LV10507B - Vektors, šūnas, eritropoetins,farmaceitiskā kompozīcija - Google Patents

Abstract

Aprakstīti no cilvēka embrija aknām izdalīta cilvēka eritropoetīna (EPO) klonetie gēni, kuri uzrāda ārkārtīgi augstu ekspresijas līmeni. Aprakstītaarīminēto gēnu ekspresija in v/froaktīvacilvēka EPO iegūšanai.

Description

Clonierte menschliche Erythropoietin-Gene und deren Produkte

Die vorliegende Erfindung betrifft klonierte Gene des menschlichen Erythropoietins, die uberraschenderweise hohe Expressionsraten liefern, die Expression der genannten Gene und die in-vitro Produktion des men schii chen Erythropoietins.

Erythropoietin (im folgenden als EPO abgekurzt) ist ein zirkulierendes Glycoprotein, das die Erythrozytenbildung in hdheren Organismen stimuliert (vgl. Carnot et al., Compt. Rend.

143 , 384 ( 1906)). Deshalb wird EPO manchmal auch als

E1 ektropoese-stimulierender-Faktor bezeichnet.

Die Lebenszeit von menschlichen Erythrozyten betrāgt ungefāhr 120 Tage. Dies bedeutet, daS ungefāhr 1/120 der gesamten Erythrozyten tāglich im retikuloendothelialen System zerstdrt werden. Gleichzeitig wird eine relativ konstante Anzahl von Erythrozyten tāglich produziert, um die Konzentration von Erythrozyten konstant zu halten (Guyton, Textbook of Medical Physiology, S. 56-60, W.B. Saunders Co., Philadelphia (1976)).

Erythrozyten werden bei der Reifung und Differenzierung der Erythroblasten im Knochenmark gebildet. EPO ist ein Faktor, der auf weniger differenzierte Zellen wirkt und deren

Differenzierung zu Erythrozyten induziert ( Guytcn^ s.o.J. El G 1st ein vielversprechendes therapeutisches Mittel fur die klinische Behandlung von Anāmie oder im speziellen von renale. Anāmie. Der Gebrauch von EPO ist leider in der praktischen Therapie aufgrund seiner geringen Verfugbarkeit noch nicht gelāufig.

Um EPO als therapeutisches Mittel anwenden zu кбппеп, sollte Rilcksicht auf die mčgliche Antigenwirkung genommen werden, und deshalb sollte EPO vorzugsweise aus Rohmaterial menschlichen Ursprungs hergestellt werden. Beispielsweise кбппеп menschliches Blut oder Urin von Patienten verwendet werden, die an aplastischer Anāmie oder āhnlichen Krankheiten leiden und hohe Mengen an EPO ausscheiden. Diese Rohmaterialien jedoch sind nur in begrenzter Menge verfugbar (vgl. beispielsweise White et al., Rec. Progr. Horm. Res. 16 , 219 (1960); Espada et al., Biochem. Med. 3, 475 (1970); Fisher, Pharmacol. Rev. 24, 459 (1972) und Gordon, Vitam. Horm. (N.Y.) 31, 105 (1973)).

Die Herstellung von EPO-Produkten erfolgte im allgemeinen durch Konzentrierung und Reinigung von Urin von Patienten mit hohem EPO-Spiegel, die beispielsweise an aplastischer Anāmie oder āhnlichen Krankheiten leiden (vgl. U.S. Patent 4,397,840, 4,303,650 und 3,865,801). Die begrenzte Verftlgbarkeit von solchem Urin ist ein Hinderniss fiir die praktische Verwendung von EPO. Deshalb ist es sehr wilnschenswert, EPO-Produkte aus dem Urin von gesunden Menschen herzustellen. Das Problem bei der Verwendung von Urin von gesunden Menschen liegt in dem geringen Gehalt von EPO im Vergleich zu dem von anāmischen Patienten. Zusātzlich enthālt der Urin von gesunden Menschen gewisse Inhibierungsfaktoren, die in ausreichend hohen Konzentrationen gegen Elektropoese wirken, so daB ein befriedigender therapeutischer Effekt nur nach grUndlicher Reinigung des EPO erhalten werden kann.

EPO kann ebenfalls aus dem Blutplasma von Schafen erhalten werden. Die Trennung von EPO aus dem Blutplasma ergibt ausreichend Starke und stabile wasserldsliche Prāparationen (vgl. Goldwasser, Control Cellular Dif. Develop., Part A, S. 487-494, Alan R. Liss, Inc., N.Y. (1981)). EPO von Schafen jedoch kOnnte im Menschen eine Antigen-Wirkung besitzen.

- 3 Obwohl EPO ein wtinschenswertes therapeutisches Mittel darstellt, sind die bisherigen Isolierungs- und Reinigungstechniken aus natilrlichen Quellen ftlr eine Massenproduktion dieser Verbindung nicht angemessen. Sugimoto et al. beschreiben im US-Patent 4,377,513 eine Methode filr die Massenproduktion von EPO, die die in-vivo Vermehrung von menschlichen lymphoblastischen Zellen, wie Namalwa, BALL-1, NALL-1, TALL-1 und JBL umfaBt.

Die Produktion von EPO Ober andere gentechnologische Methoden ist in der Literatur beschrieben. Jedoch ist weder eine vollstandige Enthiillung noch die chemische Natur des Produktes bisher verdffentlicht. Die vorliegende Anmeldung liefert die vollstandige Enthiillung fUr die Massenproduktion von Proteinen und zeigt die biologischen Eigenschaften der Proteine und des menschlichen EPO auf. Durch solche Techniken ist es ebenso mdglich, Proteine zu produzieren, die sich chemisch vom authentischen menschlichen EPO unterscheiden, jedoch āhnliche (und in manchen Fallen bessere) Eigenschaften aufweisen. Solche Proteine, die biologische Eigenschaften von menschlichem EPO aufweisen, sollen im folgenden als EPO bezeichnet werden, unabhangig davon, ob sie chemisch mit EPO identisch sind oder nicht.

Zusammenf assurig der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Klonierung eines Gens, das eine ilberraschend hohe Menge von menschlichem EPO exprimiert, dessen Expression und die in-vitro Massenproduktion von aktivem, menschlichem EPO . Die geeigneten Expressionsvektoren fDr die Produktion von EPO, Expressionszellen, Reinigungsschemata und damit verwandte Prozesse werden ebenso beschrieben.

Wie im folgenden nāher beschrieben wird, wurde EPO in teilweise gereinigter Form erhalten, vollstāndig gereinigt und mit Trypsin verdaut, um spezifische Fragmente zu erzeugen. Diese Fragmente wurden gereinigt und sequenziert. Aus diesen Sequenzen wurden EPO-Oligonucleotide zugeordnet und synthetisiert. Diese Oligonucleotide wurden zum Screening einer menschlichen Genkartei benutzt, aus der ein EPO-Gen isoliert wurde.

Die Richtigkeit des EPO-Gens wurde aufgrund seiner DNA-Sequenz, die mit vielen sequenzierten tryptischen Protein-Fragmenten Dbereinstimmte, festgestellt. Ein Teil des genomischen Klons wurde dann verwendet, um durch Hybridisierung zu zeigen, daB EPO in menschlicher fbtaler, 20 Wochen alter mRNA nachgewiesen werden konnte. Eine cDNA-Bibliothek der menschlichen fdtalen Leber wurde aufgestellt und im Screening-Verfahren getestet. Drei EPO-cDNA-Klone wurde erhalten (nach dem Screening von 750 000 Rekombinanten). Zwei dieser Klone besaBen die voile Lānge, wie aus der kompletten Codierungssequenz und der im wesentlichen unUbersetzten Sequenz des 3’- und 5'-Endes gefolgert wurde. Diese cDNA wurde sowohl in SV-40 virustransformierten Affenzellen (COS-l-Zellinie; Gluzman, Cell 23, 175-182 (1981)) und in Ovarien des Chinahamsters (CHO-Zellinie; Urlaub G. und Chasin L.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 , 4216-4280 (1980)) exprimiert. Das von COS-Zellen produzierte EPO ist in-vitro und in-vivo biologisch aktives EPO. Das von CHO-Zellen produzierte EPO ist in-vitro biologisch aktiv und wurde in-vivo nicht getestet.

Der EPO-cDNA-Klon hat einen interessanten offenen Ableserahmen von 14-15 Aminosāuren (aa) mit Initiator und Terminator von 20-30 Nucleotiden (nt) oberhalb der Codierungsregion. Eine reprāsentative mit dem klonierten EPO-Gen transfektierte Probe von E. coli wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hinterlegt, und ist unter der Zuordnungsnummer ATCC 40153 erhāltlich.

- 5 Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Abbildung 1 stellt die Basissequenz eines Exons von 87 Basenpaaren des menschlichen EPO-Gens dar.

Abbildung 2 zeigt den Nachweis des EPO-mRNA in der menschlichen fOtalen Leber-mRNA.

Abbildung 3a zeigt die Aminosāuresequenz eines EPO-Proteins, die von der Nucleotidsequenz von Lambda-HEP0FL13 abgeleitet wurde.

Abbildung 3b zeigt die Nucleotidsequenz der EPO-cDNA in Lambda-HEP0FL13 und die davon abgeleitet Aminosauresequenz.

Abbildung 4a zeigt die relativen Positionen von DNA-Einschilben von vier unabhāngigen menschlichen EPO-Genomklonen.

Abbildung 4b zeigt eine Karte der aparenten Intron- und Exonstrukturen des menschlichen EPO-Gens.

Abbildung 4c zeigt eine DNA-Sequenz des EPO-Gens, das in Abbildung 4b dargestellt ist.

Abbildungen 5a, 5b und 5c zeigen die Konstruktion des Vektors 91023(B).

Abbildung 6 zeigt die SDS-Polyacrylamidgel-Analyse des in COS-l-Zellen produzierten EPO im Vergleich zum nativen EPO.

Abbildung 7 zeigt die Nucleotid- und AminosSuresequenz des EPO-Klons, Lambda-HEP0FL6.

Abbildung 8 zeigt die Nucleotid- und Aminosāuresequenz des EPO-Klons Lambda-HEPOFL8.

Abbildung 9 zeigt die Nucleotid- und AminosSuresequenz des EPO-Klons Lambda-HEP0FL13.

Abbildung 10 zeigt eine schematische Darstellung des Plasmides pRKL-4.

Abbildung 11 zeigt eine schematische Darstellung des Plasmides pdBPV-MMTneo(342-12).

NShere Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Klonierung von EPO-Genen und die Produktion von EPO durch die in-vitro Expression dieser Gene .

