JPH02291270A - ヒト神経成長因子 - Google Patents
ヒト神経成長因子Info
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-
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、バクロウイルス（ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ
）発現系を使用することによるヒト神経成長因子（ｈ
ＮＧＦ）の発現のための組替えＤＮＡ分子の構築に関す
る。ｈＮＧＦの製造は、スボドブテラ・フルジベルダ（
Ｓ． ｒｒｕａｉｐｅｒｄａ）宿主細胞内において該
蛋白質の発現のためのバク１コウイルス系を用いて成功
した。該組替えｈＮＧＦは、アルツハイマー病（Ａｌｚ
ｈｅｉｉｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ）の治療において
有川である。
）発現系を使用することによるヒト神経成長因子（ｈ
ＮＧＦ）の発現のための組替えＤＮＡ分子の構築に関す
る。ｈＮＧＦの製造は、スボドブテラ・フルジベルダ（
Ｓ． ｒｒｕａｉｐｅｒｄａ）宿主細胞内において該
蛋白質の発現のためのバク１コウイルス系を用いて成功
した。該組替えｈＮＧＦは、アルツハイマー病（Ａｌｚ
ｈｅｉｉｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ）の治療において
有川である。
発明の背硯
闘乳類ＮＧＦ （マウスＮＧＦ）の１次構造は、Ａｎｇ
ｅｌｅｔｉおよびＢｒａｄｓｈａｗらのＰｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．ＡｃａｄＳｃｉ． ＵＳ八６８ ： ２４ １
７ （１９７ １ ）により最初に明らかにされた。そ
の前駆体、ブレープロ一ＮＧＦの１次構造は、マウスＮ
ＧＦ ＣＤＮＡのヌクレオチド配ダ１から推定されて
いる（Ｓｃｏｔｔら３））。
ｅｌｅｔｉおよびＢｒａｄｓｈａｗらのＰｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．ＡｃａｄＳｃｉ． ＵＳ八６８ ： ２４ １
７ （１９７ １ ）により最初に明らかにされた。そ
の前駆体、ブレープロ一ＮＧＦの１次構造は、マウスＮ
ＧＦ ＣＤＮＡのヌクレオチド配ダ１から推定されて
いる（Ｓｃｏｔｔら３））。
高度に相同的なヒトＮＧＦ （ｈＮＧＦ）遺伝子もまた
同定されている（ＵｌｌｒｉｃｈのＳｙｍｐ． ｏｎＱ
ｕａｎ．Ｂ＋ｏｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｑ Ｈａ
ｒｂｏｒ ４ ８ ： ４ ３ ５（１９８３））。
同定されている（ＵｌｌｒｉｃｈのＳｙｍｐ． ｏｎＱ
ｕａｎ．Ｂ＋ｏｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｑ Ｈａ
ｒｂｏｒ ４ ８ ： ４ ３ ５（１９８３））。
そのマウスＮＧＦに対する相同性は、アミノ酸およびヌ
クレオチド配列の段階の各々において、９０％および８
７％である。
クレオチド配列の段階の各々において、９０％および８
７％である。
ｉ１ＮＧＦの希少さ故に、その生物学的活性については
、ほとんど知られていない。
、ほとんど知られていない。
バクロウイルス発現ベクターは、インピボまたはインピ
ト口のいずれかにおける昆虫ａＩａ内での種々の外来遺
伝子の発現に用いられてきた（米国特許第４．７４５．
０５１号、１９８８年５月１７日発行参照》。これらの
発現ベクターは、高度に効率的であり、かつ一時的に制
御されるＡ一トラファ令カリフオルニカ（ Ａｕｔｏｇ
ｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ）核ポリへドロシ
ス・ウイルス（ＡｃＮＰＶ）ポリへドリンブロモータに
より、該ブロモータの下流側に挿入された興味ある遺伝
子を伴って協力を受けている。対応する遺伝子産物は、
該組換えバクロウイルスに感染されたスボドプデラ・フ
ルジペルダから得られる。
ト口のいずれかにおける昆虫ａＩａ内での種々の外来遺
伝子の発現に用いられてきた（米国特許第４．７４５．
０５１号、１９８８年５月１７日発行参照》。これらの
発現ベクターは、高度に効率的であり、かつ一時的に制
御されるＡ一トラファ令カリフオルニカ（ Ａｕｔｏｇ
ｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ）核ポリへドロシ
ス・ウイルス（ＡｃＮＰＶ）ポリへドリンブロモータに
より、該ブロモータの下流側に挿入された興味ある遺伝
子を伴って協力を受けている。対応する遺伝子産物は、
該組換えバクロウイルスに感染されたスボドプデラ・フ
ルジペルダから得られる。
ｈＮＧＦのβ−サブユニットの単離およぴＥ，ＣＯｆｉ
ｉ中における異種蛋白質としての発現は、ヨーロッパ特
許出願第０．１２１．３３８＠に記載ざれている。組換
え技術の使用により、ヒトβ−ＮＧＦは、他の咄乳類蛋
白質を本質的に含むことなく発現ざれた。改造されたア
ミノ末端を有する２種の遺伝子を用いて＠合蛋白質の発
現をもたらすＥ，ｃｏｔ ｉ中でのｈＮＧＦの発現は、
ＩｗａｉらのＣｈｅｍ．Ｐｈａｒｇｉ．Ｂｕｌｌ．
３ ４ ： ４ ７ ２ ４ （ １９８６）により記
載されている。
ｉ中における異種蛋白質としての発現は、ヨーロッパ特
許出願第０．１２１．３３８＠に記載ざれている。組換
え技術の使用により、ヒトβ−ＮＧＦは、他の咄乳類蛋
白質を本質的に含むことなく発現ざれた。改造されたア
ミノ末端を有する２種の遺伝子を用いて＠合蛋白質の発
現をもたらすＥ，ｃｏｔ ｉ中でのｈＮＧＦの発現は、
ＩｗａｉらのＣｈｅｍ．Ｐｈａｒｇｉ．Ｂｕｌｌ．
３ ４ ： ４ ７ ２ ４ （ １９８６）により記
載されている。
ウイルス感染昆虫細胞中におけるポリベブチド製造のた
めの組換え技術の使用は、ヨーロッパ特許出願第０．２
２８，０３６弓に記載ざれている。
めの組換え技術の使用は、ヨーロッパ特許出願第０．２
２８，０３６弓に記載ざれている。
バクロウイルス発現系を用いた蛋白質、Ｂ型肝炎表面抗
原の製造方法は、公知である。遺伝子的に異なり、その
一つが関連づる異種遺伝子を含む、少なくとも２種類の
バクロウイルス類に由来するヌクレオカブシド類の混合
物を含有する混合多面包接体（ＰＩＢ）の使用は、特許
協力条約出願Ｗ０ ８８／０２０３０に記載されてい
る。記載された共感染技術を用いて、異種蛋白質が発現
される。
原の製造方法は、公知である。遺伝子的に異なり、その
一つが関連づる異種遺伝子を含む、少なくとも２種類の
バクロウイルス類に由来するヌクレオカブシド類の混合
物を含有する混合多面包接体（ＰＩＢ）の使用は、特許
協力条約出願Ｗ０ ８８／０２０３０に記載されてい
る。記載された共感染技術を用いて、異種蛋白質が発現
される。
これらの大ぎい噛乳類蛋白質の発現が可能であるにもか
かわらず、本発明まではバクロウイルス発現系を用いた
ｈＮＧＦ等の小さい分子の発現の成功についての情報は
、ほとんど無い。この特定の発現系が、生物学的活性を
示す為の蛋白質前駆体の翻訳後蛋白質分解を必要とする
小さい蛋白質の産生に適しているか否かについても疑問
であった。
かわらず、本発明まではバクロウイルス発現系を用いた
ｈＮＧＦ等の小さい分子の発現の成功についての情報は
、ほとんど無い。この特定の発現系が、生物学的活性を
示す為の蛋白質前駆体の翻訳後蛋白質分解を必要とする
小さい蛋白質の産生に適しているか否かについても疑問
であった。
我々は、ｈＮＧＦがバクロウイルス昆虫細胞発現系を用
いて収率良く成功裏に発現されるであろうことを予期せ
ずに見出した。
いて収率良く成功裏に発現されるであろうことを予期せ
ずに見出した。
本発明は、ｈＮＧＦを生物学的に活性な形態で発現し得
るバクロウイルス系において用いられる発現ベクターの
構築を記述する。本発明に従った組換えＤＮＡ技術によ
るｈＮＧＦの充分な近の産生は、アルツハイマー病（Ａ
Ｄ）におけるＮＧＦの潜在的な有用性をｆ’ｌｌするこ
とを可能ならしめる。
るバクロウイルス系において用いられる発現ベクターの
構築を記述する。本発明に従った組換えＤＮＡ技術によ
るｈＮＧＦの充分な近の産生は、アルツハイマー病（Ａ
Ｄ）におけるＮＧＦの潜在的な有用性をｆ’ｌｌするこ
とを可能ならしめる。
木刀Ｊト鳩１旬
本発明の一実態態様は、昆虫細胞類内で機能し得る制御
因子に対して適切な方向をもって結合されたヒト神経成
長囚イ（ｈＮＧＦ）またはその誘導体の遺伝子を有する
バクロウイルス転移ベクターである。好ましくは、ｈＮ
ＧＦをコードする該遺伝子は、先行配列とバクＵウイル
ス遺伝子のブＯモータとが組込まれたキメラ遺伝子であ
る。
因子に対して適切な方向をもって結合されたヒト神経成
長囚イ（ｈＮＧＦ）またはその誘導体の遺伝子を有する
バクロウイルス転移ベクターである。好ましくは、ｈＮ
ＧＦをコードする該遺伝子は、先行配列とバクＵウイル
ス遺伝子のブＯモータとが組込まれたキメラ遺伝子であ
る。
本発明の他の実施態様において、昆虫細胞内での生物学
的に活性なｈＮＧＦおよびその誘導体の製造方法が記述
されている。該方法は、ｈＮＧＦの該遺伝子をバク口ウ
ィルス転移ベクター中に挿入し、キメラ遺伝子を形成す
ることがらなる。該キメラ遺伝子は、次いでバク口ウィ
ルス内に組込まれ、次いで該組換えバク口ウルイスによ
り昆虫細胞の感染がなされる。該感染昆虫細胞は、好ま
しくは低または無血清培地中にて育生され、そして該使
用培養培地から生物学的に活性なｈＮＧＦが採取される
。
的に活性なｈＮＧＦおよびその誘導体の製造方法が記述
されている。該方法は、ｈＮＧＦの該遺伝子をバク口ウ
ィルス転移ベクター中に挿入し、キメラ遺伝子を形成す
ることがらなる。該キメラ遺伝子は、次いでバク口ウィ
ルス内に組込まれ、次いで該組換えバク口ウルイスによ
り昆虫細胞の感染がなされる。該感染昆虫細胞は、好ま
しくは低または無血清培地中にて育生され、そして該使
用培養培地から生物学的に活性なｈＮＧＦが採取される
。
本発明の更に他の実施態様においては、該生物学的に活
性なｈＮＧＦは、アルツハイマー病の治療において使用
される医薬組成物として調製される。
性なｈＮＧＦは、アルツハイマー病の治療において使用
される医薬組成物として調製される。
図面の概略的記載
第１図： ｈＮＧＦの成熟ベータυブユニットのアミノ
酸配列 第２図： ＤＡＣ３ ７３ｍｈＮＧＦブラスミドの構築 第３図：ｐＡｃＹＭｂＮＧＦブラスミドの構築第４図：
ウィルス感Ｓ１ｉＪ胞の上澄から精製されたｈＮＧＦの
ｍｔｉ色およびウ〕ニスタンプロット分析 第５図： ｐＡｃＹ２ＭｈＮＧＦ組換えバクロウイルス
感染細胞由来の培養液により処 理されたＰＣ１２ｌｌｌｌ１ｌ 第６図：軸索突起の成長により示される攻撃の比率 第７図：バクロウイルス産生ｈＮＧＦに帰因する生物学
的活性 第８図： ｈＮＧＦの投与を受けたラットにおける記憶
の低Ｆおよび思考力の減退 １１立止豊皇ヱ１ 本発明は、バクロウイルス発現系を用いて組換えｈＮＧ
Ｆおよびその誘導体を製造する手法を記述する。ｈＮＧ
Ｆ前駆体の配列をコードするＤＮＡをバクロウイルス発
現ベクター中に組込むことにより、生物学的に活性なｈ
ＧＮＦ分子が発現される。
酸配列 第２図： ＤＡＣ３ ７３ｍｈＮＧＦブラスミドの構築 第３図：ｐＡｃＹＭｂＮＧＦブラスミドの構築第４図：
ウィルス感Ｓ１ｉＪ胞の上澄から精製されたｈＮＧＦの
ｍｔｉ色およびウ〕ニスタンプロット分析 第５図： ｐＡｃＹ２ＭｈＮＧＦ組換えバクロウイルス
感染細胞由来の培養液により処 理されたＰＣ１２ｌｌｌｌ１ｌ 第６図：軸索突起の成長により示される攻撃の比率 第７図：バクロウイルス産生ｈＮＧＦに帰因する生物学
的活性 第８図： ｈＮＧＦの投与を受けたラットにおける記憶
の低Ｆおよび思考力の減退 １１立止豊皇ヱ１ 本発明は、バクロウイルス発現系を用いて組換えｈＮＧ
Ｆおよびその誘導体を製造する手法を記述する。ｈＮＧ
Ｆ前駆体の配列をコードするＤＮＡをバクロウイルス発
現ベクター中に組込むことにより、生物学的に活性なｈ
ＧＮＦ分子が発現される。
ｈＮＧＦの６誘導体“は、ｈＮＧＦと実質的に同じ活性
を有する分子を生ずるような様式、例えばアミノ酸の付
加、削除または置換によってｈＮＧＦとは異なる分子を
包含することを意味する。
を有する分子を生ずるような様式、例えばアミノ酸の付
加、削除または置換によってｈＮＧＦとは異なる分子を
包含することを意味する。
生物学的に活性なｈＮＧＦは、バクロウイルスＤＮＡの
ポリへドリンプロモータと先行配列とに連結されたブレ
ーブｏ−ｈＮＧＦ遺伝子からなるキメラ遺伝子を構築す
ることにより、バクロウイルス発現系において発現され
得る。バクロウイルスＤＮＡのブロモータおよび先行配
列を有するブラスミドの例は、Ｄ Ａ ｃ Ｙ Ｍ １
（ Ｂｉｓｈｏｐ， Ｄ．Ｈ．のｐＡｃ１０１ （米
国特許第４，７４５．５０１号） 、ｐＡＣ３７３ （
Ｓｍｉｔｈ， Ｇ．Ｅ．のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｅａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＩＩＳＡ． ８ ２ ： ８ ４ ０
４ （ １ ９８５）） 、およびｐＥ Ｖ ５ １
（ Ｒｉｃｅ， Ｗ．Ｃ．のＪＶｉｒｏｌ． 旦ユ
： １ ７１ ２ （１９８７））を含む。
ポリへドリンプロモータと先行配列とに連結されたブレ
ーブｏ−ｈＮＧＦ遺伝子からなるキメラ遺伝子を構築す
ることにより、バクロウイルス発現系において発現され
得る。バクロウイルスＤＮＡのブロモータおよび先行配
列を有するブラスミドの例は、Ｄ Ａ ｃ Ｙ Ｍ １
（ Ｂｉｓｈｏｐ， Ｄ．Ｈ．のｐＡｃ１０１ （米
国特許第４，７４５．５０１号） 、ｐＡＣ３７３ （
Ｓｍｉｔｈ， Ｇ．Ｅ．のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｅａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＩＩＳＡ． ８ ２ ： ８ ４ ０
４ （ １ ９８５）） 、およびｐＥ Ｖ ５ １
（ Ｒｉｃｅ， Ｗ．Ｃ．のＪＶｉｒｏｌ． 旦ユ
： １ ７１ ２ （１９８７））を含む。
本発明の好適な実施においては、該ｈＮＧＦ遺伝子は、
ブラスミドＤＡ Ｃ ＹＭ １に挿入される。
ブラスミドＤＡ Ｃ ＹＭ １に挿入される。
ｈＮＧＦの該コード配列は、例えば、既知のＤＮＡ配列
を利用した遺伝子の合成または当業者に知られている標
準的なクローニング技術の使用により、数種の供給源か
ら入手可能である。
を利用した遺伝子の合成または当業者に知られている標
準的なクローニング技術の使用により、数種の供給源か
ら入手可能である。
ｈＮＧＦコード配列を有するｃＤＮＡクローンは、既知
のｈＮＧＦ配列に基づいて特異的に設計されたオリゴヌ
クレオヂドハイプリダイゼーションプローブを使用する
ことにより同定され得る。
のｈＮＧＦ配列に基づいて特異的に設計されたオリゴヌ
クレオヂドハイプリダイゼーションプローブを使用する
ことにより同定され得る。
ｈＮＧＦコード配列を得た後、該配列は、ｐＡＣＹＭ１
等のバクロウイルスクローニングベクター中に挿入され
る。該クローニングベクターは、該コード配列の効率的
な転写、ｉ［および複写に要する適切な制御機能を与え
るように構築される。
等のバクロウイルスクローニングベクター中に挿入され
る。該クローニングベクターは、該コード配列の効率的
な転写、ｉ［および複写に要する適切な制御機能を与え
るように構築される。
本発明の一面において、ｈＮＧＦをＳ．フルジベルダ細
胞中で産生ずる組換えＤＮＡ分子は、バクロウイルス転
移ベクター中に挿入されたｈＮＧＦ前駆体のＤＮＡ’）
一ド配列を有している。
胞中で産生ずる組換えＤＮＡ分子は、バクロウイルス転
移ベクター中に挿入されたｈＮＧＦ前駆体のＤＮＡ’）
一ド配列を有している。
転移ベクターは、興味ある外来遺伝子が、ポリへドリン
ブロモータの下流に挿入され得るプラスミドを意味して
いる。更に、該転移ベクターは、天然型バクロウイルス
ゲノムと相同的な組換えが可能となるのに充分な量のポ
リヘドリン遺伝子配列を含み、かくして結果としてのウ
イルスは、興味ある外来遺伝子を、該ウイルスボリヘド
リンブロモー夕の制御下に合有Ｊる。
ブロモータの下流に挿入され得るプラスミドを意味して
いる。更に、該転移ベクターは、天然型バクロウイルス
ゲノムと相同的な組換えが可能となるのに充分な量のポ
リヘドリン遺伝子配列を含み、かくして結果としてのウ
イルスは、興味ある外来遺伝子を、該ウイルスボリヘド
リンブロモー夕の制御下に合有Ｊる。
該バクロウイルスプＯモータの使用によって、該成熟ｈ
Ｎ Ｇ Ｆ前駆体が発現され、次いで成熟ｈＮＧＦへ
加工される。次いで、該成熟ｔｌＮＧＦは、該組換えウ
イルスに感染した細胞から分泌される。
Ｎ Ｇ Ｆ前駆体が発現され、次いで成熟ｈＮＧＦへ
加工される。次いで、該成熟ｔｌＮＧＦは、該組換えウ
イルスに感染した細胞から分泌される。
本発１Ｊの好ましい実施において、前記相同的組換えに
おいて使用されるバクロウイルスは、ＡＣＮＰＶと命名
されたアウトグラファ カリフ等を含み、より一般的に
はヨーロッパ特許公開第０２２８０３６号に示されたも
のを含む。使用される特定のバクロウイルス系は、行な
われる遺伝子操作の種類により決定される。
おいて使用されるバクロウイルスは、ＡＣＮＰＶと命名
されたアウトグラファ カリフ等を含み、より一般的に
はヨーロッパ特許公開第０２２８０３６号に示されたも
のを含む。使用される特定のバクロウイルス系は、行な
われる遺伝子操作の種類により決定される。
該ｈＮＧＦ遺伝子は、メチオニン聞始コドンのひとつが
利用可能となるようにバクロウイルス転移ベクター中に
挿入される。該ｉ１ＮＯＦ遺伝子は、記述（Ｕｌｌｒｉ
ｃｈらのＣｏｌｄ Ｓ ｒｉｎ ＨａｒｂｏｒＳ ｍ
ｐｏｓｉａ ｏｎ Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．ＸＬＶＩ
Ｉ１， ｐ４ ３ ５ （ １９８３））によると、翻
訳開始コドンとして使用されていると思われるメチオニ
ンを−１２１および−１１９位置に有している（１位は
、成熟ｈＮＧＦのＮ一末端セリン残基を示している。第
１図参照）。対照的には、最も良く研究ざれてぎた神経
成艮因子であるマウスＮＧＦの顎下腺ｃＤＮＡは、−１
２１位と−１１９位とに加えて−１８７位にメチオニン
を有している。ヒトまたはマウスにおいて、とのコドン
が翻訳開始コドンとして機能しているかは明確でない。
利用可能となるようにバクロウイルス転移ベクター中に
挿入される。該ｉ１ＮＯＦ遺伝子は、記述（Ｕｌｌｒｉ
ｃｈらのＣｏｌｄ Ｓ ｒｉｎ ＨａｒｂｏｒＳ ｍ
ｐｏｓｉａ ｏｎ Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．ＸＬＶＩ
Ｉ１， ｐ４ ３ ５ （ １９８３））によると、翻
訳開始コドンとして使用されていると思われるメチオニ
ンを−１２１および−１１９位置に有している（１位は
、成熟ｈＮＧＦのＮ一末端セリン残基を示している。第
１図参照）。対照的には、最も良く研究ざれてぎた神経
成艮因子であるマウスＮＧＦの顎下腺ｃＤＮＡは、−１
２１位と−１１９位とに加えて−１８７位にメチオニン
を有している。ヒトまたはマウスにおいて、とのコドン
が翻訳開始コドンとして機能しているかは明確でない。
該マウスｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡを用いた研究は、
小麦胚抽出物を用いたインビト口での翻訳では、一・１
８７位のメチオニンにおいて翻訳が開始されることを示
している（ Ｅｄｗａｒｄｓらの、ムこの観察と一致し
て、顎下腺においては−１８７位メチオニンにて翻訳開
始が起こり得ることを示ｔＮＧＦ前駆体が、マウス顎下
腺から単離されている（ Ｓａｂｏｏｒ ｉおよびｖｏ
ｕｎａの、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２５ ： ５５６
５ （１ ９８６））。しかしながら、マウスにおいて
、少なくとも３種類の異なったＮ Ｇ Ｆ ｍ Ｒ
Ｎ Ａが産せられることも示されていル（Ｓｅｆｂｙら
（７）Ｈｏｌ．ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌ．
７ ： ３０５７ （１９８７））。この多様性は
、別のスブライシングおよび／または別のブロモータに
由来する独立した開始によるものとして説明される。
小麦胚抽出物を用いたインビト口での翻訳では、一・１
８７位のメチオニンにおいて翻訳が開始されることを示
している（ Ｅｄｗａｒｄｓらの、ムこの観察と一致し
て、顎下腺においては−１８７位メチオニンにて翻訳開
始が起こり得ることを示ｔＮＧＦ前駆体が、マウス顎下
腺から単離されている（ Ｓａｂｏｏｒ ｉおよびｖｏ
ｕｎａの、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２５ ： ５５６
５ （１ ９８６））。しかしながら、マウスにおいて
、少なくとも３種類の異なったＮ Ｇ Ｆ ｍ Ｒ
