HU216079B - Eljárás eritropoietin előállítására - Google Patents

Eljárás eritropoietin előállítására Download PDF

Info

Publication number
HU216079B
HU216079B HU553/86A HU55386A HU216079B HU 216079 B HU216079 B HU 216079B HU 553/86 A HU553/86 A HU 553/86A HU 55386 A HU55386 A HU 55386A HU 216079 B HU216079 B HU 216079B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
priority
epo
erythropoietin
dna
cells
Prior art date
Application number
HU553/86A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT40706A (en
Inventor
Edward Fritsch
Rodney M. Hewick
Kenneth Jacobs
Original Assignee
Genetics Institute, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27418329&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU216079(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genetics Institute, Inc. filed Critical Genetics Institute, Inc.
Publication of HUT40706A publication Critical patent/HUT40706A/hu
Publication of HU216079B publication Critical patent/HU216079B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/44—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

A találmány tárgya eljárás biőlógiailag aktív eritrőpőietintexpresszáló emberi cDNS-klón előállítására. Az eljárás sőrán a)tisztítőtt eritrőpőietin fehérjét tripszinnel hasítanak, és b) az a) lépésben tripszines hasítással nyert fragmensek aminősav-szekvenciája alapján egy őligőnűkleőtid próbakészletet állítanak elő,és c) a b) lépésben kapőtt őligőnűkleőtid próbákkal egy emberi genőmiálisDNS-tárat screenelnek, és d) kiválasztják azőkat a klónőkat, amelyekhez a próbák hibridizálnakés szekvenciálják ezeket a klónőkat annak megállapítására, hőgyeritrőpőietin klónők-e, és e) a d) lépésben nyert klónők közül azőnősítanak egy eritrőpőietinklónt, és f) az e) lépésben kapőtt klónt egy emberi magzat máj-cDNS-táránakscreenelésére használják, és g) kiválasztanak egy eritrőpőietin klónt az f) szerinti magzatmáj-cDNS-tárból. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás eritropoietin előállítására; a találmány humán eritropoietint kódoló klónozott génekre vonatkozik, amelyek expressziós szintje meglepően magas, továbbá ezeknek a géneknek az expresszálódására és az aktív emberi eritropoietin in vitro előállítására.
Az eritropoietin (rövidítése a továbbiakban EPO) egy, a szervezetben keringő glikoprotein, amely magasabbrendű élőlényekben az eritrociták képződését serkenti [Camet és munkatársai: Compt. Rend., 143:384, (1906)]. Az EPO-t néha eritropoézist serkentő faktorként is említik.
Az emberi eritrociták élettartama körülbelül 120 nap. így az összes eritrociták körülbelül 1/120-a pusztul el nap mint nap a retikuloendoteliális rendszerben. Egyidejűleg naponta közelítőleg állandó számú eritrocita képződik, hogy az eritrocitaszint mindig azonos legyen [Guyton: Textbook ofMedical Physiology, 56-60. oldal, W. B. Saunders Co. kiadó, Philadelphia, (1976)].
Az eritrociták a csontvelőben képződnek az eritroblasztok érésével és differenciálódásával, és az EPO egy olyan faktor, amely a kevésbé differenciált sejtekre hat és serkenti eritrocitákká differenciálódásukat [Guyten: Textbook of Medical Physiology, 56-60. oldal, W. B. Saunders Co. kiadó, Philadelphia, (1976)].
Az EPO egy ígéretes új terápiás szer az anémia, elsősorban a renális anémia klinikai kezelésére. Sajnos az EPO alkalmazása a gyakorlati gyógyításban még nem általános, mivel csak kis mennyiségben hozzáférhető.
Az EPO terápiás szerként való felhasználásához figyelembe kell venni a lehetséges antigenitási problémákat, és ezért előnyös, hogy az EPO emberi eredetű nyersanyagból készüljön. így például alkalmazható aplasztikus anémiában vagy más ehhez hasonló betegségben szenvedő, nagy mennyiségű EPO-t kiválasztó betegek vére vagy vizelete. Ezekből a nyersanyagokból azonban korlátozott az ellátás [például White és munkatársai: Rec. Progr. Herm. Rés., 16:219, (1960); Espada és munkatársai: Biochem. Med., 3:475, (1970); Fisher: Pharmacol. Rév., 24:459, (1972) és Gordon: Vitám. Horni. (Ν. Y.), 31:105, (1973)].
Az EPO-preparátumok előállítását általában magas EPO-szintű betegek, például aplasztikus anémiában vagy más hasonló betegségben szenvedők vizeletének koncentrálásával és tisztításával oldják meg (például 4 397 840., 4 303 650. és 3 865 801. lajstromszámú USAbeli szabadalmi leírások). Az ilyen vizelet korlátozott mennyisége az EPO gyakorlati alkalmazásának akadálya, és ezért igen kívánatos, hogy egészséges emberek vizeletéből készítsenek EPO-preparátumokat. Az egészséges emberek vizeletének felhasználásánál az a probléma, hogy annak EPO-tartalma az anémiás betegekéhez képest alacsony. Ezenfelül az egészséges emberek vizelete tartalmaz bizonyos inhibitáló faktorokat, amelyek megfelelően nagy koncentrációban az eritropoézis ellen hatnak, így az ilyen vizeletből származó EPO csak akkor fejt ki megfelelő terápiás hatást, ha előzőleg jelentősen megtisztították.
Az EPO-t birkavérplazmából is ki lehet nyerni, és az EPO szeparálása az ilyen vérplazmából megfelelően hatásos és stabil, vízben oldható preparátumokat eredményez [Goldwasser: Control Cellular Dif. Develop., Part A, 487-494., Alán R. Liss, Inc. kiadó, New York (1981)]. A birka EPO azonban emberekben várhatóan antigén hatású. így tehát, míg az EPO egy olyan terápiás szer, amelyre igény van, a szokásos elválasztási és tisztítási technikák és a természetes források felhasználása nem teszik lehetővé ennek a vegyületnek nagy mennyiségben való előállítását.
A 4 377 513 lajstromszámú USA-beli szabadalmi leírásban Sugimoto és munkatársai ismertetnek egy módszert az EPO nagy mennyiségben való előállítására, amely emberi limfoblasztoid sejtek - beleértve a Namalwa, BALL-1, NALL-1, TALL-1 és JEL sejteket is - in vivő multiplikációján alapul. Az irodalomból ismeretesek mások közleményei az EPO génsebészeti technikákkal való előállításáról. [Ilyen közlemények a következők: Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 80; (12), 1983. 3651-55; EP 104061 számú szabadalmi leírás; Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 81 (9), 1984, 2708-12; Natúré (London) 1985, 313 (6005) 806-10; WO 85261 (EP 148605) számú nyílvánosságrahozatali irat (ez a 2404/85 alapszámú magyar szabadalmi bejelentés); WO 8503079 számú nyílvánosságrahozatali irat, és C. A. 104 P 107914 n 1986.] Lásd például Lee Huang Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 81 2708-2712 (1984). Eddig azonban sem megvalósítható kitanítást, sem pedig a termék kémiai természetét nem közölték. Ezzel szemben jelen leírásunkban megvalósítható kitanítást adunk olyan fehérjék nagy mennyiségben való előállítására, amelyek az emberi EPO biológiai tulajdonságait mutatják. Ezekkel a technikákkal olyan fehéqék is előállíthatok, amelyek kémiailag különbözhetnek az autentikus emberi EPO-tól, de hasonló (egyes esetekben még jobb) tulajdonságokat mutatnak. Az egyszerűség kedvéért minden ilyen fehérjét, amely az emberi EPO biológiai tulajdonságait mutatja, a továbbiakban EPO-nak nevezünk, függetlenül attól, hogy kémiailag azonos azzal vagy sem.
Találmányunk egy olyan gén klónozására vonatkozik, amelynek expresszálódása meglepően nagy mennyiségű emberi EPO-t eredményez, továbbá ennek a génnek az expresszálódására, és ebből az aktív emberi EPO in vitro nagy mennyiségben való előállítására. Ismertetjük az EPO előállításához megfelelő expressziós vektorokat, expressziós sejteket, tisztítási eljárásokat és a többi idevágó eljárási részt is.
Amint azt az alábbiakban részletesen ismertetjük, az EPO-t részlegesen tisztított formában állítottuk elő és tovább tisztítottuk, amíg homogén nem lett, majd tripszinnel hasítottuk, hogy specifikus fragmenseket nyerjünk. Ezeket a fragmenseket tisztítottuk és meghatároztuk aminosav-szekvenciájukat. Ezeknek a szekvenciáknak az alapján EPO-oligonukleotidokat terveztünk meg és szintetizáltunk. Ezeket az oligonukleotidokat egy emberi genomtár screenelésére használtuk, amelyből izoláltunk egy EPO-gént.
Az EPO-gén azonosságát DNS-szekvenciája alapján igazoltuk, amely összeillett számos, tripszines hasítással nyert fehérjefragmenssel, amelyek aminosav-szekvenciáját meghatároztuk. A genomiális klón egy részét hibridizáltuk, így bizonyítottuk, hogy az EPO-mRNS ki2
HU 216 079 Β mutatható a 20 hetes emberi magzat mRNS-ében. Elkészítettük és screeneltük egy emberi magzatmáj cDNSének tárát. Több mint 750000 rekombináns screenelése után 3 EPO-cDNS-klónt kaptunk. A teljes kódoló szekvencia megléte és az 5-végen és 3-végen megtalálható, fontos, nem lefordított szekvenciák alapján ezek közül a kiónok közül 2 teljes hosszúságúnak bizonyult. Ezeket a cDNS-eket expresszáltuk SV-40 vírussal transzformált majomsejtekben [COS-1 sejtvonal; Gluzmann: Cell, 23:175-182, (1981)] és kínai hörcsög petefészeksejtjeiben [CHO-sejtvonal; Urlaub, G., Chasin, L. A.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216-4280, (1980)]. A COSsejtekből előállított EPO biológiailag aktív in vitro és in vivő is. A CHO-sejtekből előállított EPO is aktív biológiailag in vitro és in vivő is.
Az EPO-cDNS-klónnak 14-15 aminosavból álló, érdekes, nyílt leolvasási kerete van iniciátorral és terminátorral, 20-30 nukleotiddal a kódoló régió után. A klónozott EPO-génnel transzfektált E. coli reprezentatív mintája az American Type Culture Collection-ban (Rockville, Maryland, USA) van deponálva ATCC 40153 számon.
Az alábbiakban megadjuk az ábrák és táblázatok leírását.
Az 1. táblázat egy emberi EPO-gén 87 bázispárt tartalmazó exonjának bázisszekvenciája.
Az 1. ábra az EPO-mRNS kimutatását szemlélteti az emberi magzatmáj mRNS-ében.
A 2. táblázat egy EPO-fehérjének a lambda-HEPOFL13 nukleotidszekvenciájából kikövetkeztetett aminosav-szekvenciáját mutatja.
A 3. táblázat az EPO-cDNS nukleotidszerkezetét mutatja a lambda-HEPOFL 13-ban (amelyet sematikusan a 2. ábra szemléltet), valamint az abból kikövetkeztetett aminosav-szekvenciát.
A 3. ábra 4 független emberi EPO genomiális klón DNS-inszertjeinek relatív helyzetét ábrázolja.
A 4. ábra az emberi EPO-gén intron- és exonszerkezetének térképét szemlélteti.
A 4. táblázat a 4. ábrán szemléltetett EPO-gén DNSszekvenciáját mutatja.
Az 5A., 5B. és 5C. ábrák a 91023(B)-vektor konstruálását szemléltetik.
A 6. ábra a COS-1 sejtekben előállított EPO SDS poliakrilamid gélanalizisét mutatja a természetes EPOval összehasonlítva.
Az 5. táblázat a lambda-HEPOFL6 EPO-klón nukleotid- és aminosav-szekvenciáját mutatja.
A 6. táblázat a lambda-HEPOFL8 EPO-klón nukleotid- és aminosav-szekvenciáját mutatja.
A 7. táblázat a lambda-HEPOFL 13 EPO-klón nukleotid- és aminosav-szekvenciáját mutatja.
A 7. ábra a pRKl -4 plazmid sematikus ábrázolása.
A 8. ábra a pdBPV-MMTneo (342-12) plazmid sematikus ábrázolása.
A találmány EPO-gének klónozására és ezeknek a géneknek in vitro expressziójával EPO előállítására vonatkozik.
A szabadalmi és a tudományos irodalomban számos olyan eljárást ismertetnek, amelyek a jelentések szerint rekombináns termékek előállítására használhatók. Általánosságban ezek a technikák egy kívánt génszekvencia izolálásából vagy szintetizálásából, majd ennek a szekvenciának egy prekarióta vagy eukarióta sejtben való expressziójából állnak olyan módszerek alkalmazásával, amelyek szakember számára ismertek. Ha egy bizonyos gént izoláltak, tisztítottak és beépítettek egy transzfervektorba (azaz klónoztak), annak hozzáférhetősége jelentős mennyiségben biztosított. A vektort klónozott génjével átviszik egy megfelelő mikroorganizmusba vagy sejtvonalba, például baktériumokba, élesztőbe, emlőssejtekbe, így COS-1-be (majomvese), CHO-ba (kínai hörcsög petefészek), rovarok sejtvonalaiba és ehhez hasonló sejtekbe, ahol a vektor replikálódik, ahogy a mikroorganizmus vagy a sejtvonal osztódik, és amelyből a vektor szokásos módszerekkel izolálható. így a gén folytonosan megújítható forrása áll rendelkezésre további manipulációkhoz, módosításokhoz és más vektorokba vagy ugyanazon a vektoron belül más génhelyekre való átvitelhez.
Az expresszálódást gyakran úgy érik el, hogy a megfelelő orientációjú és leolvasási keretű klónozott gént egy transzfervektor megfelelő helyére viszik át úgy, hogy a transzlációs leolvasás egy prokarióta vagy eukarióta génből egy fehéijeprekurzor szintézisét eredményezi, amely a klónozott gén által kódolt aminosav-szekvenciát tartalmazza metioninhoz vagy a prokarióta vagy eukarióta génből származó amino-terminális szekvenciához kapcsolva. Más esetekben a transzkripció és transzláció iniciálására szolgáló szignálokat a klónozott gén megfelelő genomiális fragmensével biztosíthatjuk. Amennyiben fehéijeprekurzort állítanak elő, számos specifikus fehérjehasítási technikát alkalmazhatnak a fehéijeprekurzor hasítására egy kívánt ponton úgy, hogy a kívánt aminosav-szekvencia szabaduljon föl, amelyet azután szokásos módszerekkel tisztíthatunk. Bizonyos esetekben a kívánt aminosav-szekvenciát tartalmazó fehéijét előállíthatják specifikus hasítási technika alkalmazása nélkül is, és ki is juttathatják a sejtből a sejten kívüli tápközegbe.
Az emberi EPO genomiális kiónjának izolálása során az aplasztikus anémiában szenvedő betegek vizeletéből nyert emberi EPO-t a homogenitás eléréséig tisztítottuk. Ennek a tisztított EPO-nak proteáz-tripszinnel végzett teljes hasítása fragmenseket eredményezett, amelyeket reverz fázisú nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC-vel) választottunk el és a gradiens frakciókból nyertünk ki, majd mikroszekvencia analízisnek vetettünk alá. A tripszines hasítással nyert fragmensek szekvenciáit a 3. ábrán aláhúztuk és a továbbiakban részletesen ismertetjük. Két aminosav-szekvenciát, a ValAsn-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lys-t és a Val-Tyr-Ser-Asn-PheLeu-Arg-ot oligonukleotid próbák megtervezésére választottunk ki (az első, tripszines hasítással nyert fragmensből egy 17 nukleotid hosszúságú 32-szeresen degenerált és egy 18 nukleotid hosszúságú 128-szorosan degenerált oligonukleotid készletet, a második fragmensből pedig két, egyenként 14 nukleotid hosszúságú és 48szorosan degenerált oligonukleotid készletet kaptunk). A 32-szeresen degenerált, 17 nukleotid hosszúságú készletet egy emberi genomiális DNS-tár screenre hasz3
HU 216 079 Β náltuk egy Ch4A-vektorban [Lawn, R. M., Fritsch, E. F., Parker, R. C., Blake, G., Maniatis, T.: Cell, 15:1157, (1978)], a screenhez szükséges szűrők előállítására a módosított, Wee és O’Malley által kidolgozott in situ amplifikálási eljárást [Wee, S. L. C., Dugaiczyk, A., Társai, M. J., Lai, E. C., Catterall, J. F., O’Malley, B. W.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:3688, (1978)] alkalmazva.
