DE68928718T2 - Human-Nervenwachstumsfaktor - Google Patents
Human-NervenwachstumsfaktorInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft die Konstruktion von rekombinanten DNA- Molekülen für die Expression von Human-Nervenwachstumsfaktor (hNGF) unter Verwendung eines Baculovirus-Expressionssystems. Die Produktion von hNGF wird durch Verwendung des Baculovirus-Systems zur Expression des Proteins in S. frugiperda-Wirtszellen erreicht. Der rekombinante hNGF besitzt Anwendungspotential zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit.
- Die Primärstruktur eines Säuger-NGF (Maus-NGF) wurde zuerst von Angeleti und Bradshaw, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 68:2417 (1971) aufgeklärt. Die Primärstruktur dessen Vorläufers, Präpro-NGF, wurde aus der Nukleotidsequenz der Maus-NGF-cDNA (Scott et al., Nature 302:538 (1983); Ullrich et al., Nature 303:821 (1983)) abgeleitet.
- Das in hohem Maße homologe Human-NGF (hNGF)-Gen wurde ebenfalls identifiziert (Ullrich, Symp. on Quan. Biol.. Cold Spring Harbor 48:435 (1983). Dessen Homologie zum Maus-NGF beträgt 90 und 87% auf den Ebenen der Aminosäure- bzw. Nukleotidsequenz. Aufgrund der Knappheit an hNGF ist wenig über dessen biologische Aktivität bekannt.
- Baculovirus-Expressionsvektoren wurden für die Expression einer Vielfalt fremder Gene in Insektenzellen in vitro oder in vivo eingesetzt (siehe US-A- 4745051). Diese Expressionsvektoren verwenden den hocheffizienten und zeitweilig regulierten Autographa californica-Kernpolyhedrosis-Virus (AcNPV)-Polyhedrinpromotor mit dem interessierenden Gen stromabwärts des Promotors inseriert. Das entsprechende Genprodukt wird aus Spodoptera frugiperda-Zellen erhalten, die mit den rekombinanten Baculovirus-Vektoren infiziert sind.
- Die Isolierung der β-Untereinheit von hNGF und deren Expression als heterologes Protein in E. coli wird in EP-A-121338 beschrieben. Unter Anwendung rekombinanter Verfahren wurde Human-β-NGF im wesentlichen frei von anderen Säugerproteinen exprimiert. Die Expression des hNGF in E. coli unter Verwendung zweier Gene, die geänderte Aminotermini enthalten, was in der Expression eines Fusionsproteins resultiert, wird von Iwai et al., Chem. Pharm. Bull. 34:4724 (1986), beschrieben.
- Der Einsatz rekombinanter Verfahren zur Produktion von Polypeptiden in viral infizierten Insektenzelen wird in EP-A-228036 beschrieben. Unter Verwendung des Baculovirus-Expressionssystems wird ein Verfahren zur Produktion des Proteins, Hepatitis B Oberflächenantigen, angegeben. Die Verwendung von gemischten polyednschen Einschlußkörpern (PIB), die eine Mischung von Nukleokapsiden von mindestens zwei genetisch verschiedenen Baculoviren enthalten, von denen einer das interessierende heterologe Gen enthält, wird in WO 88/02030 beschrieben. Unter Verwendung der beschriebenen Koinfektionstechnik wird ein heterologes Protein exprimiert.
- Obwohl die Expression dieser großen Säugerproteine möglich ist, lag bis zur vorliegenden Erfindung wenig Information über die erfolgreiche Expression kleiner Moleküle wie hNGF unter Verwendung eines Baculovirus-Expressionssystems vor. Es war auch fraglich, ob dieses spezielle Expressionssystem geeignet sein würde zur Produktion kleiner Proteine, welche eine post-translationale proteolytische Spaltung des Proteinvorläufers erfordern, um biologische Aktivität aufzuweisen.
- Wir haben nun unerwarteterweise festgestellt, daß hNGF unter Verwendung eines Baculovirus-Insektenzellen-Expressionssystems erfolgreich in guten Ausbeuten exprimiert werden kann.
- Die vorliegende Erfindung beschreibt die Konstruktion von Expressionsvektoren, geeignet zur Verwendung in einem Baculovirus-System, das imstande ist, hNGF in biologisch aktiver Form zu exprimieren. Die Produktion ausreichender Mengen an hNGF durch rekombinante DNA-Technologie gemäß dieser Erfindung macht es möglich, die potentielle Nützlichkeit von NGF bei der Behandlung der Alzheimer-Krankheit (AK) festzustellen.
- In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen Baculovirus- Transfervektor wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7 definiert, der das Gen für Human-Nervenwachstumsfaktor (hNGF) in der richtigen Orientierung verknüpft mit regulatorischen Elementen aufweist, die in Insektenzellen funktionell sind; d.h. die Leader-Sequenz und der Promotor eines Baculovirus-Polyhedrin-Gens.
- In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden Insektenzellen beschrieben, die mit dem Baculovirus-Transfervektor infiziert sind.
- In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Produktion von biologisch aktivem hNGF in Insektenzellen. Das Verfahren umfaßt die Konstruktion eines Transfervektors wie oben definiert, die Inkorporation des Transfervektors in einen Baculovirus und die Infektion von Insektenzellen mit dem erhaltenen rekombinanten Baculovirus. Die infizierten Zellen werden gezüchtet, vorzugsweise in serumarmem oder serumfreiem Medium, und der biologisch aktive hNGF wird aus dem verbrauchten Kulturmedium gewonnen.
- In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird rekombinanter biologisch aktiver hNGF bereitgestellt, der durch ein Baculovirus-Expressionssystem erhältlich ist und frei von Verunreinigungen, die üblicherweise mit hNGF aus natürlichen Quellen assoziiert sind.
- In einer noch weiteren Ausführungsform der Erfindung wird der biologisch aktive hNGF hergestellt als pharmazeutische Zusammensetzung, z.B. zur Verwendung bei der Behandlung von neurologischen Erkrankungen wie Alzheimer- Krankheit.
- Figur 1: Aminosäuresequenz der reifen β-Untereinheit von hNGF
- Figur 2: Konstruktion von pAc373mhNGF-Plasmiden
- Figur 3: Konstruktion von pAcYMhNGF-Plasmiden
- Figur 4: Silberfärbung und Western-Blot-Analyse von hNGF, der aus Virusinfizierten Zellüberständen gereinigt wurde
- Figur 5: PC&sub1;&sub2;-Zellen, behandelt mit Kulturflüssigkeit von mit rekombinantem pAcY2MhNGF-Baculovirus infizierten Zellen
- Figur 6: Eintrittsgeschwindigkeit, wie nachgewiesen durch Neuritenauswuchs
- Figur 7: Biologische Aktivität, die dem durch Baculovirus produzierten hNGF zugeschrieben wird
- Figur 8: Verringerung der Beeinträchtigung von Erinnerungs- und kognitivem Vermögen bei Ratten mit verabreichtem hNGF
- Biologisch aktiver hNGF kann in einem Baculovirus-System exprimiert werden durch Konstruktion eines chimären Gens, bestehend aus dem Gen für Präpro-hNGF in Verknüpfung mit dem Polyhedrin-Promotor und der Leader-Sequenz von Baculovirus-DNA. Beispiele von Plasmiden, welche den Promotor und die Leader Sequenz für Baculovirus-DNA tragen, umfassen pAcYM1 (Bishop, D.H., J. of Gen. Virol. 68:1233 (1987)), pAC101 (U.S. Patent 4,745,501), pAc373 (Smith, G.E., Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 82:8404 (1985)) und pEV51 (Rice, W.C., J. Virol. 61:1712 (1987)). In der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das hNGF-Gen in das Plasmid pAcYM1 inseriert.
- Die kodierende Sequenz für hNGF ist aus mehreren Quellen erhältlich, z.B. durch Synthese des Gens unter Heranziehung der bekannten DNA-Sequenz oder durch Einsatz von Standard-Klonierungstechniken, die Fachleuten bekannt sind. cDNA-Klone, welche die für hNGF kodierende Sequenz tragen, können durch Einsatz von Oligonukleotid-Hybridisierungssonden identifiziert werden, die auf Grundlage der bekannten Sequenz von hNGF spezifisch konstruiert wurden.
- Nach Erhalt der für hNGF kodierenden Sequenz wird die Sequenz in einen Baculovirus-Klonierungsvektor inseriert, z.B. pAcYM1. Der Klonierungsvektor ist so konstruiert, daß er die geeigneten regulatorischen Funktionen bereitstellt, welche für die effiziente Transkription, Transation und Prozessierung der kodierenden Sequenz erforderlich sind.
- In einem Aspekt der Erfindung umfassen die rekombinanten DNA-Moleküle, welche hNGF in S. frugiperda-Zellen produzieren, die kodierende DNA-Sequenz für den hNGF-Vorläufer in einen Baculovirus-Transfervektor inseriert. Transfervektor bedeutet ein Plasmid, in welches das fremde Gen von Interesse stromabwärts des Polyhedrin-Promotors inseriert werden kann. Darüber hinaus enthält der (7) Transfervektor ausreichende Anteile der Polyhedrin-Gensequenz, um die homologe Rekombination mit dem Wildtyp-Baculovirus-Genom zu ermöglichen, so daß der Produkt-Virus nun die interessierende fremde Gensequenz unter der Kontrolle des viralen Polyhedrin-Promotors enthält.
- Durch Verwendung des Baculovirus-Promotors wird der Vorläufer des reifen hNGF exprimiert und anschließend zu reifem hNGF prozessiert. Der reife hNGF wird dann aus Zellen, die mit dem rekombinanten Virus infiziert sind, ausgeschieden.
- In der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Baculovirus, der bei der genannten homologen Rekombination eingesetzt wird, Autographa californica, bezeichnet als AcNPV. Andere Baculovirus-Systeme umfassen beispielsweise Insektenviren, die aus Bombyx mon und Heliothis zea isoliert wurden, und dgl., allgemeiner die in der europäischen Patentveröffentlichung 0228036 angegebenen. Das speziell eingesetzte Baculovirus-System wird von der durchzuführenden Art der genetischen Manipulation bestimmt.
- Das Gen für hNGF wird so in den Baculovirus-Transfervektor inseriert, daß eines der Methionin-Initiationscodons zur Verfügung steht. Das hNGF-Gen wie bisher beschrieben (Ullrich et al., Coid Spring Harbor Symposia on Quant. Biol. XLVIII, S. 435 (1983)) besitzt Methionine an den Positionen -121 und -119, welche wahrscheinlich als translationale Initiationscodons eingesetzt werden (Position 1 bezieht sich auf den N-terminalen Serinrest von reifem hNGF, siehe Fig. 1). Im Gegensatz dazu besitzt die cDNA für Maus-Unterkieferdrüsen-NGF, der am eingehendsten untersuchte Nervenwachstumsfaktor, ein Methionin an Position -187 neben denjenigen an den Positionen -121 und -119. Es ist weder beim Menschen noch bei der Maus klar, welche der Codons als translationales Initiationscodon dienen.
- Studien mit MRNA, die der Maus-cDNA entspricht, zeigen, daß die in vitro- Transation mit einem Weizenkeimextrakt die Translation bei Methionin -187 initiieren kann (Edwards et al., J. Biol. Chem. 263:6810 (1988)). Mit dieser Beobachtung stimmt überein, daß ein NGF-Vorläufer aus Maus-Unterkieferdrüsen isoliert wurde (Saboori und Young, Biochemistry 25:5565 (1986)), der anzeigt, daß in der Unterkieferdrüse die Initiation der Translation bei Methionin -187 stattfinden kann. Es wurde jedoch ebenfalls gezeigt, daß mindestens drei verschiedene Spezies von NGF-mRNA in der Maus gebildet werden (Selby et al., Mol. and Cellular Biol. 7:3057 (1987)). Diese Diversität wird alternativem Splicing zugeschrieben und/oder unabhängiger Initiation von alternativen Promotoren. Nachdem einigen der alternativen Maus-NGF-mRNAs das Methionincodon bei -187 fehlt, wurde geschlossen, daß die Translation auch an Methionin -121 oder -119 beginnen kann (Selby et al., supra).
