PL154180B1 - Method of obtaining a human clone cdna exhibiting biological expressions of active erythropoetin - Google Patents

Description

RZECZPOSPOLITA OPIS PATENTOWY 154 18©

POLSKA

Patent dodatkowy do patentu nr--Zgłoszono: 85 12 03 (P. 256589)

Int. Cl.⁵ C12N 15/10

Pierwszeństwo 85 01 03 Stany Zjednoczone Ameryki

URZĄD

PATENTOWY

RP

Ποιο

Zgłoszenie ogłoszono: 86 10 21

Opis patentowy opublikowano: 1992 02 28

Twórca wynalaakk--Uprawniony z patentu: Genetics Institute, Inc.,

Cambridge (Stany Zjednoczone Ameryki)

Sposób wytwarzania klonu ludzkiego cDNA wykazującego ekspresję biologicznie aktywnej erytropoetyny

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania klonu ludzkiego cDNA wykazującego ekspresję biologicznie aktywnej erytropoetyny.

Erytropoetyna, określana w dalszej części niniejszego opisu skrótem EPO, jest glikoproteiną, która stymuluje wtwarzanie erytrocytów w organizmach wyższych (patrz: Carnot i wsp., Compt. Rend., 143, 384 /1906/). EPO czasami określa się jako czynnik stymulujący erytropoezę.

Czas życia ludzkich erytrocytów wynosi około 120 dni. Tak więc, około 1/120 część całkowitej ilości erytrocytów ulega codziennie zniszczeniu w układzie siateczkowośródbłonkowym. Jednocześnie, codziennie tworzona jest względnie stała ilość erytrocytów dla utrzymania przez cały czas względnie stałego ich poziomu [Guyton, Textbook of Medical Physiology, str. 56-60, W. B. Saunders Co., Philadelphia /1976/].

Erytrocyt tworzą się na drodze dojrzewania i różnicowania się erytroblastów w szpiku kostnym, a EPO jest czynnikiem, który działa na komórki mniej zróżnicowane i indukuje ich różnicowanie się do erytrocytów (Guyton, wyżej).

EPO jest obiecującym czynnikiem terapeutycznym do klinicznego leczenia niedokrwistości, a w szczególności niedokrwistości pochodzenia nerkowego. Niestety, wykorzystanie EPO nie jest jeszcze częste w praktyce klinicznej, a to z powodu jej małej dostępności.

Zmierzając do zastosowania EPO jako czynnika terapeutycznego należy brać pod uwagę możliwość zaistnienia problemów związanych z antygenowością i wobec tego jest rzeczą korzystną otrzymywanie EPO z surowego materiału pochodzenia ludzkiego. I tak np., można wykorzystać krew lub mocz ludzki od pacjentów z niedokrwistością aplastyczną, lub cierpiących na podobne choroby, wydzielających duże ilości EPO. Dostępność takich surowych materiałów jest jednak ograniczona. Patrz np.: White i wsp., Rec. Progi. Horm. Res., 16, 219 /1960./, Espada i wsp., Biochem. Med., 3,475 /1970,/, Fisher, Phannacol. Rev., 24,459 /1972/ i Gordon, Vitam. Horm. /N. Y./, 31, 105 /1973/, których odkrycia włączono do niniejszego opisu jako odnośniki.

Otrzymywanie produktów o charakterze EPO odbywa się na ogół za pomocą zatężania i oczyszczania moczu od pacjentów wykazujących wysoki poziom EPO, takich jak pacjenci z

154 180 niedokrwistością aplastyczną i podobnymi chorobami. Patrz np., opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr nr 4 397840, 4303650 i 3865 801, które to ujawnienia są włączone do niniejszego opisu jako odnośniki. Ograniczona dostępność moczu tego rodzaju stanowi przeszkodę w praktycznym użyciu EPO i z tego powodu jest wysoce pożądane otrzymywanie produktów o charakterze EPO z moczu ludzi zdrowych, jednakże przy zastosowaniu takiego moczu problemem jest niski poziom EPO w porównaniu z moczem od pacjentów z niedokrwistością. Oprócz tego, mocz od osobników zdrowych zawiera różne czynniki hamujące, działające przeciwnie do erytropoetyny, przy czym czynniki te wykazują wystarczająco wysokie stężenie, tak, że zadowalający efekt terapeutyczny można byłoby uzyskać, w przypadku zastosowania EPO otrzymanego z moczu ludzi zdrowych, dopiero po jego daleko idącym oczyszczeniu.

EPO można także otrzymać z osocza krwi baraniej i przez wydzielenie EPO z tego osocza otrzymano preparaty wystarczająco skuteczne, stabilne i rozpuszczalne w wodzie. Patrz: Goldwasser, Control Cellular Dif. Develop., cz. A, str. 487-494, Alan R. Liss, Inc., N. Y. /1981/, włączony do niniejszego opisu jak odnośnik. Można jednak oczekiwać, że barania EPO będzie wykazywać w organizmie ludzkim antygenowość.

Tak więc, podczas gdy EPO jest pożądanym czynnikiem terapeutycznym, to z drugiej strony zwykłe metody wyodrębniania i oczyszczania, stowsowane w przypadku naturalnych materiałów stanowiących źródło EPO, nie są odpowiednie do masowej produkcji tego związku.

Sugimoto i wsp. w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4377513 opisują sposób wytwarzania dużych ilości EPO obejmujący namnażanie in vivo ludzkich komórek limfoblastoidalnych, w tym Namalwa, BALL-1, NALL-1, TALL-1 i JBL.

W piśmiennictwie fachowym pojawiły się doniesienia, że do wytwarzania EPO zastosowano metody inżynierii genetycznej. Jednakże nie opublikowano ujawnienia umożliwiającego wytwarzanie, ani też danych dotyczących chemicznego charakteru produktu. W przeciwieństwie do tego, niniejsze zgłoszenie przedstawia ujawnienie umożliwiające masową produkcję białek wykazujących właściwości biologiczne białek, takich jak białka o właściwościach biologicznych ludzkiej EPO. Sposobem takim można wytwarzać białka, które pod względem chemicznym mogą się różnić od autentycznej ludzkiej EPO, tym niemniej jednak wykazują podobne, a w niektórych przypadkach polepszone właściwości. Dla wygody, wszystkie te białka wykazujące właściwości biologiczne ludzkiej EPO określa się w dalszej części opisu jako EPO, niezależnie od tego, czy są one, czy też nie są chemicznie identyczne z EPO.

Wynalazek niniejszy dotyczy klonowania genu wykazującego zaskakująco wysoki poziom ekspresji ludzkiej EPO.

Jak to opisano bardzej szczegółowo w dalszej części opisu, otrzymano EPO w postaci oczyszczonej, po czym oczyszczano ją dalej aż do uzyskania homogeniczności i trawiono trypsyną w celu wytworzenia specyficznych fragmentów. Fragmenty te oczyszczono i poddano sekwencjonowaniu. Na podstawie tych sekwencji zaprojektowano pulę sond oligonukleotydowych, dokonano ich syntezy i użyto do skriningu ludzkiego zbioru genomowego, z którego wyodrębniono gen EPO.

Gen EPO zwerifikowano na podstawie jego sekwencji DNA, którą skojarzono z wieloma fragmentami trypsynowymi uzyskanymi z sekwencjonowania. Następnie fragmentu klonu genomowego użyto do wykazania za pomocą hybrydyzacji, że można wykryć mRNA EPO w płodzie ludzkim (20-tygodniowym). Otrzymano i poddano skriningowi zbiór cDNA z wątroby płodu ludzkiego. Po skriningu ponad 750 000 rekombinantów otrzymano trzy klony cDNA EPO. Stwierdzono, że dwa z tych klonów mają pełną długość, o czym można było sądzić na podstawie całkowitej sekwencji kodującej i zasadniczej sekwencji 5' i 3' nie podlegającej translacji. Doprowadzono do ekspresji tych DNA zarówno w komórkach małpich transformowanych wirusem SV-40 (linia komórkowa COS-1, Gluzman, Celi, 23,175-182 /1981/), jak i w komórkach jajnika chomika chińskiego (linia komórkowa CHO, G. Urlaub i L. A. Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4280 /1980/). EPO tworzona w komórkach COS stanowi EPO biologicznie aktywną in vitro i in vivo. EPO tworzona w komórkach CHO jest bilogicznie aktywna in vitro. In vivo nie była ona badana.

Klon cDNA EPO ma interesującą otwartą ramę odczytu 14-15 aminokwasów (aa) oraz inicjator i terminator z 20 do 30 nukleotydów (nt) za regionem kodującym. Reprezentatywną

154 180 próbkę E. coli transfekowanej klonowanym genem EPO zdeponowano w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, gdzie jest dostępna pod numerem rejestracyjnym ATCC 40553.

Figura 1 przedstawia sekwencję 87 par zasad egzonu, ludzkiego genu EPO. Fig. 2 objaśnia wykrycie mRNA EPO w mRNA wątroby płodu ludzkiego. Fig. 3A przedstawia sekwencję aminokwasów białka EPO wydedukowaną z sekwencji nukleotydów .A-HEPOFL13. Fig. 3B przedstawia sekwencję nukleotydów w cDNA EPO w Ż-HEPOFL13 i wydedukowaną z tego sekwencję amonokwasów co schematycznie przedstawiono na fig. 3C. fig. 4A 'przedstawia względną pozycję insertów DNA czterech niezależnych ludzkich genomowych klonów EPO. fig. 4B przedstawia mapę rzeczywistej struktury intronu i egzonu ludzkiego genu EPO. fig. 4C przedstawia sekwencję DNA genu EPO przedstawionego na fig. 4B. fig. 5A, 5B i 5C przedstawiają konstrukcję wektora 91023(B). fig. 6 przedstawia analizę w żelu poliakryloamidowym EPO wytworzonej w komórkach COS-1w porównaniu z natywną EPO. fig. 7 przedstawia sekwencję nukleotydów i aminokwasów klonu EPO, Λ-HEPOFLó. fig. 8 przedstawia sekwencję nukleotydów i aminokwasów klonu EPO, .A-HEPOFL8. fig. 9 przedstawia sekwencję nukleotydów i aminokwasów klonu EPO, λHEPOFL13. fig. 10 przedstawia schematycznie plazmid pRKl-4, oraz fig. 11 przedstawia schematycznie plazmid pdBPV-MMTneo (342-12).

Wynalazek dotyczy klonowania genów EPO.

Piśmiennictwo patentowe i naukowe obfituje w doniesienia o procesach użytecznych w wytwarzaniu produktów rekombinantowych. Ogólnie, techniki te obejmują wyodrębnianie lub syntezę sekwencji żądanego genu i ekspresję tej sekwencji w komórkach prokariotycznych, lub eukariotycznych, z zastosowaniem metod zwykle dostępnych fachowcom w tej dziedzinie wiedzy. Gdy dany gen zostanie wyodrębniony, oczyszczony i wprowadzony od odpowiedniego wektora przenoszącego (to jest klonowany), zapewniona zostaje też jego dostępność w dużych ilościach. Wektor, wraz z klonowanym w nim genem, zostaje wprowadzony do odpowiedniego drobnoustroju lub linii komórkowej, np. bakterii, drożdży, komórek ssaków, takich jak COS-1 (nerka małpy), CHO (jajnik chomika chińskiego) oraz linii komórek owadzich itp., w których wektor ulega replikacji w miarę namnażania się drobnoustroju lub komórek z linii komórkowej. Z komórek tych wektor można wyodrębnić zwykłymi sposobami. Tak więc zostaje zapewnione ciągle odnawiające się źródło genu do dalszych manipulacji, modyfikacji i przenoszenia do innych wektorów lub innych loci w tym samym wektorze.

Do ekspresji często można doprowadzić za pomocą przeniesienia klonowanego genu, w odpowiedniej orientacji i w ramie odczytu, do stosownego miejsca w wektorze przenoszącym, tak że translacyjne odczytanie prokariotycznego lub eukariotycznego genu daje w wyniku syntezę prekursora białkowego zawierającego sekwencją aminokwasów kodowaną przez klonowany gen związaną z Met, lub aminokońcową sekwencją zależną od genu prokariotycznego lub eukariotycznego. W innych przypadkach, sygnały inicjacji transkrypcji i translacji może zapewnić odpowiedni fragment genomowy klonowanego genu. W celu rozszczepienia prekursora białkowego, jeżeli taki jest wytwarzany, w żądanym miejscu, można użyć różnorodnych metod specyficznego rozszczepiania białek, tak, że zostaje uwolniona żądana sekwencja aminokwasów, którą można oczyszczać zwykłymi środkami. W niektórych przypadkach, białko zawierające żądaną sekwencję aminokwasów zostaje bez potrzeby zastosowania metod specyficznego rozszczepiania i daje się również wydzielić z komórek do zewnątrzkomórkowego podłoża wzrostowego.

Wyodręnianie genomowego klonu ludzkiej EPO. Ludzką EPO oczyszczono do homogenizacji z moczu pacjentów dotkniętych niedokrwistością aplastyczną, jak to opisano w dalszej części ninijeszego opisu. Całkowite strawienie tej oczyszczonej EPO proteazą-trypsyną dostarczyło fragmentów, które rozdzielono za pomocą cieczowej chromatografii ciśnieniowej z odwróconymi fazami, odzyskano z frakcji gradientowych i poddano analizie mikrosekwencyjnej. Sekwencje fragmentów trypsynowych podkreślono na fig. 3 i bardziej szczegółowo przedyskutowano w poniższej części niniejszego opisu. Dwie sekwencje aminokwasów, Val- Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lys i Val-Tyr-Ser-Asn-Phe-Leu-Arg, wybrano do zaprojektowania sond oligonukleotydowych, z czego wynikła pula oligonukleotydów o długości 17 nt i 32-krotnie zdegenerowana i pula oligonukleotydów o długości 18 nt i 128-krotnie zdegenerowana, które odpowiadały pierwszemu fragmentowi trypsynowemu, oraz dwie pule o długości 14 nt, z których każda była 48-krotnie zdegenerowana i

154 180 które odpowiadały dalszemu fragmentowi trypsynowemu. 17-członowej 32-krotnie zdegenerowanej puli użyto do screeningu zbioru ludzkiego genomowego DNA w wektorze Ch4A (22), przy zastosowaniu modyfikacji metody amplifikacji in situ Woo i O'Malley'a (47) do otrzymywania filtrów do screeningu.

