JPH02104284A - エリトロポエチンを発現するヒトｃＤＮＡまたはヒトｇＤＮＡのクローニング方法 - Google Patents

エリトロポエチンを発現するヒトｃＤＮＡまたはヒトｇＤＮＡのクローニング方法

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JPH02104284A
JPH02104284A JP63065592A JP6559288A JPH02104284A JP H02104284 A JPH02104284 A JP H02104284A JP 63065592 A JP63065592 A JP 63065592A JP 6559288 A JP6559288 A JP 6559288A JP H02104284 A JPH02104284 A JP H02104284A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は驚くほど高い発現レベルを示すヒトエリトロポ
エチンのクローン化遺伝子、その組換えＤＮＡベクター
、および該組換えベクターで哺乳動物細胞を形質転換さ
せて得られる形質転換体に関するものである。
発明の背景 エリトロポエチン（以後ＥＰＯと略す）は高等動物にお
ける赤血球の形成を促進する循環系中の糖タンパク質で
ある。例えば、カルノー（ｃａｒｎｏＤらのＣｏｍｐｔ
、　Ｒｅｎｄ、、　１４３　：　３８４　（１９０６）
を参照されたい。それゆえ、ＥＰＯは赤血球形成促進因
子とも呼ばれている。
ヒト赤血球の寿命は約１２０日間である。従って、全赤
血球の約１／１２０は細網内皮系で毎日破壊される。同
時に、比較的一定数の赤血球が常時赤血球レベルを維持
するために毎日生産される〔ガイトン（Ｇｕｙｔｏｎ）
のＴ’ｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　ＭｅｄｉｃａｌＰｈｙｓ
ｉｏｌｏｇｙ、　　ｐ、５６−６０．　　Ｗ、　　Ｂ、
　　５ａｕｎｄｃｒｓ　　Ｃｏ、、　フ　、イラデルフ
ィア（１９７６）を参照〕。
赤血球は骨髄中で赤芽球の成熟および分化により生産さ
れ、ＥＰＯは未分化の前駆細胞に作用してそれらの細胞
の赤血球への分化を誘起する因子である（ガイトンの上
記文献参照）。
ＥＰＯは貧血、特に腎性貧血の臨床治療のための有望な
治療薬剤である。しかしあいに（ＥＰＯは、治療剤とし
て使用するのに必要な十分量を入手することが容易でな
いため実際上の医療面において未だ普及していない。
ＥＰＯを治療薬剤として使用するためには、抗原性の問
題を考慮しなければならないだろう。
従って、ＥＰＯはヒト由来の原料から生産されるのが好
ましい。例えば、再生不良性貧血または同様の症状をも
つ患者（大量のＥＰＯを排畠する）からの血液もしくは
尿が使用できる。例えば、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）らの
Ｒｅｃ、　Ｐｒｏｇｒ、　Ｉｌｏｒｍ、　Ｒｅｓ、。
１６　：　２１９　（１９６０）　；エスパダ（Ｅｓｐ
ａｄａ）らのＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｍｅｄ、、　３　：　
４７５　（１９７０）　；　フィッシャーおよびゴート
ン（Ｇｏｒｄｏｎ）のＶｌｔａｍ、　Ｈｏｒｍ、　（Ｎ
、Ｙ、）３１　：　１０５　（１９７３）を参照された
い（これらの文献の記載内容は明細書の一部として引用
される）。
上記のとおり、ＥＰＯは一般に高いＥＰＯレベルを示す
患者（例えば、再生不良性貧血や同様の症状をもつ患者
）からの尿を濃縮および精製することにより製造される
。例えば、米国特許第４３９７８４０号；同第４３０３
６５０号；および同第３８８５８０１号の各明細書を参
照されたい（これらの特許の記載内容は明細書の一部と
して引用される）。しかしながら、この種の尿の供給量
は限られているため、ＥＰＯの実際上の使用は制限され
ている。このため、健康なヒトの尿からもＥＰＯ産物を
得ることが非常に望ましい。しかしながら、健康なヒト
から採取した尿を使用する際の１つの問題点は、そのＥ
ＰＯ含有量が貧血患者の尿と比較して低いということで
ある。さらに、健康なヒトの尿は赤血球形成に対して作
用するいくつかの阻害因子を相当に高濃度で含んでいる
ために、満足のゆく治療効果を得るには高度精製後に得
られるＥＰＯを使用しなければならないと考えられる。
ＥＰＯはヒツジの血漿から回収することもでき、この種
の血漿からＥＰＯを分離して満足すべき効力を有し、安
定な水溶性製剤が得られる。ゴールＲ，Ｌｉ５ｓ、　Ｉ
ｎｃ、、ニューヨーク　（１９８０を参照されたい（各
々の文献については明細書の一部として引用される）。
しかしながら、ヒツジＥＰＯはヒトに対して抗原性があ
ると予測される。
以上に述べたとおり′、ＥＰＯは有望な治療薬剤である
にもかかわらず、天然供給源から通常の単離／精製技術
で大歯生産することは困難である。
スギモト（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ）らの米国特許第４３７７
５１３号明細書は、Ｎａｍａｌｗａ、　ＢＡＬＬ−１，
ＮＡＬＬ−１，ＴＡＬＬ−１およびＪＢＬを含めたヒト
リンパ芽球細胞のｉｎ　ｖｉｖ。
増殖操作によるＥＰＯの大量生産方法を開示している。
その他にも遺伝子工学技術を用いるＥＰＯの生産に関す
る報告がなされている（例えば、本出願の優先日後に国
際公開されたＷ　Ｏ８５／　０２６１０号およびＷ　Ｏ
８５／　０３０７９号を参照）。しかし、その生産技術
の詳細や、その生産物の化学的性質は未だに発表されて
いない。これとは対照的に、本発明はヒトＥＰＯの生物
学的性質を有するタンパク質の人足生産を可能にする方
法を提供するものである。また、本発明の方法により、
天然のヒトＥＰＯと化学的に異なるかも知れないが類似
の（場合によっては改良された）性質を示すタンパク質
を生産することも可能となる。便宜上、ヒトＥＰＯの生
物学的性質を示すこの種のタンパク質は、ヒトＥＰＯと
化学的に完全同一でないものも含めて、本明細書中で以
後ＥＰＯと総称する。
発明の概要 本発明は驚くほど高いレベルのヒトＥＰＯを発現する遺
伝子のクローニング、その発現組換えＤＮＡベクターお
よび数組換えＤＮＡベクターで形質転換させて、活性ヒ
トＥＰＯをｉｎ　ｖｌｔｒｏで大量に生産できる形質転
換体に関する。
以下でより詳細に説明するように、本発明者らは先ず、
再生不良性貧血患者の尿より部分精製された形で得られ
たＥＰＯを均一になるまでさらに精製し、トリプシンで
消化して特定のフラグメントを得た。これらのフラグメ
ントを精製してそのアミノ酸配列を決定した。これらの
配列に基づいてＥＰＯオリゴヌクレオチドを推定し、そ
して合成した。合成したオリゴヌクレオチドを使用して
ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングし、そのライ
ブラリーからＥＰＯ遺伝子を単離した。
単離されたものがＥＰＯ遺伝子であることは、アミノ酸
配列が決定された上記トリプシン消化タンパク質フラグ
メントの多くに対応する事実に基づいて証明された。さ
らに、単離された上記ゲノムクローンの一断片を使用し
て、ノ１イブリダイゼーション法によりヒト胎児（２０
週１）ｍＲＮＡ中のＥＰＯｍＲＮＡを単離し、ヒト胎児
肝臓ｃＤＮＡライブラリーを作成して、ゲノムクローン
の一断片から作成されたプローブでスクリーニングした
。７５０，０００以上の組換え体をスクリーニングした
後に３個のＥＰＯｃＤＮＡクローンが得られた。これら
のクローンのうち２つが、完全なコーディング配列およ
び実質的な５−プライムおよび３−プライム非翻訳配列
を持つことから、全長のＥＰＯｃＤＮＡであると決定さ
れた。これらのｃＤＮＡはＳ　Ｖ　−４０ウイルス由来
のベクターに挿入し、このベクターで形質転換したサル
細胞（ｃＯ８−１細胞株：グラズマン（Ｇｌｕｚｍａｎ
）、　Ｃｅ１ｌ　２３　：　１７５−１８２　（１９８
１）を参照〕およびチャイニーズハムスター卵巣細胞（
ｃＨＯ細胞株；アーラウプ（Ｕｒｌａｕｂ、　Ｇ、）お
よびカーシン（ｃｈａｓｉｎ、　Ｌ、　Ａ、）のＰｒｏ
ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ１゜ＵＳＡ　７７
　：　４２１Ｂ−４２８０（１９８０）を参照〕の両細
胞内で発現させた。ＣＯ８細胞から生産されたＥＰＯお
よびＣＨＯ細胞から生産されたＥＰＯは共にｉｎ　ｖｌ
ｔｒｏおよびｉｎ　ｖｌｖｏにおいて生物学的に活性な
ＥＰＯである。
クローン化されたＥＰＯｃＤＮＡは第３表に示すように
コーディング領域の２０〜３０ヌクレオチド上流にイニ
シエーターおよびターミネータ−を有する１４〜１５ア
ミノ酸の興味あるオープン・リーディング・フレームを
有する。クローン化ＥＰＯｃＤＮＡでトランスフェクシ
ョンされた代表的な大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）サンプルは
、メリーランド州ロックビルのアメリカンφタイプ・カ
ルチャー・コレクションに寄託され、寄託番号ＡＴＣＣ
４０１５３のちとに入手可能である。
表の説明 第１表はヒ）ＥＰＯ遺伝子中の８７塩基対からなるエク
ソン部分の塩基配列を示すものであり；第２表はヒトＥ
ＰＯｃＤＮＡのクローンの一つラムダ−ＨＥＰＯＦＬ１
３のヌクレオチド配列から推定されたＥＰＯタンパク質
のアミノ酸配列を示し； 第３表はラムダ−ＨＥＰＯＦＬ１３中のＥＰＯ・ｃＤＮ
Ａのヌクレオチド配列およびそれから推定される第２表
のものと同じアミノ酸配列杢示し；第４表は第４図に示
すＥＰＯ遺伝子のｇＤＮＡ配列を示し； 第５表はヒトＥＰＯｃＤＮＡクローン、ラムダ−ＨＥＰ
ＯＦＬ６中のＥＰＯｃＤＮＡのヌクレオチド配列とそれ
から推定されるアミノ酸配列を示し； 第６表はヒトＥＰＯｃＤＮＡクローン、ラムダ−ＨＥＰ
ＯＦＬ８中のＥＰＯｃＤＮＡのヌクレオチド配列とそれ
から推定されるアミノ酸配列を示し； 第７表は第３表と同じもので、ヒトＥＰＯｃＤＮＡクロ
ーン、ラムダ−ＨＥＰＯＦＬ１３中のＥＰＯｃＤＮＡの
ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。
詳細な説明 本発明はヒトＥＰＯｃＤＮＡのクローニングおよびその
ｃＤＮＡのｉｎ　ｖｉｔｒｏ発現によるＥＰＯの生産に
使用する組換えＤＮＡベクターおよびその形質転換体に
関する。
ヒトＥＰＯｃＤＮＡは、次のようにして得ることが可能
である。なお、明細書中で使用する（１）から（１７）
の数字は、本明細書の終わりに番号順に掲載した刊行物
を意味する。
ヒトＥＰＯのゲノムクローンの単離 先ずヒトＥＰＯを以下で説明するように再生不良性貧血
に悩む患者の尿等の材料から均一に精製する。この精製
ＥＰＯをタンパク質分解酵素トリプシンで完全消化して
フラグメントを得、これらのフラグメントを逆相高速液
体クロマトグラフィーで分離し、勾配画分から回収し、
