CZ127496A3 - Způsob produkce rekombinantního lidského erythropoietinu - Google Patents

Description

Způsob produkce rekombinantního lidského erythropoietinu

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu produkce rekombinantního lidského erythropoietinu.

Dosavadní stav techniky

Erythropoietin (dále označován jako EPO) je cirkulující glykoprotein, který stimuluje tvorbu erythrocytů ve vyšších organismech, viz Carnot a spol., Compt.Rend., 143:384 (19 06) . Jako takový je EPO někdy označován jako erythrocyty stimulující faktor.

Doba životnosti lidských erythrocytů je asi 120 dnů.

Asi 1/120 celkových erythrocytů je denně odbourána v retikulo-endotheliáfíím systému. Současně je denně produkován relativně konstantní počet erythrocytů, aby byla stále udržena určitá hladina erythrocytů (Guyton, Textbook of Medical Physiology, str. 56 až 60, W.B.Saunders Co., Philadelphia 1976).

Erythrocyty jsou produkovány zráním a diferenciací erythroblastů v kostní dřeni a EPO je faktor, který působí na méně diferencované bufíky a indukuje jejich diferenciací k erythrocytům (viz výše).

EPO je slibným terapeutickým prostředkem pro klinickou léčbu anemie nebo konkrétně renální anemie. V praktické terapii není používání EPO dosud bohužel běžné pro jeho malou dostupnost.

Pro použití EPO jako terapeutického prostředku je třeba uvážit možné problémy antigenicity a proto je výhodné připravovat EPO ze suroviny lidského původu. Je možno například použít lidskou krev nebo moč pacientů, postižených aplastickou anemií nebo podobnými nemocemi, které způsobují vylučování velkého množství EPO. Tyto suroviny však jsou k dispozici v omezeném množství, viz například White a spol., Rec.Progr.Horm.Res., 16; 219 (1960), Espada a spol., Biochem.Med., 3; 475 (1970), Fisher, Pharmacol. Rev., 459 (1972) a Gordon, Vitam.Horm. (N.Y.) 31; 105 (1973).

Příprava EPO produktů se obvykle prováděla koncentrací a čištěním moči pacientů, vykazujících vysokou úroveň EPO, například pacientů postižených aplastickou anemií a podobnými nemocemi, viz například patenty USA 4397840, 4303650 a 3865801. Omezená zásoba takovéto moči je překážkou praktického použití EPO a tudíž je velmi žádoucí, připravovat EPO produkty z moči zdravých osob. Problém použití moči zdravých lidí spočívá v jejím nízkém obsahu EPO ve srovnání s anemickými pacienty. Moč zdravých jedinců obsahuje určité inhibiční faktory, které v dostatečně vysoké koncentraci působí proti erythropoese, takže dostatečný terapeutický účinek může být u EPO, získaného z takové moči, dosažen pouze s použitím následujícího významného postupu čištění.

EPO lze rovněž regenerovat z ovčí krevní plasmy a separace EPO z této krevní plasmy poskytla dostatečně potentní a stabilní vodorozpustné preparáty, viz Goldwasser, Control Cellular Dif.Develop., díl A, str. 487 až 494, Alan R.Liss, lne., N.Y. (1981). Lze však očekávat, že ovčí EPO bude pro lidi antigenní.

Běžné izolační a čistící metody s použitím přírodních zdrojů EPO tedy nejsou adekvátní masové produkci tohoto žádaného terapeutického prostředku.

Sugimoto a spol. v patentu USA č. 4377513 popisují jeden ze způsobů masové produkce EPO, zahrnující multiplikace in vivo lidských lymfoblastoidních buněk, zahrnujících Namalwa, BALL-1, NALL-1, TALL-1 a JBL.

Zprávy o produkci EPO jinými metodami genetického inženýrství se objevily ve standardní literatuře. Nebyl však zatím publikován reprodukovatelný způsob výroby ani chemická charakteristika produktu. Předmět tohoto vynálezu naproti tomu představuje reprodukovatelný způsob masové produkce proteinů, vykazujících biologické vlastnosti lidského EPO. Tímto způsobem je možno rovněž produkovat proteiny, které se mohou chemicky lišit od autentického lidského EPO a současně vakazovat podobné (a v některých případech zlepšené) vlastnosti. Pro jednoduchost se zde všechny proteiny, vykazující biologické vlastnosti lidského EPO označovány jako EPO bez ohledu na to, zda s ním jsou nebo nejsou chemicky identické.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je způsob produkce rekombinantního lidského erythropoietinu, hEPO, zahrnující stupně wsrjecuíi*í á)h£lte^ílto Uďec· (cvo)

a) kultivace buněk^které obsahují DNA sekvenci kódující hEPO operativně připojenou k expresní kontrolní sekvenci, ve vhodném mediu a

b) získání a separace produkovaného rekombinantního hEPO z buněk a media,

3a jehož podstata spočívá v tom, že se použije CHO buněk majících schopnost poskytovat N- a O-připojenou glykosylaci se zavedením fúkosy a N-acetylgalaktosaminu, přičemž z buněk a media se získá a oddělí rekombinantní hEPO s N- a O-připojenou glykosylaci.

Podle vynálezu se používá rekombinantních technik klonování genu exprimujícího překvapivě vysoké hladiny lidského EPO, jeho exprese a masové produkce aktivního lidského EPO in vitro. Jsou také popsány vhodné expresní vektory pro produkci EPO, expresní buňky, schémata čištění a příbuzné procesy.

Jak je podrobněji dále popsáno, byl EPO získán v částečně čištěné formě ^byl dále čištěn do homogenity a štěpen trypsinem za vzniku specifických fragmentů. Tyto

3lXl fragmenty byly čištěny a sekvenovány. EPO oligonukleotidy byly navrženy a syntetizovány na základě těchto sekvencí.

tyto oligo^dsylypoužity ke screeningu lidské genomické knihovny, ze které byla izolován EPO gen.

EPO gen byl ověřen na základě své DNA sekvence, která odpovídala mnoha ze sekvenovaných tryptických proteinových fragmentů. Část genomické^lonu pak byla použita pro demonstraci při hybridizací, že EPO mRNA by mohla být detegována v lidské fetální mRNA (stáří 20 týdnů). Byla připravena cDNA knihovna jater lidského plodu a byla screenována. Byly získány tři EPO cDNA klony (po screeningu

750000, rekombinantů). Dva z těchto klonů byly stanoveny jako mající plnou délku podle kompletní kódující sekvence a v podstatě 5-konec a 3-konec netranslatováné sekvence. Tyto cDNA byly exprimovány jak v SV-40 virem transformovaných opičích buňkách (COS-1 buněčná linie; Gluzman, Cell 23:175182 (1981)) a buňkách vaječníků čínských křečků (buněčná linie CHO; Urlaub G. a Chásin L.A. Proč.Nati.Acad.Sci. USA 77:4216-4280(1980)). EPO produkovaný COS buňky je biologicky aktivní EPO in vitro a in vivo. EPO produkovaný z CHO buněk je také biologicky aktivní in vitro a in vivo.

EPO cDNA klon má zajímavý otevřený čtecí rámeček 14-15 aminokyselin (aminoacids -aa) s iniciátorem a terminátorem ze 20 až 30 nukleotidů (nt) proti směru kódující oblasti. Reprezentativní vzorek E.coli transfektované klonovaným EPO genem byl uložen v American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, který je dostupný pod přírůstkovým · číslem ATCC 40153.

Popis obrázků na připojených výkresech

Tabulka 1 je sekvence 87 párů bází exonu lidského EPO genu;

obr. 1 ilustruje detekci EPO mRNA v lidské fetální jaterní mRNA, tabulka 2 ilustruje aminokyselinovou sekvenci EPO proteinu odvozenou z nukleotidovou sekvenci lambda-HEPOFL13; tabulka 3 ilustruje nukleotidovou sekvenci EPO cDNA v lambda-HEPOFL13 ( uvedena schematicky na obr. 2) a z ní odvozenou aminokyselinovou sekvenci;

obr.3 ilustruje relativní polohy DNA inzertů čtyř nezávislých lidských EPO genomických klonů;

obr. 4 představuje mapu zjevné intronové a exonové struktury lidského EPO genu;

tabulka 4 ilustruje DNA sekvenci EPO genu ilustrovanou na obr. 4B;

obr. 5A, 5B a 5C ilustrují konstrukci vektoru 910(B); obr.6 ilustruje SDS pólyakrylamidovou gelovou analýzu EPO produkovaného v COS-1 buňkách ve srovnání s nativním EPO, tabulka 6 ilustruje nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci EPO klonu, lambda-HEPOFL8;

tabulka 7 ilustruje nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci EPO klonu, lambda-HEPOFL13; obr.7 je schematickou ilustrací plasmidu pRkl-4 a obr.8 je schematickou ilustrací plasmidu pdBPV-MMTneo(342 12) .

Předložený vynález se týká klonování EPO genů a produkce EPO in vitro expresí těchto genů.

V patentové a vědecké literatuře je uváděno mnoho způsobů vhodných pro produkci rekombinantních proteinů. Obecně tyto techniky zahrnují izolaci nebo syntézu požadované genové sekvence a expresi takové sekvence bud v prokaryotické nebo eukaryotická buňce za použití technik běžně odborníkům známých. Jakmile byl gen izolován, čištěn a inzertován do transfer vektoru (tj. klonován), je zajištěna dostupnost podstatného množství. Vektor s do něj klonovaným genem je tranferován do vhodného mikroorganismu^ nebojbuněčné linie, například bakterie, kvasinky, savčích buněk jako jsou

COS-1 buňky (opičí ledviny), CHO (vaječníky čínského křečka), hmyzí buněčné linie a podobně, kde se vektor replikuje při proliferaci mikroorganismu nebo buněčné linie a ze kterých vektor může být izolován běžnými prostředky.

Je tak poskytnut obnovitelný zdroj genu pro další manipulace, modifikace a transfery do jiných vektorů nebo jiných míst v tomtéž vektoru.

Exprese muže být často dosažena transferováním klonovaného genu, ve správné orientaci a čtecím rámečku, do vhodného místa v transfer vektoru, tak že translační čtecí postup z prokaryotického nebo eukaryotického genu vede k syntéze proteinového prekurzoru, obsahujícího aminokyselinovou sekvenci) kodovanou klonovaným genem připojeného k Met nebo aminokoncové sekvenci zprokaryotického nebo eukaryotického genu. V obou případech mohou být signály pro iniciaci transkripce a translace dodány vhodným genomickým fragmentem klonovaného genu. Mnoho specifických technik štěpení proteinů může být použito pro štěpení proteinového prekurzoru, je-li produkován, v požadovaném bodě tak, aby se uvolnila požadovaná aminokyselinová sekvence, která může být pak čištěna obvyklými prostředky. V některých případech je protein, obsahující požadovanou aminokyselinovou sekvenci produkován bez potřeby specifických technik štěpení a může být také uvolněn z buněk do extracelulárního růstového media.

Izolace genomického klonu lidského EPO

Lidský EPO byl čištěn do homogenity z moči pacientů postižených aplastickou anemií jak popsáno dále. Úplné štěpení tohoto čištěného EPO proteásovým trypsinem poskytlo fragmenty, které byly odděleny vysokotlakovou kapalinovou chromatografií s reverzní fází, získány z gradientových frakcí a podrobeny mikrosekvenční analýze. Sekvence tryptických fragmentů jsou podtrženy v tabulkách 2 a 3 a jsou podrobněji diskutovány dále. Dvě aminokyselinové sekvence, Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lys a Val-Tyr-Ser-Asn-PheLeu-Arg, byly zvoleny pro návrh oligonukleotidových sond (vedoucích k oligonukleotidovém poolu 17 nt dlouhému a 32krát degenerovanému a oligonukleotidovému poolu 18 nt dlouhému a 128-krát degenerovanému, ze dřívějšího tryptického fragmentu jakož i dvou poolů 14nt dlouhého, vždy 48-krát degenerovaného, z pozdějšího tryptického fragmentu). 32-krát degenerovaný 17merový pool byl použit pro screening lidské genomické DNA knihovny v Ch4A vektoru (22) za použití modifikace Woo-a a 0'Malleye v in šitu amplifikačním postupu (47) pro přípravů filtrů pro screening.

Arabské číslice v závorkách (1) až jsou použity pro označení publikací, které jsou uvedeny v podle čísel na konci tohoto popisu.

Fágy, hybridizující k 17meru, byly vybrány, spojeny do malých skupin a sondovány se 14merovými a 18merovými pooly. Fágy, hybridizující k 17merových, 18merovým a 14merovým poolům, byla plakově čištěny a fragmenty byly subklonovány do M13 vektorů pro sekvenaci dideoxy-řetězec ukončující metodou podle « < >» gutcctoegcetgtggccagggccagagccttcagggaeecttguctccccgggctgtgtgcatttcag

E* tí	S cu
<1 co	O
< <	H £-t
o	CJ „
	O .2
O o	O <
H tí	É1 Í4
< <o	< >>
< <	η h
O 3 C-I o	E“1 Ji
H J	H Ch
O h w o	<í w
< CQ	< <
O cn □	H - H d
c-ι O	O >

O	. <	tn
<.2	<
o c:	<	tJ

tí

O

O Ji < £tú >—· o ϋ bo cj hů O to a

Q

4-)

O

4-* <3

C bo

CJ ho bo

Η .	O Cu	b£
O « O <	< w O <	CO ώ
		bo
H tn O	u 2	O <	tí
Η ϋ	CJ Ch.	CJ ZJ
o	o _	o	?<
a a? o o	H .a a >	•H <	u s
O	H ti	c	to
O Ji	o jí	o	ÍU
<	< H	<	<

O

4-* ¢0 bo

Λ co bo co to to to

CO

CO <0 bo

4^ cO bů bo co éJ r-H

X) eO

H

O

C£ α_ >O

U,

Z3 __)

123 «=C >

<3 § X Q>>

_J Ξ3 M < UJ a > -J u3

C

V) <

P·* a

cs cí r-H cí

H

υ Q	ο ta	o	P	X	O		<a
cd	W	3	o	P	O	o
U	ta	(P	o	o	O	n	«j
ω	ca
υ	υ
U •ti	V u	w	P	3	o		ti
u	u	X	o	bl	P		^4
ο	u	o	P	P	u		<

P P <=>r=y < H <

o

SJ a

Tabulka 3 cccggagcc gcnccgCCCC caccgcgccc cctctgctccg ca čó ca a

ca u

ti ca ca ca υ

υ

C9 a

ta u

υ ta u

<j ta u

ta u

u u

u ta «

w ti ta ca ta ca u

ca υ

u u

co ca ti u

u u

u v

ca u

u ta (3 ti ti ta ta u

a u

u

O

S*4 to o >- ρ s υ o ·< cc o b, o t x co o

CO ta u

CO u

ta ta o

u <j ta ta u

u u

u o

ta ta ta o

ta

M u

ca a

u ca ta d

U u

u u

ta υ

ca u

ta ta u

u u

o υ

u ta ca ti H ³ 9 «Μ <

o o

X o o o

3S -1 o i- o

3í

MO o

tj

P

3S

P o « υ μ υ w P

O b) í-i p u

O Ul P P O s

P <

o o

-i β O 3 XO w υ η

O ο ο .es o μ — u

a w

&

n >jO CO C β Η σ -π υ η < ο β Η 3 χρ ΙΟ Ο Η χ'ο Λ ο ο,ο Uo η¹ <

Ρ,Ο ο <

O

P υ

o o

SJ ε'ρ

2^2

I σ

ΙΛ

ti	O		5	O
	U	o	ti	P
·<	o	09	►«!	o
c	q		R	o
			**	o
o	o		<	o
e	o		c	o
	<			<
o	□		o	o
PO		>	o
^4	o			o
O	o		o	o
f-4	o		60 O
	p		μ	o
>	p		<	o
	<
a	o		3	o
r-4	<		ti	P
O	o		U	o
XI	o.			o
o X	2·'		ti s>	3
eúO		ti	P
J-í	o			o
	<		<	o
a	o		□
>				<í
u			Q	o
c.	o		μ	o
u	o		u	O
ř-	P		co	P
o	o		3	o
r-<	a	O	ti	P
<	u	r*	U	o
μ	P		3	q
	<		ti	P
H	P		U	u
ti	o		ti	o
	P			u
fr.	P			o
C	P		□	o
«η	-<		ti	P
<			-J	o
·-*	P		*	o
ti	P		iH	o
>	o		O	o
o	-		c	o
>»				·<
	<		U	o
U	o		B.O
	u		P	o
P	<		P	P
0.0		P	o
ie	·<		<9	P
<	o		>	o
a	<		3
P	o		P	•4
P	o		O	o
P	o		P	<
a	P		4	P
3.	o		>	o

Ο u Η ο « ο —· «ο <

ρ ο <ο ρ > ο ο ο 28

Ρ ρ «4α co] ρ ι c, α ι/ϊ <

<ι<

Ο u «ν ti —» w ο ο

3*2 c $2 *·* ο υ ·?3 ο ο ·<

ο es ο ο υ —< j·< <

Ο Ρ ο < ο χα ~ ο ο υ okrač.

