produkují i vyšší hladiny EPO. Pro skupiny, které na základě RIA byly negativní, byly kolonie, rezistentní k metotrexátu, získány z duplikátních kultur, které rostly za přítomnosti methotrexátu (0,02 uM), opět ve skupinách zkoušeny na EPO pomocí RIA. Tyto kultury, které nebyly pozitivní, byly subklonovány a podrobeny růstu v dále se zvyšujících koncentracích methotrexátu.
Postupná methotrexátová selekce (MTX) byla dosažena opakováním cyklů kultivace buněk za přítomnosti zvyšujících se koncentrací methotrexátu a selekcí přežívajících. V každém cyklu byl měřen EPO v kulturách supernatantu pomocí RIA a in vitro biologické aktivity. Hladiny methotrexátu, použité v každé postupné amplifikaci, byly 0,02 uM, 0,1 uM a 0,5 uM. Jak je uvedeno v tabulce 10, po jednom cyklu selekce v 0,02 uM MTX byly do kultivačního média uvolněny významně vysoké hladiny EPO.
| Tabulka 10 | |||
| Vzorek | Zkouška | Hladina EPO, uvolněného do média získáno z média 0,02 uM methotrexát | |
| skupina 4 4 | RIA | alfa 17 ng/ml | v médiu alfa 50 ng/ml |
jediná kolonie
4 klon
| (.02-7) | RIA | 460 mg/ml |
| Příklad | 11 | |
| Exprese | EPO v CHO buňkách - metoda II |
DNA z klonu lambda HEPOFL13 byla štěpena pomocí EcoRI a malý fragment, obsahující EPO gen, byl subklonován do EcoRI místa plasmidu RK1-4 (viz přiklad 10). Tato DNA (RKFL13) pak byla použita ke transfekci DHFR-negativních CHO buněk přímo (bez štépe
-26CZ 281756 B6 ní) a selekce a amplifikace byla provedena, jak je popsáno výše v příkladu 10.
RKFL13 DNA byla také inzertována do CHO buněk protoplastovou fúzí a mikroinjekcí. Plasmid RKFL13 byl uložen a je dostupný v Američan Type Culture Collection, Rockville, Maryland pod přírůstkovým číslem ATCC 39989.
Tabulka 11
| Vzorek | Zkouška |
| skupina kolonií | |
| A | RIA 3H-Thy |
Hladina EPO, získáno z média alfa ng/ml uvolněného do média
0,02 uM methotrexát v médiu alfa jediná RIA kolonie 3H-Thy kloní.02C-Z) mikroinj ektovaná skupina RIA (DEPO-1) 3H-Thy ng/ml
1,8 j./ml
2 ng/ml (skupina)
150 ng/ml (klon)
1,5 j./ml
0 ng/ml
5,9 j./ml
160 ng/ml
Preferovaný klon jediné kolonie byl uložen a je dostupný z Američan Type Culture Collection, Rockville, Maryland pod přírůstkovým číslem ATCC CRL8695.
Přiklad 12
Exprese EPO genomického klonu v COS-1 buňkách
Pro expresi EPO genomického klonu byl použit vektor pSVOd (Mellon a spol., supra). DNA z pSVOd byla úplně štěpena pomocí Hind III a zatupena s velkým fragmentem DNA polymerázy I. EPO genomický klon lambda-HEP3 byl úplně štěpen s EcoRI a Hind III a 4,0 kb fragment, obsahující EPO gen, byl izolován a zatupen jako výše. Nukleotidová sekvence tohoto fragmentu z Hind III místa do oblasti právé za polyadenylačním signálem je uvedena na obr. 4 a v tabulce 4. EPO genový fragment byl inzertován do pSVOd plasmidového fragmentu a správně konstruované rekombinanty v obou orientacích byly izolovány a ověřeny. Plasmid CZ2-1 má EPO gen v orientaci a (tj. 5' konec EPO nejblíže k SV40 počátku) a plasmid CZ1-3 je v opačné orientaci (orientace b).
Plasmidy CZ1-3 a CZ2-1 byly transfektovány do COS-1 buněk, jak je popsáno v příkladu 7, a média byla sklizena a zkoušena na imunologicky reaktivní EPO. Přibližně 31 ng/ml EPO bylo defektních v supernatantu kultury z CZ2-1 a 16-31 ng/ml CZ1-3.
-27CZ 281756 B6
Genomické klony HEPO1, HEPO2 a HEPO5 mohou být inzertovány do COS buněk pro expresi podobným způsobem.
Příklad 13
Exprese v Cl27 a v 3T3 buňkách. Konstrukce pBPVEPO.
Plasmid, obsahující EPO cDNA sekvenci pod transkripční kontrolou myšího metalothioneinového promotoru a napojený ke kompletní DNA hovězího papilloma viru, byl připraven následovně:
pEPO49F
Plasmid SP6/5 byl získán od Promega Biotec. Tento plasmid byl štěpen kompletně pomocí EcoRI a 1340 bp EcoRI fragment z lambda-HEPOFL13 byl inzertován DNA ligázou. Výsledný plasmid, ve kterém 5’ konec EPO genu byl nejblíže k SP6 promotoru (stanoveno pomocí štěpení BglI a Hind III), byl nazván pEPO49F. V této orientaci je BamHI místo v PSP6/5 polylinkeru přímo připojeno k 5' konci EPO genu.
pMMTneo BPV
Plasmid pdBPV-MMTneo (342-12) (Law a spol., Mol. and Cell Biol., 3:2110-2115 (1983)), ilustrovaný na obr. 8, byl štěpen kompletně pomocí BamHI za vzniku dvou fragmentů - velkého fragmentu asi 8 kb v délce, obsahujícího BPV genom, a menšího fragmentu asi 6,5 kb délky, obsahujícího pML2 počátek replikace a gen ampicilinové rezistence, metallothioneinový promotoe, gen rezistence neomycinu a SV40 polyadenylační signál. Štěpená DNA byla recirkularizována DNA ligázou a plasmidy, které obsahují pouze 6,8 kb fragment, byly identifikovány pomocí EcoRI a BamHI restrikčním endonukleázovým štěpením. Jeden z těchto plasmidů byl nazván pMMTneo BPV.
pEPO15a pMMT neo BPV byl kompletně štěpen pomocí BglII. pEPO49f byl štěpen kompletně pomocí BamHI a BglII a přibližně 700 bp fragment byl připraven izolací na gelu. BglII štěpený pMMTneo BPV a 700 bp BamHI/BglII Epo fragment byly ligovány a výsledné plasmidy, obsahující EPO cDNA, byly identifikovány koloniovou hybridizaci s oligonukleotidovou d(GGTCATCTGTCCCCTGTCC) sondou, která je specifická pro EPO gen. Z plasmidů, které byly pozitivní při hybridizační analýze, byl jeden (pEPO15a), který měl EPO cDNA v orientaci takové, že 5' konec DNA byl nejbližší metallothioneinovému promotoru, identifikován štěpením pomocí EcoRI a Kpnf.
pBPV-EPO
Plasmid pEPO15A byl štěpen kompletně BamHI pro linearizaci plasmidu. Plasmid pdBPV-MMTneo(342-12) byl také štěpen kompletně pomocí BamHI za vzniku dvou fragmentů 6,5a 8 kb. 8kb fragment, který obsahuje celý genom hovězího Papilloma viru, byl izolován na gelu. pEPO15a/BamHI a 8kb BamHI fragment byly spolu ligovány a plasmid (pBPV-EPO), který obsahuje BPV fragment, byl identifikován koloniovou hybridizaci za použití oligonukleotidové sondy
-28CZ 281756 B6 d(PCCACACCCGGTACACA-OH), která je specifická pro BPV genom. Štěpení pBPV-EPO DNA pomocí Hind III indikuje, že směr transkripce BPV genomu byl stejný jako směs transkripce metallothioneinového promotoru (jako v pdBPV-MMMTnec(342-12) viz obr. 8). Plasmid pdBPV-MMTneo(342-12) je dostupný z Američan Type Culture Collection, Rockville, Maryland pod přírůstkovým číslem č. ATCC 37224.
