JPH02442A - エリトロポエチンを発現するヒトｃＤＮＡのクローニング方法 - Google Patents

エリトロポエチンを発現するヒトｃＤＮＡのクローニング方法

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JPH02442A
JPH02442A JP63198766A JP19876688A JPH02442A JP H02442 A JPH02442 A JP H02442A JP 63198766 A JP63198766 A JP 63198766A JP 19876688 A JP19876688 A JP 19876688A JP H02442 A JPH02442 A JP H02442A
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フリッシュ，エドワード
Rodney M Hewick
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は驚くほど高い発現レベルを示すヒトエリトロポ
エチンのクローン化遺伝子、その組換えＤＮＡベクター
、および該組換えベクターで哺乳動物細胞を形質転換さ
せて得られる形質転換体に関するものである。
発明の背景 エリトロポエチン（以後ＥＰＯと略す）は高等動物にお
ける赤血球の形成を促進する循環系中の糖タンパク質で
ある。例えば、カルノー（ｃａｒｎｏｔ）らのＣｏｍｐ
ｔ、　Ｒｅｎｄ、、　１４３　：　３８４　（１９０６
）を参照されたい。それゆえ、ＥＰＯは赤血球形成促進
因子とも呼ばれている。
ヒト赤血球の寿命は約１２０日間である。従って、全赤
血球の約１／１２０は細網内皮系で毎日破壊される。同
時に、比較的一定数の赤血球が常時赤血球レベルを維持
するために毎日生産される〔ガイトン（Ｇｕｙｔｏｎ）
のＴｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　ＭｅｄｉｃａｌＰｈｙｓｉ
ｏｌｏｇｙ、　ｐ、５６−６０．　Ｗ、　Ｂ、　５ａｕ
ｎｄｅｒｓ　Ｃｏ、、フィラデルフィア（１９７６）を
参照〕。
赤血球は丹髄中で赤芽球の成熟および分化により生産さ
れ、ＥＰＯは未分化の前駆細胞に作用してそれらの細胞
の赤血球への分化を誘起する因子である（ガイトンの上
記文献参照）。
ＥＰＯは貧血、特に腎性貧血の臨床治療のための有望な
治療薬剤である。しかしあいに＜、ＥＰＯは、治療剤と
して使用するのに必要な十分足を入手することが容易で
ないため実際上の医療面において未だ普及していない。
ＥＰＯを治療薬剤として使用するためには、抗原性の問
題を考慮しなければならないだろう。
従って、ＥＰＯはヒト由来の原料から生産されるのが好
ましい。例えば、再生不良性貧血または同様の症状をも
つ患者（大量のＥＰＯを排出する）からの血液もしくは
尿が使用できる。例えば、ホワイト（Ｗｈｉ　ｔｃ）ら
のＲｃｅ、　Ｐｒｏｇｒ、　ｆｌｏｒＯｌ、　Ｒｃｓ、
。
１６　：　２１９　（１９６０）　：エスパダ（Ｅｓｐ
ａｄａ）らのＢｉｏｅｈｃｍ、　Ｍａｄ、、　３　：　
４７５　（１９７０）　；フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ
）のＰｈａｒｍａｃｏｌ、　Ｒｅｖ、、　２４　：　４
５９　（１９７２）　；およびゴートン（Ｇｏｒｄｏｎ
）のＶｉｔａｍ、　ｌｌｏｒｍ、　（Ｎ、Ｙ、）：Ｈ：
　１０５　（１９７３）を参照されたい（これらの文献
の記載内容は明細書の一部として引用される）。
上記のとおり、ＥＰＯは一般に高いＥＰＯレベルを示す
患者（例えば、再生不良性貧血や同様の症状をもつ患者
）からの尿を濃縮および精製することにより製造される
。例えば、米国特許第４３９７８４０号；同第４３０３
８５０号；および同第３８６５８０１号の各明細書を参
照されたい（これらの特許の記載内容は明細書の一部と
して引用される）。しかしながら、この種の尿の供給量
は限られているため、ＥＰＯの実際上の使用は制限され
ている。このため、健康なヒトの尿からもＥＰＯ産物を
得ることが非常に望ましい。しかしながら、健康なヒト
から採取した尿を使用する際の１つの問題点は、そのＥ
ＰＯ含有世が貧血患者の尿と比較して低いということで
ある。さらに、健康なヒトの尿は赤血球形成に対して作
用するいくつかの阻害因子を相当に高濃度で含んでいる
ために、満足のゆく治療効果を得るには高度精製後に得
られるＥＰＯを使用しなければならないと考えられる。
ＥＰＯはヒツジの血漿から回収することもでき、この種
の血漿からＥＰＯを分離して満足すべき効力を有し、安
定な水溶性製剤が得られる。ゴールＲ，Ｌｉ５ｓ、　Ｉ
ｎｃ、、ニューヨーク　（１９８１）を参照されたい（
各々の文献については明細書の一部として引用される）
。しかしながら、ヒツジＥＰＯはヒトに対して抗原性が
あると予測される。
以上に述べたとおり、ＥＰＯは有望な治療薬剤であるに
もかかわらず、天然供給源から通常の単離／精製技術で
大量生産することは困難である。
スギモト（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ）らの米国特許第４３７７
５１３号明細書は、Ｎａｍａｌｗａ、　ＢＡＬＬ−１，
ＮＡＬＬ−１，ＴＡＬＬ−１およびＪＢＬを含めたヒト
リンパ芽球細胞のｉｎ　ｖｉｖ。
増殖操作によるＥＰＯの大量生産方法を開示している。
その他にも遺伝子工学技術を用いるＥＰＯの生産に関す
る報告がなされている（例えば、本出願の優先日後に国
際公開されたＷ　Ｏ８５１０２６１０号およびＷ　Ｏ８
５／　０３０７９号を参照）。しかし、その生産技術の
詳細や、その生産物の化学的性質は未だに発表されてい
ない。これとは対照的に、本発明はヒトＥＰＯの生物学
的性質を有するタンパク質の大量生産を可能にする方法
を提供するものである。また、本発明の方法により、天
然のヒトＥＰＯと化学的に異なるかも知れないが類似の
（場合によっては改良された）性質を示すタンパク質を
生産することも可能となる。便宜上、ヒトＥＰＯの生物
学的性質を示すこの種のタンパク質は、ヒｌ−Ｅ　Ｐ　
Ｏと化学的に完全同一でないものも含めて、本明細書中
で以後ＥＰＯと総称する。
発明の概要 本発明は驚くほど高いレベルのヒトＥＰＯを発現する遺
伝子のクローニング、その発現組換えＤＮＡベクターお
よび数組換えＤＮＡベクターで形質転換させて、活性ヒ
ｈＥＰＯをｉｎ　ｖｉｔｒｏで大量に生産できる形質転
換体に関する。
以下でより詳細に説明するように、本発明者らは先ず、
再生不良性貧血患者の尿より部分精製された形で得られ
たＥＰＯを均一になるまでさらに精製し、トリプシンで
消化して特定のフラグメントを得た。これらのフラグメ
ントを精製してそのアミノ酸配列を決定した。これらの
配列に基づいてＥＰＯオリゴヌクレオチドを推定し、そ
して合成した。合成したオリゴヌクレオチドを使用して
ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングし、そのライ
ブラリーからＥＰＯ遺伝子を単離した。
単離されたものがＥＰＯ遺伝子であることは、アミノ酸
配列が決定された上記トリプシン消化タンパク質フラグ
メントの多くに対応する事実に基づいて証明された。さ
らに、単離された上記ゲノムクローンの一断片を使用し
て、ハイブリダイゼーション法によりヒト胎児（２０週
目）ｍＲＮＡ中のＥＰＯｍＲＮＡを単離し、ヒト胎児肝
臓ｃＤＮＡライブラリーを作成して、ゲノムクローンの
一断片から作成されたプローブでスクリーニングした。
７５０．０００以上の組換え体をスクリーニングした後
に３個のＥＰＯｃＤＮＡりローンが得られた。これらの
クローンのうち２つが、完全なコーディング配列および
実質的な５プライムおよび３−プライム非翻訳配列を持
つことから、全長のＥＰＯｃＤＮＡであると決定された
。これらのｃＤＮＡはＳ　Ｖ　−４０ウイルス由来のベ
クターに挿入し、このベクターで形質転換したサル細胞
［Ｃ０８−１細胞株；グラズマン（Ｇｌｕｚｍａｎ）、
　Ｃｅ１ｌ　２３　：　１７５−１８２　（１９８１）
を参照］およびチャイニーズハムスター卵巣細胞（ｃＨ
Ｏ細胞株；アーラウブ（ｔｌｒｌａｕｂ、　Ｇ、）およ
びカーシン（ｃｈａｓｉｎ、　Ｌ、　Ａ、）のＰｒｏｅ
、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ。
ＵＳＡ　７７　：　４２１ｔ３−４２８０　（１９８０
）を参照〕の両細胞内で発現させた。ＣＯ８細胞から生
産されたＥＰＯおよびＣＨＯ細胞から生産されたＥＰＯ
は共にｔｎ　ｖｔｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏにおいて
生物学的に活性なＥＰＯである。
クローン化されたＥＰＯｃＤＮＡは第３表に示すように
コーディング領域の２０〜３０ヌクレオチド上流にイニ
シエーターおよびターミネータ−を有する１４〜１５ア
ミノ酸の興味あるオープン・リーディング・フレームを
有する。クローン化ＥＰＯｃＤＮＡでトランスフェクシ
ョンされた代表的な大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）サンプルは
、メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクションに寄託され、寄託番号ＡＴＣＣ
４０１５３のもとに入手可能である。
表の説明 第１表はヒトＥＰＯ遺伝子中の８７塩基対からなるエク
ソン部分の塩基配列を示すものであり；第２表はヒトＥ
ＰＯｃＤＮＡのクローンの一つラムダ−ＨＥＰＯＦＬ１
３のヌクレオチド配列から推定されたＥＰＯタンパク質
のアミノ酸配列を示し； 第３表はラムダ−ＨＥＰＯＦＬ１３中のＥＰＯｃＤＮＡ
のヌクレオチド配列およびそれから推定される第２表の
ものと同じアミノ酸配列を示し；第４表は第４図に示す
ＥＰＯ遺伝子のｇＤＮＡ配列を示し； 第５表はヒトＥＰＯｃＤＮＡクローン、ラムダ−ＨＥＰ
ＯＦＬ６中のＥＰＯｃＤＮＡのヌクレオチド配列とそれ
から推定されるアミノ酸配列を示し； 第６表はヒトＥＰＯｃＤＮＡクローン、ラムダ−ＨＥＰ
ＯＦＬ８中のＥＰＯｃＤＮＡのヌクレオチド配列とそれ
から推定されるアミノ酸配列を示し； 第７表は第３表と同じもので、ヒトＥＰＯｃＤＮＡクロ
ーン、ラムダ−ＨＥＰＯＦＬ１３中のＥＰＯｃＤＮＡの
ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。
詳細な説明 本発明はヒトＥＰＯｃＤＮＡのクローニングおよびその
ｃＤＮＡのｉｎ　ｖｉｔｒｏ発現によるＥＰＯの生産に
使用する組換えＤＮＡベクターおよびその形質転換体に
関する。
ヒｈＥＰｏ　　ｃＤＮＡは、次のようにして得ることが
可能である。なお、明細書中で使用する（１）から（１
７）の数字は、本明細書の終わりに番号順に掲載した刊
行物を意味する。
ヒトＥＰＯのゲノムクローンの単離 先ずヒ）ＥＰＯを以下で説明するように再生不良性貧血