Die Patentliteratur und die wissenschaftliche Literatur sind (Iberfilllt mit Prozessen, die fiir die Produktion von rekombinaten Produkten anwendbar sind. Diese Techniken enthalten im allgemeinen die Isolierung oder Synthese der gewOnschten Gensequenz und die Expression dieser Sequenz in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen, indem die vom Fachmann Dblichen Techniken angewendet werden. Sobaid ein bestimmtes Gen isoliert, gereinigt und in einen Transfer-Vektor inseriert (d.h. kloniert) wurde, ist seine VerfUgbarkeit in grdBeren Mengen sichergestellt. Der Vektor wird mit seinem klonierten Gen in einen passenden Mikroorganismus oder eine Zellinie transferiert, z.B. in Bakterien, Hefe, Sāugerzellen, wie z.B. COS-1 (Affenniere), CHO (Ovarium des Chinahamsters), Zellinien von Insekten, und dergleichen, in denen der Vektor repliziert wird, sobaid der Mikroorganismus oder die Zellinie

- 7 sich vermehrt, und von denen der Vektor durch konventionelle Methoden isoliert werden kann. Auf diese Weise wird eine kontinuierlich erneuerbare Quelle des Gens geliefert und damit weitere Manipulationen, Modifikationen und der Transfer zu anderen Vektoren oder anderen Orten innerhalb des gleichen Vektors ermāglicht. Die Expression kann oft erreicht werden durch Transfer des klonierten Gens (in korrekter Richtung und Ableserahmen) in die entsprechende Stelle eines Transfervektors, so daS die Ubersetzung von einem prokaryontischen oder eukaryontischen Gen zu der Synthese eines Protein-Precursors fiihrt. Damit ist die Aminosāuresequenz mitumfafit, die vom klonierten Gen kodiert wird, das an Methionin oder an einer aminoterminalen Sequenz des prokaryontischen oder eukaryontischen Gens angeknOpft ist. In anderen Fallen кбппеп die Signale fur die Initiierung der Transkription und Translation durch ein entsprechendes Genomfragment des klonierten Gens geliefert werden. Eine Vielzahl von spezifischen Proteinspaltungstechniken kann angewendet werden, um den Protein-Precursor an einem gewtlnschten Punkt zu spalten, um so die gewilnschte AminosSuresequenz abzuspalten, die dann durch konventionelle Methoden gereinigt werden kann. In einigen Fallen wird das Protein, das die gewilnschte AminosSuresequenz enthalt, ohne die Notwendigkeit spezifischer Spaltungstechniken produziert und kann somit auch von Zellen in das extrazellulSre Nāhrmedium abgegebe.n werden.

Isolierung eines Genklons des menschlichen EPO

Menschliches EPO wurde aus Urin von Patienten mit aplastischer Anāmie in hochreiner Form isoliert, wie im folgenden beschrieben wird. Dieses gereinigte EPO wurde durch Trypsin vollstāndig verdaut. Dabei wurden Fragmente erhalten, die durch reversed-phase-HPLC getrennt wurden. Aus den

Gradient-Fraktionen wurden die einzelnen Fragmente gewonnen und der Mikroanalyse unterworfen. Die Sequenzen der tryptischen Fragmente sind in Abbildung 3 unterstrichen und werden im folgenden nSher diskutiert. Zwei der AminosSuresequenzen, Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lys und Val-Tyr-Ser-Asn-Phe-Leu-Arg wurden filr die Konstruktion von Oligonucleotidproben ausgewShlt (dies ergibt einen 17 Nucleotide langen und 32fach entarteten Pool von 01igonucleotiden bzw. einen 18 Nucleotide langen und 128fach entarteten Pool von Oligonucleotiden, aus den frtlheren tryptischen Fragmenten, sowie zwei 14 Nucleotide lange, jeweils 48fach entarteten Pools aus den letzteren tryptischen Fragmenten). Der 32fach entartete 17-mer-Pool wurde verwendet filr das Screening einer menschlichen Genom-DNA-Bibliothek in einem Ch4A-Vektor (22), indem filr die Herstellung der Filter fūr das Screening eine Modifizierung des Woo-und-0’Malley-in-situ-Verstārkungsverfahrens (47) angewendet wurde.

Die im Text verwendeten arabischen Nummern (1)-(61) beziehen sich auf die Publikationen, die am Ende dieser Anmeldung in numerischer Reihenfolge aufgelistet sind.

Die Phagen, welche mit den 17-mer Nucleotiden hybridisieren, wurden gesammelt, in kleine Gruppen zusammengegeben und mit den 14-mer und 18-mer Pools tlberprilft. Die Phagen, welche mit den 17-mer-, 18-mer- und 14-mer-Pools hybridisieren, wurden mittels der Plaque-Technik gereinigt und Fragmente wurden in M13-Vektoren subkloniert fUr die Sequenzierung mittels der Dideoxy-Kettenterminierungs-Methode von Sanger und Coulson (23) (1977). Die Sequenz der Region, die mit dem 32fach entarteten 17-mer-Nucleotid in einem der Klone hybridisiert, ist in Abbildung 1 dargestellt. Diese DNA-Sequenz enthālt innerhalb eines offenen Ableserahmens die Nucleotide, die genau das tryptische Fragment

- 9 codieren konnten, das fUr die Ableitung des 17-mer-Pools der Oligonucleotide verwendet wurde. Weiterhin zeigte die Analyse der DNA-Sequenz, daB die 17-mer-Hybridisierungsregion innerhalb eines 87 bp-Exons enthalten war, das durch potentielle SpleiBakzeptoren und Donorstellen eingegrenzt war. Die positive Bestatigung, daB diese beiden Klone (im folgenden als Lambda-HEPOl und Lambda-HEPO2 bezeichnet) EPO-Genomklone sind, wurde durch Sequenzierung zusātzlicher Exons erhalten, die weitere Code-Informationen beinhalten, die Uber tryptische Fragmentierung gewonnen wurden.

Isolierung von EPO-cDNA-Klonen

Die Northern-Analyse (56) menschlicher fbtaler (20 Wochen alter) Leber-mRNA wurde durchgefiihrt, indem eine 95 nucleotid-1ange einstrāngige Probe verwendet wurde, die aus einem M13-Klon hergestellt wurde, der ein Teil des in Abbildung 1 beschriebenen 87 bp-Exons enthālt. Wie in Abbildung 2 gezeigt ist, konnte ein starkes Signal in fētaler Leber-mRNA entdeckt werden. Die genaue Identifizierung dieser Bande als EPO-mRNA gelang, indem die gleiche Probe ftlr das Screening der Bakteriophagen-Lambda-cDNA-Bibliothek der fbtalen Leber-mRNA verwendet wurde (25). Mehrere Hybridisierungsklone wurden mit einer Hāufigkeit von ungefāhr 1 pro 250 000 Rekombinanten erhalten. Die kompletten Nucleotid- und davon abgeleitete Aminosa.uresequenzen fUr diese Klone (Lambda-HEP0FL13 unci Lanibda-HEPOFL8) sind in den Abbildungen 7 und 8 dargestellt.

Die EPO-codierende Information ist innerhalb 594 Nucleotiden in der 5’-Haifte der cDNA enthalten, die ein sehr hydrophobes, 27 Aminosāuren-langes AnfangsstUck und das fertige Protein mit einer Lange von 166 Aminosauren beinhalten.

Die Zuordnung des N-Terminus des fertigen Proteins beruht auf der N-terminalen Sequenz des Proteins, das im Urin von Personen mit aplastischer Anāmie ausgeschieden wird (vgl. Abbildung 1; Goldwasser (26), Sue and Sytkowski (27) und Yanagawa(21)). Ob dieser N-Terminus (Ala-Pro-Pro-Arg—) den aktuellen N-Terminus des zirkulierenden EPO darstellt, oder ob Spaltungen in der Leber oder im Urin stattfinden, ist zur Zeit unbekannt.

Die Aminosāuresequenzen, die in Abbildung 3 unterstrichen sind, weisen auf diejenigen tryptischen Fragmente oder Teile des N-Terminus hin, filr die die Proteinsequenz erhalten wurde. Die abgeleitete AminosSuresequenz stimmt exakt mit den tryptischen Fragmenten ilberein, die sequenziert wurden, womit bestātigt wird, daB die isolierten Gene menschliches EPO codieren.

Struktur und Sequenz von menschlichen EPO-Genen

Die Abbildung 4a zeigt die relativen Positionen von DNA-EinschOben von 4 unabhāngigen menschlichen EPO-Genomklonen. Hybridisierungsanalysen von diesen klonierten DNA’s mit Oligonucleotidproben und mit verschiedenen Proben, die von zwei verschiedenen Klassen der EPO-cDNA-Klonen hergestellt wurden, belegen die Position des EPO-Gens schStzungsweise innerhalb der 3,3 kb-Region, wie in Abbildung 4a durch die dunklen Linien gezeigt wird. VollstSndige Sequenzanalysen von dieser Region (vgl. Be’spiel 4) und Vergleich mit den cDNA-Klonen ergeben die Karte der Intron- und Exonstrukturen der EPO-Gene (vgl. Abbildung 4b). Das EPO-Gen ist in fOnf Exons unterteilt. Ein Teil von Exon I, die gesamten Exons II, III und IV und ein Teil von Exon V enthalten die Proteincodierungsinformation. Der Rest von Exon I und V codiert die 5’- und 3'- unllbersetzten Sequenzen.

- 11 VorObergehende Expression von EPO in COS-Zellen

Um zu zeigen, daB biologisch aktives EPO in einem in-vitro

Zellkultursystem exprimiert werden kann, wurden COS-Zellexpressionsstudien durchgefilhrt (58). Der Vektor p91023(B), der ftlr die voriibergehenden Studien verwendet wurde, ist in Beispiel 5 beschrieben. Dieser Vektor enthālt den Adenovirus-major-late-Promotor, eine SV40-Polyadenylierungs-Sequenz, einen SV40-Ursprung der Replikation, einen SV40-Enhancer und das Adenovirus-VA-Gen. Der cDNA-Einschub Lambda-HEPOFL13 (vgl. Abbildung 8) wurde in einen p91023(B)-Vektor inseriert, unterhalb des Adenovirus-major-late-Promotors. Dieser neue Vektor wird als pPTFL13 identifiziert.

Stunden nach der Transfektion dieser Konstruktion in den M6-Stamm von COS-l-Zellen (Horowitz et al., J. Mol. Appl. Genet. 2_, 147-149 (1983)) wurden die Zellen gewaschen und das Medium gegen serumfreies Medium ausgetauscht. Die Zellen werden 48 Stunden spāter geerntet. Der Grad der Abgabe von EPO in den Kulturilberstand wurde dann mit Hilfe eines quantitativen Radioimunoassays fūr EPO (55) untersucht. Wie Tabelle 1 (Beispiel 6) zeigt, wurde immunologisch reaktives EPO exprimiert. Die biologische Aktivitāt des EPO, das von COS-l-Zellen erzeugt wurde, wurde ebenfalls untersucht. In eineiu getrennteu Experiment wurde der Vektor, der EPO-cDNA von Lambda-HEP0FL13 enthālt, in COS-l-Zellen transfektiert und die Medien, wie oben beschrieben, geerntet. EPO wurde dann im Medium quantitativ durch einen von zwei in-vitro biologischen Assays bestimmt, ^H-Trymidin und CFU-E (12,29), und durch einen der beiden in-vivo Assays (bei hypoxischen Māusen und bei hungernden Ratten (30,31)) (vgl. Tabelle 2, Beispiel 7).

Diese Ergebnisse zeigen, daB biologisch aktives EPO in COS-l-Zellen produziert wird. In Western-Blots konnte mit Hilfe eines polyklonalen Anti-EP0-Antik6rpers gezeigt werden, daB EPO, das von COS-Zellen produziert wird, eine Mobilitat auf SDS-Polyacrylamidgelen besitzt, die identisch mit derjenigen des nativen EPO ist, das aus menschlichem Urin hergestellt wurde (Beispiel 8). Daher kann geschlossen werden, daB das AusmaB der Glycosilierung von COS-1 produziertem EPO āhnlich der des nativen EPO ist.