W niniejszym opisie liczby arabskie w nawiasach od (1) do (61) wykorzystano w przypadku odnoszenia się do publikacji, które wyliczono w porządku alfabetycznym przy końcu niniejszego opisu.

Fagi hybrydyzujące z 17-członową pulą pobrano, połączono w małe grupy i sondowano pulami: 14-członową i 18-członową. Fagi hybrydyzujące z pulami: 17-cztonową, 18-członową i 14-członową oczyszczono za pomocą tworzenia łysinek i fragmenty subklonowano do wektorów M13 w celu analizy sekwencji metodą didezoksy-zakończenia łańcucha Sangera i Coulsona (23) /1977). Sekwencję regionu w jednym z klonów, hybrydyzującego z 32-krotnie zdegenerowaną 17-członową pulą, pokazano na fig. 1. Ta sekwencja DNA zawiera w otwartej ramie odczytu nukleotydy, które mogły dokładnie kodować fragment trypsynowy użyty do zaprojektowania 17-członowej puli oligonukleotydów. Dalej, analiza sekwencji DNA wykazała, że 17-członowy region hybrydyzujący zawarty był w egzonie o 87 parach zasad, związanym z potencjalnymi mijescami akceptora i donora cięcia i składania.

Pozytywne potwierdzenie tego, że te dwa klony (oznaczone w niniejszym opisie jako λHEPO1 i Λ-ΗΕΡΟ2) są genomowymi klonami EPO, otrzymano za pomocą poddania analizie sekwencji dodatkowych egzonów zawierających informację dotyczącą kodowania innych fragmentów trypsynowych.

Wyodrębnianie klonów cDNA EPO. Analizę metodą Northerna (56) mRNA wątroby ludzkiego płodu (20 tygodni) prowadzono stosując jednoniciową sondę o 95 nt otrzymaną z klonu Μ13 zawierającego część egzonu o 87 parach zasad opisanego na fig. 1. Jak objaśniono na fig. 2, w mRNA wątroby płodu można było wykryć silny sygnał. Dokładniej identyfikacji tego pasma jako mRNA EPO dokonano za pomocą zastosowania tej samej sondy do screeningu zbioru cDNA z bakteriofaga λ, który to cDNA odpowiadał mRNA wątroby płodu (25). Otrzymano kilka hybrydyzujących klonów z częstością odpowiadającą mniej więcej jednemu pozytywnemu na 250000 rekombinantów poddanych screeningowi. Całkowitą sekwencję nukleotydów i wydedukowaną sekwencję aminokwasów dla tych klonów (Λ-HEPOFL13 i 1-HEPOFL8) przedstawiono na fig. 7 i 8. Informacja dotycząca kodowania EPO jest zawarta w połowie cDNA 5' o 594 nt, obejmując w wysokim stopniu hydrofobowy lider o 27 aminokwasach i dojrzałe białko o 166 aminokwasach.

Identyfikację N-końca dojrzałego białka oparto na N-końcowej sekwencji białka wydzielanego w moczu osób z niedokrwistością aplastyczną, jak przedstawiono w niniejszym opisie (fig. 1), oraz jak to opublikowali: Goldwasser (26), Sue i Sytkowski (27) i Yanagawa (21). Nie jest obecnie wiadome, czy ten N-koniec (Ala-Pro-Pro-Arg—) reprezentuje rzeczywisty N-koniec znajdowany w EPO występującej w krążeniu, czy też w nerce lub moczu następuje rozszczepienie w pewnym stopniu.

Sekwencje aminokwasów podkreślone na fig. 3 wskazują te fragmenty trypsynowe lub część N-końca, z których otrzymano informację dotyczącą sekwencji białkowej. Wydedukowana sekwencja aminokwasów zgadza się z fragmentami trypsynowymi, które analizowano, potwierdzając, że wyodrębniony gen koduje ludzką EPO.

Struktura i sekwencja genu ludzkiej EPO. Względnie pozycje insertów DNA i czterech niezależnych genomowych klonów ludzkiej EPO pokazano na fig. 4A. Analiza hybrydyzacji tych klonowych DNA z sondami oligonukleotydowymi i z różnymi sondami otrzymanymi z tych dwu klas klonów cDNA EPO pozwala na umiejscowienie genu EPO w regionie o około 3,3 kilozasady pokazanym przyciemnioną linią na fig. 4A. Całkowita analiza sekwencji tego regionu (patrz przykład IV) i porównanie z klonami cDNA dało w wyniku mapę struktury intronowej i egzonowej genu EPO, pokazaną na fig. 4B. Gen EPO jest podzielony na 5 egzonów. Część egzonu I, wszystkie egzony II, III i IV, oraz część egzonu V zawierają informację dotyczącą białka. Pozostałe części egzonów I i V kodują, odpowiednio, sekwencje 5' i 3' nie ulegające translacji.

Tymczasowa ekspresja EPO w komórkach COS. W celu wykazania, że można oczekiwać ekspresji biologicznie aktywnej EPO w układzie hodowli komórkowej in vitro, przeprowadzono

154 ISO badania ekspresji w komórkach COS (58). Wektor stosowany do tymczasowych badań,p91023(B), opisano w przykładzie V. Wektor zawiera główny promotor późny adenowirusa, sekwencję poliadenylacji SV40, początek replikacji SV40, wzmacniacz SV40 i gen VA adenowirusa. Insert cDNA w Λ-HEPOFL 13 (patrz fig. 8) wprowadzono do wektora p91023(B), w dół od głównego promotora późnego adenowirusa. Ten nowy wektor zidentyfikowano jako pPTFL13.

Po upływie 24 godzin od wprowadzenia tej konstrukcji do szczepu M6 komórek COS-1 na drodze transfekcji [Horowitz i wsp., J. Mol. Appl. Genet., 2, 147-149 /1983/], komórki te przemyto, przeniesiono do podłoża bez surowicy. 48 godzin później komórki zebrano. Następnie badano poziom uwalniania EPO do supernatantu hodowli stosując ilościowy test radioimmunologiczny dla EPO (55). Jak pokazano w tabeli 1 (przykład VI) nastąpiła ekspresja immunologicznie reaktywnej EPO. Badano również całkowitą aktywność biologiczną EPO tworzonej przez komórki COS-1. W oddzielnym eksperymencie, komórki COS-1 transfekowano wektorem zawierającym cDNA EPO z λ- HEPOFL13. Podłoża zebrano jak opisano powyżej. EPO w podłożach badano ilościowo zarówno w dwóch testach biologicznych in vitro (³H-tymidyna i CPU-E /12,29), jak i w dwóch testach in vivo (niedotleniona mysz i głodzony szczur) (30,31) (patrz tabela 2, przykład VII). Badania te wykazały, że w komórkach COS-1 jest tworzona biologicznie aktywna EPO. Za pomocą nakroplenia metodą Westerna, stosując poliklonalne przeciwciało przeciw EPO, wykazano, że EPO wytworzona w komórkach COS ma tę samą ruchliwość elektroforetyczną w żelach SDSpoliakryloamidowych, co natywna EPO otrzymana z moczu ludzkiego (przykład VIII). Tak więc, rozmiary glikozylacji EPO wytworzonej przez COS-1 mogą być podobne do wykazywanego przez natywną EPO.

Można także użyć w zastosowaniu do komórek COS albo innych komórek ssaków łub komórek eukariotycznych różnych wektorów zawierających inne promotory. Przykłady tych innych promotorów obejmują wczesne i późne promotory SV40, promotor genu mysiej metalotioneiny, promotor znajdowany w długich terminalnych powtórkach retrowirusów ptaków i ssaków, promotor genu polihedryny bacculowirusa i inne. Przykłady innych typów komórek użytecznych w praktycznym zastosowaniu sposobu według wynalazku obejmują E. coli, drożdże, komórki ssaków, takie jak CHO (jajnik chomika chińskiego), 0127 (nabłonek małpi) 3T3 (fibroblasty mysie), CV-1 (nerka afrykańskiej małpy zielonej) oraz komórki owadów takich jak Spodoptera frugiperda i Drosophila metanogaster. Te alternatywne typy promotorów i/lub komórek mogą umożliwić regulacją czasu pojawiania się łub regulację poziomu ekspresji EPO, wytwarzanie komórkowospecyficznego typu EPO, lub wzrost komórek tworzących EPO w dużych ilościach, w warunkach łatwiejszych do skontrolowania i pociągających za sobą niższe koszty.

Układ ekspresyjny, który zachowuje dodatnie cechy ekspresji u ssaków, ale wymaga mniej czasu do wytworzenia wysokoekspresyjnej linii komórkowej, jest złożony z linii komórek owadzich i wirusa DNA, który reprodukuje się w tej linii komórkowej. Wirus jest wirusem jądrowej polihedrozy. Ma on dwuniciowy kolisty genom DNA o 128 kilozasadach. Nukleokapsyd jest pałeczkowaty i stwierdzono, że może być upakowany w dwóch formach, nie zamkniętej jako wirus otoczony błoną oraz w formie zamkniętej w krysztale białkowym w jądrze zakażonej komórki. Te wirusy mogą być rutynowo namnażane w hodowli komórek owadzich in vitro i można ich używać przy wszystkich rutynowych metodach stosowanych do wirusów zwierzęcych. Płynem do hodowli komórek jest typowo roztwór soli odżywczych z płodową surowicą cielęcą w ilości 10%.

In vitro wzrost wirusa jest inicjowany, gdy nie zamknięty wirus (NOV) wnika do komórki i przechodzi do jądra, gdzie jest replikowany. Replikacja jest jądrowa. Podczas fazy wstępnej (8-18 godzin po zakażeniu) zastosowania wirusa, w jądrze zostają zmontowane nukleokapsydy i następnie BUD przenika przez błonę plazmatyczną jak NOV, rozsiewając zakażenie w hodowli komórek. Oprócz tego, niektóre z nukleokapsydów w dalszym ciągu (18 + godzin po zakażeniu) pozostają w jądrze i zostają zamknięte w materiale białkowym. Znane są jako wielościenne ciałka wtrętowe (PIB). Ta forma nie jest zakaźna w hodowli komórkowej. Powyższy materiał jest złożony z białka znanego jako polihedryna, o masie cząsteczkowej 33 kilodaltonów. Każdy PIB ma około 1 mm średnicy i może być ich tak wiele, jak nawet 100000 PIB na jedno jądro. Tak więc, polihedryna jest tworzona późno w cyklo infekcyjnym w wyraźnie dużej ilości, tak dużej, że wynosi to nawet 25% całkowitego białka komórkowego.

Ponieważ pIB nie gra roli w cyklu replikacji in vitro, gen polihedryny można usunąć z chromosomu wirusa bez wpływu na żywotność in vitro. Przy użyciu tego wirusa jako wektora ekspresyjnego, twórcy wynalazku zastąpili region zawierający gen kodujący polihedrynę obcym DNA, który ma ulegać ekspresji, umieszczając go pod kontrolą promotora polihedryny. Daje to w wyniku fenotyp wirusa nie tworzącego PIB. Układ ten wykorzystało kilku badaczy. Najwybitniejszymi z nich są Pennock i wsp., oraz Smith i wsp. Pennock i wsp. (Gregory D. Pennock, Charles Shoemaker i Lois K. Miller, Molecular and Celi Biology, 3:84, str. 399-406) donieśli o wysokim poziomie ekspresji białka bakteryjnego, /3-galaktozydazy, znajdującej się pod kontrolą promotora polihedryny.

Inny wektor ekspresyjny pochodzący z wirusa polihedrozy jądrowej przedstawili Smith i wsp. Gale E. Smith, Mas. D. Summersi M. J. FRaser, Molecular and Celi Biology, 16 maja, s. 2156-2165 /1985/. Wykazali oni skuteczność tego wektora w ekspresji ludzkiego j3-interferonu. Stwierdzono, że syntetyzowany produkt był glikozylowany i wydzielany z komórek owadzich, jak można było tego oczekiwać. W przykładzie XIV opisano modyfikacje plazmidu zawierającego gen polihedryny z wirusa polihedrozy jądrowej Autographa californica (AcNPV), które pozwalają na łatwe wprowadzenie genu EPO do plazmidu, tak, aby znalazł się on pod kontrolą transkrypcyjną promotora polihedryny. Utworzonym DNA kotransfekuje się komórki owadzie stosując go łącznie z nienaruszonym chromosomowym DNA z dzikiego typu AcNPV. W przypadku rekombinacji genetycznej zachodzi zastąpienie regionu genu polihedryny AcNPVC przez DNA z plazmidu. Powstały wirus rekombinantowy można zidentyfikować wśród potomstwa wirusa na podstawie posiadania sekwencji DNA genu EPO. Oczekuje się, że ten wirus rekombinantowy będzie wytwarzał EPO po reinfekcji komórek owadzich.

Przykłady ekspresji w komórkach CHO, C127 i 3T3 i owadzich podano w przykładach X i XI (CHO), XIII (C127 i 3T3), oraz XIV (komórki owadzie).

Biologicznie aktywnej EPO wytworzonej za pomocą prokariotycznej lub eukariotycznej ekspresji genów EPO klonowanych sposobem według niniejszego wynalazku, można użyć in vivo do leczenia ssaków różnych gatunków, a dotyczy do lekarzy i/lub weterynarzy. Ilość składnika czynnego będzie oczywiście zależeć od ciężkości schorzenia osobnika leczonego, wybranej drogi podawania i aktywności właściwej EPO, a ostatecznie będzie o tym decydować prowadzący kurację lekarz lub weterynarz. Tę ilość aktywnej EPO określoną przez leczącego lekarza przytacza się w niniejszym opisie jako ilość EPO terapeutycznie skuteczną. I tak np., w leczeniu indukowanej niedokrwistości hipoproliferatywnej towarzyszącej przewlekłej niewydolności nerek u owcy, skuteczna dawka dzienna EPO wynosi, jak stwierdzono, lOjedn/kg w ciągu 15 do 40 dni. Patrz: Eschbach i wsp., J. Glin. Inwest., 74, 434 /1984/.

Aktywną EPO można podawać każdą drogą odpowiednią do stanu leczonego. Korzystnie EPO wstrzykuje się do krwi leczonego ssaka. Fachowcy łatwo zdadzą sobie sprawę z tego, że korzystna droga podawania będzie się różnić w zależności od stanu leczonego.

Aczkolwiek możliwe jest podawanie aktywnej EPO jako związku czystego lub zasadniczo czystego, korzystnie podaje się ją w postaci środka lub preparatu farmaceutycznego.