に悩む患者の尿等の材料から均一に精製する。この精製
ＥＰＯをタンパク質分解酵素トリプシンで完全消化して
フラグメントを得、これらのフラグメントを逆相高速液
体クロマトグラフィーで分離し、勾配画分から回収し、
そして微世アミノ酸配列分析法にかける。この分析によ
り決定される各トリプシン消化フラグメントのアミノ酸
配列は、例えば第２表および第３表において下線が施さ
れた部分に相当する。これらのうち、適当なフラグメン
ト、好ましくはＶａｌ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ａｌ
ａ−Ｔ’ｒｐ−ＬｙｓおよびＶａｉＴｙｒ−５ｅｒ−Ａ
ｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇを選んで、その配列に対
応するオリゴヌクレオチドプローブを合成する。前者の
トリプシン消化フラグメントからは１７ヌクレオチド長
の３２種類のオリゴヌクレオチドブールと１８ヌクレオ
チド長の１２８種類のオリゴヌクレオチドブール、およ
び後者のトリプシン消化フラグメントからは各々１４ヌ
クレオチド長の４８種類の２つのプールがそれぞれ得ら
れる。これらのうちから、３２種類の１７オリゴヌクレ
オチド（以下ｍＱｒと略す）プールを使用してＣｈａｒ
ｏｎ　４Ａ　　（ｅｈ４八）ベクター（３）中のヒトゲ
ノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。なお、
スクリーニングはウー（Ｗｏｏ）およびオマジー（０’
Ｍａｌ　Ｉｅｙ）のｉｎ　５ｉｔｕ増幅法（１１）の変
法を使用できる。スクリーニング用のフィルター調製そ
の他の詳細は、実施例１で詳述する。
Ｌ７ｍａｒとハイブリダイズするファージを採取し、小
グループ別にプールし、そしてプローブとして１４ｍｃ
ｒおよびＬ８ｍｃｒプールを使用してさらに検索する。
１７ｍｃｒおよび１４ｍｃｒプールとハイブリダイズす
るファージをプラーク精製し、精製ファージの塩基フラ
グメントをＭ１３ファージベクター中にサブクローニン
グして、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）およびクールソン（
ｃｏｕｌｓｏｎ）のジデオキシ・チエイン・ターミネー
ション法（４）　（１９７７）により塩基配列を決定す
る。本発明者らが得た一つのクローン中の、３２種類の
１７ｍａｒとハイブリダイズする領域の塩基配列を第１
表に示す。このＤＮＡ配列は、オープン・リーディング
・フレーム内にＬａｍａｒプールのオリゴヌクレオチド
を推論するのに使用したトリプシン消化フラグメントを
正確にコードしうるヌクレオチドを含んでいた。さらに
、分析結果はこのＤＮＡ配列は、１７ｍｅｒとハイブリ
ダイズする領域がスプライス受容部位と供与部位（夫々
第１表中、ａおよびｄで示される）によって境界される
８７ｂｐのエクソン内に含まれることを示した。
ＥＰＯｃＤＮＡクローンの単離 次に、上記で得られたＥＰＯのゲノムＤＮＡをプローブ
として、適当なヒトｃＤＮＡライブラリーからＥＰＯｃ
ＤＮＡを単離する。本発明者らの研究によれば、胎児肝
臓ｍＲＮＡから作られたヒトｃＤＮＡライブラリーがこ
の目的に最適であった。即ち、本発明者らは、第１表に
示す８７ｂｐ工クソン部分を含む前記Ｍ１３クローンか
ら９５ヌクレオチド−重鎖を調製し、これをプローブと
して用いて、ヒト胎児（２０週０）肝臓ｍＲＮＡのノー
ザン分析（１５）を行った。ｍ１図に示すように、強い
シグナルが胎児肝臓ｍＲＮＡ中に検出された。そこで同
じプローブを使って胎児肝臓ｍＲＮＡからバクテリオフ
ァージラムダ中に作られたｃＤＮＡライブラリーをスク
リーニングしたところ（５）、スクリーニングした２５
０．０００個の組換え体当たり約１個の陽性クローンの
頻度で、数個のハイブリダイズするクローンが得られた
。これらのｃＤＮＡクローン（ラムダ−Ｉ（ＥＰＯＦＬ
１３およびラムダ−ＨＥＰＯＦＬ８と命名した）の完全
なヌクレオチド配列およびそれから推定されたアミノ酸
配列を第３表と第６表に示す。ＥＰＯコーディング情報
は非常に疎水性の２７個のアミノ酸からなるリーダ一部
分と１６８個のアミノ酸からなるマチュア部分を含むｃ
ＤＮＡの５−プライム側半分の５９４ヌクレオチド内に
含まれる。なお、マチュアタンパク質のＮ末端の推定は
、ゴールドバッサ−（Ｇｏｌｄｗａｓｓｃｒ）　（６）
　、スー（Ｓｕｅ）およびシトコツスキー（Ｓｙｔｋｏ
ｗｓｋｉ）　（７）、およびヤナガワ（Ｙａｎａｇａｗ
ａ）　（２）により発表された結果、または本発明者ら
が別に決定した再生不良性貧血患者の尿中に排泄された
タンパク質のＮ末端配列に基づいた。このＮ末端（Ａｌ
ａ−Ｐｒｏ−Ｐｒ。
Ａｒｇ・・・）が循環中のＥＰＯに見られる実際のＮ末
端であるのかどうか、または腎臓や尿中でいくつかの切
断が起こるのかどうか今のところ不明である。
第２表および第３表で下線を施したアミノ酸配列は、タ
ンパク質配列情報が得られたトリプシン消化フラグメン
トまたはＮ末端の部分を示す。りローン化されたｃＤＮ
Ａ配列から推定されたアミノ酸配列は、アミノ酸配列が
決定されたトリプシン消化フラグメントと正確に一致し
、単離されたｃＤＮＡはヒトＥＰＯをコードすることが
確かめられた。
ヒトＥＰＯ遺伝子の構造および塩基配列Ｃｈ４Ａベクタ
ー（３）に組込まれたヒトゲノムＤＮＡライブラリーを
作製し、先に得られた２種類のＥＰＯｃＤＮＡクローン
から調製されたオリゴヌクレオチドプローブ及び他の種
々のプローブを用いてハイブリダイゼーション分析を行
った。
この分析により４個の独立したヒトＥＰＯゲノムクロー
ン（ｇＤＮＡ）を得、またこれらクローンのＤＮＡ挿入
物の相対位置を確認して第３図に示した。第３図に黒い
線で示される約３．３ｋｂ　６ｆｆ域内にＥＰＯ遺伝子
が存在することが示されている。
この領域の完全な塩基配列分析（参考例１を参照）およ
びｃＤＮＡクローンとの比較から、第４図に示されるＥ
Ｐ○遺伝子のイントロンおよびエクソン構造の地図を描
くことができた。ＥＰＯ逍伝子は５個のエクソンに分割
される。エクソンエの一部、エクソン■、■および■の
全部、およびエクソンＶの一部がタンパク質コーディン
グ情報を含む。エクソン■およびＶの残部はそれぞれ５
プライムおよび３−プライム非翻訳配列をコードする。
こうして得られるクローン（本明細書中ではラムダ−Ｈ
ＥＰＯＩおよびラムダ−ＨＥＰＯ２と呼ぶ２つのクロー
ンが得られた）が完全なＥＰＯゲノムクローンであると
いうことは、他のトリプシン消化フラグメントのコーデ
ィング情報を含んだ別のエクソンの塩基配列を決定する
ことにより確認できた。
ＣＯＳ細胞によるＥＰＯの発現 本発明は、単離されたＥＰＯｃＤＮＡを含む組換えＤＮ
Ａベクターを調製しそれを用いて哺乳動物細胞を形質転
換させ、そして活性なＥＰＯを生産する方法も提供する
。得られたｃＤＮＡが生物学的に活性なＥＰＯをｉｎ　
ｖｉｔｒｏ細胞培養細胞培養石発現し得ることを確認す
るためには、Ｇｌｕｚｍａｎの方法でＣＯ８細胞の形質
発現実験を行う（１６）。この試験的発現に使用可能な
ベクターＴ）９１０２３　（Ｂ）は実施例４に示される
。このベクターはアデノウィルス主要後期プロモーター
（ｍａｊｏｒ　１ａｔｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ＳＶ４
０ポリＡ付加配列、ＳＶ４０複製開始点、ＳＶ４０エン
ハンサ−１およびアデノウィルスＶＡ遺伝子を含む。前
記ｃＤＮＡクローン、例えばラムダ−ＨＥＰＯＦＬ１３
（第７表を参照）中のｃＤＮＡ挿入物をｐ９１０２３　
（Ｂ）ベクター内のアデノウィルス主要後期プロモータ
ーの下に連結挿入する。本発明者らは、このようにして
得られた新しいベクターをｐＰＴＦＬ１３と命名した。
こうして構築されたベクターで、例えばＣＯ８−１細胞
のＭ６株〔ホロビッツ（ｌｌｏｒｏｗｉｔｚ）らのＪ、
　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｃｎｃｔ、　２　：　１４
７−１４９　（１９８３）を参照〕をトランスフェクシ
ョンし、約２４時間後に細胞を洗浄し、無血清培地に変
え、そして約４８時間後に培養上清を集める。そして、
培養上清中に放出されたＥＰＯの世をＥＰＯに関するＳ
ｈｅｒｗｏｏｄ、　Ｊ、　Ｂ、らの定量的ラジオイムノ
アッセイを用いて試験する（１４）。この方法によれば
、第８表（実施例５）に示すように、免疫学的に反応性
を有するＥＰＯの発現が検出される。生産されたＥＰＯ
の生物学的活性も試験できる。例えば、本発明者らは培
地中のＥＰＯを２つのｉｎ　Ｖ１ｔｒＯバイオアッセイ
（３Ｈ−チミジンおよびＣＦＵ−Ｅ（１，８））および
２つのｉｎ　ｖｉｖｏアッセイ〔低酸素性マウスおよび
飢餓ラット（９，ｔｏ）　）により定量化した（実施例
６の第９表を参照）。これらの結果は、生物学的に活性
なＥＰＯがＣＯＳ　−１細胞で生産されることを示して
いる。
本発明の方法で生産されたＥＰＯがヒト尿から得られた
天然ＥＰＯと同じものであることは、ポリクローナル抗
ＥＰＯ抗体を使用するウェスターンブロッティング（Ｗ
ｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ）により、５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル上で同じ移動度を有していること
から証明された（実施例７を参照）。従って、ＣＯ３−
１細胞で生産されたＥＰＯのグリコジル化の程度は天然
ＥＰＯのそれと同様でありうる。
本発明はまた、ヒトＥＰＯｃＤＮＡの発現のために特に
好適な、他のプロモーターを含む異なるベクターを使用
した、極めて効率的なＥＰＯの生産法も開示する。その
ようなベクターは、ＣＯ８細胞もしくは他の哺乳動物細
胞において使用することができる。本発明の実施に有用
なこの種の他のプロモーターの例にはＳＶ４０初期およ
び後期プロモーター、マウスメタロチオネイン遺伝子プ
ロモーター　トリまたは哺乳動物レトロウィルスの長い
末端繰返し配列中に見出されるプロモーター　バキュロ
ウィルスポリヘドロン遺伝子プロモーターおよびその他
のものが含まれる。
本発明の実施に際して有用な他の細胞の例にはＣＨＯ（
チャイニーズハムスター卵巣）　、ＣＬ２７（サル上皮
）　、３Ｔ３　（マウス線維芽細胞）、ＣＶ−１（アフ
リカン・グリーン・モンキー腎臓）のような哺乳動物細
胞が倉まれる。このように本発明の形質転換体は、哺乳
動物細胞を用いる。
これは大腸菌等の微生物に比べＥＰＯが細胞外へ分泌さ
れるためＥＰＯの精製が容易であること、また生物的活
性に寄与する糖鎖が付加するという利点があるためであ
る。これらの特定のプロモーターおよび／または細胞は
ＥＰＯの発現タイミングや発現レベルの調節、細胞に特
異的な型のＥＰＯの生産、または比較的費用がかからず
容易に制御できる条件下でのＥＰＯ生産細胞の大量増殖
を可能にしうる。細胞培養培地は一般に栄養素塩類溶液