Azokat a fágokat, amelyek a 17 nukleotid hosszúságú oligonukleotid hatására hibridizálódtak, kiválasztottuk, kis csoportokba osztottuk és megvizsgáltuk a 14, illetve 18 nukleotidot tartalmazó oligonukleotidokkal együtt is. A 17, 18, illetve 14 nukleotidot tartalmazó készletek hatására hibridizálódó fágokat tarfolt módszerrel (plaque módszerrel) végzett tisztításnak vetettük alá és a fragmentumokat M13-vektorokba szubklónoztuk, hogy szekvenálhassuk Sanger és Coulson didezoxi láncterminációs módszerével [Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-, (1977)]. A 32-szeresen degenerált 17 nukleotid hosszúságú oligonukleotid hatására hibridizálódó régió szekvenciáját az egyik kiónban az 1. táblázat mutatja. Ez a DNS-szekvencia egy nyílt leolvasási kereten belül tartalmazza azokat a nukleotidokat, amelyek pontosan képesek kódolni a tripszines hasítással kapott fragmenseket, amelyeket előzőleg a 17 nukleotidot tartalmazó oligonukleotid készlet létrehozására használtunk. Ezenkívül a DNS-szekvencia elemzése azt mutatta, hogy a 17 nukleotidos oligonukleotid hatására hibridzálódó régió egy 87 bázispámyi exonban helyezkedik el, potenciális inszert akceptor- és donorhelyek által körülvéve.
Annak megerősítésére, hogy ez a két klón (itt lambda-HEPO 1-nek és lambda-HEPO2-nek nevezzük őket) EPO genomiális klón, további exonokat szekvenáltunk, amelyek más, tripszines hasítással kapott fragmenseket kódoló információt tartalmaztak.
Az EPO-cDNS kiónok izolálása során először 20 hetes emberi magzat máj-mRNS-ének Northemelemzését [Derman, E., Krauter, K., Walling, L., Weinberger, C., Ray, N., Damell, J. T.: Cell, 23:731-, (1981)] végeztük el, olyan 95 nukleotidos egyfonalas próbával, amely az 1. táblázatban szemléltetett, 87 bázispárt tartalmazó exon egy részét magában foglaló Ml 3klónból készült. Amint a 2. ábrán látható, a magzat májmRNS-ében erős jelzést lehetett megfigyelni. Annak pontos azonosítására, hogy ez a sáv az EPO-mRNS-től származik, ugyanazt a próbát a magzati máj-mRNS lambda-bakteriofágban levő cDNS-tárának screenjére is felhasználtuk [Toole, J. J., Knopf, J. L., Wezney, J. M., Sultzman, L. A., Buecker, J. L., Pittman, D. D., Kaufman, R. J., Brown, E., Shoemaker, C., Orr, E. C., Amphlett, G. W., Foster, W. B., Coo, M. L., Knutsen, G. J., Fass, D. N., Hewick, R. M.: Natúré in press]. Több hibridizációs kiónt kaptunk; 25 000 screenelt rekombinánsra számítva körülbelül 1 volt pozitív. Ezeknek a kiónoknak (lambda-HEPOFL13 és lambda-HEPOFL8) teljes nukleotid- és ebből kikövetkeztetett aminosavszekvenciája a 7. és 8. ábrán látható. Az EPO-t kódoló információ a cDNS 5-vég felőli részén helyezkedik el 594 nukleotidnyi részen belül, és magában foglal egy igen hidrofób 27 aminosavnyi leader-szekvenciát és a
166 aminosavnyi fehérjét kódoló részt.
Az így kapott fehérje N-terminális végének azonosítása az aplasztikus anémiában szenvedő betegek által kiválasztott fehéije N-terminális szekvenciáján alapult (1. táblázat) Goldwasser [Goldwasser, E.: Blood Suppl., 1, 58, xlii (kivonat), (1981)], Sue és Sytkowski [Sue, J. M., Sytkowski, A. J.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:3651-3655, (1983)] és Yamagawa [Yamagawa, S., Hirade, K., Chnota, H., Sasaki, R., Chiba, H., Veda, M., Gete, M.: J. Bioi. Chem., 259:2707-2710, (1984)] módszere szerint. Jelenleg nem tudjuk, hogy ez az N-terminális szekvencia (Ala-Pro-Pro-Arg-) a tényleges, a keringésben részt vevő EPO-n található N-terminális szekvenciát képviseli, vagy a vesében vagy a vizeletben valamilyen hasítás játszódik le.
A 2. és 3. táblázatban aláhúzott aminosav-szekvenciák azokat a tripszines hasítással nyert fragmenseket vagy az N-terminális szekvenciának azt a részét jelölik, amelyre fehéijeszekvencia információnk volt. A kikövetkeztetett aminosav-szekvencia tökéletesen megegyezik a tripszines hasítással nyert, szekvenált ffagmensekkel, igazolva, hogy az izolált gén kódolja az emberi EPO-t.
Megállapítottuk az emberi EPO-gén szerkezetét és szekvenciáját. Négy független emberi EPO genomiális klón DNS inszerciós szekvenciáinak relatív helyzetét szemlélteti a 4A. ábra. Ezeknek a klónozott DNS-eknek oligonukleotid próbákkal és különböző, az EPO-cDNS kiónok két osztályából készített próbákkal végzett hibridizációs analízise alapján az EPO-gént azon a körülbelül 3,3 kb-nyi régión belül helyeztük el, amelyet a 4A. ábrán a sötét vonal jelöl. Ennek a régiónak teljes szekvenciaanalízise (vő. 4. példa) és a cDNS kiónokkal való összehasonlítás az EPO-gén intron- és exonszerkezetének a 4B. ábrán látható térképét eredményezte. Az EPO-gén 5 exonra oszlik. Az I exon egy része, a teljes II, III és IV exon és az V exon egy része tartalmazza a fehérjét kódoló információt. Az I exon fennmaradó része az 5-vég, az V exon fennmaradó része a 3-vég nem lefordított szekvenciáit kódolja.
Megvalósítottuk az EPO időleges expresszióját COS-sejtekben. Annak bizonyítására, hogy a biológiailag aktív EPO expresszálódhat egy in vitro sejtkultúrában, COS-sejt expressziós vizsgálatokat végeztünk [Hewick, R. M., Hunkapiller, Μ. E., Hood, L. E., Dreyer, W. J.: J. Bioi. Chem., 256:7990-7997, (1981)]. Az időleges expresszálódás vizsgálatához használt vektort, a p91023(B)-t az 5. példában ismertetjük. Ez a vektor tartalmazza az adenovírus fő késői promoter génjét, egy SV40 poliadenilezési szekvenciát, egy SV40 őri replikációs kiindulópontot, SV40 enhancert és az adenovírus VA-génjét. A lambda-HEPOFL 13-ban levő cDNS inszerciós szekvenciát (vő. 8. ábra) a p91023(B) vektorba ékeltük be (inszertáltuk), az adenovírus fő késői promoter génje előtt. Az új vektornak a pPTFL 13 jelet adtuk.
órával azután, hogy ezt a vektorkonstrukciót transzfekcióval bevittük a COS-1 sejtek M6 törzsébe [Horewitz és munkatársai: J. Mól. Appl. Génét.,
HU 216 079 Β
2:147-149 (1983)], a sejteket mostuk, szérummentes közegbe vittük át és 48 órával később a sejteket feldolgoztuk. Ezután megvizsgáltuk az EPO-kibocsátás szintjét a tenyészet felülúszójában kvantitatív radioimmunoassay [Sherwood, J. B., Goldwasser, E.: Blood, 54:885-893, (1979)] alkalmazásával. Mint az I. táblázatban (6. példa) látható, az immunológiailag reaktív EPO expresszálódott. Megvizsgáltuk a COS-1 sejtek által termelt EPO biológiai aktivitását is. Egy külön kísérletben az EPO-cDNS-t tartalmazó vektort a lambda-HEPOFLl3-ból COS-1 sejtekbe vittük át transzfekcióval és a közeget a fent leírt módon feldolgoztuk. A közegben levő EPI mennyiségét két in vitro biológiai vizsgálati módszer, a 3H-tymidine és a CFU-E [Krystal, G.: Exp. Hematol., 11:649-660, (1983), illetve Borsch, N., Golde, D. W.: In vitro Aspects of Erythropoiesis, M. J. Murphy kiadó, New York: Springer-Verlag, (1978)] valamelyikével, és két in vivő vizsgálati módszer, a hypoxiás egéren és az éheztetett patkányon végzett vizsgálat [Cotes, P. M., Bangham, D. R.: Natúré, 191:1065-, (1961), illetve Goldwasser, E., Gross, M.: Methods in Enzymol., 37:109-121, (1975)] valamelyikével határoztuk meg (vö. II. táblázat, 7. példa). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a COS-1 sejtekben biológiailag aktív EPO termelődik. Western szűrőpapíros eljárás alkalmazásával, egy poliklonális anti-EPO antitestet használva, a COS-sejtek által termelt EPO mozgékonysága SDS-poliakrilamid géleken azonos az emberi vizeletből előállított természetes EPO mozgékonyságával (8. példa). így a COS-1 által termelt EPO glikozileződésének mértéke hasonló lehet a természetes EPO-éhoz.
Más promotereket tartalmazó különböző vektorok is alkalmazhatók a COS-sejtekben vagy más emlőssejtekben vagy eukariótasejtekben. A találmány megvalósítása során alkalmazható ilyen egyéb promoterek az SV40 korai és késői promoterek, az egér metallothionein promoter, a madarak és az emberek retrovírusainak hosszú terminális ismétlődéseiben talált promoterek, a bacculovírus poliéder gén promotere és mások. A találmány szerinti megoldásban alkalmazható más sejttípusok például az E. coli, élesztők, emlőssejtek, például CHO-sejtek (kínai hörcsög petefészeksejtjei), Cl27 (majom epithelium), 3T3 (egér fibroblaszt), CV-1 (afrikai zöldmajom vese) és rovarsejtek, például Spedeptera frugiperda és Drosophila melanogaster sejtjei. Ezek az alternatív promoterek és/vagy sejttípusok lehetővé tehetik az EPO-expresszió időzítésének vagy szintjének szabályozását, sejtspecifikus EPO létrehozását, vagy EPO-t termelő sejtek tenyésztését nagy mennyiségben, olcsóbb és könnyebben ellenőrizhető körülmények között.
Egy olyan expressziós rendszer, amely megtartja az emlős expresszálódás előnyeit, de kevesebb időt igényel magas szintű expressziós sejtvonal létrehozására, kialakítható egy rovarsejtvonalból és egy olyan DNS-virusból, amely reprodukálódik ebben a sejtvonalban. A vírus egy nukleáris polyhedrosis vírus, amelynek kétfonalas gyűrűs DNS-genomja 128 kilobázisos. A nukleokapszid bot alakú, és két formában pakolva található meg, az egyik egy nem beburkolt forma, amelynél a vírus a membránon helyezkedik el, a másik egy beburkolt forma, egy fehérjekristályba pakolva a fertőzött sejt sejtmagjában. Ezek a vírusok rutineljárással szaporíthatok in vitro rovarsejtkultúrában és alávethetők bármilyen állati virológiái rutineljárásnak. A sejt tápközege jellemzően egy sós tápoldat és 10% boíjúmagzatszérum.
Az in vitro vírusnövekedés akkor indul meg, ha egy nem beburkolt vírus behatol egy sejtbe és a sejtmag felé halad, ahol replikálódik. A replikálódás a magban történik. A vírus behatolásának kezdeti fázisában (8-18 órával a fertőzés után) nukleokapszidok gyűlnek össze a sejtmagban és ezt követően áthatolnak a plazmamembránon mint nem beburkolt vírusok, szétterjesztve a fertőzést a sejtkultúrában. Ezenfelül a nukleokapszidok egy része az ezt követő időben (több mint 18 órával a fertőzés után) a sejtmagban marad és beburkolódik egy fehérjemátrixba, amelyet poliédrikus befoglaló testnek (polyhedral inclusion body, a továbbiakban PIB) neveznek. Ez a forma sejtkultúrában nem fertőző. A mátrix egy polyhedrin nevű fehérjéből áll, amelynek molekulatömege 33 kd. Minden PIB körülbelül 1 mm átmérőjű és egy sejtmagban 100 PIB lehet. Nyilvánvalóan nagy mennyiségű, a teljes sejtfehérje 25%-át kitevő polyhedrin keletkezik az infekciós ciklus későbbi szakaszában.
Mivel a PIB nem játszik szerepet az in vitro replikációs ciklusban, a polyhedrin gént el lehet távolítani a víruskromoszómából anélkül, hogy ez az in vitro életképességet befolyásolná. A vírust expressziós vektorként használva a polyhedrin gén kódoló régióját az expreszszálandó idegen DNS-sel helyettesítettük, amelyet így a polyhedrin promoter ellenőrzése alá helyeztünk. Ez egy olyan vírus fenotípust eredményezett, amely nem termel PIB-et.
Ezt a módszert több kutatócsoport is alkalmazta, amelyek közül a legjelentősebbek Penneck és munkatársai és Smith és munkatársai. Penneck és munkatársai [Gregory D. Penneck, Charles Shoemaker, Lois K. Miller: Molecular and Cell Biology, 3:84,399-406. oldal] egy bakteriális fehérje, a β-galaktozidáz magas szintű expresszálódását írták le polyhedrin promoter ellenőrzése alatt.
Egy másik nukleáris polyhedrosis vírusból származó expressziós vektort írnak le Smith és munkatársai [Gale E. Smith, Max D. Summers, M. J. Fraser: Molecular and Cell Biology, 1983. május 16., 2156-2165. oldal]. Vektoruk hatékonyságát emberi β-interferon expressziójával bizonyították. Úgy találták, hogy a szintetizált termék glikozileződött és kiválasztódott a rovarsejtekből, amint az várható volt. A 14. példában az Autographa califomica nukleáris polyhedrosis vírus (AcNPV) polyhedron génjét tartalmazó plazmid módosítását ismertetjük, amely lehetővé teszi az EPO-gén könnyű beékelését a plazmidba, így az a polyhedrin promoter transzkripciós ellenőrzése alá kerül. A kapott DNS-t vad típusú AcNPV-ből származó érintetlen kromoszóma DNS-sel együtt rovarsejtekbe juttatjuk be kotranszfekcióval. A genetikus rekombináció azt eredményezi, hogy a plazmidból származó DNS helyettesíti az AcNPVC polyhedrin gén régióját. A kapott rekombináns vírust annak
HU 216 079 Β alapján azonosíthatjuk a vírusok utódai közül, hogy az tartalmazza az EPO-gén DNS-szekvenciáját. Várható, hogy ez a rekombináns vírus a rovarsejt újrafertőzésekor EPO-t termel.
Az EPO expresszálódásának példáit CHO, Cl27, 3T3 és rovarsejtekben a 10. és 11. példákban (CHO), a 13. példában (Cl27 és 3T3) és a 14. példában (rovarsejtek) adjuk.
A CHO-sejtekben all. példában leírt módon előállított rekombináns EPO-t szokásos oszlopkromatográfiás módszerrel tisztítottuk. A glikoproteinben jelenlévő cukrok relatív mennyiségét két egymástól független módszerrel vizsgáltuk [Reinhold: Methods in Enzymol., 50:244-249 (metanolízis), illetve Takomete, H. és munkatársai: Anal.Biochem., 145:245, (1985), (piridilaminálás, független sziálsav-meghatározással együtt)]. A két módszerrel kapott eredmények teljesen összhangban voltak. Több meghatározást végeztünk ezekkel a módszerekkel, és a következő átlagértékeket kaptuk (összehasonlítási célból az N-acetil-glükóz-amin menynyiségét 1 -nek vettük):
Cukor Relatív moláris mennyiség
N-acetil-glükóz-amin 1
hexózok: 1,4
galaktóz 0,9
mannóz 0,5
N-acetil-neuraminsav 1
fiikóz 0,2
N-acetil-galaktóz-amin 0,1
Érdemes megjegyezni, hogy mindkét független cukorelemzési módszer alkalmazásával reprodukálható módon jelentős mennyiségű fuktózt és N-acetil-galaktózamint mutattunk ki. Az N-acetil-galaktóz-amin jelenléte O-glikozilezésre utal a fehérjében. Az O-glikozilezésre mutat a glikoprotein SDS-PAGE analízise is, amelyet a glikoprotein különböző glikozidbontó enzimek kombinációjával végrehajtott hasítása után végeztünk. Különösen jelentős, hogy a glikoprotein összes nitrogénatomhoz kapcsolt szénhidrátgyökének peptidendo-F-N-glikozidáz enzimmel való lehasítása után a protein molekulatömegét tovább lehetett csökkenteni neuraminidázos hasítással, amint azt az SDS-PAGE analízissel meghatároztuk.
A tisztított rekombináns EPO in vitro biológiai aktivitását lépsejt proliferációs bioassay-vel [Krystal, G.: Exp. Hematol., 11:649, (1983)] határoztuk meg, a fehérjemeghatározással kapcsolatos számításokat az aminosavösszetétel alapján végezve. Többszöri meghatározás alapján a tisztított rekombináns EPO in vitro specifikus aktivitását 200 000 egység/mg feltétjénél nagyobb értéknek számítottuk. Az átlagérték 275000-300000 egység/mg fehéije körül volt. Ezenkívül 300000 fölötti értéket is észleltünk. Az in vivő [policitémiás egéren vizsgált, Kazal and Erslov: Am. Clinical Láb. Sci., Vol. B, 91. oldal, (1975) közleményben ismertetett módszer] és az in vitro aktivitás aránya a rekombináns anyagnál 0,7-1,3 volt.
Érdekes összehasonlítani a fenti glikoprotein jellemzését azzal a jellemzéssel, amelyet korábban közöltek egy rekombináns CHO-ból nyert EPO-ról a WO 85/02610 számú közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentésben (közzétéve 1985. június 20-án). Ennek a bejelentésnek a 65. oldalán leírt megfelelő összehasonlító cukoranalízis szerint a fiikóz és az N-acetil-galaktózamin mennyisége nulla volt, a hexózok N-acetil-galaktóz-aminhoz viszonyított arányára pedig 15,09:1-et adtak meg. Az N-acetil-galaktóz-amin hiánya az O-glikozilezés hiányát jelzi ebben a korábban leírt glikoproteinben. Ezzel az anyaggal szemben a találmányunk szerinti, korábban ismertetett rekombináns CHO-ból előállított EPO jelentős és reprodukálhatóan kimutatható mennyiségben tartalmaz mind fukózt, mind pedig Nacetil-galaktózamint, a hexánok mennyisége körülbelül egytizede az ott megadottnak és az O-glikozilezés megléte jellemzi. Ezenkívül a találmány szerinti, korábban ismertetett CHO-ból nyert rekombináns EPO nagy specifikus aktivitása közvetlen kapcsolatban lehet jellegzetes glikozilezettségével.