そして微量アミノ酸配列分析法にかける。この分析によ
り決定される各トリプシン消化フラグメントのアミノ酸
配列は、例えば第２表および第３表において下線が施さ
れた部分に相当する。これらのうち、適当なフラグメン
ト、好ましくはＶａｌ−ＡｓローＰｈｅ−Ｔｙｒ−Ａｌ
ａ−Ｔｒｐ−ＬｙｓおよびＶａｉＴｙｒ−５ｅｒ−Ａｓ
ｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇを選んで、その配列に対応
するオリゴヌクレオチドプローブを合成する。前者のト
リプシン消化フラグメン［・からは１７ヌクレオチド長
の３２種類のオリゴヌクレオチドプールと１８ヌクレオ
チド長の１２８種類のオリゴヌクレオチドプール、およ
び後者のトリプシン消化フラグメントからは各々１４ヌ
クレオチド長の４８種類の２つのプールがそれぞれ得ら
れる。これらのうちから、３２種類の１７オリゴヌクレ
オチド（以下ｍａｒと略す）プールを使用してＣｈａｒ
ｏｎ　４Ａ　　（ｃｈ４Ａ）ベクター（３）中のヒトゲ
ノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。なお、
スクリーニングはウー（Ｗｏｏ）およびオマレー（０’
Ｍａｌ　Ｉｅｙ）のｉｎ　５ｉｔｕ増幅法（１１）の変
法を使用できる。スクリーニング用のフィルター調製そ
の他の詳細は、実施例１で詳述する。
１７ｍａｒとハイブリダイズするファージを採取し、小
グループ別にプールし、そしてプローブとして１４ｍｅ
ｒおよびＬ８ｍｅｒプールを使用してさらに検索する。
１７Ｉｌｌｅｒおよび１４ｍｅｒプールとハイブリダイ
ズするファージをプラーク精製し、精製ファージの塩基
フラグメントをＭ１３ファージベクター中にサブクロー
ニングして、サンガー（ｓＨｎｇｅｒ）およびクールメ
ン（ｃｏｕｌｓｏｎ）のジデオキシ・チエインφターミ
ネーション法（４）　（１９７７）により塩基配列を決
定する。本発明者らが得た一つのクローン中の、３２種
類の１７ｍａｒとハイブリダイズする領域の塩基配列を
第１表に示す。このＤＮＡ配列は、オープン・リーディ
ング番フレーム内に１７ｍｅｒプールのオリゴヌクレオ
チドを推論するのに使用したトリプシン消化フラグメン
トを正確にコードしうるヌクレオチドを含んでいた。さ
らに、分析結果はこのＤＮＡ配列は、１７ｍａｒとハイ
ブリダイズする領域がスプライス受容部位と供与部位（
夫々第１表中、ａおよびｄで示される）によって境界さ
れる８７ｂｐのエクソン内に含まれることを示した。
ＥＰＯｃＤＮＡクローンの単離 次に、上記で得られたＥＰＯのゲノムＤＮＡをプローブ
として、適当なヒトｃＤＮＡライブラリーからＥＰＯｃ
ＤＮＡを単離する。本発明者らの研究によれば、胎児肝
臓ｍＲＮＡから作られたヒトｃＤＮＡライブラリーがこ
の目的に最適であった。即ち、本発明者らは、第１表に
示す８７ｂｐ工クソン部分を含む前記Ｍ１３クローンか
ら９５ヌクレオチド−本鎖を調製し、これをプローブと
して用いて、ヒト胎児（２０週１）肝臓ｍＲＮＡのノー
ザン分析（１５）を行った。第１図に示すように、強い
シグナルが胎児肝臓ｍＲＮＡ中に検出された。そこで同
じプローブを使って胎児肝臓ｍＲＮＡからバクテリオフ
ァージラムダ中に作られたｃＤＮＡライブラリーをスク
リーニングしたところ（５）、スクリーニングした２５
０．０００個の組換え体当たり約１個の陽性クローンの
頻度で、数個のハイブリダイズするクローンが得られた
。これらのｃＤＮＡクローン（ラムダ−ＨＥＰＯＦＬ１
３およびラムダ−ＨＥＰＯＦＬ８と命名した）の完全な
ヌクレオチド配列およびそれから推定されたアミノ酸配
列を第３表と第６表に示す。ＥＰＯコーディング情報は
非常に疎水性の２７個のアミノ酸からなるリーダ一部分
と１６６個のアミノ酸からなるマチュア部分を含むｃＤ
ＮＡの５−プライム側半分の５９４ヌクレオチド内に含
まれる。なお、マチュアタンパク質のＮ末端の推定は、
ゴールドバッサ−（Ｇｏｌｄｖａｓｓｅｒ）　（８）　
、スー（５ｕｅ）およびシトコツスキー（Ｓｙｔｋｏｖ
ｓｋｌ）　（７）、およびヤナガワ（Ｙａｎａｇａｗａ
）　（２）により発表された結果、または本発明者らが
別に決定した再生不良性貧血患者の尿中に排泄されたタ
ンパク質のＮ末端配列に基づいた。このＮ末端（Ａｌａ
−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ・・・）が循環中のＥＰＯに
見られる実際のＮ末端であるのかどうか、または腎臓や
尿中でいくつかの切断が起こるのかどうか今のところ不
明である。
第２表および第３表で下線を施したアミノ酸配列は、タ
ンパク質配列情報が得られたトリプシン消化フラグメン
トまたはＮ末端の部分を示す。りローン化されたｃＤＮ
Ａ配列から推定されたアミノ酸配列は、アミノ酸配列が
決定されたトリプシン消化フラグメントと正確に一致し
、単離されたｃＤＮＡはヒトＥＰＯをコードすることが
確かめられた。
ヒトＥＰｏ遺伝子の構造および塩基配列Ｃｈ４Ａベクタ
ー（３）に組込まれたヒトゲノムＤＮＡライブラリーを
作製し、先に得られた２種類のＥＰＯｃＤＮＡクローン
から調製されたオリゴヌクレオチドプローブ及び他の種
々のプローブを用いてハイブリダイゼーション分析を行
った。
この分析により４個の独立したヒトＥＰＯゲノムクロー
ン（ｇＤＮＡ）を得、またこれらクローンのＤＮＡ挿入
物の相対位置を確認し７て第３図に示した。第３図に黒
い線で示される約３．３ｋｂ領域内にＥＰＯ遺伝子が存
在することが示されている。
この領域の完全な塩基配列分析（参考例１を参照）およ
びｃＤＮＡクローンとの比較から、第４図に示されるＥ
ＰＯ遺伝子のイントロンおよびエクソン構造の地図を描
くことができた。ＥＰＯ遺伝子は５個のエクソンに分割
される。エクソンＩの一部、エクソン■、■および■の
全部、およびエクソンＶの一部がタンパク質コーディン
グ情報を含む。エクソンエおよび■の残部はそれぞれ５
−プライムおよび３−プライム非翻訳配列をコードする
。
こうして得られるクローン（本明細書中ではラムダ−Ｈ
ＥＰＯＩおよびラムダ−ＨＥＰＯ２と呼ぶ２つのクロー
ンが得られた）が完全なＥＰＯゲノムクローンであると
いうことは、他のトリプシン消化フラグメントのコーデ
ィング情報を含んだ別のエクソンの塩基配列を決定する
ことにより確認できた。
ＣＯ８細胞によるＥＰＯの発現 本発明は、単離されたＥＰＯｃＤＮＡを含む組換えＤＮ
Ａベクターを調製しそれを用いて哺乳動物細胞を形質転
換させ、そして活性なＥＰＯを生産する方法も提供する
。得られたｃＤＮＡが生物学的に活性なＥＰＯを１ｎ　
ｖｉｔｒｏ細胞培養細胞培養石発現し得ることを確認す
るためには、Ｃ１ｕｚａ＋ａｎの方法でＣＯ８細胞の形
質発現実験を行う（１６）。この試験的発現に使用可能
なベクターｐ９１０２３　（Ｂ）は実施例４に示される
。このベクターはアデノウィルス主要後期プロモーター
（ＩＩｌａｊｏｒ　１ａｔｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、Ｓ
Ｖ４０ポリＡ付加配列、ＳＶ４０複製開始点、ＳＶ４０
エンハンサ−１およびアデノウィルスＶＡ遺伝子を含む
。前記ｃ　ＤＮＡクローン、例えばラムダ−ＨＥＰＯＦ
ＬＬ３（第７表を参照）中のｃＤＮＡ挿入物をｐ９１０
２３　（Ｂ）ベクター内のアデノウィルス主要後期プロ
モーターの下に連結挿入する。本発明者らは、このよう
にして得られた新しいベクターをｐＰＴＦＬ１３と命名
した。
こうして構築されたベクターで、例えばＣ０８−１細胞
のＭ６株〔ホロビッツ（Ｈｏｒｏｗｌｔｚ）らのＪ、　
Ｈｏｔ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　２　：　１４７
−１４９　（１９８３）を参照〕をトランスフェクショ
ンし、約２４時間後に細胞を洗浄し、無血清培地に変え
、そして約４８時間後に培養上清を集める。そして、培
養上清中に放出されたＥＰＯの量をＥＰＯに関するＳｈ
ｅｒｗｏｏｄ、　Ｊ、　Ｂ、らの定量的ラジオイムノア
ッセイを用いて試験する（１４）。この方法によれば、
第８表（実施例５）に示すように、免疫学的に反応性を
有するＥＰＯの発現が検出される。生産されたＥＰＯの
生物学的活性も試験できる。例えば、本発明者らは培地
中のＥＰＯを２つのｉｎ　ｖ１ｔｒｏバイオアッセイ（
３Ｈ−チミジンおよびＣＦＵ−Ｅ（１，８））および２
つのｉｎ　ｖｉｖｏアッセイ〔低酸素性マウスおよび飢
餓ラット（９，１０）　］により定出代した（実施例６
の第９表を参照）。これらの結果は、生物学的に活性な
ＥＰＯがＣＯＳ　−１細胞で生産されることを示してい
る。
本発明の方法で生産されたＥＰＯがヒト尿から得られた
天然ＥＰＯと同じものであることは、ポリクローナル抗
ＥＰＯ抗体を、使用するウェスターンブロッティング（
Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ）により、５ＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル上で同じ移動度を有しているこ
とから証明された（実施例７を参照）。従って、ＣＯ８
−１細胞で生産されたＥＰＯのグリコジル化の程度は天
然ＥＰＯのそれと同様でありうる。
本発明はまた、ヒトＥＰＯｃＤＮＡの発現のために特に
好適な、他のプロモーターを含む異なるベクターを使用
した、極めて効率的なＥＰＯの生産法も開示する。その
ようなベクターは、ＣＯ８細胞もしくは他の哺乳動物細
胞において使用することができる。本発明の実施に有用
なこの種の他のプロモーターの例にはＳＶ４０初期およ
び後期プロモーター、マウスメタロチオネイン遺伝子プ
ロモーター、トリまたは哺乳動物レトロウィルスの長い
末端繰返し配列中に見出されるプロモーター、バキュロ
ウィルスポリヘドロン遺伝子プロモーターおよびその他
のものが含まれる。
本発明の実施に際して有用な他の細胞の例にはＣＨＯ（
チャイニーズハムスター卵巣）　、Ｃ１２７（サル上皮
）、３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＣＶ−１（アフリカ
ン・グリーン・モンキー腎臓）のような哺乳動物細胞が
含まれる。このように本発明の形質転換体は、哺乳動物
細胞を用いる。
これは大腸菌等の微生物に比べＥＰＯが細胞外へ分泌さ
れるためＥＰＯの精製が容易であること、また生物的活
性に寄与する糖鎖が付加するという利点があるためであ
る。これらの特定のプロモーターおよび／または細胞は
ＥＰＯの発現タイミングや発現レベルの調節、細胞に特
異的な型のＥＰＯの生産、または比較的費用がかからず
容易に制御できる条件下でのＥＰＯ生産細胞の大量増殖
を可能にしうる。細胞培養培地は一般に栄養素塩類溶液
と１０％ウシ胎児血清である。
ＣＨＯ，Ｃ１２７および３Ｔ３によるＥＰＯ発現の例は
実施例９および１０（ｃＨＯ）ならびに１２（ｃ１２７
と３Ｔ３）に示される。
実施例１０のようにＣＨＯ細胞により生産された組換え
