JPS61205485A - ヒト神経成長因子遺伝子セグメント - Google Patents
ヒト神経成長因子遺伝子セグメントInfo
- Publication number
- JPS61205485A JPS61205485A JP60045773A JP4577385A JPS61205485A JP S61205485 A JPS61205485 A JP S61205485A JP 60045773 A JP60045773 A JP 60045773A JP 4577385 A JP4577385 A JP 4577385A JP S61205485 A JPS61205485 A JP S61205485A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna sequence
- formula
- growth factor
- nerve growth
- human nerve
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/48—Nerve growth factor [NGF]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
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- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明はヒト神経成長因子遺伝子セグメントに関するも
のであり、更に詳しくはヒト神経成長因子をコードする
新規な遺伝子セグメント及びその製造法、この遺伝子セ
グメントを含む組換えプラスシト、この組換λプラスシ
トを細胞内に保有する微生物、この微生物を用いてヒト
神経成長因子を製造する方法並びにこの方法によって製
造する３、発明の詳細な説明 ［産業上の利用分野］ 本発明はヒト神経成長因子遺伝子セグメントに関するも
のであり、更に詳しくはヒト神経成長因子をコードする
新規な遺伝子セグメント及びその製造法、この遺伝子セ
グメントを含む組換えプラスミド、この組換えプラスミ
ドを細胞内に保有する微生物、この微生物を用いてヒト
神経成長因子を製造する方法並びにこの方法によって製
造することのできる新規なヒト神経成長因子融合蛋白質
に関するものである。神経成長因子（以下ＮＧＦと略記
する）は胎生時のを髄神経節細胞や交感神経節細胞の生
存および成長分化に必要な物質であり、特に雄マウスの
顎下腺に多聞に含まれている。
のであり、更に詳しくはヒト神経成長因子をコードする
新規な遺伝子セグメント及びその製造法、この遺伝子セ
グメントを含む組換えプラスシト、この組換λプラスシ
トを細胞内に保有する微生物、この微生物を用いてヒト
神経成長因子を製造する方法並びにこの方法によって製
造する３、発明の詳細な説明 ［産業上の利用分野］ 本発明はヒト神経成長因子遺伝子セグメントに関するも
のであり、更に詳しくはヒト神経成長因子をコードする
新規な遺伝子セグメント及びその製造法、この遺伝子セ
グメントを含む組換えプラスミド、この組換えプラスミ
ドを細胞内に保有する微生物、この微生物を用いてヒト
神経成長因子を製造する方法並びにこの方法によって製
造することのできる新規なヒト神経成長因子融合蛋白質
に関するものである。神経成長因子（以下ＮＧＦと略記
する）は胎生時のを髄神経節細胞や交感神経節細胞の生
存および成長分化に必要な物質であり、特に雄マウスの
顎下腺に多聞に含まれている。
ＮＧＦは沈降係数７８．分子量約１３１，５００のポリ
ペプチドで古くから研究されて来た［バイオケミストリ