CO c3

Si «3

O n

	<	O d
>>	·<	\O
		— <
	o	3
u	o
<	cj	a
d	a	>
JZ	H
c-	H	Q
u	f-«	u
	SJ	^z
6-	·<	H
c	O	u
ςζ	<	>
<	o
c	H	-
**	O	c
<	CJ	ř*
u	H	a
	CJ	>
ti	<	•J
CJ	u	3
rK	ti	G
G*	-<	*“
U	<	β
	CJ
H	<	_3
0£	·<	5s
U	o	*G
<	CJ	a
·.	a	O a
3	H	ι/Ί V-
	cj	-* <
O	<;	5
u	CJ	G
ř·	CJ	**
X	H	G
	CJ	X
<	CJ	ft-
c	ί-	c
r—	ο	cg
<	CJ	<
u	<	U
0)	CJ	G
W	H	(Λ
<3	CJ	G
	CJ	>
<	CJ
d	o
	CJ	a
<	CJ	>
c.	H	o:
V)	<	G
<	CJ	<
c	<	G
u	CJ
cu	a	c*
o	fi	3
u	tj	G
c-	CJ	B>J

O

H (_)

O o

δ o

o

O

O a

o

H o

a o

H (J u

u d

a «

a

G u

G

G

G

G g

G

G d

G

G

U u

bO g

G

U

CJ d

G

G

q	04	g	00	04	G
04 d 04	d G g	G 04 G	d a G	g 04 04	G G G
u	G	a	C4	04	G
G o	q	G q	04 u	04 G	G q
G	q	04	o4	G	G
	G	04	04	d	04
Π	u	d	q	G	G

d

G

G

G

G

G

CO £4

G g

a a

G

G

q	G	04	d	d	G	d	G
G	G	G	G	d	G	04	04
G	G	G	G	d	d ·	a	04
G	G	d	G	G	04	a	04
q	04	d	d	04	G	G	04
G	OO	04	G	G	d	04	G
d	04	04	04	G	04	00	d
G	04	d	a	G	04	G	G
04	q	04	d	G	d	04	G
04	04	d	04	d	G	04	G

03	G	G	04	G	d	G	G
G	G	•J	d	04	o0	G	G
G	00	00	G	00	04	G	04
G	G	04	00	G	04	G	04
d	G	04	d	G	O	G	G
G	G	00	00	G	G	G	G
G	G	a	a	d	G	G	G
G	a	G	G	G	d	d	G
04	a	G	G	G	G	G	G
G	c0	G	u	G	G	04	04

04 G	G	G	04	04	d	04	co
04	G	a	00	c	G	04	G
	G	G	00	co	G	G	G
q	G	d	. d	G	G	d	04
G	G	04	04	G	d	G	04
y	d	G	G	G	G	04	04
	G	d	G	04	oO	04	04
<	G	a	G	G	G	c4	04
o	00	G	d	d	G	G	G
H	G	CO	d	04	G	d	a

KO 04< \O u O

Ί 1. a. υ w <	G G G G	d G G 04	G G 04 04	d a 04 04	G G 04 G	G G G G	04 04 d G
< CJ	G	G	04	04	G	04	d
	G	04	d	G	G	04	04
	G	d	G	G	d	d	a
xo	G	G	d	04	G	G	a
1-1 U	d	G	G	G	G	G	04
CJ o	G	G	G	d	G	G	G

JZ O

H	<	d	G	04	G	d	G	d
		G	d	G	G	04	G	G
CK	O	G	G	d	04	G	G	G
u	O	00	d	04	q	CO	G	d
<	<	G	o4	04	04	00	d	d
		04	04	d	d	Π	04	04
		G	G	a	G	04	G	04
V)	o	G	d	»□	a	04	04	04
i*	o	G	G	G	04	w	G	G
	H	03	G	G	04	G	G	04

aacctcaccg acaagaacig aaaccaccaa aaaaaaanaaua

Sangera a Coulsona (23)(1977). Sekvence regionu, hybridizujícího ke 32násobně degenerovanému 17meru v jednom z klonu, je uvedena v tabulce 1. DNA sekvence obsahuje v otevřeném čtecím rámečku nukleotidy, které by mohly přesně kodovat tryptický fragment použitý k odvození 17merového poolu oligonukleotidů. Dále analýza DNA sekvence indikuje, že I7merový hybridizující region byl obsažen v 87bp exonu, navázaném v místech potenciálního sestřihu akceptoru a donoru.

Pozitivní potvrzení, že tyto dva klony (zde označené jako lambda-HEPOl a lambda-HEPO2) jsou EPO genomické klony byly získány sekvenováním další exonů, obsahujících jiný tryptický fragment kódující informaci.

Izolace EPO cDNA klonů

Byla provedena Northern analýza (56) lidské fetální (20 týdnů staré) jaterní MRNA'za použití 95nt jednořetězcové sondy připravené z M13 klonu, obsahujícího část 87bp exonu popsaného v tabulce 1. Jak je ilustrováno na obr. 1 bylo možno detegovat silný signál ve fetální jaderné MRNA. Přesná identifikace tohoto pásu jako EPO MRNA byla provedena za použití stejné sondy ke screeningu bakteriofágové lambda cDNA knihovny fetální jaterní mRNA (25) . Bylo získáno několik hybridizujících klonů při frekvenci přibližně 1 pozitivní na 250000 rekombinantú. Kompletní nukleotid a odvozené od těchto klonů (lambda-HEPOFL13 a lambda-HEPOFL8) jsou uvedeny v tabulkách 5 a 6. EPO kódující informace jeobsažena v 594nt v 5-konec polovině cDNA, zahrnující velmi hydrofobního 27 aminokyselinového leadru a 166 aminokyselinového zralého proteinu.

Identifikace N-konce zralého proteinu byla založena na N-koncové sekvenci proteinu sekretovaného do moči osob s aplastickou anemií , viz tabulka 1, a jak publikoval Goldwasser (26), Sue a Sytkowski (27) a Yangawa (21).Zda tento N-konec (Ala-Pro-Pro-Arg-) představuje skutečný Nkonec navázaný na EPO v oběhu nebo zda probíhá nějaké štěpení v ledvinách nebo moči, není v současné době známo.

Aminokyselinové sekvence, které jsou podtrženy v tabulkách 2 a 3 označují ty typické fragmenty nebo části, ze kterých byla získána proteinová sekvence. Dedukovaná sekvence přesně souhlasí s tryptickými gragmenty, které byly sekvenovány, potvrzuje, že izolovaný gen kóduje lidský EPO.

Struktura a sekvence lidského EPO genu

Relativní polohy DNA inzertu čtyř nezávislých lidských EPO genomických klonů jsou uvedeny na obr. 3. Hybridizační analýza těchto klonu s oligonukleotidovými sondami a s různými sondami připravenými ze dvou tříd EPO cDNA klonů umístuje EPO gen do přibližně 3,3 kb oblasti znázorněné na obr. 3 tmavou čarou. Kompletní sekvenční analýza této oblasti (viz příklad 4) a porovnání s cDNA klony, vede k mapě intronové a exonové struktury EPO genu, uvedené na obr. 4. EPO gen je rozdělen do 5 exonů. Část exonu I, celé exony II,III a IV a část exonu V, obsahují protein kódující informaci. Zbylé exony I a V kódují 5-konec a 3-konec netranslaťované sekvence.

Přechodná exprese EPO v COS buňkách

K demonstrování, že biologicky aktivní EPO by mohl být exprimován v in vitro buněčném systému, byla provedena COS buněčná expresní studie (58). Vektor použitý pro přechodné studie, p91023(B), je popsán v příkladu 5. Tento vektor obsahuje adenovirový hlavní pozdní promotor, SV40 polyadenylační sekvenci, SV40 původ replikace, SV40 enhancer a adenovirový VA gen. cDNA inzert v lambda-HEPOFL13 (viz tabulka 6) byla inzertována do p91023(B) vektoru, po směru od hlavního pozdního promotoru. Tento nový vektor je označen jako PPTFL13.

Dvacetčtyři hodin po transfekci tohoto konstruktu do M6 kmene COS-1 buněk (Horowitz a spol., J.Mol.Appl.Genet.2:147 149 (1983)), byly buňky promyty, přemístěny do sera prostého media a buňky byly sklizeny o 48 hodin později. Hladina uvolnění EPO do supernatantu kultury pak byla hodnocena za použití kvantitativní radioimunozkoušky pro EPO (55). Jak je uvedeno v tabulce 8 (příklad 6), byl exprimován imunologicky reaktivní EPO. Biologická aktivita EPO produkovaného z COS-1 buněk byla také hodnocena. V odděleném pokuse byl vektor, obsahující EPO cDNA z lambda-HEPOFL13 transfektován do COS-1 buněk a medium bylo sklizeno jak popsáno výše. EPO v mediu byl pak kvantifikován bud ve dvou in vitro biologických zkouškách, ³H-thymidinem a CFU-E (12, 29) a bud dvěma in vivo zkouškami, hypoxickou myší a vyhladovělou myší (30,31) (viz tabulka 9, příklad 7) . Tyto -výsledky demonstrují, že biologicky aktivní EPO je produkován v COS-1 buňkách. Při Western-blottingu za použití polyklonálních anti-EPO protilátky, EPO produkovaný COS buňkami má mobilitu na SDSpolyakrylamidových gelech, která je identická s mobilitou nativního EPO připraveného z lidské moče (příklad 8). Rozsah glykosylace EPO produkovaného COS-1 může být podobný jako u nativního EPO.

Různé vektory, obsahující jiné promotory mohou být také použity v COS buňkách nebo v jiných savčích nebo eukaryotických buňkách. Příklady takových jiných promotorů vhodných při provedení vynálezu zahrnují SV40 časné a pozdní promotory, promotor myšího metallothioneinového genu, promotor nalezený v dlouhých terminalních opakováních ptačích nebo savčích retrovirech, promotor bakulovirového polyhedron genu a jiné. Příklady typů jiných buněk vhodných v praktickém provedení tohoto vynálezu zahrnují E.coli, kvasinkové, savčí buňky jako jsou CHO ( vaječník čínského křečka), C127 (opičí epithel), 3T3 (myší fibroblast) , CV-1 (ledviny africké opice - Afričan green monkey kidney) a hmyzí buňky, jako jsou buňky ze Spodoptera frugiperda a Drosophila metanogaster. Tyto alternativní promotory a/nebo buněčné typy mohou umožňovat regulaci načasování nebo hladiny EPO exprese, produkce buněčně specifických typů EPO nebo růstu velkých množství EPO produkujících buněk za méně nákladných, snadněji kontrolovatelných podmínek.

Expresní systém, který si zachovává výhody savčí exprese, ale vyžaduje kratší dobu pro produkci vyšší hladiny exprese buněčné linie, se skládá ze hmyzí buněčné linie a DNA viru, který se reprodukuje v této buněčné linii. Virus je virus jaderné polyhedrozy. Má dvojvláknový cirkulární DNA genom o velikosti 128 kb. Nukleokapsid je tyčkovitě tvarován a nalézá se obalen ve dvou formách, neokludované formě viru prorůstajícího membránou a okludované formě, obalené v proteinovém krystalu v jádru infikované buňky. Tyto viry mohou být rutinně propagovány v in vitro hmyzí buněčné kultuře a jsou přizpůsobivé všem rutinním virovým metodám u živočichů. Medium buněčné kultury je typicky živný solný roztok a 10% fetální telecí sérum.

In vitro je růst viru iniciován, jestliže neokludovaný virus (NOV) vstupuje do buňky a přechází do jádra, kde se replikuje. Replikace je jaderná. Během počáteční fáze (8-18 h po infekci) virové aplikace, jsou nukleokapsidy shromážděny v jádře a následně prorůstají plasmovou membránou jako NOV, a rozšiřují infekci v buněčné kultuře. Navíc některé hunkleokapsidy následné (18+ h po infekci) zůstávají v jádře a jsou okludovány v proteinové matrici a jsou známy jako polyhedrální inkluzní tělísko (PIB). Tato forma není v buněčné kultuře infekční. Matrice je složena z proteinu známého jako polyhedrin, mol. hmotnost 33 kd. Každý PIB má přibližně 1 mm v průměru a v jádře může být až 100 PIB. V pozdní fázi infekčního cyklu je produkován tak velký podíl polyhedrinu, činící až 25 % celkového buněčného proteinu.

Protože PIB nehraje žádnou roli v in vitro replikačním cyklu, může být polyhedrinový gen deletován z virového chromosomu bez ovlivnění životaschopnosti in vitro. Při použití viru jako expresního vektoru byla nahrazena polyhedrinový gen kódující oblast cizí DNA, která má být exprimována a byla tak umístěna pod kontrolou polyhedrinového promotoru·; Výsledkem je virový fenotyp, netvořící PIB.

Tento systém byl použit několika výzkumníky, z nichž jsou nejčastěji uváděni Pennock a spol. a Smith a spol. Pennock a spol. (Gregory D.Pennock, Charles Shoemaker a Lois K.Miller, Molecuíar and Cell Biology 3:84, str. 399-406) popisují vysokou hladinu exprese bakteriálního proteinu, Bgalaktosidásy, jesliže je umístěn pod kontrolou polyhedrinového promotoru.

Jiný expresní vektor odvozený od jaderného polyhedr osního viru byl popsán Smithem a spol. (Gale E.Smith, Max D.Summers a M.J.Fraser, Molecuíar and Cell Biology, 16.května 1983, str. 2156-2165). Tito autoři demonstrovali účinnost svého vektoru v expresi lidského B18 interferonu. Syntetizovaný produkt byl shledán gly kosy1ováným a sekretovaným ze hmyzích buněk, jak bylo očekáváno. V příkladu 14 jsou popsány modifikace plasmidu, obsahujícího Autographa californica jaderný polyhedrosis virový (AcNPV) polyhedronový gen, které umožňují snadnou inzerci EPO genu do plasmidu, takže může být pod transkripční kontrolou polyhedrinového promotoru. Výsledná DNa je ko-transfektována intaktní chromosomovou DNA ze standardního typu AcNPV do hmyzích buněk. Genetická rekombinace vede k nahrazení AcNPVC oblasti polyhedrinového genu DNA z plasmidu. Výsledný rekombinantní virus může být identifikován mezi virovým potomstvem tím, že vykazuje DNA sekvence EPO genu. Tento rekombinantní virus má po reinfekc hmyzích buněk produkovat EPO.

Příklady EPO exprese v CHO, C127 a 3T3 a hmyzích buňkách jsou uvedeny v příkladech 10 a 11 (CHO), 13 (C127 a 3T3) a 14 (hmyzí buňky).

Rekombinantní EPO produkovaný v CHO buňkách jako v příkladu 11 byl čištěn běžnými metodami sloupcové chromatografie. Relativní množství cukrů přítomných v glykoproteinu byla analyzována dvěma nezávislými metodami [(i) Reinold, Methods in Enzymol. 50:244-249 (Methanolysis) a (II) Takemoto H. a spol., Anal. Biochem. 145:245 (1985) (pyridylaminace, spolu s nezávislým stanovením kyseliny sialové)]. Výsledky získané v každé metodě byly ve vynikajícím souladu. Bylo provedeno několik stanovení, poskytujících následující průměrné hodnoty, kde Nacetylglukosamin je, pro srovnávací účely označen hodnotou 1:

Cukr relativní molární hladina

N-acetylglukosamin hexosy: galaktosa mannosa kyselina N-acetyluraminová fukoza

N-acetylgalaktosamin

1,4

0,2

0,1

0,9

0,5

Je třeba uvést, že významné hladiny fukozy a Nacetylgalaktosaminu byly reprodukovatelně pozorovány za použití obou nezávislých metod analýzy cukrů. Přítomnost Nacetylgalaktosaminu indikuje přítomnost O-napojené glykosylace. na proteinu. Přítomnost O-napojené glykosylace byla dále indikována SDS-PAGE analýzou glykoproteinu s následujícím štěpením glykoproteinu s různými kombinacemi glykosidických enzymů. Po enzymatickém odštěpení všech Nnapojených karbohydrátů na glykoproteinech za použití enzymu peptid endo F N-glykosidasa, byla molekulová hmotnost proteinu dále snižována následujícím štěpením s neuraminidásami, jak bylo stanoveno pomocí SDS-PAGE analýzy.