ＥＰＯは慣用のカラムクロマトグラフィー法により精製
した。糖タンパク質中に存在する糖の相対伝は、２つの
独立した方法〔（Ｉ）レインホールド（Ｒｅｉｎｈｏｌ
ｄ）、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　５
０　：２４４−２４９−　（メタツリシス）および（１
１）タケモト（Ｔａｋｅｍｏｔｏ、　Ｈ，）らのＡｎａ
ｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１４５　：　２４５（１９８
５）　（独立したシアル酸測定を伴うピリジルアミノ化
）〕で分析された。これらの方法のそれぞれによって得
られた結果は申し分なく一致した。
こうして、いくつかの測定が行われて次の平均値を得た
（この場合比較目的のために、Ｎ−アセチルグルコサミ
ンを１とする）。
糖　　　　　相対モル量 Ｎ−アセチルグルコサミン　　１ ヘキソース類：１．４ ガラクトース　　　　０．９ マンノース　　　０．５ Ｎ−アセチルノイラミン酸　　１＊ フ　　　コ　　　−　　　ス　　　　　　　　　０．２
Ｎ−アセチルガラクトサミン　０．１ ＊Ｎ−アセチルノイラミン酸は不安定であり、その値は
約０．４〜約１の範囲で変動する。
両方の独立した糖分析法によって有意量のフコースとＮ
−アセチルガラクトサミンが再現可能に観察されたこと
は注目に値する。Ｎ−アセチルガラクトサミンの存在は
タンパク質における〇−結合グリコシル化の存在を示す
。〇−結合グリコシル化の存在はさらに種々の組合せの
グリコシド酵素による糖タンパク質の消化後の５ＤＳ−
ＰＡＧＥ分析によっても示された。特に、酵素ペプタイ
ド、Ｎ−グリコシダーゼＦを使用して、糖タンパク質の
全てのＮ−結合炭水化物を酵素的に除去した後、さらに
、ノイラミニダーゼ消化を行うとＳＤＳ　−ＰＡＧＥ分
析で測定したそのタンパク質の分子足はさらに減少した
。
精製された組換えＥＰＯのｉｎ　ｖｉｔｒｏ生物学的活
性は、アミノ酸組成のデータに基づいて計算されたタン
パク質定量値を使用するクリスタル（Ｇ、　Ｋｒｙｓｔ
ａｌ）のＥｘｐ、　Ｈｅｍａｔｏｌ、、　１１　：　６
４９　（１９８３）に記載の方法（肺臓細胞増殖バイオ
アッセイ）により検定した。複数の測定において、精製
組換えＥＰＯのｉｎ　ｖｉｔｒｏ比活性は２００．００
０単位／　ｍｇタンパク質以上であると計算された。平
均値は約２７５．０００〜３００，０００単位／　ｍｇ
タンパク質の範囲であった。さらに、ｓｏｏ、ｏｏｏ以
上の値も観察された。この組換え物質に対して観察され
たｉｎ　ｖｉｖ。
〔赤血球増加マウス検定；カザール（Ｋａｚａｌ）およ
びアースレブ（Ｅｒｓｌｅｖ）のＡｍ、　Ｃｌ１ｎｉｃ
ａｌ　Ｌａｂ、　Ｓｃｉ、。
Ｖｏｌ、　Ｂ、　ｐ９１　（１９７５）を参照）　／１
ｎ　ｖｉｔｒｏ活性比は０．７〜１．３であった。
先に示した糖タンパク質の特性と、本出願の優先口より
後の国際公開Ｗ　Ｏ８５／　０２６１０　（１９８５年
６月２０日付）〔特表昭６１−５０１６２７　（１９８
６年８月７日付）〕に記載されている組換えＣＨＯ生産
ＥＰＯ物質の特性とを比較することは興味のあることで
ある。上記公表公報明細書の第２６ページ左下欄に記載
されている対応する糖の比較分析は、Ｎ−アセチルグル
コサミン１に対してフコースおよびＮ−アセチルガラク
トサミンは、ゼロの値を、そしてヘキソース類は１５．
０９と大きな値を報告している。Ｎ−アセチルガラクト
サミンの不在は上記国際出願に報告された糖タンパク質
中に〇−結合グリコシルが存在しないことを示す。この
物質と対照的に、本発明の組換えＣＨＯ生産ＥＰＯは先
に性状決定がなされたように、再現可能に観察しうる有
意量のフコースとＮ−アセチルガラクトサミンの双方を
含み、ヘキソース類は相対全として１／１０以下であり
、そして〇−結合グリコシルの存在によって差異があり
、本発明で得られるＥＰＯはヒト尿から得られるＥＰＯ
と同一か近似のグリコジル化パターンを有する。さらに
、本発明の上記ＣＨＯ細胞由来組換えＥＰＯの高い比活
性はそのグリコジル化パターンと直接関連していると考
えられる。
本発明のクローン化ＥＰＯ遺伝子の哺乳動物細胞発現に
より生産された生物学的に活性なＥＰＯは、医師や獣医
師によるヒトおよび哺乳動物種の１ｎ　ｖ１ｖｏ治療に
使用できる。活性成分の量はもちろん治療しようとする
症状の程度、選ばれた投与経路、および活性ＥＰＯの比
活性に依るであろうが、最終的には主治医や獣医により
決定されるだろう。主治医によって決定された活性ＥＰ
Ｏのこのような世は、本明細書中で“ＥＰＯ治療治療有
効色量ばれる。例えば、ヒツジにおける慢性腎不全に伴
う増殖低下性貧血の治療において、ＥＰＯの一日の有効
量は１５〜４０日の間１０単位／ｋｇであることがわか
った。ニッシュバッハ（Ｅｓｃｈｂａｃｈ）らのＪ、　
Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　７４　：　４３４　　（
１９８４）を参照されたい。
活性ＥＰＯは治療しようとする症状に適する経路で投与
される。好ましくは、ＥＰＯは治療されるべき哺乳動物
の血流中に注射される。好適な投与経路は治療しようと
する症状ごとに変化する。
活性ＥＰＯは純粋な又は実質的に純粋な化合物として投
与することができるが、医薬配合物または医薬製剤とし
てそれを提供することが好ましい。
本発明を使用して得られる配合物は、上記のような活性
ＥＰＯタンパク質のほかに、１種または２種以上の薬剤
上許容される担体と他の治療成分を含有する。担体は配
合物の他の成分と共存でき且つそれを投与される者に有
害であってはならない。望ましくは、配合物としては酸
化剤やペプチドと共存できないような他の物質を含むべ
きでない。配合物は簡便には単位投与形体（ｕｎｉｔ　
ｄｏｓａｇｅｆｏｒｍ）で提供され、薬剤掌上よく知ら
れた方法により調製される。全ての方法は活性成分と１
種または２種以上の補助成分を含む担体とを混合する工
程を含む。一般に、配合物は活性成分と液体担体または
微細な固体担体またはその両者とを均一にかつ緊密に混
合し、その後必要に応じてその生成物を所望配合物へ成
形することにより作られる。
非経口投与に適する配合物は簡便には活性成分の滅菌水
溶液からなり、その際その溶液は受容者の血液と等張で
あるのが好ましい。この種の配合物は固体活性成分を水
に溶解して水溶液をつくり、その水溶液を滅菌すること
により適宜調製され、そして例えば密封アンプルやバイ
アルのような単位用量容器または多用量容器で提供され
る。
本発明で哺乳動物細胞にヒトＥＰＯを生産させるために
使用されるＥＰＯ／ｃＤＮＡにはＡＴＧコドンの後につ
ながるマチュアＥＰＯ／ｃＤＮＡ遺伝子、およびＥＰＯ
タンパク質の対立遺伝子変異体をコードするＥＰＯ／ｃ
ＤＮＡが含まれる。
１つの対立遺伝子は第３〜６表に示される。
ＥＰＯタンパク質にはＥＰＯタンパク質の１−メチオニ
ン誘導体（Ｍｅｔ　−Ｅ　Ｐ　Ｏ）およびＥＰＯタンパ
ク質の対立遺伝子変異体が含まれる。マチュアＥＰＯタ
ンパク質は第２表の配列Ａｌａ−ＰｒＯ−Ｐｒｏ−Ａｒ
ｇ・・・から始まる配列（最初のアミノ酸残基には番号
１（第２表）が付されている）によって示される。Ｍｅ
ｔ−ＥＰＯは配列Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａ
ｒｇ”・から始まる。
ＥＰＯ／ｃＤＮＡの発現の結果生成する糖タンパク質は
、形質転換体内または発現系外に存在するタンパク質分
解酵素の作用を受けることが充分者えられ、ＤＮＡ配列
から読みとられるアミノ酸配列１〜１６Ｂのすべてを備
えていないことがあり得る。例えばＣ末Ａｒｇの脱離が
、ＣＨＯ発現ＥＰＯについて見出されている。しかし、
この種の糖タンパク質もｉｎ　ｖｉｖｏ活性を有してお
り、本発明を使用して得られる目的物に含まれる。なお
、Ｃ末Ａｒｇの脱離はヒト尿ＥＰＯについても見出され
ており、ｉｎ　ｖｉｖｏ活性が保持されていることが確
認されている。
次の実施例は本発明を理解しやす（するためのものであ
り、本発明の真の範囲は請求の範囲によって説明される
。ここに記載の方法において多くの修飾が本発明の精神
から逸脱することなくなされ得ることを理解すべきであ
る。全ての温度は℃で表わされ未補正である。マイクロ
リッター、マイクロモル等に於けるマイクロの略号とし
て「μ」を用い、それぞれ「μ９」、「μｓ」として表
わす。
実施例 実施例１： ＥＰＯのゲノムＤＮＡ断片クローンの単離ＥＰＯのゲノ
ムＤＮＡを単離するには、ヒトゲノムＤＮＡライブラリ
ーから、適当なヌクレオチドプローブを用いてスクリー
ニングする必要がある。そのプローブの配列は、ＥＰＯ
のアミノ酸配列の少なくとも一部分に対応するものでな
ければならない。そこで、まず、ＥＰＯを再生不良性貧
血患者の尿からミャケらの方法〔ミャケ（Ｍｉｙａｋｅ
）らのＪ、　Ｂｌｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２５２　：　
５５５８　（１９７７）を参照〕で精製したが、゛但し
フェノール処理を省略しその代わりに８０℃で５分の熱
処理を行ってノイラミニダーゼを失活させた。精製の最
終工程は、０．１％トリフルオル酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）を
含む０〜９５％アセトニトリル勾配を１００分間で使用
するＣ−４Ｖｙｄａｃ　ＩＩＰＬＣカラム（Ｔｈｅ　５
ｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　Ｇｒｏｕｐ）での分画化により
行った。上記勾配中のＥＰＯの位置は、主要ピークのゲ
ル電気泳動およびＮ末端アミノ酸配列分析（２，６，７
）により測定した。
ＥＰＯは約５３％アセトニトリルで溶離され、逆相ＨＰ
ＬＣにかけたタンパク質の約４０％に相当した。
ＥＰＯを含む両分を次いで１００μｇになるまで蒸発さ
せ、重炭酸アンモニウムでｐＨ７、０に調節し、２％ト
シルフェニルアラニルクロロメチルケトン（Ｔ　Ｐ　Ｃ
Ｋ）処理トリプシンＵｌｏｒｔｈ１ｎｇｔｏｎ）により
３７℃で１８時間完全消化した。その後、トリプシン消
化物を上記と同様の逆相ＨＰＬＣにかけた。
２８０μｍおよび２１４μｍでの光学密度を監視した。
十分に分離した各ピークの成分を乾固状態近くにまで蒸
発させ、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４８
０Ａ型気相シークエネーターを使って直接Ｎ末端アミノ
酸配列分析（１７）にかけた。各ピークの成分は第２表
および第３表において下線が施されているアミノ酸配列
を有することが判明した。
先に述べたように、これらのトリプシン消化フラグメン
トのうち２つがヌクレオチドプローブの合成用に選ばれ
た。配列：　Ｖａｌ　−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ａｌ