と１０％ウシ胎児血清である。
ＣＨＯ，Ｃ１２７および３Ｔ３によるＥＰ○発現の例は
実施例９および１０（ｃＨＯ）ならびに１２（ｃ１２７
と３Ｔ３）に示される。
実施例１０のようにＣＨ○細胞により生産された組換え
ＥＰＯは慣用のカラムクロマトグラフィー法により精製
した。糖タンパク質中に存在する糖の相対回は、２つの
独立した方法〔（１）レインホールド（ｔ？ｅｉｎｈｏ
！ｄ）、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　
５０　：２４４−２４９−　（、メタツリシス）および
（Ｕ）タケモト（Ｔａｋｅｍｏｔｏ、　Ｉｔ、）　らの
Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１４５　：　２４５（
１９８５）　（独立したシアル酸測定を伴うビリジルア
ミノ化）〕で分析された。これらの方法のそれぞれによ
って得られた結果は申し分なく一致した。
こうして、いくつかの測定が行われて次の平均値を得た
（この場合比較目的のために、Ｎ−アセチルグルコサミ
ンを１とする）。
糖　　　　　相対モル曾 Ｎ−アセチルグルコサミン　　１ ヘキソース類：１，４ ガラクト−ス　　　　０．９ マンノース　　　０．５ Ｎ−アセチルノイラミン酸　　１１ フ　　　コ　　　−　　　ス　　　　　　　　　０．２
Ｎ−アセチルガラクトサミン　０．１ ＊Ｎ−アセチルノイラミン酸は不安定であり、その値は
約０．４〜約１の範囲で変動する。
両方の独立した糖分析法によって有意量のフコースとＮ
−アセチルガラクトサミンが再現可能に観察されたこと
は注目に値する。Ｎ−アセチルガラクトサミンの存在は
タンパク質における〇−結合グリコシル化の存在を示す
。〇−結合グリコシル化の存在はさらに種々の組合せの
グリコシド酵素による糖タンパク質の消化後の５ＤＳ−
ＰＡＧＥ分析によっても示された。特に、酵素ベプタイ
ド、Ｎ−グリコシダーゼＦを使用して、糖タンパク質の
全てのＮ−結合炭水化物を酵素的に除去した後、さらに
、ノイラミニダーゼ消化を行うとＳＤＳ　−ＰＡＧＥ分
析で／１１１１定したそのタンパク質の分子口はさらに
減少した。
精製された組換えＥＰＯのｊｎνｊｔｒｏ生物学的活性
は、アミノ酸組成のデータに基づいて計算されたタンパ
ク質定量値を使用するクリスタル（Ｇ、　Ｋｒｙｓｔａ
ｌ）のＥｘｐ、　ｌｌｅｍａｔｏｌ、、　１１　：　６
４９　（１９８３）に記載の方法（牌臓細胞増殖バイオ
アッセイ）−により検定した。複数の測定において、精
製組換えＥＰＯのｉｎ　ｖｉｔｒｏ比活性は２００，０
００単位／　ｍｇタンパク質以上であると計算された。
平均値は約２７５．０００〜３００，０００単位／　ｍ
ｇタンパク質の範囲であった。さらに、３００，０００
以上の値も観察された。この組換え物質に対して観察さ
れたｉｎ　ｖｉｖ。
〔赤血球増加マウス検定；カザール（Ｋａｚａｌ）およ
びアースレブ（Ｅｒｓｌｅｖ）のＡｍ、　Ｃ１１ｎｉｃ
ａｌ　Ｌａｂ、　Ｓｃｉ、。
Ｖｏｌ、　Ｂ、　ｐ９１　（１９７５）を参照）　／ｉ
ｎ　ｖｉｔｒｏ活性比は０．７〜１．３であった。
先に示した糖タンパク質の特性と、本出願の優先臼より
後の国際公開Ｗ　Ｏ８５／　０２８１０　（１９８５年
６月２０日付）〔特表昭６１−５０１６２７　（１９８
６年８月７日付）〕に記載されている組換えＣＨＯ生産
ＥＰＯ物質の特性とを比較することは興味のあることで
ある。上記公表公報明細書の第２６ページ左下欄に記載
されている対応する糖の比較分析は、Ｎ−アセチルグル
コサミン１に対してフコースおよびＮ−アセチルガラク
トサミンは、ゼロの値を、そしてヘキソース類は１５．
０９と大きな値を報告している。Ｎ−アセチルガラクト
サミンの不在は上記間隙出願に報告された糖タンパク質
中に〇−結合グリコシルが存在しないことを示す。この
物質と対照的に、本発明の組換えＣＨＯ生産ＥＰＯは先
に性状決定がなされたように、再現可能に観察しうる有
意量のフコースとＮ−アセチルガラクトサミンの双方を
含み、ヘキソース類は相対ｎとして１／１０以下であり
、そして〇−結合グリコシルの存在によって差異があり
、本発明で得られるＥＰＯはヒト尿から得られるＥＰＯ
と同一か近似のグリコジル化パターンを有する。さらに
、本発明の上記ＣＨＯ細胞由来組換えＥＰＯの窩い比活
性はそのグリコジル化パターンと直接関連していると考
えられる。
本発明のクローン化ＥＰＯ遺伝子の哺乳動物細胞発現に
より生産された生物学的に活性なＥＰＯは、医師や獣医
師によるヒトおよび哺乳動物種のｉｎ　ｖｉｖｏ治療に
使用できる。活性成分の量はもちろん治療しようとする
症状の程度、選ばれた投与経路、および活性ＥＰＯの比
活性に依るであろうが、最終的には主治医や獣医により
決定されるだろう。主治医によって決定された活性ＥＰ
Ｏのこのような伍は、本明細書中で“ＥＰＯ治療有効”
世と呼ばれる。例えば、ヒツジにおける慢性腎不全に伴
う増殖低下性貧血の治療において、ＥＰＯの一口の有効
量は１５〜４０口の間１０単位／ｋｇであることがわか
った。ニッシュバッハ（Ｅｓｅｈｂａｃｈ）らのＪ、　
Ｃ１ｆｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　７４　：　４３４　　（
１９８４）を参照されたい。
活性ＥＰＯは治療しようとする症状に適する経路で投与
される。好ましくは、ＥＰＯは治療されるべき哺乳動物
の血流中に注射される。好適な投与経路は治療しようと
する症状ごとに変化する。
活性ＥＰＯは純粋な又は実質的に純粋な化合物として投
与することができるが、医薬配合物または医薬製剤とし
てそれを提供することが好ましい。
本発明を使用して得られる配合物は、上記のような活性
ＥＰＯタンパク質のほかに、１種または２種以上の薬剤
上許容される担体と他の治療成分を合釘する。担体は配
合物の他の成分と共存でき■つそれを投与される者に有
害であってはならない。望ましくは、配合物としては酸
化剤やペプチドと共存できないような他の物質を含むべ
きでない。配合物は簡便には単位投与形体（ｕｎｉｔ　
ｄｏｓａｇｃｆｏｒｍ）で提供され、薬剤掌上よく知ら
れた方法により調製される。全ての方法は活性成分と１
種または２種以上の補助成分を含む担体とを混合する工
程を含む。一般に、配合物は活性成分と液体担体または
微細な固体担体またはその両者とを均一にかつ緊密に混
合し、その後必要に応じてその生成物を所望配合物へ成
形することにより作られる。
非経口投与に適する配合物は簡便には活性成分の滅菌水
溶液からなり、その際その溶液は受容者の血液と等張で
あるのが好ましい。この種の配合物は固体活性成分を水
に溶解して水溶液をつくり、その水溶液を滅菌すること
により適宜調製され、そして例えば密封アンプルやバイ
アルのような単位用量容器または多用量容器で提供され
る。
本発明で哺乳動物細胞にヒトＥＰＯを生産させるために
使用されるＥＰＯ／ｃＤＮＡにはＡＴＧコドンの後につ
ながるマチュアＥ　Ｐ　Ｏ／　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ遺伝子、
およびＥＰＯタンパク質の対立遺伝子変異体をコードす
るＥＰＯ／ｃＤＮＡが含まれる。
１つの対立遺伝子は第３〜６表に示される。
ＥＰＯタンパク質にはＥＰＯタンパク質の１−メチオニ
ン誘導体（Ｍｅｔ　−Ｅ　Ｐ　Ｏ）およびＥＰＯタンパ
ク質の対立遺伝子変異体が含まれる。マチュアＥＰ○タ
ンパク質は第２表の配列Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒ
ｇ・・・から始まる配列（最初のアミノ酸残基には番号
ｌ（第２表）が付されている）によって示される。Ｍｅ
ｔ−ＥＰＯは配列Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａ
ｒｇ・−・から始まる。
ＥＰＯ／ｃＤＮＡの発現の結果生成する糖タンパク質は
、形質転換体内または発現系外に存在するタンパク質分
解酵素の作用を受けることが充分考えられ、ＤＮＡ配列
から読みとられるアミノ酸配列１〜１６６のすべてを備
えていないこ吉があり得る。例えばＣ末Ａｒｇの脱離が
、ＣＨＯ発現ＥＰＯについて見出されている。しかし、
この種の糖タンパク質もｉｎ　ｖｉｖｏ活性を釘してお
り、本発明を使用して得られる目的物に含まれる。なお
、Ｃ末Ａｒｇの脱離はヒト尿ＥＰＯについても見出され
ており、ｉｎ　ｖｉｖｏ活性が保持されていることが１
′ｇ認されている。
次の実施例は本発明を理解しやすくするためのものであ
り、本発明の真の範囲は請求の範囲によって説明される
。ここに記載の方法において多くの修飾が本発明の精神
から逸脱することなくなされ得ることを理解すべきであ
る。全ての温度は℃で表わされ未補正である。マイクロ
リッターマイクロモル等に於けるマイクロの略号として
「μ」を用い、それぞれ［μｆ２Ｊ、ｒ郁Ｊとして表わ
す。
実施例 実施例１： ＥＰＯのゲノムＤＮＡ断片クローンの単離ＥＰＯのゲノ
ムＤＮＡを単離するには、ヒトゲノムＤＮＡライブラリ
ーから、適当なヌクレオチドプローブを用いてスクリー
ニングする必要がある。そのプローブの配列は、ＥＰＯ
のアミノ酸配列の少なくとも一部分に対応するものでな
ければならない。そこで、まず、ＥＰＯを再生不良性貧
血患者の尿からミャケらの方法〔ミャケ（旧ｙａｋｃ）
らのＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｃｍ、、　２５２　二５５
５８　（１９７７）を参照〕で精製したが、但しフェノ
ール処理を省略しその代わりに８０℃で５分の熱処理を
行ってノイラミニダーゼを失活させた。精製の最終工程
は、０．１％トリフルオル酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）を含む０
〜９５％アセトニトリル勾配を１００分間で使用するＣ
−４■ｙｄａｅ　ｔ（円７０カラム（Ｔｈｅ　５ｅｐａ
ｒａｔｉｏｎｓ　Ｇｒｏｕｐ）での分画化により行った
。上記勾配中のＥＰＯの位置は、主要ピークのゲル電気
泳動およびＮ末端アミノ酸配列分ｊＪ′Ｉ（２，６，７
）により測定した。
ＥＰＯは約５３％アセトニトリル ＨＰＬＣにかけたタンパク質の約４０％に相当した。
ＥＰＯを含む画分を次いで１００μｇになるまで蒸発さ
せ、重炭酸アンモニウムでｐｌ＋７．０に調節し、２％
トシルフェニルアラニルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ
）処理トリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）により３
７℃で１８時間完全消化した。その後、トリプシン消化
物を上記と同様の逆相ＨＰＬＣにかけた。
２８０ｒ＋ｍおよび２１４μｍでの光学密度を監視した
。
十分に分離した各ピークの成分を乾固状態近くにまで蒸
発させ、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｃｍｓ　４８