Środki zarówno do użytku weterynaryjnego jak i dla ludzi, zawierają aktywne białko EPO, jak wyżej opisano, łącznie z jednym, lub więcej niż jednym farmaceutycznie dozwolonym jej nośnikiem, oraz ewentualnie, z innymi dodatkami leczniczymi. Nośnik (nośniki) musi być „dozwolony w tym sensie, że jest zgodny z innymi składnikami środka i nie jest szkodliwy dla biorcy. Jest pożądane, aby środek nie zawierał czynników utleniających innych substancji, z którymi peptydy są, jak wiadomo niezgodne. Dogodnie, środki można formułować w postaci dawek jednostkowych dowolną z metod dobrze znanych w dziedzinie farmacji. Wszystkie metody obejmują stadium doprowadzania do połączenia składnika czynnego z nośnikiem, który stanowi jeden, lub więcej niż jeden składnik dodatkowy. Ogólnie, środki wytwarza się za pomocą doprowadzenia do jednolitego i dokładnego połączenia składnika czynnego z nośnikami płynnymi lub subtelnie rozdrobnionymi nośnikami stałymi, względnie i z tymi i z tymi, a następnie, jeżeli jest to niezbędne, nadania otrzymanemu produktowi postaci żądanego środka.

Dogodnie, środki odpowiednie do podawania pozajelitowego zawierają jałowe roztwory wodne składnika czynnego z roztworami, korzystnie izotonicznymi z krwią biorcy. Tego rodzaju środki dogodnie otrzymuje się za pomocą rozpuszczenia stałego czynnika w wodzie, w' celu

154 180 7 wytworzenia roztworu wodnego i po wyjałowieniu roztwór ten można formułować w pojemnikach jednostkowych lub wielodawkowych, takich jak zamknięte ampułki lub fiolki.

Określenie EPO/cDNA, używane w niniejszym opisie, obejmuje dojrzały gen EPO/cDNA poprzedzony kodonem ATG, oraz EPO/cDNA kodujący alleliczne wariacje białka EPO. Jeden z alleli objaśniają fig. 3A i 3B. Białko EPO obejmuje 1-metioninową pochodną białka EPO (MetEPO) i alleliczne wariacje białka EPO. Dojrzałe białko EPO, objaśnione przez sekwencję na fig. 3A, zaczyna się sekwencją Ala. Pro. Pro. Arg..., której początek jest przedstawiony nr „1“ na fig. 3A. Met-EPO zaczynałoby się sekwencją Met. Ala. Pro. Pro. Arg... .

Następujące przykłady zamieszczono w celu zrozumienia sposobu według wynalazku, którego rzeczywisty zakres wynika z załączonych zastrzeżeń. Należy rozumieć, że można dokonać modyfikacji podanych sposobów postępowania, bez odchodzenia od ducha wynalazku. Wszystkie wartości temperatury wyrażono w stopniach Celsjusza, przy czym nie są one korygowane. Symbolem mikrona lub mikro, w takich jednostkach jak mikrolitry, mikromole, jest ,,μ“, np. μΐ, pm itd.

Przykladl. Wyodrębnianie genomowego klonu EPO. EPO oczyszcza się z moczu pacjentów z niedokrwistością aplastyczną zasadniczo tak, jak to uprzednio opisano [Miyake i wsp., J. Biol. Chem., 252, 5558X1977], z tą różnicą, że eliminuje się działanie fenolem i zastępuje je działaniem ciepłem w temperaturze 80°C w ciągu 5 minut, w celu zinaktywowania neuraminidazy. Końcowym stadium oczyszczania jest frakcjonowanie na kolumnie HPLC C-4 Vydac (The Separations Group) przy zastosowaniu gradientu 0-95% acetonitrylu z 0,1% kwasem trifluorooctowym (TFA) w ciągu 100 minut. Usytuowanie EPO w gradiencie określa się za pomocą elektroforezy w żelu i analizy N-końcowej sekwencji (21,26,27) głównych pików. EPO eluuje się przy około 53% acetonitrylu i stanowi około 40% białka poddanego HPLC z odwróconymi fazami. Frakcje zawierające EPO odparowuje się do 100pi, doprowadza pH do wartości 7,0 za pomocą wodorowęglanu amonowego i trawi całkowicie 2% trypsyną potraktowaną TPCK (Worthington) w ciągu 18 godzin w temperaturze 37°C. Mieszaninę po trawieniu trypsyną poddaje się HPLC z odwróconymi fazami, jak wyżej opisano. Rejestruje się gęstość optyczną zarówno przy 280 nm jak i przy 214 nm. Dobrze rozdzielone piki odparowuje się niemal do sucha i poddaje bezpośrednio analizie sekwencji N-końcowych aminokwasów (59) stosując analizator sekwencji w fazie gazowej Applied Biosystems Model 480A. Otrzymane sekwencje są na fig. 3 podkreślone.

Jak to opisano w powyższej części niniejszego opisu, dwa z tych fragmentów trypsynowych wybiera się do sond oligonukleotydowych. Na podstawie sekwencji Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lys (aminokwasy 46 do 52 na fig. 3) otrzymuje się 17-ezłonową- 32-krotnie zdegenerowaną:

A	A	A
TTCCANGCG	TAG	AAGTT
i 18-członową 128-krotnie zdegenerowaną:
A	A	A

CCANGCG TAG AAGTTNAC

Na podstwie sekwencji Val-Tyr-Ser-Asn-Phe-Leu-Arg (aminokwasy 144 do 150 na fig.3) otrzymuje się dwie pule 14-czlonowe, z których każda jest 32-krotnie zdegenerowana:

TTGN T T TTGN T T

TACACCT AACTTCCT i TACACCT AACTTCTT które różnią się przy pierwszej pozycji kodonu leucyny. Oligonukleotydy znakuje się ³²P przy końcu 5' za pomocą kinazy polinukleotydowej (New England Biolabs) oraz y³²P-ATP (New England Nuclear). Aktywność właściwa oligonukleotydów wahała się w zakresie od 1000 do 3000 Ci/mmo! oligonukleotydu. Zbiór ludzkiego genomowego DNA w bakteriofagu Λ (Lawn i wsp., 22) poddaje się screeningowi stosując modyfikację metody amplifikacji in situ Woo i wsp. (47) (1978). Około 3,5· 10⁵ fagów nanosi się przy gęstości 6000 fagów na 150 mm płytkę Petri'ego (podłoża NZCYM) i inkubuje się w temperaturze 37°C, aż. łysinki staną się widoczne, chociaż małe (około 0,5 mm). Po ochłodzeniu do temperatury 4°C w ciągu godziny, podwójne repliki układu łysinek przenosi się na nylonowe membrany (New England Nuclear) i inkubuje przez noc w temperaturze

154 180

37°C na świeżych płytkach NZCYM. Następnie filtry poddaje się denaturacji i zobojętnieniu za pomocą położenia ich, każdorazowo na 10 minut, na cienkiej warstwie, odpowiednio, 0,5 N NaOH- IM NaCl o 0,5 M Tris (pH 8) - IM NaCl. Następnie poddaje się działaniu ciepła w temperaturze 80°C w ciągu 2 godzin pod zmniejszonym ciśnieniem, przemywa się filtry 5 X SSC, 0,5% SDS w ciągu godziny i komórkowy debris usuwa się z powierzchni filtra za pomocą łagodnego zdrapania wilgotną tkaniną. To zdrapywanie zmniejsza wiązanie się sondy z filtrami, stanowiące tło.

Następnie filtry spłukuje się wodą i poddaje prehybrydyzacji w ciągu 4 do 8 godzin w temperaturze 48°C w 3M chlorku tetrametyloamoniowym, 10 mM fosforanie sodu (pH 6,8), 5 X rotworze Denhardfa, 0,52% SDS i 10 mM EDTA. Następnie dodaje się znakowaną 32p 17członową pulę o stężeniu 0,1 pmola/ml i prowadzi hybrydyzację w temperaturze 48°C w ciągu 72 godzin. Po hybrydyzacji filtry wyczerpująco przemywa się w 2XSSC (0,3 M NaCl - 0,03 M cytrynian sodowy, pH 7) w temperaturze pokojowej, a następnie w ciągu godziny w 3 M TMAC1 -10 mM fosforanie sodu (pH 6,8) w temperaturze pokojowej i w ciągu 5-15 minut w temperaturze hybrydyzacji. Wykrywa się w przybliżeniu 120 silnych podwójnych sygnałów po upływie 2 dni autoradiografii z zastosowaniem ekranu wzmacniającego. Pobiera się materiały pozytywne, grupuje w pule po 8, ponownie przenosi na płytki i poddaje screeningowi, czyniąc to trzy razy, z zastosowaniem połowy 14-członowej puli na każdy z dwóch filtrów i 17-czlonowej na filtr trzeci. Warunki przenoszenia na płytki i hybrydyzacji, oraz 17-czlonowa pula, były takie, jak opisano w powyższej części niniejszego opisu, z tą różnicą, że hybrydyzację prowadzi się w temperaturze 37°C. Po autoradiografii, sondę usuwa się z filtra z 17-czlonową pulą w 50% formamidzie w ciągu 20 minut w temperaturze pokojowej i filtry poddaje powtórnej hybrydyzacji w temperaturze 52°C z sondą 18-członową. Dwa niezależne fagi hybrydyzują ze wszystkimi trzema sondami. DNA z jednego z tych fagów (oznaczonego w niniejszym opisie Λ-ΗΕΡΟ1) trawi się całkowicie Sau3A i subklonuje do M13 w celu analizy sekwencji z zastosowaniem metody didezoksy-zakończenia łańcucha metodą Sangera i Coulsona (23) (1977).

W niniejszym opisie przedstawiona jest sekwencja nukleotydów, oraz wydedukowana sekwencja aminokwasów otwartej ramy odczytu, kodująca fragment trypsynowy (region podkreślony). Sekwencje intronowe podane są małymi literami, sekwencje egzonowe (87 nt) podane są dużymi literami. Sekwencje odpowiadające zgodnym miejscom akceptora (a) i donora (d) cięcia i składania są podkreślone (patrz: fig. 4c).

Przykład II. Analiza mRNA wątroby ludzkiego płodu metodą Northerna.

5pg mRNA wątroby ludzkiego płodu otrzymanego z wątroby płodu 20-tygodniowego i mRNA wątroby dorosłego osobnika poddaje się elektroforezie w 0,8% agarozowym żelu formaldehydowym i przenosi na nitrocelulozę stosując metodę Dermana wi sp., Celi, 23, 731 (1981). Następnie przygotowuje się jednoniciową sondę z matrycy M13 zawierającej insert przedstawiony na fig. 1. Primer jest 20-członowy, otrzymany na podstawie tego samego fragmentu trypsynowego co oryginalna sonda 17-czlonowa. Sondę otrzymuje się, jak uprzednio opisali Anderson i wsp., PNAS (50) (1984), z tą różnicą, że po trawieniu Smal (przy użyciu którego wytwarza się żądaną sondę o długości 95 nt, zawierającą sekwencję kodującą o 74 nt), mały fragment oczyszcza się z matrycy Μ13 za pomocą chromatografii na kolumnie Sepharose CI4B w 0,1 N NaOH - 0,2 M NaCl. Filtry poddaje się hybrydyzacji z tą sondą (do około 5 · 10⁶ zliczeń/min) w ciągu 12 godzin, w temperaturze 68°C, przemywa w 2XSSC w temperaturze 68°C i eksponuje w ciągu 6 dni z zastosowaniem ekranu wzmacniającego. Pojedynczy marker stanowiący mRNA o 1200 nt (wskazany strzałką) poddaje się elektroforezie na sąsiedniej ścieżce (fig. 2).

Przykład III. cDNA otrzymany uz wykorzystaniem wątroby płodu. Otrzymuje się sondę identyczną z sondą opisaną w powyższym przykładzie II i stosuje ją do screeningu zbioru cDNA otrzymanego z wykorzystaniem wątroby płodu, przygotowanego w wektorze --Ch21A [Toole i wsp., Naturę (25) (1984)] z zastosowaniem standardowym metod sreeningu łysinek [Benton Davis, Science (54)(1978)]. Na podstawie screeningu 1 · 106 ^inek wyodrębnia się 3 niezależne pozytywne klony [oznaczone w niniejszym opisie Λ-HEPOFLó (1350 par zasad), --HEPOFL8 (700 par zasad) i Ż-HEPOFL13 (1400 par zasad)]. Nienaruszony insert z Ż-HEPOFL13 i Λ-HEPOFLó poddaje się analizie sekwencji po subklonowaniu do M13 (fig., odpowiednio, 9 i 7). Analizie sekwencji

154 180 poddaje się jedynie część 2-HEPOFL8 i zakłada się, że pozostałość jest identyczna z innymi dwoma klonami (fig. 8). Nie ulegające translacji sekwencje 5' i 3' przedstawione są małymi literami. Region kodujący przedstawiony jest dużymi literami.

W odniesieniu do fig. 3A i 3B, wydedukowana sekwencja aminokwasów pokazana poniżej sekwencji nukleotydów numerowana jest zaczynając od 1 dla pierwszego aminokwasu dojrzałego białka. Przypuszczalny peptyd liderowy jest wskazany wszystkimi „czapeczkami oznaczeń aminokwasów. Reszty cysteiny w dojrzałym białku są dodatkowo wskazane przez SH, a potencjalne miejsca N-glikozylacji są wskazane przy pomocy gwiazdki. Aminokwasy podkreślone wskazują reszty zidentyfikowane na podstawie analizy sekwencji N-końca białka, albo analizy sekwencji fragmentów EPO, jak opisano w powyższym przykładzie I. Częściowe podkreślenie wskazuje te reszty w sekwencji aminokwasów pewnych fragmentów trypsynowych, które nie mogły być określone w sposób jednoznaczny. Klony cDNA A-HEPOFL6, A-HEPOFL8 i /AHEPOFL13 zostały zdeponowane i są dostępne w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, pod numerami rejestracyjnymi, odpowiednio, ATCC 40156, ATCC 40152 i ATCC 40153.