Exprese
Následující metody byly použity pro expresi EPO.
Metoda I
DNA pBPV-EPO byla připravena a přibližně 25 ug bylo použito k transfektování asi 1 x 106 C127 (Lowy a spol., J. of Virol. 26:291-98 (1978)) CHO buněk za použití standardních technik sráženi fosforečnanem vápenatým (Grahm a spol., Virology, 52:456-67 (1973)). Pět hodin po transfekci byla transfekční média odstraněna, buňky byly podrobeny glycerinovému šoku, promyty a bylo přidáno čerstvé α-médium obsahující 10 % fetálního bovinního séra. Po 48 hodinách byly buňky trypsinizovány a štěpeny v poměru 1:10 v DME médiu, obsahujícím 500 ug/ml G418 (Southern a spol., Mol.Appl.Genet. 1:327-41 (1982)), a buňky byly inkubovány dva až tři týdny. G418 rezistentní kolonie pak byly individuálně izolovány do mikrotitračních jamek a ponechány růst do stadia za přítomnosti G418. Buňky pak byly promyty, bylo přidáno čerstvé médium, obsahující 10 % fetálního hovězího séra a média byla sklizena o 48 hodin později. Kondicionované médium bylo testováno a zjištěno jako pozitivní při radioimunoeseji a in vitro biologické eseji.
Metoda II
Cl27 nebo 3T3 buňky byly transfektovány se 25 ug pBPV-EPO a 2 ug pSV2neo (Southern a spol., supra), jak je popsáno v metodě I. Je zde přibližně 10-násobný molární přebytek pBPV-EPO. Po transfekci, postup je stejný jako v metodě 1.
Metoda III
C127 buňky byly transfektovány 30 ug pBPV-EPO, jak je popsáno v metodě I. Po transfekci a štěpení (1:10) bylo každé tři dny vyměňováno čerstvé médium. Po asi 2 týdnech byla zřejmá ložiska transformovaných buněk. Jednotlivá ložiska byla odebrána jednotlivě do 1 cm jamek mikrotitrační plotny, ponechána růst do subsouvislé monovrstvy a zkoušena na EPO aktivitu nebo antigenicitu v kondicionovaném médiu.
-29CZ 281756 B6
Přiklad 14
Exprese ve hmyzích buňkách. Konstrukce pIVEV EPOFL13.
Plasmidový vektor pIVEV byl uložen a je dostupný od Američan Type Culture Collection, Rockville, Maryland pod přírůstkovým číslem č. ATCC 39991. Vektor byl modifikován následovně:
pIVEVNI pIVEV byl štěpen pomocí EcoRI k linearizaci plasmidu, zatupen použitím velkého fragmentu DNA polymerázy I a jediný Notl linker
GGCGGCCGCC
CCGCCGGCGG byl inzertován ligací k otupeným koncům. Výsledný plasmid je nazván pIVEVNI.
pIVEVSI pIVEV byl štěpen pomocí Smál k linearizaci jediného Sfil linkeru
GGGCCCCAGGGGCCC
CCCGGGGTCCCCGGG, byl inzertován ligací k otupeným koncům. Výsledný plasmid byl nazván pIVEVSI.
pIVEVSIBgKp
Plasmid pIVEVSI byl štěpen pomocí KpnI k linearizaci plasmidu a přibližně 0 až 100 bp bylo získáno z každého konce štěpením dvojřetězcovou exonukleázou Bal 31. Jakékoliv konce, které nebyly perfektně tupé, byly zatupeny pomocí velkého fragmentu DNA polymerázy I a polylinker
Xho I
Xbal
AGATCTCGAGAATTCTAGAtCGATGGTACC TCTAGAGCTCTTAAGATCTAGCTACCATGG byl inzertován ligací k tupým koncům. Polylinker byl inzertován v obou orientacích. Plasmid, ve kterém je polylinker orientován tak, že BglII místo v polylinkeru je nejbližší k promotoru polyhedron genu, je nazván pIVEVSIBgKp. Plasmid, ve kterém KpnI místo v polylinkeru je nejbližší k promotoru polyhedron genu, je nazván pIVEVSIKpBg. Počet párů bázi, které byly deletovány mezi původním KpnI místem v pIVEVSI a polyhedron promotorem, nebyl stanoven. pIEIVSIBgKp byl uložen a je dostupný z Američan Type Culture Collection, Rockville, Maryland pod přírůstkovým číslem č. ATCC 399988.
-30CZ 281756 B6 pIEVSIBgKpNl pIVEVNI byl štěpen kompletně pomocí KpnI a Pstl za vzniku dvou fragmentů. Větší fragment, který obsahuje plasmidový počátek replikace a 3' konec polyhedron genu, byl připraven izolací na gelu (fragment A). pIEVSIBgKp byl štěpen kompletně pomocí pstl a Kpn za vzniku dvou fragmentů a menší fragment, který obsahuje polyhedron genový promotor a polylinker, byl připraven izolacemi na gelu (fragment B). Fragment A a B pak byly spojeny DNA ligázou za vzniku nového plasmidu pIVESIBgKpNI, který obsahuje částečně deletovaný polyhedron gen, do kterého byl inzertován polylinker a obsahuje také Notl místo (nahrazení zničeného EcoRI místa) a Sfil místo, které přiléhá k polyhedron genové oblasti.
pIVEPO pIVEVSI BGKpNI byl štěpen kompletně pomocí EcoRI pro linearizaci plasmidu a 1340 bp EcoRI fragment z lambda-HEPOFL13 byl inzertován. Plasmidy, obsahující EPO gen v orientaci takové, že 5' konec EPO genu je nejbližší polyhedron promotoru a 3' konec polyhedron genu, byly identifikovány štěpením s BglII. Jeden z těchto plasmidů ve výše popsané orientaci byl označen pIVEPO.
Exprese EPO ve hmyzích buňkách
Velká množství pIVEPO plasmidu byla vyrobena transformací E.coli kmene JMIOl-tgl. Plasmidová DNA byla izolována technikou čištění lyzátu (Maniatis a Fritsch, Cold Spring Harbor Manual) a dále čištěna pomocí CsCl odstředění. L-l DNA polyhedrosis viru standardního typu Autographa californica (AcNPV) byla připravena fenolovou extrakcí částic viru a následným CsCl čištěním virové DNA.