０Ａ型気相シークエネーターを使って直接Ｎ末端アミノ
酸配列分析（１７）にかけた。各ピークの成分は第２表
および第３表において下線が施されているアミノ酸配列
を有することが判明した。
先に述べたように、これらのトリプシン消化フラグメン
トのうち２つがヌクレオチドプローブの合成用に選ばれ
た。配列：　Ｖａｌ−Ａｓｎ−　Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−　Ａ
ｌａ−　Ｔｒｐ−　Ｌｙｓ　（第２表および第３表のア
ミノ酸４６〜５２）からは、３２種Ｍ（縮重）の７ｍｅ
ｒ ＡＡ ＴＴＣＣＡＮＧＣＧＴＡＧＡＡＧＴＴ および１２８種類の（縮重）の１８ｍａｒＡＡ ＣＣＡＮＧＣＧＴＡＧＡＡＧＴＴＮＡＣが合成された。
配列：　Ｖａｌ−Ｔｙｒ−　Ｓａｒ−Ａｓｎ−Ｐｈｃ−
　Ｌｅｕ−　Ａｒｇ　（第２表および第３表のアミノ酸
１４４〜１５０）からは、ロイシンコドンの第１位で異
なるそれぞれ４８種類（縮重）の２つの１４ｍａｒプー
ル １’ｉ”ＧＮ　　ｉ’　　ｉ’　　　　　　　　１”Ｉ
’ＧＮ　　’ｆ’　　１’ＴＡＣＡＣＴＡＡＣＴ’ｌ’
ＣＣＴ　　　　　ＴＡＣＡＣＴＡＡＣＴＴＣＴＴが合成
された。これらのオリゴヌクレオチドプローブをポリヌ
クレオチドキナーゼ＜Ｎｅｖ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌ
ａｂｓ）およびガン？””Ｐ　−　Ａ　Ｔ　Ｐ　（Ｎｅ
ｗ　ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ）を用いて３２Ｐで
５−プライム末端を標識した。オリゴヌクレオチドの比
活性はオリゴヌクレオチド１ミリモル当り１０００〜３
０００Ｃｉであった。
この標識プローブを使用して、バクテリオファージラム
ダ中のヒトゲノムＤＮＡ　（ヒト染色体をＨａｅｍ／Ａ
ｌｕｌで切断したＤＮＡ断片）ライブラリー（ｃｈ４Ａ
ベクター使用）（ローン（Ｌａｗｎ）ら、３）をウー（
　Ｗｏｏ）ら、　（１１）　（１９７８）によるｉｎ　
ｓｉｔｕ増幅法の変法を用いてスクリーニングした。即
ち、ヒトゲノムＤＮＡを含む一ヒ記ファージ約３．５Ｘ
ＩＯ５を１５０ｍｍベトリ皿（Ｎ　Ｚ　Ｃ　ＹＭ培地）
当り６０００フアージの密度でまいて、肉眼で見える小
さな（約０．５ｍｍ）プラークが形成されるまで３７℃
でインキュベートした。４°Ｃで１時間冷却後、プラー
クパターンの２通りのレプリカをナイロン膜（Ｎｅｗ　
Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）に移行させ、新しい
ＮＺＣＹＭ平板上３７°Ｃで一晩インキュベー１・した
。その後、フィルターをそれぞれ０．５ＮＮａＯＨ−Ｌ
Ｍ　　Ｎａ（１７および０．５Ｍ　トリス（ｐＨ８）　
　−　ＬＭ　　ＮａＣｌ２の薄膜上で１０分間ずつ処理
することにより変性および中和した。フィルターを８０
℃で２時間真空ベーキングした後、５×ＳＳＣＳ　Ｏ．
５％ＳＤＳで１時間洗い、フィルター表面の細胞破砕物
を湿ったティッシュで穏やかにかき取ることにより除去
した。このかき取りはプローブのフィルターへのバック
グラウンド結合を減少させた。次に、フィルターをＨ２
Ｏですすぎ、３Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭ
ＡＣΩ）　、１０ｍＭ　　Ｎ　ａ　Ｐ　０４　　（ｐＨ
８．８）、５　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．５％Ｓ
ＤＳおよびｌＯｍＭＥＤＴＡ中４８℃で４〜８時間プレ
ハイブリダイゼーションを行った。その後、３２Ｐ−標
識１７ｍｅｒを０．１ｐａ＋ｏｆ／＋ｎｌの濃度で加え
て４８℃で７２時間ハイブリダイゼーンヨンを行った。
ハイブリダイゼーション後、フィルターを２　Ｘ　Ｓ　
Ｓ　Ｃ　（０．３ＭＮ　ａ　Ｃ，Ｑ　−０，０３Ｍクエ
ン酸Ｎａ、ｐＨ７）で室温にて１−分に洗浄し、さらに
３Ｍ　　ＴＭＡＣρＬＯｍ　Ｍ　　Ｎ　ａ　Ｐ　０４（
ｐｌＩ６．８）で室温にて１時間、次にハイブリダイゼ
ーションを行った時と同じ温度（４８°Ｃ）で５〜１５
分間洗浄した。増感板を使用した２０間のオートラジオ
グラフィー後、約１２０の強いレプリカされたシグナル
が検出された。
陽性ファージを拾って８プールに分け、再度ファージプ
ラークを形成させ、２枚のフィルターの各々に対しては
Ｌ４ｍａｒプールの１／２ずつを使用し、２枚口のフィ
ルターに対しては１７＋ｎｃｒを使用して３通りの再ス
クリーニングを行った。プラーク形成およびハイブリダ
イゼーションの条件は先に述べた通りであるが、１４ｍ
ｅｒについてのハイブリダイゼーションは３７℃で行っ
た。オートラジオグラフィー後、室温にて２０分間５０
％ホルムアミド中でＨｍｅｒフィルターからプローブを
除去し、そのフィルターを５２℃で１８ｍａｒプローブ
と再度ハイブリダイズさせた。２つの独立のファージが
３種のプローブ全部とハイブリダイズした。
これらのファージの１つ（本明細書ではラムダＨＥＰＯ
Ｉと呼ぶ）からのＤＮＡを５ａｕ３Ａで完全消化し、Ｍ
１３中でサブクローニングし、サンガーおよびクールソ
ン、（４）のジデオキシ・チエイン・ターミネーション
法によるＤＮＡ配列分析のためにＭ１３というベクター
（市販品）に組込み、大腸菌に挿入し、増殖させた。Ｅ
ＰＯトリプシン消化フラグメント（第１表下線領域）を
コードするオープン・リーディング・フレームのヌクレ
オチド配列および推定上のアミノ酸配列を本明細書中第
１表に示す。イントロン配列は小文字で表わされ、エク
ソン配列（８７ヌクレオチド）は大文字で表わされる。
コンセンサススプライス受容部位（ａ）および供与部位
（ｄ）と一致する配列には下線が施されている。第１表
の配列は、そのま−第４表の配列の一部を構成している
。
実施例２：ヒト胎児肝ｆＱ　ｍ　ＲＮ　Ａのノーザン分
析本実施例では上記ヒト胎児肝臓ｍＲＮＡのライブラリ
ーを作成し、このライブラリー中に目的とするｍＲＮＡ
が存在することを確認し、またそのｍＲＮＡのおよその
サイズを測定することを目的としている。
５μｇのヒト胎児肝臓ｍＲＮＡライブラリー（２０週口
の胎児肝臓から調製したもの）および成人肝１９ｍＲＮ
Ａライブラリーを０．８％アガロースホルムアルデヒド
ゲルによる電気泳動に付し、ダーマン（Ｄｅｒｍａｎ）
らのＣｅ１１．２３　：　７３１　（１９８１）に記載
の方法を用いてニトロセルロースに移行させた。
これと別に、第１表に示す配列を押入物中に含むＭ１３
テンプレートから、ノーザン分析用の９５ヌクレオチド
−本鎖プローブを作成した。その際、プライマーとして
は初めの１７ｍａｒプローブと同じトリプシン消化フラ
グメントから誘導された２０ｍａｒのものを使用した。
プローブはアンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）らのＰＮ
ＡＳ、　（１２）　（１９８４）に記載された方法で作
成したが、ＳｍａＩ消化（７４ヌクレオチドのコープイ
ンク゛配列を念む９５ヌクレオチド長の目的プローブを
もたらす）後、０．ＩＭＮ　ａ　ＯＨ−Ｌ２Ｍ　　Ｎａ
ＣｆＩ中セファ０−スＣ１４Ｂカラムでのクロマトグラ
フィーによりその９５ｍｃｒの小さなフラグメントをＭ
１３テンプレートから精製した。
このプローブ約５　Ｘ　１１０６ｃｐを、上記二ｌ・ロ
セルロースフィルターと６８°Ｃで１２時間ハイブリダ
イズさせ、６８℃にて２ＸＳＳＣで洗浄し、増感板を用
いて６日間感光させた。１２００ヌクレオチドの単一の
マーカーｍＲＮＡ　（矢印で示す）は隣接レーンで泳動
させた。（第１図） その結果、ヒト胎児肝臓ｍＲＮＡライブラリー中に、プ
ローブとハイブリダイズする一本のバンドが見出された
。
実施例３：胎児肝臓ｃＤＮＡの単離 前記ノーザン分析の結果、胎児肝臓のｍＲＮＡからｃＤ
ＮＡライブラリーを作成し、この中からスクリーニング
を行えば、ヒトＥＰＯｃＤＮＡが単離できると予測され
た。そこで、実施例２に記載のプローブと同じ９５ｍｅ
ｒのプローブを使用し、そして標準プラークスクリーニ
ング〔ベントン・デービス（Ｂｅｎｔｏｎ　Ｄａｖｉｓ
）の５ｃｉｅｎｃｅ、　（１３）　（１９７７）を参照
〕方法を使用して、胎児肝臓ｍＲＮＡ誘導され、ベクタ
ーラムダ−Ｃｈ２１Ａ［トール（１”ｏｏ　Ｉ　ｃ）ら
のＮａｔｕｒｅ、　（５）　　（１９８４）を参照〕中
に作られた胎児肝臓ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニ
ングした。その結果、１×１０６個のプラークをスクリ
ーニングした後に３つの独立の陽性ｃＤＮＡクローン〔
本明細書ではラムダ−ＨＥＩ）ＯＰＬ６　（１３５０ｂ
ｐ）、ラムダ−ｔｌＥＰＯＰＬ８　（７００ｂｐ）およ
びラムダ−１圧ＰＯＦＬ１３　（１４００ｂｐ）と呼ぶ
〕を単離した。
ラムダ−＋１ＥＰＯＰＬ１３およびラムダ−１１ＥＰＯ
ＦＬ６の完全挿入物についてはＭＬ３でのサブクローニ
ング後に塩基配列を決定した。それぞれの塩基配列を第
７表および第５表に示す。ラムダ利ＪＥＰＯＦＬ８につ
いても部分的に塩基配列を決定し、残りの部分は他の２
つのクローンと同じであると推定した。その塩基配列を
第６表に示す。５−プライムおよび３−プライム非翻訳
配列は小文字で表わされる。
コーディング領域は大文字で表わされる。
明細書の浄書（内容に変更なし） 第６表 ＣＣＣｇｇＣＣｇ ｃｔｃｇｃｔｇ、ａｇｅ ｔｇｃｇｃｃｇｃａｃ ｃｇｃｇｃｔｇｔｃｃ ｔｃｃｃｇｇａｇｃｃ ｇｇａｃｃｇｇｇｇｃ ｃａｃｃｇｃｇｃｃｃ ｇｃｔｃｔｇｃｔｃｃｇ ａｃａｃｃｇｃｇｃｃ ｃｃｃＪｇａｃａｇ ｃｃｇｃｃｃｔｃｔｃ ｃｔｃｃａｇｇｃｃｃ ｇｔｇｇｇｇｃｔｇｇ ｃｃｃｔｇｃａｃｃｇ ｃｃｇａｇｃｔｔｃｃ ｃｇｇｇａｔｇａｇｇｇ ｃｃｃｃｃｇｇｔｇｔ ｇｇｔｃａｃｃｃｇｇ ｃｇｃｇｃｃｃｃａｇ １ｇｔ　ｃ　ｇｃ　ｔ　ｇａｇｇ ｇａｃｃｃｃｇｇｃｃ 明細書の浄書（内容（二変更なし） 第６表（続き） 第７表（および第３表）に関して、ヌクレオチド配列の
上に示される推定上のアミノ酸配列は成熟タンパク質の
第１番目のアミノ酸を１として番号が付けられている。
推定上のリーダーペプチドはアミノ酸の略号が大文字で
示される。成熟タンパク室中のシスティン残基はさらに
ＳＨで示され、またＮ−結合グリコシル化の可能性があ
る部位は星印で示される。下線が施されているアミノ酸
は、Ｎ末端タンパク質配列決定または実施例１で述べた
ようなＥＰＯのトリプシン消化フラグメントの配列決定
により同定されたアミノ酸残基を示す。
点線は明確に決定し得なかったトリプシン消化フラグメ
ントのアミノ酸配列中の残基を示す。
ｃＤＮＡクローンのラムダ−１１ＥＰＯＦＬ６、ラムダ
ＩＥＩ）０１”Ｌ８およびラムダ−ＨＥＰＯＦＬ１３は
メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクションに寄託され、それぞれ寄託番号Ａ