Unterschiedliche Vektoren, die andere Promotoren enthalten, кбппеп ebenso in COS-Zellen oder in anderen Sāugerzellen oder eukaryontischen Zellen verwendet werden. Beispiele von solchen anderen Promotoren im Sinne der vorliegenden Erfindung beinhalten SV40-Fr(ih- und Spatpromotoren, den Mause-Metallothionein-Gen-Promotor, den Promotor, der in Retroviren von V6geln oder Sāugern gefunden wird, der Bacculovirus-Polyeder-Gen-Promotor und andere. Beispiele von anderen Zelltypen im Sinne der vorliegenen Erfindung beinhalten

E. coli, Hefe, Sāugerzellen, wie z.B. CHO (Ovarium des Chinahamsters), C127 (Affenepithelium), 3T3 (Māusefibroblasten), CV-1 (african green monkey kidney) und Insektenzellen, wie z.B. diejenigen von Spodoptera frugiperda und Drosophila metanogaster. Diese wechselnden Promotoren und/oder Zelltypen кбппеп die Regulation hinsichtlich der Zeit oder des Grades der EPO-Expression bewirken, indem Sie einen zel1spezifischen Typ von EPO produzieren oder das Wachstum von groBen Mengen von EPO-produzierenden Zellen unter weniger teuren, aber leichter kontrol1ierbaren Bedingungen ermčglichen.

- 13 Ein Expressionssystem, das die VorzDge einer Expression bei Sāugern besitzt, aber weniger Zeit bendtigt, um eine hochgradige Expressionszellinie zu produzieren, setzt sich zusammen aus einer Insektenzellinie und einem DNA-Virus, der sich in dieser Zellinie vermehrt. Der Virus ist ein Nuclear-polyhedrosis-Virus. Er besitzt ein doppelstrāngiges zirkulSres DNA-Genom von 128 kb. Das Nucleokapsid ist stābchenfdrmig und liegt in zwei Formen vor, der nichtokkludierten Form im membrangebundenen Virus und in einer okkludierten Form, die im infizierten Zellkern von einem Proteinkristall eingehUllt wird. Diese Viren kdnnen ilblicherweise in in-vitro Insektenzellkulturen fortgepflanzt werden und sind durch alle routinemSBigen tierisch-virologischen Methoden abānderbar. Das

ZelIkulturmedium ist Ublicherweise eine Nāhrsalzldsung von 10-iigem fdtalem Kālberserum.

Das Viruswachstum wird in-vitro iniziiert, wenn ein nichtokkludierter Virus (NOV) in eine Zelle eindringt und sich zum Kern hinbewegt, in dem er sich fortpflanzt. Die Replikation findet im Kern statt. Wāhrend der Anfangsphase (8-18 Stunden nach der Infektion) werden Nucleokapside im Zellkern angesammelt und keimen daraufhin als NOV durch die Plasmamembran und verbreiten somit die Infektion durch die Zellkultur. Einige der Nucleokapside verbleiben daraufhin zusStzlich (mehr als 18 Stunden nach der Infektion) im Zellkern und werden in einer Proteinmatrix okkludiert (bekannt als polyhedrale Inclusions-Kdrper, (PIB)). Diese Form wirkt nicht infektids in der Zellkultur. Die Matrix setzt sich zusammen aus einem Protein, das als Polyhedrin bekannt ist (Molmasse 33 kd). Jeder PIB besitzt einen ungefāhren Durchmesser von 1 mm und es kdnnen mehrere hundert PIB pro Nucleus vorkommen. Es wird sicherlich eine groBe Menge von Polyhedrin erst spāt im Infektionszyklus produziert (ungefāhr 25 % der gesamten zellulāren Proteinmenge).

Da die PIB keine Rolle in den in-vitro Replikationszyklen spielen, kann das Polyhedrin-Gen ohne nachhaltigen Effeķt auf die in-vitro Lebensfāhigkeit vom Viruschromosom geldscht werden. Durch Verwendung des Virus als Expressionsvektor haben wir die codierende Region fiir das Polyhedrin-Gen mit der fremden zu exprimierenden DNA ersetzt, indem wir es unter die Kontrolle des Polyhedrin-Promotors stellten. Dies ergibt einen nicht-PIB-bildenden Virus-Phānotyp.

Dieses System wurde von vielen Forschern verwendet, insbesondere von Pennock et al. und Smith et al.. Pennock et al. (Gregory D. Pennock, Charles Shoemaker und Lois K. Miller, Mol. Cell. Biol. 3, 399-406 (1984)) berichteten Ober den hohen Exressionsgrad eines bakteriellen Proteins, B-Galactosidase, wenn es unter die Kontrolle des Polyhedrin-Promotors gestellt wird.

Ein anderer nuclearer vom Polyhedrosisvirus abgeleiteter Expressionsvektor wurde von Smith et al. vorgestellt (Gale E. Smith, Mas. D. Summers und M.J. Fraser, Mol. Cell. Biol., 16. Mai, 2156-2165 (1983)). Die Autoren demonstrierten die Effektivitāt ihres Vektors durch die Expression von menschlichem B-Interferon. Das synthetisierte Produkt wurde als glycosilierte Form gefunden und wie erwartet von Insektenzellen sekretiert. In Beispiel 14 werden Modifizierungen des Plasmides beschrieben, welches das Polyhedron-Gen des

Autographa-californica-nucleare-polyhedrosis-Virus (AcNPV) enthSlt, das eine einfache Insertion des EPO-Gens in das Plasmid erlaubt, so daB es unter der Transkriptionskontrolle des Polyhedron-Promotors steht. Die resultierende DNA wird in Insektenzellen co-transfektiert mit intakter chromosomaler DNA des Wildtyps AcNPV. Ein genetischer Rekombinationsversuch ergibt die Ersetzung der AcNPVC-Polyhedrin-Gen-Region durch die DNA des Plasmides. Der resultierende rekombinate Virus kann aus

- 15 der viralen Nachkommenschaft durch das Vorhandensein der DNA-Sequenzen des EPO-Gens identifiziert werden. Dieser rekombinante Virus sollte erwartungsgemāB nach Reinfektion von Insektenzellen EPO produzieren.

Beispiele der EPO-Expression in CHO, C127 und 3T3 und Insektenzellen sind in den Beispielen 10 und 11 (CHO), 13 (C127 und 3T3) und 14 (Insektenzellen) gegeben.

Das biologisch aktive EPO, das durch prokaryontische oder eukaryontische Expression der klonierten EPO-Gene der vorliegenden Erfindung produziert wurde, kann von Xrzten und/oder Veterināren ftlr die in-vivo Behandlung von Sāugern angewendet werden. Die Menge von aktiven Bestandteilen wird natUrlich von der Schwere des zu behandelnden Zustandes abhāngen, vom Weg der gewāhlten Verabreichung, von der spezifischen Aktivitāt des aktiven EPO und wird letztendlich vom behandelnden Arzt oder Veterinārmediziner entschieden werden. Diejenige Menge von aktivem EPO, die vom behandelnden Arzt festgelegt wird, wird im folgenden als EPO-behandlungseffektive Menge bezeichnet. Beispielsweise wurde fUr die Behandlung von induzierter hypoproliferativer Anāmie, die bei Schafen von einer chronischen renalen Schwāche begleitet wird, Uber den Zeitraum von 15-40 Tagen eine tāgliche effektive Menge von EPO von 10 U/kg gefunden (vgl. Eschbach et al, J. Clin. Invest. 74 , 434 (1934 )). Dao aktive EPO kann auf jedem, vom zu behandelnden Zustand abhSngigen Weg verabreicht werden. Vorzugsweise wird das EPO in die Blutbahn des zu behandelnden Sāugetieres injiziert. Es kann leicht durch den Fachman abgeschātzt werden, daB der bevorzugte Verabreichungsweg je nach Art des zu behandelnden Zustandes variieren kann. Obwohl es m6glich ist, das aktive EPO in reiner Form oder als nahezu reine Verbindung zu verabreichen, wird es vorzugsweise als pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht.

Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Verbindungen, sowohl fūr die Anwendung im Verterinār- als auch im Humanbereich, umfassen das aktive EPO-Protein, wie oben beschrieben, zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutischen vertrāglichen Trāgerstoffen und gegebenenfalls anderen therapeutischen Beimischungen. Die Trāgerstoffe mUssen vertrāglich sein mit anderen Inhaltsstoffen der Zusammensetzung und fiir den Patienten nicht schādlich. Die Zusammensetzung sollte keine Oxidationsmittel und andere Substanzen enthalten, von denen bekannt ist, daB sie mit Peptiden unvertrāglich sind. Die Zusammensetzungen kbnnen zweckmāBigerweise in einheitlichen Dosierungsformen abgepackt werden und kbnnen durch viele in der Pharmazie bekannten Methoden hergestellt werden. Alle Methoden beinhalten den Schritt des Mischens von aktivem Inhaltsstoff mit dem Trāgermaterial, das sich aus einem oder mehreren Hilfsstoffen zusammensetzt. Im allgemeinen werden die Zusammensetzungen durch einheitliches und intensives Mischen von aktivem Inhaltsstoff mit flUssigen Trāgern oder feinverteilten iesten Trāgerstoffen oder beidem hergestellt und dann, falls notwendig, wird das Produkt in die gewUnschte Form der Zusammensetzung tlberfilhrt.

Die Zusammensetzungen fūr parenterale Verabreichungen umfassen zweckmāBigerweise sterile wāssrige Lbsungen des aktiven Inhaltsstoffes und Lbsungen, die vorzugsweise isotonisch mit dem Blut des Empfāngers sind. Solche Zusammensetzungen кбппзп zweckmāBigerweise hergestellt werden durch Lbsen des festen aktiven Inhaltsstoffes in Wasser, urn eine wāssrige Lbsung zu erzeugen, und unter sterilen Bedingungen kann diese Lbsung in einheitlichen oder mehrfach dosierbaren Darreichungsformen, z.B. in versiegelten Ampullen oder GefāBen, abgepackt werden.

- 17 Die hier verwendete EPO-cDNA beinhaltet das reife EPO-cDNA-Gen, dem ein ATG-Codon vorausgeht, und EPO-cDNA, die filr allelomorphische Variationen des EPO-Proteins codiert. Eine allelomorph!sche Variation ist in den Abbildungen 3a und 3b dargestellt. Das EPO-Protein enthālt das 1-Methionin-Derivat des EPO-Proteins (Met-EPO) und allelomorphische Variationen des EPO-Proteins. Das reife EPO-Protein, das durch die Sequenz in Abbildung 3a dargestellt ist, beginnt mit der Sequenz Ala-Pro-Pro-Arg ..., deren Anfang durch die Zahl ”1 in Abbildung 3 gekennzeichnet wird. Das Met-EPO wilrde mit der Sequenz Met-Ala-Pro-Pro-Arg ... beginnen.

Die folgenden Beispiele sollen zum besseren Verstāndnis der vorliegenden Erfindung dienen, deren wahre Reichweite in den anliegenden Patentansprdchen dargelegt wird. Ebenso sind Abānderungen der dargelegten Verfahren mbglich, die von der vorliegende Erfindung mitumfaBt werden. Alle Temperaturen werden in °C angegeben und sind unkorrigiert. Das Symbol fUr Micron oder Micro, z.B. Microliter, Micromol usw., ist ”u, z.В. ul, urn usw..