Przykład IV. Genomowa struktura genu EPO. Względne wielkości i pozycje czterech niezależnych klonów genomowych (Λ-ΗΕΡΟ1, 2, 3 i 6) ze zbioru Haelll/Alul przedstawione są zachodzącymi na siebie liniami na ,fig. 4A. Linie pogrubiane wskazją pozycję genu EPO. Wskazana jest skala (w kilozasadach) i pozycje znanych miejsc rozpoznawania endonukleaz restrykcyjnych. Region zawierający gen EPO został całkowicie zanalizowany pod względem sekwencji obydwu nici przy zastosowaniu ukierunkowanych, wytworzonych przez endonukleazę III serii delecji w tym regionie. Schematyczna reprezentacja pięciu egzonów mRNA kodujących EPO jest przedstawiona na fig. 4B. Dokładna granica egzonu I po stronie 5' nie jest obecnie znana. Części egzonów kodujące białko są zaciemnione. Całkowita sekwencja regionu jest pokazana na fig. 4C. Znane granice każdego regionu są nakreślone grubymi, pionowymi kreskami. Genomowe klony Λ-ΗΕΡΟ1, Λ-ΗΕΡΟ2, Λ-ΗΕΡΟ3 i Λ-ΗΕΡΟ6 zostały zdeponowane i są dostępne w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, pod numerami rejestracyjnymi, odpowiednio, ATCC 40154, ATCC 40155 40150 i ATCC 40151.

Przykład V. Konstrukcja wektora p91023/B/. Wektor transformacyjny pAdD26SVp A/3/ jest opisany przez Kaufmana i wsp., Mol. Celi Biol., 2, 1304 (1982). Struktura tego wektora jest pokaźna na fig. 5 A. Mówiąc krótko, plazmid ten zawiera cDNA genu mysiej reduktazy dihydrofolianowej (DFHR), który znajduje się pod transkrypcyjną kontrolą głównego promotora późnego adenowirusa 2 (Ad2). Miejsce rozszczepienia 5'jest wskazane w adenowirusowym DNA, a miejsce rozszczepienia 3' pochodzące z genu immunoglobuliny, jest obecne między głównym promotorem Ad2 i sekwencją kodującą DHFR. Wczesne miejsce poliadenylacji SV40 występuje w dół od sekwencji kodującej DHFR. Część pAdD26SVpA/3/ pochodzenia prokariotycznego otrzymana jest z pSVOd [Mellon i wsp., Celi, 27, 279, /1981/] i nie zawiera sekwencji pBR322 znanych z hamowania replikacji w komórkach ssaków [Lusky i wsp., Naturę, 293, 79 /1981/].

pAdD26SVpA/3/ przeprowadza się w plazmid pCVSVL2 jak przedstawiono na fig. 5A. pAdD26SVpA/3/ przeprowadza się w plazmid pAdD26SVpA/3//<±/ za pomocą delecji jednego z dwóch miejsc Pstl w pAdD26SVpA/3/. Dokonuje się tego na drodze częściowego strawienia przy użyciu Pstl przy deficycie enzymu, tak, aby uzyskać plazmidy przeprowadzone w postać liniową, w których rozszczepione zostaje tylko jedno miejsce Pstl. Następnie działa się fragmentem Klenowa, liguje w celu przeprowadzenia ponownie w postać kolistą i dokonuje screeningu pod względem delecji miejsca Pstl zlokalizowanego przy końcu 3' w stosunku do sekwencji poliadenylacji SV40.

Trójczłonowy lider adenowirusa i wirusowe geny towarzyszące (VA) włączone do pAdD26SVpA/3//d/jak pokazano na fig. 5A. Najpierw pAdD26SVpA/3//d/rozszczepia się PvuII w celu otwarcia liniowej cząsteczki w części 3' trzech elementów obejmujących trzyczęściowy lider. Następnie, pJAW [Zain i wsp., Celi, 16, 851 /1979/], trawi się Xhol, poddaje działaniu fragmentu Klenowa, trawi PvuII, po czym wyodrębnia fragment o 140 parach zasad, zawierający drugą część trzeciego lidera, na drodze elektroforezy w żelu poliakryloamidowym (6% w buforze Tris-boran, Maniatis i wsp., wyżej). Następnie fragment o 140 parach zasad liguje się do AAdD26SVpA/3//d/ strawionego PvuII. Produktu ligacji używa się do transformowania E. coli do oporności na tetracyklinę i poddaje się następnie kolonie screeningowi, używając sposobu postępowania Grunsteina-Hognessa z zastosowaniem sondy znakowanej ^P hybrydyzującej z fragmentem o 140

154 180 parach zasad. Z pozytywnie hybrydyzujących kolonii otrzymuje się DNA w celu sprawdzenia, czy zrekonstruowane miejsce PvuII jest 5' czy 3' we włączonym DNA o 140 parach zasad, specyficznym dla drugiego i trzeciego z późnych liderów adenowirusa. Prawidłową orientację dla miejsca PvuII jest strona 5' insertu o 140 parach zasad. Plazmid ten jest na fig. 5A oznaczony jako pTPL,,

Fragment D AvaII z SV40 zawierający sekwencję wzmacniacza SV40 otrzymuje się za pomocą strawienia DNA SV40 przy użyciu AvaII, przeprowadzenia końców w tępe przy użyciu fragmentu Klenowa polimerazy I, ligowania do fragmentu łączników Xhol, strawienia Xhol w celu otworzenia miejsca Xhol i wyodrębnienia czwartego największego /D/ fragmentu na drodze elektroforezy w żelu. Fragment ten liguje się następnie do pTPL przeciętnego Xhol, w wyniku czego otrzymuje się plazmid pCVSVL2-TPL. Orientacja fragmentu D SV40 w pCVSVL2-TPL jest taka, że późny promotor SV40 ma tę samą orientację, co główny promotor późny adenowirusa.

W celu wprowadzenia wirusowych genów towarzyszących (VA) do pCVSVL2-TPL, najpierw konstruuje się plazmid pBR322, który zawiera fragment B Hindlll adenowirusa typu 2. DNA adenowirusa typu 2 trawi się Hindlll i wyodrębnia fragment B za pomocą elektroforezy w żelu. Fragment ten wprowadza się do pBR322 strawionego uprzednio Hindlll. Po transformacji E. coli do oporności na ampicylinę, rekombinanty poddaje się screeningowi pod względem insercji fragmentu C Hin^^Il i jego orientację określa się za pomocą trawienia enzymem restrykcyjnym. pBR322 - Ad Hindlll B zawiera fragment B Hindlll adenowirusa typu 2 w orientacji przedstawionej na fig. 5B.

Jak to objaśnia fig. 5B, geny VA dogodnie otrzymuje się z plazmidu pBR322 - Ad Hindlll B za pomocą trawienia Hpal, dodania łączników EcoRI i trawienia EcoRI, a następnie odzyskania fragmentu p 1,4 kilozasady. Fragment mający lepkie końce EcoRI liguje się następnie do miejsca EcoRI w PTL uprzednio strawionego EcoRI. Po transformacji E. coli HB101 i selekcji pod względem oporności na ampicylinę kolonie poddaje się screeningowi na drodze hybrydyzacji na filtrze z DNA specyficznym dla genów VA. Z pozytywnie hybrydyzujących klonów otrzymuje się DNA i charakteryzuje za pomocą trawienia endonukleazę restrykcyjną. Powstały plazmid oznaczony jest jako p91023.

Jak to objaśnia fig. 5C, dwa miejsca EcoRI w p91023 zostały usunięte za pomocą przecięcia (całkowicie), przy użyciu EcoRI, z uwtorzeniem dwóch fragmentów DNA, jednego o około 7 kilozasadach, a drugiego o około 1,3 kilozasady. Ten ostatni fragment zawiera geny VA. Końce obu fragmentów uzupełnia się za pomocą fragmentu Klenowa polimerazy I i następnie łączy się te dwa fragmenty. Plazmid p91023/A/, zawierający geny VA i podobny do p91023, ale z usuniętymi dwoma miejscami EcoRI identyfikuje się za pomocą screeningu metodą Grunsteina-Hogessa z fragmentem VA i za pomocą konwencjonalnej analizy miejsc restrykcyjnych.

Pojedyncze miejsce Pstl w p91023/A/ usuwa się i zastępuje miejscem EcoRI. p91023ZA/ przecina się (całkowicie) Pstl i poddaje działaniu fragmentu Klenowa polimerazy I w celu wytworzenia zrównanych końców. Łączniki EcoRI liguje się do miejsca Pstl przeprowadzonego w tępe w p91023/A/. Liniowy p91023/A/, z łącznikami EcoRI przyłączonymi przy miejscu Pstl przeprowadzonym w tępe, oddziela się od nie przyłączonych łączników i trawi całkowicie EcoRI, oraz ponownie liguje. Plazmid, p91023/B/jak przedstawiony na fig. 5C, odzyskuje się i identyfikuje jako wykazujący strukturę podobną do p91023/A/, ale z miejscem EcoRI zamiast poprzedniego miejsca Pstl. Plazmid p91023/B/ został zdeponowany i jest dostępny w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, pod numerem rejestracyjnym ATCC 39754.

Przykład VI. Klony cDNA (A-EPOFL6 i λ-EPOFL1/, przykład III) wprowadza się do plazmidu p91023/B/ z utworzeniem, odpowiednio, pPTFLó i pPTFL13. 8//g każdego z oczyszczonych DNA używa się następnie do transfekcji 5 · 10⁶ komórek COS z zastosowaniem metody DŁAŁ-dekstran (poniżej). Po upływie 12 godzin komórki przemywa się i poddaje działaniu 0,1 mM Chloroąuin w ciągu 2 godzin, po czym znów przemywa i przenosi na okres 24 godzin do 10 ml porcji podłoża zawierającego płodową surowicę cielecą w stężeniu 10%. Podłoża zmienia się na 4 ml porcje bez surowicy i zbiera po upływie 48 godzin.

154 180

Poziom wytwarzanej immunologicznie aktywnej EPO oznacza się ilościowo w teście radioimmunologicznym, jak to opisali Sherwood i Goldwasser/55/. Przeciwciało otrzymano od dr Judith Sherwood, Jodowany wskaźnik izotopowy otrzymuje się z homogenicznej EPO opisanej w przykładzie I. Czułość testu wynosi w przybliżeniu 1 ng/ml. Wyniki są przedstawione w tabeli 1.

Tabela 1

Poziom EPO

Wektor uwalnianej do podłoży _ (ng/ml)_ pPTFL13 330 pPTFLó 31

PTFL13 został zdeponowany i jest dostępny w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, pod numerem rejestracyjnym ATCC 399.

^P rz^ykła^d VII. cDNA ^EPO (^J-H^EPOFL13) w^prowadza s^ię do wektora ^p91023/B/^, stosując do transfekcji komórek COS-1, i zbiera w sposób opisany w powyższej części niniejszego opisu (przykład VI), z tą różnicą, że pomija się działanie Chloroquin.

In vitro biologicznie aktywną EPO oznacza się z zastosowaniem albo testu tworzenia kolonii z komórkami wątroby płodu mysiego jako źródłem CFU-E, albo testu pobierania 3H-tymidyny, zastosowaniem komórek śledziony myszy, której wstrzyknięto fenylohydrazynę. Czułość tych testów wynosi w przybliżeniu 25mjedn/ml. In vivo biologicznie aktywną EPO oznacza się z zastosowaniem albo testu: niedotleniona mysz, albo testu: głodzony szczur. Czułość tych testów wynosi w przybliżeniu lOOmjedn/ml. Nie wykrywa się aktywności w obydwu tych testach przy zastosowaniu podłoża z warunków naśladujących właściwą hodowlę. Wyniki oznaczania EPO wytworzonej w rezultacie ekspresji klonu EPOFL13 są przedstawione w poniższej tabeli 2, w której aktywność podana jest w jedn/ml, przy użyciu, jako standardu, handlowej, ilościowo oznaczonej EPO (Toyobo, Inc.).

Tabela 2

EPO wydzielana przez komórki COS transfekowane cDNA EPO typu I

Test Aktywność

RIA 100 ng/ml

CFU-E 2s00,5 jedn/ml ³H-Thy 3,K0,8 eedn/ml

Niedotleniona mysz 1 y^c^nAnl

Głodzony szczur 2 jedn/ml

Przy kład VIII. Analiza EPO z komórek COS metodą elektroforezy w żelu SDSpoliakryloamidowym. 180ng EPO wydzielonej do podłoża przez komórki COS transfekowane cDNA EPO (^-HEPOFL13) w wektorze 91023/B/ (powyżej) poddaje się elektroforezie w 10% żelu SDS-poliakryloamidowym (Laemlli) i przenosi z zastosowaniem prądu elektrycznego na bibułę nitrocelulozową [Towbin i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4350 /1979/]. Filtr sonduje się przy użyciu przeciwciała przeciw EPO, jak opisano w tabeli 1, przemywa i ponownie sonduje białkiem A gronkowców znakowanym ¹²,J. Filtr poddaje się autoradiografii w ciągu 2 dni. Natywną homogeniczną EPO, taką jak opisana w powyższym przykładzie I, poddaje się, albo przed jodowaniem (ścieżka B), albo po jodowaniu (ścieżka C), elektroforezie (patrz fig. 6). Do zastosowanych markerów należą: ^S-metionina (znakowana), albumina surowicza (68000 daltonów) i owoalbumina (45000 daltonów).

Przykład IX. Konstrukcja RK-1. Wyodrębnia się fragment BamHI-PvuIi z plazmidu PSV2DHFR [Subramani i wsp., Mol. Celi. BioL, 1, 854-864 /1981/J zawierającego region wczesnego promotora S\^z40 sąsiadujący z genem mysiej reduktazy dihydrofolianowej (DHFR), wzmacniacz SV40, intron małego antygenu t i sekwencję poliadenylacji SV40 (fragment A). Pozostałe fragmenty otrzymuje się z wektora p91023/A/ (powyżej) jak następuje. p91023/A/ trawi się Pstl w pojedynczym miejscu Pstl blisko promotora adenowirusowego w celu przeprowadzenia plazmidu

154 180 w postać liniową i albo liguje się z syntetycznymi konwertorami Pstl do EcoRI, a następnie przeprowadza w postać kolistą [z tworzeniem miejsca Pstl-EcoRI-Pstl w pierwotnym miejscu Pstl, 91023/B'/], albo poddaje działaniu dużego fragmentu polimerazy DNA I w celu zniszczenia miejsc Pstl, a następnie liguje się z syntetycznym łącznikiem EcoRI i przeprowadza ponownie w postać kolistą [z tworzeniem miejsca EcoRI w pierwotnym miejscu Pstl, 91023/B/]. Każdy z tych dwóch otrzymanych plazmidów, 91023/B/ oraz 91023/B'/, trawi się Xba i EcoRI w celu wytworzenia dwóch fragmentów (F i G). Za pomocą połączenia fragmentu F z p91023/B/ z fragmentem G z p91023/B'/, oraz fragmentu G z p91023/B/ z fragmentem F z p91023/B'/ tworzy się dwa nowe plazmidy, które zawierają albo miejsce EcoRI-Pstl albo miejsce Pstl-EcoRI w pierwotnym miejscu

Pstl. Plazmid zawierający miejsce Pstl-EcoRI, w którym miejsce Pstl jest najbliżej głównego promotora późnego adenowirusa, został nazwany p91023/C/.