１″ＣＣ４０１５６，Ａ１’ＣＣ４０１５２およびＡＴ
ＣＣ４０１５３として人手可能である。
参考例１：ＥＰＯ遺伝子のゲノム構造 本発明者等はＥＰＯゲノムＤＮＡの構造および塩基配列
も明らかにした。実施例３で得た３種類のＥＰＯｃＤＮ
Ａクローンから調製されたオリゴヌクレオチドおよび種
々のプローブを用いてヒトゲノムＨａｅＩＩＩ　／　Ａ
　Ｉ　ｕ　Ｉライブラリー（ｃｈＡ４ベクター使用）を
スクリーニングを行い、４個の独立したゲノムクローン
を得た。これら４個の独立したゲノムクローン（ラムダ
−ＨＥＰＯＩ、２゜３および６）の相対的な大きさおよ
び位置は、第３図において重複する線によって示される
ことが判明している。太くて濃い３．３ｋｂの線がＥＰ
Ｏ遺伝子の存在する部分である。既知制限エンドヌクレ
アーゼ切断部位の位置とスケール（ｋｂ）も示されてい
る。次に、ＥＰＯ遺伝子を含む領域は、この領域の一連
の欠失を生じさせる特異的エキソヌクレアーゼ■を使用
して、両路から完全に塩基配列が決定された。ＥＰＯｍ
ＲＮＡをコードする５つのエクソンとイントロンの構造
の模式図を第４図に示す。エクソン■の正確な５−プラ
イム境界は今のところ不明である。それぞれのエクソン
のタンパク質コーディング部分は黒く塗りつぶされてい
る（この領域の完全なヌクレオチド配列は既に第４表に
示した）。第４図において、各エクソンの既知範囲は垂
直線で示される。エクソンＩの一部、エクソン■、■お
よび■の全部、およびエクソンＶの一部がタンパク質コ
ーディング情報を含む。エクソン■およびＶの残部はそ
れぞれ５−プライムおよび３−プライム非翻訳配列をコ
ードする。ゲノムクローンのラムダ−ＨＥＰＯｌ、ラム
ダ−ＨＥＰＯ２，ラムダ−ＨＥＰＯ３およびラムダ−Ｈ
ＥＰＯ６はメリーランド州ロックビルのアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクションに寄託され、それぞれ
寄託番号ＡＴＣＣ４０１５４゜ＡＴＣＣ４０１５５，Ａ
ＴＣＣ４０１５０およびＡＴＣＣ４０１５１として入手
可能である。
実施例４：ベクターｐ　９１０２３（Ｂ）の作成形質転
換用ベクターとしてカウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）らの
Ｈｏｔ、　Ｃｅ１ｌ　ｌ３ｉｏ１．、２　：　１３０４
　（１９８２）に記載のｐＡｄＤ　２６ＳＶｐＡ　（３
）を用イタ。コノヘクター（１）４７４造は第５Ａ図に
示す。簡単に述べれば、このプラスミドはアデノウィル
ス（Ａ　ｄ　２）主要後期プロモーターの転写制御下に
あるマウスジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）ｃＤＮＡ
遺伝子を含む。
５−プライムスプライス部位はアデノウィルスＤＮＡ中
に示され、３−プライムスプライス部位（免疫グロブリ
ン遺伝子から誘導される）はＡｄ２主要後期プロモータ
ー（ｉａｊｏｒ　ｌａｔｅｐｒｏｍｏｔｅｒ）とＤＨＦ
Ｒ−ｙ−ディング配列の間に存在する。ＳＶ４０初期ポ
リＡ部位はＤＨＦＲコーディング配列から下流に存在す
る。ｐＡｄｏ　２６ＳｖｐＡ（３）の原核生物由来部分
はｐｓＶＯｄ　　Ｃメロン（Ｍｅｌｌｏｎ）らのＣｅ１
１．２７　：　２７９（１９８１）を参照〕から山来し
、哺乳動物細胞内で複製を阻害することが知られている
ｐＢＲ３２２配列を含まない〔ラスキー（Ｌｕｓｋｙ）
らのＮｅｔｃ＋ｒｅ、　２９３　：　７９（１９８１）
を参照〕。
ｐＡｄＤ　２６ＳＶｐＡ　（３）は第５Ａ図オヨび第５
Ｂ図に示すようにプラスミドｐｃＶｓＶＬ　２へ変換し
た。
ｐＡｄＤ　２８ＳＶｐＡ　（３）はその中の２個のＰ　
ｓｔ　Ｉ部位の一方を欠失させることによりプラスミド
ｐＡｄＤ　２８ＳＶｐＡ　（３）（ｄ）Ｉ：変換した。
コノ変換は１個のＰｓｔＩ部位のみが切断された線状プ
ラスミドのサブ集団を得るために酵素活性を弱めたＰｓ
ｔＩで部分消化し、続いてフレノウ（Ｋ　Ｉ　ｅｎｏｖ
）で処理し、連結して環状化し、そしてＳＶ４０のポリ
Ａ配列の３−プライム側に位置するＰｓｔＩ部位の欠失
についてスクリーニングすることにより達成された。
次イテ、ｐＡｄＤ　２８ＳＶｐＡ　（３）　（ｄ）　ｌ
：、以下ノヨうにしてアデノウィルス３分節系（ｔｒｉ
ｐａｒｔｊｔｅ）リーダーおよびウィルス関連遺伝子（
ＶＡ遺伝子）を挿入した。即ち、最初に、ｐＡｄＤ　２
６ＳＶｐＡ　（３）（ｄ）をＰｖｕＵで切断して、３分
節系リーダーからなる３つの要素の３−プライム部分内
で開環した線状分子を作った。次に、ｐＪＡＷ４３　Ｃ
ゼイン（Ｚａｉｎ）らのＣｅ１ｌ、　１６　：　８５１
　（１９７９）を参照〕をＸｈｏＩで消化し、フレノウ
で処理し、ＰｖｕＩＩで消化し、そして第３番口のリー
ダーの第２部分を含む１４０ｂｐフラグメントをアクリ
ルアミドゲル（トリス−ホウ酸緩析液中６％；マニアチ
スらの上記文献参照）による電気泳動により単離した。
その後、この１４０ｂｐフラグメントをＰｖｕＩＩで消
化したｐＡｄＤ　２６ＳＶｐＡ　（３）（ｄ）へ連結し
た。コノ連結生成物を用いて大腸菌をテトラサイクリン
耐性へと形質転換し、Ｌ４０ｂｐフラグメントとハイブ
リダイズする３２Ｐ標識プローブを使用するグルンスタ
イン（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ）−ホグネス（ｌｌｏｇｎｅ
ｓｓ）法によりコロニーを選択した。ポジティブにハイ
ブリダイズするコロニーからＤＮＡを調製して、再構成
されたＰｖｕＩＩ部位が第２および第３アデノウィルス
後期リーダーに特異的なＬ４０ｂｐ　Ｄ　Ｎ　Ａ挿入物
の５−プライム側にあるかあるいは３−プライム側にあ
るかについて試験した。正しい向きのＰｖｕＩＩ部位は
１４０ｂｐ挿入物の５−プライム側に存在する。このプ
ラスミドは第５Ａ’図にｐＴＰＬとして示される。
次に、ｐＴＰＬにＳＶ４０エンハンサ−を含むＳＶ４０
のＡｖａＩＩＤフラグメントを挿入するため、第５Ｂ図
に示すようにＳＶ４０　　ＤＮＡをＡｖａｌＩで消化し
、Ｐｏ１Ｉのフレノウフラグメントで両末端を平滑にし
、これらのフラグメントにＸｈｏｌリンカ−を連結し、
ＸｈｏＩで消化してＸｈｏＴ部位を開き、そしてゲル電
気泳動で４番口に大きいフラグメント（Ｄフラグメント
と呼ぶ）を単離した。このＤフラグメントをＸｈｏＩ消
化ｐＴＰＬに連結してプラスミドｐＣＶＳＶＬ２−ＴＰ
Ｌを得た。
ｐＣＶＳＶＬ２−ＴＰＬ中の５Ｖ４０Ｄフラグメントの
向きは、ＳＶ４０後期プロモーターがアデノウィルス主
要後期プロモーターと同じ向きで存在するものであった
。
ｐＣＶＳ￥Ｌ２−ＴＰＬ内にアデノウィルス関連（ＶＡ
）遺伝子を導入するために、ＶＡ遺伝子供給源としての
アデノウィルス２ｆｆｉＨｉｎｄｌｌｌＢフラグメント
を含むプラスミドｐＢＲ３２２を作成した。即ち、アデ
ノウィルス２ＦＤＮＡをＨｉｎｄｅｒで消化して、Ｂフ
ラグメントをゲル電気泳動により単離した。このフラグ
メントをあらかじめＨｊｎｄｌＩＩで消化したｐＢＲ３
２２の中に挿入し、第５Ｂ図に示すｐ　Ｂ　Ｒ３２２−
Ａｄ　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩＢを得た。
このフラグメント（アンピシリン耐性をマーカーとして
持つ大腸菌を形質転換した後、形質転換体をＨｊｎｄｍ
Ｂプラスミドの挿入についてアンピシリン耐性を指標に
スクリーニングし、挿入された向きを制限酵素消化によ
り調べた。ｐＢＲ３２２Ａｄ　Ｈｌｎｄ　ｍＢは第５Ｂ
図に示す向きでアデノウィルス２型ＨｊｎｄＩＩＩＢフ
ラグメントを含む。
第５Ｂ’図に示すように、ＶＡ遺伝子はプラスミドｐ　
Ｂ　Ｒ３２２−Ａｄ　Ｈｌｎｄ　ＩＩＩＢをＨｐａＩで
消化し、ＥｃｏＲＩリンカ−を付加してＥｃｏＲＩで消
化し、続いて１．４ｋｂフラグメントを回収することに
より得られる。このＥｃｏＲＩ接着末端をもつ］、４ｋ
ｂフラグメントは、次に前もってＥｃｏＲＩで消化した
ｐＣＶＳＶＬ２−ＴＰＬのＥｃｏＲＩ部位に連結した。
得らねたプラスミドで大腸菌ＨＢ　１０１を形質転換し
てテトラサイクリン耐性を指標にして選別した後、ＶＡ
遺伝子に特異的なりＮＡに対するフィルターハイブリダ
イゼーションによりコロニーをスクリーニングした。
ポジティブにハイブリダイズするクローンからＤＮＡを
調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化により同定した。
得られたプラスミドはｐ　９１０２３と命名した（第５
Ｂ’図）。
続いてｐ　９１０２３に存在する２個のＥｃｏＲＩ部位
を除去するため、第５Ｃ図に示すように、ｐ　９１０２
３をＥｃｏＲＩで完全消化して２つのＤＮＡフラグメン
ト（一方は約７ｋｂであり、他方はＶＡ遺伝子を含んで
おり、約１．３ｋｂである）を生成させた。両フラグメ
ントの末端をＰｏ１Ｉのフレノウフラグメントを用いて
夫々修復し、次にその２つのフラグメントを再度連結し
た。ＶＡ遺伝子を含み、ｐ　９１０２３に類似するが２
個のＥｃｏＲ１部位を欠失したプラスミドｐ９１０２３
　（Ａ）は、ＶＡ遺伝子フラグメントを使用するグルン
スタインーホグネススクリーニングにより、または慣用
の制限部位分析により同定した。
さらに、ｐ９１０２３　（Ａ）中の単一のＰｓｔＩ部位
を除き、その代わりにＥｃｏＲｒ部位を入れた。即ち、
ｐ９１０２３　（Ａ）をＰｓｔＩで完全消化し、Ｐｏ１
Ｉのフレノウフラグメントで処理して平滑末端を生成さ
せた。ｐ９１０２３　（Ａ）のその平滑末端化ＰｓｔＩ
部位にＥｃｏＲＩリンカ−を連結した。平滑末端化Ｐｓ
ｔＩ部位にＥｅｏＲＩリンカ−を連結させた線状ｐ９１
０２３　（Ａ）を非連結リンカ−から分離し、ＥＣ０Ｒ
Ｉで完全消化して再び連結させた。第５Ｃ図に示すプラ
スミドｐ９１０２３　（Ｂ）を回収し、ｐ９１０２３　
（Ａ）に類似するがＰｓｔＩ部位の代わりにＥｅｏＲ１
部位を有するものを単離同定した。
プラスミドｐ９１０２３　（Ｂ）はメリーランド州ロッ
クビルのアメリカン・タイプ−カルチャー争コレクショ
ンに寄託され、寄託番号ＡＴＣＣ３９７５４として入手
可能である。
実施例５：ＣＯ３−１細胞中でのＥＰＯｃＤＮＡの発現
例１ ｃＤＮＡクローン（ラムダ−ＥＰＯＦＬ６およびラムダ
−ＥＰＯＦＬ１３．実施例３参照）をプラスミドｐ９Ｌ
Ｏ２３（Ｂ）に挿入した。挿入後のプラスミドをそれぞ
れｐＰＴＦＬ６およびｐＰＴＦＬ４３と命名した。その
後、それぞれのプラスミドからの精製ＤＮＡ８μｇを用
いて５×１０６個のＣＯ３−１細胞をＤＥＡＥ−デキス
トラン法（以下参照）によりトランスフェクションした
。１２時間後、細胞を洗浄し、クロロキン（０，１ｍ、
Ｍ）で２時間処理し、再び洗浄し、そして１０％ウシ胎
児血清を含む培地１０ｍ１に２４時間さらした。その培
地を無血清培地４ｍｌに変えて４８時間後に収穫した。
免疫学的に活性なＥＰＯの生産は、シェアウッド（Ｓｈ
ｅｒｗｏｏｄ）およびゴールドバッサ−（Ｇｏｌｄｗａ
ｓｓｅｒ）　　（１４）により示されるラジオイムノア
ッセイにより定量化した。抗ＥＰＯ抗体はシュディス・