- Im Gegensatz zum Maus-NGF-Gen wurde die Human-NGF-Genstruktur nicht im selben Ausmaß charakterisiert. Es ist jedoch gleichermaßen unklar, welches der Methionincodons für die translationale Initiation verwendet wird. Wir haben nun festgestellt (wie in Beispiel 3 illustriert), daß die Transtionsinitiation im Baculovirus- Expressionssystem am effizientesten bei Methionin -121 [bezeichnet als 2-MET- Position] stattfindet, während die Initiation an Methionin -119 [bezeichnet als 1-MET- Position] ineffizient, falls überhaupt, stattfindet.
- Es wurde auch festgestellt, daß die korrekte Expression und Sekretion von biologisch aktivem hNGF unter Verwendung des Baculovirus-Expressionssystems dieser Erfindung die Anwesenheit der Pro-NGF-Sequenz erfordert. Versuche zur Deletion der Pro-Sequenz, d.h. Splicen der (Prä-)Signalsequenz direkt an die reife NGF-Sequenz, resultierten nicht in einer hNGF-Sekretion.
- Bei der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Gen für hNGF in einen Transfervektor inseriert, um ein chimäres Gen zu bilden. Durch Kotransfektion von Zellen mit dem Transfervektor, der das fremde Gen von Interesse enthält, und genomischer Wildtyp-Baculovirus-DNA resultiert eine homologe Rekombination zwischen der Virus-DNA und dem Transfervektor in einem rekombinanten Genom, welches das chimäre NGF-Gen in das Baculovirus- Polyhedringen inseriert enthält. Viren, die das rekombinante Genom enthalten, werden durch Plaque-Reinigung kloniert und als Expressionsvektor verwendet. Insektenzellen, die mit dem Expressionsvektor infiziert sind, werden in serumarmem oder serumfreiem Medium gezüchtet und hNGF aus den verbrauchten Kulturmedien gewonnen.
- Konkreter werden die Transfervektoren, welche das hNGF-Gen inkorporiert haben, konstruiert durch Modifizierung des Plasmids, welches das hNGF-Gen trägt. Das Plasmid wird so modifiziert, daß es sowohl stromaufwärts als auch stromabwärts der für hNGF kodierenden Sequenz eine günstige Restriktionsstelle inkorporiert hat. Die Modifizierung wird erzielt durch die Verwendung synthetischer Adapter. Beispielsweise werden zwei Oligonukleotid-Adapter mit den gewünschten Restriktionsstellen synthetisiert. Der erste Adapter: 5' GGGGATCCAAATATGTCCATGTTGTTCTACACTCT 3' und 5' GATCAGAGTGTAGMCMCATGGACATATTTGGATCCCC 3' besitzt die BamH I- Spaltungsstelle unmittelbar stromaufwärts des ersten von zwei möglichen lnitiationscodons [die 2-MET-Position, Position -121, siehe Fig. 1]. Dagegen plaziert der zweite Adapter: 5' GGGGATCCAAATATGTTGTTCTACACTCT 3' und 5' GATCAGAGTGTAGMCMCATATTTGGATCCCC 3' die Restriktionsstelle neben das zweite Methionincodon [die 1-MET-Position, Position -119, siehe Fig. 1]. Ferner werden synthetische Linker, z.B. 5' pCAGATCTG stromabwärts des hNGF- Gens inseriert, um eine günstige Restriktionsstelle zu inkorporieren.
- In einem weiteren Beispiel kann ein Plasmid, welches das hNGF-Gen trägt, unmittelbar stromabwärts des Baculovirus-Polyhedringen-Promotors inseriert werden, wodurch der Baculovirus-Polyhedrin-Promotor zur Transkriptionsinitiierung genutzt wird.
- Neben den oben genannten Methoden, welche das Methionin- Initiationscodon bereitstellen, ist es auch möglich, ein hybrides oder chimäres Gen zu konstruieren, worin die Präpro-Anteile des NGF-Gens diejenigen der cDNA der Maus-Unterkieferdrüse sind, während der Anteil des NGF, der für reifen NGF kodiert, die Human-NGF-Gensequenz ist (Figur 1). Ein solches hybrides oder chimäres Gen ermöglicht potentiell die Inituerung der Translation an dem Methionin -187, das in der Maus-Präpro-NGF-Gruppierung vorhanden ist, führt jedoch zur Expression von reifem hNGF. Es wurde gezeigt, daß ein solches chimäres Gen korrekt gefaltet oder post-translational prozessiert wird. Unter Verwendung des Baculovirus- Expressionssystems ergab ein solches chimäres Gen biologisch aktiven hNGF.
- Unter Verwendung der oben genannten synthetischen Adapter werden die resultierenden Transfervektoren so konstruiert, daß das Gen für hNGF neben einem der beiden zur Verfügung stehenden Methionin-(Met)-Startcodons lokalisiert ist. Die modifizierte Sequenz von hNGF wird mit einem geeigneten Baculovirus- Transfervektor, z.B. pAcYM1, kombiniert, um das hNGF-Gen in der richtigen Orientierung zu inserieren. Das resultierende Plasmid enthält einen Baculovirus- Promotor in enger Nachbarschaft zu einem der möglichen NGF-Methionin- Initiationscodons.
- Die so konstruierten rekombinanten Baculovirus-Transfervektoren werden selektioniert durch beispielsweise Screening auf Restriktionsenzym-Spaltungsstellen oder durch DNA-Sequenzierungstechniken, die im Stand der Technik bekannt sind.
- Ebenso wie die in den Beispielen erläuterten speziellen Vektoren sind auch Derivate dieser speziellen Vektoren konkret umfaßt. Derivate werden Vektoren einschließen, welche Modifikationen enthalten, die ihre Schlüsselrolle der Bereitstellung des hNGF-Gens in exprimierbarer Form nicht signifikant beeinflussen, z.B. Modifikationen in Restriktionsenzymstellen.
- Nach der Selektion der hNGF-Transferplasmide kann das Plasmid, welches das chimäre hNGF-Gen enthält, zusammen mit der Baculovirus-DNA in eine geeignete Insektenwirtszelle kotransfiziert werden. Eine solche Wirtszelle kann beispielsweise S. frugiperda (geeignete Zellinie Sf9, ATCC Nr. CRL 1711), A. californica, Heliothis zea-Larven und dgl. sein. Die Transfektion wird nach Standard-techniken durchgeführt. Solche Techniken umfassen beispielsweise virale Transfektion, DEAE-Dextran-induzierte Pinozytose, Calciumphosphat-Fällung und seit kurzem Lipofektion. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Transfektion mit einer Lipofektionstechnik durchgeführt wie von Felgner, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:7413 (1987) beschrieben.
- Nach der Transfektion werden die Zellen in Kulturmedien gezüchtet. Geeigneterweise nach 3 oder 4 Tagen wird der verbrauchte Überstand gewonnen und auf konfluenten Monoschichten von Wirtszellen plaquiert. Okklusions-negative Plaques, welche rekombinante Viren anzeigen, werden gepickt und weiter plaquegereinigt.
- Zur Expression werden dann geeignete Insektenwirtszellen, vorzugsweise die Sf9-Zellen, mit dem rekombinanten Virus bei geeigneterweise 0,01 bis 10 Plaquebildenden Einheiten/Zelle infiziert und anschließend auf vorzugsweise serumarmen oder serumfreien Medien gezüchtet. Kulturflüssigkeit wird geeigneterweise nach 3 bis 7 Tagen gewonnen und Standard-Identifizierungsassays, z.B. Immunoassays wie ELISA und Western-Blot-Analyse oder biologische Assays wie PC&sub1;&sub2;- Zelldifferenzierung (Greene, L.A., Trends Neurosci 7:91 (1986)) durchgeführt.
- Um die proteolytische Prozessierung des Präpro-NGF-Vorläufers zu erhöhen, können die oben beschriebenen Verfahren durch die Koinfektion der Wirtszelle mit anderen rekombinanten Viren verbessert werden. Beispielsweise kann die proteolytische Prozessierung des Präpro-hNGF in S. frugiperda erhöht werden durch Komfektion der S. frugiperda-Zellen mit rekombinanten Viren, welche die Gene für die β-Untereinheit von hNGF und die Gamma-Untereinheit von mNGF enthalten. Ebenfalls geeignet ist die Koinfektion mit rekombinanten Viren, welche die β- Untereinheit von hNGF und die Hefe-KEX 2-Gene enthalten, oder rekombinanten Viren, welche die Gene für die β-Untereinheit von hNGF und eine Human-Kallikrein- Protease enthalten.
- Der hNGF der Erfindung kann aus den verbrauchten Kulturmedien weiter gereinigt werden. Standard-Proteinreinigungstechniken, z.B. Ionenaustauschchromatographie, Umkehrphasenchromatographie, Affinitätschromatographie, Größenausschlußchromatographie, isoelektrische Fokussierung und dgl. können eingesetzt werden.
- Zur Verwendung als Therapeutikum kann hNGF weiter gereinigt werden, um pharmazeutisch reines hNGF zu erhalten. Eine pharmazeutische Formulierung würde derart sein, daß eine Dosierungseinheit von hNGF eine effektive Menge an hNGF in einem geeigneten pharmazeutischen Träger umfassen würde, um bei der Behandlung der Alzheimer-Krankheit (AK) und anderen neurologischen Störungen wirksam zu sein.
- Die Pathologie von AK, der häufigsten Form von Demenz, ist komplex und betrifft viele neuronale Systeme. Der am meisten konsistente neuro-pathologische Befund bei AK-Gehirnen ist ein ausgeprägter Verlust an zentralen cholinergen Neuronen (Hyman et al., Science 225:1168-1170 (1984); Pearson et al., Brain Research 2:395 (1983), Whitehouse et al., Science 215:1234 (1982)). Dieser Verlust steht in Beziehung zur Schwere der Demenz (Perry et al., British Med. Journal 2:1457 (1987)) und korreliert quantitativ mit der Anzahl neuritischer Plaques. Das Defizit an cholinergen Neuronen scheint auf Neuronen beschränkt zu sein, welche die aufsteigenden Bahnen der Basalganglien des Vorderhirns (mittleres Septum und Nucleus basalis) bilden, welche axonale Projektionen zum Hippocampus und Cortex verlängern. Diese beiden Regionen sind besonders wichtig für die kognitive Funktion (Mann et al., J. Neural. Neurosurg. Psychiatry 49:310 (1986)). Der Verlust dieser Neuronen resultiert in einer ausgeprägten zerebralen Atrophie sowohl im Cortex als auch im Hippocampus und wird als hauptsächlich zu den Defiziten des Erinnerungsvermögens, die für AK charakteristisch sind, beitragender Umstand angesehen.
- Verschiedene Verfahren zur Behandlung von AK auf Grundlage dieser neurochemischen Defizite kamen zur Anwendung; gegenwärtig am erfolgversprechendsten ist orales physostigmin, ein Acetylcholinesterase-Inhibitor. Es ist gezeigt worden, daß die intravenöse Verabreichung von physostigmin die kognitive Funktion bei einigen AK-Patienten verbessert (Mohs et al., Am. J. Psychiatry 142:28 (1985), Davis et al., New England J. Med. 308:721(1983); Christie et al., Br. J. Psychiatry 138:46 (1981)), obwohl dessen klinische Anwendbarkeit durch seine kurze Halbwertszeit beschränkt ist. Der Einsatz neurotropher Faktoren, insbesondere Nervenwachstumsfaktor (NGF), um sowohl die Degeneration cholinerger Neuronen zu verhindern als auch die neuronale Regeneration zu erhöhen (Hefti, Ann. Neurol. L3:109 (1983)), wurde kürzlich als neuer Weg zur AK- Behandlung vorgeschlagen. Siehe auch Hefti, Ann. Neurol. 20:275 (1986).
- NGF wurde ursprunglich die Rolle der Regulation der Entwicklung und Aufrechterhaltung spezifischer Funktionen der peripheren sympathischen und der von der Neuralleiste abgeleiteten sensiblen Neuronen eines Wirbeltieres zugeschrieben (Lev-Montalcini und Angeleti, Physiol. Rev. 48:534 (1986)). In jüngerer Zeit wurde auch anerkannt, daß NGF eine trophische Rolle für aufsteigende cholinerge Neuronen im basalen Vorderhirn spielt.