In vitro biologická aktivita čištěného rekombinantního EPO byla zkoušena metodou G.Krystala, Exp.Hematol. 11:649 (1983) (biozkouška proliferace slezinných buněk) s proteinovými ukončeními vypočtenými na základě údajů o aminokyselinovém složení. Po vícenásobných ukončeních byla in vitro specifická aktivita čištěného rekombinantního EPO vypočtena jako vyšší než 200000 jednotek/mg proteinu. Průměrná hodnota byla v rozmezí asi 275000- 300000 jednotek/mg proteinu. Navíc byly také pozorovány hodnoty vyšší než 300000. Poměry in vivo/polycytemická zkouška na myších, Kazal a Erslev, Am.Clinical Lab.Sci., Vcl.B, str.91 (1975)/in vitro aktivity pozorované pro rekombinantní materiál byly v rozmezí 0,7 až 1,3.

Je zajímavé porovnat glykoproteinové charakteristiky uvedené výše pro rekombinantní CHO-produkovaný EPO materiál dříve uvedený v mezinárodní patentové přihlášce WO 85/02610 (publikované 20.června 1985). Odpovídající srovnatelná anylýza cukru popsaná na str.65 této přihlášky udává nulovou hodnotu pro fukozu a pro N-acetylgalaktosamin a poměr hexozy-.N-acetylgalaktosamin 15,09:1. Nepřítomnost N acetylgalaktosaminu indikuje nepřítomnost O-napojené glykosylace ve dříve uváděném glykoproteinu . Na rozdíl od tohoto materiálu, rekombinantní CHO-produkovaný EPO podle tohoto vynálezu, který je charakterizován výše, obsahuje významná a reprodukovatelná pozorovatelná množství jak fukozy tak N-acetylgalaktosaminu, obsahuje méně než jednujdesetinu relativníhó-Tnnožství hexoz a je charakterizován přítomností O-napojené glykosylace. Dále může být vysoká specifická aktivita výše popsaného CHOzískaného rekombinantního EPO podle tohoto vynálezu přímo vztažena ke svému charakterickému glykosylačnímu uspořádání

Biologicky aktivní EPO produkovaný prokaryotickou nebo eukaryotickou expresí klonovaných EPO genů podle předloženého vynálezu může být použit pro in vivo léčbu savčích druhů lékaři a/nebo veterináři. Množství účinné složky bude, samozřejmě, záviset na intenzitě léčené choroby, zvoleném způsobu podání a specifické aktivitě aktivního EPO a v konečné podobě bude stanoveno příslušným lékařem nebo veterinářem. Takové množství aktivního EPO stanovené příslušným lékařem je zde také označováno jako léčebně účine EPO množství. Například v léčbě indukované hypoproliferativní anemie spojené s chronickým selháním ledvin u ovce, bylo účinné denní množství EPO nalezeno 10 jednotek/kg po 15 až 40 dnů. Viz Eschbach a spol.,

J.Clin.Invest., 74:434 (1984).

Účinný EPO může být podáván jakýmkoliv způsobem vhodným pro stav, který je léčen. Výhodně je EPO injektován do krevního proudu léčeného savce. Odborníkovi v oboru bude zřejmé, že preferovaný způsob podání se bude měnit podle léčeného stavu.

U účinného EPO je možné, aby byl podáván jak jako čistá tak v podstatě čistá sloučenina, je výhodné ho podávat ve formě farmaceutické formulace nebo preparátu.

Formulace podle předloženého vynálezu, jak pro veterinární tak humánní použití, obsahují účinný EPO protein jak je popsán výše, spolu s jedním nebo více jeho farmaceuticky přijatelnými nosiči a popřípadě další terapeutické složky. Nosič(e) musí být přijatelné v tom smyslu, že jsou kompatibilní s jinými složkami formulace a neškodí jejímu příjemci. Je žádoucí, aby formulace neobsahovala oxidační činidla a jiné substance, o kterých je známo, že nejsou s peptidy kompatibilní. Formulace může být výhodně ve formě jednotkové dávkové formy a může být připravena jakoukoliv metodou známou v oboru farmacie. Všechny metody zahrnují stupeň uvedení do spojení účinné složky a nosičem, který tvoří jedna nebo více pomocných složek. Obecně jsou formulace připraveny homogenním a dokonalým spojením účinné složky s kapalnými nosiči nebo jemně dělenými pevnými nosiči nebo oběma typy nosičů a pak jsou, je-li to nezbytné, tvarovány produkty do požadovaného tvaru.

Formulace vhodné pro parenterální podání obvykle zahrnují sterilní vodné roztoky účinné složky s roztoky, které jsou výhodně isotonické s krví příjemce. Takové formulace mohou být výhodně připraveny rozpuštěním pevné účinné složky ve vodě za vzniku vodného roztoku a sterilizací roztoku v jedno nebo vícedávkových nádobkách, například zatavených ampulích nebo lahvičkách.

Zde používaný EPO/cDNA zahrnuje zralý EPO/cDNA gen, jemuž předchází ATG kodon a EPO/cDNA kódující alelické variace EPO proteinu. Jedna alela je ilustrována v tabulkách 2 a 3. EPO protein zahrnuje 1-methioninový derivát EPO proteinu (Met-EPO) a alelické variace EPO proteinu. Zralý EPO protein ilustrovaný sekvencemi v tabulce 2 začíná sekvencí Ala-Pro-Pro-Arg..., jejíž začátek je v tabulce 2 označen číslem 1. Met-EPO by začínal sekvencí Met-Ala-ProPrc-Arg...

Následující příklady' slouží lepšímu porozumění vynálezu, jehož rozsah je dán připojenými nároky. Je pochopitelné, že modifikace mohou být provedeny v uvedených postupech, aniž by byl překročen rozsah vynálezu. Všechny teploty jsou udávány ve stupních Celsia a nejsou korigovány. Symbol mikron nebo mikro, např. mikrolitr, mikromol atd., je u, např. ul, um atd.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1

Izolace genomického klonu EPO

EPO byl čištěn z moči pacientů s aplastickou anemií v podstatě jak bylo popsáno dříve (Miyake a spol.,

J.Biol.Chem., 252:5558 (1977)) s tím rozdílem, že bylo vynecháno zpracování s fenolem a nahrazeno tepelným zpracováním při 80 obupnfc-h po 5 min pro inaktivaci neuraminidasy. Konečný stupeň v čištění byla frakcionace na C-4 Vydac HPLC koloně (The Separation Group) s použitím 0 až 95% acetonového gradientu s 0,1% kyselinou trifluoroctovou (TFA) během 100 minut. Poloha EPO v gradientu byla stanovena gelovou elektroforézou a N-terminální sekvenční analýzou (21,26, 27) hlavních píků. EPO byl eluován přibližně 53% acetonitrilem a představuje přibližně 40 % proteinu podrobeného HPLC s reverzní fází. Frakce, obsahující EPO byly odpařeny na 100 μΐ, upraveny na pH 7,0 hydrogenuhličitanem amonným , dokonale štěpeny 2% TPCKzpracovaným trypsinem (Worthington) po 18 hodin při 37 stupních. Produkt tryptického štěpení byl pak podroben HPLC s reverzní fází jak je popsáno výše. Byla sledována optická hustota jak při 280 tak 214 nm. Dobře oddělené píky byly odpařeny téměř dosucha a podrobeny přímo N-terminální aminokyselinové sekvenční analýze (59) za použití Applied Biosystems Model 480Ab sekvenátoru v plynné fázi. Získané sekvence jsou v tabulkách 2 a 3 podtrženy. Jak je zde uvedeno výše byly dva z těchto tryptických fragmentů zvoleny pro syntézu oligonukleotidových sond. Ze sekvence Val-AsnPhe-Tyr-Ala-Trp-Lys byly připraveny (aminokyseliny 46 až 52 v tabulkách 2 a 3)

17mer 32násobné degenerace

TTCCANGCGTAGAAGTT a 18 mer 128násobné degenerace

CCANGCGTAGAAGTTNAC.

Ze sekvence Val-Tyr-Ser-ASn-Phe-Leu-Arg (aminokyseliny 144 až 150 v tabulkách 2 a 3) byly připraveny dva pooly 14merů, každý 32násobně degenerován

TACACCTAACTTCCT a TACACCTAACTTCTT které se liší v první poloze připraveného leucinového kodonu. Oligonukleotidy jsou značeny na 5-konec konci pomocí ³²P použitím polynukleotid-kinásy (New England Biolabs) a gamma ³²P-ATP (New England Nuclear). Specifická aktivita oligonukleotidú se měnila mezi 1000 a 3000 Ci/mmol oligonukleotidu. Lidská genomická DNA knihovna v bakteriofágu lambda (Laen a spol., 22) byla screenována za použití modifikace in šitu amplifikačního postupu původně popsaného Woo-em a spol. (47)(1978). Přibližně 3,5 χ 10⁵ fágů bylo umístěno v hustotě 6000 fágů na 150 mm Petriho misku (NZCYM medium) a inkubováno při 37 stupních do viditelných plakú, které jsou však malé (přibližně 0,5 mm). Po 1 hodině chlazení při 4 stupních byly duplikátové kopie vzorků plaků přeneseny na nylonové membrány (New England Nuclear) a inkubovány přes noc při 37 stupních na čerstvých NZCYM plotnách. Filtry pak byly denaturovány a neutralizovány lOminutovým pobytem vždy po 10 min na tenkém filmu 0,5N NaOH - 1M NaCI a 0,5M Tris (pH 8)- ÍM NaCI. Po vakuovém sušení při 80 stupních po 2 hodiny byly filtry promyty v 5 x SSC, 0,5% SDS po 1 h a buněčné zlomky na povrchu filtru byly odstraněny mírným škrabáním vlhkou tkaninou. Toto škrabání redukuje podstatnou vazbu sondy k filtrům. Filtry pak byly promyty vodou a prehybridizovány po 4 až 8 hodin při 48 stupních ve 3M tetramethylamoniumchloridu, 10 mM NaPO₄ (pH 6,8), 5 x Denhardtově roztoku, 0,5% SDS a 10 mM EDTA. ³²P značený 17mer byl pak přidán v koncentraci 0,1 pmol/ml a hybridizace byla provedena při 48 stupních po 72 h. Po hybridizaci byly filtry intenzivně promyty 2 x SSC (0,3M NaCI- 0,03M Nacitrát, pH 7) při teplotě místnosti a pak 1 h ve 3M TMAC1 10 mm NaPO₄ (pH 6,8) při teplotě místnosti a od 5 do 15 min při hybridizační teplotě. Přibližně 120silných duplikátových signálů bylo detegováno 2 dny po autoradiografiii za intenzifikačního screeningu. Pozitiva byla vybrána, shromážděna po 8 a znovu třikrát rescreenována za použití jedné poloviny 14merového poolu na každém ze dvou filtru a

127 meru na třetím filtru. Podmínky a 17mer pro umístění na plotnu jsou popsány výše s výjimkou, že hybridizace pro 14mer byla při 37 stupních. Po autoradiografii byly sondy odstraněny ze 17merového filtru v 50% formamidu po 20 min při teplotě místnosti a filtr byl rehybridizován při 52 stupních s 18merovou sondou. Dva nezávislé fágy hybridizují ke všem třem sondám. DNA z jednoho ztěchto fágů (zde označen lambda HEPO1) byla dokonale štěpena pomocí Sau3A a subklonována do M13 pro DNA sekvenční analýzu za použití dideoxy řetězec terminující metody podle Sangera a Coulsona, (23)(1977). Nukleotidová sekvence a odvozená aminokyselinová sekvence otevřeného čtecího ráměčku, kódující pro EPO tryptický fragment (podtržená oblast)jsou zde popsány. Intronové sekvence jsou uvedeny malými písmeny, exonové sekvence (87nt) velkými písmeny. Sekvence, které souhlasí smísty akceptorového (a) a donorového (d) střihu jsou podtrženy (viz tabulka 4).

Příklad 2

Northern analýza mRNA jater lidského plodu ug mRNA jater lidského plodu (připravené z jater 20týdenního lidského fetu) a mRNA jater dospělého člověka bylo elektroforezováno v 0,8% agarosovém formaldehydovém gelu a transferováno na nitrocelulozu za použití metody Dermana a spol., Cell, 23:731 (1981). Jednořetězcová sonda pak byla připravena z M13 templátu, obsahujícího inzert ilustrovaný v tabulce 1. Konecr byl 20mer získaný ze stejného tryptického fragmentu jako původní 17merová sonda. Sonda byla připravena jak popsal Anderson a spol., PNAS, (50)(1984) s tím rozdílem, že následující štěpení pomocí Amal (které produkuje požadovanou sondu délky 95nt, obsahující 74nt kódující sekvence), malý fragment byl čištěn z ml3 te^njlátu chromatografií na sloupci sepharosy C14B

O	O .	o	O
w3	o	V»	o
»4	n	<ř	Ό

ο

VI

	o	O
o	vi	o
a	o	<s
cn	*«4	0·*

-ί rt

Λί r—4

Β ρ

tí

Η

u	d	O	u	d	o	O	a
u	d	O	q	00	a	o	o
a	u	U	U	d	u	H	·<
00	0	00	q	q	<	a	u
d	q	d	d	q	o	t?	u
d	0 »	q	0	eo	o	a	o
<J	AJ	60	q	O0<	. o	a	<
U	cO	d	oo	q	a	a	a
q	tú	q	OO	q	o	H	f-
0	00	oo	AJ	q	<	b	ω
u		q ·	q	q	a	u ·	o
u	a	u	q	q	CJ	o	ω
q	a	AJ	q	a	a	a	ί-
o	u	00	q	00	o	o	ο
q	q	O	d	q	u	o	a
0	AJ «	d	AJ	q	H	<	<
o	0	u	q	q	o	u	a
00	d	00	q	q	cj	υ	u
q	u	u	q	60	H	H	a
u	u	d	q	d	CJ	a	ω
q .	0	u «	60	q	H	a ·	o
u	a	d	00	d	O	H	u
4J	o	q	AJ	d	CJ	a	cj
d	AJ	a	oO	AJ	cj	H	u
u	q	u	00	d	cj	Q	u
0	00 *	d	0	03	cj	CJ	cj
00	d	00	q	d	ω	o	ω
d	ϋ	AJ	q	q	-<	o	CJ
u	00	d	q	00	ω	co	CJ
a	c	u	q	AJ	o	CJ	<
u ,	w	u .	d	d	o		CJ
d	Q	q	00	q	CJ	<	f-
d	O0	u	AJ	d	o	o	CJ
u	o	a	q	q	cj	<	O
0	q	oo	AJ	d	o	o	ί-
<3	u ·	d	q	q	H	• O	α
o	q	u	00	00	a	H	H
q	AJ	OO	AJ	q	cj	0	o
U	Aj	d	q	d	a	0	CJ
d	AJ	00	q	q	o	0	CJ
a	q	00 ,	q	oO	H	S? ·	CJ
0	y	CO	u	q	o	0	CJ
0	00	q	0	00	o	0	a
U	d	u	AJ	q	a	0	CJ
00	y	q	q	q	ί-	0	CJ
q	q	00	q	q	α	• 0	u
AJ	fj	00	AJ	d	a	0	o
AJ	00	co	00	q	ω	<	<
O	d	a	q	q	o	0	o
d	eo	q	60	q	o		H
AJ ·	00	u ·	00	q	o	·	-<
u	00	u	d	q	ω	0	CJ
00	y	d	q	d	o	0	CJ
d	y	oo	q	q	u		CJ
q	tj	q	q	q	íl	0	CJ
u	oo	00	a.	q	o	* 0	u
a	XJ	q	d	q	u		CJ
a	00	q	q	q	u	u	H
00	00	q	AJ	AJ	00	H	ί-
d	d	AJ	q	q	00	0	α
u »		q .	q	AJ	M	0 ·	CJ
q	60	q	60	q	u	0	<
AJ	d	q	d	q	u	0	o
AJ	y	q	£0	00	u	0	CJ
q	q	q	00	d	u	0	u
00	y	q	q	q	u	• 0	CJ
60	q	d	q	d	ta	0	CJ
00	y	q	q	q	a	0	CJ
AJ	y	00	q	d	ta	0	<
q		AJ	eo	q	(3	<í	u
AJ ,		q .	a	oO	υ	0 »	CJ
AJ	fj	00	u	q	eo	0	H
<J	00	00	q	d	u	0	a
00 ·	60	u	00	q	u	0	CJ
d	00	q	q	AJ	ta	0	a

u	q
u	q
60	q
4U	d
U	oo
υ	00
u	a
u	d
6Λ	q
60	w
60 ·	60
U	u
O	u
o	q
60	d
u	60
u	q
υ	60
60	60
u	q
u ·	q
u	d
u	00
u	60
60	d
u	d
60	q
to	AJ
eo	U
u	60
u	00
60	00
tú	u
to	u
u	00
60	00
u	AJ
U	00
u	60
13	d
XJ	00
to	OO'
a	d
60	q
U	q
ta	00
CJ u	00
cj a	AJ
< ·κ	u
a =	d
a -i	u
H a	q
CJ >	oo
O	00
CJ rH	q
CJ CJ	q
CJ XJ	q
H O	q
< s	00
u	q
<	60
u	d
CJ	AJ
CJ	AJ
CJ	AJ
CJ	d
CJ	00
CJ	60
<	eo
CJ	60
υ .	q
o	00
o	d
CJ	eo
CJ	AJ

q	0
d	d
a	0
d	d
d	0
d	0
q	U
eo	0
60	d
AJ	q
d	q
ort	0
60	AJ
eo	0
eo	u
AJ	q
AJ	0
u	AJ
q	q
AJ	AJ
60	AJ
d	0
eo	0
60	0
eo	0
eo	0
eo	0
AJ	AJ
U	AJ
U	U
d	0
00	0
oo	a
eo	d
oo	0
u	d
00	d
d	0
q	0
q	0
eo	0
AJ	a
co	0
q	AJ
d	AJ
q	0
q	0
AJ	0
q	0
q	0
00	AJ
d	AJ
q	AJ
00	0
oo	a
eo	q
00	d
u	q
00	d
co	0
0	0
0	0
0	0
0	d
d	d
0	0
0	q
0	0
0	u
0	q
d	q
d	a
0	0
0	AJ
q	q