A találmány szerinti klónozott EPO-gének prokarióta vagy eukarióta expressziójával nyert biológiailag aktív EPO-t orvosok és/vagy állatorvosok emlősfajták in vivő kezelésére használhatják. A hatóanyag mennyisége természetesen a kezelendő elváltozás súlyosságától, a beadás módjától és az EPO specifikus aktivitásától függ, és azt végső soron a gyakorló orvos vagy állatorvos állapítja meg. A gyakorló orvos által meghatározott aktív EPO-mennyiségre is úgy hivatkozunk leírásunkban, mint „EPO-kezelés szempontjából hatásos” mennyiségre. így például birkák krónikus veseelégtelenséggel társult indukált hipoproliferatív anémiájának kezelésére az EPO hatásos napi mennyiségét 10 egység/kg-nak találták 15-40 napig [Eschbach és munkatársai: J. Clin. Invest., 74:434, (1984)].
Az aktív EPO-t bármilyen, a kezelendő állapotnak megfelelő úton adagolhatjuk. Az EPO-t előnyösen befecskendezzük a kezelt emlős véráramába. Szakember könnyen megérti, hogy az előnyös beadási mód a kezelendő állapot szerint változik.
Az aktív EPO beadható tiszta vagy lényegében tiszta formában is, előnyösebb azonban gyógyszerkészítmény alakjában adagolni.
A találmány szerinti, humán vagy állatgyógyászati célra szolgáló gyógyszerkészítmények egy aktív EPOfehétjéből, amelyet fent ismertettünk, egy vagy több gyógyászatilag elfogadható hordozóból és előnyösen más segédanyagokból állnak. A hordozóknak „elfogadhatók”-nak kell lenniük abban az értelemben, hogy összeférhetők legyenek a készítmény több alkotórészével és ne legyenek ártalmasak arra, aki a készítményt kapja. Kívánatos, hogy a készítmény ne tartalmazzon oxidálószereket és más olyan anyagokat, amelyekről ismeretes, hogy a peptidekkel összeférhetetlenek. A készítményeket célszerűen egységadagok formájában, a gyógyszerkészítésben jól ismert módszerek bármelyikével lehet kiszerelni. Mindegyik módszer magában foglal egy keverési lépést, amelynek során a hatóanyagot érintkezésbe hozzuk az egy vagy több segédanyagot tartalmazó hordozóval. Általánosságban a készítményeket úgy állítjuk elő, hogy a hatóanyagot egyenletesen és alaposan összekeverjük folyékony hordozókkal vagy finoman porított szilárd hordozókkal vagy mindkettővel,
HU 216 079 Β majd ha szükséges, a terméket a kívánt formában kiszereljük.
A parenterális beadásra szolgáló készítmények célszerűen magukba foglalják a hatóanyag steril vizes oldatait olyan oldatokkal együtt, amelyek előnyösen izotóniásak a készítményt kapó vérével. Ilyen készítményeket célszerűen úgy állítunk elő, hogy a szilárd hatóanyagot vízben oldjuk és a kapott oldatot sterilizáljuk. Az oldatot egységadagokban vagy több adagot tartalmazó kiszerelésben készíthetjük, például lezárt ampullában vagy üvegben.
A leírásban használt „EPO/cDNS” megjelölés magában foglalja az ATG kodon által megelőzött kódoló EPO/cDNS gént és az EPO-fehéije alléi variációit kódoló EPO/cDNS-t. Egy alléit a 2. és 3. táblázat szemléltet. Az „EPO-fehéije” magában foglalja az EPO-fehéije 1-metionin-származékát (Met-EPO) és az EPO-fehérje alléi variációit. A 2. táblázat szekvenciája által szemléltetett EPO-fehéije az Ala-Pro-Pro-Arg- szekvenciával kezdődik, amelynek elejét a 2. táblázatban az „1” számmal jelöltük. A Met-EPO a Met-Ala-Pro-Pro-Argszekvenciával kezdődne.
A következő példák a találmány jobb megértését segítik elő. A leírt eljárásban módosítások hajthatók végre anélkül, hogy a találmány szellemétől eltérnénk. A hőmérsékletértékeket °C-ban és korrigálatlanul adjuk meg.
Példák
I. példa: Egy EPO genomiális klón izolálása
Az EPO-t aplasztikus anémiában szenvedő betegek vizeletéből lényegében a már leírt módon tisztítottuk [Miyake, és munkatársai: J. Bioi. Chem., 252:5558, (1977)], azzal az eltéréssel, hogy a fenolos kezelést kihagytuk és 80 °C-on 5 percig végzett hőkezeléssel helyettesítettük a neuraminidáz inaktiválására. A tisztítás utolsó lépése a C-4 Vydac HPLC oszlopon (The Separation Group) végzett frakcionálás volt, 0-95% acetonitril gradiens alkalmazásával 0,1% trifluor-ecetsav jelenlétében 100 percig. Az EPO elhelyezkedését a gradiensben gélelektroforézissel és a fő csúcsok N-terminális szekvenciaanalízisével [Yanagawa, S., Híradó, K., Ohneta, H., Sasaki, R., Chiba, H., Voda, M., Goto, M.:
J. Bioi. Chem., 259:2707-2710, (1984); Goldwasser, E.: Blood Suppl. 1, 58, xlii (kivonat), (1981); Sue, J. M., Sytkowski, A.: J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:3651-3655, (1983)] határoztuk meg. Az EPO körülbelül 53% acetonitrilnél eluálódott és körülbelül 40%-át alkotta a reverz fázisú HPLC-nek alávetett fehérjemennyiségnek. Az EPO-t tartalmazó frakciókat 100 μΐ-re pároltuk be, pH-jukat ammónium-hidrogénkarbonáttal 7,0-re állítottuk be és teljesen hasítottuk 2%-os TPCK-val kezelt tripszinnel (Werthington) 18 óra alatt 37 °C hőmérsékleten. A tripszines hasítással kapott fragmenseket azután a fent leírt módon reverz fázisú HPLC-nek vetettük alá. Az optikai sűrűséget 280 és 214 nm-en mértük. A jól elkülönülő csúcsokat adó frakciókat egészen kis nedvességtartalomra pároltuk be és közvetlenül N-terminális aminosav-analízisnek [Towbin, H., Stacholin, T., Gordon, J.: Proc. Natl. Acad, Sci., 76:4380-, (1979)] vetettük alá egy Applied
Biosystem Model 480A típusú gázfázisú szekvenciaelemzővel. A kapott szekvenciákat a 3. ábrán aláhúzással jelöltük. Amint ezt már leírtuk, a tripszines hasítással nyert fragmensek közül kettőt kiválasztottunk oligonukleotid próbák szintetizálására. A Val-Asn-Phe-TyrAla-Trp-Lys szekvenciából (a 3. táblázat 46-52. aminosavai) a
AAA
TTCCANGCGTAGAAGTT képletű 32-szeresen degenerált 17 nukleotidból álló oligonukleotidot, és a
AAA
CCANGCGTAGAAGTTNAC képletű 128-szeresen degenerált 18 nukleotidból álló oligonukleotidot állítottuk elő. A Val-Tyr-Ser-Asn-PheLeu-Arg szekvenciából (a 3. ábra 144-150. aminosavai) két, 32-szeresen degenerált, egyenként 14 oligonukleotidot tartalmazó készletet állítottunk elő, amelynek képlete
TTGN Τ T TTGN Τ T
TACACCTAACTTCCT TACACCTAACTTCTT és amelyek a leucin kodon első pozíciójában különböznek. Az oligonukleotidokat az 5-végen 32P izotóppal jelöltük meg polinukleotid-kináz (New England Biolabs) és gamma 32P-ATP (New England Nuclear) alkalmazásával. Az oligonukleotidok specifikus aktivitása 1000 és 3000 Ci/mmol nukleotid között mozgott. Lambda-bakteriofágban tárolt emberi DNS-genomtárat [Lawn, R. N., Fritsch, E. F., Parker, R. C., Blake, G., Maniatis, T.: Cell, 15:1157, (1978)] screeneltünk, az eredetileg Woo és munkatársai által leírt in situ amplifíkációs eljárást [Woo,
S. L. C., Dugaiczyk, A., Társai, M. J., Lai, E. C., Catterall, J. F., O’Malley, B. W.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:3688-, (1978)] módosított formában alkalmazva. Körülbelül 3,5 χ 105 fágot helyeztünk el Petri-csészékben 6000 fág/150 mm-es Petri-csésze sűrűségben, NZCYM táptalajon, [NZ amin 10 g (DIFCO), NaCl 5 g, Kazaminosav 1 g, Bacto-yeast 5 g MgSO4-7H2O 2 g; pH = 7,5 NaOH-val], és a tenyészeteket 37 °C-on inkubáltuk, amíg a tarfoltok (plaque-ok) láthatóvá váltak, de még kicsik voltak (körülbelül 0,5 mm). 1 órányi 4 °Cra való hűtés után a tarfolt mintázat replikáinak másolatát nejlonmembránokra (New England Nuclear) vittük át, és egy éjszakán át inkubáltuk 37 °C-on új NZCYM lemezeken. Ezután a szűrőket denaturáltuk és semlegesítettük, mindegyiket 10—10 percig lebegtetve 0,5 N nátrium-hidroxidból és 1 M nátrium-kloridból, illetve 0,5 M triszpufferból (pH=8) és 1 M nátrium-kloridból álló vékony filmen. A szűrőket vákuumkemencében 80 °C-on szárítottuk 2 óra hosszat, majd 5xSSC-vel, 0,5% SDS-sel mostuk 1 órát és a szűrő felületén levő sejttörmeléket egy nedves textildarabbal finoman ledörzsöltük. Ez a dörzsölés csökkentette a próba háttérkötődését a szűrőhöz. A szűrőket ezután vízzel leöblítettük és előhibridizáltuk 4-8 óra hosszat 48 °C-on, 3 M tetrametil-ammóniumklorid, 10 mM nátrium-foszfát (pH=6,8), 5xDenhardtreagens, 0,5% SDS és 10 mM EDTA alkalmazásával. Ezután hozzáadtuk a 32P izotóppal megjelölt 17 nukleotidot tartalmazó oligonukleotidot 0,1 pmol/ml koncentrációban és a hibridizálást 48 °C-on 72 órát foly7
HU 216 079 Β tattuk. A hibridizálás után a szűrőket alaposan mostuk 2xSSC-vel (0,3 M nátrium-klorid és 0,03 M nátriumcitrát, pH=7) szobahőmérsékleten, majd 3 M TMAC1 és 10 mM nátrium-foszfát elegyével (pH=6,8) 1 órát szobahőmérsékleten és 5-15 percet a hibridizálási hőmérsékleten. Erősítő ernyővel végzett 2 napos autoradiográfiával körülbelül 120 erős kettős jelet mutattunk ki. A pozitív jelzést adó oligonukleotidokat kiválasztottuk és nyolcas csoportokba osztottuk, lemezekre helyeztük és újra screeneltük három párhuzamosban úgy, hogy a 14 nukleotidos készlet felét használtuk egy-egy szűrőn és a 17 nukleotidost a harmadikon. A körülmények és a lemezekre helyezett és hibridizáláshoz használt 17 nukleotidos oligonukleotid a már leírtak voltak azzal az eltéréssel, hogy a 14 nukleotidos oligonukleotiddal a hibridizálást 37 °C-on végeztük. Az autoradiográfiás mérés után a próbát eltávolítottuk a 17 nukleotidos szűrőről 50%-os formamiddal 20 percig szobahőmérsékleten végzett kezeléssel és a szűrőt újra hibridzáltuk 52 °C-on a 18 nukleotidos próbával. Mindhárom próba két független fághoz hibridizált. Ezek közül a fágok közül az egyik (amelyet itt lambda-HEPO 1-nek nevezünk) DNS-ét Sau3Aval teljesen emésztettük és Ml 3-vektorba szubklónoztuk DNS-szekvenciaanalízisre Sanger-Coulson didezoxi láncterminációs módszerét [Sanger, F., Nicklon, S., Coulson, A. R.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-, (1977)] alkalmazva. A tripszines hasítással nyert EPOffagmenst (aláhúzott régió) kódoló, nyílt leolvasási keret nukleotidszekvenciáját és az ebből kikövetkeztetett aminosav-szekvenciát ismertetjük. Az intronszekvenciákat kisbetűkkel, az exonszekvenciákat (87 nukleotid) nagybetűkkel jelöltük. Azokat a szekvenciákat, amelyek megegyeznek a feltételezett splice akceptor- (a) és donorhelyekkel (d), aláhúztuk (vö. 4. táblázat).
2. példa: Emberi magzat máj-mRNS-ének Northomanalízise pg emberi magzatmáj-mRNS-t (20 hetes magzat májából) és felnőtt máj-mRNS-t elektroforézisnek vetettünk alá 0,8% agaróz formaldehid gélen, majd átvittük nitrocellulózra Derman és munkatársai módszerével [Cell, 23:731, (1981)]. Ezután egy M13-templátból, amely az 1. ábrán szemléltetett inzertet tartalmazza, egyfonalas próbát készítettünk. A primer egy 20 nukleotidot tartalmazó oligonukleotid, amely ugyanabból a tripszines hasítással nyert fragmensből származott, mint a 17 nukleotidos próba. A próbát az Anderson és munkatársai [Anderson, S., Kingston, I. B.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:6836-6842, (1983)] által leírt módszerrel készítettük, azzal az eltéréssel, hogy az Smal-el végzett emésztés után (amellyel a kívánt, 95 nukleotid hosszúságú, 74 nukleotidnyi kódoló szekvenciát tartalmazó próbát kaptuk) a kis fragmentumot az M13-templátból tisztítottuk kromatográfiásan szepharose C14B oszlopon 0,1 N nátrium-hidroxid és 0,2 M nátrium-klorid elegyével. A szűrőt ennek a próbának körülbelül 5 χ 106 cpm-éhez hibridizáltuk 12 órán keresztül, 68 °C-on, 2xSSC-vel mostuk 68 °C-on és 6 napig exponáltuk erősítő ernyővel. Egy 1200 nukleotidos egyfonalas marker mRNS-t (a nyíl jelzi) a szomszédos sávon futtattunk (1. ábra).
3. példa: Magzatmáj-cDNS
A 2. példában leírttal azonos próbát készítettünk és egy lambda-Ch21A vektorban készített magzat májcDNS-tárat screeneltünk vele [Toole és munkatársai: Natúré in press, (1984)] standard tarfolt screenelést [Benton, W. D., Davis, R. W.: Science, 196:180-182, (1977)] alkalmazva, 1 χ 102 * * * 6 tarfolt screenelésével három független pozitív kiónt izoláltunk [itt lambda-HEPOFLónak (1350 bázispár), lambda-HEPOFL8-nak (700 bázispár) és lambda-HEPOFL 13-nak (1400 bázispár) nevezzük őket], A teljes lambda-HEPOFL 13 és lambdaHEPOFL6 inszerciós szekvenciákat az Ml3-ba való szubklónozás után szekvenáltuk (7., illetve 5. táblázat). A lambda-HEPOFL8-nak csak egyes részeit szekvenáltuk, a többit azonosnak tételeztük fel a másik két klónéival (6. táblázat). Az 5-vég és a 3-vég nem lefordított szekvenciáit kisbetűkkel, a kódoló régiót nagybetűkkel jelöltük.
A 2. és 3. táblázatokon a nukleotidszekvencia alatt ábrázolt kikövetkeztetett aminosav-szekvenciát „l”-gyel kezdve számozzuk a fehérje első aminosavánál kezdve. A feltételezett leader peptidet az aminosav megjelöléseknél teljes nyíllal jelöltük. A fehérjében lévő ciszteingyököket külön megjelöltük „SH”-val, a potenciális Nglikozilezés helyét pedig csillaggal. Az aláhúzott aminosavak azokat a gyököket jelentik, amelyeket az 1. példában leírt módon, N-terminális fehérjeszekvenálással vagy az EPO tripszines hasításával nyert ffagmensek szekvenálásával azonosítottunk. A részleges aláhúzás az aminosav-szekvencia olyan gyökeit jelöli, amelyeket bizonyos tripszines hasítással nyert ffagmensekben nem tudtunk kétségtelenül azonosítani. A lambda-HEPOFL6, lambda-HEPOFL8 és lambda-HEPOFL-13 cDNS-klónokat deponáltuk, és azok hozzáférhetők az American Type Culture Collection-ban, Rockville, Maryland, USA, ATCC 40156, ATCC 40152 és ATCC 40153 számon.
4. példa: Az EPO-gén genomszerkezete
Négy független genomiális klón (lambda-HEPO 1, 2, 3 és 6) relatív méretét és helyzetét a 3. ábra átfedésben levő vonalai szemléltetik; a kiónok a HaelII/AluI tárból származnak. A megvastagított vonal az EPO-gén elhelyezkedését szemlélteti. Megadtunk egy skálát (kilobázisban) és az ismert restrikciós endonukleáz hasítási helyeket is. Az EPO-gént tartalmazó régiót mindkét szélen teljesen szekvenáltuk a régió mentén irányított, exonukleáz-III-mal kiváltott sorozatos hasítások révén. Az EPO-mRNS-t kódoló öt exon sematikus ábrázolását a 4. ábra mutatja. Az I exon pontos 5-vég kötődése jelenleg ismeretlen. Az exonok fehérjét kódoló részét sötét vonallal jelöltük. A régió teljes nukleotidszekvenciáját a 4. táblázatban szemléltettük. Az egyes exonok ismert határait függőleges vonalakkal jelöltük. A lambda-HEPO 1, lambda-HEPO2, lambdaHEPO3 és lambda-HEPO6 genomiális kiónok az American Type Culture Collection-ban vannak deponálva (Rockville, Maryland, USA) és ATCC 40154, ATCC 40155, ATCC 40150, illetve ATCC 40151 számon hozzáférhetők.
HU 216 079 Β
5. példa: A p91023(b) vektor megkonstruálása
A transzformációs vektor pAdD26SVpA(3) volt [Kaufman és munkatársai: Mól. Cell Bioi., 2:1304, (1982)]. Ennek a vektornak a szerkezetét az 5A. ábra mutatja. Röviden ismertetve a plazmid egy egér dihidrofolát-reduktáz (DFHR) cDNS-gént tartalmaz, amely az adenovírus 2 (Ad2) fő késői promoterének transzkripcionális kontrollja alatt áll. Az 5-vég splice helye meg van jelölve az adenovírus-DNS-ben és egy 3-vég splice hely - amely egy immunglobulin-génből származik - az Ad2 fő késői promoter és a DFHR-t kódoló szekvencia között található. Az SV40 korai poliadenilezési helye a DHFR-t kódoló szekvencia előtt helyezkedik el. A pAdD26SVpA(3) prokariota eredetű része pSVOd-ből [Mellon és munkatársai: Cell, 27:279, (1981)] származik, és nem tartalmazza a pBR322 szekvenciákat, melyekről úgy tudják, hogy gátolják az emlőssejtekben való replikálódást [Lusky és munkatársai: Natúré, 293:79,(1981)].