- NGF und dessen RNA-Transkripte und Rezeptoren sind in großen Mengen in den Gebieten des Hippocampus und Cortex vorhanden, die von diesen cholinergen Vorderhirn-Neuronen innerviert sind (Korching et al., EMBO J. 4:1389 (1985); Riopelle et al., Proc. Soc. Neurosci 11:1056 (1985); Raivich et al., Neurosci. 20:23 (1986), Shelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2714 (1986)). Die Stimulierung von NGF-Rezeptoren auf cholinergen Neuronen resultiert in einer Erhöhung der Cholin-Acetyltransferase (ChAT)-Aktivität im Striatum und den Vorderhirn- Basalganglien (Mobley et al., Mol. Brain Res. 387:53 (1986); Science 229:284 (1985)).
- Vielleicht die überzeugendsten Beweisanzeichen dafür, daß NGF eine trophische Rolle für die Neuronen des basalen Vorderhirns spielt, sind: (a) nach Läsionen der septo-hippocampalen Bahn bei der Ratte findet eine dramatische Erhöhung des endogenen NGF statt (Gasser et al., Brain Res. 376: 351 (1986)) und (b) NGF fördert das Überleben von cholinergen Septum-Neuronen und eliminiert die kognitive Beeinträchtigung nach einer Fimbriendurchtrennung (Gage et al., J. Comp. Neurol. 269:147 (1986); Hefti, J. Neurosci. 6:2155 (1986); Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9231 (1986)). Von diesen Beobachtungen ausgehend, ist es möglich, daß der bei AK beobachtete Verlust an cholinergen Neuronen eine Folge des Unvermögens des Zielgewebes des Gehirns ist, ausreichende Mengen an NGF zu synthetisieren, um diese Neuronen aufrechtzuerhalten. Alternativ kann er eine Anomalität bei der Reaktion der cholinergen Neuronen auf NGF reflektieren, d.h. eine Rezeptor-Anomalität. Selbst wenn abweichende NGF-Reaktionen nicht an der Pathologie von AK beteiligt sind, könnte NGF immer noch nützlich sein zur Verlangsamung oder Verhinderung des Abbaus von cholinergen Neuronen und/oder Erhöhung von ChAT-Aktivität bei den verbleibenden Neuronen.
- Eine effektive pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von AK kann je nach der spezifischen Endanwendung auf irgendeinem von einer Vielfalt von Wegen verabreicht werden. Die geeigneteste Route wird von der Anwendung und der betroffenen Person abhängen.
- Die exakte Dosierung und der Zeitplan für die Verabreichung wird von den Bedürfnissen des behandelten Individuums und dem Grad der Beschwerden abhängen. Die Verfahren zur Formulierung von Proteinen, um eine wirksame pharmazeutische Zusammensetzung zu erzielen, sind Fachleuten bekannt.
- Geeigneterweise wird die Zusammensetzung eine sterile Lösung sein. Geeigneterweise wird sie durch kontinuierliche Infusion intraventrikulär mit Hilfe einer Kanüle in das Gehirn verabreicht. Die Kanüle kann geeigneterweise mit einer Minipumpe verbunden sein. Solche Minipumpen können unter die Haut inseriert werden und ein beträchtliches Wirkstoffreservoir (ausreichend für Wochen oder sogar Monate) enthalten. Die Therapie wird geeigneterweise für einen längeren Zeitraum von Wochen oder Monaten stattfinden. Geeignete Dosierungsraten liegen voraussichtlich im Bereich von 0,1 bis 100 ug hNGF pro Tag in das Gehirn, geeigneter 2,5 bis 5 ug pro Tag. Voraussichtlich könnte die Zusammensetzung alternativ in das Rückenmark verabreicht werden. Bei diesem Verabreichungsweg würden wahrscheinlich größere Dosen erforderlich sein.
- Die Erfindung ist insbesondere vorteilhaft zur Bereitstellung großer hNGF- Mengen, um eine genaue Untersuchung seiner Eigenschaften zu erlauben. Die Ausbeuten liegen geeigneterweise in der Größenordnung von bis zu 5 ug/ml, vorzugsweise bis zu 10 ug/ml, Kulturflüssigkeit.
- Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung und sollen die Erfindung nicht beschränken. Soweit nicht anders angegeben, wurden alle Enzyme, die bei den genetischen Manipulationen eingesetzt wurden, aus kommerziellen Quellen bezogen und im wesentlichen nach den Anweisungen des Herstellers eingesetzt. Klonierungsverfahren erfolgten im wesentlichen wie von Maniatis et al., Molecular Cloning, Coid Spring Harbor Laboratory, 1982, beschrieben, soweit sie nicht hier speziell beschrieben wurden.
- Eine genomische Human-Leukozytenbank (Konstruktion unter Verwendung des Klonierungsvektors: Lambda EMBL-3) wurde von Clontech Laboratories, Inc. (Pab Alto, CA) bezogen. Etwa 1,5 x 106 PFU der rekombinanten phagen wurden eingesetzt, um E. coli-LE392-Zellen zu infizieren (Silhavy, T.J., Experiments with Gene Fusion, Cold Spring Harbor Laboratory, S. xi-xii, (1984)] bei einer Infektionsmultiplizität von 0,01. Nach 20-minütiger Absorption bei 37ºC wurden die infizierten Zellen mit 0,7%igem Softagar verdünnt und auf 12 Platten mit frischer Luria Bouillon (LB) (150 mm) ausplattiert. Nach 6 Stunden bei 37ºC wurden die Platten aus dem Inkubator entnommen und über Nacht gekühlt. Auf die Phagenrasen wurden dann nacheinander zwei Stücke Nitrocellulosefilter (8BA85120 0,45 mm, Schleicher und Schuell) gelegt. Die Nitrocellulosefilter wurden dann alkalisch denaturiert (15 Minuten mit 0,5 M NaOH, 1,5 M NACl), neutralisiert (15 Minuten bei 0,5 M Tris-HCl, pH 8,0 und 1,5 M NACl), gewaschen (15 Minuten mit 6 x SSC (Salzlösung, Natriumcitrat) und 2 Stunden lang bei 80ºC gebacken. Vor der Hybridisierung wurden die Filter mit Vorhybridisierungslösung (6 x SSC, 0,1 % SDS, 5 x Denhardt's-Lösung, 1 mM EDTA, 100 mu/ml Lachssperma-D NA, 100 mu/ml Hefe-TRNA und 0,05% Na-Pyrophosphat) 16 Stunden lang bei 65ºC behandelt. ³²P- markierte (durch Nick-Translation, spezifische Aktivität 3 x 10&sup8; CpM/ug) Maus-β- NGF-cDNA (Gabe von Dr. W. Rutter, Nature 302:538 (1983)) wurde dann den Nitrocellulosefiltern zugegeben und die Hybridisierung (6 x SSC, 0,1% SDS, 2% Magermilch, 1 mM EDTA, 0,05% Na-Pyrophosphat, 100 ug/ml Dextransulfat) 16 Stunden lang bei 65ºC durchgeführt. Die Filter wurden dann zweimal mit 2 x SSC, 0,1% SDS und einmal mit 0,6 x SSC, 0,1% SDS (jewells 10 Minuten) gewaschen. Die Filter wurden luftgetrocknet und bei -70ºC damit Röntgenfilme belichtet.
- Phagen-Plaques, die positive Hybridisierungssignale ergaben, wurden gepickt und zwei weiteren Durchgängen von Subkionierung und Hybridisierung unterworfen. Bei dem dritten Hybridisierungsdurchgang wurde ein endmarkiertes synthetisches Oligonukleotid (28-mer), das zu dem Human-NGF-Gen komplementär war (5' GAGGTGAACATTAACAACAGTGTATTCA 3') ebenfalls als Hybridisierungssonde eingesetzt. Aus den positiven phagen präparierte DNAs wurden charakterisiert durch Restriktionsenzymverdauungen und Southern-Blot-Analyse, entweder unter Verwendung von nicktranslatierter Maus-β-NGF-cDNA oder des vorgenannten synthetischen Oligonukleotids als Sonden. phagen, welche hybridisierende Fragmente der vorausgesagten Größen (d.h. 1,8, 5,7 und 4,4 kb für die Bgl II-, Eco RI- bzw. Hind III-Fragmente) ergaben, wurden ausgewählt. Das 1,8-kb-Bgl 11- Fragment, welches die vollständige kodierende Sequenz für die Präpro-Human-β- NGF-Untereinheit enthält, wurde aus der phagen-DNA ausgeschnitten und in einen pUC8 (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Maryland, USA)- Plasmidvektor (über dessen kompatible BamH I-Stelle) eingeführt. Das Produkt-- Plasmid wurde als phNGF#5 bezeichnet.
- Die Konstruktion von pAC373mhNGF war ein mehrstufiges Verfahren (Figur 2). Kurz gesagt, beinhaltete die Konstruktion den anfänglichen Zusammenbau eines chimären NGF-Gens in dem Vektor pUC 8, wobei das 5'-Ende der NGF-Chimäre aus einer cDNA des Maus-Unterkieferdrüsen-NGF bestand und das 3'-Ende der NGF- Chimäre aus einem Fragment genomischer Human-DNA, kodierend für die reife Sequenz von Human-NGF, bestand.
- Das Baculovirus-Transfektionsplasmid pAC373 (Smith, G.E., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 8404 (1985)), welches eine nur einmal vorkommende BamH I-Stelle unmittelbar stromabwärts des Polyhedringen-Promotors und eine nur einmal vorkommende Kpn I-Stelle innerhalb eines Abschnitts des Polyhedrin-Strukturgens aufweist, wurde zur Aufnahme der NGF-Chimäre durch Ligierung eines Adapters in die Bam HI- und Kpn I-Restriktionsstellen modifiziert; der Adapter enthielt nur einmal vorkommende Sma I- und Pst I-Restriktionsstellen. Das chimäre Maus/Human-NGF- Gen wurde dann aus dem pUC8-Vektor als Sma I - Pst I-Fragment ausgeschnitten und in den modifizierten pAc373-Vektor über die Sma I- und Pst I-Restriktionsstellen inseriert.
- Ein Plasmid mit der Bezeichnung pmNGF wurde von Dr. Eric Shooter, Dept. of Neurobiology, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA 94305, erhalten. Das Plasmid pmNGF besteht aus dem 961-Basenpaar-Sma I - Pst I- Fragment der cDNA der Maus-Unterkieferdrüse, welche für den Maus-NGF-Vorläufer (Präpro-Maus-NGF), beschrieben von Scott et al., Nature 302:538 (1983), kodiert, das über die Sma I- und Pst I-Restriktionsstellen in den Vektor pGEM 1 (Promega, Middleton, Wisconsin, USA) subkloniert wurde.
- Zehn Mikrogramm pmNGF wurden mit der Restriktionsendonuklease Eco RI (Bethesda Research Laboratories) unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen verdaut. Die mit Eco RI gespaltene DNA wurde anschließend mit Pst I (Bethesda Research Laboratories) nach den Empfehlungen des Herstellers gespalten. Die verdauten DNA-Fragmente wurden durch Elektrophorese auf einem 0,7%igen Agarosegel aufgetrennt und das Fragment von etwa 1000 Basenpaaren mit dem DEAE-Nitrocellulose-Verfahren von Dretzen et al., Anal. Biochem. 112:295 (1981) aus dem Gel gewonnen. Etwa 0,5 Mikrogramm des gewonnen Eco RI - Pst I- Fragments wurden weiter mit der Restriktionsendonuklease Xho II (New England Biolabs, Waltham, Mass., USA) unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen verdaut. Die verdaute DNA wurde mit Phenol extrahiert, ethanolgefällt, getrocknet und in sterilem destilliertem Wasser mit einer Konzentration von 50 Nanogramm pro Mikroliter suspendiert.