Beispiele

Beispiel 1: Isolierung eines Genom-Klons von EPO

EPO aus dem Urin von Patienten mit aplastischer Anāmie wurde im wesentlichen nach der von Miyake et al., J. Biol. Chem. 252, 5558 (1977) entwickelten Methode gereinigt, mit der Ausnahme, daB die Phenolbehandlung nicht durchgefUhrt wurde und durch eine Hitzebehandlung bei 80°C (ftlnf Minuten) ersetzt wurde, urn die Neuraminidase zu inaktivieren. Der letzte Schritt der Reinigung erfolgte durch Fraktionierung auf einer C-4 Vydac HPLC-Sāule (The Separatious Group), indem ein 0-95 liger Acetonnitril-Gradient mit 0,1 I Trifluoressigsāure (TFA) filr eine Dauer von 100 Minuten angelegt wurde. Die EPO-Fraktion wurde durch Gelelektrophorese und N-terminale Sequenzanalyse (21, 26, 27) der Hauptfraktionen bestimmt. Das EPO wurde bei etwa 53 I Acetonnitril eluiert und stellte ungefāhr 40 I des Proteins dar, das durch reversed-phase-HPLC getrennt wurde. Die EPO enthaltenden Fraktionen wurden zu 100 ul einrotiert, mit Ammoniumbicarbonat auf pH 7.0 eingestellt und mit 2 I TPCK-behandelten Trypsin (Worthington) 18 Stunden lang bei 37°C vollstandig verdaut. Die tryptischen Verdauungsprodukte wurden dann einer reversed-phase-HPLC, wie oben beschrieben, unterworfen. Die optische Dichte bei 280 nm und 214 nm wurde gemessen. Gut separierte P?aks wurden bis fast zur vollstāndigen Trockne einrotiert und direkt der N-terminalen AminosSuresequenzanalyse (59) unterworfen (Applied Biosystems Model 480A Gas phase sequenator). Die erhaltenen Sequenzen sind in Abbildung 3 unterstrichen. Wie zuvor beschrieben, wurden zwei dieser tryptischen Fragenmente fUr die Synthese von

- 19 Oligonucleotidproben ausgewāhlt. Aus der Sequenz Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lys (Aminosāuren 46-52 in Abbildung 3) wurde 17mer mit 32facher Entartung

AAA

TTCCANGCGTAGAAGTT und ein 18mer mit 128facher Entartung

AAA

CCANGCGTAGAAGTTNAC hergestellt. Aus der Sequenz Val-Tyr-Ser-Asn-Phe-Leu-Arg (Aminosāuren 144-150 in Abbildung 3) wurden zwei Pools von 14mers, jeweils 32fach entartet

TTGN T T

TACACCTAACTTCCT und TTGN T T

TACACCTAACTTCTT hergestellt, die sich in der ersten Position des Leucincodons

2 unterscheiden. Die Oligonucleotide wurden am 5’-Ende mit P

2 durch Polynucleotid-Kinase (New England Biolabs) und P-ATP (New England Nuclear) markiert. Die spezifische Aktivitāt der Oligonucleotide variierte zwischen 1 000 und 3 000 Ci/mmol. Im Screening-Verfahren der menschlichen Genom-DNA-Bibliothek im Bakteriophagen-Lambda (Lawn et al., (22)) wurde eine

Modifizierung der in-situ-Vermehrungsmethode vorgenommen, wie ursprilnglich von Woo et al. (47) (1978) beschrieben. Ungefāhr

3,5 x 10^ Phagen wurden mit einer Dichte von 6 000 Phagen auf Petrischalen mit 150 mm Durchmesser (NZTYM-Medium) platicrt und bei 37°C inkubiert, bis Plaques von ca. 0,5 mm sichtbar wurden. Nach einstilndigem Abktlhlen auf 4°C wurden doppelte Replika der Plaques-Muster auf Nylonmembranen (New England Nuclear) ilbertragen und Ober Nacht bei 37°C auf frischen NZCYM-Platten inkubiert. Die Filter wurden dann denaturiert und durch 10-mintitiges Waschen mit 0.5 n NaOH/lm NaCl und 0.5 m Tris (pH 8)/1 m NaCl neutralisiert. Nach darauf folgendem Erhitzen im Vakuum bei 80°C fiir zwei Stunden wurden die Filter gewaschen (5 x SSC, 0.5 % SDS; 1 h) und der Zellrdckstand auf der FilteroberflSche durch vorsichtiges Ankratzen mit einem feuchten Tuch entfernt. Dieses Ankratzen reduziert das Anhaften der Probe auf den Filtern. Die Filter wurden dann mit Wasser gewaschen und ftir eine Dauer von 4-8 Stunden bei 48°C in 3 m Tetramethylammonium-chlorid, 10 mM NaPO^ (pH 6.8), 5 x Denhardt's, 0.5 I SDS und 10 mM EDTA prehybridisiert. Das 3 2

P-markierte 17mer wurde dann mit einer Konzentration von 0.1 pmol/ml zugegeben und die Hybridisierung wurde bei 48°C 72 Stunden lang durchgefūhrt. Nach der Hybridisierung wurden die Filter intensiv mit 2 x SSC (0.3 m NaCl/0.03 m Na-Citrat, pH 7) bei Raumtemperatur gewaschen, dann fQr eine Stunde in 3 m TMAC1/10 mM NaPO^ (pH 6.8) bei Raumtemperatur und anschlieBend ftlr eine Dauer von 5-15 Minuten bei der

Hybridisierungstemperatur. Nach zweitāgiger Autoradiographie mit einem verstSrkenden Schirm wurden ungefāhr 120 starke Duplett-Signale aufgenommen. Die Positiven wurden herausgesucht, in Pools zu acht zusammengegeben, replatiert und ein Screening-Verfahren durchgeftlhrt, indem eine Hālfte des 14mer-Pools auf jedem der beiden Filter und die 17mer auf dem dritten Filter verwendet wurden. Die Bedingungen ftlr das Auftragen auf die Platten und die Hybridisierung sind weiter oben beschrieben, allerdings wurde die Hybridisierung des 14mer bei 37°C durchgeftlhrt. Nach der Autoradiographie wurde die Probe vom 17mer-Filter in 50 % Formamid tlberfilhrt, und nach 20 Minuten bei Raumtemperatur wurde der Filter bei 52°C mit der ISiTier-Probe rehyb) idisiert. Zwei unabhāngige Phagen hybridisierten in alien drei Proben. Die DNA einer dieser Phagen (im folgenden als Lambda-HEPOl bezeichnet) wurde mit Sau3A vollstāndig verdaut und in M13 ftlr die DNA-Sequenzanalyse subkloniert, indem die Dideoxy-Kettenterminierungsmethode von Sanger und Coulson (23) (1977) verwendet wurde. Die Nucleotidsequenz und die davon abgeleitete AminosSuresequenz des offenen Ableserahmens, der fUr das EPO tryptische Fragment (unterstrichene Region)

- 21 codiert, ist in dieser Anmeldung beschrieben. Die Intron-Sequenzen werden in Kleinbuchstaben angegeben, die Exon-Sequenzen (87 Nucleotide) werden in GroBbuchstaben angegeben. Dbereinstimmende Sequenzen zwischen SpleiB-Akzeptor-(a) und Donor-(d)-Stellen sind unterstrichen (vgl. Abbildung 4c).

Beispiel 2: Northern-Analyse der menschlichen f6talen-Leber-mRNA ug der menschlichen fbtalen Leber-mRNA (aus einer 20 Wochen alten fdtalen Leber hergestellt) und eine Leber-mRNA eines Erwachsenen wurden in einem 0,8-ligen Agarose-Formaldehyd-Gel einer Elektrophorese unterworfen und mit Hilfe der Methode von Derman et al., Cell, 23 , 731 (1981) auf Nitrocellulose transferiert. Eine einstrāngige Probe wurde dann aus dem M13-Templat hergestellt, das den in Abbildung 1 dargestellten Einschub enthālt. Der Primer war ein 20-mer, der aus dem gleichen tryptischen Fragment wie die ursprtlngliche 17mer-Probe abgeleitet wurde. Die Probe wurde, wie bereits von Anderson et al., PNAS, (50) (1984) beschrieben, hergestellt, mit der Ausnahme, daB nach der Verdauung mit Smal (womit die gewilnschte Probe mit einer Lange von 95 Nucleotiden hergestellt wurde, die 74 Nucleotide der Codierungssequenz enthālt), die kleinen Fragi-e.jite -/on ill 3-Tempi at durch Chromatographie an einer Sepharose-CI4B-Sēule mit 0.1 n NaOH/0.2 m NaCl gereinigt wurden. Der Filter wurde zu ungefahr 5 x 10^ cpm dieser Probe 12 Stunden lang bei 68°C hybridisiert, zweimal mit SSC bei 68°C gewaschen und sechs Tage lang einem verstarkenden Schirm ausgesetzt. Eine einzelne Marker-mRNA von 1200 Nucleotiden (durch einen Pfeil gekennzeichnet) wurde als Vergleich in der benachbarten Reihe (siehe Abbildung 2) mitlaufen gelassen.

Beispiel 3: Fdtale Leber-cDNA

Eine zu Beispiel 2 identische Probe wurde hergestellt und fUr das Screening einer fdtalen Leber-cDNA-Bibliothek benutzt, die durch das Standard-Plaques-Screening-Verfahren (Benton Davis, Science (54) (1978)) im Vektor Lambda-Ch21A (Toole et al., Nature, (2S) (1984)) hergestellt wurde. Drei unabhāngige positive Klone (im folgenden als Lambda-HEP0FL6 (1350 bp), Lambda-HEPOFL8 (700 bp) und Lambda-HEP0FL13 (1400 bp)) wurden isoliert und anschlieBend erfolgte ein Screening der 1 x 10^ Flecken. Der gesamte Einschub von Lambda-HEPOFL13 und Lambda-HEPOFL6 wurde sequenziert und anschlieBend in M13 subkloniert (vgl. Abbildung 9 bzw. 7). Von Lambda-HEPOFL8 wurden nur Teile sequenziert und der Rest als identisch zu den anderen beiden Klonen angenommen (vgl. Abbildung 8). Die 5’und 3 ’-unilbersetzten Sequenzen werden durch Kleinbuchstaben gekennzeichnet. Die Codierungsregion wird durch GroBbuchstaben dargestellt.

BezOglich der Abbildungen 3a und 3b wird die abgeleitete AminosSuresequenz, die unterhalb der Nucleotidsequenz abgebildet ist, beginnend mit Nummer 1 fUr die erste Aminosāure des fertigen Proteins durchnumeriert. Das mutmaBliche Vorlāuferpeptid wird ebenso angegeben. Cystein-Reste im fertigen Protein werden zusStzlich durch die Bezeichnung SH und mSgliche N-Glycosilierungsstellen durch einen Stern angegeben. Die unterstrichenen Aminosāuren weisen auf solche Reste hin, die durch N-terminale Proteinsequenzierung oder durch Sequenzierung der tryptischen Fragmente von EPO, wie in Beispiel 1 beschrieben, identifiziert wurden. Teilweise durchgezogene Linien weisen auf Reste in der

- 23 AminosSuresequenz von gewissen tryptischen Fragmenten hin, die nicht eindeutig bestimmt werden konnten. Die cDNA-Klone Lambda-HEP0FL6, Lambda-HEP0FL8 und Lambda-HEP0FL13 wurden hinterlegt und sind von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter den Zuordnungsnummern ATCC 40156, ATCC 40152 und ATCC 40153 erhāltich.

Beispiel 4: Genom-Strukturen der EPO-Gene

Die relativen GrčBen und Positionen der vier unabhāngigen Genom-Klonen (Lambda-HEPOl, 2, 3, und 6) von der

HaelII/Alul-Bibliothek sind durch die Uberlappenden Linien in Abbildung 4a dargestellt. Die stārker durchgezogene Linie weist auf die Position des EPO-Gens hin. Eine Skalierung (in Kb) und die Positionen der bekannten Spaltungsstellen fUr die Restriktions-Endonucleasen sind angegeben. Die das EPO-Gen enthaltende Region wurde vollstāndig von beiden Strāngen sequenziert, indem durch Exonuclease-III erzeugte Serien von Ausldschungen innerhalb dieser Region verwendet wurden. Eine schematische Darstellung von fUnf Exons, die fUr EPO-mRNA codieren, ist in Abbildung 4b dargestellt. Die genaue 5'-Grenze des Exons I ist zur Zeit nicht bekannt. Der proteincodierende Teil dieser Exons ist schattiert. Die komplette Nucleotidsequenz dieser Region ist in Abbildung 4c dargestellt. Die bekannten Grenzen jedes Exons sind durch vertikāle Balken skizziert. Die Genomklone Lambda-HEPOl, Lambda-HEPO2, Lambda-НЕРОЗ und Lanibda-НЕРОб wurden hinterlegt und sind von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter den Zuordnungsnummern ATCC 40154, ATCC 40155, ATCC 40150 und ATCC 40151 erhāllich.