ａ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ　（第２表および第３表のアミノ酸
４６〜５２）からは、３２種類（縮重）の７ｍａｒ ＡＡ ＴＴＣＣＡＮＧＣＧＴＡＧＡＡＧＴＴ および１２８種類の（縮重）の１８ｍａｒＡＡ ＣＣＡＮＧＣＧＴＡＧＡＡＧＴＴＮＡＣが合成された。
配列：　Ｖａｔ　−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−
Ｌｅｕ−Ａｒｇ　（第２表および第３表のアミノ酸１４
４〜１５０）からは、ロイシンコドンの第１位で異なる
それぞれ４８種類（縮重）の２つの１４ｍｅｒプ＝ル ＴＴＧＮ　　Ｔ　　Ｔ　　　　　　　　ＴＴＧＮ　　Ｔ
　　ＴＴＡＣＡＣＴＡＡＣＴＴＣＣＴ　　　　　ＴＡＣ
ＡＣＴＡＡＣＴＴＣＴＴが合成された。これらのオリゴ
ヌクレオチドプローブをポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎ
ｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）およびガンｖ３
２Ｐ　−Ａ　Ｔ　Ｐ　（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃ
ｌｅａｒ）を用いて３２ｐで５−プライム末端を標識し
た。オリゴヌクレオチドの比活性はオリゴヌクレオチド
１ミリモル当り１０００〜８０００Ｃ１であった。
この標識プローブを使用して、バクテリオファージラム
ダ中のヒトゲノムＤＮＡ　（ヒト染色体をＨａｅＩ［［
／ＡｌｕＩで切断したＤＮＡ断片）ライブラリー（ｃｈ
４Ａベクター使用）（ローン（Ｌａｗｎ）ら、３）をウ
ー（Ｗｏｏ）ら、　（１１）　（１９７８）によるｉｎ
　５ｉｔｕ増幅法の変法を用いてスクリーニングした。
即ち、ヒトゲノムＤＮＡを含む上記ファージ約３．５Ｘ
　１０５を１５０＋ｎｍペトリ皿（Ｎ　Ｚ　ＣＹＭ培地
）当り６０００フアージの密度でまいて、肉眼で見える
小さな（約０．５ｍｍ）プラークが形成されるまで３７
°Ｃでインキュベートした。４℃で１時間冷却後、プラ
ークパターンの２通りのレプリカをナイロン膜（Ｎｅｗ
　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）に移行させ、新し
いＮＺＣＹＭ平板上３７℃で一部インキユベートした。
その後、フィルターをそれぞれ０．５ＮＮａＯＨ−ＩＭ
　　ＮａＣ，ｆｆおよび０．５Ｍ　トリス（ｐＨ８）−
１Ｍ　　ＨａｅＩの薄膜上テ１ｏ分間ずつ処理すること
により変性および中和した。フィルターを８０℃で２時
間真空ベーキングした後、５×５ＳＣ１０，５％ｓＤｓ
で１時間洗い、’７　（／Ｌ、ター表面の細胞破砕物を
湿ったティッシュで穏やかにかき取ることにより除去し
た。このかき取りはプローブのフィルターへのバックグ
ラウンド結合を減少させた。次に、フィルターをＨ２゜
ですすぎ、３Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡ
　ＣΩ）　、ｌｏｍＭ　　Ｎ　ａ　Ｐ　０４（ｐＨ６，
８）、５　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓＳＯ，５％ＳＤＳ
およびｉｏｎ　ＭＥＤＴＡ中４８℃で４〜８時間プレハ
イブリダイゼーションを行った。その後、３２Ｐ−標識
１７［１Ｉｅｒを０．１ｐｍｏｌ／＋ｎｌの濃度で加え
て４８°Ｃで７２時間ハイブリダイゼーションを行った
。ハイブリダイゼーション後、フィルターを２　Ｘ　Ｓ
　Ｓ　Ｃ（０，３ＭＮ　ａ　（、Ｑ　−０，０３Ｍクエ
ン酸Ｎａ、ｐＨ７）で室温にて十分に洗浄し、さらに３
Ｍ　　ＴＭＡＣΩ−１０ｍ　Ｍ　　Ｎ　ａ　Ｐ　Ｏ、ｉ
　　（ｐｔ１８．８）で室温にて１時間、次にハイブリ
ダイゼーションを行った時と同じ温度（４８°Ｃ）で５
〜１５分間洗浄した。増感板を使用した２日間のオート
ラジオグラフィー後、約１２［の強いレプリカされたシ
グナルが検出された。
陽性ファージを拾って８プールに分け、再度ファージプ
ラークを形成させ、２枚のフィルターの各々に対しては
１４ｍｅｒプールの１／２ずつを使用し、２枚目のフィ
ルターに対しては１７ｍｅｒを使用して３通りの再スク
リーニングを行った。プラーク形成およびハイブリダイ
ゼーションの条件は先に述べた通りであるが、１４Ｉｌ
ｌｌｅｒについてのハイブリダイゼーションは３７℃で
行った。オートラジオグラフィー後、室温にて２０分間
５０％ホルムアミド中で１７ｍａｒフィルターからプロ
ーブを除去し、そのフィルターを５２℃で１８ｍａｒプ
ローブと再度ハイブリダイズさせた。２つの独立のファ
ージが３種のプローブ全部とハイブリダイズした。
これらのファージの１つ（本明細書ではラムダ−ＨＥＰ
ＯＩと呼ぶ）からのＤＮＡを５ａｕ３Ａで完全消化し、
ＭＬＳ中でサブクローニングし、サンガーおよびクール
ソン、（４）のジデオキシ会チエイン・ターミネーショ
ン法によるＤＮＡ配列分析のためにＭ２Ｓというベクタ
ー（市販品）に組込み、大腸菌に挿入し、増殖させた。
ＥＰＯトリプシン消化フラグメント（第１表下線領域）
をコードするオープンφリーディングΦフレームのヌク
レオチド配列および推定上のアミノ酸配列を本明細書中
第１表に示す。イントロン配列は小文字で表わされ、エ
クソン配列（８７ヌクレオチド）は大文字で表わされる
。コンセンサススプライス受容部位（ａ）および供与部
位（ｄ）と一致する配列には下線が施されている。第１
表の配列は、そのま＼第４表の配列の一部を構成してい
る。
実施例２：ヒト胎児肝臓ｍＲＮＡのノーザン分析本実施
例では上記ヒト胎児肝臓ｍＲＮＡのライブラリーを作成
し、このライブラリー中に目的とするｍＲＮＡが存在す
ることを確認し、またそのｍＲＮＡのおよそのサイズを
測定することを目的としている。
５μｇのヒト胎児肝臓ｍ　ＲＮ　Ａライブラリー（２０
週口の胎児肝臓から調製したもの）および成人肝臓ｍＲ
ＮＡライブラリーを０．８％アガロースホルムアルデヒ
ドゲルによる電気泳動に付し、ダーマン（Ｄｅｒｍａｎ
）らのＣｅ１１．２３　：　７３１　（１９８１）に記
載の方法を用いてニトロセルロースに移行させた。
これと別に、第１表に示す配列を挿入物中に含むＭ１３
テンプレートから、ノーザン分析用の９５ヌクレオチド
−本鎖プローブを作成した。その際、プライマーとして
は初めの１７ｍａｒプローブと同じトリプシン消化フラ
グメントから誘導された２０ｍｅｒのものを使用した。
プローブはアンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）らのＰＮ
ＡＳ、　（１２）　（１９８４）に記載された方法で作
成したが、５ｆｆｌａＩ消化（７４ヌクレオチドのコー
ディング配列を含む９５ヌクレオチド長の目的プローブ
をもたらす）後、０．１ＭＮ　ａ　ＯＨ−０，２Ｍ　　
ＮａＣΩ中セファ０−スＣ１４Ｂカラムでのクロマトグ
ラフィーによりその９５ｍｅｒの小さなフラグメントを
Ｍ１３テンプレートから精製した。
このプローブ約５　Ｘ　１１０６ｃｐを、上記ニトロセ
ルロースフィルターと６８℃で１２時間ハイブリダイズ
させ、６８℃にて２ｘＳＳＣで洗浄し、増感板を用いて
６日間感光させた。１２００ヌクレオチドの単一のマー
カーｍＲＮＡ　（矢印で示す）は隣接レーンで泳動させ
た。（第１図） その結果、ヒト胎児肝臓ｍＲＮＡライブラリー中に、プ
ローブとハイブリダイズする一本のバンドが見出された
。
実施例３：胎児肝臓ｃＤＮＡの単離 前記ノーザン分析の結果、胎児肝臓のｍＲＮＡからｃＤ
ＮＡライブラリーを作成し、この中からスクリーニング
を行えば、ヒトＥＰＯｃＤＮＡが単離できると予測され
た。そこで、実施例２に記載のプローブと同じ９５ｒ５
ｅｒのプローブを使用し、そして標準プラークスクリー
ニング〔ベントン・デービス（Ｂｅｎｔｏｎ　Ｄａｖｉ
ｓ）の５ｃｉｅｎｃｅ、　（１３）　（１９７７）を参
照〕方法を使用して、胎児肝臓ｍＲＮＡ誘導され、ベク
ターラムダ−Ｃｈ２１ＡＣトール（Ｔｏｏｌｅ）らのＮ
ａｔｕｒｅ、　（５）　　（１９８４）を参照〕中に作
られた胎児肝臓ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング
した。その結果、１×１０６個のプラークをスクリーニ
ングした後に３つの独立の陽性ｃＤＮＡクローン〔本明
細書ではラムダ−ＨＥＰＯＰＬ６　（１３５０ｂｐ）、
ラムダ−ＨＥＰＯＰＬ８　（７００ｂｐ）およびラムダ
−１１ＥＰＯＰＬ１３　（１４００ｂｐ）と呼ぶ〕を単
離した。
ラムダ−ＨＥＰＯＰＬ１３およびラムダ−ＨＥＰＯＦＬ
６の完全挿入物についてはＭ２Ｓでのサブクローニング
後に塩基配列を決定した。それぞれの塩基配列を第７表
および第５表に示す。ラムダ−ＨＥＰＯＰＬ８について
も部分的に塩基配列を決定し、残りの部分は他の２つの
クローンと同じであると推定した。その塩基配列を第６
表に示す。５−プライムおよび３−プライム非翻訳配列
は小文字で表わされる。
コーディング領域は大文字で表わされる。
第７表（および第３表）に関して、ヌクレオチド配列の
上に示される推定上のアミノ酸配列は成熟タンパク質の
第１番目のアミノ酸を１として番号が付けられている。
推定上のリーダーペプチドはアミノ酸の略号が大文字で
示される。成熟タンパク質中のシスティン残基はさらに
ＳＨで示され、またＮ−結合グリコシル化の可能性があ
る部位は星印で示される。下線が施されているアミノ酸
は、Ｎ末端タンパク質配列決定または実施例１で述べた
ようなＥＰＯのトリプシン消化フラグメントの配列決定
により同定されたアミノ酸残基を示す。
点線は明確に決定し得なかったトリプシン消化フラグメ
ントのアミノ酸配列中の残基を示す。
ｃＤＮＡクローンのラムダ−）ｉＥＰＯＦＬ６、ラムダ
−１１ＥＰＯＰＬ８およびラムダ−ＨＥＰＯＰＬ１３は
メリーランド州ロックビルのアメリカンｅタイプ赤カル
チャー・コレクションに寄託され、それぞれ寄託番号Ａ
ＴＣＣ４０１５Ｂ、　ＡＴＣＣ４０１５２およびＡＴＣ
Ｃ４０１５３として入手可能である。
参考例１　：　ＥＰＯ遺伝子のゲノム構造本発明者等は
ＥＰＯゲノムＤＮＡの構造および塩基配列も明らかにし
た。実施例３で得た３種類のＥＰＯｃＤＮＡクローンか
ら調製されたオリゴヌクレオチドおよび種々のプローブ
を用いてヒトゲノムＨａｅＩ［Ｉ／ＡｌｕＩライブラリ
ー（ｃｈＡ４ベクター使用）をスクリーニングを行い、
４個の独立したゲノムクローンを得た。これら４個の独
立したゲノムクローン（ラムダ−ＨＥＰＯＩ、２゜３お
よび６）の相対的な大きさおよび位置は、第３図におい
て重複する線によって示されることが判明している。太
くて濃い３．３ｋｂの線がＥＰＯ遺伝子の存在する部分
である。既知制限エンドヌクレアーゼ切断部位の位置と
スケール（ｋｂ）も示されている。次に、ＥＰＯ遺伝子
を含む領域は、この領域の一連の欠失を生じさせる特異
的エキソヌクレアーゼ■を使用して、両鏡から完全に塩
基配列が決定された。ＥＰＯｍＲＮＡをコードする５つ
のエクソンとイントロンの構造の模式図を第４図に示す