A pAdD26SVpA(3)-t a pCVSVL2 plazmiddá alakítottuk az 5A. ábrán szemléltetett módon. A pAdD26SVpA(3)-t a pAdD26SVpA(3) (d) plazmiddá alakítottuk úgy, hogy a pAdD26SVpA(3)ban levő két Pstl-hely közül egyiket eltávolítottuk. Ezt Pstl-el végzett részleges emésztéssel hajtottuk végre úgy, hogy olyan kevés enzimet alkalmaztunk, hogy egy olyan linearizált plazmid szubpopulációt kapjunk, amelyben csak az egyik Pstl-hely van elhasítva, ezután Klenow-kezelést, a gyűrűs szerkezet helyreállítódását eredményező ligálást, majd az SV40 poliadenilezési szekvenciától a 3-vég felé elhelyezkedő Pstl-hely kiiktatásának ellenőrzésére screenelést végeztünk.
Az adenovírus háromrészes leader és vírushoz kapcsolt (VA) génjeit az 5A. ábrán bemutatott módon inszercióval bevittük a pAdD26SVpA(3) (d)-be. Először a pAdD26SVpA(3) (d)-t PvuII-vel hasítottuk, így a háromrészes leadert tartalmazó három alkotórész 3-vég felé eső részén felnyitott lineáris molekulát kaptunk. Ezután a pJAW 43-at [Zain és munkatársai: Cell, 16:851, (1979)] Xhol-el emésztettük, Klenow-kezelésnek vetettük alá, PvuII-vel emésztettük és a harmadik leader második részét tartalmazó 140 bázispámyi fragmentumot akrilamid gélen végzett elektroforézissel izoláltuk [6% trisz borátpufferben; Maniatis és munkatársai már említett módszerével], A 140 bázispámyi fragmentumot ezután a PvuIIvel emésztett pAdD26SVpA(3) (d)-vel ligáltuk. A ligálással kapott terméket E. coli tetraciklin-rezisztenciájának kialakítására használtuk és a telepeket GrunsteinHogness-eljárással screeneltük, a 140 bázispámyi fragmentumhoz hibridzálódó, 32P izotóppal jelölt próba alkalmazásával. A hibridizálódó telepekből DNS-t nyertünk ki, hogy megvizsgáljuk, hogy a rekonstruált PvuII-hely a 3-végnél vagy az 5-végnél helyezkedik el a második és harmadik adenovírus késői leaderekre specifikus 140 bázispámyi DNS inszerciós szekvenciához képest. A PvuIIhely akkor van megfelelő orientációban, ha a 140 bázisprányi inszerciós szekvencia 5-végénél helyezkedik el. Ezt a plazmidot az 5A. ábrán tTPL-lel jelöltük.
Az SV40 Ava Π D fragmentumát, amely az SV40 enhancer szekvenciát tartalmazza, úgy kaptuk, hogy az
SV40 DNS-ét AVA II-vel emésztettük, a végeket a polimeráz I Klenow-ffagmensével tompává alakítottuk, a fragmentumokhoz Xhol linkereket ligáltunk, Xhol-gyei emésztettük az Xhol -hely felszabadítására, és a negyedik legnagyobb fragmentumot (D) gélelektroforézissel izoláltuk. Ezt a fragmentumot azután az Xhol-gyei hasított pPTL-hez ligáltuk, így a pCVSVL2-TPL plazmidot kaptuk. A pCVSVL2-TPL-ben olyan volt az SV40 D fragmentum orientációja, hogy az SV40 késői promoter azonos orientációjú volt az adenovírus fő késői promoterével.
Az adenovírushoz kapcsolt (VA) géneknek a pCVSVL2-TPL-be való bevitelére először egy olyan pBR322 plazmidot konstruáltunk, amelyik tartalmazta a 2-típusú adenovírus Hind III B fragmentumát. A 2-típusú adenovírust Hind ΙΠ-mal emésztettük és a B fragmentumot gélelektroforézissel izoláltuk. Ezt a fragmentumot inszercióval (beékeléssel) vittük be az előzőleg Hind ΙΠ-mal emésztett pBR322-be. Az E. coli ampicillinre rezisztenssé transzformálása után a rekombinánsokat screeneltük a Hind III B fragmentum inszerciójára és a beékelődési orientációt restrikciós enzimmel végzett emésztéssel határoztuk meg. A pBR322-Ad Hind III B a 2-típusú adenovírus Hind ΙΠ B fragmentumát az 5B. ábrán feltüntetett orientációban tartalmazza.
Amint azt az 5B. ábrán szemléltettük, a VA géneket a pBR322-Ad Hind III B plazmidból Hpa I-el végzett emésztéssel, EcoRI linkerek hozzáadásával és EcoRI-el végzett emésztéssel, majd az 1,4 kilobázisos fragmentum kinyerésével kaptuk. Az EcoRI ragadós végeket tartalmazó fragmentumot azután a PTL EcoRI-helyére ligáltuk, miután előzőleg EcoRI-el emésztettük. Miután az E. coli HBlOl-et tetraciklin rezisztenciára transzformáltuk és szelektáltuk, a telepeket szűrőhibridizálással screeneltük a VA génekre specifikus DNS-re. A hibridizálódó klónokból DNS-t nyertünk ki és restrikciós endonukleázos emésztéssel meghatároztuk jellemzőit. A kapott plazmidot p91023-maI jelöltük.
Amint azt az 5C. ábrán szemléltettük, a p91023-ban levő két EcoRI-helyet eltávolítottuk úgy, hogy a p91023at EcoRI-el teljesen emésztettük, így két DNS-fragmentumot kaptunk, az egyik 7 kilobázisnyi, a másik körülbelül 1,3 kilobázisnyi. Az utóbbi fragmentum tartalmazta a VA géneket. Mindkét fragmentum végét kiegészítettük a polimeráz I Klenow-fragmentumának alkalmazásával, majd a két fragmentumot együtt ligáltuk. A p91023(A) plazmidot, amely tartalmazta a VA géneket és hasonlított a p91023-ra, de hiányzott belőle a két EcoRI-hely, Grunstein-Hogness screenmódszerrel [Pnas. 72: 3961 (1975)] azonosítottuk a VA gén fragmentumával, továbbá szokásos restrikciós hely analízissel.
A p91023(A)-ban levő egyetlen Pstl-helyet eltávolítottuk és egy EcoRI-hellyel helyettesítettük. A p91023(a)-t Pstl-gyei teljesen emésztettük és polimeráz I Klenow-fragmentumával kezeltük, hogy „tompa végeket” hozzunk létre. A p91023(A) tompává alakított Pstl-helyére EcoRI linkereket ligáltunk. A lineáris, a tompa Pstl-helyhez kapcsolva EcoRI linkereket tartalmazó p91023(A)-t elválasztottuk a nem ligáit linkerektől és EcoRI-el teljesen emésztettük, majd újra ligáltuk. Az
HU 216 079 Β
II. táblázat
I. típusú EPO-cDNS-sel transzfektált COS-sejtekből nyert EPO
5C. ábrán p91023(B)-vel jelölt plazmidot kinyertük, és megállapítottuk, hogy szerkezete hasonlít a p91023éhoz, de a Pstl-hely egy EcoRI-hellyel van helyettesítve. A p91023(B) plazmidot deponáltuk, és hozzáférhető az American Type Culture Collection-ban, Rockville, Maryland, USA, ATCC 39754 számon.
6. példa
A lambda-EPOFL6 és lambda-EPOFL13 cDNS-klónokat inszercióval bevittük a p91023(B) plazmidba, így pPTFL6-ot, illetve pPTFL13-at nyerünk. A tisztított DNS-ekből 8 μ§-οΙ transzfekcióval beviszünk 5 χ 106 COS-sejtbe az alább ismertetett DEAE-dextrán módszer alkalmazásával. 12 óra eltelte után a sejteket mostuk és 0,1 mM Chloroquinnal kezeltük 2 óra hosszat, újra mostuk és 10 ml, 10% borjúmagzatszérumot tartalmazó közegbe helyeztük 24 órára. A közeget ezután 4 ml szérummentes közeggel váltottuk fel és 48 óra múlva feldolgoztuk.
Az immunológiailag aktív EPO mennyiségét radioimmunoassay-vel (RIA) határoztuk meg [Sherwood, J. B., Goldwasser, E.: Blood, 54:885-893, (1979)]. Az antitestet Dr. Judith Sherwood biztosította (Columbia University, N. Y.). A jódozott követőt az 1. példában leírt homogén EPO-ból készítettük. A kimutatás érzékenysége körülbelül 1 ng/ml. Az eredmények az alábbi
I. táblázatban láthatók.
I. táblázat
Vektor EPO-szint a közegben (ng/ml)
pPTFL13 330
pPTFLó 31
A pPTFL13-at deponáltuk és hozzáférhető az American Type Culture Collection-ban, Rockville, Maryland, USA, ATCC 3999 számon.
7. példa
EPO-cDNS-t (lambda-HEPOFL 13-ból) inszercióval bejuttatunk p91023(B) vektorba, majd COS-1 sejtekbe transzfektáljuk és feldolgozzuk a 6. példában leírt módon, azzal az eltéréssel, hogy a chloroquinos kezelést kihagyjuk.
Az in vitro biológiailag aktív EPO mennyiségét vagy telepképző vizsgálattal határoztuk meg, CPU-E forrásként egér magzati májsekteket használva, vagy pedig 3H-timidin felvétel vizsgálattal, fenil-hidrazinnal injekciózott egerek lépsejtjeinek felhasználásával állapítottuk meg. Ezeknek a vizsgálatoknak az érzékenysége körülbelül 25 mE/ml. Az in vivő biológiailag aktív EPO mennyiségét vagy hipoxiás egéren, vagy éheztetett patkányon mértük. Ezeknek a vizsgálatoknak az érzékenysége körülbelül 100 mE/ml. Hasonló körülmények között vizsgálva maga a közeg egyik vizsgálatban sem mutatott aktivitást. Az EPOFL13 által expresszált EPOval kapott eredményeket az alábbi, II. táblázatban foglaltuk össze; az aktivitást egység/ml-ben adtuk meg és standardként kereskedelemben kapható, ismert minőségű EPO-t (Toyobo Inc.) használtunk.
Vizsgálat típusa Aktivitás
RIA 100 ng/ml
CFU-E 2±0,5 egység/ml
3H-timidin 3,1 ±1,8 egység/ml
hipoxiás egér 1 egység/ml
éheztetett patkány 2 egység/ml
8. példa: COS-sejtekből nyert EPO SDS-poliakrilamid gélanalízise
91023(B) vektorban levő EPO-cDNS-sel (lambdaHEPOFL13) transzfektált COS-sejtek tápközegébe kibocsátott EPO 180 ng-ját elektroforézisnek vetettük alá 10% SDS Laemlli poliakrilamid gélen és elektrotranszferáltuk nitrocellulóz papírra [Tewbin és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:4350, (1979)]. A szűrőt anti-EPO antitesttel kezeltük, amint azt az 1. táblázatban feltüntettük, mostuk és 125I-staph A fehérjével újra kezeltük. A szűrőt 2 napig autoradiografáltuk. Az 1. példában leírt természetes homogén EPO-t elektroforézisnek vetettük alá jódozás előtt (B csík) vagy jódozás után (C csík) (vő. 6. ábra). Az alkalmazott markerek közé tartozott a 35S metionin (izotóppal jelzett), szérum albumin (68 000 dalion) és ovalbumin (45 000 dalton).
9. példa: Az RK1 -4plazmid megkonstruálása
A PSV2DHFR plazmid [Subramani és munkatársai: Mól. Cell. Bioi., 1:854-864 (1981)] Bam HI-PvuII fragmentumát izoláltuk; a fragmentum tartalmazott egy SV40 korai régió promotert az egér dihidrofelátreduktáz (DHFR) gén mellett, egy SV40 enhancert, a kicsi t antigén intront és az SV 40 poliadenilezési szekvenciáját (fragmentum A). A többi fragmentumokat a fent ismertetett p91023(A) vektorból kaptuk a következőképpen: a p91023(A)-t az adenovírus promoter közelében elhelyezkedő egyetlen Pstl I-helyén Pét I-el emésztettük a plazmid línearizálására, majd vagy szintetikus Pst I-hez és EcoRI konverterekhez ligáltuk és viszszaállítottuk a gyűrűs szerkezetet [így az eredeti Pst Ihelynél Pst I - EcoRI - Pst I-helyeket alakítunk ki; 91023 (B’)], vagy a DNS-polimeráz I nagy fragmentumával kezeljük a Pst I-hely megszüntetésére, egy szintetikus EcoRI-linkerhez ligáljuk és visszaállítjuk a gyűrűs szerkezetet [így az eredeti Pst I-helyen egy EcoRI-helyet hozunk létre; 91023(B)]. Mindkét kapott plazmidot, a 91023(B)-t és a 91023(B’)-t is Xba-val és EcoRI-vel emésztjük, így két fragmentumot kapunk (F és G). A p91023(B) F-fragmentumát a p91023(B’) G-fragmentumával és a p91023(B’) F-fragmentumát a p91023(B) G-fragmentumával összekapcsolva két olyan új plazmidot kaptunk, amelyek az eredeti Pst I-helynél vagy egy EcoRI - Pst I-helyet, vagy egy Pst I - EcoRI helyet tartalmaznak. Azt a plazmidot, amely a Pst I - EcoRIhelyet tartalmazza, amelyben a Pst I-hely a legközelebb
HU 216 079 Β van az adenovírus fő késői promoteréhez, p91023(C)nek neveztük el.
A p91023(C) vektort Xhol-el teljesen emésztettük és a kapott, ragadós végeket tartalmazó linearizált DNS-t egy végkitöltési reakcióval tompa végűvé alakítottuk az E. coli DNS-polimeráz I-ének nagy fragmentumával. Ehhez a DNS-hez egy 340 bázispámyi Hind ΠΙ - EcoRI fragmentumot ligáltunk, amely a következőképpen előállított SV40 emhancert tartalmazta:
Az SV40-ből a Hind III - Pvu II fragmentumot, amely tartalmazza az SV40 replikációs kiindulási helyét és az enhancert, inszercióval beékeltük a c lac plazmidba [Little és munkatársai: Mól. Bioi. Med., 1:473-488, (1983)]. A c lac vektort úgy állítottuk elő, hogy a c lac DNS-t BamHI-el emésztettük, a ragadós véget a DNSpolimeráz-I nagy fragmentumával kitöltöttük és a DNS-t Hind III-mal emésztettük. A kapott plazmid (c SVHPlac) regenerálta a BamHI-helyet a Pvu II tompa véghez való ligálódás révén. Az EcoRI - Hind III fragmentumot a c SVHPlac-ból készítettük és a PSVOD EcoRI - Hind III fragmentumához (Mellon és munkatársai, fent említett közlemény) ligáltuk, amely tartalmazta a plazmid replikációs kiinduló helyét. A kapott pSVHPOd plazmidot szelektáltuk, majd elkészítettük a PSVHPOd 340 bázispámyi EcoRI - Hind III fragmentumát, amely tartalmazta az SV40 kiindulási helyet/enhancert úgy, hogy mindkét véget a DNS-polimeráz-I nagy fragmentumával tompává tettük, és a fent leírt, Xho 1-gyel emésztett, tompa végűvé alakított p91023(c) vektorhoz ligáltuk. A kapott plazmid (p91023(C)/Xho/tompa vég plusz EcoRI/Hind Hl/tompa SV40 kiindulási hely plusz enhancer), amelyben a Hind III - EcoRI fragmentum orientációja olyan volt, hogy a fragmentumon belül a BamHI-hely a legközelebb volt a VA-génhez, a pES105 jelet kapta. A pES105 plazmidot Bam ΗΙ-vel és PvuII-vel, illetve csak Pvuü-vel emésztettük, és izoláltuk az adenovírus fő késői promotert tartalmazó BamHI - PvuII fragmentumot (E fragmentum), a PvuII fragmentumot, amely a plazmid tartós rezisztencia génjét (tetraciklin rezisztencia) tartalmazza és más szekvenciákat (fragmentum C). Az A, B és C fragmentumokat ligáltuk és a kapott, 10. ábrán szemléltetett plazmidot izoláltuk és RK1-4-nek neveztük el. Az RK1-4 plazmidot letétbe helyeztük az American Type Culture Collection-ban, Rockville, Maryland, USA, ahol ATCC 39940 számon hozzáférhető.
10. példa: EPO expresszálódása CHO-sejtekben I. módszer
A fent leírt (6. példa) pPTFL13 plazmid DNS-éből 20 pg-ot Cla I restrikciós endonukleázzal emésztettünk, hogy linearizáljuk a plazmidot, 2 pg pAdD26SVp(A) plazmidból származó, Cla I-el emésztett DNS-sel ligáltuk; ez utóbbi DNS egy érintetlen dihidrofelát-reduktáz (DHFR) gént tartalmazott, amelyet egy adenovírus fő késői promoter vezérelt [Kaufman, Sharp: Mól. and Cell. Bioi., 2:1304-1319, (1982)]. Ezt a ligáit DNS-t CHOsejtek transzfekciójára használtuk, amelyek DHFR-negatívak voltak [DUKX-ΒΠ; Chasin, L. A., Urlaub, G.: Proc. Natl. Acad. Sci., 77,4216-4220, (1980)], majd két nap tenyésztés után alfa tápközegen (lásd Maniatis: A Laboratory Manual), amelyben nem voltak nukleotidok, és 10% dializált borjúmagzatszérumot tartalmazott, szelektáltuk azokat a sejteket, amelyekbe legalább 1 DHRF-gén beépült. Kétheti szelektív tápközegen végzett tenyésztés után a telepeket eltávolítottuk a lemezről, 10-100 telep/csoport nagyságú csoportokba osztottuk, új lemezre helyeztük és nukleotidmentes alfa tápközegen addig tenyésztettük, míg a telepek összefolytak. A csoportokból methotrexátos kezelés előtt nyert felülúszót RIA-módszerrel megvizsgáltuk EPO-tartalomra. Azokat a csoportokat, amelyek EPO-t termeltek, 0,02 pN methotroxát jelenlétében tenyésztettük, majd szubklónoztuk és újra megvizsgáltuk. Az EPO Cla 4a4, 0,2-7, az EPO Cla 4a4,02 csoport egyik szubklónozott tagja, 0,02 pM methotrexátot tartalmazó tápközegben 460 ng/ml EPO-t termelt, amely a tápközegbe jutott. (3. táblázat). Az EPO Cla 4a4,02-7 az a sejtvonal, amelyet EPO-termelésre kiválasztottunk és deponáltuk az American Type Culture Collection-ban ATCC CRL8695 számon. Ezt a kiónt jelenleg lépcsőzetes szelektálásnak vetjük alá növekvő methotroxátkoncentrációk jelenlétében, és így feltehetően olyan sejteket kapunk, amelyek még több EPO-t termelnek. A RIA-módszerrel negatívnak bizonyult csoportok esetén a 0,02 pM methotroxát jelenlétében tenyésztett párhuzamos tenyészetekből kapott methotrexátrezisztens telepeket csoportokban újra megvizsgáltuk RIA-módszerrel EPO-termelésre. Ezek közül azokat a tenyészeteket, amelyek nem voltak pozitívak, szubklónoztuk és további növekvő methotroxátkoncentráció jelenlétében tenyésztettük.