Beispiel S: Konstruktion des Vektors p91023(B)

Der verwendete Transformationsvektor war pAdD26SVpA(3), wie von Kaufman et al., Mol. Cell. Biol. 2_, 1304 (1982) beschrieben. Die Struktur dieses Vektors ist in Abbildung 5a dargestellt. Dieses Plasmid enthSlt ein

Māuse-Dihydrofolat-Reduktase-(DHFR)-cDNA-Gen, das unter der Transkriptionskontrolle des

Adenovirus-2-(Ad2)-major-late-Promotors steht. Eine

5’-SpleiB-Stelle ist in der Adenovirus-DNA angegeben und eine 3’-SpleiB-Stelle, von einem Immunglobulin-Gen abgeleitet, befindet sich zwischen dem Ad2-major-late-Promotor und der DHFR-Codierungssequenz. Die SV40-early-Polyadenylierungsstelle befindet sich im Strang unterhalb der DHFR-Codierungssequenz. Die prokaryontisch abgeleitete Sektion von pAdD26SVpA(3) stammt von pSVOd (Mellon et al., Cell 27 , 279 (1981)) und enthālt nicht die pBR322-Sequenzen, die bekannt sind fur die Inhibierung der Replikation in Sāugerzellen (Lusky et al., Nature 293, 79 (1981)).

pAdD26SVpA(3) wurde in das Plasmid pCVSVL2 Dberfilhrt, (vgl. Abbildung 5a). pAdD26SVpA(3) wurde in das Plasmid pAdD26SVpA(3)(d) durch Lbschen einer der beiden Pstl-Stellen in pAdD26SVpA(3) Oberftlhrt. Dies wurde durch teilweise Verdauung mit Pstl erreicht, indem ein UnterschuB von Enzym verwendet wurde, so daB eine Subpopulation von linearisierten Plaswlden erhalten wurde, in denen nur eine einzige Pstl-Stelle gespalten wurde, anschlieBend erfolgte eine Behandlung mit Klenow, die Ligation, um zu rezirkularisieren, und das Screening bzgl. Auslbschungen der Pstl-Stelle, die sich am 3*-Ende der SV40-Polyadenylations-Sequenz befindet.

- 25 Der Adenovirus-Tripartit-Leader und die virusassoziierten Gene (VA-Gene) wurden in pAdD26SVpA(3)(d) inseriert (vgl. Abbildung 5a). Zuerst wurde pAdD26SVpA(3)(d) mit PvuII gespalten, um ein lineares MolekUl zu erhalten, das innerhalb der З’-Region der drei Elemente, die den Tripartit-Leader umfassen, gedffnet ist. Dann wurde pJAW43 (Zain et al., Cell 16, 851 (1979)) mit Xhol verdaut, mit Klenow behandelt, mit PvuII verdaut und die 140 bp-Fragmente, die den zweiten Teil des dritten Leaders enthalten, wurden durch Elektrophorese auf Acrylamidgel (6 % in Tris-Borat-Puffer; Maniatis et al., s.u.) isoliert. Das 140 bp-Fragment wurde dann mit dem PvulI-verdauten pAdD26SVpA(3)(d) verbunden. Das verbundene Produkt wurde dazu verwendet, E.coli zur Tetracyclinresistenz zu transformieren, und die Kolonien wurden nach dem Grunstein-Hoguess-Verfahren gescreent, indem eine P-markierte Probe verwendet wurde, die zu dem 140 bp-Fragment hybridisiert. Eine DNA aus positiv hybridisierten Kolonien wurde hergestellt, um zu testen, ob die rekonstruierte PvuII-Stelle ein 5'-oder З’-Ende der inserierten 140 bp-DNA war, die spezifisch fUr die zweiten und dritten Adenovirus-late-Leaders ist. Die richtige Orientierung der PvuII-Stelle ist das S'-Ende des 140 bp-Einschubes. Dieses Plasmid wird als pTPL in Abbildung 5a bezeichnet.

Das AvalID-Fragment von SV40, das die SV40-Enhancer-Sequenz enthālt, wurde durch Verdauung von SV40-DNA mit Avail erhalten, die Enden wurden mit dem Klenow-Fragme.nt von Poll in glatte Enden tlberfQhrt, Xhol-Linker mit den Fragmenten verbunden, mit Xhol verdaut, um die Xhol-Stellen zu bffnen, und die vier grdBten (D)-Fragmente durch Gelelektrophorese isoliert. Dieses Fragment wurde dann mit aus Xhol geschnittener pTPL verknOpft und somit das Plasmid pCVSVL2-TPL erhalten. Die Orientierung des SV40-D-Fragmentes in pCVSVL2-TPL war derart, daB der SV40-late-Promotor in der gleichen Orientierung war wie der Adenovirus-major-late-Promotor.

Um die Adenovirus-assoziierten (VA)-Gene in die pCVSVL2-TPL zu Uberfilhren, wurde zuerst ein Plasmid pBR322 konstruiert, das das Adenovirus-Typ-2-HINDIII-B-Fragment enthielt. Die Adenovirus-Typ-2-DNA wurde mit Hindlll verdaut und das В-Fragment durch Gelelektrophorese isoliert. Dieses Fragment wurde in pBR322 inseriert, das zuvor mit Hindlll verdaut wurde. Nach der Transformation von E.coli zur Ampicillin-Resistenz wurden die Rekombinanten hinsichtlich der Insertion des HindIII-B-Fragmentes gescreent und die inserierte Orientierung durch Verdauung mit Restriktionsenzymen bestimmt.

pBR322-AdHindlII-B enthālt das Adenovirus-Typ-2-HindIII-B-Fragment in der in Abbildung 5b gezeigten Orientierung.

Wie in Abbildung 5b dargestellt wird, werden die VA-Gene tlbicherweise aus dem Plasmid pBR322-Ad HindIII-B durch Verdauung mit Hpal erhalten, indem EcoRl-Linker zugegeben werden und mit EcoRl verdaut wird, und anschlieBend das 1.4 kb-Fragment zurOckgewonnen wird. Das Fragment mit den tlberstehenden EcoRl-Enden wird dann mit der EcoRl-Stelle von PTL verknUpft, das zuvor mit EcoRl verdaut wurde. Nach der Transformation von E.coli HB101 und Selektion hinsichtlich Tetracyclin-Resistenz wurde mit den Kolonien ein Screening-Verfahren durch Filterhybridisierung zur DNA durchgefllhrt, die fOr die VA-Gene spezifisch ist. Die DNA wurde aus positiv hybridisieiten Klonen bs)unu durch Verdauuung mit Restriktionsendonucleaseri char akter i siert. Das erhaltene Plasmid wird als p91023 bezeichnet.

Wie in Abbildung 5c dargestellt ist, werden die zwei EcoRl-Stellen in p91023 durch vollstandiges Schneiden von p91023 mit EcoRl entfernt, so daB zwei DNA-Fragmente erzeugt werden, eines mit ungefāhr 7 kb, das andere mit ungefShr 1,3 kb. Das letzere Fragment enthielt die VA-Gene. Die Enden von beiden Fragmenten wurde mit Hilfe des Klenow-Fragmentes von

- 27 Poll aufgeftlllt, und die beiden Fragmente wurden dann zusammengefOgt. Ein Plasmid p91023(A), das die VA-Gene enthālt und zu p91023 āhnlich ist, jedoch die beiden EcoRl-Stellen nicht enthālt, wurde sowohl nach dem Grunstein-Hogness-Screening-Verfahren mit dem VA-Gen-Fragment als auch durch konventionelle Restriktionsstellen-Analyse identifiziert.

Die einzelne Pstl-Stelle in p91023(A) wurde entfernt und durch eine EcoRl-Stelle ersetzt. p91023(A) wurde vollstāndig mit Pstl geschnitten und dem Klenow-Fragment von Poll behandelt, urn frische Enden zu erhalten. EcoRl-Linker wurden mit den glatten Pstl-Stellen von p91023(A) verknttpft. Die lineare p91023(A) mit den EcoRl-Linkern an den glatten Pstl-Stellen wurde von den unverknOpften Linkern abgetrennt und vollstāndig mit EcoRl verdaut und wieder neu verknilpft. Ein Plasmid p91023(B) wurde erhalten (vgl. Abbildung 5c) und mit einer zu p91023(A) āhnlichen Struktur charakterisiert, jedoch mit einer EcoRl-Stelle anstelle der friiheren Pstl-Stelle. Das Plasmid p91023(B) wurde hinterlegt und ist von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter der Zuordnungsnummer ATCC 397S4 erhāltlich.

Beispiel 6:

Die cDNA-Klone (Lambda-HEP0FL6 und Lambda-HEPOFLIS, vgl. Beispiel 3) wurden in das Plasmid p91023(B) inseriert, so da6 pPTFL6 und pPTFL13 erhalten wurden. 8 ug jeder gereinigten DNA wurden dann dazu verwendet, 5 x 10⁶ COS-Zellen mit Hilfe der DEAE-Dextran-Methode (siehe unten) zu transfektieren. Nach 12 Stunden wurden die Zellen gewaschen und mit Chlorochin (0,1 mM) zwei Stunden lang behandelt, wieder gewaschen und fUr 24 Stunden 10 ml Medium ausgesetzt, das 10 % fčtales Kālberserum enthālt. Das Medium wurde dann gegen 4 ml serum-freies Medium ausgetauscht und 48 Stunden spāter geerntet.

Die Produktion von immunologisch aktivem EPO wurde mit Hilfe eines Radioimmunoassays nach der Methode Sherwood und Goldwasser (55) quantifiziert. Der Antikbrper wurde von Dr. Judith Sherwood zur Verftlgung gestellt. Der jodierte Tracer wurde aus dem gereinigten EPO (vgl. Beispiel 1) hergestellt. Die Empfindlichkeit des Assays betrāgt ungefāhr 1 ng/ml. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1

Vektor	Konz, an in das Medium abgegebenem EPO (ng/ml)
PPTFL13 PPTFL6	330 31

pPTFL13 wurde hinterlegt und ist von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter der Zuordnungsnummer ATCC 3999 erhāltlich.

Beispiel 7:

Die EPO-cDNA (Lambda-HEPOFL13) wurde in den p91023(B)-Vektor inseriert, in COS-l-Zellen transfektiert und wie oben (Beispiel 6) geerntet, mit der Ausnahme, daB die Chlorochinbehandlung weggelassen wurde.

In-vitro biologisch aktives EPO wurde dadurch vermessen, indem entweder ein koloniebildender Assay mit fbtalen Leberzellen aus Māusen als Quelle fiir CFU-E Oder der ³H-Tymidinaufnahmeassay verwendet wurde, bei dem Milzzellen mit Phenylhydrazin injizierten Māusen verwendet werden. Die Empfindlichkeit dieser Nachweise betrāgt ungefāhr 25 mU/ml. Biologisch aktives EPO wurde in-vivo entweder nach der Methode mit hypoxischen Māusen

- 29 oder mit hungernden Ratten gemessen. Die Empfindlichkeit dieser Nachweise betrāgt ungefāhr 100 mU/ml. Bei beiden Nachweisen wurden in Blindversuchen keine Aktivitaten nachgewiesen. Die Ergebnisse des durch den Klon HEPOFL13 exprimierten EPO’s sind in Tabelle 2 dargestellt, in der die Aktivitaten in U/ml ausgedrilckt sind, wobei kommerzielles EPO (Toyobo Incorp.) als Standard verwendet wurde.