Wektor p91023/C/ trawi się Xhol (całkowicie) i powstający liniowy DNA z lepkimi końcami przeprowadza się w DNA z tępymi końcami za pomocą wypełnienia w reakcji z dużym fragmentem polimerazy DNA I E. coli. Z tym fragmentem DNA liguje się fragment HindUI-EcoRI o 340 parach zasad, zawierający wzmacniacz SV40 otrzymany w sposób następujący.

Fragment HindIII-PvuII z SV40 zawierający początek replikacji SV40 i wzmacniacz wprowadza się do plazmidu c lac[Little i wsp., Mol. Biol. Med., 1,4/3-488 /1983/]. Wektor c lac otrzymuje się za pomocą trawienia DNA c lac przy użyciu BamHI, wypełnienia lepkich końców z zastosowaniem dużego fragmentu polimerazy DNA I i trawienia DNA za pomocą Hindlll. W powstającym plazmidzie (c SVHPlac) regeneruje się miejsce BamHI za pomocą ligowania z tępym końcem PvuII. Fragment EcoRI-Hindlll otrzymuje się z c SVHPlac i liguje z fragmentem EcoRI-Hindlll PSVOd (Mellon i wsp., powyżej), który zawiera plazmidowy początek replikacji, po czym selekcjonuje się powstający plazmid pSVHPOd. Następnie otrzymuje się fragment EcoRI-Hindlll o 340 parach zasad z PSVHPOd, zawierający początek replikacji/wzmacniacz SV40, obydwa końce przeprowadza się w tępe za pomocą dużego fragmentu polimerazy DNA I i liguje z wektorem p91023/c/ powyżej opisanym, strawionym Xhol i z końcami przeprowadzonymi w tępe. Powstający plazmid (p91023/C/ /Xho/ tępe plus EcoRI/Hindlll/ tępe początek SV40 plus wzmacniacz), w którym orientacja fragmentu Hindlll-EcoRI jest taka, że miejsce BamHI w tym fragmencie jest najbliższe genu VA, został nazwany pES105. Plazmid pESI trawi się BamHI i PVuII, a również samą PvuII i wyodrębnia się fragment BamHI-PvuII zawierający główny promotor późny adenowirusa (fragment B) i fragment PvuII zawierający plazmid, w którym zanjduje się gen oporności (oporności na tetracyklinę) oraz inne sekwencje (fragment C). Fragmenty A, B i C liguje się i utworzony plazmid, pokazany na fig. 10, wyodrębnia się. Nazwany jest on RK1-4. Plazmid RK1-4 został zdeponowany w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, gdzie jest dostępny pod numerem rejestracyjnym ATCC 39940. ,

Przykład X. Ekspresja EPO w komórkach CHO - Metoda I. 20pg DNA z plazmidu pPTFL13 opisanego powyżej (przykład VI) trawi się endonukleazą restrykcyjną Ciał w celu przeprowadzenia go w postać liniową i liguje z 2/tg DNA trawionego Ciał z lazmidu pAdD26SVp/A/ 1, który zawiera nienaruszony gen reduktazy dihydrOfolianowej (DHFR) poprzedzany przez główny promotor późny adenowirusa [Kaufman i Sharp, Mol. and Celi Biol., 2, 1304-1319 /1982/]. Tego ligowanego DNA używa się do transfekcji komórek CHO DHFRujemnych [DUKX-BII. L. A. Chasin i G. Urlaub, PNAS, //, 4216-4220 /1980/]. Po 2-dniowym wzroście selekcjonuje się komórki, do których został włączony chociaż jeden gen DHFR, w podłożach alfa bez nukleozydów, uzupełnionych dializowaną płodową surowicą bydlęcą w stężeniu 10%. Po wzroście w ciągu 2 tygodni w wybiórczych podłożach, kolonie pobiera się z oryginalnych płytek, łączy się w grupy po 10-100 kolonii na pulę, ponownie przenosi na płytki i hoduje do zlewania się na podłożach alfa bez nukleozydów. Supernatanty podłoży z pul hodowanych przed selekcją z użyciem metotreksatu, bada się pod względem EPO przy wykorzystaniu RIA. Pule, które okazują się dodatnie pod względem wytwarzania EPO hoduje się w obecności 0,02μΜ metotreksatu, subklonuje i ponownie bada. EPO Cla 4 a· 4.02-7, pojedynczy subklon z puli EPO Cla 4 cr4.02 wydziela 460ng/ml EPO do podłoży zawierających 0,02 μΜ ΜΤΧ (tabela 3). EPO Cla 4 a 4.02-7 jest linią komórkową z wyboru do wytwarzania EPO i została zdeponowana w American Type Culture Collection (numer rejestracyjny ATCC CRL8695). Obecnie klon ten poddaje się

154 180 stopniowej selekcji we wzrastających stężeniach ΜΤΧ i prawdopodobnie otrzyma się komórki, które będą wytwarzać EPO nawet na wyższym poziomie. Odnośnie pul, które były negatywne w RIA, kolonie oporne na metotreksat otrzymane z hodowli duplikatowych, prowadzonych w obecności 0,02μΜ metotreksatu, ponownie bada się w pulach pod względem EPO za pomocą RIA. Te hodowle, które nie są pozytywne, ponownie subklonuje się i dalej hoduje w ciągle wzrastających stężeniach metotreksatu.

Stopniowej selekcji z użyciem metotreksatu dokonuje się przez powtarzane cykle hodowania komórek w obecności wzrastających stężeń metotreksatu z selekcją komórek przeżywających. Przy każdym nawrocie EPO oznacza się w supernatancie hodowli za pomocą RIA i testów aktywności biologicznej in vitro. Poziomy metotreksatu stosowane w każdym stopniowym wzmocnieniu wynoszą 0,02μΜ, 0,1 μΜ i 0,5μΜ. Jak pokazano w poniższej tabeli 3 po 1 nawrocie selekcji w 0,02μΜ metotreksacie, do podłoży hodowlanych zostają uwolnione znaczne ilości EPO.

Tabela 3

Poziom EPO wydzielanej do podłoży

Uzysk w podłożu alfa

Próbka	Test	Uzysk w podłożu alfa	z 0,02μΜ metotreksatem
Pula 4a4	RIA	17 ng/ml	50 ng/ml
Pojedyncza
kolonia 4a4
Klon (0,02-7)	Ria	—	460 ng/ml

Przykład XI. Ekspresja EPO w komórkach CHO - Metoda II. DNA z klonu .3-HEPOFL13 trawi się EcoRI i subklonuje się mały fragment RI zawierający gen EPO do miejsca EcoRI w plazmidzie RK-1 (patrz przykład X). Następnie DNA (RKFL13) używa się bezpośrednio (bez trawienia) do transfekcji komórek CHO DHFR-negatywnych, a selekcję i amplifikację prowadzi się jak w powyższym przykładzie X.

DNA RKFL13 wprowadza się do komórek CHO za pomocą fuzji protoplastów i mikroiniekcji. Plazmid RKFL13 został zdeponowany i jest dostępny w American Type Culture Collection, Rockville, maryland, pod numerem rejestracyjnym ATCC 39989.

Tabela 4

Poziom EPO wydzielanej do podłoży

Uzysk w podłożu alfa

Próbka	Test	Uzysk w podłożu alfa	z 0,02μΜ metotreksatem
Pula kolonii A	RIA	3 ng/ml	42 ng/ml (pula) 150 ng/ml (klon)
	3H-Thy	—	l,5jedn/ml
klon pojedynczej kolonii	RIA	—	90 ng/ml
(0.02C-Z)	3H-Thy	—	5,9jedn/ml
Pula po mikroiniekcji	RIA	60 ng/ml	160 ng/ml
(DEPO-1)	3H-Thy	l,8jedn/ml	—

Korzystny klon pojedynczej kolonii został zdeponowany i jest dostępny w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, pod numerem rejestracyjnym ATCC CRL 8695.

Przykład XII. Ekspresja genomowego klonu EPO w komórkach COS-1. Wektorem używanym do ekspresji genomowego klonu EPO jest pSVOd (Mellon i wsp., powyżej). DNA z pSVOd trawi się całkowicie Hindlll i końce przeprowadza w tępe za pomocą dużego fragmentu polimerazy DNA I. Genomowy klon EPO Λ-ΗΕΡΟ3 trawi się całkowicie EcoRI i Hindlll, wyodrębnia się fragment o 4,0 kilozasady zawierający gen EPO i jego końce przeprowadza w tępe sposobem opisanym w powyższej części niniejszego opisu. Sekwencję nukleotydów tego fragmentu od miejsca Hindlll do regionu będącego już za sygnałem poliadenylacji pokazano na fig. 4. Fragment genu EPO wprowadza się fragmentu plazmidu pSVod i prawidłowo skonstruowane rekombinanty w obydwu arientacjach wyodrębnia się i weryfikuje. Plazmid CZ2-1 ma gen EPO w orientacji „a“ (to jest koniec 5' EPO jest najbliższy początkowi replikacji SV40), a plazmid CZ1-3 jest w odwrotnej orientacji (orientacja ,,b“).

154 180

Plazmidami CZ1-3 i CZ1-2 transfekuje się komórki COS-1 jak opisano w przykładzie VII. Podłoża zbiera się i bada pod względem immunologicznie reaktywnej EPO. Około 31 ng/ml EPO wykrywa się w supernatancie hodowli CZ2-1 i 16-31 ng/ml w supernatancie hodowli CZ1-3.

Genomowe klony HEPO1, HEPO2 i HEPO6 można wprowadzić do komórek COS w celu ekspresji w podobny sposób.

Przykład XIII. Ekspresja w komórkach C127 i CHO. Konstrukcja pBPVEPO. Plazmid zawierający sekwencję cDNA EPO pod transkrypcyjną kontrolą promotora mysiej metalotioneiny związany z całkowitym DNA bydlęcego papillomawirusa otrzymuje się w następujący sposób.

pEPO49f. Plazmid SP6/5 otrzymuje się z Promega Biotec. Plazmid ten trawi się całkowicie EcoRI i fragment EcoRI o 134C parach zasad z A-HEPOFL13 wprowadza się za pomocą ligazy DNA. Powstający plazmid, w którym koniec 5' genu EPO znajduje się najbliżej do promotora SP6 (jak stwierdzono za pomocą trawienia Bgll i Hindlll) został nazwany pEPO49f. W tej orientacji, miejsce BamHI w poliłączniku PSP6/5 bezpośrednio przylega do końca 5' genu EPO.

ρΜΜΤηβοΔΒΡν. Plazmid pdBPV-MMTneo(342-12) [Law i wsp., Mol. and Celi Biol., 3, 211C-2115 /1983/], przedstawiony na fig. 11 trawi się całkowicie BamHI w celu wytworzenia dwóch fragmentów: dużego fragmentu o długości ~8 kilozasad zawierającego genom BPV i mniejszego fragmentu o długości ~6,5 kilozasady, zawierającego początek replikacji pML2 i gen oporności na ampicylinę, promotor metalotioneiny, gen oporności na neomycynę i sygnał poliadenylacji SV4C. Strawiony DNA przeprowadza się w postać kolistą za pomocą ligazy DNA i plazmidy, które zawierają tylko fragment o 6,8 kilozasady identyfikuje się za pomocą trawienia endonukleazami restrykcyjnymi EcoRI i BamHI. Jeden z tych plazmidów nazwano pMMTneo Δ PBV.

pEPO15a. pMMTnoe Δ BPV trawi się całkowicie Bglll. pEPO49f trawi się całkowicie za pomocą BamHI i Bglll i wyodrębnia na drodze elektroforezy w żelu fragment o około 7CC parach zasad, zawierający nienaruszony region kodujący EPO.

pMMTneo Δ BPV strawiony Bglll i fragment BamHI/bglll EPO łączy się i powstające plazmidy zawierające cDNA EPO identyfikuje się za pomocą hybrydyzacji kolonii z sondą oligonukleotydową d(GGTCATCTGTCCCCTCTCC), która jest specyficzna dla genu EPO. Z plazmidów, które są pozytywne w analizie hybrydyzacji, jeden (pEPO15a) zawierający cDNA EPO w takiej orientacji, że koniec 5' cDNA EPO znajduje się najbliżej promotora metalotioneiny, identyfikuje się za pomocą trawienia przy użyciu EcoRI i KpnI.

pBPV-EPO. Plazmid pEPO15a trawi się całkowicie BamHI w celu przeprowadzenie go w postać liniową. Plazmid pdBPV-MMTneo(342-12) również trawi się całkowicie BamHI z utworzeniem dwóch fragmentów, o około 6,5 i 8 kilozasadach. Fragment o około 8 kilozasadach zawierający nienaruszony genom bydlęcego papillomawirusa, wyodrębnia się za pomocą elektroforezy w żelu. pEPO15a/BamHI i fragment BamHI o około 8 kilozasadach liguje się i identyfikuje się plazmid (pBPV-EPO), zawierający fragment PBV za pomocą hybrydyzacji kolonii z zastosowaniem sondy oligonukleotydowej d(P-CCACACCCGGTACACA-OH), która jest specyficzna dla genomu BPV. Trawienie DNA pBPV-EPO przy użyciu Hindlll wskazuje, że kierunek transkrypcji w genomie BPV jest taki sam, jak kierunek transkrypcji promotora metalotioneiny (jak w pdBPVMMTneo/342-12), patrz fig. 11. Plazmid pdBPV-MMTneo/342-12) jest dostępny w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, pod numerem rejestracyjnym ATCC 37224.

Ekspresja. Do ekspresji EPO użyto następujących metod.