Lépcsőzetes methotroxátszelekció megvalósításához a sejteket ismételten növekvő koncentrációjú methotroxát jelenlétében tenyésztettük és kiválasztottuk a túlélőket. Minden egyes ciklusban a tenyészet felülúszójában RIA-módszerrel és in vitro biológiai aktivitásmeghatározással megmérjük az EPO mennyiségét. A methotroxát mennyisége az egyes lépcsőkben 0,02 pM, 0,1 pM és 0,5 pM volt. Amint az a III. táblázatban látható, egy szelekciós ciklus után, amelyet 0,02 pM methotroxát-ban hajtottunk végre, jelentős mennyiségű EPO szabadult föl a tápközegbe.
III. táblázat
A tápközegbe kibocsátott EPO mennyisége
Minta Mérési mód Alfa közegben a mennyiség 0,02 μΜ methotroxáttal alfa közegben
4cc4 csoport RIA 17 ng/ml 50 ng/ml
4a4 egyik telepe
Klón (0,02-7) RIA - 460 ng/ml
11. példa: EPO expresszionálódása CHO-sejtekben II. módszer
A lambda-HEPOFL13 kiónból származó DNS-t EcoRI-vel emésztettünk és az EPO-gént tartalmazó kis
HU 216 079 Β
Rí fragmentumot az RK1-4 plazmid (vő. 10. példa) EcoRI-helyére szubklónoztuk. Ezt a DNS-t (RKFL13) használtuk azután a DHFR-negatív CHO-sejtek közvetlen (emésztés nélküli) transzfekciójára és a szelekciót és amplifikálást a 10. példában leírt módon hajtottuk végre.
Az RFKL13 DNS-t CHO-sejtekbe protoplasztfuzióval (lásd Maniatis, mint fent) és mikroinjekciózással is bevittük. Az RKFL13 plazmidot deponáltuk az American Type Culture Collection-ban, Rockville, Mary5 land, USA, ahol ATCC 39 989 számon hozzáférhető.
IV. táblázat
A tápközegbe kibocsátott EPO mennyisége
Minta Módszer Alfa tápközegben mennyiség 0,02 mM methotrexáttal alfa tápközegben mennyiség
Telep RIA 3 ng/ml 42 ng/ml (csoport)
A csoport 3H-Thy 150 ng/ml (klón) 1,5 egység/ml
Egy telep klón RIA - 9C ng/ml
(0,02C-Z) ’H-Thy - 5,9 egység/ml
RIA 60 ng/ml 160 ng/ml
Mikroinjekciózott csoport (DEPO-1) 3H-Thy 1,8 egység/ml
Az előnyös egy telep kiónt deponáltuk az American Type Culture Collection-ban, Rockville, Maryland, USA, ahol ATCC CRL8695 számon hozzáférhető.
12. példa: EPO genomiális klón expresszionálódása COS-1 sejtekben
Az EPO genomiális klón expressziójára használt vektor a pSVOd (Mellon és munkatársai fent hivatkozott közleménye). A pSVOd-ből származó DNS-t Hind ΙΠmal teljesen emésztettük és a véget tompává alakítottuk DNS-polimeráz-I nagy fragmentumával. A lambdaHEPO3 EPO genomiális kiónt EcoRI-vel és Hind ΙΠmal teljesen emésztettük és az EPO-gént tartalmazó 4,0 kilobázisnyi fragmentumot izoltáluk és a véget tompává alakítottuk, ahogy ezt fent leírtuk. Ennek a fragmentumnak a Hind ΙΠ-helytől a közvetlenül a poliadenilezési szignál mögött levő régióig terjedő nukleotidszekvenciáját a 4. ábra és 4. táblázat mutatja. Az EPOgén fragmentumot beékeltük a pSVOd plazmidfragmentumba és a mindkét orientációjú, megfelelően konstruált rekombinánsokat izoláltuk és szerkezetüket igazoltuk. A CZ2-1 plazmid az EPO-gént „a” orientációban (azaz az EPO 5’-végével az SV40 indítási helye felé legközelebb), a CZ1-3 plazmid pedig ellentétes orientációban („b” orientáció) tartalmazza.
A CZ1-3 és CZ2-1 plazmidokat COS-1 sejtekbe transzfektáltuk a 7. példában leírt módon és a közeget feldolgoztuk és megvizsgáltuk immunológiailag aktív EPO-ra. A CZ2-1 tenyészetének felülúszójából körülbelül 31 ng/ml, a CZl-3-éból pedig 16-31 ng/ml EPO-t mutattunk ki.
A HEPO1, HEPO2 és HEPO6 genomiális kiónok expressziós céllal hasonló módon ékelhetők be a COSsejtekbe.
13. példa: C127 és 3T3 sejtekben való expresszálódás
A pBPVEPO megkonstruálása
Az egér metallothionein promoter transzkripciós kontrollja alatt álló és a teljes borjú papilloma vírus DNS-hez kapcsolt EPO-cDNS szekvenciát tartalmazó plazmidot a következőképpen állítottuk elő:
pEPO49F
Az SP6/5 plazmidot a Promoga Biotec.-től szereztük be. Ezt a plazmidot EcoRI-el teljesen emésztettük és az 1340 bázispámyi EcoRI fragmentumot a lambdaHEPOFL13-ból beékeltük DNS-ligázzal. A kapott plazmidot, amelyben az EPO-gén 5’-vége a legközelebb volt az SP6 promoterhez (amint azt BglI-el és Hind ΠΙ-mal végzett emésztéssel igazoltuk, pEPO49F-nek neveztük el. Ebben az orientációban a BamHI-hely a PSP6/5 polilinkerben közvetlenül az EPO-gén 5’-végé30 nél helyezkedik el. pMMTneo ABPV
A 11. ábrán szemléltetett pdBPV-MMTneo plazmidot [Law és munkatársai: Mól. and Cell. Bioi., 3:2110-2115, (1983)] BamHI-el teljesen emésztettük, így két fragmentumot kaptunk, egy nagyot, amely körülbelül 8 kilobázis hosszúságú és a BPV-genomot tartalmazza, és egy kisebbet, amely körülbelül 6,5 kilobázis hosszúságú és tartalmazza a pML2 kiindulási helyet és az ampicillinrezisztencia-gént, a metallothionein promo40 tort, a neomicinrezisztencia-gént és az SV40 poliadenilezési szignált. Az emésztett DNS-t DNS-ligázzal kezelve visszaállítottuk a gyűrűs szerkezetet és azokat a plazmidokat, amelyek csak a 6,8 kilobázisnyi fragmentumot tartalmazták, EcoRI-vel és BamHI-el restrikciós endo45 nukleázos emésztésnek vetettük alá. Az egyik ilyen plazmidot pMMTneo ABPV-nek neveztük el. pEPO15a
A pMMTneo ABPV-t BglII-vel teljesen emésztettük. A pEPO49f-et BamHI-el és BglII-vel teljesen emésztet50 tűk és a körülbelül 700 bázispámyi, a teljes EPO-kódoló régiót tartalmazó fragmentumot géllel elválasztottuk. A BglII-vel emésztett pMMTneo ABPV-t és a 700 bázispámyi BamHI/BglII EPO-fragmentumot ligáltuk és a kapott, EPO-cDNS-t tartalmazó plazmidokat telephibridi55 zálással azonosítottuk egy olyan oligonukleotid próbával d(CGTCATCTGTCCCCTGTCC), amely az EPO-génre specifikus. A hibridizációs analízissel pozitívnak bizonyult plazmidok közül egyet (a pEPO15a-t), amely az EPO-cDNS-t olyan orientációban tartalmazta, hogy an60 nak 5’-vége volt legközelebb a metallothionein promo12
HU 216 079 Β terhez, azonosítottuk EcoRI-vel és KpnI-el végzett emésztéssel.
pBVP-EPO
A pEPO15A plazmidot teljesen emésztettük BamHIel, hogy linearizáljuk. A pdBPV-MMTneo-(342-12) plazmidot is teljesen emésztettük BamHI-el, hogy két, 6,5, illetve 8 kilobázis hosszúságú fragmentumot kapjunk. A 8 kilobázisnyi fragmentumot, amely tartalmazta a teljes boíjú papilloma vírus genomot, gélen izoláltuk. A pEPO15a/BamHI-t és a 8 kilobázisnyi BamHI-fragmentumot együtt ligáitok, és a plazmidot (pBPV-EPO), amely tartalmazta a BPV-fragmentumot, telephibridizálással azonosítottuk, egy olyan oligonukleotid próba felhasználásával, amely a BPV-genomra specifikus d(P-CCACACCCGGTACACA-OH). A pBPV-EPO-DNS Hind III-mal végzett emésztése azt mutatta, hogy a BPV-genom transzkripciójának iránya megegyezik a metallothionein transzkripciójának irányával (mint a pdBPV-MMTneo(342-12)-ben, vő. 11. ábra). A pdBPV-MMTneo(342-12) hozzáférhető az American Type Culture Collection-ban, ATCC 37224 számon.
Expresszió
A következő módszereket alkalmaztuk az EPO expresszálására.
I. Módszer pBPV-EPO-DNS-t készítettünk és körülbelül 25 pg-ot arra használtunk, hogy körülbelül 1 χ 106 C127 [Lewy és munkatársai: J. of Virol., 26:291-98, (1978)] CHO-sejtet transzfektáljunk standard kalciumfoszfát lecsapási technikával [Grahm és munkatársai: Virology, 32:456-67, (1973)]. 5 órával a transzfekció után a transzfekciós közeget eltávolítottuk, a sejteket glicerinnel kezeltük, mostuk, és friss, 10% boíjúmagzatszérumot tartalmazó α-közeget adtunk hozzá. 48 órával később a sejteket tripszinnel kezeltük és 1:10 arányban hasítottuk 500 pg/ml G418-at tartalmazó DME közegben [Southern és munkatársai: Mól. Appl. Génét., 1:327-41, (1982)], majd a sejteket 2-3 hétig inkubáltuk. A G-418-ra rezisztens telepeket egyenként izoláltuk mikrotitráló edényekbe és G418 jelenlétében addig tenyésztettük, amíg majdnem összeértek. A sejteket ezután mostuk, 10% boqúmagzatszérumot tartalmazó friss tápközeget adtunk hozzá és a közeget 24 óra múlva feldolgoztok. A közeget meghatározott feltételek mellett megvizsgáltuk és EPO-ra pozitívnak találtuk RIA-módszerrel és in vitro biológiai vizsgálattal.
II. Módszer
Cl27 vagy 3T3 sejteket kotranszfektáltonk 25 pg pBPV-EPO-val és 2 pg pSV2neo-val (Southern és munkatársai fent idézett közleménye) az I. módszernél leírt módon. Ez az arány körülbelül tízszeres moláris felesleget jelent pBPV-EPO-ból. A transzfekció után az eljárás megegyezik az I. módszernél leírtakkal.
III. Módszer
C127 sejteket transzfektáltunk 30 pg pBPV-EPOval az I. módszernél leírt módon. Transzfekció és hasítás után (1:10) a tápközeget minden 3. napon frissre cseréltük. Körülbelül 2 hét után a BPV transzformált sejtek fókuszai láthatóvá váltak. Az egyes fókuszokat külön-külön 1 cm-es edényekbe tettük át mikrotiter lemezre, egy rétegben addig tenyésztettük, míg a telepek majdnem összeértek, és a közegben meghatározott körülmények között megvizsgáltok az EPO-aktivitást és az antigenitást.
14. példa: Expresszió rovarsejtekben pIVEVEPOFL13 megkonstruálása A pIVEV plazmidvektort deponáltuk és hozzáférhető az American Type Culture Collection-ban, Rockville, Maiyland, USA, az ATCC 39 991 számon. A vektort a következőképpen módosítottuk:
pIVEVNI pIVEV-et emésztettünk EcoRI-vel, hogy linearizáljuk, a véget tompává tettük a DNS-polimeráz-I nagy fragmentumával és egy egyedi NotI linkért, amelynek képlete
GGCGGCCGCC
CCGCCGGCGG kapcsoltuk hozzá tompa vég ligálással. A kapott plazmidot pIWNI-nek neveztük el.
pIVEVSI
A pIVEV-et Smal-el emésztettük, hogy a plazmidot linearizáljuk, és egy
GGGCCCCAGGGGCCC
CCCGGGGTCCCCGGG képletű egyedi Sfil linkért ékeltünk bele tompa vég ligálással. A kapott plazmidot pIVEVSI-nek neveztük el. pIVEVSIBgKp
A pIVEVSI plazmidot KpmI-el emésztettük, hogy linearizáljuk és mindkét végéről körülbelül 0-100 bázispárt távolítottunk el a kétfonalas Bal 31 exonukleázzal végzett emésztéssel. Ha maradt nem teljesen tompa vég, azt tompává tettük a DNS-polimeráz-I nagy fragmentumának felhasználásával és tompa vég ligálással beékeltük a
Xhol Xbal
I------| I------1
Bglll i ' EcoRI i Clal KpnI i-H rí—!~i rl r I
AGATCTCGAGAATTCTAGATCGATGGTACC
TCTAGAGCTCTTAAGATCTAGCTACCATGG képletű polilinkert. A polilinkert mindkét orientációban beékeltük. Azt a plazmidot, amelyben a polilinker orientációja olyan, hogy a polilinkeren belül a BglII-hely a legközelebb van a polihedron gén promoterhez, pIVEVSIBgKp-nek neveztük el. Azt a plazmidot, amelyben a polilinkeren belül a KpnI-hely a legközelebb van a polihedron gén promoterhez, pIVEVSIKpEg-nek neveztük el. Az eredeti KpnI-hely és a polihedron promoter közötti, a pIVEVSI-ből törölt bázispárok számát nem határoztuk meg. A pIEIVSIBgKp-t depenáltuk és hozzáférhető az American Type Culture Collectionban, Rockville, Maiyland, USA, ATCC 39988 számon. pIVEVSIBgKpNl
A pIVEVNI-t KpnI-el és Pstl-el teljesen emésztettük, így két fragmentumot kaptunk. A nagyobb fragmentum, amely tartalmazta a plazmid replikációs kiinduló helyét és a polihedron gén 3’-végét, gélizolálással volt előállítható (fragmentum A). A pIVEVSIBgKp-t Pstl-el és
HU 216 079 Β
Kpn-nel teljesen emésztettük, így két fragmentumot kaptunk és a kisebb fragmentumot, amely tartalmazta a polihedron génpromotert és a polilinkert, gélizolálással állítottuk elő (B fragmentum). Ezután az A és B fragmentumokat ligálással DNS-ligázzal összekapcsoltuk, így a pIVEVSIBgKpNl új plazmid keletkezett, amely egy részlegesen törölt polihedron gént tartalmazott, amelybe egy polilinkert ékeltünk be és egy Netl-hely is található volt benne. Ez utóbbi a megszüntetett EcoRIhely helyére került; ezen kívül egy Stíl-hely is jelen volt, amely a polihedron génrégiót szegélyezte.
pIVEPO
A pIVEVSI BGKpNI-t EcoRI-vel teljesen emésztettük, hogy linearizáljuk a plazmidot és beleékeltük a lambda-HEPOFL 13-ból származó 1340 bázispámyi EcoRI-fragmentumot. Azokat a plazmidokat, amelyek az EPO-gént olyan orientációban tartalmazták, hogy az EPO-gén 5’-vége a legközelebb volt a polihedron promoterhez és a polihedron gén 3’-végéhez, BglII-vei végzett emésztéssel azonosítottuk. Ezek közül a plazmidok közül egynek az orientációja a fent megjelölt volt, és ezt pIVEPO-nak neveztük el.
EPO expressziója rovarsejtekben
Nagy mennyiségű pIVEPO-t állítottunk elő úgy, hogy E. coli JMlOl-tgl törzset transzformáltuk. A plazmid-DNS-t tisztított lizát technikával (Maniatis és Fritsch módszere, Cold Spring Harbor Manual) izoláltuk és tovább tisztítottuk CsCl centrifúgálással. Vad típusú Autographa catifornica vírus (polihedrosis vírus, AcNPV) L-l törzsének DNS-ét a vírusrészecskék fenolos extrahálásával és ezt követően a virális DNS CsCl-os tisztításával állítottuk elő.
Ezt a kétféle DNS-t azután kotranszfektáltuk Spedoptera frugiperda IPLB-SF-21 sejtekbe [Vaughn és munkatársai: In vitro, B kötet, 213-17. oldal, (1977)] a kalcium-foszfátos transzfekciós eljárással (Petter és Miller, 1977). Minden olyan sejtlemezre, amelyre kotranszfektáltunk, 1 pg vad típusú AcNPV-DNS-t és 10 pg pIVEPO-t alkalmaztunk. A lemezeket 27 °C-on inkubáltuk 5 napig. Ezután a felülúszót összegyűjtöttük és a benne levő EPO-t RIA-módszerrel és in vitro biológiai módszerrel határoztuk meg.
75. példa: Az EPO tisztítása
COS-sejtek meghatározott feltételek között tartott közegét 200 pg/l-ig teijedő EPO-koncentrációval 600 ml-re töményítjük be 10000-es molekulatömeg-küszöbértékű ultraszűrő membránokkal, így például Millipore Pellicannal, amely 0,47 m2 membránnal van fölszerelve. RIAmódszerrel vizsgálatokat végeztünk a 6. példában leírt módon. Az ultraszűrés után visszamaradt anyagot dialízisnek vetettük alá 4 ml 10 mM nátrium-foszfáttal szemben, amelynek pH-ja 4-re volt beállítva. A koncentrált és dializált, meghatározott körülmények között tartott tápközeg 2,5 mg EPO-t és 380 mg összes fehéijét tartalmazott. Az EPO-tartalmú oldatot tovább sűrítettük 186 mire és a kicsapódott fehérjéket 110 000 g-n 30 percig végrehajtott centrifúgálással távolítottuk elő.
A 2,0 mg EPO-t tartalmazó felülúszót pH=5,5-re állítottuk be 50%-os ecetsavval, 4 °C-on kevertettük percig és a csapadékot 13 000 g-on 30 percig végzett centrifugálással távolítottuk el.
Karbonil-metil-szefaróz kromatográfia (CSC)
A centrifugálással kapott 20 ml felülúszót, amely 200 pg EPO-t (24 mg összes fehéijét) tartalmazott, 20 ml CM-szefarózzal töltött, 10 mM 5,5 pH-jú nátrium-acetáttal ekvilibrált oszlopra vittük föl és ugyanennek a puffemek 40 ml-ével mostuk. A CM-szefarózhoz kötött EPO-t 100 ml NaU(O-l) gradienssel eluáltuk 10 mM 5,5 pH-jú nátrium-foszfát-pufferben. Az EPO-t tartalmazó frakciók (az összesen 2 mg fehérjéből 50 pg) kiválasztása után azokat összegyűjtöttük és Amicon YM10 ultraszűrő membránnal 2 ml-re sűrítettük be.
Reverz fázisú HPLC
A CM-szefarózról lejövő, EPO-t tartalmazó besűrített frakciókat reverz fázisú HPLC-vel, Vydac C-4 oszlopon tovább tisztítottuk. Az EPO-t olyan oszlopra vittük fel, amelyet 10% B oldószerrel ekvilibráltunk (az A oldószer 0,1 %-os vizes trifluor-ecetsav oldat; a B oldat 0,1 %-os trifluor-metil-cianidos trifluor-ecetsav-oldat) 1 ml/perc sebességgel. Az oszlopot 10% B oldattal mostuk 10 percig és az EPO-t lineáris B gradienssel eluáltuk (10-70%-kal, 60 perc alatt). Az EPO-t tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük (körülbelül 40 pg EPO 120pg összes fehéijében) és liofilizáltuk. A liofilizált EPO-t újra feloldottuk 0,1 M trisz-hidrokloridban, amely 7,5 pH-jú volt és 0,15% M nátrium-kloridot tartalmazott, és az oldatot reverz fázisú HPLC-vel újra kromatografáltuk. Az EPO-t tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük és SDS-poliakrilamid (10%) gél elektroforézissel (Lamelli, U. K.: Natúré) megvizsgáltuk. Az EPO kiválasztott frakciói 15,5 pg EPO-t tartalmaztak 25 pg összes fehérjében.