Tyto dvé DNA pak byly kotransfektovány do Spodoptera frugiperda buněk IPLB-SF-21 (Vaughn a spol., In Vitro, díl B, str. 213-17 (1977) za použití transfekčního postupu s fosforečnanem vápenatým (Potter a Millere, 1977). Pro každou plotnu kontransfektovaných buněk byl použit 1 ug DNA standardního typu AcNPV a 10 ug pIVEPO. Plotny byly inkubovány při 27 ’C 5 dnů. Supernatant pak byl oddělen a EPO exprese v supernatantu byla potvrzena radioimunoeseji a in vitro biologickou eseji.
Příklad 15
Čištění EPO
COS-buněčná kondicionovaná média (121) s EPO koncentracemi až 200 ug/litr byla koncentrována na 600 ml za použití ultrafiltračních membrán se schopnosti dělení 10.000 mol. hmotnosti, jako je Millipore Pellicans 0,46 m2 na membránu. Eseje byly provedeny pomocí RIA, jak je popsáno v příkladu 6. Retentát z ultrafiltrace byl diafiltrován proti 4 ml 10 mM 10 mM fosforečnanu sodného, pufrovaného na pH 7,0. Koncentrovaná a diafiltrovaná kondiční média obsahuji 2,5 mg EPO ve 380 mg celkového proteinu. EPO roztok byl dále koncentrován na 186 ml a vysrážené proteiny byly odstraněny odstředěním při 110.000 x g po 30 minut.
-31CZ 281756 B6
Supernatant, který obsahuje EPO (2,0 mg), byl upraven na pH
5.5 s 50% kyselinou octovou, ponechán míchat při 4 °C 30 minut a sraženina byla odstraněna odstřelováním při 13.000 x g po 30 minut.
Chromatografie na karbonylmethylsepharóze
Supernatant z odstřelování (20 ml), obsahující 200 ug EPO (24 mg celkového proteinu), byl nanesen na kolonu, naplněnou CM-Sepharosou (20 ml), ekvilibrovanou v 10 mM octanu sodném pH 5,5, promytou 40 ml stejného pufru. EPO, který se navázal k CM-Sepharose, byl eluován 100 ml gradientu NaU (0-1) v 10 mM fosforečnanu sodném pH 5,5. Frakce, obsahující EPO (celkem 50 ug ve 2 mg celkových proteinů), byly spojeny a koncentrovány na 2 ml za použití Amicon YM10 ultrafiltrační membrány.
HPLC s reverzní fází
Koncentrované frakce z CM-Sepharosy, obsahující EPO, byly dále čištěny pomocí HPLC s reverzní fázi za použití Vydac-4 kolony. EPO byl nanesen na kolonu, ekvilibrovanou v 10% rozpouštědle B (rozpouštědlo A bylo 0,1 % CF3CO2H ve vodě; rozpouštědlo B bylo 0,1 % CF3CO2H v CF3CO2H v CF3CN), při průtokové rychlosti 1 ml/min. Kolona byla promývána 10% B po 10 minut a EPO byl eluován s lineárním gradientem B(10-70 % po 60 minut). Frakce, obsahující EPO, byly spojeny (asi 40 ug EPO ve 120 ug celkových proteinů) a lyofilizovány. Lyofilizovaný EPO byl rekonstituován v 0,1M Tris HC1 při pH 7,5, obsahujícím 0,15M NaCl a rechromatografován pomocí HPLC s reverzní fází. Frakce, obsahující EPO, byly spojeny a analyzovány SDS-polyakrylamidovou (10%) gelovou elektroforézou (Lameli U.K., Nátuře). Spojené frakce EPO obsahují
15.5 ug EPO ve 25 ug celkového proteinu.
Vynález byl podrobně popsán svými výhodnými provedeními. Odborník v oboru může snadno provést modifikace a vylepšení na základě popisu a předložených obrázků, aniž by byla porušena myšlenka a rozsah vynálezu, který je dán připojenými nároky.
-32CZ 281756 B6
1) Jacobson, L. O., Goldwasser, E. Fned. W., a. . Plzak. L. F.. Trans. Assoc. Am. Physicians TO:305-2 (1957).
2) Krantz. S. 8. a Jacobson. L. O. Chicago: University oř Chicago Press 1970. pp. 29-31.
3) Hammond. D a Winnick, S. Ann. N.Y. Acad. Sci. 23(1219-227 (1974).
4) Sherwood, J. B. a. Goldwasser. E., Endocrinology 103:866-870 (1978).
5) Fned. W. Blood 40:671 -677 (1972).
6) Fisher, J. J. Lab. and Clin. Med. 93:695-699 (1979).
7) Naughton-B. A.,Kaplan. S. M.. Roy. M., Burdowski. A. J., Gordon, A. S.. a.... Piliero. S. J. Scier 196301-302.
8) Lucarelli. G. P., Howard. D., a . Stohlman. F„ Jr. J. Clin. Invest 43:2195-2203 (1964).
9) Zanjani. E. D . Poster, J.. Burlington. H., Mann, L. I., ar Wasserman. L. R. J. Lab. Clin. Med. 89:6644 (1977).
10) Krantz. S. B.. Gallien-Lartigue. O., ai Goldwasser, E. J. Biol Chem. 238:4085-4090 (1963).
11) Dunn, C. Jarvis. J. H. a . Greenman, J. M. Exp. Hematol. 3:65-78 (1975).
12) Krystal. G Exp. Hematol. 11:649-660 (1983)
13) Iscove. N.N. a. * Guilbert, L.J.. M.J. Murphy, Jr. (Ed.) New York:Springer-Verlag, pp. 3-7 (1978).