。エクソンＩの正確な５−プライム境界は今のところ不
明である。それぞれのエクソンのタンパク質コーディン
グ部分は黒く塗りつぶされている（この領域の完全なヌ
クレオチド配列は既に第４表に示した）。第４図におい
て、各エクソンの既知範囲は垂直線で示される。エクソ
ンＩの一部、エクソン■、■および■の全部、およびエ
クソンＶの一部がタンパク質コーディング情報を含む。
エクソンＩおよびＶの残部はそれぞれ５−プライムおよ
び３−プライム非翻訳配列をコードする。ゲノムクロー
ンのラムダ−ＨＥＰＯｌ、ラムダ−ＨＥＰＯ２，ラムダ
−１（ＥＰＯ３およびラムダ−ＨＥＰＯ６はメリーラン
ド州ロックビルのアメリカンφタイプ・カルチャー・コ
レクションに寄託され、それぞれ寄託番号ＡＴＣＣ４０
１５４゜ＡＴＣＣ４０１５５，ＡＴＣＣ４０１５０およ
びＡＴＣＣ４０１５１として入手可能である。
実施例４：ベクターｐ　９１０２３（Ｂ）の作成形質転
換用ベクターとしてカウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）らの
Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｌｏｔ、、　２　：　１３０４
　（１９８２）に記載のｐＡｄｏ　２６ＳＶｌ）Ａ　（
３）を用いた。このベクターの構造は第５Ａ図に示す。
簡単に述べれば、このプラスミドはアデノウィルス（Ａ
　ｄ　２）主要後期プロモーターの転写制御下にあるマ
ウスジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＰＲ）ｃＤＮＡ遺伝子
を含む。
５−プライムスプライス部位はアデノウィルスＤＮＡ中
に示され、３−プライムスプライス部位（免疫グロブリ
ン遺伝子から誘導される）はＡｄ２主要後期プロモータ
ー（ｍａｊｏｒ　ｌａｔｅｐｒｏｍｏｔｅｒ）とＤＨＦ
Ｒ：Ｉ−ディング配列ノ間ニ存在する。ＳＶ４０初期ポ
リＡ部位はＤＨＰＲコーディング配列から下流に存在す
る。ｐＡｄＤ　２６ＳＶｐＡ（３）の原核生物由来部分
はｐｓＶＯｄ　　（メロン（Ｍｅｌｌｏｎ）らのＣｅ１
ｌ、　２７　：　２７９（１９８１）を参照〕から山来
し、哺乳動物細胞内で複製を阻害することが知られてい
るｐＢＲ３２２配列を含まない〔ラスキー（Ｌｕｓｋｙ
）らのＮｅｔｕｒｅ、　２９３　：　７９（１９８１）
を参照〕。
ｐＡｄＤ　２６ＳＶＩ）Ａ　（３）は第５Ａ図および第
５Ｂ図に示すようにプラスミドｐｃＶｓＶＬ　２へ変換
した。
ｐＡｄＤ　２６ＳＶｐＡ　（ｊ）はその中の２個のＰ　
ｓｔ　Ｉ部位の一方を欠失させることによりプラスミド
ｐＡｄＤ　２６ＳＶｐＡ　（３）（ｄ）に変換した。こ
の変換は１個のＰｓｔＩ部位のみが切断された線状プラ
スミドのサブ集団を得るために酵素活性を弱めたＰｓｔ
Ｉで部分消化し、続いてフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）で処
理し、連結して環状化し、そしてＳＶ４０のポリＡ配列
の３−プライム側に位置するＰｓｔＩ部位の欠失につい
てスクリーニングすることにより達成された。
次イテ、ｐＡｄＤ　２６ＳＶｐＡ　（３）　（ｄ）　＋
：、以下のようにしてアデノウィルス３分節系（ｔｒｔ
ｐａｒｔｉｔｅ）リーダーおよびウィルス関連遺伝子（
ＶＡ遺伝子）を挿入した。即ち、最初に、ｐＡｄＤ　２
ＢＳＶｐＡ　（３）（ｄ）をＰｖｕＩＩで切断して、３
分節系リーダーからなる３つの要素の３−プライム部分
内で開環した線状分子を作った。次に、ｐＪＡＷ４３　
［ゼイン（Ｚａｉｎ）らのＣｅ１１．１６　：　８５１
　（１９７９）を参照〕をＸｈｏＩで消化し、フレノウ
で処理し、ＰｖｕＩＩで消化し、そして第３番目のリー
ダーの第２部分を含む１４０ｂｐフラグメントをアクリ
ルアミドゲル（トリス−ホウ酸緩前液中６％；マニアチ
スらの上記文献参照）による電気泳動により単離した。
その後、この１４０ｂｐフラグメントをＰｖｕＩＩで消
化したｐＡｄＤ　２６ＳＶｐＡ　（３）（ｄ）へ連結し
た。この連結生成物を用いて大腸菌をテトラサイクリン
耐性へと形質転換し、Ｌ４０ｂｐフラグメントとハイブ
リダイズする３２ｐ標識プローブを使用するグルンスタ
イン（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ）−ホグネス（Ｈｏｇｎｃｓ
ｓ）法によりコロニーを選択した。ポジティブにハイブ
リダイズするコロニーからＤＮＡを調製して、再構成さ
れたＰｖｕｌＩ部位が第２および第３アデノウィルス後
期リーダーに特異的な１４０ｂｐＤＮＡ挿入物の５−プ
ライム側にあるかあるいは３−プライム側にあるかにつ
いて試験した。正しい向きのＰｖｕ１１部位は１４０ｂ
ｐ挿入物の５−プライム側に存在する。このプラスミド
は第５Ａ’　図にｐＴＰＬとして示される。
次に、ｐＴＰＬにＳＶ４０エンハンサ−を含むＳＶ４０
のＡｖａＩｆＤフラグメントを挿入するため、第５Ｂ図
に示すようにＳＶ４０　　ＤＮＡをＡｖａＩ［で消化し
、Ｐｏ１Ｉのフレノウフラグメントで両末端を平滑にし
、これらのフラグメントにＸｈｏＩリンカ−を連結し、
ＸｈｏＩで消化してＸｈｏＩ部位を開き、そしてゲル電
気泳動で４番目に大きいフラグメント（Ｄフラグメント
と呼ぶ）を単離した。このＤフラグメントをＸｈｏＩ消
化ｐＴＰＬに連結してプラスミドｐｃＶｓＶＬ２−ＴＰ
Ｌを得た。
ｐｃＶｓＶＬ２−ＴＰＬ中の５ｖ４０Ｄフラグメントの
向きは、ＳＶ４０後期プロモーターがアデノウィルス主
要後期プロモーターと同じ向きで存在するものであった
。
ｐＣＶＳＶＬ２−ＴＰＬ内にアデノウィルス関連（ＶＡ
）遺伝子を導入するために、ＶＡ遺伝子供給源としての
アデノウィルス２型Ｈ１ｎｄＩＩｒＢフラグメントを含
むプラスミドｐＢＲ３２２を作成した。即ち、アデノウ
ィルス２型ＤＮＡをＨｉｎｄ、ＩＩＩで消化して、Ｂフ
ラグメントをゲル電′気泳動により単離した。このフラ
グメントをあらかじめＢｉｎｄｍで消化したｐＢＲ３２
２の中に挿入し、第５Ｂ図に示すｐ　ＢＲ３２２−Ａｄ
　Ｈｌｎｄ　ｍＢを得た。
このフラグメント（アンピシリン耐性をマーカーとして
持つ大腸菌を形質転換した後、形質転換体をＨ１ｎｄｍ
Ｂプラスミドの挿入についてアンピシリン耐性を指標に
スクリーニングし、挿入された向きを制限酵素消化によ
り調べた。ｐＢＲ３２２−Ａｄ　Ｈｌｎｄ　ｍＢは第５
Ｂ図に示す向きでアデノウィルス２型Ｈ１ｎｄｍＢフラ
グメントを含む。
第５Ｂ’図に示すように、ＶＡ遺伝子はプラスミドｐＢ
Ｒ３２２−Ａｄ　Ｈｉｎｄ　Ｉ［［ＢをＨｐａ　Ｉで消
化し、ＥｃｏＲＩリンカ−を付加してＥｃｏＲＩで消化
し、続いて１．４ｋｂフラグメントを回収することによ
り得られる。このＥｃｏＲＩ接着末端をもつ１．４ｋｂ
フラグメントは、次に前もってＥｃｏＲＩで消化したｐ
ｃＶｓＶＬ２−ＴＰＬのＥｃｏＲＩ部位に連結した。得
られたプラスミドで大腸菌ＨＢ　１０１を形質転換して
テトラサイクリン耐性を指標にして選別した後、ＶＡ遺
伝子に特異的なりＮＡに対するフィルターハイブリダイ
ゼーションによりコロニーをスクリーニングした。
ポジティブにハイブリダイズするクローンからＤＮＡを
調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化により同定した。
得られたプラスミドはｐ　９１０２３と命名した（第５
Ｂ’図）。
続いてｐ　９１０２３に存在する２個のＥｅｏＲＩ部位
を除去するため、第５Ｃ図に示すように、ｐ　９１０２
３をＥｃｏＲＩで完全消化して２つのＤＮＡフラグメン
ト（一方は約７ｋｂであり、他方はＶＡ遺伝子を含んで
おり、約ＩＪｋｂである）を生成させた。両フラグメン
トの末端をＰｏ１Ｉのフレノウフラグメントを用いて夫
々修復し、次にその２つのフラグメントを再度連結した
。ＶＡ遺伝子を含み、ｐ　９１０２３に類似するが２個
のＥｃｏＲＩ部位を欠失したプラスミドｐ９１０２３　
（Ａ）は、ＶＡ遺伝子フラグメントを使用するグルンス
タインーホグネススクリーニングにより、または慣用の
制限部位分析により同定した。
さらに、ｐ９１０２３　（Ａ）中の単一のＰｓｔＩ部位
を除き、その代わりにＥｃｏＲＩ部位を入れた。即ち、
ｐ９１０２３　（Ａ）をＰｓｔＩで完全消化し、Ｐｏ１
Ｉのフレノウフラグメントで処理して平滑末端を生成さ
せた。ｐ９１０２３　（Ａ）のその平滑末端化ＰｓｔＩ
部位にＥｃｏＲＩリンカ−を連結した。平滑末端化Ｐ　
ｓｔ　Ｉ部位にＥｃｏＲＩリンカ−を連結させた線状ｐ
９１０２３　（Ａ）を非連結リンカ−から分離し、Ｅｃ
ｏＲＩで完全消化して再び連結させた。第５Ｃ図に示す
プラスミドｐ９１０２３　（Ｂ）を回収し、ｐ９１０２
３　（Ａ）に類似するがＰｓｔＩ部位の代わりにＥｃｏ
ＲＩ部位を有するものを単離同定した。
プラスミドｐ９１０２３　（Ｂ）はメリーランド州ロッ
クビルのアメリカン・タイプ争カルチャーΦコレクショ
ンに寄託され、寄託番号ＡＴＣＣ３９７５４として入手
可能である。
実施例５：Ｃ０３（細胞中でのＥＰＯｃＤＮＡの発現例
１ ｃＤＮＡクローン（ラムダ−ＥＰＯＦＬ６およびラムダ
−ＥＰＯＦＬ１３．実施例３参照）をプラスミドｐ９１
０２３　（Ｂ）に挿入した。挿入後のプラスミドをそれ
ぞれｐＰＴＦＬ６およびｐＰＴＦＬ１３と命名した。そ
の後、それぞれのプラスミドからの精製ＤＮＡ８μｇを
用いて５Ｘ１０６個のｃｏｓ−ｉ細胞をＤＥＡＥ−デキ
ストラン法（以下参照）によりトランスフェクションし
た。１２時間後、細胞を洗浄し、クロロキン（０，１ｍ
Ｍ）で２時間処理し、再び洗浄し、そして１０％ウシ胎
児血清を含む培地１０ｍ１に２４時間さらした。その培
地を無血清培地４ｍｌに変えて４８時間後に収穫した。
免疫学的に活性なＥＰＯの生産は、シェアウッドＣＳｈ
ｅｒｗｏｏｄ）およびゴールドバッサ−（Ｇｏｌｄｗａ
ｓｓｅｒ）　　（１４）により示されるラジオイムノア
ッセイにより定量化した。抗ＥＰＯ抗体はシュディス・
シェアウッド博士（Ｄｒ、　ＪｕｄｉｔｈＳｈｅｒｗｏ
ｏｄ）により堤供された。ヨウ素化トレーサーは実施例
１に記載の均一なＥＰＯから製造した。検定の感度は大
体１ｎｇ／ｍｌである。結果を下記の第８表に示す。
第　　　８　　　表 培地中に放出された ベ　り　タ　−　　ＥＰＯのｆｉ　（ｎｇ／　ｍｌ　）
ｐ　Ｐ　Ｔ　Ｆ　Ｌ　１３　　　　　　３３０ｐＰＴＦ
Ｌ６　　　　　　３１ ｐＰＴＦＬ１３はメリーランド州ロックビルのアメリカ
ン会タイプΦカルチャー・コレクションに寄託され、寄
託番号ＡＴＣＣ３９９９０のもとに人手可能である。
実施例６：ＣＯ５−１細胞中でのＥＰＯｃＤＮＡの発現
例２ ＥＰＯｃＤＮＡ　（ラムダ−ＨＥ　Ｐ　ＯＦ　Ｌ　１３
）をｐ９１０２３　（Ｂ）に挿入し、Ｃ０８−１細胞を
トランスフェクションして上記（実施例５）のように収
穫した。ただしクロロキン処理を省いた。
ｔｎ　ＶｉｔｒＯで生物学的に活性なＥＰＯは、ＣＦＵ
−、Ｅ源としてマウス胎児肝臓細胞を用いるコロニー形
成検定またはフェニルヒドラジン注射マウスからの牌臓
細胞を用いる３Ｈ−チミジン取込み検定により測定した