Metoda I. Otrzymuje się DNA pBPV-EPO i około 25pg używa się do transfekcji ~1 · 1C⁶ komórek Cl 27 [Łowy i wsp., J. of Virol., 26, 291-298 /1978/] lub CHO, stosując standardową metodę wytrącania fosforanem wapnia [Grahm i wsp., Virology, 52,456-467/1973/]. Po upływie 5 godzin od transfekcji usuwa się podłoża transfekcyjne, komórki poddaje się wstrząsowi glicerynowemu, przemywa i dodaje świeże podłoże alfa zawierające płodową surowicę bydlęcą w stężeniu 10%. Po upływie 48 godzin komórki trypsynizuje się i rodziela w stosunku 1:1C w podłożu DME zawierającym 500μιτι/ιηΙ G418 [Southern i wsp., Mol. Appl. Genet., 1, 327-341 /1982/]. Komórki inkubuje się w ciągu 2-3 tygodni. Następnie kolonie oporne na G418 izoluje się indywidualnie w dołkach do mikromiareczkowania i hoduje prawie do zlewania się w obecności G418. Następnie komórki przemywa się, dodaje świeżych podłoży zawierających płodową surowicę bydlęcą w stężeniu 10% i zbiera porcje podłoża po upływie 24 godzin. Bada się kondycjonowane podłoża i

154 180 15 wykazuje, że są pozytywne pod względem EPO za pomocą testu radioimmunologicznego i testu biologicznego in vitro.

Metoda II. Komórki Cl27 lub CHO kotransfekuje się przy użyciu 25 pg pBPV-EPO i 2pg pSV2neo (Southern i wsp., powyżej) jak opisano w powyższej Metodzie I. Jest to w przybliżeniu 10-krotny nadmiar molowy pBPV-EPO. Po transfekcji, sposób postępowania jest taki sam, jak opisano w powyższej Metodzie I.

Metoda III. Komórki C127 transfekuje się przy użyciu 30pg pBPV-EPO sposobem opisanym w powyższej Metodzie I. Po transfekcji i rozdzieleniu (1:10) podłoża wymienia się na świeże każdorazowo co 3 dni. Po upływie mniej więcej 2 tygodni uwidaczniają się ogniska komórek transformowanych BPV. Poszczególne ogniska pobiera się oddzielnie do 1 cm dołków w płytce do mikromiareczkowania, prowadzi hodowlę prawie do zlewania się pojedynczej warstwy i bada się kondyncjonowane podłoża pod względem aktywności EPO lub antygenowości.

Przykład XIV. Ekspresja w komórkach owadzich. Konstrukcja pIVEV EPOFL13. Plazmidowy wektor pIVEV został zdeponowany i jest dostępny w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, pod numerem rejestracyjnym ATCC 39991. Wektor ten modyfikuje się w sposób następujący.

pIVEVNI. pIVEV trawi się EcoRI w celu przeprowadzenia plazmidu w postać liniową, przeprowadza końce w tępe przy użyciu dużego fragmentu polimerazy DNA I pojedynczy łącznik Notl

GGCGGCCGCC

CCGCCGGCGG wprowadza się na drodze ligowania tępych końców. Powstający plazmid został nazwany pIVEVNI.

pIVEVSI. pIVEV trawi się Smal w celu przeprowadzenia plazmidu w postać liniową i pojedynczy łącznik Sfil

GGGCCCCAGGGGCCC

CCCGGGGTCCCCGGG wprowadza się za pomocą ligowania tępych końców. Powstający plazmid został nazwany pIVEVSI.

pIVEVSIBgKp. Plazmid pIVEVSI trawi się KpnI w celu przeprowadzenia plazmidu w postać liniową i z każdego końca usuwa się w przybliżeniu 0 do 100 par zasad za pomocą trawienia przy użyciu egzonukleazy Bal31 dostosowanej do substratu dwuniciowego. Wszelkie powstające końce, które nie są zupełnie tępe, przeprowadza się w tępe stosowaniem dużego fragmentu polimerazy DNA 1 następnie wprowadza się poliłącznik

X.ol Xbal

Bglll BcoRt dal KpnI

I ί ' !

I ! I ! ' I I I !

AGATOTGGAGAATTOTAGATCOATGGTACC

TCTAGAGCTCTTAA&ATCTAGCTACCATCG przez ligowanie tępych końców. Poliłącznik zostaje włączony w obydwu orientacjach. Olazmid, w którym poliłącznik zorientowany jest w ten sposób, że miejsce Bglll w poliłączniku jest najbliżej promotora genu wielościanu, nazwany jest pIVEVSIBgKp. Plazmid, w którym miejsce KpnI w poliłączniku jest najbliżej promotora genu wielościanu jest nazwany pIVEVSIKpBg. Ilość par zasad, które zostały usunięte między orginalnym miejscem KpnI w pIVEVSI a promotorem wielościanu nie została określona. pIEIVSIBgKp został zdeponowany i jest dostępny w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, pod numerem rejestracyjnym ATCC 39988.

pIVEVSIBgKpN. piVEVNI trawi się całkowicie KpnI i Pstl z wytworzeniem dwóch fragmentów. Większy fragment, który zawiera plazmidowy początek replikacji i koniec 3' genu wielościanu,

154 180 otrzymuje się za pomocą wyodrębnienia z żelu (fragment A). pIVEVSIBgKp trawi się całkowicie za pomocą Pstl i Kpn z utworzeniem dwóch fragmentów oraz fragmentu mniejszego, zawierającego promotor genu wielościanu i poliłączniki i który otrzymuje się za pomocą wyodrębnienia z żelu (fragment B). Fragmenty A i B łączy się następnie przy użyciu ligazy DNA z utworzeniem nowego plazmidu pIVEVSIBgKpNl, który zawiera gen wielościanu z częściową delecją i do którego włączono poliłącznik, przy czym zawiera on również miejsce Notl (zastępujące zniszczone miejsce EcoRI) oraz miejsce Sgil flankujące regionu genu wielościanu.

pIVEPO. pIVEVSIBgKpNI trawi się całkowicie EcoRI w celu przeprowadzenia plazmidu w postać liniową i wprowadza się do niego fragment EcoRI o 1340 parach zasad z /-HEPOFL13. Plazmidy zawierające gen EPO w takiej orientacji, że koniec 5' genu EPO znajduje się najbliżej promotora wielościanu i końca 3' genu wielościanu, identyfikuje się za pomocą trawienia BglH. Jeden z tych plazmidów, o orientacji powyżej opisanej został oznaczony pIVEPO.

Ekspresja EPO w komórkach owadzich. Duże ilości plazmidu pIVEPO wytwarza się za pomocą transformowania E. coli szczep JMlOl-tgl. Plazmidowy DNA wyodrębnia się metodą klarownych lizatów (Maniatis and Fritsch, Cold Spring Harbor Manuał) i dalej oczyszcza za pomocą wirowania w CsCl. DNA wielościennego wirusa Autographa californica (AcNPV) szczep L-l otrzymuje się za pomocą ekstrakcji fenolem cząstek wirusa z następującym po tym oczyszczeniem wirusowego DNA przy użyciu CsCl.

Tymi dwoma DNA kotransfekuje się komórki Spodoptera frugiperda IPLB-SF-21 [Vaughn i wsp., In Vitro, tom B, str. 213-217 /1977/] stosując metodę transfekcji z użyciem fosforanu wapnia (Potter i Miller, 1977). Na każdą płytkę z komórkami, które mają być transfekowane, używa się 1 j-fg DNA AcNPV typu dzikiego i H)//g pIVEPO. Płytki inkubuje się w temperaturze 27°C w ciągu 5 dni. Następnie zbiera się supernatanty i potwierdza ekspresję EPO na drodze badania jej obecności w supernatantach za pomocą testu radioimmunologicznego oraz z wykorzystaniem badania biologicznego in vitro.

Przykład XV. Oczyszczanie EPO. Podłoża kondycjonowane z zastosowaniem komórek COS (121), z EPO w stężeniu do 200pg/litr, zatęża się do objętości 600 ml, stosując membrany do ultrafiltracji z przerwaniem przy masie cząsteczkowej 10000, takie jak Millipore Pellican wyposażone w membrany o powierzchni 46,45 dcm². Badania przeprowadza się z zastosowaniem RIA, jak to opisano w powyższym przykładzie VI. Płyn retencyjny po ultrafiltracji diafiltruje się wobec 4 ml 10 mM fosforanu sodu buforowanego przy wartości pH 7,0. Zatężone i diafiltrowane podłoża kondycjonowane zawierają 2,5 mg EPO w 380 mg białka całkowitego. Roztwór EPO zatęża się dalej do 186 ml i wytrącone białka usuwa się za pomocą wirowania przy 110000 Xg w ciągu 30 minut.

Supernatant, który zawiera 2,0 mg EPO, doprowadza się do pH 5 przy użyciu 50% kwasu octowego, miesza w ciągu 30 minut w temperaturze 4°C i usuwa osad za pomocą wirowania przy 13000 X g w ciągu 30 minut.

Chromatografia na Carbonylmethyl Sepharose. 20 ml supernatantu po wirowaniu, zawierającego 2000/zg EPO (24 mg białka całkowitego) nanosi się na kolumnę z 20 ml CM-Sepharose, zrównoważoną 10 mM octanem sodu, przemytą 40 ml tego samego buforu. EPO, która związała się z CM-Sepharose, elluje się 100 ml gradientu NaU(Ol) w 10 mM fosforanie sodu o pH 5,5. Frakcje zawierające EPO (w całości 50//g w 2 mg białka całkowitego) łączy się i zatęża do 2 ml stosując membranę Amicon YM10 do ultrafiltracji.

HPLC z odwróconymi fazami. Zatężone frakcje z CM-Sepharose zawierające EPO poddaje się dalszemu oczyszczaniu za pomocą HPLC z odwróconymi fazami, stosując kolumnę Vydac C-4. EPO nanosi się na kolumnę zrównoważoną 10 ml rozpuszczalnika B (rozpuszczalnikiem A jest 0,1% wodny roztwór CF3COOH, rozpuszczalnikiem B jest 0,1% roztwór CF3COOH w CF3CN) przy szybkości przepływu 1 ml/min. Kolumnę przemywa się 10% B w ciągu 10 minut i eluuje, liniowym gradientem B, EPO (10- w ciągu 60 minut). Frakcje zawierające EPO łączy się (~40_mg EPO w 120/yg białka całkowitego) i liofilizuje. Liofilizowaną EPO rekonstytuuje się w 0,1 M Tris-HCl o pH 7,5 zawierającym 0,15 M NaCl i poddaje powtórnej chromatografii HPLC z odwróconymi fazami. Frakcje zawierające EPO łączy się i analizuje za pomocą elektroforezy w 10% żelu SDS-poliakryloamidowym (U. K. Lameli, Naturę). Połączone frakcje EPO zawierają 15,5//g EPO w 25pg całkowitego białka.

	cccggagcc	ggrccggggc	caccgcgcci	c gccccgctccg	acacegcgec
ccctggacag . ccgccccctc ctcceggccc gtggggctgg	ccccgcaccg	ccgagcttcc cgggecgaggg	cccccggtgc
			-27
			MET CLY	YAL HIS CŁU	CYS PRO
ggtcacccgg cgcgececag gtcgccgagg gaccceggcc	•ggcgcggag	ATC CCC	CTC CAC CAA A	TC CCT
AU TRP	LEU TRP LEU LEU LEU SER LEUs LEU	SER LEU PRO	LEU CLY	LEU PRO VAL	LEU CLY
CCC TCC	CTC TCC CTT CTC CTC TCC CTC CTC	TCC CTC CCT	CTC CCC	CTC CCA cifc	CTC CCC
1	SH 10				20
r Ala Pro	Pro Ara Leu Ile Cya Aso Ser Arg	Yal Leu Clu	Arg Tvr	Leu Leu Clu	Ale Lya
CCC CCA	CCA CCC CTC ATC TCT CAC ACC CCA	CTC CTC CAC	ACC TAC	CTC TTC CAC	CCC AAC
	* SU 30	SH		*	40
Clu Ala	_Cl.e _A?ił. J1e _Thr. .<·!*_ cy« ai«	Clu Sie Cya	Ser Leu	Asn Clu Aan	U· Th
CAC CCC	CAC AAT ATC ACC^AGC CCC ' TCT CCT	CAA CAC TCC	ACC TTC	AAT CAC AAT	ATC ACT
	50				«0
Yal Prr	Asp Thr Lya Yal Asn Phe Tyr Ala	Trr Lye-. Arg	Met Clu	Yal Cly Cln	Cln Ale
. CTC CCA	CAC ACC AAA CTT AAT TTC TAT CCC	TCC AAC ACC	ATC GAC	CTC CCC CAC	CAC CCC
	10				00
Vel Clu	Yal Trp Cln Cly Leu Ala Leu Leu	Ser Clu Ala	Val Leu	Arg Clv Cln	ńii_Leu.
CTA CAA	CTC TCC CAC .CCC CTC CCC CTC CTC	TCC CAA CCT	CTC CTC	CCC CCC CAC	ccc ao
	* 90				100
Łeu Val	MW. Mgr_-S«Ł—Pln_Pr-r Trr Clu Prr	Leu Gin Łeu	-MLa.Ynl	Asa Łya Ala	Yal Sar
TTC CTC	AAC TCT TCC CAC CCC TCC CAC CCC	CTC CAC CTC	CAT CTC	CAT AAA CCC	CTC AGT
	110				120
Cly Leu	Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg	Ale Leu Cly	Ale Cln	Lye Clu Ale	Ile Ser
CCC CTT	CCC ACC CTC ACC ACT CTC CTT CCC	CCT CTC CCA	CCC CAC	AAC CAA CCC	ATC TGC
	FUG.	38	A

Prr Prr Asp	Ala Ala Ser	Ala Ala Prr	130 Leu Arg Thr	Ile Thr Ala	Asp Thr Phe CAC ACT TTC	140 —Arg. Lye CCC AAA
GGT CCA CAT	GGG CCC TGA	CCT CCT. CCA	CTC CCA 'AGA	ATC AGT CCT
Leu Phe Arg CTC TTC CCA	Yal Tyr Ser CTG TAC tcg	Asn Phe Lcu AAT TTC CTC	ISO _Arg Cly Lya CCC CCA AAC	Leu Lya Leu CTC AAC CTC	Tyr Thr Cly TAC AGA CCC	160 Clu Ala CAC CCC
SU Cys Arg Thr TGG ACC AGA	166 Cly Asp Arg CCC GAC AGA	• TCA ccaggtg	tgtccacccg	ggcatatcca	ccacccccct	ce^aaca^
gcttgtgcca	caccctcccc	cgcMctcce	gaaccccgtc	gag&ftgccct	^g^tcagcg	ccagcctccc
ccatggacac	tccagtgcca	gcaacgacit	ctcaggggcc	agaggaactg	tccagagagc	aactct^CaC
tctaaggatg	ccacagggcc	aacttgaggg	cccagagcag	ga^^^^tca	gagageaget	Ctaaactcac
ggacagagee	atgctgggaa	gacgcccgag	ctcactcggc	accctgcaaa	atttgatgee
ttggaggcga	tttacctgtc	cccgcaccta	ccatcaggga	cag^atgacc	tggag&Mct	iccicc^ic
ctgtgacttc	tccaggrctc	acgggcatgg	gcactcccct	C^CCc^CI	gcccccttga	caccg^^^g
gtgggaacca	tgaagacagg	atgggggccg	gcctccggct	ctcatccggt	ccj^ccccc	tgtattcttc
aaccccactg	acaagaactg	eoeccacca!	aaaaaaaaaaaa

FIG. 3B /cięg dalezy/

O oć a.