Ｎ Ａが産せられることも示されていル（Ｓｅｆｂｙら
（７）Ｈｏｌ．ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌ．
７ ： ３０５７ （１９８７））。この多様性は
、別のスブライシングおよび／または別のブロモータに
由来する独立した開始によるものとして説明される。
他のマウスＮ Ｇ Ｆ ｍ Ｒ Ｎ Ａ類が−１８７
位メチオニンを欠除していることから、−１２１位また
は−１１９位のメチオニンにおいても翻訳が開始され得
ることが推論されている（Ｓｅｌｂｙらの前出文献）。
位メチオニンを欠除していることから、−１２１位また
は−１１９位のメチオニンにおいても翻訳が開始され得
ることが推論されている（Ｓｅｌｂｙらの前出文献）。
該マウスＮＧＦ３１Ｉ伝子とは対照的に、ヒトＮＧＦ遺
伝子構造は、そこまでは特徴付けられてはいない。従っ
て、同様にどのメチオニンコドンが翻訳開始の為に使用
されているかについては明らかではない。我々は、ここ
で（例３に示されるように》翻訳開始が、バクロウイル
ス発現系においては−１２１位メチオニン［２−ＭＥＴ
位と命名される］にて最も効率的に起こり、その一方−
１１９位メチオニン［１−ＭＥＴ位と命名される］での
開始は、全く非効率的であることが示された。
伝子構造は、そこまでは特徴付けられてはいない。従っ
て、同様にどのメチオニンコドンが翻訳開始の為に使用
されているかについては明らかではない。我々は、ここ
で（例３に示されるように》翻訳開始が、バクロウイル
ス発現系においては−１２１位メチオニン［２−ＭＥＴ
位と命名される］にて最も効率的に起こり、その一方−
１１９位メチオニン［１−ＭＥＴ位と命名される］での
開始は、全く非効率的であることが示された。
本発明のバク１コウイルス発現系を用いた生物学的に活
性なｈＮＧＦの正しい発現および分泌は、ブローＮＧＦ
配列の存在を必要とすることもまた観察された。ブロー
配列を除去する試み、寸なわち（プレー）シグナル配列
の成熟ｈＮＧＦ配列に対する直接的なスプライシングは
、ｈＮＧＦの分泌を生じなかった。
性なｈＮＧＦの正しい発現および分泌は、ブローＮＧＦ
配列の存在を必要とすることもまた観察された。ブロー
配列を除去する試み、寸なわち（プレー）シグナル配列
の成熟ｈＮＧＦ配列に対する直接的なスプライシングは
、ｈＮＧＦの分泌を生じなかった。
本発明の好適な実施においては、ｈＮＧＦ遺伝子が転移
ベクター中に挿入され、ギメラ遺伝子が形成される。興
味ある外来遺伝子を含む転移ベクターと天然型バクロウ
イルスゲノムＤＮＡとによる細胞の共一感染によって、
ビリオンＤＮＡおよび該転移ベクターの間の相同的組換
えは、バクロウイルスボリヘドリン遺伝子中に挿入され
たキメラＮＧＦ遺伝子を含む組換えゲノムを生ずる。組
換えゲノムを含むウイルス類は、ブラーク精製によりク
ローン化され、発現ベクターとして使用される。該発現
ベクターに感染された昆虫細胞類は、低または無血清培
地中で育生され、ｈ Ｎ Ｇ Ｆ ｌｆｉ該使用された
培養培地から採取される。
ベクター中に挿入され、ギメラ遺伝子が形成される。興
味ある外来遺伝子を含む転移ベクターと天然型バクロウ
イルスゲノムＤＮＡとによる細胞の共一感染によって、
ビリオンＤＮＡおよび該転移ベクターの間の相同的組換
えは、バクロウイルスボリヘドリン遺伝子中に挿入され
たキメラＮＧＦ遺伝子を含む組換えゲノムを生ずる。組
換えゲノムを含むウイルス類は、ブラーク精製によりク
ローン化され、発現ベクターとして使用される。該発現
ベクターに感染された昆虫細胞類は、低または無血清培
地中で育生され、ｈ Ｎ Ｇ Ｆ ｌｆｉ該使用された
培養培地から採取される。
更に特定的には、ＩｈＮＧＦ遺伝子が組込まれた転移ベ
クターは、該ｈＮＧＦ遺伝子を有するブラスミドの修飾
により構築される。該ブラスミドは、ｈＮＧＦコード配
列の上流および下流の両方に都合のよい制限部位が組込
まれるように嵌飾される。この修飾は、合成アダプタの
使用により達成される。例えば、所望の制限部位を有す
る２種類のアダプタが合成される。第１の７ダブタ：５
゜ＧＧＧＧ＾ＴＣＣ＾＾八■＾ＴＧＴＣＣ＾ＴＧＴＴＧ
ＴＴＣＩＡＣＡＣＴＣＴ ３’および ５゜ ＧＡＴＣＡＧＡＧＴＧＩ八ＧＡＡＣＡ八Ｃ＾ＴＧ
ＧＡＣＡＴ＾ＩＴＴＧＧΔＴＣＣＣＣ３゜は、２つの０
■能な開始コドンのうちの第１のもの［２−ＭＥＴ位、
−１２１位、第１図参照］のすぐ上流にＢａｍｌ−４Ｉ
切断部位を有している。・一方、第２のアダプタ： ５’ＧＧＧＧＡＴＣＣ八＾ＡＴＡＴＧＴＴＧＴＴＣＴＡ
ＣＡＣＴＣＴ３’および５゜ＧＡ丁ＣＡＧ八ＧＴＧＴＡ
ＧＡＡＣＡＡＣＡＴＡＴＴＴＧＧＡＴＣＣＣＣ３’
は、 第２のメチオ一ン」ドン［１−ＭＥＴ位、−１１
９位、第１図参照１の次にυ１限部位を置いている。
クターは、該ｈＮＧＦ遺伝子を有するブラスミドの修飾
により構築される。該ブラスミドは、ｈＮＧＦコード配
列の上流および下流の両方に都合のよい制限部位が組込
まれるように嵌飾される。この修飾は、合成アダプタの
使用により達成される。例えば、所望の制限部位を有す
る２種類のアダプタが合成される。第１の７ダブタ：５
゜ＧＧＧＧ＾ＴＣＣ＾＾八■＾ＴＧＴＣＣ＾ＴＧＴＴＧ
ＴＴＣＩＡＣＡＣＴＣＴ ３’および ５゜ ＧＡＴＣＡＧＡＧＴＧＩ八ＧＡＡＣＡ八Ｃ＾ＴＧ
ＧＡＣＡＴ＾ＩＴＴＧＧΔＴＣＣＣＣ３゜は、２つの０
■能な開始コドンのうちの第１のもの［２−ＭＥＴ位、
−１２１位、第１図参照］のすぐ上流にＢａｍｌ−４Ｉ
切断部位を有している。・一方、第２のアダプタ： ５’ＧＧＧＧＡＴＣＣ八＾ＡＴＡＴＧＴＴＧＴＴＣＴＡ
ＣＡＣＴＣＴ３’および５゜ＧＡ丁ＣＡＧ八ＧＴＧＴＡ
ＧＡＡＣＡＡＣＡＴＡＴＴＴＧＧＡＴＣＣＣＣ３’
は、 第２のメチオ一ン」ドン［１−ＭＥＴ位、−１１
９位、第１図参照１の次にυ１限部位を置いている。
更に、例えば５“ｐＣＡＧΔＴＣＴＧ等の合成リンカー
が、好通な制限部位を導入するために１１ Ｎ Ｇ Ｆ
ｍ伝子の下流に挿入される。
が、好通な制限部位を導入するために１１ Ｎ Ｇ Ｆ
ｍ伝子の下流に挿入される。
他の実施例において、該ｈＮＧＦ３１！伝子を有するブ
ラスミドは、バクロウイルスボリヘドリン遺伝子ブロモ
ータの直ぐ下流に仲人されてもよく、これによって転写
開始のためにバクロウイルスボリヘドリンブロモータが
使用される。
ラスミドは、バクロウイルスボリヘドリン遺伝子ブロモ
ータの直ぐ下流に仲人されてもよく、これによって転写
開始のためにバクロウイルスボリヘドリンブロモータが
使用される。
メチオニン聞始］ドンを与える上記方法に加え、ＮＧＦ
Ｉｉ伝子のプレープロ部分が、マウス顎下腺ｃＤＮＡの
ものであり、一方成熟ＮＧＦをコードするＮＧＦの部分
がヒトＮＧＦ遺伝子配列（第１図）であるようなハイブ
リッドまたはキメラ遺伝子を構築するＣとも可能である
。このようなハイブリッドまたはキメラ遺伝子は、該マ
ウスブレ−ブＤＮＧＦ部分に存在Ｊる−１８７位メチオ
ニンにおける翻訳開始を可能的にｒＦ容し、一方成熟ｂ
Ｎ Ｇ Ｆの発現をもたらす。このようなキメラ遺伝
子は、正確に折り重ねられたか、あるいは翻訳後に加工
されたことが示された。該バクＤウイルス発現系を使用
して、このようなキメラ遺伝子は、生物学的に活性なｈ
ＮＧＦを生じた。
Ｉｉ伝子のプレープロ部分が、マウス顎下腺ｃＤＮＡの
ものであり、一方成熟ＮＧＦをコードするＮＧＦの部分
がヒトＮＧＦ遺伝子配列（第１図）であるようなハイブ
リッドまたはキメラ遺伝子を構築するＣとも可能である
。このようなハイブリッドまたはキメラ遺伝子は、該マ
ウスブレ−ブＤＮＧＦ部分に存在Ｊる−１８７位メチオ
ニンにおける翻訳開始を可能的にｒＦ容し、一方成熟ｂ
Ｎ Ｇ Ｆの発現をもたらす。このようなキメラ遺伝
子は、正確に折り重ねられたか、あるいは翻訳後に加工
されたことが示された。該バクＤウイルス発現系を使用
して、このようなキメラ遺伝子は、生物学的に活性なｈ
ＮＧＦを生じた。
上記した合成アダプタを用い、得られた転移ベクターは
、該ｈ Ｎ Ｇ Ｆ遺伝子が利用可能な２つのメチオニ
ン（ｎｅ ｔ ）開始コドンの１つに隣接して位置ずる
ように構築される。＠ｈＮＧＦの修飾配列は、例えばＤ
ＡＣＹＭ１等の適当なバクロウイルス転移ベクターに対
し、該ｈＮＧＦ遺伝子が適切な方向となるように連結さ
れる。得られるブラスミドは、バクロウイルスブＵモー
タを、可能なＮＧＦメチオニン開始コドンのひとつに近
隣して含んでいる。
、該ｈ Ｎ Ｇ Ｆ遺伝子が利用可能な２つのメチオニ
ン（ｎｅ ｔ ）開始コドンの１つに隣接して位置ずる
ように構築される。＠ｈＮＧＦの修飾配列は、例えばＤ
ＡＣＹＭ１等の適当なバクロウイルス転移ベクターに対
し、該ｈＮＧＦ遺伝子が適切な方向となるように連結さ
れる。得られるブラスミドは、バクロウイルスブＵモー
タを、可能なＮＧＦメチオニン開始コドンのひとつに近
隣して含んでいる。
このように構築された組換えバクロウイルス転移ベクタ
ーは、例えば制限酵素切斬部位についてのスクリーニン
グまたはこの分野で公知のＤＮＡ配列化技術によって選
択される。
ーは、例えば制限酵素切斬部位についてのスクリーニン
グまたはこの分野で公知のＤＮＡ配列化技術によって選
択される。
実施例中に記載された特定のベクターに加え、これら特
定のベクターの誘導体もまた特定的に包含されている。
定のベクターの誘導体もまた特定的に包含されている。
誘導体類は、発現可能な形態の該ｈＮＧＦ遺伝子の木質
的な役割に対して明らかな影費を与えることのない、酵
素制限部位等における修飾を含んでいる。
的な役割に対して明らかな影費を与えることのない、酵
素制限部位等における修飾を含んでいる。
−ａ該ｈＮＧＦ転移ブラスミドが選択された後は、咳キ
メラｈＮＧＦｍ伝子を含むブラスミドは、適当な昆虫宿
王１１１１泡中に該バクロウイルス性ＤＮＡと共に共−
トランスフエクトされ得る。このような宿主ＩｌｌＩＩ
１は、例えばＳ．フルジベルダ（好ましくは細胞株Ｓｆ
９、ＡＴＣＣ ｋＣＲＬ１７１１）、Ａ．カリフオル
ニノＪ１ヘリＡテイスゼアラルバ等であり得る。トラン
スフェクションは、ＷＡ単的な技術により実庫される。
メラｈＮＧＦｍ伝子を含むブラスミドは、適当な昆虫宿
王１１１１泡中に該バクロウイルス性ＤＮＡと共に共−
トランスフエクトされ得る。このような宿主ＩｌｌＩＩ
１は、例えばＳ．フルジベルダ（好ましくは細胞株Ｓｆ
９、ＡＴＣＣ ｋＣＲＬ１７１１）、Ａ．カリフオル
ニノＪ１ヘリＡテイスゼアラルバ等であり得る。トラン
スフェクションは、ＷＡ単的な技術により実庫される。
このような技術は、例えば、ウイルス性トランスフェク
ション、ＤＥＡＥ−デクストラン誘導ビノサイトシス、
リン酸力ノレシウム沈殿、および最近においては、リボ
フエクション（リボ感染》を含む。本発明の好適な実施
においては、トランスフェクションは、Ｆｅ１０ｎｅｒ
のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．υＳＡ８４
：７４１３ （１９８７）に記載されているように、リ
ボフエクション技術を用いて実施される。
ション、ＤＥＡＥ−デクストラン誘導ビノサイトシス、
リン酸力ノレシウム沈殿、および最近においては、リボ
フエクション（リボ感染》を含む。本発明の好適な実施
においては、トランスフェクションは、Ｆｅ１０ｎｅｒ
のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．υＳＡ８４
：７４１３ （１９８７）に記載されているように、リ
ボフエクション技術を用いて実施される。
トランスフェクションに続いて、該細胞は、培地中で育
生される。好ましくは３日または４日の後に、該使用ざ
れた上澄が採取され、゛償主細胞の融合性の単層上にブ
ラーク形成される。組換えウイルスを示す閉塞性負のプ
ラークが摘み採られ、更にプラーク精製される。
生される。好ましくは３日または４日の後に、該使用ざ
れた上澄が採取され、゛償主細胞の融合性の単層上にブ
ラーク形成される。組換えウイルスを示す閉塞性負のプ
ラークが摘み採られ、更にプラーク精製される。
発現のために好適な昆虫宿主細胞、好ましくはＳｆ９細
胞は、次いで、組換えウイルスにより好適には０．０１
から１０ブラーク形成単位／ｍ胞をもって感染され、引
き続き好ましくは低または無血清培地で育生される。培
養液は、好適には３から７日後に採取され、標準的な同
定試験、例えばＥＬＩＳＡおよびウエスタンプロット分
析等の免疫試験、またはＰＣ１２細胞分化（Ｇｒｅｅｎ
ｅ， Ｌ．八．のＴｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ
ヱニ９１ （１９８６） ）等の生物学的試験が行なわ
れる。
胞は、次いで、組換えウイルスにより好適には０．０１
から１０ブラーク形成単位／ｍ胞をもって感染され、引
き続き好ましくは低または無血清培地で育生される。培
養液は、好適には３から７日後に採取され、標準的な同
定試験、例えばＥＬＩＳＡおよびウエスタンプロット分
析等の免疫試験、またはＰＣ１２細胞分化（Ｇｒｅｅｎ
ｅ， Ｌ．八．のＴｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ
ヱニ９１ （１９８６） ）等の生物学的試験が行なわ
れる。
ブレーブローＮＧＦ前駆体の加水分解処理を増大させる
ため、上述した方法は、宿主細胞の他の組換えウイルス
類と共感染されることにより増強されてもよい。例えば
、Ｓ．′ノルジベルダにおけるプレープローｈＮＧＦの
加水分解処理は、該εエフルジベルダ細胞のｈＮＧＦの
ベータサブユニットおよびｍＮＧＦのガンマナブユニッ
トの遺伝子を含む組換えウイルス類による共一感染によ
って増強され得る。ｈＮＧＦのベータサブユニットと酵
ｆｆｌＫ Ｅ Ｘ ２遺伝子を含む組換えウイルス類ま
たはｈＮＧＦのベータサブユニットとヒト力リクレイン
プ口テアーゼの遺伝子を含む組換えウイルス類による共
一感染もまた有川である。
ため、上述した方法は、宿主細胞の他の組換えウイルス
類と共感染されることにより増強されてもよい。例えば
、Ｓ．′ノルジベルダにおけるプレープローｈＮＧＦの
加水分解処理は、該εエフルジベルダ細胞のｈＮＧＦの
ベータサブユニットおよびｍＮＧＦのガンマナブユニッ
トの遺伝子を含む組換えウイルス類による共一感染によ
って増強され得る。ｈＮＧＦのベータサブユニットと酵
ｆｆｌＫ Ｅ Ｘ ２遺伝子を含む組換えウイルス類ま
たはｈＮＧＦのベータサブユニットとヒト力リクレイン
プ口テアーゼの遺伝子を含む組換えウイルス類による共
一感染もまた有川である。
本発明の該ｈＮＧＦは、使用された培養培地から更に精
製され得る。標準的な蛋白質精製技術、例えば、イオン
交換クロマトグラフイー、逆相クロマトグラフイー、ア
フイニテイク０マトグラフイー、大きざ排除クロマトグ
ラフイー、等電点フオ一カシング等が採用され得る。
製され得る。標準的な蛋白質精製技術、例えば、イオン
交換クロマトグラフイー、逆相クロマトグラフイー、ア
フイニテイク０マトグラフイー、大きざ排除クロマトグ
ラフイー、等電点フオ一カシング等が採用され得る。
臨床的な使用のためには、ｈＮＧＦは医薬品グレードの
ｉＮＧＦを得るために史にｍＨされる。
ｉＮＧＦを得るために史にｍＨされる。
医薬品剤型は、ｈ Ｎ Ｇ Ｆの１投与単位が、アルツ
ハイマー病（ＡＤ）および他の神経性疾患の治療に有効
であるように、有効量のｈＮＧＦを適当な製薬学的担体
中に含んでなるであろう。
ハイマー病（ＡＤ）および他の神経性疾患の治療に有効
であるように、有効量のｈＮＧＦを適当な製薬学的担体
中に含んでなるであろう。
痴呆の最も一般的な型態である△Ｄの病理学は、多くの
神経系が関与し複雑である。△１〕脳において最も一致
した神経病理学的な知見は、中框コリン作働性ニューロ
ンの顕著な減損である（Ｈｙｇｌａｎらの、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２２５ ： １ １ ６８ − １ １ ７０
（ １ ９ ８ ４ ） ： Ｐｅａｒｓｏｎらの、Ｂ
ｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ２８９ ：３９５ （１９
８３）：Ｗ旧ｔｅｈｏｕｓｅらの、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２１５：１２３４ （１９８２））．この減損は、痴呆
の程度に関連しており（ Ｐａｒｒｙらの、Ｂｒｉｔｉ
ｓｈ Ｈｅｄ．Ｊｏｕｒｎａｌ ２ ： １ ４ ５
７ （ １ ９７８）） 、軸索突起ブラークの数に
定量的な相関がある。コリン作働性ニューロン欠損は、
海鳥回および皮質に向けて軸索突起を延ばす基底前脳核
（中央隔膜および神経核基底）の上Ｉ７Ｖ紅路を形成す
るニューロンに限定されて生ずる。これらの２つの領域
は、認識機能において特に重要である（ Ｈａｎｎらの
、Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒａ．Ｐｓ ｃｈ
ｉａｔｒｙ．±９ ：３１０ （１９８６）’）。これ
らのニューロンの減損は、皮質および海馬回の両者にお
いて顕著な脳委縮を生じ、ΔＤに特徴的な記憶欠損に対
して主要な寄与をするものと考えられている。
神経系が関与し複雑である。△１〕脳において最も一致
した神経病理学的な知見は、中框コリン作働性ニューロ
ンの顕著な減損である（Ｈｙｇｌａｎらの、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２２５ ： １ １ ６８ − １ １ ７０
（ １ ９ ８ ４ ） ： Ｐｅａｒｓｏｎらの、Ｂ
ｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ２８９ ：３９５ （１９
８３）：Ｗ旧ｔｅｈｏｕｓｅらの、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２１５：１２３４ （１９８２））．この減損は、痴呆
の程度に関連しており（ Ｐａｒｒｙらの、Ｂｒｉｔｉ
ｓｈ Ｈｅｄ．Ｊｏｕｒｎａｌ ２ ： １ ４ ５
７ （ １ ９７８）） 、軸索突起ブラークの数に
定量的な相関がある。コリン作働性ニューロン欠損は、
海鳥回および皮質に向けて軸索突起を延ばす基底前脳核
（中央隔膜および神経核基底）の上Ｉ７Ｖ紅路を形成す
るニューロンに限定されて生ずる。これらの２つの領域
は、認識機能において特に重要である（ Ｈａｎｎらの
、Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒａ．Ｐｓ ｃｈ
ｉａｔｒｙ．±９ ：３１０ （１９８６）’）。これ
らのニューロンの減損は、皮質および海馬回の両者にお
いて顕著な脳委縮を生じ、ΔＤに特徴的な記憶欠損に対
して主要な寄与をするものと考えられている。
これらの神経化学的欠損に基づき、種々のＡＤの治療方
法が行なわれ、最近において最も有力なものは、アセヂ
ルコリンエステラーゼ阻害剤である経口フイソスチグミ
ン（ ｐｈ’ｙｓＯｓｔｉＱｌｉｎｅ ’）である。フ
イソスチグミンの経皮投与は、ある種のＡＤ患者におい
て認識機能の改善を示した（ＨｏｈＳらの、Ａｍ．Ｊ．
Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １ ４ ２ ： ２ ８ （
１ ９ ８５ ） 、Ｄａｖｉｓらの、Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ Ｊ．Ｈｅｄ． ３ ０ ８ ：７ ２
１ （ １ ９ ８ ３ ） ： Ｃｈｒｉｓｔｉ
ｅらの、Ｂｒ． Ｊ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １ ３
８ ： ４６ （ １ ９８ １ ） ）が、その臨床
的使用は、その半減期の短かさ故に限定されている。向
神経性因子である神経成長囚了の、特にコリン作働性ニ
ューロン退化の防止および神１０９ （１９８３））の
両者のための使用は、最近ＡＤ治療の新たな手がかりと
して示唆ざれている。ｌｌＯｆｔｉのＡｎｎ．Ｎｅｕｒ
ｏｌ． ２ ０ ： ２ ７ ５ （ １ ９８６
）も参照。
法が行なわれ、最近において最も有力なものは、アセヂ
ルコリンエステラーゼ阻害剤である経口フイソスチグミ
ン（ ｐｈ’ｙｓＯｓｔｉＱｌｉｎｅ ’）である。フ
イソスチグミンの経皮投与は、ある種のＡＤ患者におい
て認識機能の改善を示した（ＨｏｈＳらの、Ａｍ．Ｊ．
Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １ ４ ２ ： ２ ８ （
１ ９ ８５ ） 、Ｄａｖｉｓらの、Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ Ｊ．Ｈｅｄ． ３ ０ ８ ：７ ２
１ （ １ ９ ８ ３ ） ： Ｃｈｒｉｓｔｉ
ｅらの、Ｂｒ． Ｊ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １ ３
８ ： ４６ （ １ ９８ １ ） ）が、その臨床
的使用は、その半減期の短かさ故に限定されている。向
神経性因子である神経成長囚了の、特にコリン作働性ニ
ューロン退化の防止および神１０９ （１９８３））の