- Ein halbes Mikrogramm des Plasmids pUC8 wurde mit BamH I (Bethesda Research Laboratories) unter den vom Hersteller vorgeschlagenen Bedingungen verdaut. Die mit BamH I gespaltene DNA wurde weiter mit der Restriktionsendonuklease Eco RI gespalten. Die gespaltene DNA wurde mit Phenol extrahiert und ethanolgefällt. Das mit Xho II gespaltene Eco RI - Pst I-Fragment von pmNGF wurde mit dem mit BamH I und Eco RI gespaltenen pUC8 in einer Reaktionsmischung von 25 Mikrolitern ligiert, die 125 Nanogramm mit Eco RI und BamH I gespaltenes pUC8, etwa 125 Nanogramm mit Xho II gespaltenes Eco RI - Pst I- Fragment von pmNGF, 1,25 Mikromol Tris-HCl, pH 7,8, 0,25 Mikromol MgCl&sub2;, 0,50 Mikromol reduziertes Dithiothreit, 2,5 Nanomol ATP und 1 Einheit T4 DNA-Ligase (Bethesda Research Laboratories) enthielt. Die Reaktionsmischung wurde 16 Stunden lang bei 15ºC inkubiert.
- Die Ligierungsmischung wurde in kompetente E. coli TG 1-Wirtszellen (Taylor, J.W., Nucl. Acids Res.. 13:8749 (1985)) transformiert und auf L-Agarplatten (10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 10 g NACl, 15 g Bacto-Agar pro Liter), die 50 Mikrogramm pro ml Ampicillin, 50 Mikrogramm pro ml 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D- galactopyranosid upd 0,05 Mikromol pro ml Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid enthielten, ausplattiert. Nach dem Wachstum über Nacht bei 37ºC wurden zwölf farblose Kolonien willkürlich gepickt und mit jeder 1,5 ml L-Bouillon, enthaltend 50 Mikrogramm pro ml Ampicillin, beimpft. Nach 5 Stunden Wachstum bei 37ºC auf einer Schüttelplattform wurde Mini-Lysat-DNA aus jeder Kultur nach dem Verfahren von Birnboim und Doly, Nucleic Acids Research 7:1513 (1979) präpariert. Nach der Spaltung mit Eco RI und BamH I ergaben vier dieser Mini-Lysat-Plasmid-DNA- Präparationen das erwartete Fragment von etwa 580 Basenpaaren (das durch Xho II erzeugte DNA-Ende besitzt in diesem Fall eine solche Sequenz, daß bei Ligierung mit einem durch BamH I erzeugten DNA-Ende die BamH I-Stelle regeneriert wird). Eines dieser Plasmide mit der Bezeichnung pmNGF#2 wurde für die weitere Konstruktion verwendet.
- Um ein Xho II-Fragment von genomischer Human-DNA, das für den reifen Anteil von hNGF kodiert, in die BamH I-Stelle von pmNGF#2 einzuführen, wurde der Vektor pmNGF#2 mit BamH I gespalten und mit alkalischer phosphatase behandelt, um eine Selbstligierung zu verhindern. Ein Mikrogramm pmNGF#2 wurde mit der Restriktionsendonuklease BamH I verdaut. Die gespaltene DNA wurde mit Phenol extrahiert und ethanolgefällt. Das getrocknete DNA-Pellet wurde dann in 10 Mikroliter sterilem destilliertem Wasser resuspendiert. Die mit BamH I gespaltene PMNGF#2-DNA wurde dann mit alkalischer phosphatase in einer 21-Mikroliter- Reaktionsmischung, die 1 Mikrogramm mit BamH I gespaltenes pmNGF#2, 0,315 Mikromol Natriumborat, pH 10,4, und eine Einheit alkalischer Kalbsdarm- Phosphatase (Sigma Chemicals) enthielt, durch Inkubation bei 37ºC für 1 Stunde behandelt. Nach einer Stunde wurde EDTA, pH 8,0, bis zu einer Endkonzentration von 5 Millimolar zugegeben und die Mischung bei 68ºC 15 Minuten lang inkubiert. Die Mischung wurde dann mit Phenol extrahiert, ethanolgefällt, getrocknet und in sterilem destilliertem Wasser erneut suspendiert.
- Zehn Mikrogramm phNGF#5 (beschrieben in Beispiel 1) wurden mit der Restriktionsendonuklease Xho II (New England Biolabs) unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen verdaut. Anschließend wurde die mit Xho II verdaute phNGF#5-DNA mit Pvu II (Bethesda Research Laboratories) nach den Empfehlungen des Herstellers verdaut. Das Xho II-Fragment, das aus dem pUC8- Vektoranteil des Plasmids stammte, besaß etwa dieselbe Größe wie das gewünschte, von genomischer hNGF-DNA stammende, 1004-Basenpaar-Xho II- Fragment. Das von pUC8-stammende Fragment enthielt eine Pvu II-Stelle und war deshalb im Vergleich zu dem von genomischer hNGF-DNA stammenden Fragment, welches keine Pvu II-Stelle enthielt, in der Größe reduziert. Die verdauten DNA- Fragmente wurden durch Elektrophorese auf einem 0,7%igen Agarosegel aufgetrennt und das Fragment von etwa 1000 Basenpaaren mit dem DEAE- Nitrocelluloseverfahren von Dretzen et al., Anal. Biochem. 112:295 (1981) aus dem Gel gewonnen.
- Das gewonnene 1000-Basenpaar-Xho II-Fragment genomischer hNGF-DNA wurde mit dem mit BamH I und alkalischer phosphatase behandelten pmNGF#2 in einer 20-Mikroliter-Reaktionsmischung ligiert, die 120 Nanogramm mit BamH I gespaltenes und mit alkalischer phosphatase behandeltes pmNGF#2, 250 Nanogramm des 1000-Basenpaar-Xho II-Fragments genomischer hNGF-DNA, 1 Mikromol Tris-HCl, pH 7,8, 0,20 Mikromol MgCl&sub2;, 0,40 Mikromol reduziertes Dithiothreit, 2 Nanomol ATP und 1 Einheit T4-DNA-Ligase enthielt. Die Reaktionsmischung wurde 16 Stunden lang bei 15ºC inkubiert.
- Die 20-Mikroliter-Ligierungsmischung wurde in kompetente E. coli TG 1- Wirtszellen transformiert und auf L-Agarplatten ausplattiert, die 50 Mikrogramm pro ml Ampicillin enthielten. Nach Wachstum über Nacht bei 37ºC wurden 170 isolierte, willkürlich ausgewählte Kolonien einzeln auf Nitrocellulosefilter mit 82 mm Durchmesser (Typ BA85, Schleicher und Schuell) ausgestrichen.
- Es wurde das Kolonie-Hybridisierungsverfahren von Grunstein und Hogness, wie in Maniatis (S. 312-315) beschrieben durchgeführt, wobei ein synthetisches 28- mer-Oligodesoxynukleotid 5' GAGGTGAACATTAACAACAGTGTATTCA 3', welches homolog zu der genomischen Human-DNA ist, die für einen Teil der reifen Form von NGF kodiert, nach einer ³²P-Markierung des 5'-Endes als Sonde verwendet wurde. Vierundvierzig der 170 getesteten Kolonien hybridisierten mit der 28-mer-Sonde. Mit vierundzwanzig der positiv hybridisierenden Kolonien wurden einzeln je 1,5 ml L- Bouillon, die 50 Mikrogramm pro ml Ampicillin enthielten, angeimpft. Nach 5 Stunden Wachstum bei 37ºC auf einer Schüttelplattform wurde Mini-Lysat-DNA aus jeder Kultur nach dem yerfahren von Birnboim und Doly (supra) präpariert. Nach der Spaltung mit Eco RI ergaben drei dieser Mini-Lysat-Plasmid-DNA-Präparationen das erwartete Fragment von etwa 700 Basenpaaren. Diese Plasmide erhielten die Bezeichnungen pmhNGF#5, pmhNGF#9 und pmhNGF#21.
- Eine DNA-Sequenzanalyse des Plasmids pmhNGF#9 zeigte an, daß es die erwünschte Verbindung zwischen der Maus-cDNA und der genomischen Human- DNA besaß. Zehn Mikrogramm DNA des Plasmids pmhNGF#9 wurden mit der Restriktionsendonuklease Sma I (Bethesda Research Laboratories) unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen gespalten. Nach Ethanolfällung und Trocknung im Vakuum wurde die mit Sma I gespaltene DNA mit der Restriktionsendonuklease Pst I (Bethesda Research Laboratories) unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen weiter verdaut. Das Fragment von etwa 1580 Basen paaren wurde durch Elektrophorese auf einem 0,7%igen Agarosegel abgetrennt und die DNA mit dem DEAE-Nitrocelluloseverfahren von Dretzen etal.. Anal. Biochem. 112:295 (1981), gewonnen.
- Der den Polyhedrin-Promotor enthaltende Baculovirus-Klonierungsvektor Plasmid pAc 373 wurde zur Aufnahme der chimären Sma I-Pst I-Maus/Human-NGF- DNA von 1580 Basenpaaren modifiziert durch die Insertion ein es Adapters, der Sma I- und Pst I-Restriktionsstellen zwischen den nur einmal vorkommenden BamH I- und Kpn I-Stellen von pAc373 enthielt. Das synthetische 35-mer-Oligodesoxynukleotid 5' GATCCGAGCTCCCGGGAGATCTAGACTGCAGGTAC 3' (welches die SmaI-, PstI- und anderen Restriktionsenzymstellen enthält) wurde in destilliertem Wasser in einer Konzentration von 100 Picomol pro Mikroliter resuspendiert.
- Zweihundert Picomol des 35-mers wurden durch Inkubation in einer 20-Mikroliter- Reaktionsmischung, die neben dem 35-mer 1,4 Mikromol Tris-HCl, pH 7,6, 0,2 Mikromol MgCl&sub2;, 0,1 Mikromol Dithiothreit, 1 Nanomol ATP und 7,5 Einheiten T4- Polynukleotidkinase (Pharmacia) enthielt, für 1 Stunde bei 37ºC phosphoryliert. Das Enzym wurde dann durch 10-min ütige Erwärmung auf 65ºC inaktiviert. Das komplementäre synthetische 27-mer-Oligodesoxynukleotid 5, CTGCAGTCTAGATCTCCCGGGAGCTGG 3' wurde gleichermaßen behandelt.
- 5 Mikroliter-Aliquots einer jeden Phosphorylierungsreaktionsmischung (enthaltend 50 Picomol eines jeden phosphorylierten Oligodesoxynukleotids) wurden kombiniert und den selbst-komplementären Oligodesoxynukleotiden durch 4-minütige Inkubation bei 70ºC, gefolgt von 30-minütiger Inkubation bei 37ºC und schließlich 60-minütiger Inkubation bei 23ºC, die Verschmelzung miteinander erlaubt.
- Drei Mikrogramm Plasmid pAc373 wurden mit der Restriktionsendonuklease Kpn I (Bethesda Research Laboratories) gespalten. Das mit Kpn I gespaltene pAC373 wurde weiter mit der Restriktionsendonuklease BamH I gespalten. Die mit Kpn I und BamH I gespaltene DNA wurde mit Phenol extrahiert, ethanolgefällt, im Vakuum getrocknet und in sterilem destilliertem Wasser in einer Konzentration von 120 Nanogramm pro Mikroliter resuspendiert. Die gespaltene pAc373-Vektor-DNA wurde dann mit den verschmolzenen Oligodesoxynukleotiden in einer 20-Mikroliter- Reaktionsmischung ligiert, die 120 Nanogramm mit Kpn I und BamH I gespaltene pAC 373-DNA, 1,0 Picomol verschmolzene Oligodesoxynukleotide, 1 Mikromol Tris-HCl, pH 7,8, 0,2 Mikromol MgCl&sub2;, 0,4 Mikromol reduziertes Dithiothreit, 2 Nanomol ATP und 1 Einheit T4-DNA-Ligase enthielt. Die Ligierungsmischung wurde 16 Stunden lang bei 15ºC inkubiert.