ー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、 ６巻 ２２０３
−２２０９頁（１９６７）］ 。
ペプチドで古くから研究されて来た［バイオケミストリ
ー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、 ６巻 ２２０３
−２２０９頁（１９６７）］ 。
１分子の７８ ＮＧＦは２単位のα、１単位のβ及び２
単位のγ各すブユニットからなる（α２βγ２）がβ−
サブユニット以下（β−ＮＧ「と略記覆る）のみが神経
成長因子として生物活性を有する。
単位のγ各すブユニットからなる（α２βγ２）がβ−
サブユニット以下（β−ＮＧ「と略記覆る）のみが神経
成長因子として生物活性を有する。
β−ＮＯＦはアミノ酸１１８個からなるポリペプチドで
ある［アンブレラティ他（Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ、に、１
１．ｅｔａｌ、）ブロシーデングス・オプ・ナショナル
・アカデミ−・オプ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ。
ある［アンブレラティ他（Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ、に、１
１．ｅｔａｌ、）ブロシーデングス・オプ・ナショナル
・アカデミ−・オプ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、 ） ＵＳＡ、６８巻 ２４１７−２４２０頁
（１９７１） ］ 。
（１９７１） ］ 。
最近ヒトβ−ＮＧＦのアミノ酸配列がＣＯＮ八から推定
され、マウスβ−ＮＧＦと類似していることが示唆され
た［ネーチｖ −（Ｎａｔｕｒｅ） ３０３巻８２１
−８２５０ （１９８３） ］ 。
され、マウスβ−ＮＧＦと類似していることが示唆され
た［ネーチｖ −（Ｎａｔｕｒｅ） ３０３巻８２１
−８２５０ （１９８３） ］ 。
ヒト神経成長因子は知覚神経、交感神経細胞などの神経
細胞を成長、増殖させる作用を持ち、詳細には、神経増
殖作用、細胞骨格の重合化、オルガネラの増大、核に関
連する膜の変質などの作用があり、同化作用としては、
代謝前駆体の取り込み、即ち、ウリジン、グルコースお
よびアミノ酸の取り込みやＲＮ八へ成、蛋白質合成を促
進する。
細胞を成長、増殖させる作用を持ち、詳細には、神経増
殖作用、細胞骨格の重合化、オルガネラの増大、核に関
連する膜の変質などの作用があり、同化作用としては、
代謝前駆体の取り込み、即ち、ウリジン、グルコースお
よびアミノ酸の取り込みやＲＮ八へ成、蛋白質合成を促
進する。
また特殊な同化作用としてチロシン ヒドロキシラーゼ
合成、ドパミン−β−ヒドロキシラーゼ合成、オルニチ
ン デカルボキシラーゼ合成を増強する。このような作
用から近年ボケ防止薬として期待されでいる乙のの一つ
である。
合成、ドパミン−β−ヒドロキシラーゼ合成、オルニチ
ン デカルボキシラーゼ合成を増強する。このような作
用から近年ボケ防止薬として期待されでいる乙のの一つ
である。
上述したネーチャー、３０３巻８２１−８２５頁（１９
８３）には、ヒトβ−ＮＧＦをρＢＲ３２２プラスミド
中ヘクロン化したことが記載されている。しかしその発
現については報告されていない。
８３）には、ヒトβ−ＮＧＦをρＢＲ３２２プラスミド
中ヘクロン化したことが記載されている。しかしその発
現については報告されていない。
［発明が解決しようとする問題点］
一般に真核生物の遺伝子は、原核生物遺伝子の発現が可
能なベクター系へ組込み、これを原核細胞中へ尋人した
としても、その真核生物遺伝子の発現（遺伝子産物の産
生）が、少なくとも検出し得る程度になされるかどうか