両者のための使用は、最近ＡＤ治療の新たな手がかりと
して示唆ざれている。ｌｌＯｆｔｉのＡｎｎ．Ｎｅｕｒ
ｏｌ． ２ ０ ： ２ ７ ５ （ １ ９８６
）も参照。
ＮＧＦの役割は、第１には、Ｗ椎末梢交感および神経稜
一誘導知覚神経の特異的な機能の発達Ｌ１３よび維持を
ｌＩｌｊ御することに帰する（ Ｌｅｖ−Ｈｏｎｔａｌ
ｃｉｎｉおよびＡｎｇｅｌｅｔｉのＰｈｙｓｉｏｌ．Ｒ
ｅｖ． ４ ８ ：５３４ （１９８６））。より最
近においては、ＮＧＦは、基底前脳におｌノる上界コリ
ン作働性ニューロンの栄養作用を有することも確立され
た。
一誘導知覚神経の特異的な機能の発達Ｌ１３よび維持を
ｌＩｌｊ御することに帰する（ Ｌｅｖ−Ｈｏｎｔａｌ
ｃｉｎｉおよびＡｎｇｅｌｅｔｉのＰｈｙｓｉｏｌ．Ｒ
ｅｖ． ４ ８ ：５３４ （１９８６））。より最
近においては、ＮＧＦは、基底前脳におｌノる上界コリ
ン作働性ニューロンの栄養作用を有することも確立され
た。
ＮＧＦ，そのＲＮＡ転写物およびレセブター類は、これ
らの前脳コリン作働性ニューロンにより刺激を受ける海
馬回および皮質領域に高水準で存在している（Ｋｏｒｃ
ｈｉｎａらの、ＥＨＢＯ Ｊ． ４ ： １ ３８９
（１９８５） ：Ｒｉｏｏｃｌｌｃらの、Ｐｒｏｃ．
ＳｏｃＮｅｕｒｏｓｃｉ １１ ： １０５６（１９
８５） ；８３ ： ２７１４ （１９８６））。コリ
ン作働性二ユーロントのＮＧＦレセブターの刺徴は、線
条および基底萌脳核におけるコリンアセチルトランスフ
エラーゼ（ｃｈ八Ｔ）活性の増大を生じる（Ｈｏｂｌｅ
ｙらのＨｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ３ ８ ７
： ５ ３ （ １９８５）；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
２９：２８４ （１９８５））。
らの前脳コリン作働性ニューロンにより刺激を受ける海
馬回および皮質領域に高水準で存在している（Ｋｏｒｃ
ｈｉｎａらの、ＥＨＢＯ Ｊ． ４ ： １ ３８９
（１９８５） ：Ｒｉｏｏｃｌｌｃらの、Ｐｒｏｃ．
ＳｏｃＮｅｕｒｏｓｃｉ １１ ： １０５６（１９
８５） ；８３ ： ２７１４ （１９８６））。コリ
ン作働性二ユーロントのＮＧＦレセブターの刺徴は、線
条および基底萌脳核におけるコリンアセチルトランスフ
エラーゼ（ｃｈ八Ｔ）活性の増大を生じる（Ｈｏｂｌｅ
ｙらのＨｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ３ ８ ７
： ５ ３ （ １９８５）；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
２９：２８４ （１９８５））。
ＮＧＦが基底前脳神経に対して栄養作用を右ずることに
ついての最も得心のゆく証凰は、多分＝（ａ）ラットに
おける中隔海馬回経路に対するＩｆに続き、内因性ＮＧ
Ｆの劇的な増大があること（ ＧａＳＳｅｒらの、Ｂｒ
ａｉｎＲｃｓ． ３７６：３５ｉ （１９８６）’
）および、（ｂ）ＮＧＦは、縁のり所に続く隔膜コリン
作動性ニューロンの生存を促し、かつ認識損傷をなくす
こと（ Ｇａｇｅらの、Ｌ収ｖ、Ｗｉ１１ｉａｉｓらの
、ＰｒＯＣ．Ｍａｔｌ．＾ｃａｄ．ｓｃｉ．ＵｓＡ
８ ３ ：９２３１ （１９８６））である。これらの
観察に基づくと、ＡＤにおいて観察されるコリン作働性
ニューロンの滅失は、これらのニューロンを維持するた
めに充分な量のＮＧＦを合成することについての脳標的
組織の失敗の結果であろう可能性がある。選択的には、
それは、コリン作働性ニューロンのＮＧＦに対する応答
における異常性、すなわちレセプターの異常性を反映す
るであろう。
ついての最も得心のゆく証凰は、多分＝（ａ）ラットに
おける中隔海馬回経路に対するＩｆに続き、内因性ＮＧ
Ｆの劇的な増大があること（ ＧａＳＳｅｒらの、Ｂｒ
ａｉｎＲｃｓ． ３７６：３５ｉ （１９８６）’
）および、（ｂ）ＮＧＦは、縁のり所に続く隔膜コリン
作動性ニューロンの生存を促し、かつ認識損傷をなくす
こと（ Ｇａｇｅらの、Ｌ収ｖ、Ｗｉ１１ｉａｉｓらの
、ＰｒＯＣ．Ｍａｔｌ．＾ｃａｄ．ｓｃｉ．ＵｓＡ
８ ３ ：９２３１ （１９８６））である。これらの
観察に基づくと、ＡＤにおいて観察されるコリン作働性
ニューロンの滅失は、これらのニューロンを維持するた
めに充分な量のＮＧＦを合成することについての脳標的
組織の失敗の結果であろう可能性がある。選択的には、
それは、コリン作働性ニューロンのＮＧＦに対する応答
における異常性、すなわちレセプターの異常性を反映す
るであろう。
ＡＤの病理学において異常なＮＧＦ応答が関与していな
いとしても、ＮＧＦは、コリン作働性ニューロンの急化
を遅れさせ、または防止し、および／または残るニュー
ロンのＣ ｈ Ａ ”ｒ活性の増大において、なお有用
である。
いとしても、ＮＧＦは、コリン作働性ニューロンの急化
を遅れさせ、または防止し、および／または残るニュー
ロンのＣ ｈ Ａ ”ｒ活性の増大において、なお有用
である。
ＡＤ治療に対して有効な医薬組成物は、特異的な最終的
用途に依存する種々の経路のいずれかによって投与され
る。最も好ましい経路は、用途および関与する患者に依
存するであろう。
用途に依存する種々の経路のいずれかによって投与され
る。最も好ましい経路は、用途および関与する患者に依
存するであろう。
正確な投与量および投与回数は、治療される患者の要求
および苦悩の程度に依存するであろう。
および苦悩の程度に依存するであろう。
効果的な医薬組成物を得るための蛋白質の製剤化方法は
、当業者に知られている。
、当業者に知られている。
好ましくは、該組成物は殺菌溶液であろう。好ましくは
、それはカニューレにより脳内に腔内的な連続注入によ
り投与されるであろう．該カニューレは、好ましくは小
型ボンブに連結され得る。
、それはカニューレにより脳内に腔内的な連続注入によ
り投与されるであろう．該カニューレは、好ましくは小
型ボンブに連結され得る。
このような小型ポンプは、皮下に挿入され得て、かつ薬
剤の多量の貯Ｒ（数週問または数ケ月間に充分な》を保
持し得る。治療は、好ましくは数週または数ケ月の長期
間に亘る。好ましい投与量の割合は、脳内に１日あたり
０．１から１００μ９ｈＮＧＦの範囲が予想され、より
好ましくは２．５−５μｇ／日である。考えられるとこ
ろでは、該組成物は別法として脊髄中に投与され得る。
剤の多量の貯Ｒ（数週問または数ケ月間に充分な》を保
持し得る。治療は、好ましくは数週または数ケ月の長期
間に亘る。好ましい投与量の割合は、脳内に１日あたり
０．１から１００μ９ｈＮＧＦの範囲が予想され、より
好ましくは２．５−５μｇ／日である。考えられるとこ
ろでは、該組成物は別法として脊髄中に投与され得る。
この投与経路によると、より多量の投与最が必要であろ
う。
う。
本発明は、ｈＮＧＦの高取率を与える点において特に優
れており、かくしてその性質の適切な評価を可能として
いる。収率は、好ましくは培養液について５μｇ／Ｉｄ
の程度、好適には１０μｇ／一である。
れており、かくしてその性質の適切な評価を可能として
いる。収率は、好ましくは培養液について５μｇ／Ｉｄ
の程度、好適には１０μｇ／一である。
以下の例は、記述的なものであって、本発明を制限する
ものではない。別途特定されない限り、遺伝子操作にお
いて用いたすべてのＭ素は、商業的な供給者より得られ
たもので、実質的に製造者の指示に基づいて使用された
。クローン化処理は、特に記さない限り、Ｈａｎｉａｔ
ｉｓらの、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎａ， Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｌｎｏ Ｉｌａｒｂｏｒ ｔａｂＯｒａｔ
ｏｒｙ， １ ９８２により記述されているようにして
実質的に行なわれた。
ものではない。別途特定されない限り、遺伝子操作にお
いて用いたすべてのＭ素は、商業的な供給者より得られ
たもので、実質的に製造者の指示に基づいて使用された
。クローン化処理は、特に記さない限り、Ｈａｎｉａｔ
ｉｓらの、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎａ， Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｌｎｏ Ｉｌａｒｂｏｒ ｔａｂＯｒａｔ
ｏｒｙ， １ ９８２により記述されているようにして
実質的に行なわれた。
例 １
ヒトベータ神経成長囚 遺伝子の単離
ヒト白血球ゲノムライブラリー（クローニングベクター
：ラムダＥＭＢＬ−３を用いて構築ざれている）は、Ｃ
ｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．
（バＯアルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ） 、カリフォ
ルニア州）から購入した。約１ ． ５ Ｘ １ ０６
ｐ．ｒ．ｕ．の組換えファ−ジが、Ｅ．ｃｏｊｉ Ｌ
Ｅ３９２細朧［Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．のＥｘｐｅｒ
ｔｍｅｒｒｔｓ ｗｉｔｈ ＧｅｎｅＦｕｓｉｏｎ，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｌｌａｒｂｏｒ ｔａｂ
ｏｒａｔＯｒｙ，Ｘｉ−ｘｉ１頁（１９８４）］を０．
０１倍の感染をもって感染させるために用いられた．３
７℃にて２０分聞の吸収の後に、感染細胞は、０．７％
の軟質寒天で希釈され、１２の新鮮なルリアブロス（
Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ （ Ｌ Ｂ ） ）プレー
ト（１５０１Ｍ）上に塗布された。３７℃にて６時間の
後、該プレートは培養器から取出され、一夜冷蔵ざれた
。次いで、該ファージＯ−ンは、２片のニトロセルロー
スフィルター（ＢＡ８５／２０ ０．４５ｓ、Ｓｃｈ
ｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）により順次
覆われた。
：ラムダＥＭＢＬ−３を用いて構築ざれている）は、Ｃ
ｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．
（バＯアルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ） 、カリフォ
ルニア州）から購入した。約１ ． ５ Ｘ １ ０６
ｐ．ｒ．ｕ．の組換えファ−ジが、Ｅ．ｃｏｊｉ Ｌ
Ｅ３９２細朧［Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．のＥｘｐｅｒ
ｔｍｅｒｒｔｓ ｗｉｔｈ ＧｅｎｅＦｕｓｉｏｎ，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｌｌａｒｂｏｒ ｔａｂ
ｏｒａｔＯｒｙ，Ｘｉ−ｘｉ１頁（１９８４）］を０．
０１倍の感染をもって感染させるために用いられた．３
７℃にて２０分聞の吸収の後に、感染細胞は、０．７％
の軟質寒天で希釈され、１２の新鮮なルリアブロス（
Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ （ Ｌ Ｂ ） ）プレー
ト（１５０１Ｍ）上に塗布された。３７℃にて６時間の
後、該プレートは培養器から取出され、一夜冷蔵ざれた
。次いで、該ファージＯ−ンは、２片のニトロセルロー
スフィルター（ＢＡ８５／２０ ０．４５ｓ、Ｓｃｈ
ｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）により順次
覆われた。
次いで該ニトロセルロースフィルターは、アルカリ変性
され（０．５Ｍ ＮａＯＨ１１．５ＭＮａＣｊ！によ
り１５分間）、中性化され（０．５ＭトリスＨＣ１、Ｉ
）１１８．０および１．５ＭＮａＣＩにて１５分間）、
洗浄され（６ＸＳＳＣ（塩、クエン酸ナトリウム）にて
１５分間）、そして８０℃にて２分間焼成された。ハイ
ブリダイゼーションに先立ち、該フィルターは、プレー
ハイブリダイゼーション溶＠（６ＸＳＳＣ、０．１％Ｓ
ＤＳ， ５Ｘデンハルト溶液、１ ｍＨ Ｅ Ｄ Ｔ
Ａ、１００ｍμ／ｄサウ゛精子ＤＮＡ，１００ｍμ／
ｌｄ醇母ｔＲＮＡおよび０．０５％Ｎａビロリンｍ塩》
により６５℃にて１６時間処理された。３２Ｐ標識《ニ
ツクートランスレーションによる、比活性３ｘｉ ０８
ｃｐｓ ／μｙ＞ マウスベーターＮＧＦｃ Ｄ Ｎ
Ａ （ Ｗ．Ｒｕｔｔｅｒ博士からの寄贈、Ｎａｔｕｒ
ｅ ３０２ ：５３８ （１９８３））が、次いで該二
トロ口ルＤ一スフィルターに添加され、モしてハイプリ
ダイゼーション（６ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ．２％１
１５２ ｌｉｆｔ 乳、１＋ｌ４ ＥＤＴＡ，０．０
５％ＮａビロリンＦｉｌｌ塩、１００μｇ／ｍ硫酸デク
ストラン》が６５℃にて１６時間行なわれた。次いで、
該フィルターは、２ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳにて２回
、０．６ＸＳＳＧ．０．１％ＳＤＳにて１回（それぞれ
１０分闇》洗浄された。該フィルターは、空気乾燥され
、そして−７０℃にてＸ−線フイルムに嘔ざれた。
され（０．５Ｍ ＮａＯＨ１１．５ＭＮａＣｊ！によ
り１５分間）、中性化され（０．５ＭトリスＨＣ１、Ｉ
）１１８．０および１．５ＭＮａＣＩにて１５分間）、
洗浄され（６ＸＳＳＣ（塩、クエン酸ナトリウム）にて
１５分間）、そして８０℃にて２分間焼成された。ハイ
ブリダイゼーションに先立ち、該フィルターは、プレー
ハイブリダイゼーション溶＠（６ＸＳＳＣ、０．１％Ｓ
ＤＳ， ５Ｘデンハルト溶液、１ ｍＨ Ｅ Ｄ Ｔ
Ａ、１００ｍμ／ｄサウ゛精子ＤＮＡ，１００ｍμ／
ｌｄ醇母ｔＲＮＡおよび０．０５％Ｎａビロリンｍ塩》
により６５℃にて１６時間処理された。３２Ｐ標識《ニ
ツクートランスレーションによる、比活性３ｘｉ ０８
ｃｐｓ ／μｙ＞ マウスベーターＮＧＦｃ Ｄ Ｎ
Ａ （ Ｗ．Ｒｕｔｔｅｒ博士からの寄贈、Ｎａｔｕｒ
ｅ ３０２ ：５３８ （１９８３））が、次いで該二
トロ口ルＤ一スフィルターに添加され、モしてハイプリ
ダイゼーション（６ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ．２％１
１５２ ｌｉｆｔ 乳、１＋ｌ４ ＥＤＴＡ，０．０
５％ＮａビロリンＦｉｌｌ塩、１００μｇ／ｍ硫酸デク
ストラン》が６５℃にて１６時間行なわれた。次いで、
該フィルターは、２ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳにて２回
、０．６ＸＳＳＧ．０．１％ＳＤＳにて１回（それぞれ
１０分闇》洗浄された。該フィルターは、空気乾燥され
、そして−７０℃にてＸ−線フイルムに嘔ざれた。
正のハイブリダイゼーション信号を与えたファ−ジブラ
ークを摘探り、サブクローニングおよびハイプリダイゼ
ーションの２種の付加的なラウンドに供した。ハイブリ
ダイゼーションの第３のラウンドの間に、ヒトＮＧＦ遺
伝子 （５゜ＧＡＧＧＴＧＡＡＣＡＴＴＡＡＣＡＡＣＡＧＴＧ
ＴＡＴＴＣＡ３゜）に対して相補的な末ｒａｍ”ａ合成
オリゴヌクレオチド《２８吊休》もハイブリダイゼーシ
ョンブローブとして用いられた。正のファージから調製
されたＤＮＡ類は、制限酵素消化およびニツクートラン
スレーションによるマウスベーターＮＧＦ ｃＤＮＡ
または前述した合成オリゴヌクレオチドのいずれかをブ
Ｏ−ブとして使用するサザンブロット分析により特徴付
けがなされた。予想された大きさ（ＢＱｊ！ｌ［、Ｅｃ
ｏＲＩＪ５よびＨ ｉ ｎ ｄ ＩＩ断片について、そ
れぞれ１．８、５．７および４．４ｋｂ）のハイブリッ
ド化断片を生ずるファージが選択された。プレーブロヒ
トベータ−ＮＧＦサブユニットの全コード配列を含む１
．８ｋｂＢｇＪ■断片は、該ファージＤＮＡから切取ら
れ、ｐＬｌｃ８（Ｂｅｔｈｃｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
ｔａｂｏｒａｔｏｒｔｃｓ，ガイテルスブルグ、メリ
ーランド、米国）プラスミドベクター中に転移ざれた（
互換性の３ａｍｌ−ＩＩ部位を介して）。結果としての
ブラスミドは、ｐｈＮＧＦ＃５と命名した。
ークを摘探り、サブクローニングおよびハイプリダイゼ
ーションの２種の付加的なラウンドに供した。ハイブリ
ダイゼーションの第３のラウンドの間に、ヒトＮＧＦ遺
伝子 （５゜ＧＡＧＧＴＧＡＡＣＡＴＴＡＡＣＡＡＣＡＧＴＧ
ＴＡＴＴＣＡ３゜）に対して相補的な末ｒａｍ”ａ合成
オリゴヌクレオチド《２８吊休》もハイブリダイゼーシ
ョンブローブとして用いられた。正のファージから調製
されたＤＮＡ類は、制限酵素消化およびニツクートラン
スレーションによるマウスベーターＮＧＦ ｃＤＮＡ
または前述した合成オリゴヌクレオチドのいずれかをブ
Ｏ−ブとして使用するサザンブロット分析により特徴付
けがなされた。予想された大きさ（ＢＱｊ！ｌ［、Ｅｃ
ｏＲＩＪ５よびＨ ｉ ｎ ｄ ＩＩ断片について、そ
れぞれ１．８、５．７および４．４ｋｂ）のハイブリッ
ド化断片を生ずるファージが選択された。プレーブロヒ
トベータ−ＮＧＦサブユニットの全コード配列を含む１
．８ｋｂＢｇＪ■断片は、該ファージＤＮＡから切取ら
れ、ｐＬｌｃ８（Ｂｅｔｈｃｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
ｔａｂｏｒａｔｏｒｔｃｓ，ガイテルスブルグ、メリ
ーランド、米国）プラスミドベクター中に転移ざれた（
互換性の３ａｍｌ−ＩＩ部位を介して）。結果としての
ブラスミドは、ｐｈＮＧＦ＃５と命名した。
例 ２
ｐＡＣ３７３ｍｈＮＧＦの調製
ＤＡＣ３ ７３ｍｈＮＧＦの構築は、多段階工程であっ
た（第２図）。概略的には、該構築は、キメラＮＧＦ遺
伝子のベクターｃｌｃｓ中への最初の組立てに関し、こ
こで該ＮＧＦキメラの５′末端は、マウス顎下腺ＮＧＦ
ｃＤＮＡからなり、該キメラの３′末端は、ヒトＮ
ＧＦの成熟配列をコードするヒトゲノムＤＮＡの断片か
らなる。
た（第２図）。概略的には、該構築は、キメラＮＧＦ遺
伝子のベクターｃｌｃｓ中への最初の組立てに関し、こ
こで該ＮＧＦキメラの５′末端は、マウス顎下腺ＮＧＦ
ｃＤＮＡからなり、該キメラの３′末端は、ヒトＮ
ＧＦの成熟配列をコードするヒトゲノムＤＮＡの断片か
らなる。
ポリへドロン遺伝子ブロモータの直下流に特異的なＢａ
ｍＨ王部位を有し、ポリヘドリン構造遺伝子内部に特異
的なＫｐｍＩ部位をｈするバクロウイルストランスフエ
クシコンブラスミドρＡＣ３ ７ ３ （Ｓｇ＋
ｉｔｈ． Ｇ．Ｅ． のＰｒＯＣ．Ｎａｔｌ．＾ｃ
ａｄ．ｓｃｉ．ＬＩＳＡ． ８２：８４０４（１９８
５）Ｈ；ｔ、アタプタをＢ ａ ｍ Ｈ ＩおよびＫ
ｏ ｎ Ｉ ｔＩｌｌ限部位に連結することにより、該
ＮＧＦキメラを受け入れるために！！篩され、該アダプ
タは、特異的なＳｍａＩおよびｐｓｔｊ制限部位を含ん
でいた。次いで、該キメラマウス／ヒトＮＧＦ遺伝子は
、ｌＤＬＩｃ８ベクターからＳｍａＩからＰｓｔＩまで
の断片として切取られ、そして該ＳｍａＩおよびＰｓｔ
Ｉ制限部位を介してｖｉ（ＩＩＤＡＣ３７３ベクター中
に挿入された。
ｍＨ王部位を有し、ポリヘドリン構造遺伝子内部に特異
的なＫｐｍＩ部位をｈするバクロウイルストランスフエ
クシコンブラスミドρＡＣ３ ７ ３ （Ｓｇ＋
ｉｔｈ． Ｇ．Ｅ． のＰｒＯＣ．Ｎａｔｌ．＾ｃ
ａｄ．ｓｃｉ．ＬＩＳＡ． ８２：８４０４（１９８
５）Ｈ；ｔ、アタプタをＢ ａ ｍ Ｈ ＩおよびＫ
ｏ ｎ Ｉ ｔＩｌｌ限部位に連結することにより、該
ＮＧＦキメラを受け入れるために！！篩され、該アダプ
タは、特異的なＳｍａＩおよびｐｓｔｊ制限部位を含ん
でいた。次いで、該キメラマウス／ヒトＮＧＦ遺伝子は
、ｌＤＬＩｃ８ベクターからＳｍａＩからＰｓｔＩまで
の断片として切取られ、そして該ＳｍａＩおよびＰｓｔ
Ｉ制限部位を介してｖｉ（ＩＩＤＡＣ３７３ベクター中
に挿入された。
ｐｍＮＧＦと称されるブラスミドは、カリフォルニア州
９４３０５、スタンフォード、スタンフォード大学薬学
部、神経生物学科のＥｒｉｃ ｓｈｏｏｔｅｒ博士から
得た。ブラスミドｐｍＮＧＦは、ＳｃｏｔｔらのＮａｔ
ｕｒｅ ３０２：５３８（１９８３）に記載されたマ
ウスＮＧＦ前駆体（プレブロマウスＮＧＦ）をコードす
るマウス顎下腺ｃＤＮＡのＳｍａＩからｐｓｔ’ｉまで
の９６１塩基対断片からなり、ベクターＤＧＥＭＩ （
Ｐｒ０１ｅ（ｌａ ，ミドルトン、ウイスコンシン、米
国）中に、Ｓｍａ１およびｐｓｔＩ制限部位を介してサ
ブクローン化されている。
９４３０５、スタンフォード、スタンフォード大学薬学
部、神経生物学科のＥｒｉｃ ｓｈｏｏｔｅｒ博士から
得た。ブラスミドｐｍＮＧＦは、ＳｃｏｔｔらのＮａｔ
ｕｒｅ ３０２：５３８（１９８３）に記載されたマ
ウスＮＧＦ前駆体（プレブロマウスＮＧＦ）をコードす
るマウス顎下腺ｃＤＮＡのＳｍａＩからｐｓｔ’ｉまで
の９６１塩基対断片からなり、ベクターＤＧＥＭＩ （
Ｐｒ０１ｅ（ｌａ ，ミドルトン、ウイスコンシン、米