Claims (37)

SZABADALMI IGÉNYPONTOK
1) megfelelő vektorba egy kifejező szabályozó szekvenciával működőképesen kapcsolt, 3. vagy 4. táblázatban megadott, vagy azzal analóg DNS-szekvenciát inszertálunk,
1. Eljárás biológiailag aktív eritropoietint expreszszáló humán cDNS-klón előállítására, azzal jellemezve, hogy
a) tisztított eritropoietin fehéijét tripszinnel hasítunk, és
b) az a) lépésben tripszines hasítással nyert fragmensek aminosav-szekvenciája alapján egy oligonukleotid próbakészletet állítunk elő, és
c) a b) lépésben kapott oligonukleotid próbákkal egy emberi genomiális DNS-tárat screenelünk, és
d) kiválasztjuk a próbákkal hibridizálódó kiónokat és ezeket szekvenáljuk, és
e) a d) lépésben nyert kiónok közül azonosítunk egy eritropoietin-klónt, és
f) az e) lépésben kapott kiónt egy emberi magzat májcDNS-tárának screenelésére használjuk, és
g) kiválasztunk egy eritropoietin-klónt az f) szerinti magzatmáj-cDNS-tárból. (Elsőbbsége: 1984. 12.04.)
2) az így kapott vektorral emlős gazdasejtet transzformálunk,
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 3. táblázatban szemléltetett 1-166. aminosavakat kódoló cDNS-szekvenciát állítunk elő.
3) a transzformált sejteket tenyésztjük, és
3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 3. táblázatban megadott MET GÉY... LEU GLY
HU 216 079 Β aminosav leaderszekvenciát kódoló DNS-t tartalmazó cDNS-t állítunk elő. (Elsőbbsége: 1984. 12. 04.)
4) a keletkezett eritropoietint elválasztjuk a sejtektől és a tápközegtől. (Elsőbbsége: 1984. 12.04.)
4. Eljárás rekombináns DNS-vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerint előállított DNS-klónt megfelelő vektorba inszertáljuk. (Elsőbbsége: 1984. 12.04.)
5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a lambda-HEPOFL13 DNS-klónt alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1984. 12. 04.)
6. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 4. táblázatban megadott szekvenciájú genomiális DNS-klónt alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1984. 12. 04.)
7. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy heterológ promotert és a 2. vagy 3. igénypont szerint előállított cDNS-szekvenciát tartalmazó vektort állítunk elő. (Elsőbbsége: 1984. 12.04.)
8. Eljárás emlős- vagy rovarsejtvonal előállítására, azzal jellemezve, hogy gazdasejteket a 4. igénypont szerint előállított rekombináns DNS-vektorral transzformálunk. (Elsőbbsége: 1984. 12. 04.)
9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 5. igénypont szerint előállított vektort alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1984. 12. 04.)
10. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 6. igénypont szerint előállított vektort alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1984. 12. 04.)
11. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 7. igénypont szerint előállított vektort alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1984. 12. 04.)
12. 04.)
12. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy emlőssejtként 3T3, Cl27 vagy CHO sejteket alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1984. 12. 04.)
13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy emlőssejtként CHO-sejteket alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1984. 12.04.)
14. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy borjú papilloma vírus DNS-t és EPO-t kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó sejteket állítunk elő. (Elsőbbsége: 1984. 12.04.)
15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Cl27 és 3T3 sejteket alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1984. 12.04.)
16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy egér metallothionin promoter transzkripcionális kontrollja alatt álló EPO-DNS-t tartalmazó sejteket állítunk elő. (Elsőbbsége: 1984.12. 04.)
17. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy pdBPY-MMTneo(342-12)-ből származó DNS-t tartalmazó sejteket állítunk elő. (Elsőbbsége: 1984. 12. 04.)
18. Eljárás humán eritropoietin előállítására, azzal jellemezve, hogy
19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy emlőssejtként 3T3 sejteket alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1984. 12.04.)
20. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy emlőssejtként kínai hörcsög petefészek sejteket (CHO-sejteket) alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1984.
21. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy borjú papilloma vírust is tartalmazó vektort alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1984. 12. 04.)
22. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 275000-300000 egység/mg-nál nagyobb specifikus aktivitású eritropoietint állítunk elő. (Elsőbbsége: 1985.12. 03.)
23. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy magzatszérumot tartalmazó táptalajt alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1984. 12. 04.)
24. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan eritropoietintől mentes humán eritropoietin terméket állítunk elő, amelynek SDS-PAGE módszerrel mért molekulatömege nagyobb a vizeletből izolálténál. (Elsőbbsége: 1985.01.03.)
25. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy olyan eritropoietintől mentes humán eritropoietin terméket állítunk elő, amelynek átlagos szénhidrátösszetétele a természetesétől eltérő. (Elsőbbsége: 1985. 01.03.)
26. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan eritropoietintől mentes humán eritropoietin terméket állítunk elő, amelynek SDS-PAGE módszerrel mért molekulatömege nagyobb a vizeletből izolálténál, és amelynek átlagos szénhidrát-összetétele a természetesétől eltérő. (Elsőbbsége: 1985. 01. 03.)
27. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a következő DNS-szekvenciák valamelyikét alkalmazzuk: a 3. táblázat szerinti DNS-szekvencia; a 4. táblázat szerinti DNS-szekvencia; a 4. táblázat szerinti DNS-szekvenciának a -27. helyzetű Met aminosavat kódoló ATG kodontól 50 nukleotiddal felfelé elhelyezkedő „GGTC” nukleotidoktól a 166. helyzetű Arg aminosavat kódoló AGA kodont követő TGA nukleotidig teijedő része; vagy a 4. táblázat szerinti DNSszekvenciának a -27. helyzetű Met aminosavat kódoló ATG kodontól a 166. helyzetű Arg aminosavat kódoló AGA kodont követő TGA nukleotidig terjedő része. (Elsőbbsége: 1985.01.03.)
28. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan eritropoietintől mentes humán eritropoietin terméket állítunk elő, amelynek SDS-PAGE módszerrel mért molekulatömege nagyobb a vizeletből izolálténál; és hogy a következő DNS-szekvenciák valamelyikét alkalmazzuk: a 3. táblázat szerinti DNS-szekvencia; a 4. táblázat szerinti DNS-szekvencia; a 4. táblázat szerinti DNS-szekvenciának a -27. helyzetű Met aminosavat kódoló ATG kodontól 50 nukleotiddal felfelé elhelyezkedő „GGTC” nukleotidoktól a 166. helyzetű Arg aminosavat kódoló AGA kodont követő TGA nukleotidig terjedő része; a 4. táblázat szerinti DNS-szekvenciának a -27. helyzetű Met aminosavat kódoló ATG kodontól a 166. helyzetű Arg aminosavat kódoló AGA kodont kö15
HU 216 079 Β vető TGA nukleotidig teijedő része. (Elsőbbsége: 1985. 01.03.)
29. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan eritropoietintől mentes humán eritropoietin terméket állítunk elő, amelynek átlagos szénhidrát-összetétele a természetesétől eltérő; és hogy a következő DNS-szekvenciák valamelyikét alkalmazzuk: a 3. táblázat szerinti DNS-szekvencia; a 4. táblázat szerinti DNS-szekvencia; a 4. táblázat szerinti DNS-szekvenciának a -27. helyzetű Met aminosavat kódoló ATG kodontól 50 nukleotiddal felfelé elhelyezkedő „GGTC” nukleotidoktól a 166. helyzetű Arg aminosavat kódoló AGA kodont követő TGA nukleotidig terjedő része; a 4. táblázat szerinti DNS-szekvenciának a -27. helyzetű Met aminosavat kódoló ATG kodontól a 166. helyzetű Arg aminosavat kódoló AGA kodont követő TGA nukleotidig terjedő része. (Elsőbbsége: 1985.01.03.)
30. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan eritropoietintől mentes humán eritropoietin terméket állítunk elő, amelynek SDS-PAGE módszerrel mért molekulatömege nagyobb a vizeletből izolálténál, és amelynek átlagos szénhidrát-összetétele a természetesétől eltérő; és hogy a következő DNS-szekvenciák valamelyikét alkalmazzuk: a 3. táblázat szerinti DNSszekvencia; a 4. táblázat szerinti DNS-szekvencia; a 4. táblázat szerinti DNS-szekvenciának a -27. helyzetű Met aminosavat kódoló ATG kodontól 50 nukleotiddal felfelé elhelyezkedő „GGTC” nukleotidoktól a 166. helyzetű Arg aminosavat kódoló AGA kodont követő TGA nukleotidig teijedő része; a 4. táblázat szerinti DNS-szekvenciának a -27. helyzetű Met aminosavat kódoló ATG kodontól a 166. helyzetű Arg aminosavat kódoló AGA kodont követő TGA nukleotidig teijedő része. (Elsőbbsége: 1985.01.03.)
31. Eljárás gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy a 18. igénypont szerinti eljárással előállított rekombináns humán eritropoietint a gyógyszergyártásban szokásos hígító-, vivő- és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítjuk. (Elsőbbsége: 1985. 01. 03.)
32. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 27. igénypont szerinti eljárással előállított eritropoietint alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1985. 01. 03.)
33. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 28. igénypont szerinti eljárással előállított eritropoietint alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1985. 01. 03.)
34. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 29. igénypont szerinti eljárással előállított eritropoietint alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1985. 01. 03.)
35. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 30. igénypont szerinti eljárással előállított eritropoietint alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1985. 01. 03.)
36. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan CHO-sejteket alkalmazunk, amelyek képesek fukóz és N-acetil-galaktóz-amin beépítésével a termék Nés O-glikozilezésére, és N- és O-glikozilezett rekombináns humán eritropoietint nyerünk ki és választunk el a sejtekből és a tápközegből. (Elsőbbsége: 1985.12.03.)
37. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan rekombináns humán eritropoietint állítunk elő, amelynek összetétele glikozilezettség szempontjából a következő: hexózok és N-acetil-glükóz-amin (Nacglc) aránya 1,4:1, éspedig a galaktóz és Nacglc aránya 0,9:1, míg a mannóz és Nacglc aránya 0,5:1. (Elsőbbsége: 1985.12.03.)
HU553/86A 1984-12-04 1985-12-03 Eljárás eritropoietin előállítására HU216079B (hu)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US67781384A 1984-12-04 1984-12-04
US68862285A 1985-01-03 1985-01-03
US69325885A 1985-01-22 1985-01-22