。これらの検定の感度は大体２５ｍＵ／ｍｌである。ｉ
ｎ　ｖｉｖｏで生物学的に活性なＥＰＯは低酸素性マウ
ス法または飢餓ラット法により測定した。これらの検定
の感度は大体１００ｍｕ／ｍｌである。コントロール実
験で得られた培地（ｍｏｃｋ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｍ
ｅｄｉｕｎ）からの検定では活性が全く検出されなかっ
た。クローンＨＥＰＯＦＬ１３によって発現されたＥＰ
Ｏの結果は下記の第９表に示す〔活性は単位／ｍｌで表
わし、標準対照として市販の比活性の明示されたＥ　Ｐ
　Ｏ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を使用した〕。
第　　　９　　　表 ＥＰＯｃＤＮＡでトランスフェクションＲＩ　Ａ　　　
　　　　　　　１１００ｎ／　ｍ１ＣＦＵ−Ｅ　　　　
　　　２±０．５Ｕ／ｍ１３Ｈ−Ｔｈｙ　　　　　　３
．１±１．８Ｕ／ｍｌ低酸素性マウス　　　　　１υ／
ｍ！ 飢餓ラット　　　　２ＬＩ／ｍｌ 実施例７コｃｏｓ−ｉ細胞からのＥＰＯの５ＤＳＥＰＯ
ｃＤＮＡ　（ラムダ−ＨＥ　Ｐ　ＯＦ　Ｌ　１３）を含
むベクターｐ９１０２３　（Ｂ）でトランスフェクショ
ンされたＣＯ８細胞から培地に分泌されたＥＰ０１８０
ｎｇを１０％Ｓ　Ｄ　Ｓ　　Ｌａｅｍｌｌｉのポリアク
リルアミドゲルによる電気泳動にがけ、ニトロセルロー
ス紙に電気移動させた〔トービン（Ｔｏｗｂｉｎ）らの
Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃｅｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳ
Ａ　７６　：　４３５０（１９７９）を参照〕。このフ
ィルターは実施例５に記載されたような抗ＥＰＯ抗体を
用いて検索し、洗浄し、そして　　Ｉ−黄色ブドウ球菌
Ａプロティンを用いて再度検索した。その後２日間オー
トラジオグラフィーを行った。天然の均−ＥＰＯは実施
例１に記載されたものを使用し、ヨウ素化前（レーンＢ
）またはヨウ素化後（レーンＣ）に電気泳動を行った（
第６図参照）。使用したマーカーは３５Ｓメチオニン標
識された血清アルブミン（６８，０００ｄ）および卵白
アルブミ＞　（４５，０００ｄ）テあった。
実施例８：ｐＲＫｌ−４の作成 実用上の目的に適し、１つのプロモーターにより目的ｃ
ＤＮＡ、ＤＨＰＲの２つの遺伝子が支配される特徴を持
つ発現ベクターを作成するため、次に述べるフラグメン
トＡ、ＢおよびＣを連結してプラスミドＲＫＩ−４を作
成した。このプラスミドは第７図の構造を持ち、特に実
用的特徴がある。
フラグメントＡは次のようにして得られた。
マウスジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子に隣接
するＳＶ４０初期領域プロモーター、ＳＶ４０エンハン
サ−１小さなｔ抗原イントロン、およびＳＶ４０ポリＡ
配列を含むプラスミドＰＳＶ２ＤＨＦＲＣサブラフ−ｎ
　（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ）らのＭｏ１．　Ｃｅ１１．　
Ｂｉｏｌ、、　１　：　８５４−８６４　（１９８１）
を参照〕からＢａｍＨＩ　−ＰｖｕＩＩフラグメントを
単離した（フラグメントＡ）。
残りのフラグメントＢおよびＣは次のようにしてベクタ
ーｐ９１０２３　（Ａ）　　（実施例４および第５Ｃ図
参照）から得られた：　ｐ９１０２３　（Ａ＞をアデノ
ウィルスプロモーターの近くの単一のＰｓｔＩ部位でＰ
ｓｔＩにより消化してこのプラスミドを線状化し、次に
ＰｓｔＩ　−ＥｃｏＲＩ部位へ変換するための合成フラ
グメントに連結して再環状化する〔もとのＰｓｔＩ部位
にＰｓｔＩ　−ＥｃｏＲＩ　−ＰｓｔＩ部位を作る；　
ｐ９１０２３　（Ｂ’＞　３か、あるいは実施例４で述
べたようにＤＮＡポリメラーゼＩの大フラグメントで処
理してＰＳｔＩ部位を破壊し、合成ＥｃｏＲＩリンカ−
に連結して再環状化した〔もとのＰｓｔＩ部位にＥｃｏ
Ｒ部工部位を作る；　ｐ９１０２３　（Ｂ）　）。
得られた２つのプラスミドｐ　９１０２３　（Ｂ）とｐ
９１０２３　（Ｂ’）の各々をＸｂａＩおよびＥｃｏＲ
Ｉで消化して２つのフラグメント（ＦおよびＧ）を得た
。ｐ９ＬＯ２３（Ｂ）からのフラグメントＦとｐ９１０
２３　（Ｂ’）からのフラグメントＧおよびｐ９１０２
３　（Ｂ）からのフラグメントＧとｐ　９１０２３（Ｂ
′）からのフラグメントＦを連結することにより、もと
のＰｓｔＩ部位にＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉ部位または
ＰｓｔＩ　−ＥｃｏＲＩ部位のいずれかを含む２つの新
しいプラスミドを作成した。ＰｓｔＩ　−ＥｃｏＲＩ部
位を含むプラスミド（ＰｓｔＩ部位がアデノウィルス主
要後期プロモーターに最も接近している；プロモーター
に近接している位置に目的ｃＤＮＡを挿入できるように
ｐｓｔｒサイトが設けられている）をｐ９１０２３　（
ｃ）と命名した。
ベクターｐ９１０２３　（ｃ）をＸｈｏＩで完全消化し
、接着末端をもつ得られた線状プラスミドは大腸菌のＤ
ＮＡポリメラーゼ工大フラグメントを用いる末端修復反
応により平滑末端とした。このＤＮＡに、次のようにし
て作成したＳＶ４０エンハンサ−含有の３４０ｂｐ　Ｈ
ｉｎｄ　ｍ　−ＥｃｏＲＩフラグメントを連結した： ＳＶ４０からのＳＶ４０複製開始点およびエンハンサ−
を含むＨｌｎｄ　ｍ　−ＰｖｕＩＩフラグメントをプラ
スミドｃｌａｃ（リトル（Ｌｉｔｔｌｓ）　　らのＭｏ
１．　Ｂｆｏｌ。
取ｄ　、、　１　：　４７３−４８８　（１９８３）を
参照〕に挿入した。
ｃｌａｃベクターはｃ　ｌａｃ　ＤＮＡをＢａｍＨＩで
消化し、接着末端をＤＮＡポリメラーゼ工大フラグメン
トで修復し、そのＤＮＡをＨ１ｎｄ■で消化することに
より調製した。得られたプラスミド（ｃ　５ＶＨＰ　　
Ｉａｃ）はＰｖｕＩＩ平滑末端を連結されたことにより
ＢａｍＨＩ部位を再生していた。
ｃ　５ＶＨＰ　　ｌａｃからＥｃｏＲＩ　−Ｈｌｎｄ　
■７ラグメントを作り、プラスミドの複製開始点を含む
ｐｓｖｏｔ：ｉ　（実施例４に示したメロンらの上記文
献参照）のＥｃｏＲＩ　−Ｈｌｎｄ　ｍフラグメントに
連結し、得られたプラスミドｐｓＶＨＰＯｄを選択した
。その後、ＳＶ４０複製開始点／エンハンサ−を含むｐ
ｓＶＨＰＯｄの３４０ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄ■
フラグメントを作り、両末端をＤＮＡポリメラーゼ■大
フラグメントで平滑末端とし、そして上記のＸｈｏＩ消
化し、平滑末端化ｐ９１０２３　（ｃ）ベクターに連結
した。
Ｈｌｎｄ　ｍ　−ＥｃｏＲＩフラグメント中のＢａｍＨ
Ｉ部位がＶＡ遺伝子に最も接近するような向きをもつ得
られたプラスミド（ｐ９１０２３　（ｃ）　／ＸｈｏＩ
／平滑末端プラスＥ　ｃｏＲＩ　／　Ｈｉｎｄ　ｍ／平
平滑末端ＳＶ４０複画面始点プラスエンハンサ）はｐＥ
Ｓ１０５と命名した。このプラスミドｐ　Ｅ　Ｓ　１０
５をＢａｍＨＩとＰｖｕＩＩで、またはＰｖｕＩＩだけ
で消化して、アデノウィルス主要後期プロモーターを含
むＢａｍＨＩ　−ＰｖｕＩＩフラグメント（フラグメン
トＢ）および耐性遺伝子（テトラサイクリン耐性）と他
の配列との間にそのプラスミドを含むＰｖｕＩＩフラグ
メント（フラグメントＣ）を単離した。
フラグメントＡ、ＢおよびＣを連結し、第７図に示すプ
ラスミドを単離してＲＫＩ−４と命名した。プラスミド
ＲＫＩ−４はメリーランド州ロックビルのアメリカンφ
タイプφカルチャー・コレクションに寄託され、寄託番
号ＡＴＣＣ３９９４０のもとに入手可能である。
実施例９：ＣＨＯ細胞によるＥＰＯの発現−方法Ｉ 上記実施例５のプラスミドｐＰＴＦＬ１３からのＥＰＯ
ｃＤＮＡを含むＤＮＡ　（２０μｇ）を制限エンドヌク
レアーゼＣＩａＩで消化して線状化し、そしてプラスミ
ドｐＡｄＤ　２８ＳＶｐ　（Ａ）　ｌ　（カウフマン等
のＭｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｌｏｔ、、　２　：　１３
０４　（１９８２））からのＣＩａＩ消化ＤＮＡ　（２
μｇ）　　（アデノウィルス主要後期プロモーターによ
り制御される完全なジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）
を含む〕に連結した〔カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）お
よびシャープ（Ｓｈａｒｐ）のＭｏ１．　ａｎｄ　Ｃｅ
１ｌ　Ｂｉｏｌ、　２　：　１３０４−１３１９　（１
９８２）を参照〕。この連結ＤＮＡを使ってＤＨＦＲ−
ネガティブＣＨＯ細胞［ＤＵＫＸ　−Ｂ　Ｉ　Ｉ、カー
シン（ｃｈａｓｉｎ　Ｌ、　Ａ、）およびアーラウプ（
Ｌｌｒｌａｕｂ　Ｇ、）のＰＮＡＳ　７７　：　４２１
６−４２２０　（１９８０）を参照〕をトランスフェク
ションし、２日間増殖後、少なくとも１つのＤＨＦＲ遺
伝子を組み込んだ細胞をアルファ培地（ヌクレオチドを
欠き、１０％透析ウシつ児血清を補充したもの）で選択
した。選択培地で２週間増殖後、コロニーをもとの平板
から採取し、１プール当り１０〜１００個のコロニーか
ら成るグループに分け、再度ヌクレオチド欠損培地で培
地上全面に増殖するまで培養した。増殖プールからの培
地上清をメトトレキセート（ＭＴＸ）選択に先立ってＲ
ＩＡでＥＰＯについて検定した。陽性のＥＰＯ生産を示
したプールはメトトレキセート（０，０２μ旧の存在で
増殖させ、サブクローニングして再度検定した。ＥＰＯ
Ｃ１ａ　　４α４．０２（ＭＴＸ耐性のものを精製した
もの）プールからサブクローニングされた単一のＥＰＯ
Ｃ１ａ４α４．０２−７は０．０２μＭＭＴＸを含む培
地中に４６０ｎｇ／ｍｌのＥＰＯを放出した（第１０表
参照）。
ＥＰＯｃｌａ　　４ａ４．０２−１はＥＰＯ生産に特に
適する細胞株であり、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクションに寄託番号ＡＴＣＣＣＲＬ　８８９５と
して寄託された。一般に、このクローンは次第に増加す
る濃度のＭＴＸ中で段階的選択にかけると、さらに高レ
ベルのＥＰＯを生産する細胞を生成するであろう。ＲＩ
Ａで陰性であったプールについては、メトトレキセー）
　（０，０２μＭ）の存在下で増殖した相対培養物から
のメトトレキセート耐性コロニーをＲＩＡでＥＰＯにつ
いてプールごとに再び検定した。陽性でなかったこれら
の培養物をサブクローニングし、さらに濃度を高めたメ
トトレキセート中で増殖させた。
段階的にメトトレキセート（ＭＴＸ）濃度を上げて培養
する選択は、次第に増加する濃度のメトトレキセートの
存在下で細胞を培養して生存細胞を選択するというサイ
クルを繰り返すことにより達成された。各回ごとに培養
上清中のＥＰＯをＲＩＡおよびｔｎ　ｖｉｔｒｏ生物活
性により測定した。