Tabelle 2

Aus mit Typ I-EPO-cDNA transfektierten Zellen ausgeschiedenes

EPO

Nachwei s

RIA

CFU-E ³H-Thy hypoxische Maus hungernde Ratte

Aktivitat

100 ng/ml 2^0.5 U/ml 3.1^1.8 U/ml

U/ml

U/ml

Beispiel 8: SDS-Polyacrylamid-Gel-Analyse von EPO aus COS-Zellen

180 ng von EPO, das in das Medium von COS-Zellen abgegeben wurde, die mit EPO (Lambda-HEPOFL13)-cDNA im Vektor 91023(B) (siehe oben) transfektiert wurden, wurden auf einem 10-%igen SDS-Laemlli-Polyacrylamid-Gel elektrophoretisch getrennt und auf Nitrocellulose-Papier elektrotransferiert (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 76, 4350 (1979)). Der Filter wurde mit Anti-EP0-Antik6rpern, wie in Tabelle 1 beschrieben,

5 tlberprdft, gewaschen und mit I-staph-A-Protein neu UberprUft. Der Filter wurde zwei Tage lang autoradiographiert. Natives reines EPO, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde entweder vor (Linie B) Oder nach der Jodierung (Linie C) elektrophoretisch getrennt (vgl. Abbildung 6). Die verwendeten Marker beinhalteten ³³S-Methionin-markiertes Serumalbumin (68 000 D) und Ovalbumin (45 000 D).

Beispiel 9: Konstruktion von RK1-4

Das BamHI-PvuII-Fragment aus dem Plasmid PSV2DHFR (Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1^, 854-864 (1981)), das den zum M3use-Dihydrofolat-Reductase-(DHFR)-Gen benachbarten SV40-early-region-Promotor, einen SV40-Enhancer, das kleine t Antigen-Intron und die SV40-Polyadenylierungssequenz enthālt, wurde isoliert (Fragment A). Die verbleibenden Fragmente wurden aus dem Vektor p91023(A) (siehe oben) wie folgt erhalten: p91023(A) wurde mit PstI an der einzelnen Pstl-Seite neben dem Adenovirus-Promotor verdaut, um das Plasmid zu linearisieren, und entweder mit synthetischem PstI oder mit EcoRI-Konvertern verknUpft und rezirkularisiert (dabei werden die Stellen PstI-EcoRI-PstI an der ursprUnglichen Pstl-Stelle erzeugt; 91023(B’)) oder mit dem groBen Fragment der DNA-Polymerase I behandelt, um die Pstl-Stellen zu zerstbren, und mit den synthetischen EcoRl-Linker verknUpft und rezirkularisiert (dabei wird eine EcoRI-Stelle an der ursprUnglichen Pstl-Stelle erzeugt; 91023(B)). Jedes der beiden resultierenden Plasmide 91023(B) und 91023(B’) wurden mit Xba und EcoRI verdaut, wobei zwei Fragmente (F und G) gebildet werden. Durch Verbinden von Fragment F aus p91023(B) und Fragment G aus p 91023 (B’) und Fragment G aus p91023(B) und Fragment F aus p91023(B’) wurden zwei neue Plasmide erzeugt, die entweder eine EcoRI-PstI-Stelle oder eine PstI-EcoRI-Stelle an der ursprUnglichen Pstl-Stelle enthiclten. Das Plasmid, das die PstI-EcoRI-Stelle enthielt, wo die Pstl-Stelle dem Adenovirus-major-late-Promotor am nāchsten ist, wurde als p91023(C) bezeichnet.

Der Vektor p91023(C) wurde mit Xhol vollstSndig verdaut und die resultierende linearisierte DNA mit Uberstehenden Enden wurde mit einem groBen Fragment von E.coli DNA Polymerase 1 in eine DNA mit glatten Enden UberfUhrt. An diese DNA wurde ein

- 31 340 bp Hindi 11-EcoRI-Fragment gebunden, das den SV40-Enhancer enthālt, der wie folgt hergestellt wurde:

Das Hindi 11-PvulI-Fragment aus SV40, das den SV40-Ursprung oder die Replikation und den Enhancer enthālt, wurde in das Plasmid c-lac inseriert (Little et al., Mol. Biol. Med. 1_, 473-488 (1983)). Der c-lac-Vektor wurde durch Verdauung von c-lac-DNA mit BamHI hergestellt, anschlieBend die Uberstehenden Enden mit einem groBen Fragment von DNA-Polymerase 1 aufgeftlllt und die DNA mit Hindlll verdaut. Das resultierende Plasmid (c-SVHPlac) regenerierte die BamHI-Stelle durch VerknOpfen der glatten Enden von PvuII. Das EcoRI-HindlII-Fragment wurde aus c-SVHPlac hergestellt und an das EcoRI-Hindlll-Fragment von PSVOd gebunden (Mellou et al., siehe oben), das den Plasmid-Ursprung der Repliklation enthielt, und das resultierende Plasmid PSVHPOd wurde selektioniert. Das 340 bp EcoRI-Hindi II-Fragment von PSVHPOd, das den SV40-Ursprung/Enhancer enthālt, wurde dann hergestellt, beide Enden mit einem groBen Fragment von DNA-Polymerase in glatte Enden (IberfOhrt und an den Xhol-verdauten p91023(c)-Vektor, wie oben beschrieben, gebunden. Das resultierende Plasmid (p91023(C)/Xho/glattes Ende plus EcoRI/HindlII/glattes Ende, SV40-Ursprung plus Enhancer), in dem die Orientierung des Hindlll-EcoRI-Fragmentes derart war, daB die BamHI-Stelle innerhalb dieses Fragmentes dem VA-Gen am nāchsten war, wurde als pESlOS bezeichnet. Das Plasmid pES105 wurde mit BamHI und PvuII und ebenso mit PvuII allein verdaut, und das BamHI-PvuII - Fragment, das den Adenovirus-major-late-Promotor (Fragment B) enthālt, und das PvuII-Fragment, das das Plasmid innerhalb der Resistenzgene (Tetracyclinresistenz) enthālt, und andere Sequenzen (Fragment C) wurden isoliert. Die Fragmente A, В und C wurden verkntipft und das in Abbildung 10b dargestelle Plasmid wurde isoliert und als RK1-4 bezeichnet. Das Plasmid RK1-4 wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hinterlegt und ist dort unter der Zuordnungsnummer ATCC 39940 erhāltlich.

Beispiel 10: Expression von EPO in СНО-Zellen (Methode I

Die DNA (20 ug) aus dem Plasmid pPTFL13 (vgl. Beispiel 6) wurde mit der Restriktions-Endonuclease Clal verdaut, urn das Plasmid zu linearisieren, und wurde mit Cla-1-verdauter DNA aus dem Plasmid pAdD26SVp(A)1 (2ug) verkndpft, das ein durch den Adenovirus-major-late-Promotor (Kaufman und Sharp, Mol. and Cell. Biol. £, 1304-1319 (1982)) reguliertes intaktes Dihydrofolatreductase-(DHFR)-Gen enthalt. Diese verknilpfte DNA wurde verwendet, um DHFR-negative СНО-Zellen (DUKX-BII, Chasin L.A. und Urlaub G., Proc. Natl. Acad. Sci. 77 , 4216-4220 (1980)) zu transfektieren, und nach zweitagigem Zttchten wurden die Zellen, die mindestens ein DHFR-Gen beinhalteten, in nucleosidfreiem Alphamedium selektioniert und 10 % dialysiertes fOtales Kālberserum zugegeben. Nach zweiwdchigem Wachstum in selektiven Medien wurden die Kolonien von den Originalplatten entfernt, in Gruppen zu 10 bis 100 Kolonien zusammengeftlgt, replattiert und in nucleosidfreiem Alphamedium gezdchtet. Die (lberstehenden Medien der Pools, die vor der

Methotrexat-Selektion gewachsen waren, wurden auf EPO mit Hilfe eines RIA getestet. Pools mit positiver EPO-Produktion wurden in Gegenwart von Methotrexat (0,02 UM) gezilchtet, dann subkloniert und wieder getestet. EPO-Cla4alpha4.02-7, ein einzelner Subklon aus dem EPO-Cla4alpha4.02-Pool, gibt 460 ng/ml EPC in das Medium ab, das 0,02 uM MTX (vgl. Tabelle 3) enthālt. EPO-C1a4alpha4.02-7 ist die Zellinie der Wahl for die EPO-Produktion und wurde bei der American Type Culture Collection (Zuordnungsnummer ATCC CRL869S) hinterlegt. Zur Zeit wird dieser Klon einer schrittweisen Selektion mit steigenden Konzentration vom MTX unterworfen und wird voraussichtich Zellen ergeben, die noch hChere Konzentrationen von EPO

- 33 produzieren. FOr Pools, die im RIA negativ waren, wurden Methotrexat-resistente Kolonien, welche aus den Gegenkulturen erhalten wurden, die in der Gegenwart von Methotrexat (0,02 uM) gewachsen waren, erneut mittels RIA auf EPO geprilft. Diejenigen Kulturen, die nicht positiv waren, wurden subkloniert und in weiter steigenden Konzentrationen von Methotrexat gezUchtet.

Die schrittweise Methotrexat-(MTX)-Selektion wurde durch sich wiederholende Zyklen des ZUchtens von Zellen in Gegenwart von steigenden Konzentrationen an Methotrexat und durch die Selektion der Uberlebenden Zellen erreicht. Nach jedem Durchgang wurde EPO im Kulturtlberstand durch RIA und durch in-vitro biologische Aktivitāt gemessen. Die Konzentrationen von Methotrexat, die in jeder schrittweisen VerstSrkung verwendet wurden, waren 0,02 M, 0,1 M und 0,5 M. Wie in Tabelle 3 dargestellt ist, wurden nach einem Durchgang der Selektion in 0,02 Μ MTX signifikante Konzentrationen von EPO in das Kulturmedium abgegeben.

Tabelle 3

Konzentration von in das Medium abgegebenem EPO

Probe Test alpha-Medium-Ernte 0,02 uM methotrexat in der alpha-Medium Ernte 4oc 4 Pool RIA 17 ug/ml 50 ng/ml

4< 4 Single

Pool

Klon

(.02-7) RIA

460 ng/ml

Beispiel 11: Expression von EPO in CHO-Zellen (Methode 2)

Die DNA des Klons Lambda-HEPOFL13 wurde mit EcoRI verdaut und das kleine RI-Fragment, das das EPO-Gen enthālt, wurde in die EcoRI-Stelle des Plasmides RK1-4 (vgl. Beispiel 10) subkloniert. Diese DNA (RKFL13) wurde dann benutzt, um die DHFR-negativen CHO-Zellen direkt zu transfektieren (ohne Verdauung). Die Selektion und Verstārkung wurde wie in Beispiel 10 beschrieben durchgefilhrt.

Die RKFL13-DNA wurde ebenfalls in CHO-Zellen durch Protoblastenfusion und Mikroinjektion inseriert. Das Plasmid RKFL13 wurde hinterlegt und ist von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter der Zuordnungsnummer ATCC 39989 erhSltlich.