国）中に、Ｓｍａ１およびｐｓｔＩ制限部位を介してサ
ブクローン化されている。
１０マイクログラムのｐｍＮＧＦを、制限エンドヌクレ
７−ゼＥ ｃ ｏ Ｒ Ｉ （ Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用い、供
給者の勧める条件を用いて消化した。ＥｃｏＲ Ｉ切Ｉ
ＤＮＡを、次いでＰ ｓ ｔ Ｉ （ Ｂｅｔｈｃｓｄ
ａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を
用いて供給者の勧めに従って切断した。該消隼ＤＮＡ断
片を、０．７％アガロースゲル上での電気泳動により分
離し、約ｉ，ｏｏｏ塩基対断片を該ゲルからｏｒｃｔｚ
ｃｎらのＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｌ． １ １２ ：
２９５＜１９８１）によるＤＥＡＥ二１一口セルロース
法で回収した。回収された約０．５マイクログラムのＥ
Ｃ Ｏ Ｒ ＩからＰＳｔｌまでの断片を、ｖ１限エ
ンドヌクレアーゼＸ ｈ Ｏ ＩＩ （ Ｈｅｍ Ｅｎ
ｇｌａｎｄＢｉＯｌａｂＳ， ウオノレサム、冫サチ
ューサツ、米国）により供給者の勧める条に１を用いて
更に消化した。
７−ゼＥ ｃ ｏ Ｒ Ｉ （ Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用い、供
給者の勧める条件を用いて消化した。ＥｃｏＲ Ｉ切Ｉ
ＤＮＡを、次いでＰ ｓ ｔ Ｉ （ Ｂｅｔｈｃｓｄ
ａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を
用いて供給者の勧めに従って切断した。該消隼ＤＮＡ断
片を、０．７％アガロースゲル上での電気泳動により分
離し、約ｉ，ｏｏｏ塩基対断片を該ゲルからｏｒｃｔｚ
ｃｎらのＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｌ． １ １２ ：
２９５＜１９８１）によるＤＥＡＥ二１一口セルロース
法で回収した。回収された約０．５マイクログラムのＥ
Ｃ Ｏ Ｒ ＩからＰＳｔｌまでの断片を、ｖ１限エ
ンドヌクレアーゼＸ ｈ Ｏ ＩＩ （ Ｈｅｍ Ｅｎ
ｇｌａｎｄＢｉＯｌａｂＳ， ウオノレサム、冫サチ
ューサツ、米国）により供給者の勧める条に１を用いて
更に消化した。
該消化ＤＮＡを、フェノール抽出し、エタノール沈殿さ
せ、乾燥させそして無菌の蒸留水中にマイクロリットル
中５０ナノグラムの濃度で懸濁させた。
せ、乾燥させそして無菌の蒸留水中にマイクロリットル
中５０ナノグラムの濃度で懸濁させた。
２分の１マイクログラムのブラスミドｐＵｃ８を、Ｂ
ａ ｍ Ｈ Ｉ （ Ｂｃｔｈｃｓｄａ ＲＯＳＱａｒ
Ｃｈｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により供給者の勧める
条件を用いて消化した。該Ｂａｍｌ−ＩＩ切１１ｉＤＮ
Ａを、史に制限エンドヌクレアーゼＥＣＯＲＩにより切
断した。
ａ ｍ Ｈ Ｉ （ Ｂｃｔｈｃｓｄａ ＲＯＳＱａｒ
Ｃｈｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により供給者の勧める
条件を用いて消化した。該Ｂａｍｌ−ＩＩ切１１ｉＤＮ
Ａを、史に制限エンドヌクレアーゼＥＣＯＲＩにより切
断した。
該切断ＤＮＡを、フェノール抽出し、そしてエタノール
沈殿させた。該ＸｈｏＩ［切断されたＤｍＮＧＦのＥＣ
ＯＲＩからｐｓｔ４までの断ハを、ＢａｒｎｌｌＩおよ
びＥｃｏＲＩ切ｆＩｏＬＩｃ８と、１２５ナノグラムの
ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ切断ｐｕｃｓ、約１２５ナ
ノグラムのＸｈｏＩＩ切断されたｐｍＮＧＦのＥＣＯＲ
Ｉか’ＢＰＳｔＩ＊での断片、１．２５マイクロモルの
トリスート１Ｇ！、１１１＋７．８、０．２５マイクＯ
モルのＭＯＣＩ 、０．５０マイクロモルの遠元ジチ
オスレイトール、２．５ナノモルのＡＴＰ，および１単
位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ ＢｃｔｈｅｓｄａＲｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含有１る２
５マイクＤリットルの反応註含物中で連結しＩζ。該反
応混合物は、１５℃にて１６時問熟成された。
沈殿させた。該ＸｈｏＩ［切断されたＤｍＮＧＦのＥＣ
ＯＲＩからｐｓｔ４までの断ハを、ＢａｒｎｌｌＩおよ
びＥｃｏＲＩ切ｆＩｏＬＩｃ８と、１２５ナノグラムの
ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ切断ｐｕｃｓ、約１２５ナ
ノグラムのＸｈｏＩＩ切断されたｐｍＮＧＦのＥＣＯＲ
Ｉか’ＢＰＳｔＩ＊での断片、１．２５マイクロモルの
トリスート１Ｇ！、１１１＋７．８、０．２５マイクＯ
モルのＭＯＣＩ 、０．５０マイクロモルの遠元ジチ
オスレイトール、２．５ナノモルのＡＴＰ，および１単
位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ ＢｃｔｈｅｓｄａＲｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含有１る２
５マイクＤリットルの反応註含物中で連結しＩζ。該反
応混合物は、１５℃にて１６時問熟成された。
該連結混合物を、適切な［，ＣＯ１ｉ ＴＧＩ宿主細
胞（ Ｔａｙｌｏｒ， Ｊ．Ｗ．のＮｕｃｌ．Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ． １ ３ ：８７４９ （１９８５））
中に形質転換させ、そしてｄあたり５０マイクログラム
のアンビシリン、ｄあたり５０マイクログラムの５−ブ
ロモー４−クロロ．−３−インドリル ベーターＤ−ガ
ラクトごラノシド、および一あたり０．０５マイクロモ
ルのイソブロビルベータ一〇−チオガラク１−ビラノシ
ドを含むし寒天平板（１０ｇｍのトリブトン、５ａｍの
酵母抽出物、ＩｏｎのＮａＣｉ、１５ｕのバクト〜アガ
ー（ ｂａｃｔｏ−ａｇａｒ）をリットルあたり含む）
上に塗布した。３７℃にて一夜台牛した後、１２の無色
のコロニーを無作為に摘採り、各々を一あたり５０マイ
クログラムのアンビシリンを含む１．５ｄのＬブロス中
に接種した．，車上シエイカー上で３７℃にて５時問育
生した後、微少溶菌ＤＮＡを各培養物からＢｉｒｎｂｏ
ｉｌｌ１３よびＤｏｌｌ／の１４ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７ ： １ ５ １３ （
１９７９）の方沫により調製した。ＥｃｏＲＩおよびＢ
ａ ｍ Ｈ Ｉによる切断の後、これらの微少溶菌ブ
ラスミドＤＮＡＷ製物のうちの４つが、約５８０Ｊ！！
基対の予想ざれた断片（該ＸｈｏＩＩ生成ＤＮＡ末端は
、この場合、ＢａｍＨＩ生成ＤＮＡ末端に連結されたと
きにＢ ａ ｍ Ｈ Ｉ部位を再生成するような配列を
有する）を生じた。これらのブラスミドの一つをｐｍＮ
ＧＦｔｔ２と命名し、更に構築に使用した。
胞（ Ｔａｙｌｏｒ， Ｊ．Ｗ．のＮｕｃｌ．Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ． １ ３ ：８７４９ （１９８５））
中に形質転換させ、そしてｄあたり５０マイクログラム
のアンビシリン、ｄあたり５０マイクログラムの５−ブ
ロモー４−クロロ．−３−インドリル ベーターＤ−ガ
ラクトごラノシド、および一あたり０．０５マイクロモ
ルのイソブロビルベータ一〇−チオガラク１−ビラノシ
ドを含むし寒天平板（１０ｇｍのトリブトン、５ａｍの
酵母抽出物、ＩｏｎのＮａＣｉ、１５ｕのバクト〜アガ
ー（ ｂａｃｔｏ−ａｇａｒ）をリットルあたり含む）
上に塗布した。３７℃にて一夜台牛した後、１２の無色
のコロニーを無作為に摘採り、各々を一あたり５０マイ
クログラムのアンビシリンを含む１．５ｄのＬブロス中
に接種した．，車上シエイカー上で３７℃にて５時問育
生した後、微少溶菌ＤＮＡを各培養物からＢｉｒｎｂｏ
ｉｌｌ１３よびＤｏｌｌ／の１４ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７ ： １ ５ １３ （
１９７９）の方沫により調製した。ＥｃｏＲＩおよびＢ
ａ ｍ Ｈ Ｉによる切断の後、これらの微少溶菌ブ
ラスミドＤＮＡＷ製物のうちの４つが、約５８０Ｊ！！
基対の予想ざれた断片（該ＸｈｏＩＩ生成ＤＮＡ末端は
、この場合、ＢａｍＨＩ生成ＤＮＡ末端に連結されたと
きにＢ ａ ｍ Ｈ Ｉ部位を再生成するような配列を
有する）を生じた。これらのブラスミドの一つをｐｍＮ
ＧＦｔｔ２と命名し、更に構築に使用した。
１１ＮＧＦの成熟部分をコードするヒトゲノムＤＮＡの
ＸｈｏＩ［断ハを、ｐｍＮＧＦ＃２の３ａｍＨＴ部位に
導入するために、該ベクターｐｍＮＧＦ＃２をＢａｍＨ
Ｉにより切断し、自己連結の防止のためにアルカリホス
ファターゼにより処理した。１マイクログラムのｐｍＮ
ＧＦ＃２を制限エンドヌクレアーぜＢ ａ ｍ ｌ−Ｉ
Ｉにより消化した。該切ＩＦｉＤＮＡをフェノール抽
出し、そしてエタノール沈殿させた。次いで、該乾燥Ｄ
ＮＡベレットを、１０マイクロリットルの殺菌蒸留水中
に再懸濁した。該ＢａｍＨＩ切断ｐｍＮＧＦ＃２を、次
いで１マイクログラムの３ａｍＨＩ切断ＤｍＮＧＦ＃２
、０．３１５？イクロモルのホウ酸ナトリウム、ρ１１
１０．４および１単位のウシ腸管７ノレカリホスファタ
ーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ）を含む２１
マイクロリットルの反応混合物中で、アルカリボスファ
ターゼを用い、３７”Ｃ，にて１時間の熟成によって処
理した。１時問の後にＥＤＴＡ，ｐｌｌ８．Ｏを最終濃
度５ミリモルまで加え、該混合物を６８℃で１５分間熟
成した。次いで、該混合物を７１ノール抽出し、エタノ
ール沈殿させ、乾燥させ、そして殺菌蒸留水中に再懸濁
した。
ＸｈｏＩ［断ハを、ｐｍＮＧＦ＃２の３ａｍＨＴ部位に
導入するために、該ベクターｐｍＮＧＦ＃２をＢａｍＨ
Ｉにより切断し、自己連結の防止のためにアルカリホス
ファターゼにより処理した。１マイクログラムのｐｍＮ
ＧＦ＃２を制限エンドヌクレアーぜＢ ａ ｍ ｌ−Ｉ
Ｉにより消化した。該切ＩＦｉＤＮＡをフェノール抽
出し、そしてエタノール沈殿させた。次いで、該乾燥Ｄ
ＮＡベレットを、１０マイクロリットルの殺菌蒸留水中
に再懸濁した。該ＢａｍＨＩ切断ｐｍＮＧＦ＃２を、次
いで１マイクログラムの３ａｍＨＩ切断ＤｍＮＧＦ＃２
、０．３１５？イクロモルのホウ酸ナトリウム、ρ１１
１０．４および１単位のウシ腸管７ノレカリホスファタ
ーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ）を含む２１
マイクロリットルの反応混合物中で、アルカリボスファ
ターゼを用い、３７”Ｃ，にて１時間の熟成によって処
理した。１時問の後にＥＤＴＡ，ｐｌｌ８．Ｏを最終濃
度５ミリモルまで加え、該混合物を６８℃で１５分間熟
成した。次いで、該混合物を７１ノール抽出し、エタノ
ール沈殿させ、乾燥させ、そして殺菌蒸留水中に再懸濁
した。
１０マイクログラムのｐｈＮＧＦ＃５ （例１に記載さ
れている）を制限エンドヌクレアーゼＸ ｈ ｏ ＩＩ
（ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ−Ｂｉｏｂａｂｓ ）を
用い、供給者の勧める条件に従って消化した。次いで、
該ｘｈｏ■切断ｐｈＮＧＦ＃５ＤＮＡ＠Ｐｖｕ ＩＩ（
Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ）を用い、供給者の勧めに従って消化を行な
った。該ブラスミドのｐｕｃｓベクタ一部分に由来する
該Ｘ ｈ ｏ ＩＩ断片は、Ｘｈｏｕ断片から誘導され
た所望の１，００４塩基対のｈＮＧＦゲノムＤＮＡとほ
ぼ同様な大きさであった。該ｐｔＪＣ８誘導断片は、Ｐ
ｖｕ■部位を含んでおり、従って、ｐ Ｖ ＬＪ ＩＩ
部位を含んでいないｈＮＧＦゲノムＤＮＡ誘導断片に比
較して大きさにおいて減少ざれた。該消化ＤＮＡ断片を
０．７％アガロースゲル上での電気泳動により分離し、
約１，０００塩基対の断片を、該ゲルからｏｒｅｔｚｅ
ｎらによる＾ｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｇ＋． １ １２
：２９５（１９８１）のＤＥＡＥニト［１セルロース法
により回収した。
れている）を制限エンドヌクレアーゼＸ ｈ ｏ ＩＩ
（ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ−Ｂｉｏｂａｂｓ ）を
用い、供給者の勧める条件に従って消化した。次いで、
該ｘｈｏ■切断ｐｈＮＧＦ＃５ＤＮＡ＠Ｐｖｕ ＩＩ（
Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ）を用い、供給者の勧めに従って消化を行な
った。該ブラスミドのｐｕｃｓベクタ一部分に由来する
該Ｘ ｈ ｏ ＩＩ断片は、Ｘｈｏｕ断片から誘導され
た所望の１，００４塩基対のｈＮＧＦゲノムＤＮＡとほ
ぼ同様な大きさであった。該ｐｔＪＣ８誘導断片は、Ｐ
ｖｕ■部位を含んでおり、従って、ｐ Ｖ ＬＪ ＩＩ
部位を含んでいないｈＮＧＦゲノムＤＮＡ誘導断片に比
較して大きさにおいて減少ざれた。該消化ＤＮＡ断片を
０．７％アガロースゲル上での電気泳動により分離し、
約１，０００塩基対の断片を、該ゲルからｏｒｅｔｚｅ
ｎらによる＾ｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｇ＋． １ １２
：２９５（１９８１）のＤＥＡＥニト［１セルロース法
により回収した。
該回収された１，０００塩基対
ＸｈｏｌＩｈＮＧＦゲノムＤＮＡＩ片を、ＢａｍＨＩお
よびアルカリホスファターゼ処理ＤｍＮＧＦ＃２に対し
、１２０ナノグラムのＱ ａ ｍ Ｈ Ｉ切所アルカリ
ホスファタービ処理ｐｍＮＧＦ＃２、２５０ナノグラム
の１．０００の塩基対ＸｈｏｎｈＮＧＦゲノムＤＮＡ，
１マイクロモルのトリスー１−ＩＣｉ、ｐＨ７．８、０
、２０マイクロモルのＭｑＣＪ２ 、０．４０マイクロ
モルの還元ジチオスレイトール、２ナノモルのＡＴＰ１
および１単位のｒ４ＤＮＡリガーゼを含む２０マイクロ
リットルの反応混合物中で連結した。該反応混合物を１
５℃にて１６時間熟成しｊこ 。
よびアルカリホスファターゼ処理ＤｍＮＧＦ＃２に対し
、１２０ナノグラムのＱ ａ ｍ Ｈ Ｉ切所アルカリ
ホスファタービ処理ｐｍＮＧＦ＃２、２５０ナノグラム
の１．０００の塩基対ＸｈｏｎｈＮＧＦゲノムＤＮＡ，
１マイクロモルのトリスー１−ＩＣｉ、ｐＨ７．８、０
、２０マイクロモルのＭｑＣＪ２ 、０．４０マイクロ
モルの還元ジチオスレイトール、２ナノモルのＡＴＰ１
および１単位のｒ４ＤＮＡリガーゼを含む２０マイクロ
リットルの反応混合物中で連結した。該反応混合物を１
５℃にて１６時間熟成しｊこ 。
該２０マイクロリットルの連結混合物を、適切なＥ，ｃ
ｏＪｉ ＴＧＩ宿主細胞中に形質転換し、ｄあたり５
０マイクログラムのアンビシリンを含むＬ寒天平板上に
塗布した。３７℃にて一夜育生した後、１７０の無作為
に選択した単離コロニを別々に直径８２１ｌｍｌのニト
ロセルロースフィルタ（ＢＡ８５型、Ｓｃｈｌｅｉｃｈ
ｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）上に線条に付けた。
ｏＪｉ ＴＧＩ宿主細胞中に形質転換し、ｄあたり５
０マイクログラムのアンビシリンを含むＬ寒天平板上に
塗布した。３７℃にて一夜育生した後、１７０の無作為
に選択した単離コロニを別々に直径８２１ｌｍｌのニト
ロセルロースフィルタ（ＢＡ８５型、Ｓｃｈｌｅｉｃｈ
ｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）上に線条に付けた。
ａｒｕｎｓｔｅｉｎおよびｆｌ ｏ ｇ ｎ ｅ ｓ
ｓのコロニーハイブリダイゼーション法をＨａｎｉａｔ
ｉｓ（３ １ ２−３ １ ５頁）に記載されているよ
うに、Ｎ Ｇ Ｆの成熟型部分をコードするヒトゲノム
ＤＮＡと相同な２８は体合成オリゴヌクレオチド ５゜ＧＡＧＧＴＧＡＡＣ八ＴＴＡＡＣＡＡＣＡＧＴＧＴ
Ａ丁１ｃＡ ３’ を、 ３２Ｆ）５′末端標識の
後にブローブとして用いて行なった．１７０の試験コロ
ニーのうら４４が２８ｆｆｉ体プローブとハイブリッド
化した。明確にハイブリッド化したコロニーのうら２４
を別々に耐あたり５０マイクログラムのアンビシリンを
含むしブロ３ワ ス１．５ａｅ中に接種した。阜上シェーカートでＶ℃に
て５時間の育生の後、微少溶菌ＤＮＡを各培養物からＢ
ｉｒｎｂｏｉＩＩ１およびＤｏｌｙの方法（前出文献）
により［４した。ＥＣＯＲＩによる切断の後、微少溶菌
ブラスミド調製物は、約７００塩塁対の予想された断片
を生成した。これらのブラスミドをｐｒｎｈＮＧＦ＃５
、ｐｒｎｈＮＧＦ＃９およびｏｍｈＮＧＦ＃２１と命名
した。
ｓのコロニーハイブリダイゼーション法をＨａｎｉａｔ
ｉｓ（３ １ ２−３ １ ５頁）に記載されているよ
うに、Ｎ Ｇ Ｆの成熟型部分をコードするヒトゲノム
ＤＮＡと相同な２８は体合成オリゴヌクレオチド ５゜ＧＡＧＧＴＧＡＡＣ八ＴＴＡＡＣＡＡＣＡＧＴＧＴ
Ａ丁１ｃＡ ３’ を、 ３２Ｆ）５′末端標識の
後にブローブとして用いて行なった．１７０の試験コロ
ニーのうら４４が２８ｆｆｉ体プローブとハイブリッド
化した。明確にハイブリッド化したコロニーのうら２４
を別々に耐あたり５０マイクログラムのアンビシリンを
含むしブロ３ワ ス１．５ａｅ中に接種した。阜上シェーカートでＶ℃に
て５時間の育生の後、微少溶菌ＤＮＡを各培養物からＢ
ｉｒｎｂｏｉＩＩ１およびＤｏｌｙの方法（前出文献）
により［４した。ＥＣＯＲＩによる切断の後、微少溶菌
ブラスミド調製物は、約７００塩塁対の予想された断片
を生成した。これらのブラスミドをｐｒｎｈＮＧＦ＃５
、ｐｒｎｈＮＧＦ＃９およびｏｍｈＮＧＦ＃２１と命名
した。
プラスミドｐｍｔ’ｌＮＧＦ＃９のＤＮＡ配列分析は、
それがマウスＣＤＮＡとヒトゲノムＤＮＡとの所望の結
合を有していることを示した。１０マイクログラムのブ
ラスミドｐｍｈＮＧＦ＃９ＤＮＡを、ＩＩ限エンドヌク
レアーゼＳｍａＩ（Ｂｃｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用い、供給名の勧め
る条件により切断した。エタノール沈殿および減圧下で
の乾燥後、該ＳｍａＩ切断ＤＮＡを更に制限エンドヌク
レアーゼＰＳｔＩ（Ｂｅｔｈｃｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｅ
ｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用い、供給者の勧め
る条件により切断した。約１．５８０塩基対語片が０．
７％アガロースゲルでの電気泳動により分離され、該Ｄ
ＮＡをｔｔｒｅｔｚｅｎらのＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
． １ １ ２ ： ２９５ （ １ ９８ １ ）の
Ｄ［ＡＥ−ニトＯｔ？ルロース法により回収した。
それがマウスＣＤＮＡとヒトゲノムＤＮＡとの所望の結
合を有していることを示した。１０マイクログラムのブ
ラスミドｐｍｈＮＧＦ＃９ＤＮＡを、ＩＩ限エンドヌク
レアーゼＳｍａＩ（Ｂｃｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用い、供給名の勧め
る条件により切断した。エタノール沈殿および減圧下で
の乾燥後、該ＳｍａＩ切断ＤＮＡを更に制限エンドヌク
レアーゼＰＳｔＩ（Ｂｅｔｈｃｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｅ
ｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用い、供給者の勧め
る条件により切断した。約１．５８０塩基対語片が０．
７％アガロースゲルでの電気泳動により分離され、該Ｄ
ＮＡをｔｔｒｅｔｚｅｎらのＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
． １ １ ２ ： ２９５ （ １ ９８ １ ）の
Ｄ［ＡＥ−ニトＯｔ？ルロース法により回収した。
バクロウイルスクローニングベクタープラスミドｐＡＣ
３７３を含むポリへドリンプロモータを１．ｓｓｏ塩ｕ
対３ｍａＩからＰｓｔＩｖウス／ヒトキメラＮＧＦ
ＤＮＡを受容するために、ｐＡｃ３７３の特異的な［３
ａｍＨＩおよびＫＥ）ｎＩ部位の間に３ｍａＩおよびＰ
ｓｔＩ部位を含むアダプタを挿八ずることにより修飾し
た。
３７３を含むポリへドリンプロモータを１．ｓｓｏ塩ｕ
対３ｍａＩからＰｓｔＩｖウス／ヒトキメラＮＧＦ
ＤＮＡを受容するために、ｐＡｃ３７３の特異的な［３
ａｍＨＩおよびＫＥ）ｎＩ部位の間に３ｍａＩおよびＰ
ｓｔＩ部位を含むアダプタを挿八ずることにより修飾し
た。
該合成３５量体オリゴヌクレオチド
５゜ＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＣＧＧＧＡＧ＾ＴＣＴ＾