- Die 20-Mikroliter-Ligierungsmischung wurde dann in kompetente E. coli HB 101-Wirtszellen (Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laborabory: New York) transformiert und auf LB-Agarplatten auspiattiert, die 50 Mikrogramm pro ml Ampicillin enthalten. Nach Wachstum über Nacht bei 37ºC wurden 12 Kolonien willkürlich ausgewählt und mit jeder 1,5 ml L-Bouillon, die 50 Mikrogramm pro ml Ampicillin enthielt, angeimpft. Nach 5 Stunden Wachstum bei 37ºC auf einer Schüttelplattform wurde Mini-Lysat-DNA aus jeder Kultur nach dem Verfahren von Birnboim und Doly (supra) präpariert.
- Nach der Spaltung mit Pst I und Xho I (eine nur einmal vorkommende Restriktionsstelle in pAc373) wurde mit einer Ausnahme bei allen Mini-Lysat- Plasmid-DNA-Präparationen ein DNA-Fragment der erwarteten Größe von etwa 2000 Basenpaaren erhalten. Alle Plasmide, die eine Pst I-Restriktionsstelle erworben hatten, wurden auch befunden, eine Sma I-Restriktionsstelle erworben zu haben, wie durch Spaltung mit Xho I und Sma I festgestellt. Eines dieser Plasmide mit der Bezeichnung pAC373 SSBXP-8 wurde für die endgültige Plasmidkonstruktion eingesetzt.
- Ein Mikrogramm des Plasmids pAC373 SSBXP-8 wurde mit der Restriktionsendonuklease Sma I unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen verdaut. Nach Ethanolfällung wurde das getrocknete Pellet der mit Sma I gespaltenen DNA in sterilem destilliertem Wasser resuspendiert und weiter mit Pst I (Bethesda Research Laboratories) nach den Empfehlungen des Herstellers gespalten. Die mit Sma I und Pst I gespaltene pAC373 SSBXP-8-DNA wurde mit Phenol extrahiert, ethanolgefällt und das getrocknete DNA-Pellet in sterilem destilliertem Wasser in einer Konzentration von 100 Nanogramm pro Mikroliter resuspendiert. Der gespaltene pAC 373 SSBXP-8-Vektor wurde dann mit dem vorher isolierten Sma I - Pst I- Fragment von pmhNGF#9 von etwa 1580 Basenpaaren, welches die Maus/Human- NGF-Chimäre enthielt, in einer 20-Mikroliter-Reaktionsmischung ligiert, die 100 Nanogramm mit Sma I und Pst I gespaltenes pAc 373 SSBXP-8, 250 Nanogramm des Sma I - Pst I-Fragments von pmhNGF#9 von etwa 1580 Basenpaaren, 1,0 Mikromol Tris-HCl, pH 7,8, 0,20 Mikromol MgCl&sub2;, 0,40 Mikromol reduziertes Dithiothreit, 2,0 Nanomol ATP und 1 Einheit T4-DNA-Ligase enthielt. Die Reaktionsmischung wurde 16 Stunden lang bei 15ºC inkubiert.
- Die Ligierungsmischung wurde in kompetente E. coli HB 101-Wirtszellen transformiert und auf L-Agarplatten ausplattiert, die 50 Mikrogramm pro ml Ampicillin enthielten. Nach Wachstum über Nacht bei 37ºC wurden 12 Kolonien willkürlich gepickt und mit jeder 1,5 ml L-Bouillon, die 50 Mikrog ramm pro ml Ampicillin enthielten, angeimpft. Nach 5 Stunden Wachstum bei 37ºC auf einer Schüttelplattform wurde Mini-Lysat-DNA aus jeder Kultur nach dem Verfahren von Birnboim und Doly (supra) präpariert. Nach Spaltung mit Eco RI ergaben zwei dieser Mini-Lysat- Plasmid-DNA-Präparationen das erwartete 3400-Basenpaar-Fragment.
- Eines dieser Plasmide mit der Bezeichnung pAC373MhNGF wurde zur Kotransfektion von Spodoptera frugiperda-Sf9-Zellen mit genomischer Baculovirus- DNA in der in Beispiel 4 unten beschriebenen Weise eingesetzt. Der resultierende rekombinante Virus wurde zur Infektion von Sf9-Insektenzellen verwendet und dann hNGF auf die in Beispiel 5 unten beschriebene Weise exprimiert.
- Die Konstruktion der pAcYMhNGF-Plasmide war ein mehrstufiges Verfahren (Figur 3). Das Plasmid phNGF#5 (beschrieben in Beispiel 1) wurde zuerst modifiziert, um günstige Restriktionsenzymstellen sowohl stromaufwärts als auch stromabwärts der für β-NGF kodierenden Sequenz zu inkorporieren. Zur Bereitstellung einer stromaufwärts gelegenen BamH I-Spaltungsstelle wurden zwei Oligonukleotid-Adapter synthetisiert. Der erste Adapter: 5, GGGGATCCAAATATGTCCATGTTGTTCTACACTCT 3' und 5, GATCAGAGTGTAGAACAACATGGACATATTTGGATCCCC 3' besitzt die BamHI- Spaltungsstelle unmittelbar stromaufwärts des ersten der beiden möglichen lnitiationscodons [die 2-MET-Position, -121]. Der zweite Adapter hingegen: 5' GGGGATCCAAATATGTTGTTCTACACTCT 3' und 5' GATCAGAGTGTAGAACAACATATTTGGATCCCC 3' plaziert die Restriktionsstelle neben das zweite Methionincodon [die 1-MET-Position, -119].
- Das 35-mer-Oligodesoxynukleotid 5' GGGGATCCAAATATGTCCATGTTGTTCTACACTCT 3' wurde in destilliertem Wasser in einer Konzentration von 100 Picomol pro Mikroliter resuspendiert.
- Einhundert Picomol des 35-mers wurden durch Inkubation in einer 20-Mikroliter- Reaktionsmischung, enthaltend 1,4 Mikromol Tris-HCl, pH 7,6, 0,2 Mikromol MgCl&sub2;, 0,1 Mikromol Dithiothreit, 1 Nanomol ATP und 7,5 Einheiten T4-Polynukleotidkinase (Pharmacia), für eine Stunde bei 37ºC phosphoryliert. Das Enzym wurde dann durch 10-min ütiges Erwärmen auf 65ºC inaktiviert. Das 39-mer-Oligodesoxynukleotid 5' GATCAGAGTGTAGAACAACATGGACATATTTGGATCCCC 3' wurde gleichermaßen behandelt.
- Mikroliter-Aliquots einer jeden Phosphorylierungsreaktionsmischung (enthaltend 25 Picomol eines jeden phosphorylierten Oligodesoxynukleotids) wurden kombiniert und den selbst-komplementären Oligodesoxynukotiden durch Inkubation bei 70ºC für 4 Minuten, gefolgt von Inkubation bei 37ºC für 30 Minuten und schließlich 23ºC für 60 Minuten, die Verschmelzung miteinander gestattet.
- Plasmid-DNA von phNGF#5 wurde aus dem dam- E. coli-Wirt GM 48 (dam3&supmin;, dcm6, gal, ara, lac, thr, leu, thi, tonA, tsx) hergestellt und 5 Mikrogramm der DNA mit der Restriktionsendonuklease Bcl I (Boehringer Mannheim) nach den Empfehlungen des Herstellers gespalten. Nach einer Ethanolfällung wurde das Pellet der mit Bd I- gespaltenen DNA im Vakuum getrocknet. Das getrocknete DNA-Pellet wurde in sterilem Wasser resuspendiert -und mit der Endonuklease Sma I gespalten. Die mit Sma I und Bcl 1 gespaltene phNGF#5-DNA wurde mit Phenol extrahiert, ethanolgefällt, im Vakuum getrocknet und in sterilem destilliertem Wasser resuspendiert. Die gespaltene phNGF#5-Vektor-DNA wurde dann mit den verschmolzenen Oligodesoxynukleotiden in einer 20-Mikroliter-Reaktionsmischung ligiert, die 100 Nanogramm (0,038 Picomol) mit Bcl I und Sma I gespaltene phNGF#5-DNA, 2,5 Picomol verschmolzene Oligodesoxynukleotide, 1 Mikromol Tris-HCl, pH 7,8, 0,2 Mikromol MgCl&sub2;, 0,4 Mikromol reduziertes Dithiothreit, 2 Nanomol ATP und 1 Einheit T4-DNA-Ligase enthielt. Die Ligierungsmischung wurde 16 Stunden lang bei 15ºC inkubiert.
- Die 20-Mikroliter-Ligierungsmischung wurde dann in kompetente E. coli GM 48-Wirtszellen transformiert und auf LB-Agarplatten ausplattiert, die 50 Mikrogramm pro ml Ampicillin enthielten. Nach Wachstum über Nacht bei 37ºC wurden 12 Kolonien willkürlich gepickt und mit jeder 1,5 ml L-Bouillon, enthaltend 50 Mikrogramm pro ml Ampicillin, angeimpft. Nach 5 Stunden Wachstum bei 37ºC auf einer Schüttelplattform wurde Mini-Lysat-DNA aus jeder Kultur nach dem Verfahren von Birnboim und Doly (supra) präpariert. Nach Spaltung mit BamH I und Sal I ergab jede dieser Mini-Lysat-DNAp das erwartete 1500 Basenpaar-Fragment. Eines dieser Plasmide mit der Bezeichnung phNGF2M wurde einer DNA-Sequenzierung nach dem Verfahren von Sanger (Proc. Natl. Acad. Sci. USA.. 74:5463 (1977)) unterworfen und befunden, die erwünschte Sequenz zu besitzen.
- Das Plasmid phNGF1M wurde auf analoge Weise konstruiert unter Verwendung der synthetischen Oligonukleotide 5' GGGGATCCAAATATGTTGTTCTACACTCT 3' und 5' GATCAGAGTGTAGAACAACATATTTGGATCCCC 3'. Nach Spaltung mit BamH I und Sal I ergab eine Mini-Lysat-Plasmid-Präparation des Klons phNGF1m das erwartete 1500-Basenpaar-Fragment.
- Um eine BamH I-kompatible, stromabwärts gelegene Restriktionsstelle zur Klonierung in pAcYM1 (sudra) zu erhalten, wurde ein Bgl II-Linker zwischen den beiden Apa I-Stellen stromabwärts der hNGF-DNA eingeführt. Das 8-mer- Oligodesoxynukleotid 5' CAGATCTG 3' wurde durch Inkubation in einer 20-Mikroliter-Reaktionsmischung, die 188 Picomol des 8-mers, 1,4 Mikromol Tris-HCl, pH 7,6, 0,2 Mikromol MgCl&sub2;, 0,1 Mikromol reduziertes Dithiothreit, 1 Nanomol ATP und 7,5 Einheiten T4-Polynukleotidkinase (Pharmacia) enthielt, für eine Stunde bei 37ºC phosphoryliert. Das Enzym wurde durch 10-min ütiges Erwärmen auf 65ºC inaktiviert. 1,6 Mikrog ramm des Plasmids phNGF2M wurden mit der Restriktionsendonuklease Apa I (New England Biolabs) unter den vom Hersteller vorgeschlagenen Bedingungen verdaut. Nach Phenolextraktion, Ethanolfällung und Trocknen wurde die mit Apa I gespaltene DNA in sterilem destilliertem Wasser in einer Konzentration von 200 Nanogramm pro Mikroliter resuspendiert. Die 3'-Überhänge der mit Apa I gespaltenen DNAs wurden anschließend enifemt (stumpfendig gemacht) durch Inkubation mit dem Klenow-Fragment von E. coli DNA-Polymerase I und allen vier pNTPen. 1,4 Mikrog ramm mit Apa I gespaltenes phNGF2M wurden in einer 25- Mikroliter-Reaktionsmischung, bestehend aus der mit Apa I gespaltenen DNA, 1,25 Mikromol NACl, 0,25 Mikromol Tris-HCl, pH 7,5, 0,25 Mikromol MgCl&sub2;, jeweils 5 Nanomol dATP, dGTP, dTTP und dCTP und 1 Einheit Klenow-Fragment von E. coli DNA-Polymerase 1 (Bethesda Research Laboratories), bei 23ºC 10 Minuten lang inkubiert.