0	d	0	H	βω	0
0	d	q	Q	>ω	U
d	0	d		CJO
q	q	0	5	3<	O
q	d	0		r-O	u
d	d	0	0	ω	0j
q	0	0	d		O
a	q	q	q	u	u
q	q	0	q	u	CU
AJ	d	q	q	CJ	c
0	0	a	q	ω
U	0	0	0	a	<
q	d	d	q	ω
AJ	u	0	q	o
q	0	d	q	CJ	u
q	d	q	d	CJ	3
0	q	0	q	H	q
d	0	0	q	ω	ql
d	0	0	0	CJ	r-4
0	q	0	0	H	d
0	d	q	q	o	>
0	q	q	q	·<	o
0	d	0	q	O	U
d	q	d	0	ω	pu
0	0	0	d	u	3
d	q	q .	- q	• H	d
q	0	d	q	a	l-Ο
q	q	0	q	ω	ϊκ
0	0	0	q	CJ
q	0	d	q	u	O
q	0	d	d	CJ	3
q	0	0	0		q
d	q	0	q	CJ	r4
AJ	0	d	q	H	O
U	0	U	q	u	u
q	0	d	0	• O	£«
d	0	0	q	ω	3
q q	0 q	0 0	q q	CJ	q
d	q	0	q	ω	M
q	q	q	AJ	ω	q
q	0	q	q	Η	0
0	d	0	q	CJ	3
d 0	q 0	0 q	q q	Η ω	q U
0	0	d	q	• ω	3
q	q	q	4J	Η	q
q	q	0	q	ω	rJ
0	0	q	q	ω	q
q	q	u	q	ω	q
0	d	q	q	Η	0
0	0	0	d	ω	3
0	0	q	q	ί-	q
q	q	0	q	ο	—
q	0	d	0	ω	3
q	d	0	d	• t-·	q
d	d	q	q	ω	—·
a	0	q	d	ί-	3
q	d	q	q	Η	q
a	0	d	q	ω
0	0	q	q	CJ	3>
q	q	0	q	CJ	q
q	q	d	q	Η	H
0	0	q	q	CJ	3
d	0	0	q	t-·	q
d	q	0	0	• CJ
q	q	d	q	CJ	CL
d	q	0	q	CJ	q
0	0	0	0	ί-	H
q	d	0	d	ο	d
q		d	d	u	•-J
0	0	q	0	ω	<
d	q	q	0		O
d	q	0	d	CJ	q
0	d	0	d	CJ	cu

CTCATCTGTCACAGCCGACTCCTCCACACCTACCTCTTCGAGCCCAAGCACCCCCAGAATATCACGgtgagnccc 1350 Leu 11 eCysAspScrArgValLeuGluArgTyrLeuLeuGluAloLyaCluAlaGluABnIleThr cttccccagcacattccacagaactcargctcagggct tcagggaucccctcccagacccaggaacctggcactt:

.ím X27

o		a			o
o		vn			o
tn		vO			<a
—					••X
u	y	y	j:	u	ca
(J (4	y <3	3	H a.	d d	ca d
d	CO			co	ca
XJ	y	o	•5	d	kt
d	u	<	o	co	d
o	O	a	M	ca	ca
u	υ	y	CU	y	a
d	u	u	—1	y	co
d	d	<3	u	d
d	ca ,	. G	>	u	a
y	ca	F-t	U	u	co
u	CO	G	J3	kt	d
y	d	<	F-t	xj	u
a	o	o	«	u	00
co	u	t-	«Η	u	d
00	u	<	►M	o	co
y	u	El	a	ki 1 t	co

>υ β3

ÍH

Ο

CU ca «3

Η α

<3 xj <0 «3 ca <3 ¢3 xj d

υ η

χ/ υ

y υ

υ y

υ ca xj

U d

y σ

ca d

u u

co d

a ca co co u

ki ca a

ca

XJ co oa ca co kt co

CO co

	O m σι	o o *·* <N	o un <N
ca	ca	ca	d	Q	d
ca	d	y	d	y	ca
u	d	u	d	XJ	co
u	co	co	co	XJ	co
u	u	co	d	d	d
u	ca	d	d	y	ca
co	ca	ca	d	XJ	ca
d	d	XJ	d	XJ	d
ca	y	XJ	co	d	y
u	u	y	d	y	ca
kt	ca	d	d	XJ	ca
u	d	d	d	XJ	ca
ca	W	co	d	d	ca
u	XI	ca	Q	y	d
XA	d	d	d	XJ	ca
d	d	y	y	u	XJ
d	d	y	XJ	d	y
ca	d	y	o	y	• ca
d	d	ca	XJ	XJ	Xj
ca	d	d	ca	y	y
ca	d	ca	y	d.	ca
00	u	u	y	y	ca
XJ	XJ	XJ	u	y	ca
d	XJ	y	y	y	ca
co	d	co	ca	d	u
d	u	y	ca	y	XJ
ca	d	XJ	d	XJ	y
u	d	d	ca	y	CO
u	d	ca	y	«	XJ
co	u	co	ca	y	ca
ca .	d	d	d	XJ	cO
y	y	co	ca	XJ *	XX
d	y	ca	d	d	y
ca	XJ	ca	y	u	y
a	y	y	a	u	ca
ca	u	co	co	XJ	d
XJ	d	co	u	d	y
U	y	d	ca	u	XJ
ca	y	ca	d	XJ	y
ca	y	XJ	y	d	ca
d ,	y	y	u	u .	XJ
u	y	ca	y	XJ	ki
U	u	co	y	XJ	ta
o	d	d	co	CO	ca
u	ca	d	d	u	XJ
d	d	co	y	d	y
d	00	ca	y	XJ	M
u	XJ	y	u	d	XJ
d	Od	XJ	y	d	y
k>	d	XJ	d	co	y
y ,	xj	d	y	ea4	d
XJ	d	XJ	co	XJ	XJ
ca	y	d	XJ	d	d
u	ca	co	y	XJ	y
d	d	d	d	ca	ca
u	y	y	y	w	y
y	ca	y	y	y	XJ
u	ca	y	d	cd	d
ca	d	XJ	y	ca	XJ
co	XJ	CO	d	ca	XJ
d «	y	d	y	<3 »	y
ca	y	XJ	u	co	XJ
d	d	ca	d	XJ	ca
o	d	co	co	d	d
co	y	XJ	XJ	d	d
y	y	ca	ca	XJ	u
ca	d	ca	XJ	d	d
ca	ca	XJ	y	d	d
ca	d	o	ca	d	y
XA	y	y	d	Q	ki
u.	u	ca	CO	d.	kt
y	u	XJ	y	ca	d
ca	w	co	co	d	y
y	ca	ca	d	d	u
y	d	XJ	y	d	ki

βηβββΓ gnca t ccc tcagc t gac tαεεπβΟβtccac r ccc c fitagClCCCCCACCAGGCCCTACAACTCTCCCAC ValClyClnClnAlaValCluValTrpCln pCCCTGCCCCTCCTCTCCCAACCTCTCCTGCCCCCCCACCCCCTGTTCGTCAACTCrrCCCACCCGTCGCACCCC 2400

O u

cu r-i

CJ

Q.

U

H

O u

a, c

rH

CJ

M

O

W

U

4)

Vi ** a

<

rt >

□ rt a

rt o

>9 ιΉ e

oo u

o •J rt >

a o

M

6)

V) □

rt u

a <

4» ►J

O	o
νΠ	o
m	r*
íN	CN

υ	c	O	u	fci H cn H
«ς	r-4	rt ·	a	W U U C3
υ	CJ	cj	a	a < >,H
υ	a	to	H	Μ Η E- O
CJ	-¼	CO	b	a cj —i h
CJ	<	rt	H	-4 H « U
<		a		μ o >g
υ	<-4	•a	a	e < ee<
CJ	CJ	XI	CJ	-1 CJ M cj
CJ	3	to	a	-d a < y
f-i	a ·	rt		> a a <
G		CO	<:	ΜΗΛΟ	•
	a	co	υ	u H a· H
G	i-l	Q	a	ca cj 3 <	to
CJ	<	rt		* H o u	u
a	co	AJ		-2 o u <
CJ	u	(J	co	e co o	o·
CJ	<	to	rt	<í	U3
H	3	XJ	u		·<
(->	a	u	CO	' υ <*$2	>%
CJ		a	to	C3 u <3
CJ	3	u	AJ	υ < <J	u
H	a	co	XJ	CJ o <	u
a	-1	to	a	a J= ω	•3
ί-	u	to	CJ	ř-· P. <	H
α <	P	a a	AJ <J	£ U C3 o ω	to U
o	U '	co	u	< £- <
CJ		Π	AJ	CJ O.JJ	<0
<	r-·	to	U	w a
CJ	3 ·	to	U	CJ -d H	CJ
H	rt	to	oO	H a	a
CJ	J	co	XJ	G r-l J2
CJ	M	a	U	u < H	<
o	rt	a	u	f-. M CJ	3
<	W	to	XJ	G Λ <	rH
a	CO	a	O	< ί- $?	CJ
CJ	U	o	u	CJ O j
CJ	<	xj	rt	H r-l «	ř“4
	3	to	to	«4 r“4 S2	CJ
£	rt ·	u	o	5 w <	U
CJ	U	o	to	υ j= y	J3
CJ		xj	η		H
CJ	•H	u	u	*6 oo y	Va
CJ	CJ	u	to	CJ M <	>>
H	u	u	u	CJ < H	ř-4
CJ	rt	o	a	CJ 3 2	3
-a	cn	u	rt	H a H	O
CJ	»—<	to	o	υ J u	«J
H	a	AJ	to	< o y	(Λ
CJ	> ·	u	cO	CJ M <	ϊη
CJ	□	u	XJ	CJ frl <
CJ	i-M	co	to	H a y	3
CJ	<	AJ	XJ	CJ <-1 H
	(4	u	U	cj < y	•J
		AJ	AJ	H a y	(0
	u	AJ	XJ	CJ r-c <
fH	CU	u	XJ	cj < 5	•U
<0	W	rt	a	-a u «ί
CJ	-s	u	a	o a y
CJ	»-i ·	rt	u	H M cj	CJ
H	63	to	AJ	cj a cj	tO
CJ	>.	co	XJ	CJ r4 CJ	w
	(0	a	u	o < CJ	<
<	«*4	co	0	<J a y	3
CJ		rt	AJ	O r4 H	rt
CJ	3	to	AJ	o < H	rJ
H	rt	cO	rt	(-< o* y	rt
CJ		rt	AJ	< ta H
CJ	c	AJ	CO	cj < h	C«
<	«Η ·	to	u	< o H	··
CJ CJ	a 3	rt to	o AJ	a m 5 3 CJ C, 5 Τ'
t->	OJ	AJ	to	h o y	H
CJ	U	ta	XJ	CJ M-CJ	rt

o

CS cj a

o a

o cj ία cj řcj <

o o

o

CJ cj cj cj a

ία cj o

<

CJ <

CJ u

.o

H o

eH o

o

H

H <

a υ

CJ <

CJ řCJ

CJ

CJ

CJ «a

CJ a

<

a cj

H <

řa o

CJ

CJ u

CJ <

CJ $4

a o

kT n

«a cj o

o o

<

CJ δ

% o

<

cj ία a

<

u

CJ

CJ

K a

<

o o

-a a

a o

-a o

CJ o

o o

CJ

-a o

tC-l

L)

CJ

CJ

CJ · CJ CJ eCJ

-a cj

CJ

CJ

H <

CJ a

-a a

<

υ

H

CJ

H <

O <

CJ < · < CJ CJ

CJ υ

CJ

CJ CJ < 5 o < H CJ G CJ CJ · <

S š δ <

f- CJ cj E CJ H

Q P O H CJ · CJ < 5

O «= CJ O H O

	υ <	SŽ	δ
	2	a
	o	«a	h
	<d	o	*:
	CJ	• H	f-<
u	CJ	H	o
o	{1	a	h
ί-	CJ	a	CJ
α	CJ	CJ	t*
CJ	<{	CJ	H
o	o	a	r
<	{1	CJ	f-<
a		<	CJ
a	U	o

3 <· CJ CJ O υ

Cl o

u el a

o o

a u

co η

u u

u u

u a

c>

Cl u

u w

υ co >CJ cd

c.

Λ4

O

PC

-a cd

Já r>

cd

H v O,1N NaOH-0,2M NaCl. Filtr byl hybridizován k přibližně 5x10® cpm této sondy po 12 hodin při 68 stupních, promyt ve 2 x SSC při 68 stupních a vystaven 8 dnú intenzivnímu screeningu. Jediná markerová mRNA o 1200 nt (označeno šipkou) probíhala v sousední dráze (obr. 1).

Příklad 3 cDNA z jater plodu

Byla připravena sonda shodná se sondou popsanou v příkladu 2 a byla použita ke screeningu cDNA knihovny jater plodu připravené ve vektoru lambda-Ch21A (Toole a spol., Nátuře, (25) (1984) za použití standardního screeningového (Benton Davis, Science, (54)(1978)) postupu. Tři nezávislé pozitivní klony (označené zde lambda-HEPOFL6 (1350bp), lambda-HEPOFL8 (700 bp) a lambda-HEPOFL3 (1400 bp) byly izolovány po screeningu 1 x 10 ⁶ plakú. Celý inzert lambaHEPOFL13 a lamda-HEPOFL6 byly sekvenovány po subklonování do M13. (Tabulka 7 a 5) . Pouiže části lambda-HEPOFL8 byly sekvenovány a zbytek byl považován za shodný s ostatními dvěma klony (tabulka 6). 5-konec a 3-konec netranslatované sekvence jsou uváděny malými písmeny. Kódující oblast je zapsána písmeny velkými.