>- -4

4 o *4

u o t* m t*

« s<

3 O 4 ag *4

o b O φ Z (Λ

o *«·> 9 ca

o > v >* *< *4

ST w <·

co >· o

O UJ —i

<C

O

B 3

4 <

*4 >

£

te{ b <

□ 5

-J u>

— <x »

3 3

e 4 <

B »4 Ο

£ c

a 5

4 <

9 X CC

X 3

co Ξ

o az O-

3 9 •4

3 3

Χ 5

X 5

0 > u

3 3

Thr

b X

~Λ «c >

=3 UJ -4

9 Φ «4

c e> <

tu b <

Asp

en *4

Asp

b X H

>- -J O

>· —1 O

b >

9 35

9 3

3 9 *4

a >

£ o

4 <

3 5

Kh— CMUJ 1 3C

=3 UJ -J

£ <

b O co

4* 9 S

*4 >

a X

9 <

b X l··

M X u

O cc O.

9 3

4 X u

ba b <

4

9 9 U

X 3

£

3 O •4

ZO UJ -J

a 2

4 2

co > ►

9 3

c 5

3 £

b X M

4 u

oc Ul, co

*» >

3 3

Ci b h

b 4 CJ

. 3 4 ►

<1 <

M b <

* 3

o UJ —J

U w <

« S2

SO Ala

$

3 O 44 t- «4

O a» G

o b 3«

130 Leu

°i3 2 <

Z3 LU -4

b Φ ΪΛ

X u

X «η

b >

o w LL

3 O _1

3 S

3 3

O b A,

3 O ►4

oi LU CO

O W <

►{ °l

a Λ C.

4 <

0 b

3 55

4 3

O X CC

Z3 Ul —4

a > o

X ca

bl £3

c «0 <

3 O «4

O b 0.

b JZ H

9 <

c <0 <

Z3 UJ -J

U

X

C

b JZ

b 9

b Φ

§ £

φ

Ji h«

5

3

5

H

W

9Λ

w <C

lii

3

0

c

b V

9 0»

4

b X

Ol a

__J

9 ►4

Φ

X u

3

ca

U

<

CU QO ł—

te b <

1

►

u X H

a. b H

b V C3

b 9 O

4 <

*3 >

X 3

Z3

1

c1 Ca

O

t£

1C

UJ

o

3

a

*3

0

b

9

b

X

—J

b CC

. 5

4 <

>

<1 < a

<

<

H

o.

3

9

o

4

M

ce

o

a

2

4

9

b

X

b

ł—»

b 0.

<

b a·

3

>

U

X

0·

<

«C -J

3

9

*4

3 9

X *4

2

3 9

9 >

«X

w<

3

>

>

►4

o

o·

U

O

FIG. 3A /ciąg dalazy/

154 180

Sposób według wynalazku został opisany szczegółowo, przy czym objęto jego korzystne zastosowania. Jednakże, należy zdawać sobie sprawę z tego, że fachowcy mogą dokonać modyfikacji i ulepszeń przy rozważaniu tego opisu i przedstawionych rysunków, bez odejścia od istoty i zakresu wynalazku, przedstawionych w załączonych zastrzeżeniach patentowych.

Claims (3)

1. Zastrzeżenie patentowe

   Sposób wytwarzania klonu ludzkiego cDNA wykazującego ekspresję biologicznie aktywnej erytropoetyny, znamienny tym, że a) trawi się oczyszczone białko erytropoetyny trypsyną, b) tworzy się pulę sond oligenukleotydowych w oparciu o sekwencję aminokwasów fragmentów trypsynowych wytworzonych w stadium a), c) dokonuje się skriningu zbioru ludzkiego genomowego DNA za pomocą sond oligonukleotydowych ze stadium b), d) dokonuje się selekcji klonów hybrydyzujących z sondami i poddaje się te klony analizie w celu ustalenia, czy są one klonami erytropoetyny, e) identyfikuje się klon erytropoetyny ze stadium d), f) stosuje się klon ze stadium e) do skriningu zbioru cDNA otrzymanego z wątroby płodu ludzkiego, oraz g) dokonuje się selekcji kolnu erytropoetyny ze zbioru cDNA otrzymanego z wątroby płodu ze stadium f).

   gatcctacgcctgtggccagggccagagccttcagggacccttgactccccggfgitigtgtgcatttcag

   ACG Thr GGC Gly TGT Cys GCT Ala GAA Glu CAC His TGC Cys ACC Ser TTC Leu AAT Asn GAG Glu a AAT Asn ATC Ue ACT GTC CCA GAC ACC AAA GTT AAT TTC TAT GCC TGG AAG Thr Val Pro Asp Thr Lys _x Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys

   AGG ATG GAGgtgagttcctttttttttttttttcctttcttttggagaatctcatttgcgagcetg Arg MET ^Glu d attttggatgaaagggagaatgatc fig. i □S m

   o k_ o

   X»

   OJ g

   u S o QJg 3 £ i ί i

   154 180

   5'

   3' aaaaaaa

   27aa 166 aa

   Lider Produkt dojrzaty i I I I I

   200 400 600 800 D00 i I

   1200 100

   Par zasad

   FIG. 3C

   5--» 3'

   AHEP06

   1 kilozasada

   FIG.4B ££· /o·

   J I „„-r.~?^HEP0U ΧΗΕΡΟ2 i AHEPO3

   FIG. 4 A

   X

   DO par zasad agcctctgggcttccagacccagctactttgcggłactcagcaacccaggcatetctgagtctccgccciugacc gggatgccccccaggaaEtgtccgcgagccccaectttcccagotagcagctccgccagtcccaagggtgcgeaa ccggctgcactcccctcccccaccccagggcccgggagcagcccccatgacccacacgcacgtctgcageagcce tgttagttccggagccttaatctaggcgtctCgcttctgcectgatcctgggtggcccctacccctggcgactcc εcatg^acatagtctctctccccttcccccccgcg^aegcatacaegcagataacagccccgactceccgccaca rtcgcaaggtcecCcC&ccrrCCCCCCTCCTCCCΓCCCCTGCC<XCCΛCrCCCTTTTCC:TrCrrAAGCCCCACCG cccccacccĆcccccctctcctcccacaccccgccccctccacaccccccctctcctccagccccctccccctcc ccctćcaccccccagcttccccccatcaccgccccccctctcctcacccccccccccccacctccctcaccgacg

   CCC<CXACCCGCCCACATCCCCGTCCACCgtgagCactcgcgggcCggtcgctt:cctcccgcccgggCccetgC¢ . HotClyVelHieG > . .

   t^ga^gc^cgggattta8cgccec^ggctat^cggccagg^aggtggctgggtt^taa^cgactggcgacεt^gtcaag^ga^cee ccgaagggggagggggccggcgct^gcctccacgegccagcccgcgcteggggggaCccttgggcat:ggcaaaaac ctgacct^gcaaagg^ggacatagttCggg^ggCC^gaggggaa^gaaagCet^ggg^gggCtctgttgt^gccagt|uacag gaagctgataagcCgatacccεgggtgttggagttattatttatcCtcacgaggggaagcctcCgteacactagg atεgca^gεεc^gcccgga^gaa^ct^ggaεgccggtagccCgggcgtgCgβ^cg^tg^cacacgg^ca8^caί^act,:gaatca“

   CgccagggagcctactcttgagCgcttgtaCggtCccggccaggaaccaccacttcgggtagagacgtgggcatg aaggaagctgtccttttatacctacccttctccttccctctctgactttεagtceccctatcCgttctagAATCT

   CCTCCCTCCCTGTGGCrrCTCCTCTCCCTCCTCTCCCTCCCTCTCGCCCTCCCACTCCTCGCCCCCCCACCAciĆ ProAlaTrple!uTrpLoulc!uLeuSerI.euLeuSer^uPr<>teuCly1LauProVvlLauGlyAlaProProArg rτccτcτcτccrcrrrcc<rrrcτcrcrcrCTccrτττrcrΛCCccrccrccccGCΛCCGCcτcΛrccrggagcce LeuIlrCyβAβpSeΓAΓcVa Π.euGluCrgTyrLβu1LelUrlUlιI.yyCruλCaClutonΠ·Tfcr crttcctagtntartttatacaacrcrccetccgcgct¢ctgcccactcctctctagtecagggacctggccate

   FIG. 4c cgttcgggctggacttgccaacttacatattcttcccci:acataagaataagl:ccggcggccccaaatcatacct ggaaattaggcaagcagcaaagctagccactectacgcctgtggtcacccteagagccεrtagggccccttgact • · · · a . · ccccggccεgεgεccrtεtcrrrrrτrτc(;τrCTccACτcrΆrACcc'ccAAτcACATAττcAcτcccccAGAr:AC

   ThrGlyry8C.aGluHl8ry8SeΓLeuCεnGGιUCcΣleThrValrΓoAepTh αACAΠTTCΠTTτrcccτr(τrTAGGAAG(»G^grAτrεεcrεεcεcεεεεεεεεεεccεttcεεεεcgagaaε rLycTa^^nrheTyrClaTi^f^l.^ycAi^^ecClu cεcat:tc^cc^ac^cccc^aattccggctgaaag^cacga^ccgatc^cc^cggaaaggtaaaa^cggagcag^tacagaεg^agc crgccεgggcgcagcgcctccccCcεaεaaεcceacgcεgacarggcccagaεgggagaaεrgctεgactccεcc acεεtcagaccaattεacgcagccεagCgcacεctcccaεctcεacaaacaεεεaaaaaaaεεagεcaccεgaac εggεctaεgcεgcεacεttcagaεaεtccgagcgccgcggcgcgaggaεcccεεgactccagggaεεεcagccεc cagεcagctgεgaεcacactacεgcactccagcctcagεgacagagεgaggetctgtctcaaaaaagaaaacaaa aaagaaaaaεcaεgggg^gcccεcεgrccεacgtccatεaεεtcεεcactcactcacεcacεcaεecaεεtatεca tCcattcaccaagtcttACtgcataccttctgC¢tcctccgcccgCt8<CCggcgctgctgcggcccgggaggga

   ISO

   300

   450

   600

   730

   900

   1050

   1200

   1330

   1300

   1630

   1800

   1930

   2100

   2230

   FIG. 4C /Ciąg dalszy/

   154 180

   8^a888^l^i^^sca^^cc^^(:ctcel^^<aCeactcccegag^(^ccacl^<^<^(^l^|^lcgC^(^(AGC^<ClCCCCC^i^(^AACTC^(^CCAC

   V^lCly^:inCLn^laV^lCluV^:iTi^pCln (CGCCTGGCCCACACCGCCCGAAAACTCCrGCCCCGCCCAGCCCACACCCACAAATCTrCCCAGCCACCACACCCC

   AlyLeuAl.aLeuLeuSerCIuAlaValI.euA.rcClyGG[nU.aLeuLeuVaaAeńSerSarGlnProTrpGluPro

   CTCACGATCCCTCTCGATACCCCCGCCACTGGCCTTCAACCCATCCCCΛCTATCATTAACGCTATCCCCGACCCC

   LeuClnLeuHl8ValCspLyβAlaValSarClyLeuArgSerLeuTh]rThrLeuLeιUCrCUaLeuClyAlaCln ^ct^cacta^cca^(^^^c^c^accCti^^^c^^c^ccccttCc^C|^Cacaac^c^l^l^acaacCC^tc<^tcl^^^tacl^<^^J>8^t'^^,^^,^^ccaac.

   tctccgtatCccttcccCCtcCgtggcacCgcccaccccCcctgCtCCcCcctCggACgAACCAAGCAMCACCC

   LysClyJUalleSerP '·CTCCACACCCCCCCCTAACTCCCTCCCACCAACACCCCCCCTCTTACCACCTCCACACCATCCTAC¢GCCTCTCCT roProCspAlaClaSerClaCl<P^,roLeuCrgThrIeτΉrcAlcApτ'n^rPheCΓgLyεLeuPheCrgVal?yrS CCCCCTTCCTCCGCCGAACCCTCAACCTGTCCCCACGGGCACACTCCACCACCCGGGACA«CT»ACCA(AAΓATCT erCsnPheLeιUC'gClyLy8LeuULaILeUτrTTrClyCluCl.aCysAΓcT'>lrAlyCepCrg * ccacctccccatatccaccacctccctcaccmaaatccttctcccacaccctccccccccactcctgaaccccg

   TCGCCGGGCTCCCCCCTCAGCCCCACCCTCTCCCATCCCCCCTCCACCCCACGCCCTCCCCCCTACGCCGCCCCC • · · . . . ·

   CCCCCTGTCCCCCCACCCCCTCCCACACCTCCGCCCCTCCCCCCGCCCCACTACCGCCCCCGCGCCCGAA«ATT

   CCωGAGCΛCCrTTCMCCCCGGCACAGACC<AC·^GTα;CJC.<GC:CCCTCACCT<C^CTCCCCΛCCCTCCΛAλATT

   TCCCGCCACGACCCCCTTCGCACCCCA^,TTCACCCGTTrTCCCACCTACCAΪCAGGGCCCCGCCACCCTCCCGCCC

   TTCCATGCCCAGCTGTGCCTTCTCCACCCCTCCCGGGCCCCGCCACTCCCTTGGTGCCCCGJ^GCCCCCATrGCCAC

   CGCCCTGA'TACCCCCUAGtC.GGC^CCCACGCACCIGCCCΐCACCGτTΐC<CCCGGΐTGACCAίTTTCΪCTC.'CTCT

   TCMA:CA<TA[CCACCACC.CACWGCC:CaaCctBactcCtggcttCCCtgttCtetgcgcacctcc(^mccc ctccctctgtcccactcccggcacca