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT40706A HUT40706A (en) 1987-01-28
HU216079B true HU216079B (hu) 1999-04-28

Family

ID=27418329

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU553/86A HU216079B (hu) 1984-12-04 1985-12-03 Eljárás eritropoietin előállítására

Country Status (24)

Country Link
EP (2) EP0411678B2 (hu)
JP (4) JPH02104284A (hu)
KR (1) KR890001011B1 (hu)
AT (2) ATE71408T1 (hu)
AU (1) AU621535B2 (hu)
CA (1) CA1341502C (hu)
CZ (3) CZ281756B6 (hu)
DE (3) DE411678T1 (hu)
DK (4) DK172953B1 (hu)
ES (1) ES8800049A1 (hu)
FI (2) FI104261B1 (hu)
GE (1) GEP19970775B (hu)
GR (1) GR852890B (hu)
HK (2) HK105693A (hu)
HU (1) HU216079B (hu)
IL (1) IL77081A (hu)
LV (2) LV10505B (hu)
MD (1) MD1639C2 (hu)
NO (1) NO304469B1 (hu)
PL (2) PL154180B1 (hu)
PT (1) PT81590B (hu)
SK (2) SK281799B6 (hu)
UA (1) UA44882C2 (hu)
WO (1) WO1986003520A1 (hu)