V tabulkách 2 a 3 je dedukovaná aminokyselinová sekvence uvedena pod nukleotidovou sekvencí a je číslována tak, že číslo 1 platí pro první aminokyselinu maturovaného proteinu. Předpokládaný vedoucí peptid (leader peptid) je označen zápisem celých zkratek pro zápis aminokyselin. Cysteinové zbytky ve zralém proteinu jsou dále označeny SH a potenciální N-napojená glykosylační místa hvězdičkou. Aminokyseliny, které jsou podtrženy označují ty zbytky identifikované N-terminálním proteinovým sekvenováním nebo sekvenováním tryptických fragmentů EPO jak je popsáno v

Tabulka 5 CncagRaag gacgngctgg gacdgagacg cggggaCgaa

o	H	> ϋ	01 U	u H
—*	α	3 o	O X<L	0 3 0
fr«	u	o u	N J <	-τ H <
co	H	=3 3	<« 3	3 O
X	CJ	U) ř-	— a	— Í3
u	H	3 O	< 3	-4 <
3		3 3	3 O	c Z
•J	3	< H	— <	« «2 <
		> O	O 3	< -í
	«
	JJ U	o <	3 O	3 9
	O	a 3	O H	—4 -ť
	u	tp 3	3 H	3 3
	«4
	JJ	3 O	3 3	C £
		Ul Η	O H	« <
		-I 3	3 3	< <
	a
	u 4	x a	P 3	3 O
	jj	3 3	X <	O f-
	U	o o	ř- H	3 H
	cd
	eo jj	3 3	U 3	u 3
	a	3 H	P 3	O 3
	u	3 3	< <	ín <
		O f-	3 3	91 3
	¢3	d O	—4 *0	= X3
	π	tP 3	3 3	W 3 H
	u
	M u	3 3	3 3	91 O
	4J	tu 5-·	a 5-	—i <L
	O	3 3	3 3	= 3
	a
	co u	d O	—< 3	3 <
		LU O	rj H	— <
		tn H	> 3	3 3
	υ υ	3 3	efl <	fl f-
	co	LU í—»	O U 3	0-4 3
	u	3 3	— < 3	,r-« < 3
	o
	u <J	3 O	P 3 '	tn f-
	u	LU S->	3 3	3L X3
	u	3 O	tn <	V) 3 Γ-
	a	d o	C.O	ΧΟ
		LU O	01 <	*< ^J
	u	tn H	< 3	o o
	u
	u JJ	3 O	ο» H	u CJ
	JJ	tU H	= X3	X CJ
	u	3 3	tn 3 H	H <
	u
	(9	3 3	o O	u CJ.
	u	tu e-	— ř-	X CJ
		3 3	— . <	r· <
	u	3 H	3 3	CJ o
	co a	tu H j a	a í3 3
	u
	a <J	lp 3	es 3
	o o	d 3 ¢-1 t->	p 3 < 3	4C 0 <í < <
	JJ
	u	3 3	0 <	3 3
		tU H	P 3	RR *í
		3 3	a. 3	3 O
	u
	JJ co	0- 3	3 <	<3 3
	JJ o	d 3 H é—	p 3 LP 3	-- 3 < O
	co
	c 0	C 3	0 3	3 3
	co	3 3	-4 3	-4 <L
	w	< 3	— < O	3 O

(9	•J		3	3	O	u	ř-	o	1j	CJ
	o	o	4J	H	o	o	o	<N	CJ	CJ
.<	a	co		3	**	ω		«Η	co	H
c	o		d	3			o		0	a
	<			3		d	ί-		**
3	o		<	3		>	ο			<

c O	e o	a o	(9 3
		j-í.CJ	-4 CJ
o a	3 3	< o	< 3
>\O		0 *ť	3 3
o	—4 3		-4 <
o o	o o	3 J	3 3
Rj CJ	60 O	O.f-	01 3
O H	U 3	« <
> O	< 3	< O	3 <
3 CJ	3 O	3 3	C 3
	o H	a ř-	-4 <
a 5	U 3	> 3	3 3
u CJ	-4 3	o E-	ra 3
CJ t*4	rt H	-4 <L	-4 3
X <	> 3	=: 3	< 3
co o	rt ř-<	3 3
u cj	-4 3	e H	o
< <	< 3	3 3	<J ο
« o	3 <	C 3	□ a
>1 <	— <	-4 «5	a r-»
u <	3 3	3 3	u-ϊ CJ
O- CJ sJ	P 3 3 3	3 3 3 ř-·	a (-» Ή CJ
Η H	tn H	3 3	< o
d cj	3 3	3 O	O eo CJ
CJ	O a H	O P O	— U CJ
< CJ	)-* —L 3	σι p U	-* < CJ
u f-	3 3	3 3	□ H
X <	y H	-4 <	CJ Γ-*
Η H	~ z:	3 3	R-a CJ
0 CJ	cj 3	C. 3	3 CJ
•S <“*	— O	p o	O H
CJ H	< 3	ί- ί-	U CJ
C H	3 3	ο 3	Ui 5-
« <	o e-	P 3	JS CJ
< <	3 3	eu 3	H <
rJ t-»	X 3	C 3	U CJ
d f-»	-4 3	— <	X CJ
> CJ	O 3	O O	H <
0 <	C 3	ρ cj	3 a
X <	—4 <	U 3	° r:
-J <	3 3	W f-	J cj
í* CJ	e.3	P f-	u O
JS CJ	P o	<u o	CJ CJ
t-* <	Č4 p4	tn t-	CO <
c. a	— O	3 3	CO CJ
0	cj ř-	4! -Λ <	u CJ
< O	> 3	e <	< u
o <	3 <	-1 u	3 b
u U	<	n f-.	a H
CJ CJ	3 3	> 3	R-ί u
•4 CJ	-4 <	3 3	X CJ
d H	fj Ϊ—	3 č-	—CJ
> CJ	> 3	3 H	CJ Q

Π0 1Ó0

Pru Ριο Λιψ Ala Ala Ser Ala Ala Pro l.eu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys cct cca cat c:cc cec tca cct cct cca ctc cca aca atc act cct gac act ttc CCC ΛΛΛ o fl U <-> o _· < u

60	00	υ
(3	xj	xj
a	00	XJ
o	00	u
00	00	u
OO	00	xj
XJ	G	<a
00	g	XJ
co	<0	eo
(3	u	XJ

>»a Ή U O o u < Ji u b U Si < Η H u

u u

u u

u <3 o

o

00 g 00 a a XJ	a 00 a 00 (3 eO	XJ u 00 (3 G 00	CJ CJ eo u 3 eo	XJ XJ O <3 00	a 00 XJ XJ υ u	00 XJ XJ XJ XJ 00
o	(3	<3	u	í3	u	<3
00 ?3	0 a	00 <3	XJ u	00 00	g a	<3 u
u	XI	00	3	XJ	eo	o

³ P cí f-l J CJ

0} O

3Š (3

U

CJ u

XJ n

u ce eo u

u u

co eo eo eo eO xj

U <3 eO eo (3 eo <3 (3

U <3

XJ (3

XJ CJ io eo u b eo o ti o

eo o υ i3 · b (j eo eo ifl c3 eo

O0 <3 00 xj cj eo rt eo b eo eo J eo xj cj ίο eo *J υ co u

Tabulka 5 (pokrač.

-I o Q CJ

O v» ttCJ b U < cj

OJ u

H

CJ b CJ CJ CJ Czl H b CJ >> < Η ίCJ fi o

eo < b o < cj

CJ ε S ³ p

CJ H _] cj

eo- 4J	a XJ	u u	OO (3	u 00	a oo	XJ XJ
a (J	OO u	O0 CO	a 00	00 a	cO 00	G G
<3	a	00	Π	XJ	(3	G
a o XJ 00 XJ	g u <3 (3 00	eo a CJ XJ G	O0 <3 G u u	CJ (3 U Xl a	a XJ <3 g u	XJ G <3 G eo

00 XJ	XJ	XJ	eo	eo
00	G	<3	eo	(3
00	G	G	eo	00
(□	u	ř3	a	XJ
G	G	eo	00	G
(j	(3	XJ	x>	G
	G	<3	XJ	OO
<	G	<3	G	G
♦ O	00	G		(3
H	G	00	a	00

«o eo < Ό b CJ — .< <

W < < CJ xo -i a cj u b < Ji CJ f- <

ca a b CJ < <

η υ CJ H i3 eo xj eo

CJ b

CJ «3

CJ a eo eo eo cj eo u u

XJ <3

G '	(3	G	<3	xj	G
G	G	G	i3	XJ	XJ
G	G	CO	eo	00	G
G	eo	00	eo	XJ	XJ
XJ	XJ	eo	eo	G	eo
G	eo	<3	u	G	00
G	a	G	G	<3	<3
G	G	«3	eo	XJ	G
<3	G	G	u	XJ	G
G	XJ	XJ	í3	XJ	XJ

XJ u

eo eo u

cj

XJ

O

CJ eo !3 aj a

a eo a

XJ 3 cj cj eo u eo i3 eo o eo u eo a

XJ 3

3 eo eo

CJ eo

Ϊ0

(3	G	eo	cj	í3	G	«3
	r3	XI	CJ	00	XI	G
	G	n	ea	G	u	G
CO XI eo XJ XJ	f3 eo eo XJ <3	co 00 (3 «3 XI	a se ta o IQ	eo 00 <3 00 eo	G a 00 u 00	<3 (3 eo eo eo
G 00	G U	G xi	ZO ea	xi XJ	XJ G	XJ eO

aacctcaccg acaagaactg »43 «5

Λί <0

H

CO

U u

CO

ZA

CJ

u cj 00 u

u co AJ CO

0 oi x

X 0 0

X 0 0 0 0 0

0 CM

3 0 33

0 <T

J= 0 H

0 Ό

3 <

0 0 0

tO

to

0

u

CJ α u α

α u u u

M > 0

X 0 X

3 ω

0 X 0

3 0. 0 0 < 0

CJ

0

—i 0

0 < 0

CO 0 u AJ	co co cO a	3 0 0	-ť < 0	0 >	0 X 0	3 0	0 < 0
u	co
CO u	u α	Vi	0	0	<	3	0
CJ	co	1-1		C£	0	ii	X
aj	to	««·	0	X	0	0	e*
u	co
to	CJ	0	0	3	0	3	0
				Ci2	X	ti	X.
		>	0		0	0	0
u	u
u CJ	CJ u	X	0	X	0	Ui	0
CO	AJ	0	0	0	0	*»·
α	0	0	0	0	0		t-»

C H ³ 2 <-i <

o o c

Ul <

O

XX xo

O o

o

X

O <

to o

u □

u

CA ťj

CA υ

u « too u o < <

CJ co	CO u	to 43	rt ř-í	3 0		ta 0 X0 0 X
Cí	0 0	r-t α	< 0
to	u	CO
co co u CJ	d cj CO aj	CO u co CJ	3 0 0	0 X 0	□ CJ	0 0		a w-1	0 < 0
Π	0	CO
CO co	α CJ	co (0	10 Ξ	0 0	<0	0 X		3	3 0
			co	X	>	0		0

600 u o < <

C.0 Ui o X X

u u	co co	u CJ cO	3 0	0 H	O	co U	< 0	0	a x -1 0
co α ’ ·	. u	co	0	0		<	0	n	< 0
co	’ co	u
CO ' u	co to	u o (J	3 0	0 X		u 4J	0 0	—	« X X0
u u	co AJ		0	0		w	<	V)	0 X
AJ	co	cO
			d	0		c-	0		x0
			0	0		a	<		0 0
CJ	0	co	(Λ	X			0		0 0
<J	0	co
AJ co AJ cj	u co to (C	α to AJ 0	3 0 0	0 X 0	w	α O	X 0 X		U. 0 0 0 X <
to	0	CO
v co o	u AJ u	0 AJ CO	3 0 0	0· X 0	•	03	0		Ul 0 0 0 X <

o —· u-> <

Ui

X e->

c

CJ <

í->

X

u a u	<J AJ CJ	CA ti u	3 H ω (m	3 0 a x 0 0	CJ •H	a	«< x -S 0 <
•J	0
co	AJ	u
u	CJ U u co	CJ y	a·	0	60 0		H	Ui 0
<J CO 0	CO O	Sd H	0 X	U 0 .< U	* 3 <	3	0 0 X <
cO	u	00
AJ	CJ	CJ	-3	0	O <	□	0	X0
			04		Ul 0		·<	« <
			U	0	X 0	a	0	< 0
υ	co	CO
cO	a 0	co y	ÍM	0	0 <	a	0	0 <
u	y	cd	0	U. 0		u	u 0
to AJ	c*3 CO	CJ	P	X	X 0	<	0	X 0
U	CO	a
CO	AJ	CJ AJ		0	3 0	a	0	0 0
O	CJ			0	-4 0	-H	<	3 X
AJ u	*J u	CO	<	0	— < 0	O	0	3» 0

Val Clu Val Trp Cln Cly Leu Ala Leu Leu Ser Clu Ala Val Leu Arg Cly Gin Ala Leu

CTA GAA CTC TCG CAG CCC CTC CCC CTC CTC TCG CAA CCT CTC CTC CCG CCC CAC CCC CTC σ u υ υ « 5 <μ « ο ·— cn Η ·μ J <

Ο ρ υ < α □ ο —I «ί ο u « ο γ- Ο < Ο

Ο	« ο	>, υ
ο	ί5 £	-< ο
ο	Ρ ί-	ο ο

ο ο ρ

JS ρ

Ο. Ρ a < < Ο β ο

3*3

0.0 η «£ <.ο ρ υ >, < Ρ ίίο ο

V _Ι ο

ίο « Η —ι < =: ο (3

Ή <

ο	2*5	υ ο Ρ	3 ο 61 Ρ
ο	ο Ο	►— -ί	Ρ Ο

>ο

Λ

Ρ

Já

Ο

0.

Ο ίο \ο «3

Já α (-> -ρ ω < ο

Ρ <

>>

»Η ο

<:

ο ο

Ο ο Ο. Μ Ο ό &. υ ο «ο — ρ ο — < υ ο

ίο ο ωο ιπ ρ ο < ο ο

X»

Λ

3 Ο Ρ -ί Ο ο	ρ ο	25 ρ υ	3 Ο « Ρ Ρ Ο
C.O Ρ Ο Η ί-	3 2 35	β Ρ 33	ν υ ň Ρ Ρ Ρ
ο Ο ρ ο Ρ Ο	Ρ Ρ .2 Ο ί- <	β Ρ 33	c b ss
C ο	Ρ Ο	* á	Ρ ο
—> «á ο ο	j: ο ί- <	4J ο cn Ρ	α ο «η ρ
Ρ ο	3 Ο	Λ Ο	Ρ Ο
α υ Μ Ρ	Ο Ρ Ρ ο	33	>\ < Ρ Ρ
Ρ ρ	ρ υ	α ο	~ι ο
61 CJ	ο ο	«-* ο	<3 Ρ
W Ρ	cn <	< ο	> ο
- Ο	ω υ	®·Η	60 <
a -á	Ρ ο	w	ρ ο
< 5	< ο	< ο	< ο
— O α ρ > Ο	·3£ Ρ ο	0 < Ρ ο Ρ Ο	<3 Ο — Ρ Ρ Ρ
3 α u Ρ	>υ — ο	0 Η Ρ ο	3 Ο 4Í Ρ
•4 ί—	α ο	Ρ ο	Ρ Ο

G

X

G tZ o

g a

g c

co	o	H	X	o
w	ci	a	3	o
cd X v u		a	o	a
g	tn	Ι-	o	o
u	x	α	iii	H
u	a	H	»«·	a

tn o u H o x a < H <

c O. o — u %o < o

3,0

Cr*

O G H O G O ~* tn <

rs <

ca = o a —i <; — U C H au < o > o

Tabulka

X	X
G	X	a <	o a
G U	X a	-i o	< Γ— > a
G	X
X	u
u	a	ΙΛ O	o <
G	X	>- <	cz a
UI	X	= a	o- a
G	X
X	G
		o a	a a
		< H	Id H
		> a	-j a
G	G
G	I θ
G	1 u	> u	> a
X	U,	— a	a a
G	G	a a	a o
X	X	φ
G	(3
O	X	r*· ř* O	a a
C	G	xi X H	3 H
G	G	1 S <	o a

3 la -*K
O	o
3	o
G	Cm
-J	H
□	a
O	ί-
	α
G	a
X
H	CM
X	a
u	a
<	<

Crt

— <	a		a	>
a a	o o	o	a	u		o
S H	a	eoa	c	ř-	‘Λ
«1 <	nj Η	u	o		<	X
< <	> o	<	a	<	a

o 3 H -j a

C

			O H	□	o
G	X	X	cZ CJ		<
X	G	O	z. u	o	o
X	G	X
X	SJ	X
X	G	G	3 a	3	o
G	X	X	uj h	3	J-·
G	U,	G	a	U	a
a	G	ϋ
X	G	X
x .	G	Q	cz a		a
			zz a		—«
			ví H	>	o
G	X	G
u	X	G	a a	XI <
X	«j	-Λ	3 s->	O ·-	a
rs	G	X	a	— <	a
t2	X	G
X	X	G
G	X	G	3 a	uia
U	X	G	« {->	3 10
U	u	íS	—· a	tn	<
	X	X
			cz a	c.	u
			3 a	Cl<
	U	X	V. H	<	a
	G	X .
	G
	X		3 a	ts Jř-»
	X	3	— h·	33 Xiw
	¢3	G	a	tn <J	Γ*
	G	X
	G	G
	4J	UI	3 a	a	O
	G	X	u H		H
			u a		<
	G	o*	3 f->	3	a
	u	rs	— ϊ-·	G	Cm
	G	G	-j a	-J	Q
	u	G
	G	G
	G	G	e- a	.·	a
	G	X	cz a		o
	X	G	7- t~	<
	G	X
	G	G
			3 a	c	<
			UJ ř-	Uiu
			a	c.	a
	X	X
	a	X
	G	G	c. a	0 ;
	a	G	cz a	u:	a
	X		č- f-	*	a
	X	?;
	o	G		i
	G		< a	d !	o
	G		_j a	— 'a
	G	X	< o	— <ia

u a a a w <

n a 3 >, a w a H •53 a a (3 H o — a n < a w H 3 5>a m a h >(U al a

u. a 3· a u O _= o H <

310 — H >-> <

- f·Λ|<

O —1< aia cla — ΙΟ < a

o	o		H
H	.3 Γ-»	M	<
	> a	=	a
O	a H	=	o
o	μ- Q	Z	Cm
<	< O		O
a	3 <	=	o
<	— <·		<
<	O O	a	u
o	u o	-»	a
P	g a		tM
	tn H		O
o	3 O	-	O
o	O G H	a u, a
1«	rs 'j
z.	3 O	310
'<	G H		<
Cm	-J U	O	o
a	c o	£.	··
Γ-	w	u	o
Η	< O
Cm	3 U	z	o
<:	3 r*	G	o
<	-4 U		o
Cm	>> X
H	*- O		<
a	o o	«Μ	a
	s o	u	a
<?	<	G	o
*	c o	in	H
a	C.Z3	u	ř*
a		oi a
<	s* í—
a	*	=	O
<	*S H	ťí zl<
a	Z* «3	<<
<	3 *5	-	O
a	ZZ		•M
o			o
a	—» <	3Í