- Nach der Inkubation wurden 0,5 Mikromol EDTA, pH 8,0, zugegeben, die resultierende Mischung mit Phenol extrahiert, ethanolgefällt, getrocknet und in einer DNA-Konzentration von 100 Na nog ramm pro Mikroliter resuspendiert. Die mit Apa I gespaltene und stumpfendig gemachte phNGF2M-Vektor-DNA wurde dann mit dem 8-mer-Bgl II-Linker in einer 20-Mikroliter-Reaktionsmischung ligiert, die 100 Nanogramm mit Apa I gespaltenes und stumpfendig gemachtes phNGF2M, 28 Mikromol phosphorylierte 8-mer-Linker, 1 Mikromol Tris-HCl, pH 7,8, 0,2 Mikromol MgCl&sub2;, 0,4 Mikromol reduziertes Dithiothreit, 2 Nanomol ATP und 1 Einheit T4-DNA- Ligase (Bethesda Research Laboratories) enthielt.
- Die Ligierungsmischung wurde 16 Stunden lang bei 23ºC inkubiert. Die DNA- Ligase wurde dann durch 10-minütige Inkubation bei 65ºC inaktiviert. Die ligierte DNA wurde anschließend mit der Restriktionsendonuklease Bgl II (Bethesda Research Laboratories) unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen gespalten. Nach Phenolextraktion, Ethanolfällung und Trocknen wurde die DNA in sterilem destilhiertem Wasser in einer Konzentration von 10 Nanog ramm pro Mikroliter resuspendiert und die DNA in einer 20-Mikroliter-Reaktionsmischung religiert, die 100 Nanogramm DNA, 10 Mikromol Tris-HCl, pH 7,8, 0,2 Mikromol MgCl&sub2;, 0,4 Mikromol reduziertes Dithiothreit, 2 Nanomol ATP und 1 Einheit T4 DNA- Ligase enthielt. Die Ligierungsmischung wurde 16 Stunden lang bei 23ºC inkubiert. Die 20-Mikroliter-Ligierungsmischung wurde dann in kompetente E. coli HB 101- Wirtszellen transformiert und auf LB-Agarplatten, enthaltend 50 Mikrogramm pro ml Ampicillin, ausplattiert.
- Nach Wachstum über Nacht bei 37ºC wurden 6 Kolonien willkürlich gepickt und mit jeder 1,5 ml L-Bouillon, enthaltend 50 Mikrog ramm pro ml Ampicillin, angeimpft. Nach 5 Stunden Wachstum bei 37ºC auf einer Schüttelplattform wurde Mini-Lysat-DNA aus jeder Kultur nach dem Verfahren von Birnboim und Doly (supra) präpariert. Nach Spaltung mit BamH I und Bgl II ergaben zwei der Mini-Lysat- Plasmid-DNA-Präparationen aus der Ligierung von phNGF2M das erwartete Fragment von etwa 780 Basenpaaren.
- Das Plasmid phNGF1M wurde auf analoge Weise konstruiert und das BamH I -Bgl II-Fragment von 780 Basenpaaren gereinigt.
- Etwa 2 Mikrogramm der DNA des Piasmids phNGF2M wurden mit den Restriktionsendonukleasen BamH I und Bgl II gespalten. Die verdauten DNA- Fragmente wurden durch Elektrophorese auf einem 0,7%igen Agarosegel aufgetrennt und das Fragment von etwa 780 Basenpaaren mit dem DEAE- Nitrocelluloseverfahren von Dretzen et al., Anal. Biochem. 112:295, aus dem Gel gewonnen. Die gewonnene DNA wurde in sterilem destilliertem Wasser in einer Konzentration von 30 Nanogramm pro Mikroliter resuspendiert.
- Neun Mikrogramm des den Polyhedrin-Promotor enthaltenden Baculovirus- Transferplasmids pAcYM1 (Matsuura, Y., J. of Gen. Virol. 68:1233(1987)) wurde mit der Restriktionsendonuklease BamH I unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen gespalten. Nach Phenolextraktion, Ethanolfällung und Trocknen wurde das mit BamH I verdaute pAcYM1 in sterilem destilliertem Wasser resuspendiert und mit alkalischer phosphatase in einer 21-Mikroliter-Reaktionsmischung, enthaltend 9 Mikrogramm mit BamH I gespaltenes pAcYM1, 0,315 Mikromol Natriumborat, pH 10,4, und eine Einheit alkalischer Kalbsdarm-Phosphatase (Sigma), durch Inkubation bei 37ºC für 1 Stunde behandelt. Nach einer Stunde wurde EDTA, pH 8,0, bis zu einer Endkonzentration von 5 Millimolar zugegeben und die Mischung 15 Minuten lang bei 68ºC inkubiert. Die Mischung wurde anschließend mit Phenol extrahiert, ethanolgefällt, getrocknet und in sterilem, destilliertem Wasser resuspendiert.
- Das vorher gereinigte BamH I - Bgl II-Fragment von phNGF2M von etwa 780 Basenpaaren wurde dann mit dem mit BamH I gespaltenen und mit alkalischer Phosphatase behandelten pAcYM1 in einer 20-Mikroliter-Reaktionsmischung ligiert, die 100 Nanog ramm mit BamH I gespaltenes und phosphatase behandeltes pAcYM1, 225 Nanogramm BamH I - Bgl II-Fragment (780 Basenpaare) von PhNGF2M, 1 Mikromol Tris-HCl, pH 7,8, 0,2 Mikromol MgCl&sub2;, 0,4 Mikromol reduziertes Dithiothreit, 2 Nanomol ATP und 1 Einheit T4-DNA-Ligase enthielt. Die Ligierungsmischung wurde 16 Stunden lang bei 15ºC inkubiert.
- Die 20-Mikroliter-Ligierungsmischung wurde dann in kompetente E. coli HB 101-Wirtszellen transformiert und auf LB-Agarplatten, enthaltend 50 Mikrogramm pro ml Ampicillin, ausplattiert. Nach Wachstum über Nacht bei 37ºC wurden 12 Kolonien willkürlich gepickt und mit jeder 1,5 ml L-Bouillon, enthaltend 50 Mikrog ramm pro ml Ampicillin, angeimpft. Nach 5 Stunden Wachstum bei 37ºC auf einer Schüttelplattform wurde Mini-Lysat-DNA aus jeder Kultur nach dem Verfahren von Birnboim und Doly (supra) präpariert. Nach Spaltung mit den Restriktionsendonukleasen Pst I und Xho I ergaben zwei dieser Mini-Lysat-Plasmid-DNA-Präparationen die erwartete(n) Anzahl und Größen der Restriktionsfragmente. Eines dieser Plasmide mit der Bezeichnung pAcY2MhNGF wurde zur Kotransfektion von Spodoptera frugiperda-Sf9-Zellen mit genomischer Baculovirus-DNA eingesetzt.
- Das Plasmid pAcY1MhNGF wurde auf analoge Weise aus dem BamH I - Bgl II-Fragment von phNGF1M und pAcYM1 konstruiert.
- pAcY1MhNGF- oder pAcY2MhNGF-DNAs wurden mit Baculovirns (AcNPV)- DNA in Spodoptera frugiperda-Zelien (Sf9) unter Anwendung eines Lipofektionsverfahrens wie von Felgner (supra) beschrieben kotransfiziert.
- Verschiedene Mengen (1 bis 10 Mikrogramm) der von pAcYM1 abgeleiteten hNGF-Plasmide und 1 Mikrog ramm der AcNPV-DNA (1,5 ml) wurden gemischt mit einen gleichen Volumen der "DOTMA"-Lipidlösung (Life Science Technology, MD) (66 ug/ml in HEPES-gepufferter Salzlösung). Die Liposom-verkapselten DNAs wurden dann zu Sf9-Zellen in T-25-Kolben zugegeben und 1,5 h lang inkubieren gelassen. Dann wurden 3 ml frisches Medium zugegeben. Nach 4 h wurde das ursprüngliche Medium entfernt und durch frisches Medium ersetzt. Nach 3 oder 4 Tagen Inkubation bei 27ºC wurden die Überstandsflüssigkeiten gewonnen und in konfluenten Monoschichten von Sf9-Zellen titriert. Plaques, die keine Okklusionskörper aufwiesen, (wie durch Lichtmikroskopie bestimmt) wurden gepickt und zweimal auf Sf9-Zelien replaquiert, um Polyhedrin-negative rekombinante Viren zu erhalten. Virus-Stammlösungen mit hohem Titer (10&sup7; bis 10&sup8; PFU/ml) wurden hergestellt.
- Insektenzellen [(Fall Armyworm Ovary, Spodoptera frugiperda (Sf9), ATCC #CRL-1711), erhalten von der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD] in 35 mm-Gewebekulturschalen wurden mit einer Multiplizität von 100 PFU/Zelle separat entweder mit dem von pAcY1MhNGF oder mit dem von pAcY2MhNGF abgeleiteten rekombinanten Virus infiziert. Nach 1 Stunde wurden die infizierenden Viren entfernt und 2 ml frisches Grace-Medium (JR Scientific, Woodland, CA) (ohne fötales Kalbsserum) zugegeben. Nach 72 h wurde der Kulturüberstand gewonnen und 1 Ofach konzentriert. Das konzentrierte Material wurde einer ELISA- oder Western-Blot-Analyse unter Verwendung von Anti-Maus-NGF-Antikörpern unterworfen. Sowohl die Western-Blot- (Figur 4) als auch die ELISA-Ergebnisse zeigten an, daß der von pAcY2MhNGF abgeleitete rekombinante Virus in das Kulturmedium etwa 1 Mikrogramm/ml hNGF sekretierte, während pAcY1MhNGF keine nachweisbaren Mengen an hNGF produzierte.
- Serumfreies Medium (XL-400) wurde von JR Scientific Inc., Woodland, CA, bezogen. Sf9-Zelien, vermehrt in XL-400-Medium bei 27ºC, wurden in Suspension in 100-ml-Schüttelkolben gezüchtet. Die Zelldichte wurde durch Verdünnen mit frischem Medium bei 3 x 10&sup5; bis 1 x 10&sup6; Zellen/ml gehalten. Die Verdopplungszeit in der logarithmischen phase betrug etwa 24 Stunden. Sf9-Zellen bei einer Zelldichte von 5 x 10&sup5; bis 2,4 x 10&sup6; Zellen/ml wurden mit rekombinanten Viren mit verschiedenen Multiplizitäten der Infektion (MOL) (von 0,01 bis 10 PFU/Zelle) infiziert.
- Die Kulturüberstände wurden an den Tagen 3, 5 und 6 nach der Infektion gewonnen. Nach Filtration durch ein 0,22-um-Membranfiltersystem (Corning Glassware, Corning, NY) wurde die Menge des im Filtrat vorhandenen hNGF durch ein ELISA-Verfahren bestimmt. Im XL-400-Medium wurde rekombinanter hNGF optimal (etwa 6 ug/ml) 3 Tage nach der Infektion produziert, wenn die Sf9-Zellen bei einer Dichte von 2,4 x 10&sup6; Zellen/ml und mit einer MOL von 0,01 infiziert wurden.
- Flachbödige Immulon-2-Platten mit 96 Vertiefungen (Dynatech Labs Inc., Kat. Nr. 011-010-3450) wurden mit Anti-Maus-β (2,5S)-NGF (Boehringer Mannheim, Kat. Nr. 1008218) in einer Konzentration von 0,1 ug/ml und mit 0,15 mlnertiefung mindestens zwei Stunden lang beschichtet. (NGF wurde mit Beschichtungspuffer (Na&sub2;CO&sub3;/NaHCO&sub3;, 50 mM; Na-Azid, 0,1% Gew.Nol.; pH 9,6) verdünnt). Die Platten wurden dann mit Waschpuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,0; 200 mM NACl, 10 mM CaCl&sub2;, 0,1% (Gew./Vol.) Triton X-100, 0,05% (Gew./Vol.) Na-Azid) gewaschen. Die Platten wurden anschließend mit BSA (1% BSA, Sigma, RIA-Grad, Kat. # A-7888 in Waschpuffer) mindestens 30 Minuten lang bei Raumtemperatur blockiert und erneut mit Waschpuffer gewaschen.