Tabelle 4

Konzentration von in das Medium abgegebenem EPO

Probe Test alpha-Medium-Ernte 0.02 uM Methotrexat in der alpha-MediumErnte

Kolonie Pool	A RIA 3H-Thy	3 ng/ml	42 150 1.5	ng/ml ng/ml U/ml	(Pool) (Klon)
Einzelner
Kolonieklon	RIA	-	90	iiii/li'l
(.02c-Z)	3H-Thy	-	5.9	U/ml
Mikroinj i-	RIA	60 ng/ml	160	ng/ml
zierter Pool
(DEPO-1)
	3H-Thy	1.8 U/ml	-

Der bevorzugte einzelne Kolonie-Klon wurde hinterlegt und ist von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter der Zuordnungsnummer ATCC CRL8695 erhāltlich.

- 35 Beispiel 12: Expression des EPO-Genom-Klons in COS-l-Zellen

Der Vektor, der fUr die Expression des EPO-Genom-Klons verwendet wurde, ist pSVOd (Mellon et. al., s.o.). Die DNA von pSVOd wurde vollstāndig mit Hindlll verdaut und die Enden mit dem groBen Fragment von DNA-Polymerase-I in glatte Enden umgewandelt. Der EPO-Genom-Klon Lambda-НЕРОЗ wurde mit EcoRI und Hindlll vollstāndig verdaut und das 4,0 kb-Fragment, das das EPO-Gen enthālt, wurde isoliert und wie oben beschrieben in glatte Enden umgewandelt. Die Nucleotidsequenz dieses Fragmentes von der Hindi 11-Stelle bis zur Region oberhalb des Polyadenylierungssignals ist in Abbildung 4 dargestellt. Das EPO-Gen-Fragment wurde in das pSVOd-Plasmid-Fragment inseriert. Korrekt konstruierte Rekombinanten in beide Richtungen konnten isoliert und verifiziert werden. Das Plasmid CZ2-1 besitzt das EPO-Gen in der Orientierung a (d.h., daB das 5'-Ende von EPO dem SV40 Ursprung am nāchsten liegt) und das Plasmid CZ1-3 besitzt die entgegengesetzte Orientierung (Orientierung b).

Die Plasmide CZ1-3 und CZ2-1 wurden in COS-l-Zellen, wie in Beispiel 7 beschrieben, transfektiert, das Medium geerntet und auf immunologisch aktives EPO getestet. Ungefāhr 31 ng/ml von EPO wurde im Kulturtlberstand von CZ2-1 nachgewiesen bzw. 16-31 ng/ml von CZ1-3.

Die Genom-Klone HEPO1, HEP02 und HEPO6 konnen in COS-Zellen zur Expression auf āhnliche Weise inseriert werden.

Beispiel 13: Expression in C127 und CHO-Zellen und Konstruktion von pBPVEPO

Ein Plasmid, das die EPO-cDNA-Sequenz unter der

Transkriptions-Kontrolle des Metallothionein-Promotors von Māusen enthālt und das an die komplette Papilloma-virus-DNA von Rindern gebunden ist, wurde wie folgt hergestellt:

pEPO49f

Das Plasmid SP6/5 wurde von Promega Biotec. kāuflich erworben. Dieses Plasmid wurde mit EcoRI vollstāndig verdaut und das 1340 bp EcoRI-Fragment von Lambda-HEP0FL13 wurde durch DNA-Ligase inseriert. Das resultierende Plasmid, in dem das 5’-Ende des EPO-Gens dem SP6-Promotor (durch Bgll und Hindi 11-Verdauung bestimmt) am nāchsten war, wurde als pEPO49f bezeichnet. In dieser Orientierung ist die BatmHI-Stel le im PSP6-5-Poly-Linker dem 5’-Ende des EPO-Gens direkt benachbart.

pMMTneo^BPV

Das Plasmid pdBPV-MMTneo (342-12) (Law et al., Mol. and Cell Biol. 3^, 2110-2115 (1983)), das in Abbildung 11 dargestellt ist, wurde mit BamHI vollstāndig verdaut, urn zwei Fragmente zu erzeugen: Ein grofies Fragment einer Lānge von ca. 8 kb, das das BPV-Genom enthālt, und ein kleineres Fragment der Lānge von ungefāhr 6,5 kb, das den pML2-Ursprung der Replikation und das Ampicillin-Resistenz-Gen, den Methcllothionein-Promotor, das Neomycin-Resistenz-Gen und das SV40-Polyadenylierungssignal enthālt. Die verdaute DNA wurde durch DNA-Ligase rezirkularisiert und die Plasmide, die nur das 6,8 kb-Fragment enthielten, wurden durch Verdauung mit EcoRI- und BamHI-Restriktionsendonucleasen identifiziert. Eines dieser Plasmide wurde als pMMTneo^BPV bezeichnet.

- 37 pEP015a pMMTneo BPV wurde mit BglII vollstāndig verdaut. pEP049f wurde mit BamHI und BglII vollstāndig verdaut und die ungefāhr 700 bp-Fragmente, die die gesamte EPO-Codierungsregion enthielten, wurden durch Gelisolierung hergestellt. Die BglII verdauten pMMTneo BPV- und die 700 bp BamHI/BGl11-EPO-Fragmente wurden verknilpft und die resultierenden Plasmide, die die EPO-cDNA enthielten, wurden identifiziert durch Koloniehybridisierung mit der 01igonucleotid-d(GGTCATCTGTCCCCTGTCC)-Probe, die spezifisch ftlr das EPO-Gen ist. Von den Plasmiden, die bei der Hybridisierungsanalyse positiv waren, wurde eines (pEPO15a), das die EPO-cDNA in der Orientierung besaB, so daB das 5’-Ende der EPO-cDNA dem Metallothionein-Promotor am nāchsten war, durch Verdauung mit EcoRI und KpnI identifiziert.

pBPV-EPO

Das Plasmid pEPO15a wurde vollstāndig durch BamHI verdaut, urn das Plasmid zu linearisieren. Das Plasmid pdBPV-MMTneo (342-12) wurde ebenfalls vollstāndig mit BamHI verdaut, um zwei Fragmente von 6,5 und 8 kb zu erzeugen. Das 8 kb-Fragment, das das gesamte Rinder-Papilloma-Virus-Genom enthielt, wurde isoliert (Gel). pEP015a/BamHI und das 8 kb-BamHI-Fragment wurden miteinander verknilpft und ein Plasmid (pBPV-EPO), das das BPV-Fragment enthielt, wurde durch Koloniehybridisierung identifiziert, indem eine Oligonucleotidprobe d(P-CCACACCCGGTACACA-OH) verwendet wurde, die spezifisch ftlr das BPV-Genom ist. Die Verdauung von pBPV-EPO-DNA mit Hindlll wies darauf hin, daB die Richtung der Transkription des BPV-Genoms die gleiche war wie die Richtung der Transkription des Metallothionein-Promotors (wie in pdPBV-MMTneo(342-12), vgl. Abbildung 11). Das Plasmid pdBPV-MMTneo(342-12) ist von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter der Zuordnungsnummer ATCC 37224 erhāltlich.

Expression

Die folgenden Methoden wurden f(ir die Expression von EPO verwendet.

Methode I

DNA-pBPV-EPO wurde hergestellt und ungefāhr 25 ug wurden verwendet, urn ungefāhr 10^ C127 (Lowy et al., J. of Virol.

26, 291-298 (1978))-CHO-Zellen zu transfektieren, indem die Standardtechnik der Kalziumphosphatfāllung verwendet wurde (Grahm et al., Virology 52 , 456-467 (1973 )). Filnf Stunden nach der Transfektion wurde das Transfektionsmedium entfernt, die Zellen mit Glycerin abgeschreckt, gewaschen und frisches alpha-Medium mit 10 %igem fbtalem Rinderserum zugegeben. 48 Stunden spāter wurden die Zellen trypsiniert und im Verhāltnis von 1:10 in DME-Medium mit 500 ug/ml G418 (Southern et al., Mol. Appl. Genet. 1_, 327-341 (1982)) aufgeteilt und die Zellen fUr zwei bis drei Wochen inkubiert. G418-resistente Kolonien wurden einzeln auf in Mikrotiterplatten isoliert und in der Gegenwart von G418 gezilchtet. Die Zellen wurden dann gewaschen, frisches Medium mit 10 I fbtalem Rinderserum zugegeben und die Medien 24 Stunden spāter geerntet. Die konditionierten Medien wurden durch Radioimmunoassay und durch in-vitro biologische Versuche getestet und waren positiv for EPO.

Methode II

C127 oder СНО-Zellen wurden cotransfektiert mit 25 ug von pBPV-EPO und 2ug von pSV2neo (Southern et al, siehe oben ; vgl. Methode I). Dies bedeutet einen ungefāhr lOfachen molaren UberschuB von pBPV-EPO. Nach der Transfektion ist das Verfahren das gleiche wie in Methode I.

- 39 Methode III

C127-Zellen wurden mit 30 ug von pBPV-EPO transfektiert (vgl. Methode I). Nach der Transfektion und der Aufteilung (1 : 10) wurde das Medium alle drei Tage gegen frisches ausgetauscht. Nach ungefāhr zwei Wochen wurden Punktē von pBPV transformierten Zellen sichtbar. Einzelne Punktē wurden getrennt in 1 cm Vertiefungen von Mikrotiterplatten gegeben, zu einem subkonfluenten Monolayer gezUchtet und auf EPO-Aktivitāt oder auf Antigenitāt im konditionierten Medium getestet.

Beispiel 14: Expression in Insektenzellen

Konstruktion von pIVEV EPOFL13

Der Plasmidvektor pIVEV wurde hinterlegt und ist von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter der Zuordnungsnummer ATCC 39991 erhāltlich. Der Vektor wurde wie folgt modifiziert:

pIVEVNI pIVEV wurde mit EcoRl verdaut, urn das Plasmid zu linearisieren, durch Verwendung eines groBen Fragmentes von DNA-Polymerase I wurden die Enden in glatte Enden umgewandelt und ein einzelner Notl-Linker

GGCGGCCGCC

CCGCCGGCGG wurde durch Verbinden der glatten Enden inseriert. Das resultierende Plasmid wird als pIVEVNI bezeichnet.

pIVEVSI pIVEV wurde mit Smal verdaut, urn das Plasmid zu linearisieren, und ein einzelner Sfil-Linker

GGGCCCCAGGGGCCC CCCGGGGTCCCCGGG wurde durch Verbinden der glatten Enden inseriert. Das resultierende Plasmid wurde als pIVEVSI bezeichnet.

pIVEVSIBgKp

Das Plasmid pIVEVSI wurde mit KPnl verdaut, um das Plasmid zu linearisieren, und ungefāhr 0 - 100 bp wurden von jedem Ende durch Verdauung mit der doppelstrāngigen Exonuclease Bal31 entfernt. Alle resultierenden Enden, die nicht vollstāndig glatt waren, wurden mit Hilfe des groBen Fragmentes von

DNA-Polymerase I in glatte Xhol

I

EcoRI ¹ I

Enden umgewandelt und der Poly-Linker Xbal

Г

I

BgL'l I

I ¹ I , , ____________________________________________ ‘AGATCTbGA’GAATTCTAGATCGATGGTACC

TCTAGAGCTCTTAAGATCTAGCTACCATGG wurde durch Verbinden der glatten Enden inseriert. Der Poly-Linker wurde in beide Richtungen inseriert. Ein Plasmid, in dem der Poly-Linker so orientieri ist, daB die Bglll-Stelle innerhalb des Poly-Linkers dem Polyhedron-Gen-Promoter am nāchsten ist, wird als pIVEVSIBgKp bezeichnet. Ein Plasmid, in dem KpnI-Stelle innerhalb des Poly-Linkers dem Polyhedron-Gen-Promotor am nāchsten liegt, wird als pIVEVSIKpBg bezeichnet. Die Anzahl der Basenpaare, die zwischen der ursprūnglichen KPnl-Stelle in pIVEVSI und dem Polyhedron-Promotor geldscht wurde, wurde nicht bestimmt. pIEIVSIBgKp wurde hinterlegt und ist unter der Zuordnungsnummer ATCC 39988 von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, erhāltich.