□

Jdř* <e o ** <j < o

O 3 H -J O rs F* —4 o < O o xo

GlO XlO r- <

X o ·* O

O o σ ·λ < — — <

Xj	α	C	CJ	ui	CJ	CJ	υ
u	U	CO	*7	o		u	xj
C3	33	Π	g	CJ	rj	CJ	Ul
o	Ul	CJ	•j	υ	υ	CJ	g
fí	u	Ul	u	π	CJ	CO	ul
c	O	u	?3	υ	CJ	30	XJ
u	CO .	XJ	X	α	u	υ	Í3
u	’rj	u	<7	CJ	CJ	g	ui
	O	f*	Ul	CJ	CJ		CJ
u	G	fl	Ul	π		u	XJ

=-o •.-,κ < u nu !-> <

Zl *—1 » * •J

J □

SJ o

J-t

CJ

u	CJ	g	Ul	g	u	Γ3	co
o	u	to	υ	o	«J	30	XJ
u	CO	n	co	CO	u	xj	XJ
u	<o	CJ		XJ	α	Uf	Uf
u	v	c	υ	C	íj	G	XJ
o	u	co	CJ	CJ	ej	G	CO
u	g	α	a	XJ	α	u	CC
α	CJ	g	CJ	ui	cc	g	α
α	α	u	G	Ul	co	G	u
α	o	Ul	CJ	í3	Ul	CJ	o

rt	ul	ta	JO	α	G	Π	XJ
υ	G	u	G	α	u	CJ	CJ
o	XJ	u	XJ	<9	a	Π	CJ
XJ	□	<0	XJ	u	co	α	33
rS	CJ	<3	řj	CO	XJ	g	CJ
XJ	CJ	CJ	o	XJ	.-3	co	XJ
rs	co	CJ	CJ	υ	CJ	CJ	α
u	CJ	—	O	u	CJ	xJ	υ
CJ	«3	CJ	Π	G	• A	30	ui
CJ	CO		CJ	í3	u	co	α

Tabulka 7 (pokrač.

H

ŠJ

u íí vi <

CJ fM π:α _ o <.X3 — ixj < O

CJ •Ji <

O'< KIXJ — r_>

O SX J-) u — <

u

CJ

XJ

Η 'Λ u

CJ

M

Cm <

υ

CJ í->

u CJ >4<

— !CJ -ct ř—

33 ·	o	v	CJ	g	7Z	Uf	XJ
XJ	<J	o	rj	30	30	u	3)
α	7··^	CJ	α	CJ	33	g	CJ
α	U	to	CJ	□	30	U	CJ
π	o	CJ	α	XJ	Q	u	XJ
u	υ	CJ	CJ	G	υ	XJ	u
u	υ	77	• A	3	XJ	u	XJ
«J		g	g	G	rj	rs	G
30	r*	XJ	g	XJ	g	g	G
XJ	¢0	G	υ	α	α	tO	CJ

ca
XJ	XJ	XJ	»A	A	íj	CJ	CJ
»*	G	P*	Oj	ίζ	x^	30	. u
Čj	G	G	33	CJ	31	•j	3/
Π	XJ	77	?7	XJ	31	α	30
31	31	CJ	CJ	31	Π	u	CJ
G	Q	u	XJ	G	O	CJ	CJ
	31		IJ	CJ	CJ	CJ	30
<	O	Π	G	ζ»	31	CJ	CJ
» a	CJ	u	rj	r3	XJ	G	ul
-·	G	CJ	α	CJ	XJ	α	α

%o sa < \O U J — < <

	u u	Π G	G U	<0 Π	XJ XJ	G U	CO co
C- ZJ	G	□	CJ	30	CJ	G	í0
Ti <	G	co	CJ	CJ	ui	Uf	u
< u	XJ	XJ	CJ	CO	G	?J	*j
	G	CO	c	XJ	G	CJ
	G	n	u	G	r;	«•j	rz
X -J	G	G	c	**	XJ	G	rz
	<3	G	w		xJ	G	ej
c -	G	XJ	XJ	TZ	w	ul	x>

*1<	G	<
u.O	2Z	U
<:o	Γ*	<
			α	G	CJ	G	7J	G
		1	G	O		G	30	XJ
alIq		b	•J	G	“J	co	G	XJ	G
	u		CO		iJ	•ζ	39	G
a»i γ-	<	<	XJ		3>f	CJ	CJ	“7	a
			CJ	G.		(Z	*z	30	to
ι			xJ	XJ		G	• A		• Cu
	vs		XJ		.f	“7	30	30	•J
•ji		a:	G	G	J	CJ	ul	w	w
	3* 3>	Γ*	«Μ	G	XJ	3Í	< «	G	30

.i.iťť tcat c i« acaagauctg aaaccac.caa uaanaanaaaazi příkladu 1. Částečné podtržení označuje zbytky v aminokyselinové sekvenci určitých tryptických fragmentů, které nemohly být stanoveny jednoznačně. cDNA klony lambdaHEPOFL8 a lambda-HEPOFL13 byly screenovány, uloženy a jsou dostupné z American Type Culture Collection, Rockville, Maryland pod přírůstkovým číslem ATCC 40156, ATCC 40152 a ATCC 40153.

Příklad 4

Genomická struktura EPO genu

Relativní velikosti a polohy čtyř nezávislých genomických klonů (lambda - HEPO1, 2, 3 a 6) z knihovny HaelII/AluI jsou ilustrovány překrývajícími se čarami na obr.3. Silná čára označuje polohu EPO genu. Je uvedena stupnice (v kb) a polohy známých míst štěpení restrikční endonukleásou. Oblast, obsahující EPO gen byla kompletně sekvenována z obou řetězců za použití řízené serie delecí v této oblasti. Schematická·znázornění pěti exonů, kódujících EPO mRNA je uvedeno na obr. 4. Přesná 5-konec vazba exonu I je v současnosti neznámá. Protein kódující podíly exonů jsou tmavší. Kompletní nukleotidová sekvence oblasti je uvedena v tabulce 4. Známé hranice každého exonu jsou označeny pomocí silných vertikálních čar, genomické klony lambdaHEPO1, lambda-HEPO2, lambda-HEPO3 a lambda-HEPO6 byly uloženy a jsou dostupné z American Type Culture Collection, Rockville, Maryland pod přírůstkovým číslem ATCC 40154, ATCC 40155 a ATCC 40150 a ATCC 40151.

Příklad 5

Konstrukce vektoru p91023 (b)

Transformačním vektorem byl pAdD26SVpA(3) popsaný

Kaufmanem a spol., Mol.Cell Biol., 2:1304 (1982). STruktura tohoto vektoru je uvedena na obr. 5A. Stručně, tento plasmid obsahuje gen cDNA myší dihydrofolát reduktásy (DFHR), který je pod transkripční kontrolou adenovirus 2 (Ad2) hlavního pozdního promotoru. 5-konec střihové místo je indikováno v adenovirové DNA a 3-konec střihové místo, odvozené od imunoglobulinového genu, je přítomno mezi Ad2 hlavním pozdním promotorem a DFHR kódující sekvencí. SV40 časné polyadenylační místo je přítomno za DHFR kódující sekvencí. Prokaryoticky odvozená sekce pAdD26SVpA(3) je z pSVOd (Mellon a spol., Cell, 27:279(1981)) a neobsahuje pBR322 sekvence, o nichž je známé, že inhibují replikaci v savčích buňkách (Lusky a spol., Nátuře, 293:79 (1981)).

pAdD26SVpA(3) byl převeden na plasmid pCVSVL2 jak je ilustrováno na obr. 5A. pAdD26SVpA(3) byl převeden na plasmid pAdD26SVpA(3)(d) delecí jednoho ze dvou Pstl míst v pAdD26SVpA(3). Toto bylo provedeno parciálním štěpením pomocí Pstl za použití deficitu enzymu tak, aby byla získána subpopulace linearizovaných plasmidů, ve kterých bylo štěpeno pouze jedno Pstl místo, s následujícím zpracováním Klenowem, ligací pro recirkulaci a screeningem na deleci Pstl místa umístěného 3-konec k SV40 polyadenylační sekvenci .

Adenovirový trojdílný leader a s virem spojené geny (VA geny) byly inzertovány do pAdD26SVpA(3)(d) jak je ilustrováno na obr. 5A. Nejprve byl pAdD26SVpA(3)(d)) štěpen pomocí PvuII pro získání lineární molekuly otevřené ve 3konec části tří elementů, tvořících trojdílný leader. Potom byl pJAW 43 (Zain a spol., Cell, 16:851 (1979)) zpracován s Klenowem, štěpen pomocí PvuII a 140bp fragment, obsahující druhou část třetího leaderu byl izolován elektroforézou na akrylamidovém gelu (6% ve Tris borátovém pufru; Maniatis a spol., supra). 140bp fragment byl pak ligován do PvuII štěpeného pAdD26SVpA(3)(d). Ligační produkt byl použit ke transformaci E.coli na tetracyklinovou rezistenci a kolonie byly screenovány za použití Grunstein-Hognessova postupu za použití 32_P značené sondy, hybridizující ke 140 bp fragmentu. DNA byla připravena z pozitivně hybridizujících kolonií pro test, zda PvuII rekonstruované místo bylo 5konec nebo 3-konec inzertované 140bp DNA specifické ke druhému a třetímu adenovirovému pozdnímu leaderu. Správná orientace PvuII místa je na 5-koncové straně 140bp inzertu. Tento plasmid je označen tTPL na obr. 5A.

Ava II D fragment SV40, obsahující SV40 enhancerovou sekvenci byl získán štěpením SV40 DNA pomocí Ava II, zatupením konců Klenowým fragmentem pol I, ligací Xho 1 linkerú k fragmentům, štěpením s Xho 1 pro otevření Xho 1 místa a izolací čtvrtého největšího (D) fragmentu gelovou elektroforézou). Tento fragment byl pak ligován k Xho lštěpenému pTPL za vzniku plasmidu pCVSVL2-TPL. Orientace SV40 D fragmentu v pCVSVL2-TPL byla taková, že SV40 pozdní promotor byl ve stejné orientaci jako adenovirový hlavní pozdní promotor.

Pro zavedení s adenovirem spojených (VA) genů do pCVSVL2-TPL byl nejprve konstruován plasmid pBR322, který obsahuje adenovirus typ 2 Hind III B fragment. Adenovirus typ 2 DNA byla štěpena s Hind III a B fragment byl izolován gelovou elektroforézou. Tento fragment byl inzertován do pBR322, který byl předem štěpen pomocí Hind III. Po transformaci E.coli na ampicilinovou rezistenci, byly rekombinanty screenovány na inzerci Hind III B fragmentu a orintace inzertu byla stanovena štěpením restrikčním enzymem. pBR322-Ad Hind III B obsahuje adenovirus typ 2 Hind III B fragment v orientaci znázorněné na obr. 5B.

Jak je ilustrováno na obr. 5B, jsou VA geny výhodně získány z plasmidu pBR322-Ad Hind III B štěpením s Hpa I, přídavkem EcoRI linkerů a štěpením pomocí EcoRI a následujícím odstraněním 1,4 kb fragmentu. Fragment mající EcoRI lepivé konce se pak liguje do EcoRI místa PTL, předem štěpeného s EcoRI. Po transformaci E.coli HB101 a selekci na tetracyklinovou rezistenci, byly kolonie screenovány filtrovou hybridizaci k DNA specifické pro VA geny. DNA byla připravena z pozitivně hybridizujících klonů a charakterizována štěpením restrikční endonukleásou. Výsledný plasmid je označen p91023.

Jak je ilustrováno na obr.5C, byla dvě EcoRI místa v p91023 odstraněna úplným rozštěpením p91023 pomocí EcoRI za vzniku dvou DNA fragmentů, jeden asi 7kb a druhý asi l,3kb. Posledně uváděný fragment obsahuje VA geny. Konce obou fragmentů pak byly vzájemně k sobě ligovány. Plasmid p91023(A), obsahující VA geny a podobně p91023, ale s delecí dvou EcoRI míst, byly identifikovány pomocí GrunsteinHognessova screeningu s Va genovým fragmentem a běžnou analýzou restrikčních míst.

Jediné Pstl místo v p91023(A) bylo odstraněno a nahrazeno EcoRI místem. p91023(a) byl úplně rozřezán pomocí Pstl a zpracován s Klenowým fragmentempoII pro vytvoření vyrovnaných konců. EcoRI linkery byly ligovány k zatupenému Pstl místu p91023(A). Lineární p91023(A) s EcoRI linkery připojenými k zatupenému Pst místu byly odděleny od neligovaných linkerů a plně rozštěpeny pomocí EcoRI a religovány. Byl získán plasmid p91023 (B) jak je znázorněn na obr.5C a byl identifikován jako mající strukturu podobnou p91023(A), ale s EcoRI místem místo dřívějšího Pstl místa. Plasmid p91023(B) byl uložen a je dostupný z American Type

Culture Collection, Rockville, Maryland pod přírůstkovým číslem ATCC 39754.

Příklad 6 cDNA klony (lambda-EPOFL6 a lambda-EPOFL13, příklad 3) byly inzertovány do plasmidů p91023(B) za vzniku PPTFL6 a PPTFL13 . 8 ug každé z čištěných DNA bylo pak použito k transfektování 5 x 10^ COS buněk za použití DEAE-dextranové metody (infra). Po 12 hodinách byly buňky promyty a zpracovávány s chloroquinem (0,1 mm) po 2 h, opět promyty a vystavena 10 ml media, obsahujícího 10 % fetálního telecího sera po24 hodin. Medium bylo zaměněno za 4 ml sera prostého media a sklizeno o 48 hodin později.

Produkce imunologicky aktivního EPO byla kvantifikována radioimunozkouškou jak popsali Sherwood a Goldwasser (55). Protilátka byla poskytnuta Dr.Judith Sherwood. Jodovaný značkovač byl připraven z.-homogenního EPO popsaného v příkladu 1. Citlivost zkoušky je přibližně 1 ng/ml. Výsledky jsou uvedeny dále v tabulce 8.

Tabulka 8

Vektor

PPTFL13 pPTFL6

PTFL13

Collection,

ATCC399 0.

hladina EPO uvolněného do media (ng/ml)

330 byl uložen a je dostupný z American Type Culture Rockville, Maryland pod přírůstkovým číslem

Příklad Ί

EPO cDNA (lambda-HEPOFL13) byla inzertována do p91023(B) vektoru a byla transfektována do COS-1 buněk a sklizena jak popsáno výše (příklad 6) s tím rozdílem, že bylo vypuštěno zpracování chloroquinem.

In vitro byl stanoven biologicky aktivní EPO pomocí zkoušky tvorby kolonií s buňkami jater myšího plodu jako zdroje CFU-E nebo zkoušky příjmu 3H-thymidinu za použití buněk sleziny myší, kterým byla předem podána injekce fenylhydrazinu. Citlivosti těchto zkoušek jsou přibližně 25 milijednotek/ml. In vivo byl biologicky aktivní EPO měřen použitím metod bud s hypoxickou myší nebo vyhladovělou krysou. Citlivost těchto zkoušek je přibližně 100 milijednotek/ml. Nebyla detegována žádné aktivita u obou zkoušek ani.v kontrolním pokuse. Výsledky EPO exprimovaného klonem EPOFL13 jsou uvedeny dále v tabulce 9, kde uváděné aktivity jsou vyjádřeny v·'jednotkách/ml za použití komerčního, kvantifikovaného EPO (Toyobo, lne.) jako standardu.