- Eine Standardkurve ist in jedem der kommerziellen Assays eingeschlossen: 2,5 S Maus-NGF (Sigma, Produkt Nr. N6009), vorher in destilliertem Wasser in einer Konzentration von 100 ug/ml rekonstituiert und in Aliquots von 5 ul/Röhrchen bei -60ºC gelagert, wurde aufgetaut und mit 495 ul Probenpuffer (Blockierungspuffer, ergänzt mit 20 ug/ml Aprotinin, United States Biochemical Co., Kat. Nr. 11388) verdünnt. Dieser Standard (NGF-Endkonzentration bei 1 ug/ml) ist mindestens 10 Tage lang bei 4ºC stabil.
- Der mNGF-Standard wurde mit Probenpuffer zweifach reihenverdünnt und den ELISA-Platten zugegeben (0,1 ml/Vertiefung; in Duplikaten). Die Kulturflüssigkeit wurden ebenfalls in Probenpuffer reihenverdünnt (1/2 bis 1/64.000) und den Platten zugegeben (ebenfalls mit 0,1 mlnertiefung). Nach einer Inkubation bei 4ºC über Nacht wurden die Vertiefungen wiederholt gewaschen. NGF (2,5S)-β-gal- Konjugat (Boehringer Mannheim, Kat. Nr. 1008234, 0,0125 Einheiten/ml in Blockierungspuffer) wurde jeder Vertiefung zugegeben. Nach Inkubation für 4 Stunden bei 37ºC wurden die Platten erneut gewaschen. 0,2 ml einer frisch hergestellten Substratlösung (2 mg/ml Chlorphenolrot-β-D-galactopyranosid in Substratpuffer: 100 mM Hepes, pH 7,0; 150 mM NaCl, 2 mM MgCl&sub2;; 0,1% (Gew./Vol.) Natriumazid, 1 % (Gew./Vol.) Albumin) wurden jeder der Vertiefungen zugegeben und weitere 2 Stunden bei 37ºC inkubieren gelassen. Die ELISA-Platten wurden dann mit einem Titertek Multiskan Mikrotiterplatten-Ablesegerät unter Verwendung eines Multiskan Interferenzfilters bei 570 nm abgelesen.
- Die biologische Aktivität des durch rekombinanten pAcY1MhNGF- oder pAcY2MhNGF-Virus erzeugten Materials wurde in vitro bei der PC&sub1;&sub2;-Pheochromocytom-Zellinie (Greene, L.A., Trends Neurosci. Z:91 (1986)) getestet. PC&sub1;&sub2;-Zellen wurden in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), ergänzt mit 5% definiertergänztem Kalbsserum und 5% Pferdeserum, gezüchtet und in einer Dichte von etwa 50.000 Zellen pro Vertiefung (16 mm) ausgesät. Die Zellen wurden mit einer einzigen Zugabe von entweder Kulturflüssigkeiten von mit rekombinantem Baculovirus infizierten Zellen oder von Maus-NGF (Sigma) behandelt. Die Zellen wurden bis zu 14 Tage nach der Zugabe beobachtet.
- PC&sub1;&sub2;-Zellen, die mit Kulturflüssigkeit (25 ul/ml Medium) von mit rekombinantem pAcY2MhNGF-Baculovirus infizierten Zellen behandelt worden waren, erfuhren eine schnelle Differenzierung (Figur 5). Die Eintrittsgeschwindigkeit, wie durch Neuritenauswuchs nachgewiesen, war wesentlich schneller (innerhalb 12 h) als mit Maus-NGF bei 25 und 100 ng pro ml Medium (24-36 h) (Figur 6). Die Fähigkeit, eine schnelle Differenzierung von PC&sub1;&sub2;-Zeilen zu induzieren, scheint eine inhärente Eigenschaft des durch Baculovirus produzierten hNGF zu sein. Die Dauer der Differenzierung andererseits ist konzentrationsabhängig. PC&sub1;&sub2;-Zellen, die mit einer konzentrierten Präparation von infizierter Sf9-Zellflüssigkeit behandelt worden waren, verblieben für die Dauer des Experiments (14 Tage) differenziert. Dagegen verloren PC&sub1;&sub2;-Zellen, die mit einer stärker verdünnten Präparation (0,1 X) des durch Baculovirus produzierten hNGF behandelt worden waren, ihren differenzierten Phänotyp nach 5 Tagen wieder.
- Interessanterweise zeigten PC&sub1;&sub2;-Zellen, die mit dem Überstand von mit rekombinantem pAcY1MhNGF-Virus infizierten Zellen behandelt worden waren, kein p Zeichen von Differenzierung. Diese Beobachtung ist konsistent mit den negativen Western-Blot- und ELISA-Ergebnissen (Beispiel 5).
- Die biologische Aktivität, die dem durch Baculovirus produzierten hNGF zugeschrieben wird, kann durch einen Anti-Maus-NGF-Antikörper (Figur 7) neutralisiert werden.
- PC&sub1;&sub2;-Zellen wurden ausplattiert wie in Beispiel 8 beschrieben mit der folgenden Modifikation: vor der Zugabe von NGF zum Kulturmedium wurde Anti- Maus-NGF-Antiserum (Collaborative Research Inc., bei einer 1:500- und 1:1000- Verdünnung von unvermischtem Serum) den PC&sub1;&sub2;-Zellen zugegeben. Dann wurde Maus-NGF (Sigma) oder rekombinanter Human-NGF den PC&sub1;&sub2;-Zellkulturen zugegeben und deren Wirkung auf die Zelldifferenzierung für einen Zeitraum von 14 Tagen beobachtet.
- Die NGF-induzierte Differenzierung von PC&sub1;&sub2;-Zellen durch sowohl Human- NGF (25 ul Kulturflüssigkeit) als auch Maus-NGF (100 ng) wurde durch Anti-NGF- Antiserum bei einer Verdünnung von 1:500 und 1:1000 unvermischten Serums neutralisiert.
- Kulturen von SH-SY5Y-Zellen [Biedler et al., Cancer Res. 33:2643 (1973), ibid 38:3751 (1978)] wurden in 75-cm²-Corning T-75-Kolben in einer 1:1-Mischung von Dulbecco's Modified Eagles' Medium (DMEM) und Ham's F-12 (JR Scientific, Woodland, CA), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (JR Scientific), bei 37ºC gehalten. Die Zellen wurden zur Passage abgelöst und geerntet durch Zugabe von 4 ml 0,02%iger EDTA in DMEM pro Kolben, gefolgt von heftigem Schütteln. Die Zellen wurden in einem 1:5-Aufteilungsverhältnis passiert. In den Kulturen wurden zu keiner Zeit Antibiotika eingesetzt. Nachdem die Zellen Negativkontrollüberstand, NGF (2,5 5 Maus-NGF, Sigma) bei einer Konzentration von 100 ng/ml oder Human-NGF (25 ul/ml) ausgesetzt worden waren, wurden die Zellen alle 24 h auf Anzeichen einer Differenzierung beobachtet. Das Medium wurde für die Dauer der Kultur alle 2 Tage ausgetauscht und der NGF ersetzt. Aphidicolin wurde dem Medium während der zweiten Behandlungswoche mit 10 ug/ml zugegeben.
- Die Zugabe von hNGF (25 ul/ml) zu der SH-SYSY-Human-Neuroblastom-Zelllinie induzierte eine schnelle Differenzierung (Verlängerung von Neunten aus Zellen), während keine Wirkung nach der Verabreichung eines Negativkontroll- Kulturflüssigkeitsüberstands an SH-SY5Y-Zellen (25 ul/ml) beobachtet wurde. Der schnelle Eintritt der Differenzierung aufgrund von NGF, bereits nach 24 Stunden beginnend, stand im Gegensatz zu dem viel langsameren Differenzierungseintritt, der nach der Zugabe von Maus-NGF (Sigma) zu derselben Zellinie (5 Tage) beobachtet wurde (Jensen, Dev. Biol. 120:56 (1987)).
- Aphidicolin besitzt keine Wirkung auf differenzierte Zellen, ist jedoch ein reversibler Inhibitor von α-DNA-Polymerase und wird deshalb sich mitotisch teilende Zellen abtöten. Es ist erforderlich, die Zellen in der zweiten Woche mit Aphidicolin zu behandeln, da die wenigen mitotisch aktiven Zellen, die durch NGF nicht zur Differenzierung induziert wurden, die stillen, d.h. differenzierten Zellen, überwuchern würden.
- Die Entwicklung von Transfervektoren, welche speziell konstruiert sind, um eine hohe Koexpression des hNGF-Gens und eines weiteren Gens, kodierend für ein prozessierendes Gen, z.B. die Gamma-Untereinheit von NGF oder die Hefe-KEX2- Endopeptidase, zu erlauben, ist ein alternativer Weg, um hohe Mengen an reifem NGF zu produzieren. Dies kann erzielt werden durch Insertion des β-NGF-Gens stromabwärts des Polyhedrin-Promotors und entweder des Gamma-NGF- oder des KEX2-Gens unter der Kontrolle einer zweiten Kopie des Polyhedrin-Promotors, eines weiteren Baculovirus-Promotors, wie den späten p-10-Promotor, oder eines konstruierten synthetischen Promotors. Rekombinanter Virus wird dann gebildet wie in BEISPIEL 4 beschrieben und zur Infektion von Sf9-Zellen eingesetzt wie in BEISPIEL 5 beschrieben.
- Bei diesem Test wird durch Läsionen versucht, eine cholinerge Dysfunktion in Begriffen einer Beeinträchtigung des Erinnerungs- und kognitiven Vermögens, die bei AK-Patienten gefunden wird, nachzubilden. Die hNGF-Behandlung verringerte den Grad der Beeinträchtigung signifikant.
- Männliche Charles River Wistar-Ratten (280 - 300 g) wurden einzeln in Quartieren gehalten, die hinsichtlich Geräuschpegel, Temperatur und Feuchtigkeit reguliert waren, und bei einem Licht/Dunkelheits-Zyklus von 12 Stunden gehalten. Für die ersten zehn Tage der Untersuchung hatten die Tiere freien Zugang zu Nahrung. Vom elften Tag an wurde die Futterversorgung der Tiere verringert, bis alle Tiere 80% ihres anfänglichen Körpergewichts erreichten. Dieses Gewicht wurde während des Trainings aufrechterhalten.
- Apparatur - Ein Y-Labyrinth wurde verwendet, um die Tiere vorzutrainieren, jeder Zielarm maß 13 cm Höhe x 13 cm Breite x 17 cm Länge. Diese Arme waren von dem Zugangsweg (13 cm Höhe x 13 cm Breite x 40 cm Länge) durch eine Guillotine-Tür getrennt.
- Trainingsverfahren - Das Trainings- und Testverfahren erfolgte im wesentlichen dem von Ramirez und Stein (1982)¹. In Kürze, die Tiere wurden willkürlich verschiedenen Versuchsgruppen (n = 5-9) zugeordnet und ihnen eine dreitägige Vortrainingsperiode gestattet, um mit dem Versuchsleiter und dem Y- Labyrinth vertraut zu werden. Die Tiere wurden dann 5 Tage einem willkürlichen Alternierungstraining unterzogen. Nach Plazierung der Ratte am Anfang des Zugangswegs wurde das Tier freigelassen und ihm erlaubt, sich in einen der Arme zu begeben. Das Tier erhielt eine Futterbelohnung (45 mg Noyes-Futterdragee), sobald es sich im Zielarm befand. Nach dem Fressen des Dragees wurde das Tier zum Zugangsweg zurückgebracht, freigelassen und ihm erlaubt, sich in den nächsten willkürlich gewählten Zielarm zu begeben, wo die Ratte erneut eine Futterbehnung erhielt. Die Tiere wurden durch eine Reihe von insgesamt zehn willkürlichen links/rechts Alternierungen geführt. Nach dieser erzwungenen Trainingsperiode wurden die Tiere trainiert, frei im Labyrinth zu alternieren, bis alle ein bestimmtes Kriteriumsniveau erreicht hatten: drei aufeinanderfolgende Tage von zu 80% korrektem Alternierungsverhalten.