は必ずしも期待できない。また、遺伝子のｆｌｉＭ配列
が明らかになれば、微生物中で頻度の高い」トンを選択
して化学合成によって微生物中でより発現し易い遺伝子
セグメントを合成することが考えられるが、遺伝子配列
中での相同配列の存在その他のため、望ましくないアニ
ーリングを起したり、場合によってはループ等を形成す
る恐れなどがあるうえ、発現可能な形でベクターへ組込
むための１ｌｉＪ限Ｆ９素部位の設定などの組合せの選
択も加って、その構築は容易でない。
能なベクター系へ組込み、これを原核細胞中へ尋人した
としても、その真核生物遺伝子の発現（遺伝子産物の産
生）が、少なくとも検出し得る程度になされるかどうか
は必ずしも期待できない。また、遺伝子のｆｌｉＭ配列
が明らかになれば、微生物中で頻度の高い」トンを選択
して化学合成によって微生物中でより発現し易い遺伝子
セグメントを合成することが考えられるが、遺伝子配列
中での相同配列の存在その他のため、望ましくないアニ
ーリングを起したり、場合によってはループ等を形成す
る恐れなどがあるうえ、発現可能な形でベクターへ組込
むための１ｌｉＪ限Ｆ９素部位の設定などの組合せの選
択も加って、その構築は容易でない。
［問題点を解決するための手段］
本発者らは微生物、特に大ＷＩＪ菌中で効果的に発現さ
れると期待されるコドンの選択と、そのコドンを含む望
ましいオリゴヌクレオチドからヒトβ−ＮＧＦ遺伝子セ
グメントを化学合成することについて、研究を行った結
果、本発明に到達した。
れると期待されるコドンの選択と、そのコドンを含む望
ましいオリゴヌクレオチドからヒトβ−ＮＧＦ遺伝子セ
グメントを化学合成することについて、研究を行った結
果、本発明に到達した。
「ヒトβ−ＮＧＦ遺伝子セグメント及びそのｍ製Ｊ即ち
本発明は第一に、式 ％式％ Ｉｌｅ Ｌｙｓ ａｌｙ ＬＶｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ
Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｌｅｕ ａｌｙＡＴＣ＾＾＾ ００
丁 ＡＡＡ ＧＡＡ ＧＴ八 ＡＴＣＧＴＴ Ｃ
ＴＧ ＧＧＣ■＾Ｇ ＴＴＴ ＣＣＡ ＴＴＴ Ｃ
ＴＴ ＣＡＴ ＴＡＣＣＡＡ ＧＡＣＣＣＧＧｌｕ
Ｖａｌ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｖａｌ Ｐｈｅ ＬｙｓＧＡＡ ＧＴＴ ＡＡＣＡ
ＴＴ ＡＡＴ ＡＡＣＴＣＣＧＴ＾ ＴＴＣＡＡＧＣＴ
Ｔ ＣＡＡ ＴＴＧ Ｔ＾ＡＴ丁八 ＴへＧ
ＡＧＧ ＣＡＴ ＡＡＧ ＴＴＣＧｉｎ Ｔｙｒ
Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ａ
ｒｇ ＡｓｐＣＡＡ ＴＡＴ ＴＴＴ 丁ＴＴ
ＧＡＡ ＡＣＴ ＡＡＡ ＴＧＣＣＧＴ ＧＡ
ＣＧＴＴ Ａ丁Ａ ＡＡＡ ＡＡＡ ＣＴＴ
ＴＧＡ ＴＴＴ ＡＣＧ ＧＣＡ ＣＴＧＰ
ｒｏ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｓ
ｅｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ 八ｒｇ ＧｌｙＣＣＧ
ＡＡＣＣＣＧ ＧＴＴ ＧＡＣ丁ＣＴ ＧＧ
Ｔ ＴＧ丁 Ｃ０丁 ＧＧＴＧＧＣＴＴＧ ＧＧＣＣ
ＡＡ ＣＴＧ ＡＧＡ ＣＣＡ ＡＣＡ ＧＣＡ Ｃ
ＣＡＩｔｓ Ａｓｐ Ｓｃｒ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｔｒｐ
Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｔｙｒ ＣｙｓＡＴＣＧＡＣＴＣＣ