Tabulka 9

EPO exprimovaný z COS buněk transfektovaných EPO cDNA typ I

Zkouška

RIA

CFU-E ³H-Thy hypoxická myš vyhladovělá krysa aktivita 100 ng/ml 20,5 j./ml 3,1 1,8 j./ml

j./ml

j./ml

Příklad 8

Analýza EPO z COS buněk na polyakrylamidovém gelu

180 ng EPO uvolněného do media COS buněk transfektovaných EPO (lambda-HEPOFL13) cDNA ve vektoru 91023(B)(viz výše) bylo elektroforezováno na 10% SDS Laemli polyakrylamidovém gelu a elektrotransferováno na nitrocelulozový papír (Towbin a spol.,

Proč.Nati.Acad.Sci.USA 76:4350 (1979)). Filtr byl sondován s anti-EPO protilátkou jak je popsána v tabulce 8, promyt a znovu prohledán pomocí ¹²⁵I-staph A proteinem. Filtr byl zpracováván autoradiografií po dva dny. Nativní homogenní EPO popsané v příkladu 1, bud před (dráha B) nebo po jodaci (dráha C) byly podrobeny elektroforéze (viz obr. 8). Použité markéry zahrnují ³⁵S značený methionin, sérový albumin (68000 d) a ovalbumin (45000 d).

Příklad 9

Konstrukce RK1-4

Bam HI-PvuII fragment z plasmidu PSV2DHFR (Subramani a spol., Mol.Cell.Biol. 1:854-864 (1981)), obsahující oblast časného promotoru SV40 připojeného ke genu myší dihydrofolát reduktasy (DHFR), SV40 enhancer, malý intron t antigenu a SV40 polyadenylační sekvenci, byl izolován (fragment A). Zbývající fragmenty byly získány z vektoru p91023(A) (viz výše) následovně: p91023(A) byl štěpen pomocí Pst I v jediném Pst I místě blízkém adenovirovému promotoru pro linearizaci plasmidu a bud ligován k syntetickým Pst .1 až EcoRI konverterům a recirkulován (vytvoření míst Pst I EcoRI - Pst I na původním Pst I místě; 91023(B‘) nebo zpracován s velkým fragmentem DNA polymerasy I k rozrušení Pst I míst a ligován k syntetickému EcoRI linkeru a recirkularizován (vytvořením EcoRI místa na původním místě

Pst I; 91023(B). Každý ze dvou výsledných fragmentů 91023 (B) a 91023(Β;) byly štěpeny pomocí Xba a EcoRI za vzniku dvou fragmentů (F a G) . Spojením F fragmentu z p9lO23(B) a fragmentu G z p91023(B') a fragmentu G z p91023(B) a fragmentu F z p91023(B') byly vytvořeny dva nové plasmidy, které obsahují bud EcoRI - Pst I místo nebo Pst I - EcoRI místo na původním Pst I místě. Plasmid, obsahující Pst I - Eco Rl místo, kde Pst I místo je nejblíže adenovirovému hlavnímu pozdnímu promotoru byl nazván p91023(C).

Vektor p91023(0 byl kompletně štěpen pomocí Xhol a výsledná linearizovaná DNA s lepivými konci byla zatupena reakcí zaplnění konců s velkým fragmentem E.coli z DNA polymerasy I. K této DNA byl ligován 340 bp Hind III EcoRI fragment, obsahující SV40 enhancer připravený následovně:

Hind III - Pvu II fragment ze SV40, který obsahuje SV40 počátek replikace a enhancer byl inzertován do plasmidu c lac (Little a spol., Mol.Biol.Med. 1:473-488 (1983)). c lac vektor byl připraven štěpením c lac DNA pomocí BamHI, zaplněním na lepivých koncích velkým fragmentem DNA polymerasy I a štěpením DNA pomocí Hind III. Výsledný plasmid (c SVHPlaC) regeneroval BamHI místo při ligaci k Pvu II tupému konci. Fragment EcoRI-Hind III byl připraven z c SVHPlac a ligován k EcoRI-Hind III fragmentu pSVOd (Mellon a spol, supra), který obsahuje plasmidový počátek replikace a byl selektován výsledný plasmid PSVHPOd. Pak byl připraven 340 bp EcoRI-Hind III fragment z PSVHPOd, obsahující SV40. počátek/enhancer, zatupen na obou koncích pomocí velkého fragmentu DNA polymerasy I a ligován k Xhol štěpenému, zatupenému p91023(c) vektoru popsanému výše. Výsledný plasmid (p91023(C)/Xho/zatupený plus EcoRI/Hind III/zatupený SV40 počátek plus enhancer), ve kterém byla orientace Hind

III - EcoRI fragmentu taková, že BamHI místo v tomto fragmentu bylo co nejblíže VA genu byl označen pES105. Plasmid Pesl05 byl štěpen pomocí Bam HI a PvuII a také PvuII samotným a byl izolován BamHI-PvuII fragment, obsahující adenovirový hlavní pozdní promotor (fragment B) a PvuII fragment, obsahující plasmid trvání rezistence genu (tetracyklinová resistence) a jiné sekvence (fragment C). Fragmenty A,B a C byly ligovány a výsledný plasmid je uveden na obr. 7 a byl izolován a nazván RK1-4. Plasmid RK1-4 byl uložen v American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, kde je dostupný pod přírůstkovým číslem ATCC 399940.

Příklad 10

Exprese EPO v CHO buňkách - metoda I

DNA (20 ug) z plasmidů pPTFL13 popsaného výše (příklad 6) byla štěpena restrikční endonukleásou Cla I k linearizaci plasmidů a byla ligována k Cla I-štěpené DNA z plasmidů pAdD26SVP(A) 1 (2 ug), který obsahuje intaktní dihydrofolát reduktasový (DHFR) gen řízený adenovirovým hlavním pozdním promotorem (Kaufman a Sharp, Mol. and Cell.Biol. 2:1304-1319 (1982)) . Takto ligovaná DNA byla použita k transfektování DHFR-negativních CHO buněk (DUKS-BII, Chasin L.A. a Urlaub G. (1980) PNAS 77 4216-4220) a ponechána růst dva dny, buňky, které inkorpórovaly alespoň jeden DHFR gen byly selektovány v alfa mediu postrádajícím nukleotidy a doplněném 10 % dialyzovaného fetálního hovězího sera. Po dvou týdnech růstu v selektivním mediu byly kolonie odstraněny z originálních ploten, spojeny do skupin 10-100 kolonií na skupinu, znovu umístěny na plotnu a ponechány růst do slití v mediu, postrádajícím nukleotidy.

Supernatanty media ze skupin rostlých před methotrexátovou selekcí byly zkoušeny na EPO pomocí RIA. Skupiny, které vykazují pozitivní EPO produkci rostly za přítomnosti methotrexátu (0,02 uM) a pak byly subklonovány a znovu zkoušeny. EPO Cla 4 4.02-7, jediný subklonovaný z EPO Cla 4 4.02 skupiny, uvolňuje 460 ng/ml EPO do media, obsahujícího 0,02 uM MTX (tabulka 10) . EPO Cla 4 4.02-7 je buněčná linie volby pro produkci EPO a byla uložena v American Type Culture Collection pod přírůstkovým číslem ATCC CRL8695. V současnosti je tento klon podroben postupné selekci ve zvyšujících se koncentracích MTX a bude pravděpodobně poskytovat buňky, které produkují i vyšší hladiny EPO. Pro skupiny, které na základě RIA byly negativní, byly kolonie rezistentní k metotrexátu získány z duplikátních kultur, které rostly za přítomnosti metothrexátu (0,02 uM) opět ve skupinách zkoušeny na EPO pomocí RIA. Tyto kultury, které nebyly pozitivní byly subklonovány a podrobeny růstu v dále se zvyšujících koncentracích methotrexátu.

Postupná methotrexátová selekce (MTX) byla dosažena opakováním cyklů kultivace buněk za přítomnosti zvyšujících se koncentrací methotrexátu a selekcí přežívajících. V každém cyklu byl měřen EPO v kulturách supernatantu pomocí RIA a in vitro biologické aktivity. Hladiny methotrexátu použité v každé postupné amplifikací byly 0,02 uM, 0,1 uM a 0.5 uM. Jak je uvedeno v tabulce 10 po jednom cyklu selekce v 0,02 uM MTX byly do kultivačního media uvolněny významně vysoké hladiny EPO.

Tabulka 10

	Hladina EPO uvolněného do media
Vzorek	zkouška	získáno	z media 0,02 uM methotrexát v
		alfa	mediu alfa
skupina
4 4	RIA	17 ng/ml	50 ng/ml
jediná 1	kolonie
4 4 klon
(.02-7)	RIA	-	460 mg/ml
Příklad	11
Exprese	EPO v CHO	buňkách -	metoda II

DNA z klonu lambda HEPOFL13 byl štěpen pomocí EcoRI a malý fragment, obsahující EPO gen byl subklonován do EcoRI místa plasmidu RK1-4 (viz příklad 10). Tato DNA (RKFL13) pak byla použita ke transfekci DHFR-negativních CHO buněk přímo (bez štěpení) a selekce a'amplifikace byla provedena jak je popsáno výše v příkladu 10.

RKFL13 DNA byla také inzertována do CHO buněk protoplastovou fúzí a mikroinjekcí. Plasmid RKFL13 byl uložen a je dostupný z American Type Culture Collection, Rockville, Maryland přírůstkovým číslem ATCC 39989.

Tabulka 11

Vzorek zkouška skupina kolonií

A RIA ³H-Thy jediná RIA kolonie ³H-Thy kloní.02C-Z) mikroinj ektovaná skupina RIA (DEPO-l) ³H-Thy

Hladina EPO uvolněného do media získáno z media 0,02 uM methotrexát v alfa mediu alfa ng/ml 42 ng/ml (skupina)

150 ng/ml (klon)

1,5 j./ml ng/ml

5,9 j./ml ng/ml 160 ng/ml

1,8 j./ml

Preferovaný klon jediné kolonie byl uložen a je dostupný z American Type Culturé Collection, Rockville, Maryland přírůstkovým číslem ATCC CRL8695.

Příklad 12

Exprese EPO genomického klonu v COS-1 buňkách

Pro expresi EPO genomického klonu byl použit vektor pSVOd (Mellon a spol., supra). DNA z pSVOD byla úplně štěpena pomocí Hind III a zatupena s velkým fragmentem DNA polymerasy I. EPO genomický klon lambda-HEP3 byl úplně štěpen s EcoRI a Hind III a 4,0 kb fragment, obsahující EPO gen byl izolován a zatupen jako výše. Nukleotidová sekvence tohoto fragmentu z Hind III místa do oblasti právě za polyadenylačním signálem je uvedena na obr. 4 a v tabulce 4. EPO genový fragment byl inzertován do pSVOd plasmidového fragmentu a správně konstruované rekombinanty v obou orientacích byly izolovány a oveřeny. Plasmid CZ2-1 má EPO gen v orientaci a (tj. 5' konec EPO nejblíže k SV40 počátku) a plasmid CZ1-3 je v opačné orientaci (orientace b) .

Plasmidy CZ1-3 a CZ2-1 byly transfektovány do COS-1 buněk jak je popsáno v příkladu 7 a media byla sklizena a zkoušena na imunologicky reaktivní EPO. Přibližně 31 ng/ml EPO bylo defektních v supernatantu kultury z CZ2-1 a 16-31 ng/ml CZ1-3.

Genomické klony HEPO1, HEPO2 a HEPO5 mohou být inzertovány do COS buněk pro expresi podobným způsobem.

Příklad 13

Exprese v C127 a v 3T3 buňkách. Konstrukce pBPVEPO

Plasmid, obsahující EPO cDNA sekvenci pod transkripční kontrolou myšího metalothioneinového promotoru a napojen ke kompletní DNA hovězí ho papilloma viru, byl připraven následovně:

pEPO49F

Plasmid SP6/5byl získán od Promega Biotec. Tento plasmid byl štěpen kompletně pomocí EcoRI a 1340 bp EcoRI fragment z lambda-HEPOFL13 byl inzertován DNA ligasou. Výsledný plasmid, ve kterém 5‘ konec EPO genu byl nejblíže k SP6 promotoru (stanoveno pomocí štěpení BglI a Hind III) byl nazván pEPO49F. V této orientaci je je BamHI místo v PSP6/5 polylinkeru přímo připojeno k 5' konci EPO genu.

pMMTneo BPV

Plasmid pdBPV-MMTneo (342-12)(Law a spol., Mol. and Cell Biol., 3:2110-2115 (1983)), ilustrovaný na obr. 8, byl štěpen kompletně pomocí BamHI za vzniku dvou fragmentů velkého fragmentu asi 8 kb v délce, obsahující BPV genom a menšího fragmentu asi 6,5 kb délky, obsahujícího pML2 počátek replikace a gen ampicilinové rezistence, metallothioneinový promotoe, gen rezistence neomycinu a SV40 polyadenylační signál. Štěpené DNA byla recirkularizována DNA ligasou a plasmidy, které obsahují pouze 6,8 kb fragment byly identifikovány pomocí EcoRI a BamHI restrikčním endonukleasovám štěpením. Jeden z těchto plasmidů byl nazván pMMTneo BPV.

pEPO15a pMMT neo BPV byl kompletně štěpen pomocí BglII. pEPO49f byl štěpen kompletně pomocí BamHI a BglII a přibližně 700 bp fragment byl připraven izolací na gelu. BglII štěpený pMMTneo BPV a 700 bp BamHI/BglII Epo fragment byly ligovány a výsledné plasmidy, obsahující EPO cDNA byly identifikovány koloniovou hybridizaci s oligonukleotidovou d(GGTCATCTGTCCCCTGTCC) sondou, která je specifická pro EPO gen. Z plasmidů, které byly pozitivní při hybridizační analýze, byl jeden (pEPO15a) který měl EPO cDNA v orientaci takové, že 5' konec cDNA byl nejbližší metallothioneinovému promotoru identifikován štěpením pomocí EcoRI a Kpnf.

pBPV-EPO

Plasmid pEPO15A byl štěpen kompletně BamHI pro linearizaci plasmidů. Plasmid pdBPV-MMTneo(342-12) byl také štěpen kompletně pomocí BamHI za vzniku dvou fragmentů 6,5a

8b. 8kb fragment, který obsahuje celý genom hovězího Papilloma viru, byl izolován na gelu. pEPO15a/BamHI a 8kb BamHI fragment byly spolu ligovány a plasmid (pBPV-EPO), který obsahuje BPV fragment byly identifikovány koloniovou hybridizaci za použití oligonukleotidové sondy d(PCCACACCCGGTACACA-OH), která je specifická pro BPV genom. Štěpení pBPV-EPO DNA pomocí Hind III indikuje, že směr transkripce BPV genomu byl stejný jako směs transkripce metallothioneinového promotoru (jako v pdBPV-MMMTnec(342-12) viz obr. 8). Plasmid pdBPV-MMTneo(342 -12) je dostupný z American Type Culture Collection, Rockville, Maryland pod přírůstkovým číslem č. ATCC 37224.

Exprese

Následující metody byly použity pro expresi EPO.

Metoda I

DNA pBPV-EPO byla připravena a přibližně 25 ug bylo použito k transfektování asi lx 10⁶ C127 (Lowy a spol., J.of Virol. 26:291-98 (1978)) CHO buněk za použití standardních technik srážení fosforečnanem vápenatým (Grahm a spol., Virology, 52:456-67 (1973)). Pět hodin po transfekci byla transfekční media odstraněna, buňky byly podrobeny glycerinovému šoku, promyty a bylo přidáno čerstvého ctmedia, obsahujícího 10 % fetálního bovinního sera. Po 48 hodinách byly buňky trypsinizovány a štěpeny v poměru 1:10 v DME mediu, obsahujícím 500 ug/ml G418 (Southern a spol.,

Mol.Appl.Genet. 1:327-41 (1982)) a buňky byly inkubovány dva až tři týdny. G418 rezistentní kolonie pak byly individuálně izolovány do mikrotitračních jamek a ponechány růst do stadia za přítomnosti G418. Buňky pak byly promyty, bylo přidáno čerstvé medium, obsahující 10 % fetálního hovězího sera a media byla sklizena o 48 hodin později. Kondicionované medium bylo testováno a zjištěno jako pozitivní při radioimunoeseji a in vitro biologické eseji.

Metoda II

C127 nebo 3T3 buňky se 25 ug pBPV-EPO a 2ug pSV2neo (Southern a spol., supra) jak je popsáno v metodě I. Je zde přibližně 10-násobný molární přebytek pBPV-EPO. Po transfekci, postup je stejný jako v metodě 1.

Metoda III

C127 buňky byly transfektovány 30 ug pBPV-EPO jak je popsáno v metodě I. Po transfekci a štěpení (1:10) bylo každé tři dny vyměňováno čerstvé medium. Po asi 2 týdnech byla zřejmá.ložiska transformovaných buněk. Jednotlivá ložiska byla odebrána jednotlivě do 1 cm jamek mikrotitrační plotny, ponechána růst do·subsouvislé monovrstvy a zkoušena na EPO aktivitu nebo antigenicitu v kondicionovaném mediu.