14) Goldwasser. E.. ICN UCLA Symposium, Control oř Cellular Division and Development. A. R. Lis lne., pp. 487-494 (1987)
15) Cline. M. J. a Golde. D. W. Nátuře 277:177-181 (1979)
16) Metcalf, Johnson. G. R.. a> Burgess. A. W. Blood 55:138- (1980)
17) Krane. N. Henry Ford Hosp. Med. J. 31:177-181 (1983)
18) Eschbach. J., Madenovic. J.. Garcia, J., Wahl, P., at Adamson, J. J. Clin. Invest. 74:434-441 (198-
19) Anagnostou. A.. Barone. J.. Védo. A., a: Fned. W. Br. J. Hematol 37:85-91 (1977)
20) Miyake. T.. Kung, C.. a Goldwasser. E. J. Biol. Chem. 252:5558-5564 (1977)
21) Yanagawa. S.. Hirade. K.. Ohnota. H.. Sašaki. R.. Chiba. H.. Veda. M.. ai Goto, M. J. Biol. Cher 259:2707-2710(1984)
22) Lawn, R. M., Fntsch. E. F._ Parker. R. C., Blake. G., a< Maniatis. T. Cell 15:1157 - (1978)
23) Sanger. F.. Nicklen. S.. a Coulson. A. R. Proč. Naťl. Acad. Sci.. U.S.A. 74:5463- (1977)
24) Zanianc. E.D.. Ascensao. J.L.. McGlave. P.B.. Bamsadre. M.. ar Asn. R. C. J. Clin. Invest. 67:118Σ (198D
25) Toole. J.J.. Knopf. J.L.. Wozney, J.M.. Sultzman. L.A. Buecker.'J. L.. Pittman, D. D.. Kauřman, R u Brown. E.. Shoemaker. C.. Orr, E. C.. Amphlett. G. W.. Foster. W. B.. Cce. M. L.. Knutson, G. J.. Fass. C N., a.· Hewick. R. M. Nátuře in Press
26) Goldwasser. E. Blood Suppi. i. 58. xlii (abstr) (1981)
27) Sue. J. M a· ' Sytkowdki. A. J. Proč. Naťl Acad. Sci U.S.A. 80:3651-3655 (1983)
29) Bersch. N. a; Gotda. D.W., In Vitro Aspects of Erythropoiesis. M. J. Murphy (Ed ) New York:So nger-Verlag (1978)
30) Cotes. P. M. a Bangham. □. R. Nátuře 191:1065- (1961)
31) Goldwasser. E. a Gross, M. Methodš in Enzymol 37:109-121 (1975)
32) Nabeshima. Y. -i, Fujii-Kuriyama. Y„ Muřámatsu. M., a Ogata. K. Nátuře 308:333-338 (1984)
33) Young, R. A.. Hagencuhle. O. a Schibler. U. Cell 23:451-558 (198Ϊ)
34) Medford. R. M., Nguyen. Η. T., Destree. A. T„ Summers, E. a Nadal-Ginard, B. Cell 38:409-42' (1984)
35) Ziff. E. Θ. Nátuře 287:491-499 (1980)
36) Early, P. Cell 20:313-319 (1980)
37) Sytkowski. A. Bio. Biop. Res. Comm. 96:143-149 (1980)
38) Murphy, M. a· Miyake. T. Acta. Haematol. Jpn. 46:1380-1396 (1983)
-33CZ 281756 B6
39) Wagh, P. V. a. λ. Bahl, O. P. CRC Critical Reviews in Biochemistry 307-377 (1981)
40) Wang. F. F„ Kung, C. K. -H.á Goldwasser, E. Fěď. Proč. Fed. Am. Soc. Exp-. Biol. 42:1872 (abstr) (1983)
41) Lowy, P„ Keighley. G. a Borsook, H. Nátuře 185:102-103 (1960)
42) VanLenten. L. a ' Ashwell. G. J. Biol. Chem. 247:4633-4640 (1972)
43) Lee-Huang. S. Proč. Nafl Acad-STTu.S.A. 81:2708-2712 (1984)
44) Fyhrquist, F., Rosenlof, K., Gronhagen-Riska, C., Hortling, L. ai Tikkanen, I. Nátuře 308:649-562 (1984)
45) Ohkubo, H„ Kageyama. R.. Vjihara. M., Hirose, T.. Inayama, S.. a·. Nakanishi, S. Proč. Naťl Acad.
Sci. U.S.A. 80:2196-2200 (1983) ’ ‘ '
46) Suggs. S.V., Wallace. R. B.. Hirose, T.. Kawashima, E. H. a> . Itakura, K. Proč. Naťl. Acad. Sci. U.S.A.‘78:6613-6617 (1981)
47) Woo. S. L. C.. Dugaiczyk. A.. Tsai. M. -J„ Lai. E. C.. Catterall, J. F. a. . 0'Malley, B. W. Proč. Naťl.Acad. Sci. U.S.A. 75:3688- (1978)
48) Melchior, W. B. at . VonHippel. P. H. Proč. Naťl Acad. Soc. U.S.A. 70:298-302 (1973)
49) Orosz. J. M. at Wetmis. J. G. Biopolymers 16:1183-1199 (1977)
50) Anderson, Sa ' Kingston, I. B. Proč. Naťl Acad. Sci.-U.S.A. 80:6836-6842 (1983)
51) Ullrich. A.. Cousséns. L.. Hayflick, J. S. Duli. T. J.. Gray, A.. Tam, A. W.. Lee, J.. Yarden, Y.. Libermann, T. A., Schlessinger, J., Downward. J., Mayes. E. L. V„ Whittle, H., Waterfield, M.D. ar· Seeburg, P. H. Nátuře 309: 418-425 (1984)
52) Fisher, J. Proč. Soc. Exptl. Biol. ar J Med. 173:289-305 (1983)
53) Kozák. M. Nuc. Acid Res. 12:857^872 (1984)
54) Benton, W.D. at ' Davis. R.W. Science 196:180-182 (1977)
55) Sherwood. J.B. a< ' Goldwasser, E. Blood 54:885-893 (1979)
56) Derman, E.. Krauter, K.. Walling. L.. Weinberger, C., Ray. M., a ' Darnell, J. T., Cell 23:731- (1981)
57) Gluzman, Y„ Cell 23:175-182 (1981)
58) Hewick, R. M„ Hunkapiller, Μ. E.. Hood, L. E.. at 1 Dreyer. W. J. J. Biol. Chem. 256:7990-7997 (1981)
59) Towbin, H., Stachelin. T„ a . Gordon. J., Proč. Naťl Acad. Sci. 76:4380- (1979)
60) Carnott. P., DeFlandre. C. C. R. Acad. Sci. Paris 143:432-(1960)
Claims (30)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. DNA sekvence, kódující aminokyselinovou sekvenci lidského erythropoietinu, obsahující nukleotidovou sekvenci, uvedenou v tabulce 3 nebo tabulce 4 s ohledem na aminokyseliny 1 až 166 lidského erythropoietinu.
- 2. DNA sekvence, kódující lidský erythropoietin, obsahující nukleotidovou sekvenci podle tabulky 4 od sekvence ATG, kódující počáteční Met až do AGA, kódujícího koncový Arg.
- 3. DNA sekvence podle nároku 1, kódující lidský erythropoietin, obsahující nukleotidovou sekvenci, uvedenou v tabulce 4 od sekvence GGG, kódující aminokyselinu 1 (Met) až do AGA, kódující koncovou aminokyselinu 166 (Arg).
- 4. Vektor, obsahující DNA sekvenci podle nároku 1, 2 nebo 3.
- 5. Savčí hostitelská buňka, transformovaná vektorem podle nároku 4.
- 6. Rekombinantní DNA vektor, obsahující genomický DNA klon, mající nukleotidové sekvence, uvedené v tabulce 4.
- 7. Savčí buněčná linie, transformovaná vektorem podle nároku 6.
- 8. Buněčná linie podle nároku 7, kde uvedenými savčími buňkami jsou CHO buňky.
- 9. DNA sekvence, kódující aminokyselinovou sekvenci 1 až 166 erythropoietinu, uvedenou v tabulce 3, kde uvedená DNA sekvence obsahuje nukleotid ggtc, který je 50 nukleotidů proti směru od ATG kodonu, kódujícího -27Met včetně nukleotidů TGA, následujících po AGA kodonu, kódujícím 166 Arg.
- 10. Rekombinantní DNA vektor, obsahující heterologní promotor a cDNA sekvenci podle nároku 9.
- 11.Savčí buněčná linie, transformovaná vektorem podle nároku 10.
- 12. Buněčná linie podle nároku 11, kde uvedenými savčími buňkami jsou 3T3, C127 nebo CHO buňky.