各段階的増幅において使用されたメトトレキセートの量
は０．０２μＭ、０．１μＭおよび０．５μＨであった
。第１０表に示すように、０．０２μＨのＭＴＸによる
１回の選択後に有意全のＥＰＯが培地中に放出された。
アルファ　アルファ培地中 ４α４プール　ＲＩＡ　　１７ｎｇ／ｍｌ　　　５０ｎ
ｇ／ｍ１４α４単一 コロニー クローン （，０２−７）　　　　ＲＩＡ　　　　　　　−４６０
口ｇ／ｍｌ実施例１０：ｃＨＯ細胞によるＥＰＯの発現
−方法■ クローンラムダ−ＨＥＰＯＦＬ１３からのＤＮＡをＥｃ
ｏＲＩで消化し、ＥＰＯ遺伝子を含む小さなフラグメン
ト（ＲＩフラグメント）をプラスミドＲＫＩ−４（実施
例８参照）のＥｃｏＲＩ部位内でサブクローニングした
。次に、このＤＮＡ（ＲＫＦＬ１３）を用いてＤＨＦＲ
−ネガティブＣＨＯ細胞を直接（消化せずに）トランス
フェクションし、そして上記の実施例９のようにして選
択および増幅を行った。
また、ＲＫＦＬ１３ＤＮＡはプロトプラスト融合または
微量注射法によりＣＨＯ！ｒｌ胞に挿入した。
プラスミドＲＫＦＬ１３はメリーランド州ロックビルの
アメリカン争タイプ・カルチャー・コレクションに寄託
され、寄託番号ＡＴＣＣ３９９８９のもとに人手可能で
ある。
好適な単一コロニークローンはメリーランド州ロックビ
ルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに
寄託され、寄託番号ＡＴＣＣＣＲＬ８６９５のもとに入
手可能である。
実施例１１：Ｃ０８−１細胞によるＥＰＯゲノムＤＮＡ
の発現 ＥＰＯゲノムクローンの発現のために使用したベクター
はｐｓＶＯｄ　（実施例４に示したメロンらの上記文献
参照）である。ｐｓｖｏｃｉからのＤＮＡはＨｌｎｄｍ
で完全消化し、ＤＮＡポリメラーゼ■大フラグメントで
平滑末端とした。
ＥＰＯゲノムクローンのラムダ−ＨＥＰＯ３はＥｃｏＲ
ＩとＨｌｎｄｍで完全消化し、ＥＰＯ遺伝子を含む４．
０ｋｂフラグメントを単離して上記のように平滑末端と
した。Ｈ１ｎｄ■部位からポリＡシグナルをちょうど越
えた領域までのこのフラグメントのヌクレオチド配列は
第４図および第４表に示す。ＥＰＯ遺伝子フラグメント
をｐｓｖｏｄプラスミドフラグメント内に挿入し、そし
て両方の向きの正しく構築された組換え体を単離して確
かめた。プラスミドＣＺ２−１は“ａ”の向き（すなわ
ちＥＰＯの５′末端がＳＶ４０開始点に最も接近する）
でＥＰＯ遺伝子を有し、プラスミドＣＺＩ−３はそれと
反対の向き（すなわち“ｂ”の向き）である。
プラスミドＣＺＩ−３およびＣ２０−１は実施例６のよ
うにしてＣＯ３−１細胞をトランスフェクションし、培
地を収穫して免疫学的に反応性のＥＰＯについて検定し
た。Ｃ２０−１からは培養上清中に約３１ｎｇ／ｍｌの
ＥＰＯが検出され、ＣＺｌ−３からは１６〜３１ｎｇ／
　ｍｌのＥＰＯが検出された。
ゲノムクローンＨＥＰＯＩ、ＨＥＰＯ２およびＨＥＰＯ
６は類似の方法でＣＯ８細胞に挿入し且つ発現させるこ
とができる。
マウスメタロチオネインプロモーターの転写制御下にあ
り且つ完全ウシ乳頭腫ウィルスＤＮＡに結合されたＥＰ
ＯｃＤＮＡ配列を含むプラスミドを次のようにして作成
した： ｐＥＰＯ４９ｆ プラスミド５Ｐ８１５をＰｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ
から購入した。このプラスミドをＥｃｏＲＩで完全消化
し、ラムダ−ＨＥＰＯＦＬ１３からのＥＰＯｃＤＮＡを
含むＬ３４０ｂｐＥ　ｃｏＲＩフラグメントをＤＮＡリ
ガーゼにより挿入した。ＥＰＯ遺伝子の５′末端がＳＰ
６プロモーターに極めて接近している（ＢｇｌＩおよび
ＨｌｎｄＩ［Ｉ消化で測定）得られたプラスミドをｐＥ
ＰＯ４９５と命名した。なお、方向性に関して、ｐｓＰ
６１５ポリリンカー中のＢａｍＨＩ部位はＥＰＯ遺伝子
の５′末端に直接に隣接している。
ｐ　Ｍ　Ｍ　Ｔ　ｎｅｏΔＢＰＶ 第８図に示すプラスミドｐｄＢ　Ｐ　Ｖ　−ＭＭＴｎｅ
。
（３４２−１２）　　（ｏ　−（Ｌａｗ）らのＨｏｔ、
　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ。
３　：　２１１０−２１１５　（１９８３）を参照〕を
ＢａｍＨＩで完全消化して、ＢＰＶゲノムをＳむ約８ｋ
ｂの大きなフラグメントと、ｐ　Ｍ　Ｌ　２複製開始点
およびアンピシリン耐性遺伝子、メタロチオネインプロ
モーター、ネオマイシン耐性遺伝子およびＳＶ４０ポリ
Ａシグナルを含む約６．５ｋｂの小さなフラグメントの
両フラグメントを生じさせた。消化したＤＮＡを分離す
ることな（ＤＮＡリガーゼで再び環状化し、目的とする
約６．５ｋｂフラグメントのみを含むプラスミドをＥｃ
ｏＲＩとＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ消化により
同定した。この種のプラスミドの一つをｐＭＭＴｎｃｏ
ＪＢＰＶと命名した。
ｐＥＰＯ１５ａ ｐ　ＭＭＴｎｅｏ　Ａ　Ｂ　Ｐ　ＶをＢｇｌＩＩで完全
消化した。
ｐＥＰＯ４９５をＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩで完全消化し
て、全ＥＰＯコーディング領域を含む約７００ｂｌ）フ
ラグメントプラスミドをゲル電気泳動により単離した。
ＢｇｌＩＩ消化ｐＭＭＴｎｅｏ、６ＢＰＶと７００ｂｐ
　ＢａｍＨＩ　／　ＢｇｌＩＩ　Ｅ　Ｐ　Ｏフラグメン
トとを連結し、ＥＰＯｃＤＮＡを含む得られたプラスミ
ドはＥＰＯ遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプロー
ブｄ　　（ＧＧＴＣＡＴＣＴＧＴＣＣＣＣＴＧＴＣＣ）
を使用するコロニーハイブリダイゼーションにより同定
した。ハイブリダイゼーション分析で陽性であったプラ
スミドのうち、ＥＰＯｃＤＮＡの５′末端がメタロチオ
ネインプロモーターに最も接近する方向性のＥＰＯｃＤ
ＮＡをもつ１つのプラスミド（ｐＥＰＯ１５ａ）がＥｃ
ｏＲＴおよびＫｐｎＩ消化により同定された。
ｐＢＰＶ−ＥＰＯ プラスミドｐＥＰＯ１５ａをＢａｍ）（Ｉで完全消化し
て線状化した。プラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｃｏ　
　（３４２−１２）もまたＢａｍＨＴで完全消化して、
約６．５ｋｂと８ｋｂの２つのフラグメントを得た。全
ウシ乳頭腫ウィルスゲノムを含む８ｋｂフラグメントを
ゲル電気泳動により単離した。
ｐ　Ｅ　Ｐ　０１５ａ　／　ＢａｍＨＩと８ｋｂＢａｍ
ＨＩフラグメントとを一緒に連結し、ＢＰＶフラグメン
トを含むプラスミド（ｐＢＰＶ−ＥＰＯ）は、ＢＰＶゲ
ノムに特異的なオリゴヌクレオチドプローブｄ（Ｐ−Ｃ
ＣＡＣＡＣＣＣＧＧＴＡＣＡＣＡ−ＯＨ）を使用するコ
ロニーハイブリダイゼーションニヨり同定した。ｐＢＰ
Ｖ−ＥＰＯＤＮＡ（７）Ｈ１ｎｄｍ消化は、ＢＰＶゲノ
ムの転写方向がメタロチオネインプロモーター（第８図
のｐｄＥ３ｐｖ−Ｍ　Ｍ　Ｔ　ｎｅｏ　　（３４２−１
２）を参照）の転写方向と同じであることを示した。プ
ラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ　　（３４２−１２
）はメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・
カルチャー令コレクションから寄託番号ＡＴＣＣ３７２
２４のもとに入手可能である。
発　　現 ＥＰＯを発現させるために次の方法を使用した。
方法よ りＮＡ　　ｐＢＰＶ−ＥＰＯを作成し、約２５μｇを使
用して約１×１０６個のＣ１２７Ｃローライー（Ｌｏｖ
ｙ）らのＪ、　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌ、、　２６　：　２９
１−２９８　（１９７ｇ）を参照〕および３Ｔ３細胞を
標準的なリン酸カルシウム沈殿法〔ダラム（Ｇｒａｈｍ
）らのＶｉｒｏｌｏｇｙ。
５２二４５Ｂ−４８７（１９７３）を参照〕によりトラ
ンスフェクションした。トランスフェクションの５時間
後、トランスフェクション用培地を除き、グリセロール
ショック（ｇｌｙｃｓｒｏｌ　５ｈｏｃｋ）を行い、洗
浄し、そして１０％ウシ胎児血清を含む新しいアルファ
培地を加えた。４８時間後、細胞をトリプシン処理して
５００ｇｇ／ｍＩの抗生物質０４１８を含むＤＭＥ培地
中に１：１０の比で分散させ〔サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒ
ｎ）らのＭｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、、　ｌ　
：　３２７−３４１（１９８２）を参照〕、それらの細
胞を２〜３週間インキュベートした。次いで、Ｇ４Ｌ８
耐性コロニーをミクロタイターウェル（ｍｉｃｒｏｔｉ
ｔｅｒ　ｗｅｌｌ）内に個々に単離し、Ｇ４１８の存在
下で培地全面がやや密集するまで増殖させた。その後、
細胞を洗浄し、１０％ウシ胎児血清を含む新しい培地を
加えて２４時間後に培地を収穫した。その生産培地を試
験し、ラジオイムノアッセイおよびｉｎ　ｖｉｔｒｏバ
イオアッセイによりＥＰＯについて陽性であることがわ
かった。
方法■ Ｃ１２７または３Ｔ３細胞を、方法工で述べたように、
２５μｇのｐＢＰＶ−ＥＰＯと２μｇのｐ　Ｓ　Ｖ　２
　ｎｅｏ　　（サザンらの上記文献参照）を用いて同時
トランスフェクションした。これは大体１０倍モル過剰
のｐＢＰＶ−ＥＰＯを使用する。トランスフェクション
後の手法は方法■と同じである。
方法■ 方法Ｉで述べたように、Ｃ１２７細胞を３０ｇｇのｐＢ
ＰＶ−ＥＰＯでトランスフェクションした。
トランスフェクションおよび分散（１：１０）の後、３
日おきに新しい培地と取り換えた。約２週間後にＢＰＶ
形質転換細胞の斑点が出現した。各々の斑点をミクロタ
イター皿の１０ｍ径のウェル内に別々に装置し、やや密
集した単層になるまで増殖させ、生産培地中のＥＰＯ活
性または抗原性について検定した。
実施例１３：ＥＰｏの精製 ＥＰＯ濃麿が２００ｇｇ／Ω程度のＣＯＳ細胞生産培地
（１２ｇ）を０．４６５ゴ（５平方フイート）の膜を備
えたミリボア・ペリカン（Ｍｉ　ｌ　１ｉｐｏｒｃＰｅ
ｉ　Ｉ　１ｅａｎ）のような１０，０００分子世で分離
する限外消過膜を使用して、６００ｍ１に濃縮した。検
定は実施例５のようにしてＲＩＡで行った。限外ン濾過
からの濃縮物はｐＨ７，０に緩衝化した１０ｍ　Ｍリン
酸す）・リウム４Ωに対して透析した。こうして濃縮お
よび透析された生産培地は全タンパク質３８０ｍｇ中に
ＥＰＯ２，５ｍｇを含んでいた。このＥＰＯ溶液をさら
に１８８　ｍｌに濃縮し、沈殿したタンパク質を１１０
．０００　ｘ　ｇで３０分間遠心することにより除いた
。
Ｅ　Ｐ　Ｏ（２，０＋ｎｇ）を含む上清を５０％酢酸で
ｐＨ５，５に調節し、４°Ｃで３０分間攪拌し、沈殿物
を１３．０ＯＯＸ　ｇで３０分間遠心することにより除
いた。
カルボニルメチルセファロースクロマトグラフィー Ｅ　Ｐ　Ｏ２０ｈｇ　（全タンパク質２４ｍｇ）を含む