Příklad 14

Exprese ve hmyzích buňkách. Konstrukce pIVEV EPOFL13

Pasmidový vektor pIVEV byl uložen a je dostupný od American Type Culture Collection, Rockville, Maryland pod přírůstkovým číslem č. ATCC 39991. Vektor byl modifikován následovně:

pIVEVNI pIVEV byl štěpen pomocí EcoRI k linearizaci plasmidu, zatupen použitím velkého fragmentu DNA polymerasy I a jediného Notl linkeru

GGCGGCCGCC

CCGCCGGCGG byl inzertován ligací kotupeným koncům. Výsledný plasmid je nazván pIVEVNI.

pIVEVSI pIVEV byl štěpen pomocí Smál k linearizaci jediného Sfil linkeru GGGCCCCAGGGGCCC CCCGGGGTCCCCGGG byl inzertován ligací k otupeným koncům. Výsledný plasmid byl nazván pIVEVSI.

pIVEVSIBgKp

Plasmid pIVEVSI byl štěpen pomocí KpnI k linearizaci plasmidu a přibližně 0 až 100 bp bylo získáno z každého konce štěpením dvojřetězcovou exonukleasou Bal 31. Jakékoliv konce, které nebyly perfektně tupé byly zatupeny pomocí velkého fragmentu DNA polymerasy I a polylinker _n _Xh o_I ^,ΒσΓΐΐ ‘Ecoki jcial Kpni

AGATCTCGÁGAATTCTAGATCGATGGTACC*

TCTAGAGCTCTTAAGATCTAGCTACCATGG byl inzertován ligací k tupým koncům. Polylinker byl inzertován v obou orientacích. Plasmid, ve kterém je polylinker orientován tak, že BglII místo v polylinkeru je nejbližší k promotoru polyhedron genu je nazván pIVEVSIBgKp. Plasmid, ve kterém KpnI místo v polylinkeru je nejbližší k promotoru polyhedron genu je nazván pIVEVSIKpBg. Počet párů bází, které byly deletovány mezi původním KpnI místem v pIVEVSI a polyhedron promotorem, nebyl stanoven. pIEIVSIBgKp byl uložen a je dostupný z American Type Culture Collection, Rockville, Maryland pod přírůstkovým číslem č. ATCC 399988.

pIEVSIBgKpNl pIVEVNI byl štěpen kompletně pomocí Kpnl a Pstl za vzniku dvou fragmentů, Větší fragment, který obsahuje plasmidový počátek replikace a 3' konec polyhedron genu byl připraven izolací na gelu (fragment A). pIVEVSIBgKp byl štěpen kompletně pomocí pstl a Kpn za vzniku dvou fragmentů a menší fragment, který obsahuje polyhedron genový promotor a polylinker byl připraven izolacemi na gelu (fragment B). Fragment A a B pak byly spojeny DNA ligasou za vzniku nového plasmidu pIVEVSIBgKpNI, který obsahuje částečně deletovaný polyhedron gen, do kterého byl inzertován polylinker a obsahuje také Notl místo (nahrazení zničeného EcoRI místa) a Sfil místo, které přiléhá kpolyhedron genové oblasti.

pIVEPO pIVEVSI BGKpNI byl štěpen kompletně pomocí EcoRI pro linearizaci plasmidu a 1340 bp EcoRI fragment z lambdaHEPOFL13 bylinzertován. Plasmidy, obsahující EPO gen v orientaci takové, že 5' konec EPO genu je nejbližší polyhedron promotoru a 3' konec polyhedron genu, byly identifikovány štěpením s BglII. Jeden z těchto plasmidu ve výše popsané orientaci byl označen pIVEPO.

Exprese EPO ve hmyzích buňkách

Velká množství pIVEPO plasmidu byla vyrobena transformací E.coli kmene JMIOl-tgl. Plasmidová DNA byla . izolována technikou čištění lyzátu (Maniatis a Fritsch, Cold Spring Harbor Manual) a dále čištěna pomocí CsCl odstředění. L-l DNA polyhedrosis viru standardního typu Autogxapha californica (AcNPV) byla připravena fenolovou extrakcí částic viru a následným CsCl čištěním virové DNA.

Tyto dvě DNA pak byly kotransfektovány do Spodoptera frugiperda buněk IPLB-SF-21 (Vaughn a spol., In Vitro, díl B, str. 213-17 (1977) za použití transfekčního postupu s fosforečnanem vápenatým (Potter a Millere, 1977). Pro každou plotnu kotransfektovaných buněk byl použit 1 ug DNA standardního typu AcNPV a 10 ug pIVEPO. Plotny byly inkubovány při 27 °C 5 dnu. Supernatant pak byl oddělen a EPO exprese v supernatantu byla potvrzena radioimunoesejí a in vitro biologickou eseji.

Příklad 15

Čištění EPO

COS-buněčná kondicionovaná media (121) s EPO koncentracemi až 200 ug/litr byla koncentrována na 600 ml za použití ultrafiltračních membrán se schopností dělení 10000 mol. hmotnosti, jako je Millipore Pellicans 0,46 m² na membránu. Eseje byly provedeny pomocí RIA jak je popsáno v příkladu 6. Retentát z ultrafiltrace byl diafiltrován proti 4 ml 10 mM 10 mM fosforečnanu sodného pufrovaného na pH 7,0.Koncentrovaná a diafiltrovaná kondiční media obsahují

2,5 mg EPO ve 380 mg celkového proteinu. EPO roztok byl dále koncentrován na 186 ml a vysrážené proteiny byly odstraněny odstředěním při 110000 x g po 30 minut.

Supernatant, který obsahuje EPO (2,0 mg) byl upraven na pH 5,5 s 50% kyselinou octovou, ponechán míchat při 4 °C 30 minut a sraženina byla odstraněna odstředováním při 13000 x g po 30 minut.

Chromatografíe na karbonyImethylsepharose

Supernatant z odstředování (20 ml), obsahující 200 ug EPO (24 mg celkového proteinu) byl nanesen na kolonu naplněnou CM-Sepharosou /20 ml) ekvilibrovanou v 10 mM octanu sodném pH 5,5, promytou 40 ml stejného pufiu. EPO, který se navázal k CM-Sepharose, byl eluován 100 ml gradientu NaU (0-1) v 10 mM fosforečnanu sodném pH 5,5. Frakce, obsahující EPO (celkem 50 ug ve 2 mg celkových proteinu) byly spojeny a koncentrovány na 2 ml za použití Amicon YM10 ultrafiltrační membrány.

HPLC s reverzní fází

Koncentrované frakce z CM-Sepharosy, obsahující EPO byly dále čištěny pomocí HPLC s reverzní fází za použití Vydac-4 kolony. EPO byl nanesen na kolonu ekvilibrovanou v 10% rozpouštědle B (rozpouštědlo A bylo 0,1 % CF3CO2H ve vodě; rozpouštědlo B bylo 0,1 % CF3CO2H v CF3CO2H v CF3CN) při průtokové rychlosti 1 ml/min. Kolona byla promývána 10%

B po 10 minut a EPO byl eluován s lineárním gradientem B(10-70 % po 60 minut). Frakce, obsahující EPO, byly spojeny (asi 40 ug EPO ve 120 ug celkových proteinů) a lyofilizovány. Lyofilizovaný EPO byl rekonstituován v 0,lM Tris HCI při pH 7,5, obsahujícím 0,15M NaCl a rechromatografován pomocí HPLC s reverzní fází. Frakce, obsahující EPO byly spojeny a analyzovány SDSpolyakrylamidovou (10%) gelovou elektroforézou (Lameli U.K., Nátuře). Spojené frakce EPO obsahují 15,5 ug EPO ve 25 ug celkového proteinu.

Vynález byl podrobně popsán svými výhodnými provedeními. Odborník v oboru může snadno provést modifikace a vylepšení na základě popisu a předložených obrázků, aniž by byla porušena myšlenka a rozsah vynálezu, který je dán připojenými nároky.

J.

-2 -íe^/θ

1) Jacobson, L 0., Goldwasser, E. Fried, W., a’ Pizak, L. F., Trans. Assoc. Am. Physicians TO:305-317 (1957).

2) Krantz, S. B. a. Jacobson, L. O. Chicago: University of Chicago Press 1970, pp, 29-31.

3) Hammond, D a. Winnick, S. Ann. N.Y. Acad. Sci. 230(219-227 (1974).

4) Sherwood, J. B. é Goldwasser, E., Endocrinoíčgy 103:866-870 (1978).

5) Fried, W. Blood 40:671-677 (1972).

6) Fisher, J. J. Lab. a< Clin. Med. 93:695-699 (1979).

7) Naughton. B. A., Kaplan, S. M., Roy, M., Burdowski, A. J., Gordon, A. S., a. Piliero, S. J. Science 196:301-302.

8) Lucarelli, G. P., Howard, D., a., Stohlman, F., Jr. J. Clin. Invest 43:2195-2203 (1964).

9) Zanjani. E. D., Poster, J., Burlington, H., Mann, ύΤ.,Τ . Wasserman, L. R. J. Lab. Clin. Med. 89:640644 (1977).

10) Krantz, S. B„ Gallien-Lartigue, O., ai Goldwasser, E. J. Biol Chem. 238:4085-4090 (1963). .

11) Dunn, C. D., Jarvis, J. H. a: Greeňman, J. M. Exp. Hematol. 3:65-78 (1975).

12) Krystal, G. Exp. Hematol. 11:649-660 (1983)

13) Iscove, N.N. a> . Guilbert, L.J., M.J. Murphy, Jr. (Ed.) New York: Springer-Veriag, pp. 3-7 (1978).

14) Goldwasser. E., ICN UCLA Symposium , Control of Cellular Division and Development, A. R. Liss, lne., pp. 487-494 (1981)

15) Cline, M. J. a. Golde, D. W. Nátuře 277:177-181 (1979)

16) Metcalf, D., Johnson, G. R., a, Buřgess, A. W. Blood 55:138- (1980)

17) Krane, N. Henry Ford Hosp. Med. J. 31:177-181 (1983)

18) Eschbach, J., Madenovic, J., Garcia, J., Wahl, P., a. Adamson, J. J. Clin. Invest. 74;434-441 (1984)

19) Anagnostou, A.. Barone, J., Védo, A., ai . Fried, W. Br. J. Hematol 37:8511 (1977)

20) Miyake, T„ Kung, C., a : Goldwasser, E. J. Biol. Chem. 252:5558-5564 (1977)

21) Yanagawa, S., Hirade, K., Ohnota, H., Sasaki, R„ Chiba, H., Veda, M., ai Goto, M. J. Biol. Chem. 259:2707-2710 (1984)

22) Lawn, R. M., Fritsch, E. F., Parker, R. C., Blake, G., a' Maniatis, T. Cell 15:1157 - (1978)

23) Sanger, F., Nicklen, S., a. . Coulson, A. R. Proč. Naťl. Acad. Sci., U.ŠA 74:5463- (1977)

24) Zanjanc, E.D., Ascensao, J.L., McGlave, P.B., Banisadre, Μ.,ΊΓ Ash, R. C. J. Clin. Invest. 67:1183(1981)

25) Toole. J.J., Knopf, J.L., Wozney, J.M., Sultzman, L.A. Buecker, J. L., Pitlman, D. D„ Kaufman. R. J.,

Brown, E., Shoemaker, C., Orr, E. C., Amphlett, G. W., Foster, W. B., Coe, M. L., Knutson, G. J., Fass, D. N., a. : Hewick, R. M. Nátuře in Press

26) Goldwasser, E. Blood Suppi. 1, 58. xlii (abstr) (1981)

27) Sue, J. M. ai : Šýtkowdki, A. J. Proč. Naťl Acad. Sci U.S.A. 80:3651-3555 (1983)

29) Bersch, N. a j Golde, D.W., In Vitro Aspects of Erythropoiesis, M. J. Murphy (Ed.) New York: Sprínger-Verlag (1978)

30) Čotes, P. M. a. Bangham, D. R. Nátuře 191:1065- (1961)

31) Goldwasser, E. at . Gross, M. Methods in Enzymol 37:109-121 (1975)

32) Nabeshima, Y. -i, Fujii-Kuriyama, Y„ Muřamatsu, M., a Ogata, K. Nátuře 308:333-338 (1984)

33) Young. R. A., Hagencuhle, 0. a, Schibler, U. Cell 23:451-558 (1981)

34) Medford, R. M., Nguyen, Η. T., Destree, A. T., Summers, E. a Nadal-Ginard, B . Cell 38:409-421 (1984) “

35) Ziff, Ε. B. Nátuře 287:491-499 (1980)

36) Early, P. Cell 20:313-319 (1980)

37) Sytkowskí, A. Bio. Biop. Res. Comm. 96:143-149 (1980)

38) Murphy, M. ai'-7 'Miyake, T. Ácta. Haematol. Jpn. 46:1380-1396 (1983) .

39) Wagh, P. V. a. Bahl, O. P. CRC Critlcal Reviews in Biochemistry 307-377 (1981)

40) Wang, F. F., Kung, C. K. -Η.Έ ' Goldwasser, E. Fed. Proč. Fed. Am. Soc. Exp. Biol. 42:1872 (abstr) (1983) . 41) Lowy, P., Keighley, G. a·..' Borsook, H. Nátuře 185:102-103 (1960) *42) VanLenten, L. a. Ashwell, G. J. Biol. Chem. 247:4633-4640 (1972)

43) Lee-Huang, S. Proč. Naťl Acad. Sci. U.S.A. 81:2708-2712 (1984) • 44) Fyhrquist, F., Rosenlof, K., Gronhagen-Riska, C., Hortling, L. ai ' Tikkanen, I. Nátuře 308:649-562 (1984) ··

45) Ohkubo, H., Kageyama, R., Vjihara, M., Hirose, T., Inayama, S., ai Nakanishi, S. Proč. Naťl Acad.

Sci. U.S.A. 80:2196-2200 (1983) ^r

46) Suggs, S.V., Wallace, R. B., Hirose, T., Kawashima, Ε. H. ar Itakura, K. Proč. Naťl. Acad. Sci. U.S.A. -78:6613-6617(1981)

47) Woo, S. L C., Dugaiczyk, A., Tsai, M. -J., Laí, E. C.. Catterall, J. F. ar I 0’Malley, B. W. Proč. Naťl.Acad. Sci. U.S.A. 75:3688- (1978)

48) Melchior, W. B. ai > VonHippel. P. H. Proč. Naťl Acad. Soc. U.S.A. 70:298-302 (1973)

49) Orosz, J. M. a: . Wetmls, J. G. Biopolymers 16;1183-1199 (1977)

50) Anderson, S a Kingston, I. B. Proč. Naťl Acad. Sci.-U.S.A. 80:6836-6842 (1983)

51) Ulirich, A., Coussens, L., Hayflick, J. S. Duli, T. J., Gray, A., Tam, A. W„ Lee, J., Yarden, Y., Libermann, T. A., Schlessinger, J., Downward, J., Mayes, E. L. V., Whíttle, H„ Waterfield, M.D. a. ’ Seeburg, P. H. Nátuře 309: 418-425 (1984)

52) Fisher, J. Proč. Soc. Exptl. Biol. and Med . 173:289-305 (1983)

53) Kozák, M.Ňúč? Áčiď ŘěsTl2Í8577872~(1984)

54) Benton, W.D. a . Davis, R.W. Science 196:180-182 (1977)

55) Sherwood. J.B. a; Goldwasser, E. Blood 54:885-893 (1979)

56) Derman, E., Krauter, K., Walling, L., Wěiňberger, C„ Ray, M., a . Darnell, J. T., Cell 23:731- (1981)

57) Gluzman, Y., Cell 23:175-182 (1981)

58) Hewick, R. M., Hunkapiller, Μ. E., Hood, L. E., f Dreyer, W. J. J. Biol. Chem. 256:7990-7997 (1981)

59) Towbln, H.. Stachelin, T., a, Gordon, J., Proč. Naťl Acad. Sci. 76:4380- (1979)

60) Carnott, P., Deflandre, C. C. R. Acad. Sel; Paris 143:432-(1960)

Claims (2)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob produkce rekombinantního lidského erythropoietinu, hEPO, zahrnující stupně
2. 2. VQjeLvUlul ki/feč·(ČHO)

   a) kultivace buněkkteré obsahují DNA sekvenci kódující hEPO operativně připojenou k expresní kontrolní sekvenci, ve vhodném mediu a

   b) získání a separace produkovaného rekombinantního hEPO z buněk a media, vyznačující se tím, že se použije CHO buněk majících schopnost poskytovat N- a O-připojenou glykosylaci se zavedením fúkosy a N-acetylgalaktosaminu, přičemž z buněk a media se získá a oddělí rekombinantní hEPO s N- a O-připojenou glykosylaci.

   2. Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se t í m, že rekombinantní hEPO vykazuje následující glykosylační profil: molární poměr hexos k N-acetylglukosaminu (Nacglc) 1,4:1, konkrétně molární poměr galaktosy k Nacglc 0,9:1 a mannosy k Nacglc 0,5:1.