- 13. cDNA sekvence, kódující 1-166 aminokyselinovou sekvenci nebo erythropoietinová uvedená cDNA, obsahující sekvenci z tabulky 3 od GCC kodonu, kódujícího 1 Ala po AGA kodon, kódující 166 Arg.
- 14. cDNA sekvence podle nároku 13, obsahující dále DNA sekvenci, kódující aminokyselinovou leader sekvenci Met Gly ... Leu Gly, jak je uvedena v tabulce 3.
- 15. Způsob produkce lidského cDNA klonu, který exprimuje biologicky aktivní erythropoietin, vyznačující se tím, že zahrnuje-35CZ 281756 B6 (a) štěpeni čištěného erythropoietinu trypsinem, (b) přípravu skupiny oligonukleotidových sond na bázi aminokyselinové sekvence tryptických fragmentů, získaných ve stupni (a) , (c) screening lidské genomické DNA knihovny oligonukleotidovými sondami ze stupně (b), (d) výběr klonů, které hybridizuj! k sondám a sekvencování klonů pro stanovení, zda jsou to erythropoietinové klony, (e) identifikaci erythropoietinového klonu ze stupně (d), (f) použití klonu ze stupně (e) pro screening cDNA knihovny, připravené z jater lidského fetu, (g) výběr erythropoietinového klonu z cDNA knihovny jater fetu ze stupně (f).
- 16. Způsob produkce lidského erythropoietinu, vyznačuj i c i se tím, že zahrnuje ve vhodném médiu kultivaci eukaryotických hostitelských buněk, obsahujících DNA sekvenci podle nároků 1-3, 9, 13 nebo 14, která je operativně připojená k expresní kontrolní sekvenci, a oddělení takto produkovaného erythropoietinu od buněk a média.
- 17. Způsob produkce lidského erythropoietinu, vyznačuj i c i se tím, že zahrnuje ve vhodném médiu kultivaci eukaryotických hostitelských buněk, obsahujících DNA sekvenci, uvedenou v tabulce 3, operativně připojenou k expresní kontrolní sekvenci, a oddělení takto produkovaného erythropoietinu od buněk a média.
- 18. Způsob produkce lidského erythropoietinu, vyznačuj ία i se tím, že zahrnuje ve vhodném médiu kultivaci eukaryotických hostitelských buněk, obsahujících DNA sekvenci, uvedenou v tabulce 4, operativně připojenou k expresní kontrolní sekvenci, a oddělení takto produkovaného erythropoietinu od buněk a média.
- 19. Způsob produkce lidského erythropoietinu při vyloučení erythropoietinových produktů, majících vyšší molekulovou hmotnost podle SDS-PAGE, než erythropoietin, izolovaný z urinárních zdrojů, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci ve vhodném médiu eukaryotických hostitelských buněk, obsahujících DNA sekvenci, uvedenou v tabulce 4, operativně připojenou k expresní kontrolní sekvenci, a oddělení takto produkovaného erythropoietinu od buněk a média.
- 20. Způsob produkce erythropoietinu při vyloučení takových erythropoietinových produktů, majících průměrné karbohydrátové složení, které se liší od průměrného karbohydrátového složení přirozené se vyskytujícího lidského erythropoietinu, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci ve vhodném médiu eukaryotických hostitelských buněk, obsahujících DNA sekvenci, uvedenou v tabulce 4, operativně připojenou k expresní kontrolní sekvenci, a oddělení takto produkovaného erythropoietinu od buněk a média.
- 21. Způsob produkce lidského erythropoietinu při vyloučeni takových erythropoietinových produktů, majících průměrné karbohydrátové složení, které se liší od průměrného karbohydrátového složení přirozeně se vyskytujícího lidského erythropoietinu a majících vyšší molekulovou hmotnost podle SDS-PAGE od erythropoietinu, izolovaného z urinárních zdrojů, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci ve vhodném médiu eukaryotických hostitelských buněk, obsahujících DNA sekvenci, uvedenou v tabulce 4, operativně připojenou k expresní kontrolní sekvenci, a oddělení takto produkovaného erythropoietinu od buněk a média.
- 22. Způsob podle některého z nároků 16 až 21, vyznačující se tím, že kultivační médium obsahuje fetální sérum.
- 23. Způsob podle některého z nároků 16 až 22, vyznačující se tím, že hostitelské buňky jsou savčí buňky.
- 24. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že savčí buňky jsou COS, CHO, C127 nebo 3T3 buňky.
- 25. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že savčí buňky jsou 3T3 buňky.
- 26. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že savčí buňky jsou buňky vaječníků čínského křečka (CHO).
- 27. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že uvedená DNA sekvence je obsažena ve vektoru, obsahujícím také DNA hovězího papilloma viru.
- 28. Farmaceutický přípravek pro léčbu chorob, spojených se stimulací tvorby erythrocytů, vyznačující se tím, že obsahují lidský erythropoietin, připravitelný podle nároků16 až 27, a dále obsahuje popřípadě farmaceuticky přijatelné přísady.
- 29. Farmaceutický přípravek pro léčbu chorob, spojených se stimulací tvorby erythrocytů, vyznačující se tím, že obsahuje lidský erythropoietin, připravitelný podle nároků17 až 27, a dále obsahuje popřípadě farmaceuticky přijatelné přísady.