＾＾Ａ ＣＡＣ丁ＧＧ ＡＡＣＴＣＴ ＴＡＣＴ
ＧＣ■＾Ｇ ＣＴＧ ＡＧＧ ＴＴＴ ＧＴＧ
ＡＣＣＴＴＧ ＡＧＡ ＡＴＧ ＡＣＧＴｈｒ Ｔ
ｈｒ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｔｈｒ ＰｈｃＶａｌ Ｌｙｓ
Ａｌａ Ｌｅｕ＾ＣＣＡＣＴ ＡＣＣＣＡＣＡＣＣＴ
ＴＣＧＴＧ ＡＡＡ ＧＣＴ ＣＴＧＴＧＧ Ｔ
ＧＡ ＴＧＧ ＧＴＧ ＴＧＧ ＡＡＧ Ｃ
ＡＣＴＴＴ ＣＧＡ ＧＡＣ丁ｈｒ Ｍｅｔ
ＡＳＤ ＧＩＶ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ａｌａ
Ａｌａ 丁ｒｐ ＡｒａＡＣ八 ＡＴＣＧＡＴ
ＧＧＴ ＡＡＡ ＣＡＧ ＧＣＡ Ｇ’ＣＴ
丁ＧＧ ＣＧＴＴＧ丁 ＴＡＣＣＴ八 ＣＣＡ
ＴＴＴ ＧＴＣＣＧＴ ＣＧＡ ＡＣＣＧＣＡＰ
ｈｅ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｔｌｅ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｌ
ａ Ｃｙｓ Ｖａｔ ＣｙｓＴ丁ＣＡＴＣＣＧＣＡＴ
ＣＧＡＣＡＣＣＧＣＴ ＴＧＣＧＴ＾ ＴＧＴＡＡＧ
ＴＡＣＧＣＧ ＴＡＧ ＣＴＧ 丁ＧＧ
ＣＣＡ 八ＣＧ ＣＡＴ ＡＣＡＶａｌ Ｌｅｕ
Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｖａｔ Ａｒｇ
ＧＴＴ ＣＴＧ ＴＣＴ Ｃ０丁 ＡＡＧ Ｇ
ＣＴ ＧＴＴ ＣＧＴ ”ＣＡＡ ＧＡＣＡＧＡ
ＧＣＡ ＴＴＣＣＧＡ ＣＡＡ ＣＣＡで表わ
される塩基配列からなるヒトβ−５ａｒ ３４伝子セ′
グメント［以下式（１）という、式中Ａはデオキシアデ
ニル酸の、Ｃはｆオキシシチジル酸の、Ｇはデオキシグ
アニル酸の、■はチミジル酸の各残基を表わしく以下同
じ）、塩基配列上のアミノ酸略号はこの塩基配列により
コードされているアミノ酸配列を示す１を提供するもの
である。
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グメント［以下式（１）という、式中Ａはデオキシアデ
ニル酸の、Ｃはｆオキシシチジル酸の、Ｇはデオキシグ
アニル酸の、■はチミジル酸の各残基を表わしく以下同
じ）、塩基配列上のアミノ酸略号はこの塩基配列により
コードされているアミノ酸配列を示す１を提供するもの
である。
このヒトβ−ＮＧＦ遺伝子セグメントは好ましくは、そ
の上流側末端に、式 ％式％ （式中Ｘ ハＮ末端よりＩｌｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｒ
ｇで表わされるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を
、Ｘｏはその相補配列を示す）で表わされるＤＮＡ配列
を、またその下流側末端に停止コドンを含み、制限酵素
開裂末端で終る、式 ％式％ （式中Ｙは最初の停止コドンの第二の塩基から制限酵素
開裂末端の３゛末端までを表わし、ＹｏはＹの相補配列
で、制限酵素開裂末端の５°末端までを表わす）で表わ
されるＤＮＡ配列を持つものである。
の上流側末端に、式 ％式％ （式中Ｘ ハＮ末端よりＩｌｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｒ
ｇで表わされるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を
、Ｘｏはその相補配列を示す）で表わされるＤＮＡ配列
を、またその下流側末端に停止コドンを含み、制限酵素
開裂末端で終る、式 ％式％ （式中Ｙは最初の停止コドンの第二の塩基から制限酵素
開裂末端の３゛末端までを表わし、ＹｏはＹの相補配列