シェアウッド博士（Ｄｒ、　ＪｕｄｉｔｈＳｈｅｒｗｏ
ｏｄ）により提供された。ヨウ素化トレーサーは実施例
１に記載の均一なＥＰＯから製造した。検定の感度は人
体１　ｎｇ／　ｍｌである。結果を下記の第８表に示す
。
第　　　８　　　表 培地中に放出された ベ　り　　タ　　−　　　　ＥＰＯの量　（ｎｇ／ｍｌ
　）ｐＰＴＦＬ１３　　　　　　３３０ ｐ　Ｐ　Ｔ　Ｆ　Ｌ　６　　　　　　　３１ｐＰＴＦＬ
１３はメリーランド州ロックビルのアメｌカン・タイプ
・カルチャー・コレクションに寄託され、寄託番号ＡＴ
ＣＣ３９９９０のもとに入手可能である。
実施例６：Ｃ０８−１細胞中でのＥＰＯｃＤＮＡの発現
例２ ＥＰＯｃＤＮＡ　（ラムダ−ＨＥＰＯＦＬ１３）をｐ９
１０２３　（Ｂ）に挿入し、ＣＯ３−１細胞をトランス
フェクションして上記（実施例５）のように収穫した。
ただしクロロキン処理を省いた。
ｉｎ　ｖｉｔｒｏで生物学的に活性なＥＰＯは、ＣＦＵ
−Ｅ源としてマウス胎児肝臓細胞を用いるコロニー形成
検定またはフェニルヒドラジン注射マウスからの牌臓細
胞を用いる３Ｈ−チミジン取込み検定により測定した。
これらの検定の感度は大体２５ｍＵ／ｍｌである。ｉｎ
　ｖｉｖｏで生物学的に活性なＥＰＯは低酸素性マウス
法または飢餓ラット法により測定した。これらの検定の
感度は大体１００ｍｕ／ｍｌである。フントロール実験
で得られた培地（ｍｏｃｋ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｍｅ
ｄｉｕｎ）からの検定では活性が全く検出されなかった
。クローンＨＥＰＯＦＬＬ３によって発現されたＥＰＯ
の結果は下記の第９表に示す〔活性は単位／ｍｌで表わ
し、標準対照として市販の比活性の明示されたＥ　Ｐ　
Ｏ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を使用した〕。
第　　　９　　　表 ＥＰＯｃＤＮＡでトランスフェクションＩＡ ＣＦＵ−Ｅ ３Ｈ−Ｔｈｙ 低酸素性マウス 飢餓ラット １１００ｎ／ｍ ２±０．５Ｕ／ｍ ３．１±１．８Ｕ／ｍ ＩＬＪ／ｍ ２［Ｊ／＋ｒ＋ 実施例７：ＣＯ５−１細胞からのＥＰＯの５ＤＳＥＰＯ
ｃＤＮＡ　（ラムダ−ＨＥＰＯＦＬ１３）を含むベクタ
ーｐ９１０２３　（Ｂ）でトランスフェクションされた
ＣＯ８細胞から培地に分泌されたＥＰＯ１８０ｒ１ｇを
１０％Ｓ　Ｄ　Ｓ　　Ｌ　ａｅｍｌｌｉのポリアクリル
アミドゲルによる電気泳動にかけ、ニトロセルロース紙
に電気移動させた〔トービン（Ｔｏｗｂｉｎ）らのＰｒ
ｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅｃｄ、　Ｓｅｉ、　ＬＩＳＡ
　７６　：　４３５０（１９７９）を参照〕。このフィ
ルターは実施例５に記載されたような抗ＥＰＯ抗体を用
いて検索し、洗浄し、そして１２５Ｉ−黄色ブドウ球菌
Ａプロティンを用いて再度検索した。その後２日間オー
トラジオグラフィーを行った。天然の均−ＥＰＯは実施
例１に記載されたものを使用し、ヨウ素化前（レーンＢ
）またはヨウ素化後（レーンＣ）に電気泳動を行った（
第６図参照）。使用したマーカーは３５Ｓメチオニン標
識された血清アルブミン（６８，０００ｄ）および卵白
アルブミン（４５，０００ｄ）であった。
実施例８　：　ｐＲＫｌ　−４の作成 実用上の目的に適し、１つのプロモーターにより目的ｃ
ＤＮＡ、ＤＨＦＲの２つの遺伝子が支配される特徴を持
つ発現ベクターを作成するため、次に述べるフラグメン
トＡ、ＢおよびＣを連結してプラスミドＲＫＩ−４を作
成した。このプラスミドは第７図の構造を持ち、特に実
用的特徴がある。
フラグメントＡは次のようにして得られた。
マウスジヒドロ葉酸還元酵素（Ｄ　ＨＦ　Ｒ）遺伝子に
隣接するＳＶ４０初期領域プロモーターＳＶ４０エンハ
ンサ−小さなｔ抗原イントロン、およびＳＶ４０ポリＡ
配列を含むプラスミドＰＳＶ２ＤＨＦＲ［サブラフ　ニ
ー　（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ）らのＭｏｔ、　Ｃｅ１１．
　Ｂｉｏｌ、、　Ｌ　：　８５４−８６４　（１９８１
）を参照〕からＢａｍＨＩ　−ＰｖｕＩｒフラグメント
を単離した（フラグメントＡ）。
残りのフラグメントＢおよびＣは次のようにしてベクタ
ーｐ９ＬＯ２３（Ａ）　　（実施例４および第５Ｃ図参
照）から得られた：　ｐ９１０２３　（Ａ）をアデノウ
ィルスプロモーターの近くの単一のＰｓｔＩ部位でＰｓ
ｔＩにより消化してこのプラスミドを線状化し、次にＰ
ｓｔＩ　−ＥｅｏＲＩ部位へ変換するための合成フラグ
メントに連結して再環状化する［もとのＰｓｔＩ部位に
ＰｓｔＩ　−ＥｃｏＲＴ　−ＰｓｔＩ部位を作る；　ｐ
　９１０２３　（Ｂ’）　］か、あるいは実施例４で述
べたようにＤＮＡポリメラーゼＩの大フラグメントで処
理してＰｓｔＩ部位を破壊し、合成ＥｃｏＲＩリンカ−
に連結して再環状化した〔もとのＰｓｔＩ部位にＥｃｏ
Ｒ部１部位を作る。　ｐ９ＬＯ２３（Ｂ）　）。
得られた２つのプラスミドｐ　９１０２３　（Ｂ）とｐ
９１０２３　（Ｂ’）の各々をＸｂａＩおよびＥｃｏＲ
Ｔで消化して２つのフラグメント（ＦおよびＧ）を得た
。ｐ９１０２３　（Ｂ）からのフラグメントＦとｐ　９
１０２３　（Ｂ’）からのフラグメントＧおよびｐ　９
１０２３　（Ｂ）からのフラグメントＧとｐ　９１０２
３（Ｂ′）からのフラグメントＦを連結することにより
、もとのＰｓｔＩ部位にＥｅｏＲＴ　−ＰｓｔＩ部位ま
たはＰｓｔ　Ｉ　−ＥｅｏＲＩ部位のいずれかを含む２
つの新しいプラスミドを作成した。ＰｓｔＩ　−Ｅｅｏ
ＲＩ部位を含むプラスミド（Ｐ　ｓｔ　Ｉ部位がアデノ
ウィルス主要後期プロモーターに最も接近している：プ
ロモーターに近接している位置に目的ｃＤＮＡを挿入で
きるようにＰｓｔＩサイトが設けられている）をｐ９１
０２３　（ｃ）と命名した。
ベクターｐ９１０２３　（ｃ）をＸｈｏＩで完全消化し
、接着末端をもつ得られた線状プラスミドは大腸菌のＤ
ＮＡポリメラーゼＩ大フラグメントを用いる末端修復反
応により平滑末端とした。このＤＮＡに、次のようにし
て作成したＳＶ４０エンノ１ンサー含有の３４０ｂｐ　
Ｈｉｎｄ　ｍ　−ＥｃｏＲＩ　７ラグメントを連結した
： ＳＶ４０からのＳＶ４０複製開始点およびエンハンサ−
を含むＨｉｎｄ　ｍ　−ＰｖｕＩＩフラグメントをプラ
スミドｃｌａｃ［リトル（Ｌｌｔｔｌｓ）　　らのＭｏ
１．　Ｂｉｏｌ。
Ｍａｄ　、、　１　：　４７３−４８８　（１９８３）
を参照〕に挿入した。
ｃｌａｃベクターはｃ　ｌａｃ　ＤＮＡをＢａｍＨＩで
消化し、接着末端をＤＮＡポリメラーゼ■大フラグメン
トで修復し、そのＤＮＡをＨｉｎｄＩＩｒで消化するこ
とにより調製した。得られたプラスミド（ｅ　５ＶＨＰ
　　Ｉａｅ）はＰｖｕｌＩ平滑末端を連結されたことに
よりＢａｍＨＩ部位を再生していた。
ｅ　５ＶＨＰ　　ｌａｅからＥｃｏＲＩ　−Ｈｉｎｄ　
■７ラグメントを作り、プラスミドの複製開始点を含む
ｐｓＶＯｄ　（実施例４に示したメロンらの上記文献参
照）のＥｃｏＲＩ　−Ｈｌｎｄ　ＩＩＩフラグメントに
連結し、得られたプラスミドｐｓＶＨＰＯｄを選択した
。その後、ＳＶ４０複製開始点／エンハンサ−を含むｐ
ｓＶＨＰＯｄの３４０ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−Ｈｉｎｄ■
フラグメントを作り、両末端をＤＮＡポリメラーゼ■大
フラグメントで平滑末端とし、そして上記のＸｈｏＩ消
化し、平滑末端化ｐ９１０２３　（ｃ）ベクターに連結
した。
Ｈｉｎｄ　ｍ　−ＥｃｏＲＴフラグメント中のＢａｍＨ
ｒ部位がＶＡ遺伝子に最も接近するような向きをもつ得
られたプラスミド（ｐ　９１０２３　（ｃ）　／　Ｘ　
ｈｏ　Ｉ　／平滑末端プラスＥ　ｅｏＲＩ　／　Ｈｉｎ
ｄ　ｍ／平滑末端ＳＶ４０複製開始点プラスエンハンサ
−）はｐＥＳ１０５と命名した。このプラスミドｐ　Ｅ
　Ｓ　１０５をＢａｍＨＩとＰｖｕＩＩで、またはＰｖ
ｕＩＩだけで消化して、アデノウィルス主要後期プロモ
ーターを含むＢａｍＨＩ　−ＰｖｕＩＩフラグメント（
フラグメントＢ）および耐性遺伝子（テトラサイクリン
耐性）と他の配列との間にそのプラスミドを含むＰｖｕ
ＩＩフラグメント（フラグメントＣ）を単離した。
フラグメントＡ、　　ＢおよびＣを連結し、第７図に示
すプラスミドを単離してＲＫＩ−４と命名した。プラス
ミドＲＫＩ−４はメリーランド州ロックビルのアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、寄
託番号ＡＴＣＣ３９９４０のもとに入手可能である。
実施例９：ＣＨＯ細胞によるＥＰＯの発現−方法■ 上記実施例５のプラスミドｐＰＴＦＬ１３からのＥＰＯ
ｃＤＮＡを含むＤＮＡ　（２０，ｚｇ）を制限エンドヌ
クレアーゼＣ１ａＩで消化して線状化し、そしてプラス
ミドｐＡｄＤ　２６ＳＶｐ　（Ａ）　１　（カウフマン
等のＭｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　２　：　１
３０４　（１９８２））からのＣＩａＩ消化ＤＮＡ　（
２μｇ）　　Ｃアデノウィルス主要後期プロモーターに
より制御される完全なジヒド口葉酸還元酵素（Ｄ　ＨＦ
　Ｒ）を含む〕に連結した〔カウフマン（Ｋａｕｆｍａ
ｎ）およびシャープ（５ｈａｒｐ）のＭｏ１．　ａｎｄ
　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　２　：　１３０４−１３１９
　（１９８２）を参照〕。この連結ＤＮＡを使ってＤＨ
ＦＲ−ネガティブＣＨＯ細胞［ＤＵＫＸ−Ｂ　Ｉ　Ｉ、
カーシン（ｃｈａｓｉｎ　Ｌ、　Ａ、）およびアーラウ
プ（υｒＩａｕｂ　Ｇ、）のＩ）ＮＡＳ　７７　：　４
２１Ｂ−４２２０（１９８０）を参照〕をトランスフェ
クションし、２日間増殖後、少なくとも１つのＤＨＦＲ
遺伝子を組み込んだ細胞をアルファ培地（ヌクレオチド
を欠き、１０％透析ウシつ児血清を補充したもの）で選
択した。選択培地で２週間増殖後、コロニーをもとの平
板から採取し、１ブール当り１０〜１００個のコロニー
から成るグループに分け、再度ヌクレオチド欠損培地で
培地上全面に増殖するまで培養した。増殖プールからの
培地上清をメトトレキセー）　（ＭＴＸ）選択に先立っ
てＲＩＡでＥＰＯについて検定した。陽性のＥＰＯ生産
を示したプールはメトトレキセート（０，０２μＭ）の
存在で増殖させ、サブクローニングして再度検定した。
ＥＰＯＣｌａ　　４α４．０２（ＭＴＸ耐性のものを精
製したもの）プールからサブクローニングされた単一の
ＥＰＯＣ１ａ４α４．０２−７は０．０２μＭ　ＭＴＸ
を含む培地中に４６０ｎｇ／ｍｌのＥＰＯを放出した（
第１０表参照）。
ＥＰＯＣ１ａ　　４ａ４．０２−７はＥＰＯ生産に特に
適する細胞株であり、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクションに寄託番号ＡＴＣＣＣＲＬ　８６９５と