- 30. Farmaceutický přípravek pro léčbu chorob, spojených se stimulací tvorby erythrocytů, vyznačující se tím, že obsahuje lidský erythropoietin, připravitelný podle nároků18 až 27, a dále obsahuje popřípadě farmaceuticky přijatelné přísady.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US67781384A | 1984-12-04 | 1984-12-04 | |
| US68862285A | 1985-01-03 | 1985-01-03 | |
| US69325885A | 1985-01-22 | 1985-01-22 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ880485A3 CZ880485A3 (en) | 1996-08-14 |
| CZ281756B6 true CZ281756B6 (cs) | 1997-01-15 |
Family
ID=27418329
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS858804A CZ281756B6 (cs) | 1984-12-04 | 1985-12-03 | DNA sekvence, kodující aminokyselinovou sekvenci lidského erythropoietinu, vektory, obsahující takové DNA sekvence, prokaryotické a eukaryotické hostitelské buňky transformované takovým vektorem, způsob přípravy lidského erythropoietinu, rekombinantní lidský erythropoietin a farmaceutický přípravek, obsahující erythropoietin |
| CZ19961274A CZ286557B6 (cs) | 1984-12-04 | 1996-05-02 | Způsob produkce rekombinantního lidského erythropoietinu |
| CZ19994314A CZ287620B6 (cs) | 1984-12-04 | 1999-12-02 | Způsob produkce lidského erythropoietinu |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19961274A CZ286557B6 (cs) | 1984-12-04 | 1996-05-02 | Způsob produkce rekombinantního lidského erythropoietinu |
| CZ19994314A CZ287620B6 (cs) | 1984-12-04 | 1999-12-02 | Způsob produkce lidského erythropoietinu |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0205564B2 (cs) |
| JP (4) | JPH02104284A (cs) |
| KR (1) | KR890001011B1 (cs) |
| AT (2) | ATE63137T1 (cs) |
| AU (1) | AU621535B2 (cs) |
| CA (1) | CA1341502C (cs) |
| CZ (3) | CZ281756B6 (cs) |
| DE (3) | DE411678T1 (cs) |
| DK (4) | DK172953B1 (cs) |
| ES (1) | ES8800049A1 (cs) |
| FI (2) | FI104261B1 (cs) |
| GE (1) | GEP19970775B (cs) |
| GR (1) | GR852890B (cs) |
| HK (2) | HK105593A (cs) |
| HU (1) | HU216079B (cs) |
| IL (1) | IL77081A (cs) |
| LV (2) | LV10505B (cs) |
| MD (1) | MD1639C2 (cs) |
| NO (1) | NO304469B1 (cs) |
| PL (2) | PL157926B1 (cs) |
| PT (1) | PT81590B (cs) |
| SK (2) | SK168799A3 (cs) |
| UA (1) | UA44882C2 (cs) |
| WO (1) | WO1986003520A1 (cs) |
Families Citing this family (79)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR850004274A (ko) * | 1983-12-13 | 1985-07-11 | 원본미기재 | 에리트로포이에틴의 제조방법 |
| NZ210501A (en) * | 1983-12-13 | 1991-08-27 | Kirin Amgen Inc | Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence |
| US4703008A (en) * | 1983-12-13 | 1987-10-27 | Kiren-Amgen, Inc. | DNA sequences encoding erythropoietin |
| US4677195A (en) * | 1985-01-11 | 1987-06-30 | Genetics Institute, Inc. | Method for the purification of erythropoietin and erythropoietin compositions |
| DE3789678T2 (de) * | 1986-02-27 | 1994-08-11 | Snow Brand Milk Products Co Ltd | Herstellung von erythropoietinproduzierenden Zellen und Verfahren zur Herstellung von Erythropoietin mit Verwendung dieser Zellen. |
| DK173067B1 (da) * | 1986-06-27 | 1999-12-13 | Univ Washington | Humant erythropoietin-gen, fremgangsmåde til ekspression deraf i transficerede cellelinier, de transficerede cellelinier sa |
| GB2197321B (en) * | 1986-09-12 | 1990-10-03 | Genentech Inc | Method and vectors for obtaining continuous production of heterologous protein in a eukaryotic host cell line |
| US4954437A (en) * | 1986-09-15 | 1990-09-04 | Integrated Genetics, Inc. | Cell encoding recombinant human erythropoietin |
| US4835260A (en) * | 1987-03-20 | 1989-05-30 | Genetics Institute, Inc. | Erythropoietin composition |
| FR2686899B1 (fr) | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
| US5888774A (en) * | 1994-12-19 | 1999-03-30 | Cangene Corporation | Recombinant DNA molecules and expression vectors for erythropoietin |
| ATE278794T1 (de) | 1995-06-15 | 2004-10-15 | Crucell Holland Bv | Verpackungssysteme für humane, menschliche adenoviren, zur verwendung in die gentherapie |
| EP0752474A1 (en) * | 1995-07-07 | 1997-01-08 | Boehringer Mannheim Gmbh | Nucleic acid coding for CMP-N-acetyl-neuraminic acid hydroxylase and its use for the production of modified glycoproteins |
| WO1997003200A1 (en) * | 1995-07-07 | 1997-01-30 | Boehringer Mannheim Gmbh | Nucleic acid coding for cmp-n-acetyl-neuraminic acid hydroxylase and its use for the production of modified glycoproteins |
| DE19535571A1 (de) | 1995-09-14 | 1997-03-20 | Boehringer Mannheim Gmbh | Pharmazeutische Kombinationspräparate und deren Verwendung zur Behandlung von Hämodialysepatienten |
| US5952226A (en) * | 1996-11-05 | 1999-09-14 | Modex Therapeutiques | Hypoxia responsive EPO producing cells |
| WO1998041226A1 (de) | 1997-03-18 | 1998-09-24 | Roche Diagnostics Gmbh | Pharmazeutische kombinationspräparate enthaltend erythropoietin und eisenpräparate |
| EP0885613A1 (de) | 1997-06-21 | 1998-12-23 | Roche Diagnostics GmbH | Verwendung von modifizierten Hämoglobinen zur Behandlung von Anämien und Kombinationspräparate umfassend Erythropoietin und modifiziertes Hämoglobin |
| PT1000154E (pt) | 1997-07-23 | 2007-03-30 | Roche Diagnostics Gmbh | Identificação de linhas celulares humanas para a produção de proteínas humanas por activação endógena de genes |
| US6548296B1 (en) | 1997-07-23 | 2003-04-15 | Roche Diagnostics Gmbh | Methods for identifying human cell lines useful for endogenous gene activation, isolated human lines identified thereby, and uses thereof |
| ES2281133T3 (es) * | 1997-07-23 | 2007-09-16 | Roche Diagnostics Gmbh | Identificacion de lineas celulares humanas para la produccion de proteinas humanas mediante la activacion endogena de genes. |
| KR100641969B1 (ko) | 1997-07-23 | 2006-11-06 | 로셰 디아그노스틱스 게엠베하 | 내인성 유전자 활성화에 의한 에리트로포이에틴의제조방법 |
| TR200000175T2 (tr) * | 1997-07-23 | 2001-01-22 | Roche Diagnostics Gmbh | Endogenik gen aktivasyonu ile eritropoietinin hazırlanması. |
| ATE255634T1 (de) * | 1997-09-01 | 2003-12-15 | Aventis Pharma Gmbh | Rekombinantes humanes erythropoietin mit vorteilhaftem glykosylierungsmuster |
| AR019025A1 (es) | 1998-04-09 | 2001-12-26 | Roche Diagnostics Gmbh | Uso de eritropoyetina en bajas dosis para producir un preparado farmaceutico para el tratamiento de hemocromatosis, preparado farmaceutico combinadoutilizado segun dicho uso y envase farmaceutico unitario que contiene al referido preparado farmaceutico combinado |
| BR9917606A (pt) | 1998-11-06 | 2002-12-31 | Bio Sidus S A | Procedimento para a purificação de eritropoetina humana recombinante a partir de sobrenadantes de cultivo de células e eritropoetina humana recombinante obtida com tal procedimento |