遠心上清（２０ｍｌ）を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐ
Ｈ１５，５）中で平衡化したＣＭ−セファロース（２０
ｍｌ）を充填したカラムに加え、同じ緩衝液４０ｍ１で
洗浄した。
ＣＭ−セファロースに結合したＥＰＯはＬＯｍＭＩＪ　
ン酸ナトリウム（ｐＨ５、５）中のＮ　ａ　Ｕ　（０−
１）の勾配ＬＯＯｍｌで溶離した。ＥＰＯ含有画分（全
タンパク質２　ｍｇ中全部で５０ｇｇ）を集め、アミコ
ン（Ａｍｉｃｏｎ）　ＹＭＩＯ限外？濾過膜を使って２
ｍｌに濃縮した。
逆相ＨＰＬＣ ＣＭ−セファロースからのＥＰＯを含む濃縮画分は、バ
イダック（Ｖｙｄａｃ）Ｃ−４カラムを使用する逆相Ｈ
ＰＬＣによりさらに精製した。１０％溶剤Ｂ（溶剤Ａは
ｏ、ｔ％ＣＦ　ＣＯＨ／Ｈ２０であす；溶剤Ｂは０．１
％ＣＦ　　Ｃｏ　　Ｈ／ＣＨ３ＣＮである）で平衡化し
たカラムに１ｍｌ／分の流量でＥＰＯを加えた。このカ
ラムを１０％溶剤Ｂで１０分間洗浄し、ＥＰＯを溶剤Ｂ
の直線濃度勾配（６０分で１０〜７０％）で溶離した。
ＥＰＯ含有画分（全タンパク質１２０μｇ中ＥＰＯ約４
０μｇ）を集めて凍結乾燥した。凍結乾燥ＥＰＯはＯ，
１５Ｍ　　Ｎ　ａ　（Ｊ！を含む０．１Ｍ　トリス−Ｈ
Ｃρ　（１）１１７．５）中で再調製し、逆相ＨＰＬＣ
により再びクロマトグラフ処理を行った。ＥＰＯ含有画
分を集め、５ＤＳ−ポリアクリルアミド（１０％）ゲル
電気泳動により分析した〔ラメリ（Ｌａｍｅｌｉ、　Ｌ
ｌ、　Ｋ、）、　Ｎａｔｕｒｅを参照〕。
集めたＥＰＯ画分は全タンパク質２５μｇ中ＥＰＯ１５
，５μｇを含んでいた。
発明の効果 本発明はヒトエリトロポエチンの効率的生産に使用でき
るヒトエリトロポエチンのクローン化遺伝子、組換えＤ
ＮＡベクターおよび該発現形質転換体を提供するもので
、各種貧血症の治療薬等の開発に利用できるものである
。
文　　　　献 １）Ｋｒｙｓｔａｌ、Ｇ、ＥＸＩ）、Ｈｅｍａｔｏｌ、
１１　：　６４９−６８０（１９８３）。
２）　Ｙａｎａｇａｗａ、　Ｓ、、　Ｈｌｒａｄｅ、　
Ｋ、、　０ｈｎｏｔａ、　Ｉｌ、。
５ａｓａｋｉ、　Ｒ，、Ｃｈｉｂａ、　Ｈ，、Ｖｅｄａ
、　Ｍ、、およびＧｏｔｏ、Ｍ、　Ｊ、Ｂｌｏｔ、Ｃｈ
ｅｍ、２５９　：　２７０７−２７１０（１９８４）。
３）Ｌａｗｎ、Ｒ，Ｍ、、Ｐｒ１ｔｓｃｈ、Ｅ、Ｐ、、
Ｐａｒｋｅｒ、Ｒ。
Ｃ，、Ｂｌａｋｅ、　Ｇ、、およびＭａｎｉａｔｉｓ、
　Ｔ、　Ｃｅ１１１５　：　１１５７−（１９７８）。
４）　Ｓａｎｇｅｒ、　Ｐ、、　Ｎ１ｃｋｌｃｎ、　Ｓ
、、およびｃｏｕ　Ｉ　ｓｏｎ　。
Ａ、Ｒ，Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
、ｌＪ、ｓ、Ａ。
７４　：　５４６３−（１９７７）。
５）Ｔｏｏｌｅ、Ｊ、Ｊ、、Ｋｎｏｐｆ、Ｊ、Ｌ、、Ｗ
ｏｚｎｅｙ、Ｊ。
Ｍ、、Ｓｕｌｔｚｍａｎ、Ｌ、Ａ、Ｂｕｅｃｋｅｒ、Ｊ
、Ｌ、。
Ｐｉｔｔｍａｎ、Ｄ、Ｄ、、Ｋａｕｆｍａｎ、Ｒ，Ｊ、
、Ｂｒｏｗｎ、Ｅ、。
Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ、　Ｃ，、Ｏｒｒ、　Ｅ、　Ｃ，、
Ａｍｐｈｌｅｔｔ。
Ｇ、Ｗ、、Ｐｏ５ｔｅｒ、Ｗ、Ｂ、、Ｃｏｅ、Ｍ、Ｌ、
、Ｋｎｕｔｓｏｎ。
Ｇ、　Ｊ、、　Ｐａ５ｓ、　Ｄ、　Ｎ、、およびＨｅｗ
ｌｃｋ、　Ｒ，Ｍ。
Ｎａｔｕｒｅ　３１２　：　　３４２−３４７　（１９
８４）６）　Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ、　Ｅ、　　Ｂｌｏ
ｏｄ　５ｕｐｐ１．　ｌ、　５８゜ｘｌｉｉ　　（ａｂ
ｓｔｒ）　　（１９８１）。
７）　Ｓｕｅ、　Ｊ、　Ｍ、およびＳｙｔｋｏｗｄｋｉ
、　Ａ、　Ｊ、　　Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔ’ｌ　　Ａｃａｄ、Ｓｅｔ　　Ｕ、Ｓ、Ａ、８０
　　：　　３８５１−３８５５（１９８３）　。
８）　Ｂｅｒｓｃｈ、　Ｎ、およびＧｏｌｄｅ、　Ｄ、
　Ｗ、、　Ｉｎ　Ｖｉｔｒ。
Ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｅｒｙｔｈｒｏ−ｐｏｉｅｓｌ
ｓ、　　Ｍ、　　Ｊ、　　Ｍｕｒｐｈｙ（Ｅｄ、）　Ｎ
ｅｗ　Ｙｏｒｋ　：　　Ｓｐｒｌｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａ
ｇ　　（１９７８）。
９）　Ｃｏｔｅｓ、　Ｐ、　Ｍ、およびＢａｎｇｈａｍ
、　Ｄ、　Ｒ，Ｎａｔｕｒｅ１９１　：　　１０６５−
（１９８１）。
１０）　Ｇｏｌｄｗａｓｓｃｒ、　Ｅ、およびＧｒｏｓ
ｓ、　Ｍ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ　　
３７　：　　１０９−１２１　（１９７５）。
１１）　Ｗｏｏ、　　Ｓ、　　Ｌ、　　Ｃ，、Ｄｕｇａ
ｉｃｚｙｋ、　　Ａ、、　Ｔｓａｉ、　　Ｍ、−Ｊ、、
　Ｌａｄ、　Ｅ、　Ｃ，、Ｃａｔｔｅｒａｌｌ、　Ｊ、
　Ｐ、および０°Ｍａｌｌｅｙ、Ｂ、Ｗ、Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔ’１．−Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。
Ｌｌ、Ｓ、Ａ、　　７５　　；　　３６８８−（１９７
＆）。
１２）　Ａｎｄｅｒｓｏｎ、　Ｓ、およびに１μｇｓｔ
ｏｎ、　１．　Ｂ、　Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔ’ｌ　　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、−Ｕ、Ｓ、Ａ、８０
　　：　　６８３Ｂ−８８４２（１９８３）　。
１３）　Ｂｅｎｔｏｎ、　Ｗ、　Ｄ、およびＤａｖｉｓ
、　Ｒ，Ｗ。
５ｃｉｅｎｃｅ　　１９６　　：　　１８０−１８２　
　（１９７７）。
１４）　Ｓｈｅｒｗｏｏｄ、　Ｊ、　Ｂ、およびＧｏｌ
ｄｗａｓｓｅｒ、　Ｅ。
Ｂｌｏｏｄ　　５４　　：　　８８５−８９３　　（１
９７９）。
１５）Ｄｅｒｍａｎ、Ｅ、、Ｋｒａｕｔｃｒ、に、、Ｗ
ａｌｌｉｎｇ、Ｌ、。
Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ、　Ｃ，、Ｒａｙ、　Ｍ、、およ
びＤａｒｎｅｌｌ、　Ｊ。
Ｔ、、　Ｃｅ１ｌ　　２３　　：　　７３１−（１９８
１）。
１Ｂ）　Ｇｌｕｚｍａｎ、　Ｙ、、　　Ｃｅ１ｌ　　２
３　：　　１７５−１８２　（１９８１）。
１７）　Ｈｅｖｉｃｋ、　Ｒ，Ｍ、、　Ｈｕｎｋａｐｉ
ｌｌｅｒ、　　Ｍ、　　Ｅ、、　　Ｈｏｏｄ。
Ｌ、　Ｅ、、および［）ｒｅｙｅｒ、　Ｗ、　Ｊ、　Ｊ
、　Ｂｌｏｔ、　Ｃｈｃｍ。
２５８　　：　　７９９０−７９９７　　（１９８１）
。
【図面の簡単な説明】
第１図はヒト胎児肝臓ｍＲＮＡ中のＥＰＯｍＲＮＡの検
出を示す電気泳動図であり；第２図はラムダ−ＨＥＰＯ
ＦＬＬ３中のＥＰＯｃＤＮＡのヌクレオチド配列の模式
図であり；第３図は４個の独立したヒトＥＰＯゲノムク
ローンのＤＮＡ挿入物の相対位置を示し；第４図はヒト
ＥＰＯ遺伝子のイントロンおよびラスミド９１０２３　
（Ｂ）の作成を示し；第６図は天然ＥＰＯと比較したと
きのＣＯＳ　−１細胞で生産されたＥＰＯのＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル分析を示し； 第７図はＥＰＯの発現用プラスミドｐＲＫＩ−４（実施
例９参照）の模式図であり；そして 第８図は、実施例１２で材料として用いたプラスミドｐ
ｄ　Ｂ　Ｐ　Ｖ　−Ｍ　Ｍ　Ｔ　ｎｅｏ（３４２−１２
）模式図である。 （９「ψｚ２ リ　　ｌニア１　　　Ｖ’ Ｅ　　０１　　ＣＬ 工 日ａｍＨＬ ＳＶ４０　ＤＮＡ ３、Ｄ　フラフ゛メ＞ｋの回１．Ｉ叉 「ｎ　　　　　　　　　ＬＪ

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）生物学的に活性なエリトロポエチンを発現するヒ
    トｃＤＮＡのクローニング方法であって、 （ａ）精製したエリトロポエチンタンパク質をトリプシ
    ンで消化し； （ｂ）工程（ａ）で得られたトリプシンフラグメントの
    アミノ酸配列に基づいてオリゴヌクレオチドプローブの
    プールを作製し； （ｃ）工程（ｂ）のオリゴヌクレオチドプローブを用い
    てヒトゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングし； （ｄ）そのプローブとハイブリダイズするクローンを選
    択し、そのクローンの塩基配列を決定してそれらがエリ
    トロポエチンクローンであるかどうかを調べ； （ｅ）工程（ｄ）からのエリトロポエチンクローンを同
    定し； （ｆ）工程（ｅ）からのクローンを使用してヒト胎児肝
    臓から作成したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング
    し；そして （ｇ）工程（ｆ）の胎児肝臓ｃＤＮＡライブラリーから
    エリトロポエチンクローンを選択する；各工程から成る
    上記方法。
  2. （２）ヒト胎児染色体からヒトエリトロポエチンｇＤＮ
    Ａをクローニングする方法であって、 （ａ）ヒト胎児染色体から１または２以上の適当な制限
    酵素を用いて切断したＤＮＡ断片をバクテリアファージ
    ラムダベクターに挿入してヒトｇＤＮＡライブラリーを
    作製し； （ｂ）このライブラリーから別途作成したエリトロポエ
    チンｃＤＮＡから調製されたオリゴヌクレオチドプロー
    ブまたは種々のプローブを用いて、ヒトエリトロポエチ
    ンｇＤＮＡをクローニングする； 各工程からなる上記方法。
  3. （３）上記（ａ）で用いる制限酵素がＨａｅIII／Ａｌ
    ｕ I であり、バクテリアファージラムダがＣｈａｒｏ
    ｎ４Ａであることを特徴とする特許請求の範囲第２項記
    載の方法。
  4. （４）下記のＤＮＡ配列であるｇＤＮＡ。 【遺伝子配列があります】
  5. （５）下記ＤＮＡ配列を有するｇＤＮＡを含む組換えＤ
    ＮＡベクター。 【遺伝子配列があります】
  6. （６）下記ＤＮＡ配列を有するｇＤＮＡを含む組換えベ
    クターで形質転換された哺乳動物細胞株。 【遺伝子配列があります】
  7. （７）前記哺乳動物細胞株がＣＨＯ細胞である特許請求
    の範囲第６項に記載の細胞株。
  8. （８）発現制御配列に適切に結合された下記のＤＮＡ配
    列を含む真核生物宿主細胞を適当な培地で培養し、生産
    されたエリトロポエチンを細胞および培地から分離する
    ことをから成るエリトロポエチンの生産方法。 【遺伝子配列があります】
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