ＧＡＣＴＧＣＡＧＧＴＡＣ ３“（Ｓｍａ Ｉ、Ｐｓｔ
Ｉおよび他の制限酵素部位を含む）を蒸留水中にマイク
Ｏリットルあたり１００ピコモルの濃度で再懸濁した。
ＧＡＣＴＧＣＡＧＧＴＡＣ ３“（Ｓｍａ Ｉ、Ｐｓｔ
Ｉおよび他の制限酵素部位を含む）を蒸留水中にマイク
Ｏリットルあたり１００ピコモルの濃度で再懸濁した。
２００ピコモルの＠３５量体を、該３５量体に加えて１
．４マイクロモルのトリスー＋＋ｃ１、ｌ）＋１７．６
、０，２マクイＯモルのＭｇＣ１ 、０．１マイクＯ
’Ｅルのジヂオスレイトール、１プノモルのＡ Ｔ Ｐ
，および７．５単位のＴ４ボリヌクレオチドキナーゼ
（ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ）を含む２０マイクロリット
ルの反応混合物中で３７℃にて１時間熟成することによ
ってリン酸化した。該Ｍ素を６５℃にて１０分間加熱す
ることにより不活性化した。相補的２７半体オリゴヌク
レオチド ５ ’ ＣＴＧＣＡＧＴＣＴ＾ＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＧ
ＡＧＣＴＱＧ ３’を同様な方法で処理した。
．４マイクロモルのトリスー＋＋ｃ１、ｌ）＋１７．６
、０，２マクイＯモルのＭｇＣ１ 、０．１マイクＯ
’Ｅルのジヂオスレイトール、１プノモルのＡ Ｔ Ｐ
，および７．５単位のＴ４ボリヌクレオチドキナーゼ
（ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ）を含む２０マイクロリット
ルの反応混合物中で３７℃にて１時間熟成することによ
ってリン酸化した。該Ｍ素を６５℃にて１０分間加熱す
ることにより不活性化した。相補的２７半体オリゴヌク
レオチド ５ ’ ＣＴＧＣＡＧＴＣＴ＾ＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＧ
ＡＧＣＴＱＧ ３’を同様な方法で処理した。
各リン酸化反応混合物（リン酸化オリゴヌクレオチドを
各々５０ピコモル含む）の５ミリリットル分別物を合せ
、自己一相補的オリゴヌクレオチドを、７０℃にて４分
間熟成することにより互いにアニール化させ、次いで３
７℃にて３０分間、最終的には２３℃にて６０分間熟成
した。
各々５０ピコモル含む）の５ミリリットル分別物を合せ
、自己一相補的オリゴヌクレオチドを、７０℃にて４分
間熟成することにより互いにアニール化させ、次いで３
７℃にて３０分間、最終的には２３℃にて６０分間熟成
した。
３マイクログラムのブラスミドρＡＣ３７３を制限エン
ドヌクレアーゼＫ ｐｎ Ｉ （ ＢｃｔｈｃｓｄａＲ
ｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により
切断した。該Ｋｌ）ｎＩ切断ｏＡｃ３７３を更に制限エ
ンドヌクレアーゼＢａｍＨＩにより切断した。該Ｋｐｎ
ＩおよびＢ ａｍｆ−Ｉ Ｉ切断ＤＮＡをフェノール抽
出し、エタノール沈殿させ、減圧乾燥し、そして殺菌蒸
Ｗ１水中にマイクロリットルあたり１２０ナノグラムの
濃度で再懸濁させた。該切断ｐＡｃ３７３ベクターＤＮ
Ａを、次いでアニール化オリゴヌクレオチドに対して１
２０ナノグラムのＫｐｎおよびＢａｍＨＩ切断ｐＡｃ３
７３ＤＮＡ１１．０ビコモルのアニール化オリゴヌクレ
オチド、１マイクロモルのトリスーｔ−｛Ｃｌｐｌｌ７
．８、０．２マイクロモルのＭａ（１ 、０．４マイ
クロモルの遠元ジチオスレイトール、２ナノモルのＡＴ
Ｐ，および１単位のＴ４０ＮＡリガーゼを含有する２０
マイクロリットルの反応混合物中で連結した。
ドヌクレアーゼＫ ｐｎ Ｉ （ ＢｃｔｈｃｓｄａＲ
ｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により
切断した。該Ｋｌ）ｎＩ切断ｏＡｃ３７３を更に制限エ
ンドヌクレアーゼＢａｍＨＩにより切断した。該Ｋｐｎ
ＩおよびＢ ａｍｆ−Ｉ Ｉ切断ＤＮＡをフェノール抽
出し、エタノール沈殿させ、減圧乾燥し、そして殺菌蒸
Ｗ１水中にマイクロリットルあたり１２０ナノグラムの
濃度で再懸濁させた。該切断ｐＡｃ３７３ベクターＤＮ
Ａを、次いでアニール化オリゴヌクレオチドに対して１
２０ナノグラムのＫｐｎおよびＢａｍＨＩ切断ｐＡｃ３
７３ＤＮＡ１１．０ビコモルのアニール化オリゴヌクレ
オチド、１マイクロモルのトリスーｔ−｛Ｃｌｐｌｌ７
．８、０．２マイクロモルのＭａ（１ 、０．４マイ
クロモルの遠元ジチオスレイトール、２ナノモルのＡＴ
Ｐ，および１単位のＴ４０ＮＡリガーゼを含有する２０
マイクロリットルの反応混合物中で連結した。
該連結混合物を１５℃にて１６時聞熟成した。
次いで、２０マイクロリットルの連結混合物を、適切な
Ｅ．ｃｏＪｉ Ｈｅ １０１宿主ｌｍｌ胞（ Ｈａ
ｎｉａｔｉｓ，■，らのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｌｌａｒｂｏｒｔａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ：ニューヨーク》中に形質転換し、一あたり５０マ
イクログラムのアンビシリンを含むＬＢ寒天平板上に塗
布した。
Ｅ．ｃｏＪｉ Ｈｅ １０１宿主ｌｍｌ胞（ Ｈａ
ｎｉａｔｉｓ，■，らのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｌｌａｒｂｏｒｔａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ：ニューヨーク》中に形質転換し、一あたり５０マ
イクログラムのアンビシリンを含むＬＢ寒天平板上に塗
布した。
３７℃にて一夜育生後、１２コ〇二−を任意に選択し、
それぞれをｄあたり５０マイク１コグラムのアンビシリ
ンを含む１．５＋ｄのＬブＯスに接種した。車上シェー
カー上で３７℃にて５時間育生後、各培養物からＢｉｒ
ｎｂｏｉｍおよび００１ｙの方法（前出文献）により微
少溶菌ＤＮＡを調製した。
それぞれをｄあたり５０マイク１コグラムのアンビシリ
ンを含む１．５＋ｄのＬブＯスに接種した。車上シェー
カー上で３７℃にて５時間育生後、各培養物からＢｉｒ
ｎｂｏｉｍおよび００１ｙの方法（前出文献）により微
少溶菌ＤＮＡを調製した。
ＰｓｔＩおよびＸｈｏＩ （ｐＡＣ３７３中の特異的制
限部位）による切ｌｇｉ後、予想された約２，０００塩
基対の大きさのＤＮＡｆｅｉ片が、微少溶菌ブラスミド
ＤＮＡ調製物の一つを除くすべてから得られた。Ｐｓｔ
Ｉ制限部位を′ａ得したすべてのブラスミドは、Ｘｈｏ
ＩおよびＳｍａＩによる切断から決定されるように３ｍ
ａ Ｉ制限部位もまた獲得していることが分かった。ｐ
ＡＣ３７３ＳＳＢＸＰ−８と命名ざれたこれらのブラス
ミドの一つを最終的なブラスミド構築のために使用した
。
限部位）による切ｌｇｉ後、予想された約２，０００塩
基対の大きさのＤＮＡｆｅｉ片が、微少溶菌ブラスミド
ＤＮＡ調製物の一つを除くすべてから得られた。Ｐｓｔ
Ｉ制限部位を′ａ得したすべてのブラスミドは、Ｘｈｏ
ＩおよびＳｍａＩによる切断から決定されるように３ｍ
ａ Ｉ制限部位もまた獲得していることが分かった。ｐ
ＡＣ３７３ＳＳＢＸＰ−８と命名ざれたこれらのブラス
ミドの一つを最終的なブラスミド構築のために使用した
。
１マイクログラムのブラスミドＤＡＣ３７３ＳＳＢＸＰ
−８を制限エンドヌクレアーゼＳｍａＩにより供給者が
勧める条件を用いて消化した。エタノール沈殿の後、該
乾燥ＳｍａＩＦＪＪ断ＤＮＡペレットを殺菌蒸角水中に
再懸濁し、更にＰ ｓ ｔ Ｉ （ Ｂｅｔｈｃｓｄａ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によ
り供給者の勧めに従って切断した。該３ｍａＪおよびＰ
ｓｔＩ切断ｐＡＣ３７３ ＳＳＢＸＰ−８ ＤＮＡ
をフェノール抽出し、エタノール沈殿させ、そして乾燥
ＤＮＡベレットをマイクロリットルあたり１００犬ノグ
ラムの濃度として殺菌蒸留水中に再懸濁した。次いで、
該切断ｐＡＣ３ ７３ ＳＳＢＸＰ−８ベクターを、
先に単離したマウス／ヒトＮＧＦキメラを含むｐｍｈＮ
ＧＦ＃９の約１，５８０塩基対の３ｍａｌからｐｓｔＩ
断片に、１００ナノグラムのＳｍａ ＩおよびＰＳｔＩ
切断ｐＡＣ３７３ ＳＳＢＸＰ−８、２５０ナノグラ
ムの約１．５８１基対の ＤｍｈＮＧＦ＃９のＳｍａ■からＰｓｔＩ断片、１．０
マイクロモルのトリスーＨｅｌｐｌｌ７．８、０．２０
マイクロモルのＭＯＣＩ 、０．４０７イクロモルの
還元ジヂオスレイトール、２．０ナノモルのＡＴＰ，お
よび１単位のＴ４１）ＮＡリガーゼを含む２０マイクロ
リットルの反応混合物中で連結した。該反応混合物を１
５℃にて１６時間熟成した。
−８を制限エンドヌクレアーゼＳｍａＩにより供給者が
勧める条件を用いて消化した。エタノール沈殿の後、該
乾燥ＳｍａＩＦＪＪ断ＤＮＡペレットを殺菌蒸角水中に
再懸濁し、更にＰ ｓ ｔ Ｉ （ Ｂｅｔｈｃｓｄａ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によ
り供給者の勧めに従って切断した。該３ｍａＪおよびＰ
ｓｔＩ切断ｐＡＣ３７３ ＳＳＢＸＰ−８ ＤＮＡ
をフェノール抽出し、エタノール沈殿させ、そして乾燥
ＤＮＡベレットをマイクロリットルあたり１００犬ノグ
ラムの濃度として殺菌蒸留水中に再懸濁した。次いで、
該切断ｐＡＣ３ ７３ ＳＳＢＸＰ−８ベクターを、
先に単離したマウス／ヒトＮＧＦキメラを含むｐｍｈＮ
ＧＦ＃９の約１，５８０塩基対の３ｍａｌからｐｓｔＩ
断片に、１００ナノグラムのＳｍａ ＩおよびＰＳｔＩ
切断ｐＡＣ３７３ ＳＳＢＸＰ−８、２５０ナノグラ
ムの約１．５８１基対の ＤｍｈＮＧＦ＃９のＳｍａ■からＰｓｔＩ断片、１．０
マイクロモルのトリスーＨｅｌｐｌｌ７．８、０．２０
マイクロモルのＭＯＣＩ 、０．４０７イクロモルの
還元ジヂオスレイトール、２．０ナノモルのＡＴＰ，お
よび１単位のＴ４１）ＮＡリガーゼを含む２０マイクロ
リットルの反応混合物中で連結した。該反応混合物を１
５℃にて１６時間熟成した。
該連結混合物を適切なＥ．ｃｏＪｉ ＨＢ １０１
宿１１１］胞中に形質転換し、耐あたり５０マイクログ
ラムのアンビシリンを含むし寒天平板上に塗布した。３
７℃にて一夜育生後、１２コロニを任意に摘採り、各々
をぱあたり５０マイクログラムのアンピシリンを含む１
．５ｄのＬブＯス中に接種した。屯上シェーカー上での
３７℃における５時問の育生後、各培養物から微少溶菌
ＤＮＡをＢｉｒｎｂｏｉａ＋おＪ；びＤｏｌｙの方法（
前出文献）により調製した。ＥＣＯＲＩによる切断後、
これらの微少溶菌ブラスミドＤＮＡ調製物のうちの２つ
が予想された３，４００塩塞対断片を生じた。
宿１１１］胞中に形質転換し、耐あたり５０マイクログ
ラムのアンビシリンを含むし寒天平板上に塗布した。３
７℃にて一夜育生後、１２コロニを任意に摘採り、各々
をぱあたり５０マイクログラムのアンピシリンを含む１
．５ｄのＬブＯス中に接種した。屯上シェーカー上での
３７℃における５時問の育生後、各培養物から微少溶菌
ＤＮＡをＢｉｒｎｂｏｉａ＋おＪ；びＤｏｌｙの方法（
前出文献）により調製した。ＥＣＯＲＩによる切断後、
これらの微少溶菌ブラスミドＤＮＡ調製物のうちの２つ
が予想された３，４００塩塞対断片を生じた。
ｐＡｃ３７３ｍｈＮＧＦと命名したこれらのブラスミド
の一つを、バクロウイルスゲノムＤＮＡと共に、下記例
４に記載の方法によりスボドプテラ フルジベルダＳｆ
９細胞の共−トランスフェクションのために使用した。
の一つを、バクロウイルスゲノムＤＮＡと共に、下記例
４に記載の方法によりスボドプテラ フルジベルダＳｆ
９細胞の共−トランスフェクションのために使用した。
得られた組換えウイルスを、Ｓｆ９昆虫細胞の感染に使
用し、次いで下記例５に記載の方法によりｔｌＮＧＦを
発現した。
用し、次いで下記例５に記載の方法によりｔｌＮＧＦを
発現した。
例 ３
ｐＡｃＹＭｈＮＧＦブラスミ゜の調
Ｅ）ＡＣＹＭｈＮＧＦプラスミドの構築は、多段階ｌ工
程であった（第３図）。第１に、プラスミドＤｈＮＧＦ
＃５ （例１に記載）を、ベータＮＧＦコード配列の上
流ａ３よび下流の両方に都合の良い制限酵素部位を組込
むために修飾した。上流側のＢ ａ ｍ ｌ−Ｉ Ｉ切
断部位を与えるため、２つのオリゴヌクレオチドアダプ
タを合成した。第１のアダプタ： ５゜ＧＧＧＧ＾ＴＣＣＡＡＡＩ．＾ＴＧＩＣＣ．＾ＩＧ
ＴＴＧＴＴＣＴ八ＣＡＣｒＣｒ ３゜および ５ Ｇ八ＴＣＡＧＡＧＴＧＴ＾６八ＡＣΔ八Ｃ＾ｒＧＧ
ＡｃＡＴＡＴＴＴＧＧ＾ｒｃｃｃｃ３は、２つの可能な
開始コドンの第１のもの［２ＭＥＴ位、−１２１］から
直ぐ上流側にＢａｍＨＩＩ／Ｊ断部位を有している。一
方、第２の７ タ７ ９ ： ５ ＧＧＧＧＡｒＣＣＡ
ＡＡｒＡＴＧＴＴＧＴＴＣＴＡＣＡＣｒＣＴ３゜および
５’ＧＡＴＣＡＧＡＧＴＧＴＡＧＡＡＣＡＡＣ＾［＾Ｔ
ＴＴＧＧＡＴＣＣＣＣ３゜は、第２のメチオニンコドン
［１−ＭＥＴ位、１１９］の次に制限部位が位置してい
る。
程であった（第３図）。第１に、プラスミドＤｈＮＧＦ
＃５ （例１に記載）を、ベータＮＧＦコード配列の上
流ａ３よび下流の両方に都合の良い制限酵素部位を組込
むために修飾した。上流側のＢ ａ ｍ ｌ−Ｉ Ｉ切
断部位を与えるため、２つのオリゴヌクレオチドアダプ
タを合成した。第１のアダプタ： ５゜ＧＧＧＧ＾ＴＣＣＡＡＡＩ．＾ＴＧＩＣＣ．＾ＩＧ
ＴＴＧＴＴＣＴ八ＣＡＣｒＣｒ ３゜および ５ Ｇ八ＴＣＡＧＡＧＴＧＴ＾６八ＡＣΔ八Ｃ＾ｒＧＧ
ＡｃＡＴＡＴＴＴＧＧ＾ｒｃｃｃｃ３は、２つの可能な
開始コドンの第１のもの［２ＭＥＴ位、−１２１］から
直ぐ上流側にＢａｍＨＩＩ／Ｊ断部位を有している。一
方、第２の７ タ７ ９ ： ５ ＧＧＧＧＡｒＣＣＡ
ＡＡｒＡＴＧＴＴＧＴＴＣＴＡＣＡＣｒＣＴ３゜および
５’ＧＡＴＣＡＧＡＧＴＧＴＡＧＡＡＣＡＡＣ＾［＾Ｔ
ＴＴＧＧＡＴＣＣＣＣ３゜は、第２のメチオニンコドン
［１−ＭＥＴ位、１１９］の次に制限部位が位置してい
る。
該３５ｆｆｉ体オリゴヌクレオチド
５’ＧＧＧＧＡＴＣＣＡＡ＾ＴＡＴＧＴＣＣ＾ｒＧＴＴ
ＧＴＴｃＴＡｃＡｃＴｃＴ ３゜を、マイクロリットル
あたり１００ピコモルの濃度で蒸留水中に再懸濁した。
ＧＴＴｃＴＡｃＡｃＴｃＴ ３゜を、マイクロリットル
あたり１００ピコモルの濃度で蒸留水中に再懸濁した。
１００ピコモルの３５量体を、１．４マイクロモルのト
リスー１−１ｃｊ！、ＤＩ１７．６、０．２マイクロモ
ルのＭｇＣ１２、０．１マイクロモルのジチオスレイト
ール、１ナノモルのＡ Ｔ Ｐおよび７．５単位のＴ４
ボリヌクＬ／ オチＩ’ ｔ−ナーぜ（ Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ ）を含む２０マイクロリットルの反応混合物中
で、３７℃にて１時間熟成することによりリン酸化した
。次いで、６５℃にて１０分間加熱することにより該酵
素を不活性化した。３９！！体オリゴヌクレオチド５’
ＧΔＴＣＡＧＡＧＴＧＴ八ＧＡＡＣ＾＾Ｃ八ＴＧＧＡＣ
ＡＴＡＴＴＴＧＧＡＴＣＣＣＣ ３’を同様な方法で
処理した。
リスー１−１ｃｊ！、ＤＩ１７．６、０．２マイクロモ
ルのＭｇＣ１２、０．１マイクロモルのジチオスレイト
ール、１ナノモルのＡ Ｔ Ｐおよび７．５単位のＴ４
ボリヌクＬ／ オチＩ’ ｔ−ナーぜ（ Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ ）を含む２０マイクロリットルの反応混合物中
で、３７℃にて１時間熟成することによりリン酸化した
。次いで、６５℃にて１０分間加熱することにより該酵
素を不活性化した。３９！！体オリゴヌクレオチド５’
ＧΔＴＣＡＧＡＧＴＧＴ八ＧＡＡＣ＾＾Ｃ八ＴＧＧＡＣ
ＡＴＡＴＴＴＧＧＡＴＣＣＣＣ ３’を同様な方法で
処理した。
各リン酸化反応混合物の５マイクロリットルの分別物（
各リン酸化オリゴヌクレオチド２５ピコモルを含む）を
合し、自己相補的オリゴヌクレオチドを７０℃にて４分
間の熟成、次いで３７℃にて３０分問、最終的に２３℃
にて６０分問の熟成により相豆にアニール化させた。
各リン酸化オリゴヌクレオチド２５ピコモルを含む）を
合し、自己相補的オリゴヌクレオチドを７０℃にて４分
間の熟成、次いで３７℃にて３０分問、最終的に２３℃
にて６０分問の熟成により相豆にアニール化させた。
ｐｔｌＮＧＦ＃５のブラスミドＤＮＡは、ｄａｍ− ［
Ｅ．００１ｉ宿主ＧＭ４８ （ｄａｍ３ｃｌｃｍ６、ｇ
ａ１、ａｒａ，Ｉａｃ，ｔｈｒ，ｊｊｅｕ，ｔｈｉ，ｔ
ｏｎＡ，ｔｓｘ）および制限エンドヌクレアーゼＢ Ｃ
Ａ Ｉ （ Ｂｏｃｈｒｉｎａｅｒ−Ｈａｎｎｈａｉ
ｍ ）により供給者の勧めに従って切所された５マイク
ログラムの該ＤＮＡから調製した。
Ｅ．００１ｉ宿主ＧＭ４８ （ｄａｍ３ｃｌｃｍ６、ｇ
ａ１、ａｒａ，Ｉａｃ，ｔｈｒ，ｊｊｅｕ，ｔｈｉ，ｔ
ｏｎＡ，ｔｓｘ）および制限エンドヌクレアーゼＢ Ｃ
Ａ Ｉ （ Ｂｏｃｈｒｉｎａｅｒ−Ｈａｎｎｈａｉ
ｍ ）により供給者の勧めに従って切所された５マイク
ログラムの該ＤＮＡから調製した。
エタノール沈殿後、該ＢＣ１ ｆ９１１！ＦｉＤＮＡベ
レットを減圧下に乾燥した。該乾燥ＤＮＡベレットを、
殺菌水中に再懸濁し、そしてエンドメクレアーゼＳｍａ
■により切断した。該ＳｍａＩおよびＢＣＩ■切断ｐｈ
ＮＧＦ＃５ＤＮＡをフェノール抽出し、エタノール沈殿
させ、減圧下に乾燥させ、そして殺菌蒸留水中に再懸濁
した。次いで、該切断ｐｔｌＮＧＦ＃５ベクターＤＮＡ
を、１００ナノグラム（０．０３８ピコモル）の３ Ｃ
Ｉ ＩＩおよびＳｍａＩ切％ｐｈＮＧＦ＃５ＤＮＡ，
２．５ビ」モルのアニール化オリゴメクレオチド、１マ
イクロ七ルのトリスート１ｃ１、（１１１７．８、０．
２マイクロモルのＭＱＣ，１ 、０．４マクイロモル
の遠元ジチオスレイ１−−ル、２ナノモルのＡＴＰ，１
７よび１単位の７４ ＤＮＡリガーゼを含む２０マイ
クロリットルの反応混合物中でア二ール化オリゴヌクレ
オチドに連結した。該連結混合物を１５℃にて１６時問
熟成した。
レットを減圧下に乾燥した。該乾燥ＤＮＡベレットを、
殺菌水中に再懸濁し、そしてエンドメクレアーゼＳｍａ
■により切断した。該ＳｍａＩおよびＢＣＩ■切断ｐｈ
ＮＧＦ＃５ＤＮＡをフェノール抽出し、エタノール沈殿
させ、減圧下に乾燥させ、そして殺菌蒸留水中に再懸濁
した。次いで、該切断ｐｔｌＮＧＦ＃５ベクターＤＮＡ
を、１００ナノグラム（０．０３８ピコモル）の３ Ｃ
Ｉ ＩＩおよびＳｍａＩ切％ｐｈＮＧＦ＃５ＤＮＡ，
２．５ビ」モルのアニール化オリゴメクレオチド、１マ
イクロ七ルのトリスート１ｃ１、（１１１７．８、０．
２マイクロモルのＭＱＣ，１ 、０．４マクイロモル
の遠元ジチオスレイ１−−ル、２ナノモルのＡＴＰ，１
７よび１単位の７４ ＤＮＡリガーゼを含む２０マイ
クロリットルの反応混合物中でア二ール化オリゴヌクレ
オチドに連結した。該連結混合物を１５℃にて１６時問
熟成した。
次いで、該２０マイクロリットルの連結Ｕ合物を、適切
なＥ．ｃｏｊｉ ＧＭ４Ｂ宿主細胞中に形質転換し、
ｄあたり５０マイクログラムのアンピシリンを含むＬＢ
寒人平板」−に塗布した。３７℃にて一夜育生後、１２
コロニーを任意に摘採り、それぞれを耐あたり５０マイ
クログラムのアンピシリンを含む１．５ｄのＬブロス中
に接種した。
なＥ．ｃｏｊｉ ＧＭ４Ｂ宿主細胞中に形質転換し、
ｄあたり５０マイクログラムのアンピシリンを含むＬＢ
寒人平板」−に塗布した。３７℃にて一夜育生後、１２
コロニーを任意に摘採り、それぞれを耐あたり５０マイ
クログラムのアンピシリンを含む１．５ｄのＬブロス中
に接種した。
小上シェーカー上で３７℃にて５時聞育生後、各培養物
から微少溶菌ＤＮＡをＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙ
の方法《菊出文献）により調製した。Ｂ ａ ｍ Ｈ
Ｉおよび３ａｚ Ｉにより切断した後、これらの微少溶
菌１） Ｎ Ａは、予想された１ ５ ０ ０ ＰＡ基
対断片を生成した。ｐｈＮＧＦ２Ｍと命名された、これ
らのブシスミドのひとつを、Ｓａｎｇｅｒの方法（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ． ７
４ ： ５ ４ ６ ３ （ １９７７））によるＤＮ
Ａ配列決定に付し、所望の配列を有していることが分か
った。
から微少溶菌ＤＮＡをＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙ
の方法《菊出文献）により調製した。Ｂ ａ ｍ Ｈ
Ｉおよび３ａｚ Ｉにより切断した後、これらの微少溶
菌１） Ｎ Ａは、予想された１ ５ ０ ０ ＰＡ基
対断片を生成した。ｐｈＮＧＦ２Ｍと命名された、これ
らのブシスミドのひとつを、Ｓａｎｇｅｒの方法（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ． ７
４ ： ５ ４ ６ ３ （ １９７７））によるＤＮ
Ａ配列決定に付し、所望の配列を有していることが分か
った。
ブラスミドｐｈＮＧＦ１Ｍを、合成オリゴヌクレオチド
５“ＧＧＧＧＡ／ＴＣＣ＾八＾■＾ＴＧＴＴＧＴＴＣＩ
八ＣＡＣＴＣＴ ３および５゜Ｇ＾ｒＣＡＧＡＧＴＧＴ
ＡＧＡＡＣＡＡＣＡＴＡＴＴＴＧＧ＾ＴＣＣＣＣ ３を
用いて同様な方法で構築した。ＢａｍＨＩおよびＳａｊ