| BR9905867A (pt) | 1998-11-06 | 2001-01-23 | Bio Sidus S A | Linhagem celular produtora de eritropoietina humana recombinante e a eritropoietina humana recombinante produzida por esta célula |
| US6777205B1 (en) | 1998-11-06 | 2004-08-17 | Sterrenbeld Biotechnologie North America, Inc. | Host cells expressing recombinant human erythropoietin |
| BR9905868A (pt) | 1998-11-06 | 2001-01-23 | Bio Sidus S A | Procedimento de cultivo massivo de células de mamìfero para a obtenção de eritropoetina humana, recombinante e a eritropoetina humana recombinante obtida com tal procedimento |
| DE19857609A1 (de) | 1998-12-14 | 2000-06-15 | Hannelore Ehrenreich | Verwendung von Erythropoietin zur Behandlung von cerebralen Ischämien des Menschen |
| US6855544B1 (en) | 1999-04-15 | 2005-02-15 | Crucell Holland B.V. | Recombinant protein production in a human cell |
| US7604960B2 (en) | 1999-04-15 | 2009-10-20 | Crucell Holland B.V. | Transient protein expression methods |
| US7297680B2 (en) | 1999-04-15 | 2007-11-20 | Crucell Holland B.V. | Compositions of erythropoietin isoforms comprising Lewis-X structures and high sialic acid content |
| US8236561B2 (en) | 1999-04-15 | 2012-08-07 | Crucell Holland B.V. | Efficient production of IgA in recombinant mammalian cells |
| US7527961B2 (en) | 1999-11-26 | 2009-05-05 | Crucell Holland B.V. | Production of vaccines |
| US7192759B1 (en) | 1999-11-26 | 2007-03-20 | Crucell Holland B.V. | Production of vaccines |
| US7521220B2 (en) | 1999-11-26 | 2009-04-21 | Crucell Holland B.V. | Production of vaccines |
| CA2431964C (en) | 2000-12-20 | 2013-09-10 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Conjugates of erythropoietin (pep) with polyethylene glycol (peg) |
| DE10112825A1 (de) | 2001-03-16 | 2002-10-02 | Fresenius Kabi De Gmbh | HESylierung von Wirkstoffen in wässriger Lösung |
| KR100505152B1 (ko) * | 2001-09-10 | 2005-08-03 | (주)가이아진 | 아스코르브산을 이용한 에리트로포이에틴의 생산방법 |
| US6930086B2 (en) | 2001-09-25 | 2005-08-16 | Hoffmann-La Roche Inc. | Diglycosylated erythropoietin |
| EP1465987B1 (en) | 2001-12-07 | 2008-01-23 | Crucell Holland B.V. | Production of viruses, viral isolates and vaccines |
| EP2261250B1 (en) | 2001-12-21 | 2015-07-01 | Human Genome Sciences, Inc. | GCSF-Albumin fusion proteins |
| DE10209821A1 (de) | 2002-03-06 | 2003-09-25 | Biotechnologie Ges Mittelhesse | Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid |
| DE10209822A1 (de) | 2002-03-06 | 2003-09-25 | Biotechnologie Ges Mittelhesse | Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid |
| DE10234192B4 (de) | 2002-07-26 | 2009-11-26 | Epoplus Gmbh Co.Kg | Verwendung von Erythropoetin |
| US7459435B2 (en) | 2002-08-29 | 2008-12-02 | Hoffmann-La Roche Inc. | Treatment of disturbances of iron distribution |
| AU2003253399B2 (en) | 2002-09-11 | 2010-10-14 | Fresenius Kabi Deutschland Gmbh | Hasylated polypeptides, especially hasylated erythropoietin |
| EP1681303B1 (en) | 2002-09-11 | 2013-09-04 | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | HASylated polypeptides, especially HASylated erythropoietin |
| ATE409048T1 (de) | 2002-10-08 | 2008-10-15 | Fresenius Kabi De Gmbh | Pharmazeutisch aktive oligosaccharid-conjugate |
| US7459436B2 (en) | 2002-11-22 | 2008-12-02 | Hoffmann-La Roche Inc. | Treatment of disturbances of iron distribution |
| BRPI0409895B8 (pt) | 2003-05-09 | 2021-05-25 | Crucell Holland Bv | método de cultura de células derivadas de células per.c6 capazes de crescer em suspensão para aumentar o rendimento de produto das referidas células |
| WO2005014655A2 (en) | 2003-08-08 | 2005-02-17 | Fresenius Kabi Deutschland Gmbh | Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein |
| MXPA06003234A (es) | 2003-09-29 | 2006-06-08 | Warren Pharmaceuticals Inc | Citosinas protectoras de los tejidos para el tratamiento y prevencion de la sepsis y la formacion de adhesiones. |
| CA2550301A1 (en) | 2003-12-30 | 2005-07-14 | Bionethos Holding Gmbh | Tissue regeneration method |
| DE102004004509B4 (de) | 2004-01-23 | 2010-07-01 | Epoplus Gmbh Co.Kg | Einsatz von niedrig dosiertem Erythropoietin zur Stimulation endothelialer Vorläuferzellen sowie zur Organregeneration und Progressionsverlangsamung von Endorganschäden |
| JP5396019B2 (ja) | 2004-03-11 | 2014-01-22 | フレゼニウス・カビ・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | ヒドロキシアルキルデンプンとタンパク質とのコンジュゲート |
| CN101659704A (zh) | 2004-03-11 | 2010-03-03 | 弗雷泽纽斯卡比德国有限公司 | 通过还原氨基化制备的羟烷基淀粉和蛋白质的偶联物 |
| GB0507123D0 (en) * | 2005-04-08 | 2005-05-11 | Isis Innovation | Method |
| EP1762250A1 (en) | 2005-09-12 | 2007-03-14 | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | Conjugates of hydroxyalkyl starch and an active substance, prepared by chemical ligation via thiazolidine |
| AR053416A1 (es) | 2005-11-10 | 2007-05-09 | Protech Pharma S A | Combinacion de glicoisoformas para el tratamiento o prevencion de la septicemia, linea celular transgenica productora de glicoformas de eritropoyetina, composicion farmaceutica que comprende a dicha combinacion, procedimientos para obtener la linea celular, procedimiento para producir dicha combinac |
| KR20080095868A (ko) | 2006-01-18 | 2008-10-29 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 시알산의 제거 방법 및 아시알로에리스로포이에틴의 제조방법 |
| DE102006004008A1 (de) | 2006-01-27 | 2007-08-02 | Hannelore Prof. Dr. Dr. Ehrenreich | Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Multipler Sklerose, sowie Verwendung von Erythropoietin zur Herstellung eines Arzneimittels zur intermittierenden Behandlung und/oder intermittierenden Prophylaxe von Multipler Sklerose |
| EP1991569A4 (en) * | 2006-03-07 | 2009-12-23 | Regenetech Inc | MAMMALIAN BIOLOGICAL MOLECULES WITH NATURAL GLYCOSYLATION PRODUCED BY ELECTROMAGNETIC STIMULATION OF LIVING MAMMALIAN CELLS |
| WO2007108505A1 (ja) | 2006-03-22 | 2007-09-27 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | エリスロポエチン溶液製剤 |
| ES2529234T3 (es) | 2006-08-04 | 2015-02-18 | Prolong Pharmaceuticals, LLC | Eritropoyetina modificada |
| WO2009010107A1 (en) | 2007-07-19 | 2009-01-22 | Hannelore Ehrenreich | Use of epo receptor activation or stimulation for the improvement of the edss score in patients with multiple sclerosis |
| EP2070950A1 (en) | 2007-12-14 | 2009-06-17 | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | Hydroxyalkyl starch derivatives and process for their preparation |
| EP2095829A1 (en) | 2008-02-27 | 2009-09-02 | LEK Pharmaceuticals D.D. | Selenium containing modifying agents and conjugates |
| DE102008002210A1 (de) | 2008-06-04 | 2009-12-10 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Erythropoietin |
| DE102008002209A1 (de) | 2008-06-04 | 2009-12-10 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur Aufreinigung von Erythropoietin |