pIVEVSIBgKpN pIVEVNI wurde mit KPnl und PstI vollstāndig verdaut, um zwei Fragmente zu erhalten. Das grCBere Fragment, das den Plasmidursprung der Replikation und das З'-Ende des Polyhedron-Gens enthālt, wurde durch Gelisolierung hergestellt (Fragment A). pIVEVSIBgKp wurde vollstāndig mit PstI und KPn verdaut, um zwei Fragmente sowie ein kleines Fragment zu

- 41 erhalten, das den Polyeder-Gen-Promotor enthalt. Der Poly-Linker wurde durch Gelisolation hergestellt (Fragment B). Die Fragroente A und В wurden dann durch die DNA-Ligase miteinander verbunden, urn das neue Plasmid pIVEVSIBgKpNI zu bilden, das ein teilweise geldschtes Polyeder-Gen enthālt, in das ein Poly-Linker inseriert wurde, und das ebenso die Notl-Stelle (Ersetzen der zerstdrten EcoRI-Stelle) und eine Sfil-Stelle enthālt, die die Polyhedron-Gen-Region flankiert.

pIVEPO pIVEVSI BgKpNI wurde vollstāndig mit EcoRI verdaut, urn das Plasmid zu linearisieren, und das 1340 bp EcoRI-Fragment von Lambda-HEP0FL13 wurde inseriert. Die Plasmide, die das EPO-Gen in der Orientierung enthielten, so daB das 5’-Ende des EPO-Gens dem Polyeder-Promotor am nāchsten war, und das З’-Ende des Polyeder-Gens wurden durch Verdauung mit Bglll identifiziert. Eines dieser Plasmide in der obenbeschriebenen Orientierung wurde als pIVEPO bezeichnet.

Expression von EPO in Insektenzellen

GroBe Mengen des pIVEPO-Plasmides wurden durch Transformation des E.coli Stranges JM101-tgl hergestellt. Die Plasmid-DNA wurde durch die ”cleared-lysate”-Technik isoliert (Maniatis und Fritsch, Cold Spring Harbor Manual) und weiter durch CsCl-Zentrifugation gereinigt. Die L-l-DNA aus dem Wildtyp autographa-californica-Polyhydrosis Virus (AcANPV) wurde durch Phenolextraktion von Viruspartikeln und darauf folgender CsCl-Reinigung der viralen DNA hergestellt.

Diese beiden DNAs wurde dann in spod.-frugiperda-Zellen IPLB-SF-21C Vaughn et al., in-vitro, Vol. B, S. 213 - 217 (1977)) cotransfektiert, indem das Verfahren der

Kalziumphosphat-Transfektion (Potter und Miller, 1977) verwendet wurde. FUr jede Platte der zu cotransfektierenden Zellen wurden 1 ug des Wild-Typs AcNPV-DNA und 10 ug von pIVEPO verwendet. Die Platten wurden fOnf Tage lang bei 27°C inkubiert. Der Uberstand wurde dann geerntet und die EPO-Expression im Uberstand wurde durch Radioimmunoassay und durch in-vitro biologische Methoden bestatigt.

Beispiel 15: Reinigung von EPO

Die mit COS-Zellen konditionierten Medien (121) mit EPO-Konzentration bis zu 200 ug/1 wurden auf 600 ml konzentriert, indem Ultrafiltrationsmembranen mit einer AusschluBgrenze eines Molekulargewichts von 10.000 verwendet wurden, z.B. eine Millipore-Pellikan-Membran. Die Tests wurden mit Hilfe eines RIA, wie in Beispiel 6 beschrieben, durchgefUhrt. Der Uberstand aus der Ultrafiltration wurde gegen 4 ml eines 10 mM-Natriumphosphatpuffe’-s (pH 7,0) diafiltriert. Die konzentrierten und diafiltrierten, konditionierten Medien enthielten 2,5 mg EPO (380 mg Gesamtprotein). Die EP0-L6sung wurde auf 186 ml weiterkonzentriert und die ausgefallenen Proteine wurden 30 Minuten lang bei 120.000 xg abzentrifugiert.

Der Uberstand, der 2,0 mg EPO enthielt, wurde mit 50 liger Essigsāure auf pH 5,5 eingestellt, 30 Minuten bei 4°C geriihri: und der Niederschlag 30 Minuten lang bei 13.000 xg abzentrifugiert.

- 43 Carbonylmethyl-Sepharose-Chromatographi e

Der Uberstand der Zentrifugation (20 ml), der 200 ug von EPO (24 mg Gesamtprotein) enthielt, wurde auf eine Sāule aufgetragen, die mit CM-Sepharose (20 ml) gepackt und mit 10 mM Natriumacetat (pH 5,5) fiquilibriert war. Anschliefiend wurde die Sāule mit 40 ml des gleichen Puffers gewaschen. Das an die CM-Sepharose gebundene EPO wurde nach 100 ml eines Gradienten von NaU (0 - 1) in 10 mM Natriumphosphat (pH 5,5) eluiert. Die Fraktionen, die EPO enthielten (insgesamt 50 ug von 2 mg Gesamtprotein) wurden vereinigt und auf 2 ml mit Hilfe einer Amicon-YM10-Ultrafiltrationsmembran konzentriert.

Reversed-phase-HPLC

Die konzentrierten Fraktionen nach der Sāulenchromatographie, die EPO enthielten, wurden weiter durch reversed-phase-HPLC Ober eine Vydac C-4-Sāule gereinigt. Das EPO wurde mit einer Flufirate von 1 ml/min auf die Sāule aufgetragen, die mit 10 % Lbsung В (Lbsung A war 0,1 I CF^COOH in Wasser; Lbsung В war 0,1 I CFjCOOH in CFjCN) āquilibriert wurde. Die Sāule wurde mit 10 % der Lbsung В 10 Minuten lang gewaschen und das EPO wurde mit einem linearen Gradienten von В (10 - 70 % ; 60 min) eluiert. Die EPO enthaltenden Fraktion wurden vereinigt (ungefāhr 40 ug von EPO von 120 ug Gesamtprotein) und lyophilisiert. Das lyophilisierte EPO wurde in 0,1 m Tris-HCl-Pfuffer (pH 7,5) mit 0,15 m NaCl rekonstituiert und auf einer reversed-phase-HPLC rechromatographiert. Die EPO enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und mit Hilfe der SDS-Polyacrylamid-(10 %)-Gel Elektrophorese (Lamelli, U.K. Nature) analysiert. Die vereinigten Fraktionen von EPO enthielten 15,5 ug von EPO (25 ug Gesamtprotein).

Claims (18)

1. Rekombinantās plazmīdas DNS, kas ietver cilvēka EPO kodējošo cDNS secību, kāda tā attēlota tabulā 3 vai cilvēka EPO kodējošo genoma DNS secību, kāda tā attēlota tabulā 4.

2. Rekombinantās plazmīdas DNS pēc 1. punkta, kas ietver genoma DNS secību, kāda tā attēlota tabulā 4 no secības ATG, kas kodē sākuma Met līdz AGA, kas kodē galējo Arg.

3. Rekombinantās plazmīdas DNS pēc 1. punkta, kas ietver EPO cDNS no klona λ-HEPOFL 13 (deponēts ATCC - American Type Culture Collection, Rockville, Maryland - ar numuru 40153, kur tas pasūtams), adenovīrusa galveno vēlīno promoteru, trīsdaļu līderi un ar vīrusu saistītos gēnus (VA gēnus) pēc zīm. 5c.

4. Rekombinantās plazmīdas DNS pēc 1. punkta, kas ietver EPO cDNS no klona λ-HEPOFL 13 (ATCC 40153), adenovīrusa galveno vēlīno promoteru, trīsdaļu līderi un ar vīrusu saistītos gēnus (VA gēnus) un SV40 agrīno promoteru pēc zīm. 7.

5. Rekombinantās plazmīdas DNS pēc 3. punkta, kas iegūta no plazmīdas pPTFL 13 (ATCC 39990).

6. Rekombinantās plazmīdas DNS pēc 4. punkta, kas iegūta no plazmīdas PKFL 13 (ATCC 39989).

7. Rekombinantās plazmīdas DNS pēc 1. punkta, kas ietver EPO cDNS secību no klona λ-HEPOFL 13 (ATCC 40153) un kuras transkripciju kontrolē peles metalotioneīna promoters un kas pievienota pilnai vērša papilomas vīrusa DNS un ir iegūstama no plazmīdas pdBPV-MMTneo (342-12) (ATCC 37224).

8. Zīdītāja Šūnu līnija, kas transformētas ar rekombinanto plazmīdu pēc 1. punkta.

9. Zīdītāja šūnu līnija pēc 8. punkta , kas transformētas ar plazmīdu pPTFL 13 (ATCC 39990) vai plazmīdu RKFL 13 (ATCC 39989).

10. CHO Šūnu līnija EPO Cla 44.02-7 pēc 9. punkta, kas deponēta ar reģistrācijas numuru ATCC CRL 8695.

11. Rekombinantais cilvēka eritropoefīns, kas ir O-glikozilēts, atšķiras ar to, ka tas iegūstams:

a) kultivējot piemērotā vidē CHO šūnas, kas transformētas ar plazmīdu pPTFL 13 (ATCC 39990) vai plazmīdu RKFL 13 (ATCC CRL 8695);

b) izdalot EPO no šūnām un vides un to attīrot.

12. Rekombinantais cilvēka eritropoefīns pēc 11. punkta, kas iegūstams kultivējot CHO šūnu līniju EPO Cla 44.02-7 (ATCC CRL 8695).

13. Rekombinantais cilvēka eritropoetīns pēc 11. vai 12. punkta, kas atšķiras ar to, ka ir glikozilēts ar fukozi.

14. Rekombinantais cilvēka eritropoefīns pēc 13. punkta, kas atšķiras ar to, ka tas ir glikozilēts ar heksozēm un N-acetilglikozamīnu (Nacglc) molārajā attiecībā 1,4:1; specifiski:

galaktoze: Nacglc = 0,9:1 un mannoze: Nacglc = 0,5:1.

15. Rekombinantais cilvēka eritropoefīns pēc 13. vai 14. punkta, kas atšķiras ar to, ka tas satur N-acetilgalaktozamīnu.

16. Rekombinantais cilvēka eritropoefīns pēc jebkura no 11.- 15. punktiem, kas atšķiras ar specifisko aktivitāti vismaz 200000 vienību miligramā olbaltumvielas, optimāli 275000 -300000 vienību miligramā olbaltumvielas.

17. Farmaceitiskā kompozīcija EPO deficīta ārstēšanai, kas satur farmaceitiski efektīvu daudzumu rekombinantā cilvēka eritropoetīna pēc jebkura no 11.-14. punktiem, kopā ar vienu vai vairākiem farmaceitiski pieņemamiem nesējiem, neobligātā gatavā zāļu formā.

18. Farmaceitiskā kompozīcija pēc 17. punkta, kas atšķiras ar to, ka papildus satur vienu vai vairākus citus ārstniecības līdzekļus.