！ Ｉによる切断の後、クローンｏｈＮＧＦ１ｍの微少
溶菌ブラスミド調製物は、予想ざれた１５００塩基対の
所片を生じた。
５“ＧＧＧＧＡ／ＴＣＣ＾八＾■＾ＴＧＴＴＧＴＴＣＩ
八ＣＡＣＴＣＴ ３および５゜Ｇ＾ｒＣＡＧＡＧＴＧＴ
ＡＧＡＡＣＡＡＣＡＴＡＴＴＴＧＧ＾ＴＣＣＣＣ ３を
用いて同様な方法で構築した。ＢａｍＨＩおよびＳａｊ
！ Ｉによる切断の後、クローンｏｈＮＧＦ１ｍの微少
溶菌ブラスミド調製物は、予想ざれた１５００塩基対の
所片を生じた。
ｐＡｃＹＭ１ （前出文献）中へのクローニングのため
のＢａｍＨＩ適合性下流制限部位を得るだめに、Ｂｇｔ
ＩＩリンカーをｔｌＮＧＦ ＤＮＡの下流の２つの
ＡｐａＩ部位の間に導入した。該８臆体オリゴヌクレオ
チド５’ＣＡＧＡＴＣＩＧ３゜を、１８８ビコモルの該
８量体、１．４マイクロモルのトリス−ＨＣ１、ｌ）＋
１７．６、０．２マイクロモルのＭａＣｊ！ 、０．
１マイクｕモルの還元ジチオスレイトール、１ナノモル
のＡＴＰ，および７．５単位の王４ボリヌクレオチドキ
ナーぜ （ ｐｈａｒｍａｃｉａ ）を含む２０マイクロリット
ルの反応混合物中で、３７℃にて１時間熟成することに
よりリン酸化した。該［を６５℃にて１０分間加熱する
ことにより不活性化した。１．６マイクログラムのブラ
スミドｐｈＮＧＦ２Ｍを制限エンドヌクレアーゼＡ ｐ
ａ Ｉ （ Ｎｅｗ ［ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ
）により、供給者の勧める条件に従って消化した。
のＢａｍＨＩ適合性下流制限部位を得るだめに、Ｂｇｔ
ＩＩリンカーをｔｌＮＧＦ ＤＮＡの下流の２つの
ＡｐａＩ部位の間に導入した。該８臆体オリゴヌクレオ
チド５’ＣＡＧＡＴＣＩＧ３゜を、１８８ビコモルの該
８量体、１．４マイクロモルのトリス−ＨＣ１、ｌ）＋
１７．６、０．２マイクロモルのＭａＣｊ！ 、０．
１マイクｕモルの還元ジチオスレイトール、１ナノモル
のＡＴＰ，および７．５単位の王４ボリヌクレオチドキ
ナーぜ （ ｐｈａｒｍａｃｉａ ）を含む２０マイクロリット
ルの反応混合物中で、３７℃にて１時間熟成することに
よりリン酸化した。該［を６５℃にて１０分間加熱する
ことにより不活性化した。１．６マイクログラムのブラ
スミドｐｈＮＧＦ２Ｍを制限エンドヌクレアーゼＡ ｐ
ａ Ｉ （ Ｎｅｗ ［ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ
）により、供給者の勧める条件に従って消化した。
フェノール抽出、エタノール沈殿および乾燥の侵、該Ａ
ｐａＩｔ，７］１１ＤＮＡをマイクロリットルあたり２
００ナノグラムのｉＩａ度で殺菌蒸留水中に再懸濁した
。ΔｐａＩ切断ＤＮＡの３′突出部を、次にＥ．ｃｏＪ
ｉ ＤＮＡポリメラーピ１のクレナウ断片および４種
類のｄＮＴＰのすべてを用いて熟成することにより、除
去《平滑一末端化》した。
ｐａＩｔ，７］１１ＤＮＡをマイクロリットルあたり２
００ナノグラムのｉＩａ度で殺菌蒸留水中に再懸濁した
。ΔｐａＩ切断ＤＮＡの３′突出部を、次にＥ．ｃｏＪ
ｉ ＤＮＡポリメラーピ１のクレナウ断片および４種
類のｄＮＴＰのすべてを用いて熟成することにより、除
去《平滑一末端化》した。
１．４マイクログラムのＡＤａＩ切断
Ｄ ｈ Ｎ Ｇ Ｆ ２ Ｍを、該Ａｐａ Ｉ切ｆｌｌ
ｉＤＮＡ，１．２５マイクロモルのＮａＣ１、０．２５
ｖイクロモルのトリスーＨＣ１、Ｉ）＋１７．５、０．
２５冫イクロモルのＭ（；ＪＣＩ 、それぞれ５ナノ
モルのｄＡＴＰ，ｄＧ−ｒＰ，ｄ’ＴＴＰ，およびｄＣ
ＴＰ，ならびに１単位のＥ．ＧＯｊ＋ＤＮＡポリメラー
ゼＩのクレナウ断片（ ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からなる２５マイク
ロリットルの反応混合物中で２３℃にて１０分間熟成し
た。
ｉＤＮＡ，１．２５マイクロモルのＮａＣ１、０．２５
ｖイクロモルのトリスーＨＣ１、Ｉ）＋１７．５、０．
２５冫イクロモルのＭ（；ＪＣＩ 、それぞれ５ナノ
モルのｄＡＴＰ，ｄＧ−ｒＰ，ｄ’ＴＴＰ，およびｄＣ
ＴＰ，ならびに１単位のＥ．ＧＯｊ＋ＤＮＡポリメラー
ゼＩのクレナウ断片（ ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からなる２５マイク
ロリットルの反応混合物中で２３℃にて１０分間熟成し
た。
熟成後、０．５マイクロモルのＥＤＴＡ，ｐｉｔ８。Ｏ
を添加し、得られた混合物をフェノール抽出し、エタノ
ール沈殿させ、乾燥させ、そしてマイクロリットルあた
り１００ナノグラムのＤＮＡ濃度で再懸濁した。該Ａｐ
ａＩ切断平滑末端化ＤｈＮＧＦ２ＭベクターＤＮＡを、
次いで、１００ナノグラムのΔｐａ■切断平滑末端化ｐ
ｈＮＧＦ２Ｍ、２８ビ］モルのリン酸化８艶体リンカー
１マイクロモノレのトリスーＨＣ１、ｐｔｌ７．８、
０．２ｖイクロ−Ｅ／Ｌ，のＭＯＣｊ！２、０．４マイ
クｌコモルの還元ジチオスレイトール、２ナノモルのＡ
ＴＰ，および１Ｍ１位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ Ｂｅｔ
ｈｅｓｄａ ｎｃｓｏａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ）を含む２０マイクロリッ１ヘルの反応混合物中で、
該８８休ＢＱＩ ＩＩリンカーと連結させた。
を添加し、得られた混合物をフェノール抽出し、エタノ
ール沈殿させ、乾燥させ、そしてマイクロリットルあた
り１００ナノグラムのＤＮＡ濃度で再懸濁した。該Ａｐ
ａＩ切断平滑末端化ＤｈＮＧＦ２ＭベクターＤＮＡを、
次いで、１００ナノグラムのΔｐａ■切断平滑末端化ｐ
ｈＮＧＦ２Ｍ、２８ビ］モルのリン酸化８艶体リンカー
１マイクロモノレのトリスーＨＣ１、ｐｔｌ７．８、
０．２ｖイクロ−Ｅ／Ｌ，のＭＯＣｊ！２、０．４マイ
クｌコモルの還元ジチオスレイトール、２ナノモルのＡ
ＴＰ，および１Ｍ１位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ Ｂｅｔ
ｈｅｓｄａ ｎｃｓｏａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ）を含む２０マイクロリッ１ヘルの反応混合物中で、
該８８休ＢＱＩ ＩＩリンカーと連結させた。
該連結混合物を２３℃にて１６時間熟成した。
次いで、該ＤＮＡリガーゼを６５℃にて１０分間熟成す
ることによって不活性化した。該連結ＤＮＡを、引続き
制限エンドヌクレアーゼＢ Ｑ Ｉ ＩＩ （ Ｂｅｔ
ｈｃｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ）により供給者の勧める条件で切断した。フェノー
ル抽出、エタノール沈殿および乾燥の役、該ＤＮＡをマ
イクロリットルあたり１０ナノグラムの濃度で殺菌蒸留
水中に再懸濁し、そして該ＤＮＡを１００ナノグラムの
ＤＮＡ、１マイクロモルのトリスーＨ（１１ｐｔｌ７．
８、０．２マイクロモルのＭＱＣ！ 、０．４マイク
ロモルの還元ジチオスレイトール、２ｊノモルのＡＴＰ
，およびＩｔｔｉ位のｒ４ ＤＮＡリガーゼを含む反
応混合物中で再連結した。該連結混合物を、２３℃にて
１６時間熟成した。次いで、２０マイクロリットルの該
連結混合物を適切なＥ．ｃｏ１ｉ ８８１０１宿主細
胞中に形質転換し、そして耐あたり５０マイクログラム
のアンピシリンをＣむＬＢ″４′天平根上に塗布した。
ることによって不活性化した。該連結ＤＮＡを、引続き
制限エンドヌクレアーゼＢ Ｑ Ｉ ＩＩ （ Ｂｅｔ
ｈｃｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ）により供給者の勧める条件で切断した。フェノー
ル抽出、エタノール沈殿および乾燥の役、該ＤＮＡをマ
イクロリットルあたり１０ナノグラムの濃度で殺菌蒸留
水中に再懸濁し、そして該ＤＮＡを１００ナノグラムの
ＤＮＡ、１マイクロモルのトリスーＨ（１１ｐｔｌ７．
８、０．２マイクロモルのＭＱＣ！ 、０．４マイク
ロモルの還元ジチオスレイトール、２ｊノモルのＡＴＰ
，およびＩｔｔｉ位のｒ４ ＤＮＡリガーゼを含む反
応混合物中で再連結した。該連結混合物を、２３℃にて
１６時間熟成した。次いで、２０マイクロリットルの該
連結混合物を適切なＥ．ｃｏ１ｉ ８８１０１宿主細
胞中に形質転換し、そして耐あたり５０マイクログラム
のアンピシリンをＣむＬＢ″４′天平根上に塗布した。
３７℃にて一夜育生侵、６コロニーを任意に摘採り、そ
れぞれをｄあたり５０マイクログラムのアンビシリンを
含む１．５一の１，ブ０ス中に接種した。卓上シェーカ
ー上で３７℃にて５時閤育生後、各培養物から微少溶菌
ＤＮＡをＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙの方法（前出
文献）により調製した。
れぞれをｄあたり５０マイクログラムのアンビシリンを
含む１．５一の１，ブ０ス中に接種した。卓上シェーカ
ー上で３７℃にて５時閤育生後、各培養物から微少溶菌
ＤＮＡをＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙの方法（前出
文献）により調製した。
ＱａｍＨＩおよびＢ（；Ｊｌ Ｈによる切断の後、１）
ｆｉＮＧＦ ２Ｍの連結に由来する微少溶菌ブラスミ
ド［）ＮＡＦＸＡｌ物のうち２つは、予想された約７８
０塩基対の断片を生じた。
ｆｉＮＧＦ ２Ｍの連結に由来する微少溶菌ブラスミ
ド［）ＮＡＦＸＡｌ物のうち２つは、予想された約７８
０塩基対の断片を生じた。
プラスミドＤｈＮＧＦ１ｍを、同様な方法で構築し、７
８０塩基対の１３ａｍＨＩがらｆ３ｏｌｌｉｔａｉ片を
精製した。
８０塩基対の１３ａｍＨＩがらｆ３ｏｌｌｉｔａｉ片を
精製した。
約２マイクログラムのブラスミド
ｐｈＮＧＦ２Ｍ ＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼ
３ａｍＨＩおよびＢｑオ■にょり切断した。
３ａｍＨＩおよびＢｑオ■にょり切断した。
該消化ＤＮＡ断片を０．７％アガロースゲル上での電気
泳動により分離し、約７８０塩基対断片を、Ｄｒｃｔｚ
ｅｎらのＤＥＡＥニトロセルロース法、＾ｎａｌ．Ｂｉ
ｏｃｔ＋ｅｔ １ １ ２ ： ２ ９ ５によって
ゲルから回収した。該回収ＤＮＡを、マイクロリットル
あたり３０ナノグラムの濃度で殺菌蒸留水中に再懸濁
し Ｉこ 。
泳動により分離し、約７８０塩基対断片を、Ｄｒｃｔｚ
ｅｎらのＤＥＡＥニトロセルロース法、＾ｎａｌ．Ｂｉ
ｏｃｔ＋ｅｔ １ １ ２ ： ２ ９ ５によって
ゲルから回収した。該回収ＤＮＡを、マイクロリットル
あたり３０ナノグラムの濃度で殺菌蒸留水中に再懸濁
し Ｉこ 。
バクロウイルス転移プラスミドｐＡＣＹＭＩ（ Ｈａｔ
ｓｕｕｒａ， ’ｆ．のＪ．ｏｆ ＧｅｃＶｉｒｏ
ｌ． ６ ８ ： １ ２ ３３（１９８
７））を含む９マイクログラムのポリへドリンブロモー
夕を、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩを用い、供給
者の勧める条件を使用して切断した。フェノール抽出、
エタノール沈殿および乾燥の後、該［３ａｍＨ Ｉ切１
ｐＡＣＹＭＩを殺菌蒸留水中に再懸濁し、９マイクログ
ラムの３ａｍＨＩ切断ｐＡｃＹＭ１，０．３１５？イク
ロモルのホウ酸ナトリウム、ＤＨ１０．４、および１単
位のウシ賜アルカリボスフ７ターゼ（Ｓｉ（ｌｅａ ）
を含む２１マイクロリットルの反応況合物中で、３７℃
にて１時間、アルカリホスファターゼ処理をした。１時
間後に、ＥＤＴＡ，ＤＨ８．０を５ミリモルの最終濃度
まで加え、該混合物を６８℃にて１５分問熟成した。次
いで、該混合物をフェノール抽出し、エタノール沈殿さ
せ、乾燥し、そして殺菌蒸留水中に再懸濁した。
ｓｕｕｒａ， ’ｆ．のＪ．ｏｆ ＧｅｃＶｉｒｏ
ｌ． ６ ８ ： １ ２ ３３（１９８
７））を含む９マイクログラムのポリへドリンブロモー
夕を、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩを用い、供給
者の勧める条件を使用して切断した。フェノール抽出、
エタノール沈殿および乾燥の後、該［３ａｍＨ Ｉ切１
ｐＡＣＹＭＩを殺菌蒸留水中に再懸濁し、９マイクログ
ラムの３ａｍＨＩ切断ｐＡｃＹＭ１，０．３１５？イク
ロモルのホウ酸ナトリウム、ＤＨ１０．４、および１単
位のウシ賜アルカリボスフ７ターゼ（Ｓｉ（ｌｅａ ）
を含む２１マイクロリットルの反応況合物中で、３７℃
にて１時間、アルカリホスファターゼ処理をした。１時
間後に、ＥＤＴＡ，ＤＨ８．０を５ミリモルの最終濃度
まで加え、該混合物を６８℃にて１５分問熟成した。次
いで、該混合物をフェノール抽出し、エタノール沈殿さ
せ、乾燥し、そして殺菌蒸留水中に再懸濁した。
次いで、先に精製したｐｈＮＧＦ２Ｍの約７８０１！基
対ＢａｍＨＩからＢｇｌＩＩｌｇｉ片を、１００ナノグ
ラムの３ａｍＨＩ切断リン酸化 ＤＡＣＹＭＩ、２２５ナノグラムの ｐｈＮＧＦ２ｍのＢ ａ ｍ Ｈ Ｉからｓａｚｎまで
（７８０塩基対断片）、１マイクロモルのトリス１−Ｉ
Ｃオ、ＤＩ＋７．８、０．２マイクロモルのＭＱｃ１
、０．４マイク［１モルの還元ジチオスレイトール、
２ナノモルのＡ １” Ｐ、１単位のＴ４ＤＮＡリガー
ゼを含む２０マイクロリットルのＡ反混合物中で、［３
ａ ｍ ｆｌ Ｉ切断アルカリホスファターぜ処Ｌｌ
ｐΔｃＹＭ１と連結した．該連結混合物を１５℃にて１
６時問熟成した。
対ＢａｍＨＩからＢｇｌＩＩｌｇｉ片を、１００ナノグ
ラムの３ａｍＨＩ切断リン酸化 ＤＡＣＹＭＩ、２２５ナノグラムの ｐｈＮＧＦ２ｍのＢ ａ ｍ Ｈ Ｉからｓａｚｎまで
（７８０塩基対断片）、１マイクロモルのトリス１−Ｉ
Ｃオ、ＤＩ＋７．８、０．２マイクロモルのＭＱｃ１
、０．４マイク［１モルの還元ジチオスレイトール、
２ナノモルのＡ １” Ｐ、１単位のＴ４ＤＮＡリガー
ゼを含む２０マイクロリットルのＡ反混合物中で、［３
ａ ｍ ｆｌ Ｉ切断アルカリホスファターぜ処Ｌｌ
ｐΔｃＹＭ１と連結した．該連結混合物を１５℃にて１
６時問熟成した。
次いで、２０マイクロリットルの該連結混合物を適切な
Ｅ，ｃｏｆｉ ＨＢ１０１宿主ＩＩＩＩ中に形質転換
し、ｄあたり５０マイクログラムの７ンビシリンを含む
ＬＢ寒天平板上に塗布した。３７℃にで一夜育生後、１
２コ〇二一を任意に摘採り、それぞれを一あたり５０マ
イクロモルのアンビシリンを含む１．５１ＩＩｉ！のＬ
ブロス中に接抄した。卓上シェーカーで３７℃にて５時
間育生侵、それぞれの培養物からＢｔｒｒ＋ｂｏｉｍお
よびＤｏｌｙの方法（前出文献》により、微少溶菌ＤＮ
Ａを調製した。制限エンドヌクレアーゼＰＳｔｌおよび
ＸｈＯＩによる切断後、これらの徴少溶金プラスミドＤ
ＮＡ調製物のうちの２つは、予想された数および大きさ
の制限断片を生じた。ｐＡｃＹＭ２ＭｈＮＧＦと命名し
たこれらのブラスミドのひとつを、バクロウイルスゲノ
ムＤＮＡと共にスボドプテラ 旦ジベルダ Ｓｆ９ｍｌ
！胞の共−１〜ランスフエクションに使用した。
Ｅ，ｃｏｆｉ ＨＢ１０１宿主ＩＩＩＩ中に形質転換
し、ｄあたり５０マイクログラムの７ンビシリンを含む
ＬＢ寒天平板上に塗布した。３７℃にで一夜育生後、１
２コ〇二一を任意に摘採り、それぞれを一あたり５０マ
イクロモルのアンビシリンを含む１．５１ＩＩｉ！のＬ
ブロス中に接抄した。卓上シェーカーで３７℃にて５時
間育生侵、それぞれの培養物からＢｔｒｒ＋ｂｏｉｍお
よびＤｏｌｙの方法（前出文献》により、微少溶菌ＤＮ
Ａを調製した。制限エンドヌクレアーゼＰＳｔｌおよび
ＸｈＯＩによる切断後、これらの徴少溶金プラスミドＤ
ＮＡ調製物のうちの２つは、予想された数および大きさ
の制限断片を生じた。ｐＡｃＹＭ２ＭｈＮＧＦと命名し
たこれらのブラスミドのひとつを、バクロウイルスゲノ
ムＤＮＡと共にスボドプテラ 旦ジベルダ Ｓｆ９ｍｌ
！胞の共−１〜ランスフエクションに使用した。
ブラスミドｐＡｃＹ１ＭｈＮＧＦは、
ｐｈＮＧＦＩＭのＢａｍＨＩからＢｇＩ ＩＩまでの断
片とｐＡＣＹＭ１とを用いて同様な方法で構築した。
片とｐＡＣＹＭ１とを用いて同様な方法で構築した。
例 ４
ｈＮＧＦ組換えバクロ イルスの調製
ｐＡｃＹ１ＭｈＮＧＦまたは
ｐＡｃＹ２ＭｈＮＧＦを、バクロウイルス（ＡｃＮＰＶ
）性ＤＮＡと共にスボドブテラ フルジベルダＩｎ（Ｓ
ｆ９）中に、ＦＣ！ｔｇｎｅｒ （前出文献）により
２級されたりボフエクション法をＩｎいて共一トランス
フエクトした。
）性ＤＮＡと共にスボドブテラ フルジベルダＩｎ（Ｓ
ｆ９）中に、ＦＣ！ｔｇｎｅｒ （前出文献）により
２級されたりボフエクション法をＩｎいて共一トランス
フエクトした。
１）ＡＣＹＭＩ誘導ｈＮＧＦブラスミドの種々の吊（１
から１０マイクＵグラム）および１マイクログラム（７
）ＡＣＮＰＶ ＤＮＡ （１．５或） を、同１どＤ
ＯＴＭΔ″リビド溶液（Ｌｉｆｅ ＳｃｉｅｎｃｅＴｅ
ＣｈＯｎ＋０１ＪＬ ｝１０） （ ６ ６ μ７
／ｄをＨＥＰＥＳ緩衝溶液中に含む）と混合した。次い
でリポソームにカブセノレ化されたＤＮＡをＴ−２５７
ラス」中のＳｆ９細胞に加え、１．５時間熟成し、次い
で３Ｉｄの新鮮な培地を加えた。４時間後に元の培地を
廃棄し、新鮮な培地をつぎ足した。２７℃にて３または
４日間熟成後、上澄溶液を採取し，Ｓｆ９１１１１１！
の融合性単層において測定した。閉塞体を示さない（光
顕微鏡的に測定した）ブラークをＪＩＥｉ採り、ポリへ
ドリンー負の組換えウイルスを得るためにＳｆ９ＩＩｌ
ｒｆ＆上で２回、再ブラーク化を行なった。高力価ウイ
ルス（１０７から１０８ｐ． ｒ．ｕ． ／ ｍｌ ）
株をＩ￥ＪＬた。
から１０マイクＵグラム）および１マイクログラム（７
）ＡＣＮＰＶ ＤＮＡ （１．５或） を、同１どＤ
ＯＴＭΔ″リビド溶液（Ｌｉｆｅ ＳｃｉｅｎｃｅＴｅ
ＣｈＯｎ＋０１ＪＬ ｝１０） （ ６ ６ μ７
／ｄをＨＥＰＥＳ緩衝溶液中に含む）と混合した。次い
でリポソームにカブセノレ化されたＤＮＡをＴ−２５７
ラス」中のＳｆ９細胞に加え、１．５時間熟成し、次い
で３Ｉｄの新鮮な培地を加えた。４時間後に元の培地を
廃棄し、新鮮な培地をつぎ足した。２７℃にて３または
４日間熟成後、上澄溶液を採取し，Ｓｆ９１１１１１！
の融合性単層において測定した。閉塞体を示さない（光
顕微鏡的に測定した）ブラークをＪＩＥｉ採り、ポリへ
ドリンー負の組換えウイルスを得るためにＳｆ９ＩＩｌ
ｒｆ＆上で２回、再ブラーク化を行なった。高力価ウイ
ルス（１０７から１０８ｐ． ｒ．ｕ． ／ ｍｌ ）
株をＩ￥ＪＬた。
例 ５
組換え イルス感染細胞上澄中のヒトベータＮＧＦの免
疫測定 ３５ｍの組ｉ培養皿中の昆虫細胞［アメリカンタイプ力
ルチャー コレクション（ＡＴＣＣ）、Ｏツクヴイル、
ＭＯから入手した（アキアワ」トウ卵巣（ Ｆａｌｌ
Ａｒｍｙｗｏｒｍ Ｏｖａｒｙ ）スボドプテラフルジ
ベルダ（Ｓｆ９）ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１７１１）］を、組
換えウイルスから誘導された１）ＡＣＹＩＭｈＮＧＦま
たは １）ＡＣＹ２ＭｈＮＧＦのいずれかで別々に１００ｐ．
ｆ．ｕ．／Ｉｔ胞の倍々によって感染させた。１ｌＩｌ
ｌ￥間の後、感染ウイルスを除去し、２−の新鮮Ｇｒａ
ｌ培地（Ｊｎ Ｓｃｉｅｎ口ｒｉｃ ． Ｗｏｏｄｌａ
ｎｄ， ＣＡ） （胎仔性ウシ血清を含まない）を添
加した。７２時間後、培養上澄を回収し、１０倍に濃縮
した。該濃縮試料を、抗一マウスＮＧＦ抗体を使用して
、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンプロット分析のいずれか
に供した。ウエスタンプロット（第４図）およびＥＬＩ
ＳＡの両方の結果は、ｐＡＣＹＩＭｈＮＧＦが検出可能
な爪のｈＮＧＦを産生じない一方、ｐＡｃＹ２ＭｈＮＧ
Ｆ誘導組換えウイルスは、約１マイクログラム／ｄのｈ
ＮＧＦを培地中に分秘することを示した。
疫測定 ３５ｍの組ｉ培養皿中の昆虫細胞［アメリカンタイプ力
ルチャー コレクション（ＡＴＣＣ）、Ｏツクヴイル、
ＭＯから入手した（アキアワ」トウ卵巣（ Ｆａｌｌ
Ａｒｍｙｗｏｒｍ Ｏｖａｒｙ ）スボドプテラフルジ
ベルダ（Ｓｆ９）ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１７１１）］を、組
換えウイルスから誘導された１）ＡＣＹＩＭｈＮＧＦま
たは １）ＡＣＹ２ＭｈＮＧＦのいずれかで別々に１００ｐ．
ｆ．ｕ．／Ｉｔ胞の倍々によって感染させた。１ｌＩｌ
ｌ￥間の後、感染ウイルスを除去し、２−の新鮮Ｇｒａ
ｌ培地（Ｊｎ Ｓｃｉｅｎ口ｒｉｃ ． Ｗｏｏｄｌａ
ｎｄ， ＣＡ） （胎仔性ウシ血清を含まない）を添
加した。７２時間後、培養上澄を回収し、１０倍に濃縮
した。該濃縮試料を、抗一マウスＮＧＦ抗体を使用して
、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンプロット分析のいずれか
に供した。ウエスタンプロット（第４図）およびＥＬＩ
ＳＡの両方の結果は、ｐＡＣＹＩＭｈＮＧＦが検出可能
な爪のｈＮＧＦを産生じない一方、ｐＡｃＹ２ＭｈＮＧ
Ｆ誘導組換えウイルスは、約１マイクログラム／ｄのｈ
ＮＧＦを培地中に分秘することを示した。
例 ６
無血酒培地中でのｈＮＧＦの
無血清培地（ＸＬ−４００）は、
ＪＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ． Ｗｏｏｄｌａ
ｎｄ Ｃ＾から購入した。
ｎｄ Ｃ＾から購入した。
２７℃（７）ＸＬ−４００培ｆｉ中に繁ＭしたＳｆ９１
ｌ１胞を、１００−シェーカーフラスコ中で懸濁状態で
育生した。細胞密度を新鮮培地で希釈しっつ３×１０
から１Ｘ１０６１１胞／ｄに保持しｌこ。対数相におい
て倍増する時固は、約２４時間であつた。細胞密度５×
１０ から２．４Ｘ１０６ｌＩｌ胞／Ｉｌ１のＳｆ９１
１を、組換えウイルスにより、感染の種々の倍率（ＭＯ
Ｉ）（０．０１から１０９．ｒ．ｕ．／細胞まで》をも
って感染させた。
ｌ１胞を、１００−シェーカーフラスコ中で懸濁状態で
育生した。細胞密度を新鮮培地で希釈しっつ３×１０
から１Ｘ１０６１１胞／ｄに保持しｌこ。対数相におい
て倍増する時固は、約２４時間であつた。細胞密度５×
１０ から２．４Ｘ１０６ｌＩｌ胞／Ｉｌ１のＳｆ９１
１を、組換えウイルスにより、感染の種々の倍率（ＭＯ
Ｉ）（０．０１から１０９．ｒ．ｕ．／細胞まで》をも
って感染させた。
培養上澄を、感染後３、５おより６日において採取した
。０．２２μｍｌｌフィルタ系（ｃｏｒｎｉｎｇｇｌａ
ｓｓｗａｒｅ， Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＮＹ）を通して口
過した後、口液中に存在リるｆｉＮＧＦの橿をＥＬＩＳ
Ａ法により測定した。ＸＬ−４００培地においては、組
換えｈＮＧＦは、Ｓｆ９１１１胞が密度２．４×１０６
細胞／ｄかつＭＯＩ０．０１において感染ざれた場合に
、感染後３日目に最適に産生ざれた（約６μｔＪ／ｄ）
。
。０．２２μｍｌｌフィルタ系（ｃｏｒｎｉｎｇｇｌａ
ｓｓｗａｒｅ， Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＮＹ）を通して口
過した後、口液中に存在リるｆｉＮＧＦの橿をＥＬＩＳ
Ａ法により測定した。ＸＬ−４００培地においては、組
換えｈＮＧＦは、Ｓｆ９１１１胞が密度２．４×１０６
細胞／ｄかつＭＯＩ０．０１において感染ざれた場合に
、感染後３日目に最適に産生ざれた（約６μｔＪ／ｄ）
。
例 ７
旦上』Ｊノ最呂Ｌ弘立ｌ
［ｍａ＋ｕｌｏｎ − ２平底９６穴プレート（ Ｏｙ
ｎａｔｅｃｈＬａｂｓ Ｉｎｃ．カタログ番号０１１
−０１０−３４５０）を、抗一マウスーベータ（２．５
３）ＮＧＦ（Ｂｏｅｈｒｉｎａｅｒ Ｈａｎｎｈｅｉｍ
，カタログ番号１００８２１８）により、１μｇ／ｍ
および０．１５ｍｌ！／穴のｌｌｒ！Ｌで、少なくとも
２ｖ１問被覆した。
ｎａｔｅｃｈＬａｂｓ Ｉｎｃ．カタログ番号０１１
−０１０−３４５０）を、抗一マウスーベータ（２．５
３）ＮＧＦ（Ｂｏｅｈｒｉｎａｅｒ Ｈａｎｎｈｅｉｍ
，カタログ番号１００８２１８）により、１μｇ／ｍ
および０．１５ｍｌ！／穴のｌｌｒ！Ｌで、少なくとも
２ｖ１問被覆した。
（ＮＧＦは、コーティング緩衝液（Ｎａ２Ｃ０３／Ｎａ
ＨＣ０ ，５０ａＨ：Ｎａアジド０．１％ｗ／ｖ ：
０１１９ ． ６ ）により希釈した。）次いで、該
プレートを洗浄緩衝液（５０ｌＭトリスーＨＣＩ、ｐｔ
ｌ７．Ｏ ： ２００＊ｌ４ ＮａＣ１、１０＠Ｈｃ
ａｃ１ 、ｏ．ｉ％（ ｗ／ｖ） トライトンＸ−１０
０、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｎａ−アジド）により洗浄し
た。次に、咳プレートをＢＳＡ （洗浄ａＩ＃Ｊ液中に
１％ＢＳＡ，Ｓｌ＋ｉａ，ＲＩＡ級、力９０グｉＱＡ−
７８８８）により室温下で少なくとも３０分間ブロック
し、再び洗′ｆＩ１ｌｌ衝液により洗浄した。
ＨＣ０ ，５０ａＨ：Ｎａアジド０．１％ｗ／ｖ ：
０１１９ ． ６ ）により希釈した。）次いで、該
プレートを洗浄緩衝液（５０ｌＭトリスーＨＣＩ、ｐｔ
ｌ７．Ｏ ： ２００＊ｌ４ ＮａＣ１、１０＠Ｈｃ
ａｃ１ 、ｏ．ｉ％（ ｗ／ｖ） トライトンＸ−１０
０、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｎａ−アジド）により洗浄し
た。次に、咳プレートをＢＳＡ （洗浄ａＩ＃Ｊ液中に
１％ＢＳＡ，Ｓｌ＋ｉａ，ＲＩＡ級、力９０グｉＱＡ−
７８８８）により室温下で少なくとも３０分間ブロック
し、再び洗′ｆＩ１ｌｌ衝液により洗浄した。
標準曲線は、各々の商業的な検定に包含される：蒸留水
中に１００μｇ／一の濃度をもって再構成され、５μ１
／ヂューブの分別物として−６０℃で保存された２．５
８？ウスＮＧＦ （Ｓｉｇｍａ １１Ｊ品番号８６００
９）を、解凍し、４９５μオの試料緩衝液（２０μｇ／
ｄのアブＯチニンが添加されたブロック用緩ｉｌｖｊＬ
． Ｌｌｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓｆｌｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｃｏ．カタログ番号１ １ ３８８）により希
釈した。この標準（最終ＮＧＦ１度１μｇ／ｄ）は、４
℃において少なくとも１０日間安定である。
中に１００μｇ／一の濃度をもって再構成され、５μ１
／ヂューブの分別物として−６０℃で保存された２．５
８？ウスＮＧＦ （Ｓｉｇｍａ １１Ｊ品番号８６００
９）を、解凍し、４９５μオの試料緩衝液（２０μｇ／
ｄのアブＯチニンが添加されたブロック用緩ｉｌｖｊＬ
． Ｌｌｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓｆｌｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｃｏ．カタログ番号１ １ ３８８）により希
釈した。この標準（最終ＮＧＦ１度１μｇ／ｄ）は、４
℃において少なくとも１０日間安定である。
該ｍＮＧＦＩａ準を、試料Ｉｔ物液により倍々に一連に
希釈し、ＥＬＩＳＡプレート（０．１ｍ／穴一一対で）
上に加えた。培ｉＩ液についても、試料緩衝液中に一連
に稀釈（１／２から１／６４，０００） シ、プレート
上に加えた（この場合も０．１ｍ／穴）．４℃において
一夜熟成の後、該穴を反復洗浄した．ＮＧＦ （２．５
８）一ベーターｇａｋ共役物（ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｈａｎｎｈｅｉｍ， カタログ番号１００８２３４
、ブ［１ツク用Ｎ衝液中に０．０１２５単位／Ｉｄ）を
、各穴に加えた。３７℃にて４１Ｒ間熟成後、該プレー
トを再度洗浄した。０． ２ｍｌ！の新たに調製した基
質溶液（基質ｗｉｔ中に２ａｙ／一のクロロフェノール
レッドーベータ一〇一ガラクトピラノシド：１００＋ａ
Ｈのｈｅｏｅｓ，ｐＨ７．Ｏ ：１５０１ＮのＮａＣＪ
、２１１ＨのＭｃｘＣＩ ：０．１％（ｗ／ｖ）Ｎ
ａ ７ジド、１％（Ｗ／Ｖ）の７ルグミン）を各穴に加
え、更に３７℃にて２時問熟成した。
希釈し、ＥＬＩＳＡプレート（０．１ｍ／穴一一対で）
上に加えた。培ｉＩ液についても、試料緩衝液中に一連
に稀釈（１／２から１／６４，０００） シ、プレート
上に加えた（この場合も０．１ｍ／穴）．４℃において
一夜熟成の後、該穴を反復洗浄した．ＮＧＦ （２．５
８）一ベーターｇａｋ共役物（ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｈａｎｎｈｅｉｍ， カタログ番号１００８２３４
、ブ［１ツク用Ｎ衝液中に０．０１２５単位／Ｉｄ）を
、各穴に加えた。３７℃にて４１Ｒ間熟成後、該プレー
トを再度洗浄した。０． ２ｍｌ！の新たに調製した基
質溶液（基質ｗｉｔ中に２ａｙ／一のクロロフェノール
レッドーベータ一〇一ガラクトピラノシド：１００＋ａ
Ｈのｈｅｏｅｓ，ｐＨ７．Ｏ ：１５０１ＮのＮａＣＪ
、２１１ＨのＭｃｘＣＩ ：０．１％（ｗ／ｖ）Ｎ
ａ ７ジド、１％（Ｗ／Ｖ）の７ルグミン）を各穴に加
え、更に３７℃にて２時問熟成した。
次いで、ＥＬＩＳＡプレートを丁ｔ ｔｅｒｔｅｋＮｕ
ｌ ｔ ｉ ｓｋａｎマイク口タイタープレート読取
装置により、５７０１１１１のＨｕｌｔｉｓｋａｎ干渉
フィルターを用いて読んだ。
ｌ ｔ ｉ ｓｋａｎマイク口タイタープレート読取
装置により、５７０１１１１のＨｕｌｔｉｓｋａｎ干渉
フィルターを用いて読んだ。
例 ８
バタロウイルス産生ｉ１ＮＧＦの生 活組換えＤＡＣＹ
１ＭＩＩＮＧＦまたは ｐＡｃＹ２ＭｈＮＧＦウイルスにより産生される物質の
生物活性を、インビトロにおいてＰＣ１２フ？オクロモ
ナイト’７ ｍ ＋ｂ株（ ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙ
ｔｏｍａｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ） （Ｇｒｅｅｎｅ，Ｌ
．＾．の、ＴｒｅｎｄＳＮｃｕｒｏｓｃｉ． ７ ：
９ １ （１ ９８６） ）上で試験した。
１ＭＩＩＮＧＦまたは ｐＡｃＹ２ＭｈＮＧＦウイルスにより産生される物質の
生物活性を、インビトロにおいてＰＣ１２フ？オクロモ
ナイト’７ ｍ ＋ｂ株（ ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙ
ｔｏｍａｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ） （Ｇｒｅｅｎｅ，Ｌ
．＾．の、ＴｒｅｎｄＳＮｃｕｒｏｓｃｉ． ７ ：
９ １ （１ ９８６） ）上で試験した。
ＰＣ，２ｌＩＩＩｌｌを、５％の限定的に添加された仔
ウシ血清および５％のウマ而清が添加されたダルベツコ
の修為イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で育生し、穴《１６
層》あたり約５０．０００１１胞の密度で播種した。Ｉ
ｔ胞を、組換えバクロウイルス感染細胞、またはマウス
ＮＧＦ （Ｓｉａｇｉａ ）山釆のいずれかの培養液の
一回の添加により処理した。細胞を、添加後１４日まで
観察した。
ウシ血清および５％のウマ而清が添加されたダルベツコ
の修為イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で育生し、穴《１６
層》あたり約５０．０００１１胞の密度で播種した。Ｉ
ｔ胞を、組換えバクロウイルス感染細胞、またはマウス
ＮＧＦ （Ｓｉａｇｉａ ）山釆のいずれかの培養液の
一回の添加により処理した。細胞を、添加後１４日まで
観察した。
ｐＡｃＹ２ＭｈＮＧＦ組換えバクロウイルス感染細胞由
来の培養液（２５μｌ／一培地）により処理されたＰＣ
１２細胞は、急速な分化を起こした（第５図）。神経軸
索の出芽に示される攻撃の比は、一の培地あたり２５お
よび１００ｎＯにおけるマウスＮＧＦ （２４−３６時
問〉より実質的により速い（１２時間以内）（第６図）
。ＰＣ１■ｍ胞の速い分化を誘導する能力は、バクロウ
イルス産生ｈＮＧＦの本来の性質であるように見える。
来の培養液（２５μｌ／一培地）により処理されたＰＣ
１２細胞は、急速な分化を起こした（第５図）。神経軸
索の出芽に示される攻撃の比は、一の培地あたり２５お
よび１００ｎＯにおけるマウスＮＧＦ （２４−３６時
問〉より実質的により速い（１２時間以内）（第６図）
。ＰＣ１■ｍ胞の速い分化を誘導する能力は、バクロウ
イルス産生ｈＮＧＦの本来の性質であるように見える。
伯？、分化の持続時問は、濃度依存性である。感染Ｓｆ
９細胞液の濃縮調製物により処理されたＰＣ１２細胞は
、実験の継続期問中（１４日問）分化が続いた。一方、
バクロウイルス産生ｈＮＧＦのより希釈された調製物（
０．ＩＸ）により処理されたＰＣ１■細胞は、５日後に
それらの分化の表現聖が逆転した。
９細胞液の濃縮調製物により処理されたＰＣ１２細胞は
、実験の継続期問中（１４日問）分化が続いた。一方、
バクロウイルス産生ｈＮＧＦのより希釈された調製物（
０．ＩＸ）により処理されたＰＣ１■細胞は、５日後に
それらの分化の表現聖が逆転した。
興味深いことに、ｐ Ａ ｃ Ｙ Ｉ Ｍ ｈ Ｎ Ｇ
Ｆ ［１換えウイルス感染細胞上澄により処理された
ＰＣ１■細胞は、分化の徴候を示さなかった。この観察
は、ウエスタン．プロットおよびＥＬＩＳＡの負の結果
と一致する《例５）。
Ｆ ［１換えウイルス感染細胞上澄により処理された
ＰＣ１■細胞は、分化の徴候を示さなかった。この観察
は、ウエスタン．プロットおよびＥＬＩＳＡの負の結果
と一致する《例５）。
バクＯウイルス産生ｆｉＮＧＦによる生物学的活性は、
抗一マウスＮＧＦ抗体により中和され得る（第７図）。
抗一マウスＮＧＦ抗体により中和され得る（第７図）。
例 ９
ＰＣ１■細胞のＮＧＦ−誘導分化の・中和れたように塗
布した：ＮＧＦを培養培地に添加するのに先立って、抗
−マウスＮＧＦ抗血清（ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｃ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ． 、生血清の１：５００お
よび１：１０００希釈）を該ＰＣ１２１Ｉｌ胞に添加し
た。次いでマウスＮ Ｇ Ｆ （ ＳｉｏＩＩｌａ ）
または組換えヒトＮＧＦｉ）Ｃ１，２１Ｂ胞培養物に加
え、それらの細胞分化に対する効果を１４日間の期間観
察した。
布した：ＮＧＦを培養培地に添加するのに先立って、抗
−マウスＮＧＦ抗血清（ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｃ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ． 、生血清の１：５００お
よび１：１０００希釈）を該ＰＣ１２１Ｉｌ胞に添加し
た。次いでマウスＮ Ｇ Ｆ （ ＳｉｏＩＩｌａ ）
または組換えヒトＮＧＦｉ）Ｃ１，２１Ｂ胞培養物に加
え、それらの細胞分化に対する効果を１４日間の期間観
察した。
ヒト《２５μｌの培養液》およびマウス（１００ｎＱ）
のＮＧＦ＃）両者によるＰＣ１２１Ｂ胞のＮＧＦ誘導分
化は、杭ＮＧＦ杭血清の生血清１：５００および１：１
０００希釈により中和された。
のＮＧＦ＃）両者によるＰＣ１２１Ｂ胞のＮＧＦ誘導分
化は、杭ＮＧＦ杭血清の生血清１：５００および１：１
０００希釈により中和された。
例１０
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞［ Ｂｉｅｄｌｅｒらの、Ｃａｎｃ
ｅｒ肚Ｌ 正ユ：２６４３ （１９７３）、同文献３８
：３７５１ （１９７８）１の培養物を、７５ｃ講２Ｃ
ｏｒｎｉｎｕ Ｔ − ７ ５フラスコ中において、ダ
ルベツコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）および１０％の
胎孔性ウシ血′ａ（ＪＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ）が
添加されたハム（ｌｌａｌ》のＦ − １ ２ （ＪＲ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗｏｏｄｌａｎｄ Ｃ八）
の１：１ｕ合物中で３７℃にて維持した。細胞を、フラ
スコあたり４ａｅのＤＭＥＭ中の０．０２％ＥＤＴＡを
加え、次いで激しく撮どうすることにより、移送および
採取のために分離した。１１Ｉｌ１を、１：５の分配比
で通過させた。
ｅｒ肚Ｌ 正ユ：２６４３ （１９７３）、同文献３８
：３７５１ （１９７８）１の培養物を、７５ｃ講２Ｃ
ｏｒｎｉｎｕ Ｔ − ７ ５フラスコ中において、ダ
ルベツコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）および１０％の
胎孔性ウシ血′ａ（ＪＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ）が
添加されたハム（ｌｌａｌ》のＦ − １ ２ （ＪＲ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗｏｏｄｌａｎｄ Ｃ八）
の１：１ｕ合物中で３７℃にて維持した。細胞を、フラ
スコあたり４ａｅのＤＭＥＭ中の０．０２％ＥＤＴＡを
加え、次いで激しく撮どうすることにより、移送および
採取のために分離した。１１Ｉｌ１を、１：５の分配比
で通過させた。
いずれの場合にも培養物中に抗菌剤を使用しなかった。
負の対照上澄、１００ｎＭｄの濃度のＮＧＦ （２．５
ＳｖウスＮＧＦ， Ｓｉａｍａ ）またはヒトＮＧＦ
（２５μ１／ｒｄ＞に対する細胞のｇｔｉ＊の後、該Ｉ
ｔ胞を分化の徴候について２４時間毎に観察した。培養
継続のために培地を２日毎に交換し、かつＮＧＦを充足
した。アフイジコリン（Ａｐｈｉｄｉｃｏｌｉｎ ）を
、処理の第２３１１に１０μｇ／一で培地に加えた。
ＳｖウスＮＧＦ， Ｓｉａｍａ ）またはヒトＮＧＦ
（２５μ１／ｒｄ＞に対する細胞のｇｔｉ＊の後、該Ｉ
ｔ胞を分化の徴候について２４時間毎に観察した。培養
継続のために培地を２日毎に交換し、かつＮＧＦを充足
した。アフイジコリン（Ａｐｈｉｄｉｃｏｌｉｎ ）を
、処理の第２３１１に１０μｇ／一で培地に加えた。
ＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽細胞株に対するヒトＮＧＦ
（２５μＪ！／ｄ）の添加は、急速な分化（細胞からの
軸索突起の伸長）を誘導したが、負の対照培養液上澄の
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞への投与（２５μ１／Ｉｉ）の後に
は何らの効果も観察されなかった。２４時間の早期に始
まったＮＧＦによる分化の急速な攻撃は、同じ細胞系に
対づるマウスＮＧＦ （Ｓｉｕａ ）の添加の優にｖｉ
察されたより遅い攻撃（５日） （Ｊｃｎｓｅｎ，
Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ． １ ２ ０ ：５６（１９８７）
）とは対照的であった。
（２５μＪ！／ｄ）の添加は、急速な分化（細胞からの
軸索突起の伸長）を誘導したが、負の対照培養液上澄の
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞への投与（２５μ１／Ｉｉ）の後に
は何らの効果も観察されなかった。２４時間の早期に始
まったＮＧＦによる分化の急速な攻撃は、同じ細胞系に
対づるマウスＮＧＦ （Ｓｉｕａ ）の添加の優にｖｉ
察されたより遅い攻撃（５日） （Ｊｃｎｓｅｎ，
Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ． １ ２ ０ ：５６（１９８７）
）とは対照的であった。
アフイジコリンは、分化ａＩ！に対しては何らの効果も
持たないが、アルフ７ＤＮＡポリメラーゼの可逆的な阻
害剤であり、従って有糸分裂ずる細胞を殺すであろう。
持たないが、アルフ７ＤＮＡポリメラーゼの可逆的な阻
害剤であり、従って有糸分裂ずる細胞を殺すであろう。
ＮＧＦによる分化が誘導されなかった僅かな有糸分裂的
に活性なｍｎａは、静止づなわら分化細胞に生成するた
め、第２週における細胞のアフィジコリンによる処理が
必要である。
に活性なｍｎａは、静止づなわら分化細胞に生成するた
め、第２週における細胞のアフィジコリンによる処理が
必要である。
例１１
ｈＮＧＦｍ伝子およびＮＧＦのガンマサブユニットまた
は酵母ＫＥＸ２１ンドベプチダーゼ等の処Ｎ醇素をコー
ドする他の遺伝子を高水準で共発現するように特異的に
加工された転移ベクターの発展は、成熟ＮＧＦの多量産
生への別の到達手段である。これは、ベータＮＧＦ遺伝
子をポリへドリンブロモータの下流に挿入し、かつガン
マＮＧＦまたはＫＥＸ２遺伝子をポリへドリンプロモー
タの第２の複写物、他のバクロウイルスプロモータ、他
えばｐ１０後方プロモータ、または設計された合成プロ
モータ等の制御下に挿入することにより達成され得る。
は酵母ＫＥＸ２１ンドベプチダーゼ等の処Ｎ醇素をコー
ドする他の遺伝子を高水準で共発現するように特異的に
加工された転移ベクターの発展は、成熟ＮＧＦの多量産
生への別の到達手段である。これは、ベータＮＧＦ遺伝
子をポリへドリンブロモータの下流に挿入し、かつガン
マＮＧＦまたはＫＥＸ２遺伝子をポリへドリンプロモー
タの第２の複写物、他のバクロウイルスプロモータ、他
えばｐ１０後方プロモータ、または設計された合成プロ
モータ等の制御下に挿入することにより達成され得る。
次いで、組換えウイルスを、叢」，に記載されているよ
うに耐生し、λ支に記載されているようにＳｆ９１１胞
の感染に使用される。
うに耐生し、λ支に記載されているようにＳｆ９１１胞
の感染に使用される。
例１２
記 障害試験におけるｎＮＧＦ
一般論
この試験においては、損傷は、ＡＤ患者に見られる記憶
および認識能力の傷害の見地からコリン作用性機能不全
の模倣を試みる。ｈＮＧＦ治療は、傷害の程度を著しく
減少した。
および認識能力の傷害の見地からコリン作用性機能不全
の模倣を試みる。ｈＮＧＦ治療は、傷害の程度を著しく
減少した。
』
雄のＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｗｉｓｔｅｒラット
（２８０−３０（１）を、き、温度および湿度が制御さ
れ、１２時間の明／暗サイクルが維持された住居に個別