して寄託された。一般に、このクローンは次第に増加す
る濃度のＭＴＸ中で段階的選択にかけると、さらに高レ
ベルのＥＰＯを生産する細胞を生成するであろう。ＲＩ
Ａで陰性であったプールについては、メトトレキセート
（０，０２μＭ）の存在下で増殖した相対培養物からの
メトトレキセート耐性コロニーをＲＩＡでＥＰＯについ
てプールごとに再び検定した。陽性でなかったこれらの
培養物をサブクローニングし、さらに濃度を高めたメト
トレキセート中で増殖させた。
段階的にメトトレキセート（ＭＴＸ）濃度を上げて培養
する選択は、次第に増加する濃度のメトトレキセートの
存在下で細胞を培養して生存細胞を選択するというサイ
クルを繰り返すことにより達成された。各回ごとに培養
上清中のＥＰＯをＲＩＡおよびｉｎ　ｖｉｔｒｏ生物活
性により測定した。
各段階的増幅において使用されたメトトレキセート（７
）ｆｆｌｌ；ｔＯ，０２μＭ　、　０．１　μＭおよび
０．５．ｃｚＭ　テあった。第１０表に示すように、０
．０２μＭのＭＴＸによる１回の選択後に有意台のＥＰ
Ｏが培地中に放出された。
アルファ　アルファ培地中 ４α４ブール　ＲＩＡ ４α４単一 コロニ クローン （，０２−７）　　ＲＩＡ １７ｎｇ／ｍ１ ５０ｎｇ／ｍ１ ４６０ｎｇ／ｍｌ 実施例１０：ＣＨＯ細胞によるＥＰＯの発現−方法■ クローンラムダ−ＨＥＰＯＦＬＬ３からのＤＮＡをＥｃ
ｏＲＩで消化し、ＥＰＯ遺伝子を含む小さなフラグメン
ト（Ｒ１フラグメント）をプラスミドＲＫＩ−４（実施
例８参照）のＥｃｏＲＩ部位内でサブクローニングした
。次に、このＤＮＡ（ＲＫＦＬＩ３）を用いてＤＨＦＲ
−ネガティブＣＨＯ細胞を直接（消化せずに）トランス
フェクションし、そして上記の実施例９のようにして選
択および増幅を行った。
また、ＲＫＦＬ１３ＤＮＡはプロトプラスト融合または
微伍注射法によりＣＨＯ細胞に挿入した。
プラスミドＲＫＦＬ１３はメリーランド州ロックビルの
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託
され、寄託番号Ａ１’ＣＣ３９９８９のもとに入手可能
である。
好適な単一コロニークローンはメリーランド州ロックビ
ルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに
寄託され、寄託番号ＡＴＣＣＣ１？Ｌ８６９５のもとに
入手可能である。
実施例１１：ＣＯ３−１細胞によるＥＰＯゲノムＤＮＡ
の発現 ＥＰＯゲノムクローンの発現のために使用したベクター
はｐｓＶＯｄ　（実施例４に示したメロンらの上記文献
参照）である。ｐｓＶＯｄからのＤＮＡはＨｆｎｄｌｌ
Ｉで完全消化し、ＤＮＡポリメラーゼ■大フラグメント
で平滑末端とした。
ＥＰＯゲノムクローンのラムダ−ＨＥＰＯ３はＥｃｏＲ
ＩとＨｉｎｄＩＩ［で完全消化し、ＥＰＯ遺伝子を含む
４．Ｏｋｂフラグメントを単離して上記のように平滑末
端とした。Ｈ１ｎｄＩＩｒ部位からポリＡシグナルをち
ょうど越えた領域までのこのフラグメントのヌクレオチ
ド配列は第４図および第４表に示す。ＥＰＯ遺伝子フラ
グメントをｐｓＶＯｄプラスミドフラグメント内に挿入
し、そして両方の向きの正しく構築された組換え体を単
離して確かめた。プラスミドＣＺ２−１は“ａ″の向き
（すなわちＥＰＯの５′末端がＳＶ４０開始点に最も接
近する）でＥＰＯ遺伝子を有し、プラスミドＣＺ１３は
それと反対の向き（すなわち“ｂ”の向き）である。
プラスミドＣＺＩ−３およびＣ２０−１は実施例６のよ
うにしてＣＯ３−１細胞をトランスフェクションし、培
地を収穫して免疫学的に反応性のＥＰＯについて検定し
た。Ｃ２０−１からは培養上清中に約３１ｎｇ／ｍｌの
ＥＰＯが検出され、ＣＺ１〜３からは１６〜３１ｎｇ／
　ｍｌのＥＰＯが検出された。
ゲノムクローンＨＥＰＯＩ、ＨＥＰＯ２およびＨＥＰＯ
６は類似の方法でＣＯ８細胞に挿入し且つ発現させるこ
とができる。
マウスメタロチオネインプロモーターの転写制御下にあ
り且つ完全ウシ乳頭腫ウィルスＤＮＡに結合されたＥＰ
ＯｃＤＮＡ配列を含むプラスミドを次のようにして作成
した： ｐＥＰ０４９ｆ プラスミド５Ｐ８１５をＰｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ
から購入した。このプラスミドをＥｃｏＲＩで完全消化
し、ラムダ−ＨＥＰＯＦＬＬ３からのＥＰＯｃＤＮＡを
含む１３４０ｂｐＥ　ｃｏＲＩフラグメントをＤＮＡリ
ガーゼにより挿入した。ＥＰＯ遺伝子の５′末端がＳＰ
６プロモーターに極めて接近している（ＢｇｌＩおよび
ＨｉｎｄＩＩＩ消化で測定）得られたプラスミドをｐＥ
ＰＯ４９５と命名した。なお、方向性に関して、ｐｓＰ
８１５ポリリンカー中のＢａｍＨＩ部位はＥＰＯ遺伝子
の５′末端に直接に隣接している。
ｐ　ＭＭＴｎｅｏ　ＩＪ　Ｂ　Ｐ　Ｖ 第８図に示すプラスミドｐｄＢ　Ｐ　Ｖ　−ＭＭＴｎｅ
。
（３４２−１２）　　（ｏ　−（Ｌａｖ）らのＭｏ１．
　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ。
３　：　２１１０−２１１５　（１９８３）を参照〕を
ＢａｍＨＩで完全消化して、ＢＰＶゲノムを含む約８ｋ
ｂの大きなフラグメントと、ｐＭＬ２複製開始点および
アンピシリン耐性遺伝子、メタロチオネインプロモータ
ー、ネオマイシン耐性遺伝子およびＳＶ４０ポリＡシグ
ナルを含む約６．５ｋｂの小さなフラグメントの両フラ
グメントを生じさせた。消化したＤＮＡを分離すること
な（ＤＮＡリガーゼで再び環状化し、目的とする約６．
５ｋｂフラグメントのみを含むプラスミドをＥｃｏＲＴ
とＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ消化により同定し
た。この種のプラスミドの一つをｐＭＭＴｎｅｏΔＢＰ
Ｖと命名した。
ｐＥＰＯ１５ａ ｐ　ＭＭＴｎｅｏ　ＩＪ　Ｂ　Ｐ　ＶをＢｇｌＩＩで完
全消化した。
ｐＥＰＯ４９５をＢａ１ＨＩとＢｇｌＩＩテ完全消化し
て、全ＥＰ○コーディング領域を含む約７００ｂｐフラ
グメントプラスミドをゲル電気泳動により単離した。Ｂ
ｇｌＩＩ消化ｐ　ＭＭＴｎｅｏ　Ａ　Ｂ　Ｐ　Ｖと７０
０ｂｐ　ＢａｍＨｒ／ＢｇｌＩＩＥＰＯフラグメントと
を連結し、ＥＰＯｃＤＮＡを含む得られたプラスミドは
ＥＰ○遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブｄ
　（ＧＧＴＣＡＴＣＴＧＴＣＣＣＣＴＧＴＣＣ）を使用
するコロニーハイブリダイゼーションにより同定した。
ハイブリダイゼーション分析で陽性であったプラスミド
のうち、ＥＰＯｃＤＮＡの５′末端がメタロチオネイン
プロモーターに最も接近する方向性のＥＰＯｃＤＮＡを
もつ１つのプラスミド（ｐＥＰＯ１５ａ）がＥｅｏＲＩ
およびＫｐｎＩ消化により同定された。
ｐＢＰＶ−ＥＰＯ プラスミドｐＥＰＯ１５ａをＢａｍＨＩで完全消化して
線状化した。プラスミドρｄＢＰＶ−Ｍ　Ｍ　Ｔ　ｎｅ
ｏ　　（３４２−１２）もまたＢａｍＨＩで完全消化し
て、約６．５ｋｂと８ｋｂの２つのフラグメントを得た
。全ウシ乳頭腫ウィルスゲノムを含む８ｋｂフラグメン
トをゲル電気泳動により単離した。
ｐ　Ｅ　Ｐ　０１５ａ　／　ＢａｍＨＩと８　ｋｂＢ　
ａｍＨｒ　７ラグメントとを一緒に連結し、ＢＰＶフラ
グメントを含むプラスミド（ｐＢＰＶ−ＥＰＯ）は、Ｂ
ＰＶゲノムに特異的なオリゴヌクレオチドプローブｄ（
Ｐ−ＣＣＡＣＡＣＣＣＧＧＴＡＣＡＣＡ−ＯＨ）を使用
するコロニーハイブリダイゼーションにより同定した。
ｐＢＰＶ−ＥＰＯＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ消化は、ＢＰ
Ｖゲノムの転写方向がメタロチオネインプロモーター（
第８図のｐｄＢＰＶ−Ｍ　Ｍ　Ｔ　ｎｅｏ　　（３４２
−１２）を参照）の転写方向と同じであることを示した
。プラスミドｐｄＢＰＶＭ　Ｍ　Ｔ　ｎｅｏ　　（３４
２−１２）はメリーランド州ロックビルのアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクションから寄託番号Ａ１’
ＣＣ３７２２４のもとに入手可能である。
発　　　現 ＥＰＯを発現させるために次の方法を使用した。
方法■ ＤＮＡ　　ｐＢＰＶ−ＥＰＯを作成し、約２５μｇを使
用して約１×１０６個のＣ１２７Ｃローライー（Ｌｏｗ
ｙ）　らのＪ、　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌ、、　２８　：　２
９１−２９８　（１９７ｇ）を参照〕および３７３細胞
を標準的なリン酸カルシウム沈殿法〔グラム（Ｇｒａｈ
ｍ）らのＶｉ’ｒｏｌｏｇｙ。
５２　：　４５６−４６７　（１９７３）を参照〕によ
りトランスフェクションした。トランスフェクションの
５時間後、トランスフェクション用培地を除き、グリセ
ロールショック（ｇｌｙｃｃｒｏｌ　５ｈｏｃｋ）を行
い、洗浄し、そして１０％ウシ胎児血清を含む新しいア
ルファ培地を加えた。４８時間後、細胞をトリプシン処
理して５００ａｇ／ｍｌの抗生物質Ｇ４１８を含むＤＭ
Ｅ培地中に１＝１０の比で分散させ〔サザン（Ｓｏｕｔ
ｈｅｒｎ）らのＭｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｃｎｃｔ、、
　Ｌ　：　３２７−３４１（１９ｇ２）を参照〕、それ
らの細胞を２〜３週間インキュベートした。次いで、Ｇ
４１８耐性コロニーをミクロタイターウェル（ｍｉｃｒ
ｏｔｉｔｃｒ　ｗｅｌｌ）内に個々に単離し、Ｇ４１８
の存在下で培地全面がやや密集するまで増殖させた。そ
の後、細胞を洗浄し、１０％ウシ胎児血清を含む新しい
培地を加えて２４時間後に培地を収穫した。その生産培
地を試験し、ラジオイムノアッセイおよびｉｎ　ｖｉｔ
ｒｏバイオアッセイによりＥＰＯについて陽性であるこ
とがわかった。
方法■ Ｃ１２７または３Ｔ３細胞を、方法■で述べたように、
２５μどのｐＢＰＶ−ＥＰＯと２μどのｐＳＶ２ｎｅｏ
　　（サザンらの上記文献参照）を用いて同時トランス
フェクションした。これは大体１０倍モル過剰のｐＢＰ
Ｖ−ＥＰＯを使用する。トランスフェクション後の手法
は方法Ｉと同じである。
方法■ 方法■で述べたように、Ｃ１２７細胞を３０ｇｇのｐＢ
ＰＶ−ＥＰＯでトランスフェクションした。
トランスフェクションおよび分散（１：１０）の後、３
日おきに新しい培地と取り換えた。約２週間後にＢＰＶ
形質転換細胞の斑点が出現した。各々の斑点をミクロタ
イター皿の１　ｃｍ径のウェル内に別々に装置し、やや
密集した単層になるまで増殖させ、生産培地中のＥＰＯ
活性または抗原性について検定した。
実施ｆ！１１３　：　Ｅ　Ｐ　Ｏの精製ＥＰＯ濃度が２
００μｇ／ρ程度のＣＯ８細胞生産培地（１２ｇ）を０
．４６５ゴ（５平方フイート）の膜を備えたミリポア・
ペリカン（Ｍｉ　ｌ　ｌ　１ｐｏｒｃＰａｌ　Ｉ　１ｅ
ａｎ）のような１０．０００分子量で分離する限外ン濾
過膜を使用して、８００ｍ１に濃縮した。検定は実施例