   2400

   2550

   2700
2. 2B50

   3000

   3150

   3300

   3400

   FIG. 4A /ci-ąg dalszy/

   154 180

   ΡνυΠ

   EcoRI

   Xhol _i Hind III

   Barn HI

   Główny późny promotor adenowirusa pAdD 26 SVpA(3)

   5.2 Kb .Sal I

   Pstl fiomui ί Iczęscicwe trawienie Barn mi -«j 2.tragment Klenowa

   EcoRI IWcja

   Hind III Barn HI

   Xhol

   Sali

   Barn HI FIG. 5 A

   CN —* >% ZJ C

   01 B > Ό >» c c —. cl X cp o. ₃\ X X 1 x s w

   (Ο Ο 3-C <<Χ X Ο & Q C c s β £5 > β β ’c

   Ν (&

   C <9

   Ε σ>

   (0

   FIG. 5

   _m S / <0 o / 0l H 7? o ii J OM _J \\ X σ> 11 > He γγ cl // ^ω Ό -C Wk OO > O Ol

   pBR322-Ad HindDIB

   f.trawienie Hpal

   2.EcoRI tącznik/EcoRI trawienie/
3. 3.odzyskanie fragmentu 1,4 KB ligacja ^Xho1 EcoRI

   Xhol

   SV 40 . wzmacniacz

   PvuII trójcztonowy.

   lider ^Gtćwny późny promotor adenowirusa geny va

   EcoRI

   Hind III rBam HI

   3’miejsce składani a jejr p 91023 7.9 KB

   DHFR PO' A λδ u κβ

   SV 40

   Sali

   FIG.5B’ ρ 91023 (Trawienie EcoRI /fragment Klenowa/ ligacja p 91023CA)

   Pstl/fragment Klencwa/EcoRl łącznik trawienie EcoRI/ligacja

   Xhol _ Geny VA . ΡνυΠ/ζ wzmacniacz ^tr^r0^^^^Zl:^^rOUr^^t^^o^w^c^{y p}02n^{y p}romo^t0r ' ^nt adenowinusa \r ³’miejsce Władania ^^ETR W B^{am HI}

   Hind UI

   -p91023(B) 7.9 KB

   -DHFR poli A

   SV 40

   FIG. 5C

   SC

   S § naturalna EPO rekombinantowa EPO 125j naturalna EPO

   gacaggnag gacgagctgg gacagagacg cggggacgaa ggaagctgtc ctcccacagc caccettctc cccccccgcc tgactctcag cctggctacc LU CgttctagAA CYS TCT PRO CCT AU TRP LEU TRP LEU LEU LEU SER LEU LEU SER LEU PRO LEU CLT LEU PRO VAL LEU CLT CCC TCC CTC TCC CTT CTC CTC TCC CTC CTC TCC CTC CCT CTC CCC CTC ' CCA CTC CTC CCC

   J SU 10 20

   Ala CCC Pro CCA Pro CCA Arg CCC Łcu CTC Ile ATC Cys TCT Asp CAC Ser ACC Arg CCA Tal ' Leu Clu CAC Arg ACC Tyr TAC Leu CTC Leu TTC Clu CAC Ala CCC Lys AAC CTC CTC Clu Ala Clu a Asn Ile Thr Thr ciy SH Cys 30 Ala Clu 111 s Sil Cys Ser Leu Asn Clu a Asn Ue 40 Thr CAC CCC CAC AAT ATC .ACC ACC CCC TCT CCT CAA CAC TCC ACC TTC AAT CAC AAT ATC ACT Val Pro Asp The Lys Val Asn Phe Tyr 50 Ala Trp Lys Arg Itet Clu Val Cly Cln Cln 60 Ala CTC CCA CAC ACC AAA CTT AAT TTC TAT CCC TCC AAC ACC ATC CAC CTC ccc CAC CAC CCC Tal Clu Tal Trp Cln Cly Leu Ala Leu 70 Leu Sar Clu Ala Val Leu Arg ciy Cln Ala 00 Leu CTA CAA CTC TCC CAC CCC CTC CCC CTC CTC TCC CAA CCT CTC CTC CCC ccc CAC CCC CTC Leu Tal a Asn · · Ser Ser Cln Pro Trp Clu 90 Pro Leu Cln Leu Hla Val Asp Lys Ale Val 100 Ser TTC CTC AAC TCT TCC CAC CCC TCC CAC CCC CTC CAC CTC CAT CTC CAT AAA CCC CTC AGT Cly Leu Arg Ser Lou Thr Thr Leu Leu 110 Arg Ala Leu ciy Ala Cln Lya Clu Ala Ue 120 Ser CCC CTT CCC ACC CTC ACC ACT CTC CTT CCC CCT CTC CCA CCC CAC AAC CAA CCC ATC TCC Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro 130 Leu Arg Tl.r Ue Thr Ala Asp Thr Pite Arg 140 Lys CCT CCA CAT CCC CCC TCA CCT CCT CCA CTC CCA ACA ATC ACT CCT CAC ACT TTC CCC AAA

   FIG. 7

   150 · 160 Leu Phe Arg CTC TTC CCA Val Tyr Ser CTC TAC TCC Asa Phe Leu AAT TTC CTC Atg Cly Lya CCC ,CCA AAC Leu Lya Leu CTC AAC CTC Tyr Thr Cly TAC ACA CCC Clu Ala CAC CCC SH Cya Arg Thr TCC ACC ACA 166 Cly Asp Arg CCC GAC ACA TCA ccaggtg .tgtccacctg ggcatatcca ccacctccct caccaacatt gcttgtgcca cacccecccc cgccactcct gaaccccgte gaggtgcect cagcteagcg ccagcctgtc ccatggacac tceagtgcca gcaatgaeat ctcaggggce agaggaactg tccagagagc aactctgaga tcteaggatg tcacagggcc aacttgaggg eecagagcag gaagcatCca gagagcagct ttMactcag ggacagagcc atgctgggaa gacgcctgag ctcactcggc accccgcaaa atttgatgcc aggaeaegct ttggaggcga tttaccegtt ttcgcaccta ccatcaggga caggatgacc tegagatcct aggtggeaag ctgtgacttc tccaggtctc acgggsatgg gcactcccte ggcggcaaga gcccccttga caccggggeg gtgggaacca tgaagacagg atgggggctg gcctctggct cccacggggt ccaagttttg tgtactctte aacctcattg acaagaacCg aaaceaccaa aaaaaaaaaaaa

   Ο FIG. 1 /cięg dalszy/ ctcgctgcgc tgcgccgcac cgcgccgrcc tcccggagcc ggaccggggc caccgcgccc gctctgctccg cccggccg acaccgcgec ccccggaceg ccgccctctc ctccaggccc gtggggctgg' ^x ccctgcaccg ccgagcttcc cgggatgaggg ccccc^tge ggccaeccgg cgcgccccag gccgctgagg gaceccggcc aggcgcggag -ił HET ATC CLY CCC VAL CTC HIS CAC CLU CAA CYS TCT PRO OT ALA TRP LEU TRP LEU LEU LEU SER LEU LEU SER LEU PRO LEU CLY LEU PRO VAL LEU CLY CCC TCC CTC TCC CTT CTC CTC TCC CTC CTC TCC CTC CCC CTC CCC CTC CCA CTC CTC CCC 1 Ala Pro Pro Arg Leu . SH Ile Cys Asp 10 Ser Arg Val Leu Clu Arg Tyr Leu Leu Clu Ala 20 Lys CCC CCA CCA CCC CTC ATC TCT CAC ACC CCA CTC CTC CAC ACC TAC CTC TTC CAC CCC AAC * Clu Ala Clu Asn Ile Thr Thr Cly SH 30 Cys Ala SH Clu His Cys Ser Leu Asa Clu * Aen Ile 40 Thr CAC CCC CAC AAT ATC ACC ACC CCC TCT OT CAA CAC TCC ACC TTC AAT CAC AAT ATC ACT Val Pro Asp Thr Lys Val Asa Phe 50 Tyr Ala Trp Lys Arg Mit Clu Val Cly Clu Cln 60 Ala CTC CCA CAC ACC AAA AW TTC TAT CCC TCC AAC ACC ATC CAC CTC CCC CAC CAC CCC Val Clu Val Trp Cln Cly Leu Ala 70 Leu Leu Ser Clu Ala Val Leu Arg Cly Cln Ala 80 Leu CTJA CAA CTC TCC CAC CCC CTC CCC CTC CTC TCC CAA CCT CTC CTC CCC CCC CAC CCC CTC

   FIG. 8 * 90 100

   Leu TTC Val Asn Ser TCT Ser TCC Cln CAC Pro CCC Trp.'. Clu Pro CCC Lau CTC Cln CAC Leu CTC Hla CAT Val CTC Asp CAT Lya AAA Ala CCC Val CTC Ser ACT CTC AAC TCC CAC Cly Leu ^Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu 110 Arg Ala leu ciy Ala Cln Lys Clu Ala Ile 120 Ser CCC CTT CCC ACC CTC ACC ACT CTC CTT CCC CCT CTC CCA CCC CAC AAC CAA CCC ATC TCC Pro Pro Asp Ala Ala Ser Alu Ala Pro 130 Leu Arg Thr Ile Thr Ala Aap Thr Phe Arg 140 Lye CCT CCA CAT CCC CCC TCA CCT CCT CCA CTC CCA ACA ATC ACT CCT CAC ACT TTC CCC AAA Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu ISO Arg Cly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Cly Clu CTC TTC CCA CTC TAC TCC AAT TTC CTC CCC CCA AAC CTC AAC CTC TAC ACA CCC CAC

   FIG. 8 /ciąg dalszy/ cccggagcc ggaccggggc cacegcgcec gctctgctcgg acaccgcgcc ccctggacag ccgccctctc ccccaggecc - etggggctgg ccctgceccg ccgagctccc cgggatgagfg cccccggtgt

   -27 ‘

   HET CLY VAL HIS CLU CYS PRO ggc cacccj SG ' 1gcgccccag gtl CgCtg.' .gg gaccccggci e aggegeggag ATC CCC CTC CAC CAA jL TCT CCT ALA TRP LEU TRP LEU LEU LEU SER LEU LEU SER LEU PRO LEU CLY LEU PRO PAL LEU CLY CCC TCC CTC TCC CTT CTC CTC TCC CTC CTC TCC CTC CCT CTC CCC CTC CCA CTC CTC CCC I SH 10 20 Ala Pro Pro Arg Leu Uo Cys Asp Ser Arę Val Leu Clu Arg ^Ty^r Leu Leu Clu Ala Lys CCC CCA CCA CCC CTC ATC TCT CAC ACC CCA CTC CTC CAC ACC TAC CTC TTC CAC CCC AAC A Sil 30 SH A 40 Clu Ala Clu Asn Ile Thr Thr . £iy. . Cys Ala Clu llls Cys Ser Leu Asn Clu Asn Ile Thr CAC CCC CAC AAT ATC ccc TCT CCT CAA CAC TCC ACC TTC AAT CAC AAT ATC ACT SO 60 Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Arg Met Clu Pal Cly Cln Cln Ala CTC CCA CAC ACC AAA CTT ΑΛΤ TTC TAT CCC TCC AAC ACC ATC CAC .GTC CCC CAC CAC CCC 70 80 Val Clu Val Trp Cln Oly Leu Ala Leu Leu Ser Clu Ala Val Leu Arg Cly Cln ‘Ala Leu CTA CAA CTC TCC CAC. CCC CTC CCC CTC CTC TCC CAA CCT CTC CTC CCC CCC CAC CCC CTC Λ 90 100 Leu Val Asn Ser Ser Cln Pro Trp Clu Pro Leu Clu Leu Ula Val Asp JLy. Ala Pal Ser TTC CTC AAC TCT TCC CAC CCC TCC CAC CCC CTC CAC CTC CAT CTC CAT ΑΛΑ CCC CTC ACT 110 120 Cly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Cly Ala Cln Lys Clu Ala Ile Ser CCC CTT CCC ACC CTC ACC ACT CTC CTT CCC CCT CTC CCA CCC ^CAA AAC CAA CCC ATC TCC

   FIG. 9

   Pro Pro Asp CCT CCA CAT Ala Ala Ser CCC CCC TCA Ala Ala Pro- CCT CCT CCA 130 Leu Arg Thr CTC CCA ACA Ile Thr Ala ATC ACT CCT Asp Ttir Phe CAC ACT TTC 140 —ArŁ. ^Ly^s CCC AAA Lob Plic Arg crc ttc cga Val Tvr Ser CTC TAC TCC Asn Phe Lcu AAT TTC CTC ISO Arg ' Cly Lya CCC CCA AAC Leu Lys Leu CTC AAC CTC Tyr Thr Cly tAc ACA CCC 160 Clu Ala ~^AC 2cć Sil Cyn Arg Thr TCC ACC' ACA 166 Cly Asp Arg CCC CAC ACA TCA ccaggtg tgtccacctg ggcatatcca ccacctcccc caccMcatt gcctgtgcca caccctcccc cgccactcct gaaceccgtc gagggggtct eagctcagcg ccagcctgtc ccatggacac tccagtgcca gcaatgacat ctcaggggcc agaggai^i^^g tccagagagc aactccgaga tcia.iggacg tcacagggcc aacctgaggg cccogagcag gaagcactce gagagcAgct ttaMcccag ggacagagcc atgctgggaa gacgcctgag ctcactcgge aecctgcaaa atttgatgce aggacacgct tcggaggcea tttacctgtC ctcgcaccca ccatcaggga caggatgacc tggagaactc aggtggcaag ctgtgacctc cccaggtctc- acgggcatgg gcactccccc ggtggcaaga gccccctcga caciggggtg Gtggeaacca tgnagacagg atgggggcCg gcctctggct ctcatggggc ccaagttttg tgcactcttc aacctcatcg acaagaactg auaccaccoa aaaaaaaaaaaa

   FIG. 9 /clęg dalszy//

   O £

   o

   — 1 l c~ \ć cr g<-1 > o v fe» o N . o O (V CL (/)0. \ er >— UL·* 9

   SV 40 Poli A X^V8R 322ORI

   FIG. 11

   Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 100 egz.

   Cena 3000 zł