に収容した。最初の１０日間は、｛ｄ究動物は、飼に自
由に近づけた。１１日以後は、動物の給飼をずべての動
物がそれらの元の体重の８０％となるまで減少させた。
（２８０−３０（１）を、き、温度および湿度が制御さ
れ、１２時間の明／暗サイクルが維持された住居に個別
に収容した。最初の１０日間は、｛ｄ究動物は、飼に自
由に近づけた。１１日以後は、動物の給飼をずべての動
物がそれらの元の体重の８０％となるまで減少させた。
この体重は、訓練中を通して維持された。
装置一Ｙ迷路を動物の＠訓練のために用い、各ゴールア
ームは、高さ１３１Ｘ幅１３υ×長さ４７ａｌ１であっ
た。これらのアームは、進入路（高さ１３１×幅１３α
Ｘ長さ４０ｃ腐）からギロチン様とびらにより分離され
ていた。
ームは、高さ１３１Ｘ幅１３υ×長さ４７ａｌ１であっ
た。これらのアームは、進入路（高さ１３１×幅１３α
Ｘ長さ４０ｃ腐）からギロチン様とびらにより分離され
ていた。
訓練方法一訓練および試験方法は、基本的にはＲａｌｌ
ｒｅＺおよびＳｔｅｉｎの方法（ ｅｅｈａｖ． Ｂｒ
ａｉｎ ＲｅＳ１３：５３−６１ （１９８２）に従っ
た。概略的には、動物を異なる実験グループ（ｎ−５−
９）に無作為に配分し、３日間の前訓練において実験者
およびＹ迷路に馴ませた。次いで、動物は、５日間無作
為変更訓練にあてられた。ラットを進入路の基部に置い
た後、該動物は、放たれ、アームの一方に進入すること
が許された。一旦ゴールア一ムに入ると、該動物は飼の
報Ｍ（４５１１１９のＮｏｙｅｓコードベレット）を得
た。ベレットを食べた後、該動物は進入路に戻され、放
たれて、次の無作為に選ばれ、再び該ラットが胴の報酬
を得るゴールアームに進入することが許された。該動物
は、合計１０口の左／右無作為変更の一連を経験させら
れた。この強制的な訓練期に続き、動物を、迷路中で自
由に変更するように、すべてがある暴準水準：３日問連
続しての８０％の正しい変更挙動に達するまで訓練した
。
ｒｅＺおよびＳｔｅｉｎの方法（ ｅｅｈａｖ． Ｂｒ
ａｉｎ ＲｅＳ１３：５３−６１ （１９８２）に従っ
た。概略的には、動物を異なる実験グループ（ｎ−５−
９）に無作為に配分し、３日間の前訓練において実験者
およびＹ迷路に馴ませた。次いで、動物は、５日間無作
為変更訓練にあてられた。ラットを進入路の基部に置い
た後、該動物は、放たれ、アームの一方に進入すること
が許された。一旦ゴールア一ムに入ると、該動物は飼の
報Ｍ（４５１１１９のＮｏｙｅｓコードベレット）を得
た。ベレットを食べた後、該動物は進入路に戻され、放
たれて、次の無作為に選ばれ、再び該ラットが胴の報酬
を得るゴールアームに進入することが許された。該動物
は、合計１０口の左／右無作為変更の一連を経験させら
れた。この強制的な訓練期に続き、動物を、迷路中で自
由に変更するように、すべてがある暴準水準：３日問連
続しての８０％の正しい変更挙動に達するまで訓練した
。
外科−ラツ１・をキシラジン（Ｈａｖｅｒ ） ／ケト
アミン（Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ ） ２ ０ ０ ：
２ ０＊／Ｋ９ｉ．ｇ＋．により麻酔し、立体配置フ
レーム（κｏｐｆＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ）に置いた
．ｍ’ｉ蓋骨を露出し、浄化し、各々のＨｅｙｎｅｒｔ
の中核基底（ＮＢＭ）の上部に２つの穴を穿った（座標
は、Ｐａｘｉｎｏおよびｗａｔｓｏｎ （Ｔｈｅ Ｒａ
ｔ Ｂｒａｉｎ ｉｎ ｓｔｅｒｅｏｔａｘ＋ｃＣｏｏ
ｒｄｔｎａｔｅ， 第２ｒ＆、 ＾ｃａｄｅｓｉｃ
Ｐｒｅｓｓ． Ｎｅｗ Ｗｏｒｋ）に従ってプ
レグマから測定し、額角／後端一０． ４ａｍ、横方向
±２．６麿であった）。該大の下の脳膜を員通させ、イ
ボテン酸（５ＩｙＪ／ｄ）で満たしておいたハミルトン
シリンジの先端を脳膜に対して−６．５＃および−７．
５願内方に下げた。１．０μｌのイボテン酸を、ＮＢＭ
中に１分問にわたって注入した。
アミン（Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ ） ２ ０ ０ ：
２ ０＊／Ｋ９ｉ．ｇ＋．により麻酔し、立体配置フ
レーム（κｏｐｆＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ）に置いた
．ｍ’ｉ蓋骨を露出し、浄化し、各々のＨｅｙｎｅｒｔ
の中核基底（ＮＢＭ）の上部に２つの穴を穿った（座標
は、Ｐａｘｉｎｏおよびｗａｔｓｏｎ （Ｔｈｅ Ｒａ
ｔ Ｂｒａｉｎ ｉｎ ｓｔｅｒｅｏｔａｘ＋ｃＣｏｏ
ｒｄｔｎａｔｅ， 第２ｒ＆、 ＾ｃａｄｅｓｉｃ
Ｐｒｅｓｓ． Ｎｅｗ Ｗｏｒｋ）に従ってプ
レグマから測定し、額角／後端一０． ４ａｍ、横方向
±２．６麿であった）。該大の下の脳膜を員通させ、イ
ボテン酸（５ＩｙＪ／ｄ）で満たしておいたハミルトン
シリンジの先端を脳膜に対して−６．５＃および−７．
５願内方に下げた。１．０μｌのイボテン酸を、ＮＢＭ
中に１分問にわたって注入した。
更に、第３の穴を側部脳室上部の頭蓋に穿ち（Ｓ角／後
端−０．８麿、横方向１．４麿）、ステンレス鋼カニュ
ーレを脳膜から４層脳室申に植え付けた．該カニューレ
は、２３ｇのステンレス鋼針から組立てられ、ボリエヂ
レンチューブを介してあらかじめ満たされた殺菌ＡＩＺ
ｅｔ（ＡＩＺａ，ＰａｌＯ Ａｌｔｏ、カリフオノレ
ニア、米国）モデルの２一小型浸透性ボンブ（流速２．
４μ１／時）に連結された。該ボンブは、肩甲骨囚に皮
下的に設置した。次いで、傷を縫合し、ａａ物の回復を
持った。小型ポンプは、異なる治療グループに応じて： ａ） ｈＮＧＦが、０．１μ９／ｄのラット血清を含
む殺菌食塩水中に最終濃度０．１、１．０または１０．
０μ９／Ｉｄ溶解される、すなわら、ラットは、４Ｍ間
の治療期闇に、０．２、２．０または２０．０μ９のｈ
ＮＧＦを受けるか；またはｂ）０．１■／４のラット血
清を含む食塩水により満たされた。
端−０．８麿、横方向１．４麿）、ステンレス鋼カニュ
ーレを脳膜から４層脳室申に植え付けた．該カニューレ
は、２３ｇのステンレス鋼針から組立てられ、ボリエヂ
レンチューブを介してあらかじめ満たされた殺菌ＡＩＺ
ｅｔ（ＡＩＺａ，ＰａｌＯ Ａｌｔｏ、カリフオノレ
ニア、米国）モデルの２一小型浸透性ボンブ（流速２．
４μ１／時）に連結された。該ボンブは、肩甲骨囚に皮
下的に設置した。次いで、傷を縫合し、ａａ物の回復を
持った。小型ポンプは、異なる治療グループに応じて： ａ） ｈＮＧＦが、０．１μ９／ｄのラット血清を含
む殺菌食塩水中に最終濃度０．１、１．０または１０．
０μ９／Ｉｄ溶解される、すなわら、ラットは、４Ｍ間
の治療期闇に、０．２、２．０または２０．０μ９のｈ
ＮＧＦを受けるか；またはｂ）０．１■／４のラット血
清を含む食塩水により満たされた。
処理手続
実験グループは、対照動物（ｎ−６） 、傷害のみ（ｎ
−９＞、０． １ｕ９／一のｈＮＧＦを有するａＩ官（
ｎ−９） 、１．Ｏｕｙ／一のＦＩＮＧＦを有する｛Ｈ
Ｊ（ｎ−９），および１０．０μ９／ｄのｈＮＧＦを有
する傷害＜ｎ−９｝から成っている。該動物は、空間的
変更の仕事において訓練され、外科的に処Ｎされ、次い
で３選間の治ＩＩ ＩＩ問が与えられた。治療期間の後
に、該ラットを、Ｙ−迷路中で再試験し、それらの挙動
的成績を、２０日のｌｌｌｗＢにわたって評価した。
−９＞、０． １ｕ９／一のｈＮＧＦを有するａＩ官（
ｎ−９） 、１．Ｏｕｙ／一のＦＩＮＧＦを有する｛Ｈ
Ｊ（ｎ−９），および１０．０μ９／ｄのｈＮＧＦを有
する傷害＜ｎ−９｝から成っている。該動物は、空間的
変更の仕事において訓練され、外科的に処Ｎされ、次い
で３選間の治ＩＩ ＩＩ問が与えられた。治療期間の後
に、該ラットを、Ｙ−迷路中で再試験し、それらの挙動
的成績を、２０日のｌｌｌｗＢにわたって評価した。
統計的分析−ＣＯＣｈｒａｒｉ−Ｍａｎｔｅｌ−ＨａＯ
ｎＳｚｅｌテストを、治療の全体的な効果に加えて治療
間の対的な差異に対して意味のある試験を得るために使
用した。
ｎＳｚｅｌテストを、治療の全体的な効果に加えて治療
間の対的な差異に対して意味のある試験を得るために使
用した。
結 東
実験グループにおける傷害後の死亡率は、４０％で、最
終的グループの数は、対照（６）、傷害のみ（６）、０
．１μ９／ｄのｈＮＧＦを右する傷害（５） 、１．Ｏ
ｔｔｙ．／ｒｄのｈＮＧＦを有する傷害＜６）、１０．
０μ９／ＩｄのｈＮＧＦを有するＷ書（６）であった。
終的グループの数は、対照（６）、傷害のみ（６）、０
．１μ９／ｄのｈＮＧＦを右する傷害（５） 、１．Ｏ
ｔｔｙ．／ｒｄのｈＮＧＦを有する傷害＜６）、１０．
０μ９／ＩｄのｈＮＧＦを有するＷ書（６）であった。
空聞的変更挙動におけるイボテン酸傷害およびｆｉＮＧ
Ｆの効果を測定するために、３Ｖ４類の行動ｍ準を検討
した：（１）！！害後、基準に至る日数、（ｉｉ）１日
あたりの変更誤りの平均数、および（ｉｉＮ ｌ日あた
りの忍耐的誤りの平均数。
Ｆの効果を測定するために、３Ｖ４類の行動ｍ準を検討
した：（１）！！害後、基準に至る日数、（ｉｉ）１日
あたりの変更誤りの平均数、および（ｉｉＮ ｌ日あた
りの忍耐的誤りの平均数。
第８図に示されるように、横軸方向のイボテン酸傷害動
物は、対照動物に比べて確立された水準まで到達するた
めに著しく長くかかる（ｐ＜０．０１）。この効果は、
ｈＮＧＦの１．０および１０．０μ９／ｄの投与により
部分的に改善される。傷害のみの動物と、傷害を有する
が、１．０μＳＦ／ａ！ｈＮＧＦ （ｐ＜０．０１ ）
おＪ；び１０．０μ９／ｄｈＮＧＦ （ｐ＜０．０１
）Ｉ．：より治療された動物との間には、顧著な差異が
あつた。傷害のみのラットと、傷害を有し、０．１μｇ
／ｄのｈＮＧＦを投与ざれたものとの間にはｆｉ箸な差
はなかった。
物は、対照動物に比べて確立された水準まで到達するた
めに著しく長くかかる（ｐ＜０．０１）。この効果は、
ｈＮＧＦの１．０および１０．０μ９／ｄの投与により
部分的に改善される。傷害のみの動物と、傷害を有する
が、１．０μＳＦ／ａ！ｈＮＧＦ （ｐ＜０．０１ ）
おＪ；び１０．０μ９／ｄｈＮＧＦ （ｐ＜０．０１
）Ｉ．：より治療された動物との間には、顧著な差異が
あつた。傷害のみのラットと、傷害を有し、０．１μｇ
／ｄのｈＮＧＦを投与ざれたものとの間にはｆｉ箸な差
はなかった。
横軸方向の傷害は、また、ラットに対照ラットと比べた
場合、顕茗な日変更の誤り（ｐ＜０．０１）をＫ｛き、
かつ対象動物に比べて顕著な忍耐的誤り（ｐ＜０．０１
）を招く。
場合、顕茗な日変更の誤り（ｐ＜０．０１）をＫ｛き、
かつ対象動物に比べて顕著な忍耐的誤り（ｐ＜０．０１
）を招く。
ｈＮＧＦ治療は、ＮＢＭに対する横軸方向のイボテン酸
傷害に続いて観察される損傷に限定された。傷害が治療
された、および傷害が１．０μ９／ｄ （ｐ＜０．０１
）ならびに１０．０μｇ／ｍｅ（ｐ＜０．０１ ）の
投与をもってｈＮＧＦで治療された動物の問には、変更
の誤り（第８ＦｊＡ）の平均数と、忍耐的誤りの平均数
とにおいて著しい差異があった。傷害が治療された、お
よび傷害が０．１μｇ／ｄｈＮＧＦで治療された動物の
間には、９日までは、変更および忍耐的誤りの平均数に
おいて顕著な差はなかったが、１０日以後においてはこ
れらのグループ間に著しい差異（ｐ＜０．０１）があっ
た。
傷害に続いて観察される損傷に限定された。傷害が治療
された、および傷害が１．０μ９／ｄ （ｐ＜０．０１
）ならびに１０．０μｇ／ｍｅ（ｐ＜０．０１ ）の
投与をもってｈＮＧＦで治療された動物の問には、変更
の誤り（第８ＦｊＡ）の平均数と、忍耐的誤りの平均数
とにおいて著しい差異があった。傷害が治療された、お
よび傷害が０．１μｇ／ｄｈＮＧＦで治療された動物の
間には、９日までは、変更および忍耐的誤りの平均数に
おいて顕著な差はなかったが、１０日以後においてはこ
れらのグループ間に著しい差異（ｐ＜０．０１）があっ
た。
要約すると、ラットにおけるＨｅｌ／ｎＱｒｔ中核基底
の横軸方向のイボテン酸傷害は、学習した空間的変更挙
動を著しく損なう。この損傷は、組換えｈＮＧＦにより
著しく改善され、ｒｈＮＧＦは、中枢コリン作動性機能
傷害を改善することが示唆される。
の横軸方向のイボテン酸傷害は、学習した空間的変更挙
動を著しく損なう。この損傷は、組換えｈＮＧＦにより
著しく改善され、ｒｈＮＧＦは、中枢コリン作動性機能
傷害を改善することが示唆される。
例１３
例１２に示される試験において、何らの毒性効果も観察
ざれなかった。
ざれなかった。
上記の記載および例は、好ましい実施態様を含めて本発
明を全て開示している。分子遺伝学および関連する科学
における当業者には自明であるような、ここに記載した
方法の変更は、記載された特許請求の範囲に包含される
ものと理解される。
明を全て開示している。分子遺伝学および関連する科学
における当業者には自明であるような、ここに記載した
方法の変更は、記載された特許請求の範囲に包含される
ものと理解される。
第１図は、ｈＮＧＦの成熟ベータサブユニットのアミノ
酸配列を示す図である。 クＯ−ン化されたマウスプレーブローＮＧＦｃＤＮＡと
、ｕｌｌｒｉｃｈ， Ｓｙｍｐ． ｏｎ Ｑｕａｎｔ
Ｂｉｏｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
４ ８ ： ４ ３ ５ （ １ ９ ８ ３ ）によ
り発行されたヒト配列との比較であり、ここでｍはマウ
ス配列、ｈはヒト配列を示し、ＩＶＳは、ヒト遺伝子中
の介在配列の位置を示している。 第２図は、ｐＡｃ３７３ｍｈＮＧＦプラスミドの構築を
示すフローチャートである。 第３図は、ｐＡｃＹＭｈＮＧＦプラスミドの構築を示す
フローチャートである。 第４図は、ウイルス感染細胞の上澄から精製されたｈＮ
ＧＦの銀染色およびウエスタンブロット分析の結果を示
す泳動図である。 第５図（１） 、（２） 、（３）および《４》は、ｐ
ＡｃＹ２ＭｈＮＧＦ組換えバクロウイルス感染細胞由来
の培養液により処理されたＳ胞の状態を示す、つまり生
物の構造を示す写真である。 第６図は、軸索突起の成長により示される攻撃の比率を
示すグラフである。 第７図は、バクロウイルス産生ｈＮＧＦに帰因する生物
学的活性を示すグラフである。 第８図は、ラットにおける記憶の低下および思考力の減
退を示すグラフである。 第４図 フ 奸 〜 ％分化 為 ■ ○ ０ ％分化 手続補正書（自発） 平成１年９月 ４日
酸配列を示す図である。 クＯ−ン化されたマウスプレーブローＮＧＦｃＤＮＡと
、ｕｌｌｒｉｃｈ， Ｓｙｍｐ． ｏｎ Ｑｕａｎｔ
Ｂｉｏｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
４ ８ ： ４ ３ ５ （ １ ９ ８ ３ ）によ
り発行されたヒト配列との比較であり、ここでｍはマウ
ス配列、ｈはヒト配列を示し、ＩＶＳは、ヒト遺伝子中
の介在配列の位置を示している。 第２図は、ｐＡｃ３７３ｍｈＮＧＦプラスミドの構築を
示すフローチャートである。 第３図は、ｐＡｃＹＭｈＮＧＦプラスミドの構築を示す
フローチャートである。 第４図は、ウイルス感染細胞の上澄から精製されたｈＮ
ＧＦの銀染色およびウエスタンブロット分析の結果を示
す泳動図である。 第５図（１） 、（２） 、（３）および《４》は、ｐ
ＡｃＹ２ＭｈＮＧＦ組換えバクロウイルス感染細胞由来
の培養液により処理されたＳ胞の状態を示す、つまり生
物の構造を示す写真である。 第６図は、軸索突起の成長により示される攻撃の比率を
示すグラフである。 第７図は、バクロウイルス産生ｈＮＧＦに帰因する生物
学的活性を示すグラフである。 第８図は、ラットにおける記憶の低下および思考力の減
退を示すグラフである。 第４図 フ 奸 〜 ％分化 為 ■ ○ ０ ％分化 手続補正書（自発） 平成１年９月 ４日
Claims (22)
- （１）昆虫細胞内で機能する制御因子に対して適切な方
向をもつて結合された、ヒト神経成長因子（ｈＮＧＦ）
またはその誘導体類の遺伝子を有してなるバクロウイル
ス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）転移ベクター。 - （２）ｈＮＧＦをコードする該遺伝子が、バクロウイル
ス遺伝子のｍＲＮＡリーダー配列およびプロモータが結
合されたキメラ遺伝子である請求項第１項に記載の転移
ベクター。 - （３）−１８７位の開始コドンより上流側に挿入された
ＢａｍＨＩ制限部位を有する合成アダプタを用いて構築
される請求項第１項または第２項に記載の転移ベクター
。 - （４）該合成アダプタがコード配列： ３５量体： ５′ＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＴＡ
ＧＡＣＴＧＣＡＧＧＴＡＣ３′２７量体：５′ＣＴＧＣ
ＡＧＴＣＴＡＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＧＡＧＣＩＧＧ３′
を有する請求項第３項に記載の転移ベクター。 - （５）ｐＡＣ３７３ｍｈＮＧＦまたはその誘導体である
請求項第３項に記載の転移ベクター。 - （６）該ＢａｍＨＩ制限部位が該ｈＮＧＦ遺伝子の−１
２１位の開始コドンに隣接するように挿入された合成ア
ダプタを用いて構築される請求項第１項に記載の転移ベ
クター。 - （７）該合成アダプタがコード配列： ３５量体： ５′ＧＧＧＧＡＴＣＣＡＡＡＴ￥ＡＴＧ￥ＴＣＣ￥ＡＴ
Ｇ￥ＴＴＧＴＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴ３′３９量体： ５′ＧＡＴＣＡＧＡＧＴＧＴＡＧＡＡＣＡＡＣＡＴＧＧ
ＡＣＡＴＡＴＴＴＧＧＡＴＣＣＣＣ３′を有する請求項
第６項に記載の転移ベクター。 - （８）ｐＡｃＹ２ＭｈＮＧＦまたはその誘導物である請
求項第６項に記載の転移ベクター。 - （９）ベータｈＮＧＦの遺伝子を有してなる請求項第１
項から第８項までのいずれかに記載の転移ベクター。 - （１０）請求項第１項から第９項までのいずれかに記載
の転移ベクターにより感染された昆虫細胞。 - （１１）スポドプテラ・フルジペルダ （Ｓｐｏｄｏｐｔｃｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ
９））である請求項第１０項に記載の昆虫細胞。 - （１２）請求項第１０項または第１１項に記載の該昆虫
細胞を感染させることにより調製される生物学的に活性
なｈＮＧＦまたはその誘導体。 - （１３）ａ）該ｈＮＧＦの遺伝子をバクロウイルス転移
ベクター中に挿入してキメラ遺伝子を形成し；ｂ）該（
ａ）のキメラ遺伝子をバクロウイルス中に結合し； ｃ）該組換えバクロウイルスにより昆虫細胞に感染させ
； ｄ）該（ｃ）の感染昆虫細胞を育生し；およびｅ）使用
した培養培地から該ｈＮＧＦまたはその誘導体を採取す
ることからなる、 昆虫細胞内における生物学的に活性なｈＮＧＦまたはそ
の誘導体の製造方法。 - （１４）該昆虫細胞が、低または無血清培地中で育生さ
れる請求項第１３項に記載の方法。 - （１５）該キメラ遺伝子が、バクロウイルス（発現ベク
ター）中にリボ感染法を用いて結合される請求項第１３
項または第１４項に記載の方法。 - （１６）該昆虫細胞が、該ｈＮＧＦのベータサブユニッ
トをコードする組換えウィルスにより感染される請求項
第１３項、第１４項または第１５項に記載の方法。 - （１７）該感染昆虫細胞が、生物学的に活性なベータｈ
ＮＧＦを培養培地中に分泌する請求項第１６項に記載の
方法。 - （１８）ヒトＮＧＦまたはその誘導体のＤＮＡコード配
列、および該ｈＮＧＦコード配列のバクロウイルス発現
系中へのトランスフエクシヨンに要する制御因子を有し
、ｈＮＧＦまたはその生物学的に活性な誘導体の発現を
もたらす昆虫細胞への感染が可能なｈＮＧＦ発現系。 - （１９）ｈＮＧＦまたはその生物学的に活性な誘導体を
、許容され得る医薬用担体中に含有する医薬組成物。 - （２０）ヒトの神経系疾患治療用の請求項第１９項記載
の医薬組成物。 - （２１）ヒトのアルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ
’ｓＤｉｓｅａｓｅ）治療用の請求項第２０項に記載の
医薬組成物。 - （２２）患者に対して０．１−１００μｇ／日をもつて
与えるに充分なｈＮＧＦまたはその誘導体を含有する請
求項第１９項、第２０項または第２１項に記載の医薬組
成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US27487888A | 1988-11-22 | 1988-11-22 | |
| US274878 | 1988-11-22 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6172189A Division JP2732556B2 (ja) | 1988-11-22 | 1994-07-25 | 生物学的に活性なｈＮＧＦ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02291270A true JPH02291270A (ja) | 1990-12-03 |
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