５のようにしてＲＩＡで行った。限外ン濾過からの濃縮
物はｐＨ７，０に緩衝化した１０ｍ　Ｍリン酸すトリウ
ム４Ωに対して透析した。こうして濃縮および透析され
た生産培地は全タンパク質３８０ｍｇ中にＥＰＯ２，５
ｍｇを含んでいた。このＥＰＯ溶液をさらに１８６ｍ１
に濃縮し、沈殿したタンパク質を１１０．０００　ｘ　
ｇで３０分間遠心することにより除いた。
Ｅ　Ｐ　Ｏ（２，０＋＋＋ｇ）を倉む上清を５０％酢酸
でｐＨ５，５に調節し、４℃で３０分間攪拌し、沈殿物
を１３．０００Ｘ　ｇで３０分間遠心することにより除
いた。
カルボニルメチルセファロースクロマトグラフィー Ｅ　Ｐ　０２００μｇ　（全タンパク質２４ｍｇ）を含
む遠心上清（２０ｍｌ）を、１０ｍ　Ｍ酢酸ナトリウム
（ｐＨ５，５）中で平衡化したＣＭ−セファロース（２
０ｍｌ）を充填したカラムに加え、同じ緩衝液４０ｍ１
で洗浄した。
ＣＭ−セファロースに結合したＥＰＯは１０ｍ　Ｍリン
酸ナトリウム（ｐＨ５，５）中のＮ　ａ　Ｕ　（０−１
）の勾装置００　ｍｌで溶離した。ＥＰＯ含有画分（全
タンパク質２　ｍｇ中全全部５０ｇｇ〕を集め、アミコ
ン（Ａｍｉｃｏｎ）　ＹＭＩＯ限外？濾過膜を使って２
ｍｌに濃縮した。
逆相ＨＰＬＣ ＣＭ−セファロースからのＥＰＯを含む濃縮画分は、バ
イダック（Ｖｙｄａｃ）　Ｃ−４カラムを使用する逆相
ＨＰＬＣによりさらに精製した。１０％溶剤Ｂ（溶剤Ａ
は０．１％ＣＦ　ＣＯＨ／Ｈ２０であす；溶剤Ｂは０．
１％ＣＦ　Ｃ０２Ｈ／ＣＨ３ＣＮである）で平衡化した
カラムに１ｍｌ／分の流量でＥＰＯを加えた。このカラ
ムを１０％溶剤Ｂで１０分間洗浄し、ＥＰＯを溶剤Ｂの
直線濃度勾配（６０分で１０〜７０％）で溶離した。Ｅ
ＰＯ含有画分（全タンパク質１２０μｇ中ＥＰＯ約４０
μｇ）を集めて凍結乾燥した。凍結乾燥ＥＰＯは０，１
５Ｍ　　ＮａＣΩを含む０．１Ｍ）リス−ＨＣΩ　（ｐ
Ｈ７，５）中で再調製し、逆相ＨＰＬＣにより再びクロ
マトグラフ処理を行った。Ｅ　Ｐ　Ｏ３８画分を集め、
５ＤＳ−ポリアクリルアミド（１０％）ゲル電気泳動に
より分析した〔ラメリ（Ｌａｍｅｌｉ、　Ｕ、　Ｋ、）
、　Ｎａｔｕｒｅを参照〕。
集めたＥＰＯ画分は全タンパク質２５μｇ中ＥＰＯ１５
，５μｇを含んでいた。
発明の効果 本発明はヒトエリトロポエチンの効率的生産に使用でき
るヒトエリトロポエチンのクローン化遺伝子、組換えＤ
ＮＡベクターおよび該発現形質転換体を提供するもので
、各種貧血症の治療薬等の開発に利用できるものである
。
文　　　　献 １）Ｋｒｙｓｔａｌ、Ｇ、Ｅｘｐ、ｌｌｃｍａｔｏｌ、
１１　：　８４９−６６０（１９８３）。
２）　　Ｙａｎａｇａｗａ、　　Ｓ、、　　Ｈｉｒａｄ
ｃ、　　Ｋ、、　　０ｈｎｏｔａ、　　Ｈ，。
５ａｓａｋｉ、　Ｒ，、Ｃｈｉｂａ、　ｔＬ、　Ｖｃｄ
ａ、　Ｍ、、およびＧｏｔｏ、Ｍ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ
ｈｅｍ、２５９　：　２７０７−２７１０（１９８４）
。
３）Ｌａｗｎ、Ｒ，Ｍ、、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、Ｅ、Ｆ、、
Ｐａｒｋｅｒ、Ｒ。
Ｃ，、Ｂｌａｋｅ、　Ｃ；、、およびＭａｎｉａｔｉｓ
、　Ｔ、　Ｃｅ１１１５　：　１１５７−（１９７８）
。
４）　Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、、　Ｎ１ｃｋｌｅｎ、　Ｓ
、、およびｃｏｕ　Ｉ　ｓｏｎ　。
Ａ、Ｒ，Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、
、Ｕ、Ｓ、Ａ。
７４　：　５４６３−（１９７７）。
５）Ｔｏｏｌｅ、Ｊ、Ｊ、、Ｋｎｏｐｆ、Ｊ、Ｌ、、Ｗ
ｏｚｎｃｙ、Ｊ。
Ｍ、、　５ｕｌｔｚｃａｎ、　Ｌ、　Ａ、　Ｂｕｅｃｋ
ｃｒ、　Ｊ、　Ｌ、。
Ｐｉｔｔｍａｎ、　　Ｄ、　　Ｄ、、　　Ｋａｕｆｍａ
ｎ、　　Ｒ，Ｊ、、　　Ｂｒｏｗｎ、　　Ｅ、。
Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ、　Ｃ，、Ｏｒｒ、　Ｅ、　Ｃ，、
Ａｍｐｈｌｅｔｔ。
Ｇ、　Ｉｄ、、　　Ｆｏｓｔｅｒ、　　１．　　Ｂ、、
　　Ｃｏｅ、　　Ｍ、　　Ｌ、、　　Ｋｎｕｔｓｏｎ。
Ｇ、　Ｊ、、　Ｆａｓｓ、　Ｄ、　Ｎ、、およびＨｅｗ
ｉｃｋ、　Ｒ，Ｍ。
Ｎａｔｕｒｅ　３１２　＋　　３４２−３４７　　（１
９８４）６）　Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ、　　Ｅ、　　Ｂ
ｌｏｏｄ　５ｕｐｐ１．　　ｌ、　　５８゜ｘｌｉｉ　
　（ａｂｓｔｒ）　　（１９８１）。
７）　Ｓｕｅ、　Ｊ、　Ｍ、およびＳｙｔｋｏｗｄｋｉ
、　Ａ、　Ｊ、　　Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔ’ｌ　　Ａｃａｄ、Ｓｅｔ　　Ｕ、Ｓ、Ａ、８０
　　：　　３６５１−３６５５（１９８３）　。
８）　Ｂｅｒｓｃｈ、　Ｎ、およびＧｏｌｄｅ、　Ｄ、
　Ｗ、、　Ｉｎ　Ｖｉｔｒ。
Ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｅｒｙｔｈｒｏ−ｐｏｉｅｓｉ
ｓ、　Ｍ、　Ｊ、　Ｍｕｒｐｈｙ（Ｅｄ、）　ＮＣｗ　
Ｙｏｒｋ　：　　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ　（
１９７８）。
９）　Ｃｏｔｅｓ、　Ｐ、　Ｍ、およびＢａｎｇｈａｍ
、　Ｄ、　Ｒ，Ｎａｔｕｒｅ１９１　　：　　１０６５
−（１９６１）。
１０）　Ｇｏｌｄｗａｓｓｃｒ、　Ｅ、およびＧｒｏｓ
ｓ、　Ｍ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ　　
３７　　：　　１０９−１２１　　（１９７５）。
１１）　Ｗｏｏ、　Ｓ、　Ｌ、　Ｃ，、Ｄｕｇａｉｃｚ
ｙｋ、　Ａ、、　ｌ’ｓａｉ、　Ｍ、−Ｊ、、　Ｌａｉ
、　Ｅ、　Ｃ，、Ｃａｔｔｅｒａｌｌ、　Ｊ、　Ｐ、お
よび０’Ｍａｌｌｅｙ、　　Ｂ、　　Ｗ、　　Ｐｒｏｃ
、　　Ｎａｔ’１．−Ａｃａｄ、　　Ｓｅｔ。
ＩＪ、Ｓ、Ａ、　　７５　：　　３６８８−（１９７８
）。
１２）　　Ａｎｄｅｒｓｏｎ、　　Ｓ、およびＫｉｎｇ
ｓｔｏｎ、　　１．　　Ｂ、　　Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔ’ｌ　　Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、−Ｕ、Ｓ、Ａ、８０
　　：　　６８３６−６８４２（１９８３）　。
１３）　Ｂｃｎｔｏｎ、　’ｄ、　Ｄ、およびＤａｖｆ
ｓ、　Ｒ，Ｗ。
５ｃｉｅｎｃｅ　１９６　　：　　１８０−１８２　　
（１９７７）。
１４）　Ｓｈｃｒｗｏｏｄ、　Ｊ、　Ｂ、およびＧｏｌ
ｄｗａｓｓｃｒ、　Ｅ。
Ｂｌｏｏｃｉ　５４　　：　　Ｈ５−８９３（１９７９
）。
１５）Ｄｅｒｍａｎ、Ｅ、、Ｋｒａｕｔｅｒ、に、、ｌ
（ａｌｌｆｎｇ、Ｌ、。
Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ、　Ｃ，、Ｒａｙ、　Ｍ、、およ
びＤａｒｎｅｌｌ、　Ｊ。
’ｌ’、、　ＣＣ！ＩＩ　　２３　　：　　７３１−（
１９１）。
１６）　　Ｇｌｕｚｍａｎ、　　Ｙ、、　　　Ｃｅ１ｌ
　　２３　　：　　１７５−１８２　　（１９８１）。
１７）　　Ｉｌｅｗｉｃｋ、　　Ｒ，Ｍ、、　　ｌ１ｕ
ｎｋａｐｉｌｌｅｒ、　　Ｍ、　　Ｅ、、　　１ｌｏｏ
ｄ。
Ｌ、　Ｅ、、およびＤｒｅｙｅｒ、　Ｗ、　Ｊ、　Ｊ、
　Ｂｆｏｌ、　Ｃｈｅｍ。
２５６　　：　　７９９０−７９９７　　（１９８１）
。
【図面の簡単な説明】
第１図はヒト胎児肝Ｐｌｉｉｍ　ＲＮ　Ａ中のＥＰＯｍ
ＲＮＡの検出を示す電気泳動図であり；第２図はラムダ
−ＨＥＰＯＦＬＬ３中のＥＰＯｃＤＮＡのヌクレオチド
配列の模式図であり；第３図は４個の独立したヒトＥＰ
ＯゲノムクローンのＤ　Ｎ　Ａ　４ｉｆｉ入物の相対位
置を示し；第４図はヒトＥＰＯ遺伝子のイントロンおよ
びラスミド９１０２３　（Ｂ）の作成を示し：第６図は
天然ＥＰＯと比較したときのＣ０８１細胞で生産された
ＥＰＯのＳＤＳポリアクリルアミドゲル分析を示し； 第７図はＥＰＯの発現用プラスミドｐＲＫＩ−４（実施
例９参照）の模式図であり；そして 第８図は、実施例１２で祠料として用いたプラスミドｐ
ｄＢ　Ｐ　Ｖ　−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）模式図
である。 ３′ ＡＡＡ、ＡＡＡ、Ａ ジーγ二 ＋６６０Ｑ 心、５４生、Ｓ寸ケ ２ＣＯ４の ６ω　　　８００ Ｆ７ｇ、２ ２ω　　１４００１ａｐ 図面の浄書（内容に変更なし） 図面の浄書（内容に変更なし） ＣＯＲＩ ３ａｍＨＬ ｐ９１０２Ｂ＋Ａ１ 図面の浄書（内容に変更なし） ３、Ｄ　７ウク“ノンにの回ｕ１

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）生物学的に活性なエリトロポエチンを発現するヒ
    トｃＤＮＡのクローニング方法であって、 （ａ）精製したエリトロポエチンタンパク質をトリプシ
    ンで消化し； （ｂ）工程（ａ）で得られたトリプシンフラグメントの
    アミノ酸配列に基づいてオリゴヌクレオチドプローブの
    プールを作製し； （ｃ）工程（ｂ）のオリゴヌクレオチドプローブを用い
    てヒトゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングし； （ｄ）そのプローブとハイブリダイズするクローンを選
    択し、そのクローンの塩基配列を決定してそれらがエリ
    トロポエチンクローンであるかどうかを調べ； （ｅ）工程（ｄ）からのエリトロポエチンクローンを同
    定し； （ｆ）工程（ｅ）からのクローンを使用してヒト胎児肝
    臓から作成したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング
    し；そして （ｇ）工程（ｆ）の胎児肝臓ｃＤＮＡライブラリーから
    エリトロポエチンクローンを選択する；各工程から成る
    上記方法。
  2. （２）ヒト胎児染色体からヒトエリトロポエチンｇＤＮ
    Ａをクローニングする方法であって、 （ａ）ヒト胎児染色体から１または２以上の適当な制限
    酵素を用いて切断したＤＮＡ断片をバクテリアファージ
    ラムダベクターに挿入してヒトｇＤＮＡライブラリーを
    作製し； （ｂ）このライブラリーから別途作成したエリトロポエ
    チンｃＤＮＡから調製されたオリゴヌクレオチドプロー
    ブまたは種々のプローブを用いて、ヒトエリトロポエチ
    ンｇＤＮＡをクローニングする； 各工程からなる上記方法。 【遺伝子配列があります】
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