- Chirurgischer Eingriff - Die Ratten wurden mit Xylazin (Haver)/Ketamin (Parke-Davis) 200:20 mg/kg intramuskulär narkotisiert und in den stereotaxischen Rahmen (Kopf Instruments) gebracht. Der Schädel wurde freigelegt, gesäubert und zwei Löcher über jeder der Basalganglien von Meynert (NBM) gebohrt (die ¹ Behav. Brain Res. 13:53-61
- Koordinaten wurden vom Bregma nach Paxino und Watson, 19861, gemesssen, rostral/kaudal -0,4 mm, lateral ± 2,6 mm). Die Dura unter den Löchern wurde durchstochen und die Spitze einer Hamion-Spritze, vorgefüllt mit Ibotensäure (5 mglml), -6,5 mm und -7,5 mm ventral zur Dura abgesenkt. 1,0 ul Ibutensäure wurde in das NBM im Verlauf eines Zeitraums von 1 Minute infundiert.
- Ferner wurde oberhalb der Seitenventrikel (rostral/kaudal -0,8 mm, lateral 1,4 mm) ein drittes Loch in den Schädel gebohrt und eine Kanüle aus rostfreiem Stahl 4 mm unterhalb der Dura in die Ventrikel implantiert. Die Kanülen wurden aus 23-g- Nadeln aus rostfreiem Stahl hergestellt und mit einer vorgefüllten sterilen osmotischen 2-ml-Minipumpe Modell Alzet (Aiza, Pab Aito, Kalifornien, USA) (Durchflußrate 2,4 ul/h) über einen Polyethylenschlauch verbunden. Die Pumpen wurden subdermal zwischen den Schulterblättern plaziert. Die Wunde wurde dann genäht und den Tieren erlaubt, sich zu erholen. Die Minipumpen wurden je nach den verschiedenen Behandlungsgruppen gefüllt mit:
- a) hNGF, gelöst mit einer Endkonzentration von 0,1,1,0 oder 10,0 ug/ml in steriler Salzlösung, die 0,1 ug/ml Rattenserum enthielt, d.h., die Ratten erhielten 0,2, 2,0 oder 20,0 ug hNGF pro 4-wöchige Behandlungsperiode; oder
- b) Salzlösung, die 0,1 mg/ml Rattenserum enthielt.
- Die Versuchsgruppen umfaßten Kontrolltiere (n = 6), nur Läsion (n = 9), Läsion mit 0,1 ug/ml hNGF (n = 9), Läsion mit 1,0 ug/ml hNGF (n = 9) und Läsion mit 10,0 ug/ml hNGF (n = 9). Die Tiere wurden in der Aufgabe der räumlichen Alternierung trainiert, chirurgisch behandelt und ihnen dann eine 3-wöchige Behandlungsperiode gestattet. Nach dieser Behandlungsperiode wurden die Ratten erneut in dem Y-Labyrinth getestet und deren Verhaltenseistung über einen Zeitraum von 20 Tagen bewertet.
- Statistische Analyse - Ein Cochran-Mantel-Haenszel-Test wurde verwendet, um Signifikanztests sowohl für die Gesamtwirkungen der Behandlung als auch für paarweise Unterschiede zwischen den Behandlungen zu erhalten. ¹ Das Rattengehirn in stereotaxischen Koordinaten, 2. Auflage, Academic Press, New York
- Die Sterblichkeitsrate nach den Läsionen in den Versuchsgruppen betrug 40%, die Endzahlen der Gruppen waren Kontrolle (6), nur Läsion (6), Läsion mit 0,1 ug/ml hNGF (5), Läsion mit 1,0 ug/ml hNGF (6) und Läsion mit 10,0 ug/ml hNGF (6).
- Um die Wirkungen der Ibotensäure-Läsionen und des hNGF auf das Verhalten der räumlichen Alternierung festzustellen, wurden drei Verhaltenskriterien überprüft: (i) Anzahl der Tage, um nach der Läsion das Kriteriumsniveau zu erreichen, (ii) mittlere Anzahl der Alternierungsfehler pro Tag, und (iii) mittlere Anzahl der Verharrungsfehler pro Tag.
- Wie in Fig. 8 gezeigt, brauchten die Tiere mit einer bilateralen Ibotensäure- Läsion im Vergleich zu Kontrolltieren signifikant länger (p < 0,01), um das etablierte Kriteriumsniveau zu erreichen. Dieser Effekt wurde durch hNGF-Behandlung in Dosen von 1,0 und 10,0 ug/ml teilweise verbessert. Es gab einen signifikanten Unterschied zwischen Tieren mit nur Läsionen und denjenigen, die eine Läsion erhalten hatten, jedoch mit 1,0 ug/ml hNGF (p < 0,01) und 10,0 ug/ml hNGF (p < 0,01) behandelt worden waren. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen Ratten mit nur Läsionen und denjenigen mit Läsionen, die 0,1 ug/ml hNGF erhielten.
- Bilaterale Läsionen veranlaßten die Ratten auch zu signifikant mehr täglichen Alternierungsfehlern (p < 0,01) (siehe Fig. 8) im Vergleich zu Kontrollratten und zu signifikant mehr Verharrungsfehlern (p < 0,01) als Kontrolltiere.
- hNGF-Behandlung begrenzte das Ausmaß der Beeinträchtigungen, die nach einer bilateralen Ibotensäure-Läsion des NBM beobachtet wurde. Es gab einen signifikanten Unterschied in der mittleren Anzahl der Alternierungsfehler (siehe Fig. 8) und mittleren Anzahl der Verharrungsfehler zwischen Läsions-behandelten Tieren und Läsions-hNGF-behandelten Tieren bei den Dosen von 1,0 ug/ml (p < 0,01) und den Dosen von 10,0 ug/ml (p < 0,01). Es gab keinen signifikanten Unterschied in der mittleren Anzahl der Alternierungsfehler (siehe Fig. 8) und Verharrungsfehler zwischen Läsions-behandelten Tieren und Läsions-behandelten und mit 0,1 ug/ml hNGF behandelten Tieren bis zum Tag 9, jedoch am Tag 10 und danach gab es einen signifikanten Unterschied (p < 0,01) zwischen diesen Gruppen.
- Zusammenfassend, bilaterale Ibotensäure-Läsionen des Nukleus basalis von Meynert bei Ratten beeinträchtigen das angelemte räumliche Alternierungsverhalten signifikant. Diese Beeinträchtigung wird durch rekombinanten hNGF signifikant gebessert, was nahelegt, daß rhNGF die zentrale cholinerge Dysfunktion verbessert.
- Es wurden keine toxischen Wirkungen in dem Test beobachtet, der in Beispiel 12 geschildert wurde.
Claims (23)
1. Baculovirus-Transfervektor, der in Insektenzellen funktionell ist und eine
mRNA-Leader-Sequenz und einen Promotor eines Baculovirus-Polyhedrin-
Gens in funktionsfähiger Verknüpfung mit einer kodierenden DNA-Sequenz
aufweist, wobei die kodierende DNA-Sequenz besteht aus:
einer kodierenden DNA-Sequenz für den Präpro-Anteil des Human- oder
Maus-Nervenwachstumsfaktors; und
einer kodierenden DNA-Sequenz für reifen Human-β-Nervenwachstumsfaktor.
2. Transfervektor nach Anspruch 1, konstruiert unter Verwendung eines
synthetischen Adapters mit einer Bam HI-Restriktionsstelle, die stromaufwärts
des ersten Methionin-Initiationscodons an Position -187 eingebaut ist.
3. Transfervektor nach Anspruch 2, worin der synthetische Adapter die
kodierende Sequenz aufweist:
35-mer: 5' GATCCGAGCTCCCGGGAGATCTAGACTGCAGGTAC 3'
27-mer: 5' CTGCAGTCTAGATCTCCCGGGAGCTGG 3'
4. Transfervektor nach Anspruch 2, der pAc373mhNGF (Fig. 2) ist.
5. Transfervektor nach Anspruch 1, konstruiert unter Verwendung eines
synthetischen Adapters mit einer Bam HI-Restriktionsstelle, die sich neben
dem Initiationskodon an Position -121 des hNGF befindet.
6. Transfervektor nach Anspruch 5, worin der synthetische Adapter die
kodierende Sequenz aufweist:
35-mer: 5' GGGGATCCAAATATGTCCATGTTGTTCTACACTCT 3'
39-mer: 5' GATCAGAGTGTAGAACAACATGGACATATTTGGATCCCC 3'
7. Transfervektor nach Anspruch 5, der pAcY2MhNGF (Fig. 3) ist.
8. Insektenzelle, die mit dem Transfervektor nach den Ansprüchen 1-7 infiziert
ist.
9. Insektenzelle nach Anspruch 8, die Spodoptera frugiperda (Sf9) ist.
10. Verfahren zur Produktion eines biologisch aktiven reifen
Human-β-Nervenwachstumsfaktors in Insektenzeen, welches umfaßt:
(a) Konstruktion eines Transfervektors, der eine mRNA-Leader-Sequenz
und einen Promotor eines Baculovirus-Polyhedrin-Gens in funktionsfähiger
Verknüpfung mit einer kodierenden DNA-Sequenz aufweist, wobei die
kodierende DNA-Sequenz besteht aus:
einer kodierenden DNA-Sequenz für den Präpro-Anteil des Human- oder
Maus-Nervenwachstumsfaktors; und
einer kodierenden DNA-Sequenz für reifen Human-β-Nervenwachstumsfaktor;
(b) Inkorporation des Transfervektors von (a) in einen Baculovirus, um
einen rekombinanten Baculovirus zu bilden;
(c) Infektion von Insektenzellen mit dem rekombinanten Baculovirus
von (b);
(d) Züchtung der infizierten Insektenzellen von (c); und
(e) Gewinnung des Human-β-Nervenwachstumsfaktors aus dem
verbrauchten Kulturmedium.
11. Verfahren nach Anspruch 10, worin der Transfervektor pAcY2MhNGF (Fig. 2)
oder pAc373MhNGF (Fig. 3) ist.
12. Verfahren nach Anspruch 10, worin die Insektenzellen in serumarmem oder
serumfreiem Medium gezüchtet werden.
13. Verfahren nach Anspruch 101 worin die infizierten Insektenzellen biologisch
aktiven β-hNGF in das Kulturmedium sekretieren.
14. hNGF-Expressionssysteml umfassend eine kodierende DNA-Sequenz für
hNGF oder Derivate davon nach Anspruch 1 und regulatorische Elemente, die
zur Transfektion der für hNGF kodierenden Sequenz in ein Baculovirus-
Expressionssystem erforderlich sind, welches zur Infektion von Insektenzellen
mit der resultierenden Expression von hNGF oder einem biologisch aktiven
Derivat davon in der Lage ist.
15. Rekombinanter, biologisch aktiver Human-β-Nervenwachstumsfaktor mit der
in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz 1 bis 118, dadurch gekennzeichnet,
daß er durch ein Baculovirus-Expressionssystem erhältlich und frei von
Verunreinigungen ist, die üblicherweise mit hNGF assoziiert sind, der aus
natürlichen Quellen erhalten wird.
16. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend biologisch aktiven hNGF
nach Anspruch 15 in einem annehmbaren pharmazeutischen Träger.
17. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 16, enthaltend
ausreichend biologisch aktiven hNGF, um den Patienten mit 0,1 - 100 ug/Tag
zu versorgen.
18. Verwendung von biologisch aktivem hNGF nach Anspruch 15 zur Herstellung
eines Medikaments zur Behandlung von neurologischen Erkrankungen beim
Menschen.
19. Verwendung nach Anspruch 18, worin die neurologische Erkrankung die
Alzheimer-Krankheit ist.
20. Biologisch aktiver hNGF nach Anspruch 15 zur Verwendung bei der
Behandlung einer neurologischen Erkrankung.
21. Biologisch aktiver hNGF nach Anspruch 20, worin die neurologische
Erkrankung die Alzheimer-Krankheit ist.
22. Biologisch aktiver hNGF nach Anspruch 15, hergestellt aus der infizierten
Insektenzelle nach Anspruch 8 oder 9.
23. Biologisch aktiver hNGF nach Anspruch 15, erhältlich durch das Verfahren
nach Anspruch 10.
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