| CA2736141C (en) | 2008-09-23 | 2018-03-20 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Purification of erythropoietin |
| DE102008054716A1 (de) | 2008-12-16 | 2010-06-17 | Evonik Degussa Gmbh | Inprozesskontrolle in einem Verfahren zur Herstellung von EPO |
| US20100272816A1 (en) | 2009-04-27 | 2010-10-28 | Wolfgang Rudinger | Microcapsules comprising liver cells and erythropoietin, methods for preparing said microcapsules and methods for treating a patient comprising applying said microcapsules to the patient |
| US20120264688A1 (en) | 2009-09-23 | 2012-10-18 | Walter Hinderer | Process for the purification of recombinant human erythropoietin (epo), epo thus purified and pharmaceutical compositions comprising same |
| WO2017068051A1 (en) | 2015-10-21 | 2017-04-27 | Lek Pharmaceuticals D.D. | Peg-based dendron and process for producing the same |
| CN106906359B (zh) | 2015-12-22 | 2018-12-11 | 理查德.亨威克 | 从硅酸盐矿物收取锂 |
| EP3570871B1 (en) | 2017-03-20 | 2020-11-18 | H. Hoffnabb-La Roche Ag | Method for in vitro glycoengineering of an erythropoiesis stimulating protein |
| WO2022159414A1 (en) | 2021-01-22 | 2022-07-28 | University Of Rochester | Erythropoietin for gastroinfestinal dysfunction |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US439780A (en) * | 1890-11-04 | Method of and apparatus for casting ingots | ||
| US3865801A (en) * | 1973-06-15 | 1975-02-11 | Atomic Energy Commission | Stabilization of urinary erythropoietin using sodium p-aminosalicylate and extracting into phenol |
| JPS5455790A (en) * | 1977-10-05 | 1979-05-04 | Tomoyuki Tajima | Production of erythropoetin |
| JPS5653696A (en) * | 1979-10-09 | 1981-05-13 | Ajinomoto Co Inc | Isolation of erythropoietin by adsorption |
| JPS6045849B2 (ja) * | 1980-08-25 | 1985-10-12 | 林原 健 | ヒトエリトロポエチンの製造方法 |
| US4419446A (en) * | 1980-12-31 | 1983-12-06 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector |
| JPS6043395A (ja) * | 1983-08-19 | 1985-03-07 | Sumitomo Chem Co Ltd | エリスロポエチンの製造法 |
| NZ210501A (en) * | 1983-12-13 | 1991-08-27 | Kirin Amgen Inc | Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence |
| IT1185503B (it) * | 1984-01-11 | 1987-11-12 | Univ New York | Cloni di odna di eritropietina umana |
| JPS60215632A (ja) * | 1984-04-12 | 1985-10-29 | Japan Found Cancer | エリスロポエチンの製造法 |
| US4732889A (en) * | 1985-02-06 | 1988-03-22 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Pharmaceutical composition for the treatment of the anemia of rheumatoid arthritis |
| JPH062070B2 (ja) * | 1988-07-06 | 1994-01-12 | 農林水産省食品総合研究所長 | ▲ｏ下−▼アシルアミノ酸の製造方法 |
-
1985
- 1985-11-18 IL IL7708185A patent/IL77081A/en not_active IP Right Cessation
- 1985-12-02 PT PT81590A patent/PT81590B/pt unknown
- 1985-12-02 GR GR852890A patent/GR852890B/el unknown
- 1985-12-03 SK SK1687-99A patent/SK168799A3/sk unknown
- 1985-12-03 DE DE199090118215T patent/DE411678T1/de active Pending
- 1985-12-03 PL PL1985287787A patent/PL157926B1/pl unknown
- 1985-12-03 SK SK8804-85A patent/SK279765B6/sk unknown
- 1985-12-03 CZ CS858804A patent/CZ281756B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1985-12-03 HU HU553/86A patent/HU216079B/hu unknown
- 1985-12-03 GE GEAP19851901A patent/GEP19970775B/en unknown
- 1985-12-03 CA CA000496740A patent/CA1341502C/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-12-03 DE DE8686900439T patent/DE3582732D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-03 ES ES549539A patent/ES8800049A1/es not_active Expired
- 1985-12-03 AT AT86900439T patent/ATE63137T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-12-03 WO PCT/US1985/002405 patent/WO1986003520A1/en active IP Right Grant
- 1985-12-03 EP EP86900439A patent/EP0205564B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-03 EP EP90118215A patent/EP0411678B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-03 AU AU53134/86A patent/AU621535B2/en not_active Withdrawn - After Issue
- 1985-12-03 AT AT90118215T patent/ATE71408T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-12-03 PL PL1985256589A patent/PL154180B1/pl unknown
- 1985-12-03 DE DE9090118215T patent/DE3585161D1/de not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-07-24 FI FI863044A patent/FI104261B1/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-07-28 NO NO863050A patent/NO304469B1/no not_active IP Right Cessation
- 1986-08-01 DK DK198603687A patent/DK172953B1/da not_active IP Right Cessation
- 1986-08-04 KR KR8670525A patent/KR890001011B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1988
- 1988-03-18 JP JP63065592A patent/JPH02104284A/ja active Pending
- 1988-03-18 JP JP63065591A patent/JPH0655144B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-09 JP JP63198766A patent/JPH02442A/ja active Pending
-
1991
- 1991-11-15 UA UA5010104A patent/UA44882C2/uk unknown
-
1992
- 1992-12-02 JP JP4323466A patent/JPH07184681A/ja active Pending
-
1993
- 1993-06-08 LV LVP-93-500A patent/LV10505B/lv unknown
- 1993-06-10 LV LVP-93-623A patent/LV10507B/lv unknown
- 1993-10-07 HK HK1055/93A patent/HK105593A/xx not_active IP Right Cessation
- 1993-10-07 HK HK1056/93A patent/HK105693A/xx not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-07-14 MD MD94-0371A patent/MD1639C2/ro not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-05-02 CZ CZ19961274A patent/CZ286557B6/cs not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-08-20 DK DK95197A patent/DK173254B1/da not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-08-20 DK DK199901147A patent/DK173293B1/da not_active IP Right Cessation
- 1999-09-27 FI FI992064A patent/FI105347B/fi not_active IP Right Cessation
- 1999-12-02 CZ CZ19994314A patent/CZ287620B6/cs not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-03-29 DK DK200000527A patent/DK175826B1/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ281756B6 (cs) | DNA sekvence, kodující aminokyselinovou sekvenci lidského erythropoietinu, vektory, obsahující takové DNA sekvence, prokaryotické a eukaryotické hostitelské buňky transformované takovým vektorem, způsob přípravy lidského erythropoietinu, rekombinantní lidský erythropoietin a farmaceutický přípravek, obsahující erythropoietin | |
| EP0148605B1 (en) | Production of erythropoietin | |
| RU2129613C1 (ru) | Способ получения эритропоэтина человека | |
| JPH0144317B2 (cs) | ||
| AU5711199A (en) | Method for the production of erythropoietin | |
| KR930005917B1 (ko) | 에리트로포이에틴의 제조방법 | |
| DD251788A5 (de) | Verfahren zur Herstellung eines menschlichen cDNA-Klons | |
| CZ281542B6 (cs) | Řetězec DNA pro použití k zajištění exprese polypeptidového produktu | |
| AU4252400A (en) | Production of erythropoietin | |
| DD279687A5 (de) | Verfahren zur herstellung von erythropoietin |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20051203 |