Families Citing this family (79)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ210501A (en) * 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
KR850004274A (ko) * 1983-12-13 1985-07-11 원본미기재 에리트로포이에틴의 제조방법
US4703008A (en) * 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
US4677195A (en) * 1985-01-11 1987-06-30 Genetics Institute, Inc. Method for the purification of erythropoietin and erythropoietin compositions
EP0236059B1 (en) * 1986-02-27 1994-04-27 Snow Brand Milk Products Co. Ltd. Preparation of erythropoietin-producing cells and production process of erythropoietin using same
DK173067B1 (da) * 1986-06-27 1999-12-13 Univ Washington Humant erythropoietin-gen, fremgangsmåde til ekspression deraf i transficerede cellelinier, de transficerede cellelinier sa
FR2603899B1 (fr) * 1986-09-12 1990-07-13 Genentech Inc Procede perfectionne pour l'expression de recombinants
US4954437A (en) * 1986-09-15 1990-09-04 Integrated Genetics, Inc. Cell encoding recombinant human erythropoietin
US4835260A (en) * 1987-03-20 1989-05-30 Genetics Institute, Inc. Erythropoietin composition
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US5888774A (en) * 1994-12-19 1999-03-30 Cangene Corporation Recombinant DNA molecules and expression vectors for erythropoietin
ES2333425T5 (es) 1995-06-15 2012-08-28 Crucell Holland B.V. Sistemas de empaquetado para adenovirus recombinante humano destinados a terapia génica
JPH10510434A (ja) * 1995-07-07 1998-10-13 ベーリンガー マンハイム ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Ｃｍｐ−ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼをコードする核酸及び修飾糖タンパク質の産生のためのその使用
EP0752474A1 (en) * 1995-07-07 1997-01-08 Boehringer Mannheim Gmbh Nucleic acid coding for CMP-N-acetyl-neuraminic acid hydroxylase and its use for the production of modified glycoproteins
DE19535571A1 (de) 1995-09-14 1997-03-20 Boehringer Mannheim Gmbh Pharmazeutische Kombinationspräparate und deren Verwendung zur Behandlung von Hämodialysepatienten
US5952226A (en) * 1996-11-05 1999-09-14 Modex Therapeutiques Hypoxia responsive EPO producing cells
IL131959A0 (en) 1997-03-18 2001-03-19 Roche Diagnostics Gmbh Pharmaceutical combined preparations containing erythropoietin and iron preparations
EP0885613A1 (de) 1997-06-21 1998-12-23 Roche Diagnostics GmbH Verwendung von modifizierten Hämoglobinen zur Behandlung von Anämien und Kombinationspräparate umfassend Erythropoietin und modifiziertes Hämoglobin
KR100622203B1 (ko) 1997-07-23 2006-09-07 로셰 디아그노스틱스 게엠베하 내인성 유전자 활성화에 의해 사람 단백질을 생성시키는 사람 세포주를 확인하는 방법
US6395484B1 (en) * 1997-07-23 2002-05-28 Roche Diagnostics Gmbh Identification of human cell lines for the production of human proteins by endogenous gene activation
JP4541539B2 (ja) * 1997-07-23 2010-09-08 ロシュ ダイアグノスティックス ゲーエムベーハー 内因性遺伝子活性化によるエリスロポエチンの製造
US6548296B1 (en) 1997-07-23 2003-04-15 Roche Diagnostics Gmbh Methods for identifying human cell lines useful for endogenous gene activation, isolated human lines identified thereby, and uses thereof
US6391633B1 (en) 1997-07-23 2002-05-21 Roche Diagnostics Gmbh Production of erythropoietin by endogenous gene activation
DK0902085T3 (da) * 1997-09-01 2004-04-05 Aventis Pharma Gmbh Rekombinant human erythropoietin med fordelagtig glycosyleringsprofil
AR019025A1 (es) 1998-04-09 2001-12-26 Roche Diagnostics Gmbh Uso de eritropoyetina en bajas dosis para producir un preparado farmaceutico para el tratamiento de hemocromatosis, preparado farmaceutico combinadoutilizado segun dicho uso y envase farmaceutico unitario que contiene al referido preparado farmaceutico combinado
BR9905867A (pt) 1998-11-06 2001-01-23 Bio Sidus S A Linhagem celular produtora de eritropoietina humana recombinante e a eritropoietina humana recombinante produzida por esta célula
BR9905868A (pt) 1998-11-06 2001-01-23 Bio Sidus S A Procedimento de cultivo massivo de células de mamìfero para a obtenção de eritropoetina humana, recombinante e a eritropoetina humana recombinante obtida com tal procedimento
BR9917606A (pt) 1998-11-06 2002-12-31 Bio Sidus S A Procedimento para a purificação de eritropoetina humana recombinante a partir de sobrenadantes de cultivo de células e eritropoetina humana recombinante obtida com tal procedimento
US6777205B1 (en) 1998-11-06 2004-08-17 Sterrenbeld Biotechnologie North America, Inc. Host cells expressing recombinant human erythropoietin
DE19857609A1 (de) 1998-12-14 2000-06-15 Hannelore Ehrenreich Verwendung von Erythropoietin zur Behandlung von cerebralen Ischämien des Menschen
US7297680B2 (en) 1999-04-15 2007-11-20 Crucell Holland B.V. Compositions of erythropoietin isoforms comprising Lewis-X structures and high sialic acid content
US8236561B2 (en) 1999-04-15 2012-08-07 Crucell Holland B.V. Efficient production of IgA in recombinant mammalian cells
US6855544B1 (en) 1999-04-15 2005-02-15 Crucell Holland B.V. Recombinant protein production in a human cell
US7604960B2 (en) 1999-04-15 2009-10-20 Crucell Holland B.V. Transient protein expression methods
US7521220B2 (en) 1999-11-26 2009-04-21 Crucell Holland B.V. Production of vaccines
US7527961B2 (en) 1999-11-26 2009-05-05 Crucell Holland B.V. Production of vaccines
US7192759B1 (en) 1999-11-26 2007-03-20 Crucell Holland B.V. Production of vaccines
AU2002233230B2 (en) 2000-12-20 2007-02-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Erythropoietin conjugates
DE10112825A1 (de) 2001-03-16 2002-10-02 Fresenius Kabi De Gmbh HESylierung von Wirkstoffen in wässriger Lösung
KR100505152B1 (ko) * 2001-09-10 2005-08-03 (주)가이아진 아스코르브산을 이용한 에리트로포이에틴의 생산방법
US6930086B2 (en) 2001-09-25 2005-08-16 Hoffmann-La Roche Inc. Diglycosylated erythropoietin
KR100979025B1 (ko) 2001-12-07 2010-08-30 크루셀 홀란드 비.브이. 바이러스, 바이러스 단리물 및 백신의 생산
CA2471363C (en) 2001-12-21 2014-02-11 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
DE10209822A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10209821A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10234192B4 (de) 2002-07-26 2009-11-26 Epoplus Gmbh Co.Kg Verwendung von Erythropoetin
US7459435B2 (en) 2002-08-29 2008-12-02 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment of disturbances of iron distribution
EP1681303B1 (en) 2002-09-11 2013-09-04 Fresenius Kabi Deutschland GmbH HASylated polypeptides, especially HASylated erythropoietin
RU2328505C2 (ru) 2002-09-11 2008-07-10 Фрезениус Каби Дойчланд Гмбх Полипептиды, обработанные has, особенно эритропоэтин, обработанный has
US7538092B2 (en) 2002-10-08 2009-05-26 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Pharmaceutically active oligosaccharide conjugates
US7459436B2 (en) 2002-11-22 2008-12-02 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment of disturbances of iron distribution
EP1623023B1 (en) 2003-05-09 2008-11-12 Crucell Holland B.V. Cultures of e1-immortalized cells and processes for culturing the same to increase product yields therefrom
WO2005014655A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
BRPI0414887A (pt) 2003-09-29 2006-12-12 Warren Pharmaceuticals Inc E T métodos de tratamento, prevenção, retardo do inìcio ou redução dos efeitos de citocinas pró-inflamatórias em um mamìfero e de tratamento, prevenção, retardo do inìcio de uma condição associada com um efeito de citocinas pró-inflamatórias em um mamìfero, e, composição farmacêutica
PL2233150T3 (pl) 2003-12-30 2017-06-30 Bader Erytropoetyna do zastosowania w leczeniu ran lub transplantacji komórek
DE102004063927A1 (de) 2004-01-23 2005-12-15 Epoplus Gmbh Co.Kg Einsatz von niedrig dosiertem Erythropoietin zur Stimulation endothelialer Vorläuferzellen sowie zur Organregeneration und Progressionsverlangsamung von Endorganschäden
TWI417303B (zh) 2004-03-11 2013-12-01 Fresenius Kabi De Gmbh 經由還原胺化作用製得之羥烷基澱粉及蛋白質的接合物
EP1732609B1 (en) 2004-03-11 2012-07-11 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
GB0507123D0 (en) * 2005-04-08 2005-05-11 Isis Innovation Method
WO2007102812A2 (en) * 2006-03-07 2007-09-13 Regenetech, Inc. Natively glycosylated mammalian biological molecules produced by eletromagnetically stimulating living mammalian cells
EP1762250A1 (en) 2005-09-12 2007-03-14 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyalkyl starch and an active substance, prepared by chemical ligation via thiazolidine
AR053416A1 (es) * 2005-11-10 2007-05-09 Protech Pharma S A Combinacion de glicoisoformas para el tratamiento o prevencion de la septicemia, linea celular transgenica productora de glicoformas de eritropoyetina, composicion farmaceutica que comprende a dicha combinacion, procedimientos para obtener la linea celular, procedimiento para producir dicha combinac
KR20080095868A (ko) 2006-01-18 2008-10-29 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 시알산의 제거 방법 및 아시알로에리스로포이에틴의 제조방법
DE102006004008A1 (de) 2006-01-27 2007-08-02 Hannelore Prof. Dr. Dr. Ehrenreich Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Multipler Sklerose, sowie Verwendung von Erythropoietin zur Herstellung eines Arzneimittels zur intermittierenden Behandlung und/oder intermittierenden Prophylaxe von Multipler Sklerose
US8546329B2 (en) 2006-03-22 2013-10-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Erythropoietin solution preparation
KR20090046923A (ko) 2006-08-04 2009-05-11 프로롱 파마슈티컬스, 인크. 수식된 에리스로포이에틴
WO2009010107A1 (en) 2007-07-19 2009-01-22 Hannelore Ehrenreich Use of epo receptor activation or stimulation for the improvement of the edss score in patients with multiple sclerosis
EP2070950A1 (en) 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Hydroxyalkyl starch derivatives and process for their preparation
EP2095829A1 (en) 2008-02-27 2009-09-02 LEK Pharmaceuticals D.D. Selenium containing modifying agents and conjugates
DE102008002209A1 (de) 2008-06-04 2009-12-10 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Aufreinigung von Erythropoietin
DE102008002210A1 (de) 2008-06-04 2009-12-10 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur fermentativen Herstellung von Erythropoietin
US20120172299A1 (en) 2008-09-23 2012-07-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Purification of erythropoietin
DE102008054716A1 (de) 2008-12-16 2010-06-17 Evonik Degussa Gmbh Inprozesskontrolle in einem Verfahren zur Herstellung von EPO
US20100272816A1 (en) 2009-04-27 2010-10-28 Wolfgang Rudinger Microcapsules comprising liver cells and erythropoietin, methods for preparing said microcapsules and methods for treating a patient comprising applying said microcapsules to the patient
UA107678C2 (uk) 2009-09-23 2015-02-10 ратіофарм ГмбХ Процес очищення рекомбінантного людського еритропоетину (епо), епо, очищений таким чином, та фармацевтична композиція, що містить його
WO2017068051A1 (en) 2015-10-21 2017-04-27 Lek Pharmaceuticals D.D. Peg-based dendron and process for producing the same
CN106906359B (zh) 2015-12-22 2018-12-11 理查德.亨威克 从硅酸盐矿物收取锂
EP3570871B1 (en) 2017-03-20 2020-11-18 H. Hoffnabb-La Roche Ag Method for in vitro glycoengineering of an erythropoiesis stimulating protein
WO2022159414A1 (en) 2021-01-22 2022-07-28 University Of Rochester Erythropoietin for gastroinfestinal dysfunction

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US439780A (en) * 1890-11-04 Method of and apparatus for casting ingots
US3865801A (en) * 1973-06-15 1975-02-11 Atomic Energy Commission Stabilization of urinary erythropoietin using sodium p-aminosalicylate and extracting into phenol
JPS5455790A (en) * 1977-10-05 1979-05-04 Tomoyuki Tajima Production of erythropoetin
JPS5653696A (en) * 1979-10-09 1981-05-13 Ajinomoto Co Inc Isolation of erythropoietin by adsorption
JPS6045849B2 (ja) * 1980-08-25 1985-10-12 林原 健 ヒトエリトロポエチンの製造方法
US4419446A (en) * 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
JPS6043395A (ja) * 1983-08-19 1985-03-07 Sumitomo Chem Co Ltd エリスロポエチンの製造法
NZ210501A (en) * 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
IT1185503B (it) * 1984-01-11 1987-11-12 Univ New York Cloni di odna di eritropietina umana
JPS60215632A (ja) * 1984-04-12 1985-10-29 Japan Found Cancer エリスロポエチンの製造法
US4732889A (en) * 1985-02-06 1988-03-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition for the treatment of the anemia of rheumatoid arthritis
JPH062070B2 (ja) * 1988-07-06 1994-01-12 農林水産省食品総合研究所長 ▲ｏ下−▼アシルアミノ酸の製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
ES549539A0 (es) 1987-10-16
EP0205564B2 (en) 2000-06-21
IL77081A0 (en) 1986-04-29
NO304469B1 (no) 1998-12-21
JPH02442A (ja) 1990-01-05
LV10507B (lv) 1996-06-20
DK368786D0 (da) 1986-08-01
PT81590A (en) 1986-01-01
LV10505A (lv) 1995-02-20
NO863050D0 (no) 1986-07-28
LV10507A (lv) 1995-02-20
MD940371A (en) 1996-06-28
EP0205564A4 (en) 1987-12-14
PL154180B1 (en) 1991-07-31
KR890001011B1 (en) 1989-04-18
CZ286557B6 (cs) 2000-05-17
EP0411678B2 (en) 2000-01-12
GR852890B (hu) 1986-04-03
AU5313486A (en) 1986-07-01
DK173293B1 (da) 2000-06-13
DK200000527A (da) 2000-03-29
GEP19970775B (en) 1997-01-27
EP0205564A1 (en) 1986-12-30
HUT40706A (en) 1987-01-28
DK172953B1 (da) 1999-10-18
KR870700099A (ko) 1987-02-28
DK199901147A (da) 1999-08-20
CZ287620B6 (cs) 2001-01-17
DK173254B1 (da) 2000-05-22
PT81590B (pt) 1987-10-20
SK279765B6 (sk) 1999-03-12
MD1639C2 (ro) 2001-10-31
SK168799A3 (en) 2001-08-06
DE3585161D1 (de) 1992-02-20
CZ127496A3 (cs) 2000-02-16
WO1986003520A1 (en) 1986-06-19
SK880485A3 (en) 1999-03-10
DK95197A (da) 1997-08-20
JPH01257480A (ja) 1989-10-13
CZ281756B6 (cs) 1997-01-15
FI19992064A (fi) 1999-09-27
JPH07184681A (ja) 1995-07-25
AU621535B2 (en) 1992-03-19
LV10505B (en) 1996-04-20
UA44882C2 (uk) 2002-03-15
ATE71408T1 (de) 1992-01-15
HK105593A (en) 1993-10-15
FI863044A0 (fi) 1986-07-24
EP0411678B1 (en) 1992-01-08
CZ880485A3 (en) 1996-08-14
ES8800049A1 (es) 1987-10-16
DK368786A (da) 1986-08-01
DE411678T1 (de) 1991-10-17
EP0411678A1 (en) 1991-02-06
FI105347B (fi) 2000-07-31
IL77081A (en) 1999-10-28
MD1639B2 (en) 2001-03-31
FI104261B (fi) 1999-12-15
FI863044A (fi) 1986-07-24
ATE63137T1 (de) 1991-05-15
PL256589A1 (en) 1986-10-21
DK175826B1 (da) 2005-03-14
JPH02104284A (ja) 1990-04-17
DE3582732D1 (de) 1991-06-06
SK281799B6 (sk) 2001-08-06
EP0205564B1 (en) 1991-05-02
FI104261B1 (fi) 1999-12-15
JPH0655144B2 (ja) 1994-07-27
HK105693A (en) 1993-10-15
NO863050L (no) 1986-07-28
CA1341502C (en) 2006-03-21
PL157926B1 (pl) 1992-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU216079B (hu) Eljárás eritropoietin előállítására
TW203100B (hu)
JP2957974B2 (ja) エリスロポエチン活性を有するタンパク質の製造方法
RU2129613C1 (ru) Способ получения эритропоэтина человека
LT3944B (en) Method for the production of erythropoietin
AU5711199A (en) Method for the production of erythropoietin
KR930005917B1 (ko) 에리트로포이에틴의 제조방법
AU604051B2 (en) Recombinant human erythropoietin
DD251788A5 (de) Verfahren zur Herstellung eines menschlichen cDNA-Klons
DD279687A5 (de) Verfahren zur herstellung von erythropoietin
MXPA99010042A (en) Recombinant human erythropoyetine productive cellular line and the recombinant human erythropoyetine produced by this cell

Legal Events

Date Code Title Description
HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: GENETICS INSTITUTE, LLC, US