で、制限酵素開裂末端の５°末端までを表わす）で表わ
されるＤＮＡ配列を持つものである。
上流側に付加されるＤＮＡ配列のＸ及びＸｏとしては、
式 ％式％ で表わされる配列を例示することができる。
式 ％式％ で表わされる配列を例示することができる。
下流側に付加される、停止コドンを含み制限酵素開裂末
端で終るＤＮＡ配列のり及びＹｏとしては、制限酵素
シリ−■ の開裂末端の配列を含む、式５式％ で゛表わされる配列を例示することができる。
端で終るＤＮＡ配列のり及びＹｏとしては、制限酵素
シリ−■ の開裂末端の配列を含む、式５式％ で゛表わされる配列を例示することができる。
上記（２）及び（３）式では上流側末端が（れぞれ」ロ
■及びＢａｌ ＩＩの末端で終っている。
■及びＢａｌ ＩＩの末端で終っている。
本発明のβ−ＮＧＦ遺伝子セグメントはそのコードする
アミノ酸配列において、前述のｃＤＮ＾のそれと同一で
あるが、その］トンは大きく異っている。
アミノ酸配列において、前述のｃＤＮ＾のそれと同一で
あるが、その］トンは大きく異っている。
本発明の第二は、このβ−ＮＧＦ ３１伝子セグメント
を製造する方法を提供するものである。本発明のβ−Ｎ
ＧＦ ３１伝子セグメントは以Ｆの式、Ｕｌ又はＵｌ、
及びＵ２ないし Ｕ２３ならびにＬｌ又はＬｌ・及びＬ
２ないし’２３、即ち ５゜ 旧 ＣＣＡＴＡＴＧＴＣＣＴＣＣ３゜、 ５′ 旧 ＧＡＴＣＴＴＣＸＴＣＣ丁ｃｃ”５゜ ０２ ＴＣＴＣＡＣＣＣＧＡＴＣＴＴＣ”５゜ １１３ ＣＡＣＣＧＴＧＧＣＧＡＡＴＴＣ３
゜Ｕ４ ５’ＴＣＴＧＴＴＴＧＣＧＡＴＴＣＣ３゜０
５ ＧＴＴＴＣＴＧＴＡＴＧＧＧＴＴ ３゜５゜ １６ ＧＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＣＡＣＴ ３゜５゜ ５゛ ０７ ＧＣＴＡＣＣＧＡＣＡＴＣＡＡＡＧＧ ３゜
０８ ＴＡＡＡＧＡＡＧＴＡＡＴＧＧＴＴＣ３゜５
゛ Ｕ９ ＴＧＧＧＣＧＡＡＧＴＴＡＡＣＡＴＴ
３’５゜ ｕｌｏ ”ＡＡＴＡＡＣＴＣＣＧＴＡＴＴＣ３゜ｕ１
１５°ＡＡＧＣＡＡＴＡＴＴＴＴＴＴＴ ３゜Ｕ１２
５°ＧＡＡＡＣＴＡＡＡＴＧＣＣＧＴ ”ｕ１３５°
ＧＡＣＣＣＧＡＡＣＣＣＧＧＴＴ ３゜０１４ ”Ｇ
ＡＣＴＣＴＧＧＴＴＧＴＣＧＴＧＧ ”ｕ１５５°ＴＡ
ＴＣＧＡＣＴＣＣＡＡＡＣＡＣＴ ”ｕ１６５°ＧＧＡ
ＡＣＴＣＴＴＡＣＴＧＣＡＣＣ”ｕ１７５°ＡＣＴＡＣ
ＣＣＡＣＡＣＣＴＴＣＧＴ ３゜ｕ１８５°ＧＡＡＡＧ
ＣＴＣＴＧＡＣＡＡＴＧＧ ３゜ｕ１９５°ＡＴＧＧＴ
ＡＡＡＣＡＧＧＣＡＧＣＴ ３゜０２Ｇ ”丁ＧＧ
ＣＧＴＴＴＣＡ丁ＣＣＧＣＡＴ ３゜０２１ ”Ｃ
ＧＡＣＡＣＣＧＣＴＴＧＣＧＴＡＴ ３゜Ｕ２２ ５°
ＧＴＧＴ丁ＣＴＧＴＣＴＣＧＴＡＡＧ ３°及ヒｕ２
３５°ＧＣＴＧＴＴＣＧＴＴＹ ３゜ならびに ５゜ ＬＩ ＧＴＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＣ＾ＴＡＴ
３゜、５゜ ＬＩ ＧＴＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＸＧＡＡ３゜５′ Ｕ２ ＣＣＡＣＧＧＴＧＧＡＡＧＡＴＣＧＧ ３゜
５゜ Ｕ３ ＣＡＡＡＣＡＧＡＧ八八ＴＴＣＧ
へへ５′ Ｕ４ ＾ＣＡＧ八＾ＡへＧＧＡ＾丁ＣＧ”５“ Ｕ５ ｒＴＧＴｃＡｃｃＡＡｃｃｃＡＴ ３゜５
゛ １６ ＴＣＧＧＴＡＧＣＡＧＴＧＧＴＴ ”５゛ １７ ＴＴＣＴＴｒＡＣＣＴＴＴＧＡ丁Ｇ３
゜５゜ Ｕ８ ＴＣＧＣＣＣＡＧ八＾ＣＣＡＴＴへＣ
３゜５゜ １９ ＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＧＴＴＡＡＣＴ ”５
゜ １１０ ＡＴＴＧＣＴＴＧＡＡＴ＾ＣＧＧ ３゜５
゜ Ｌｌｌ［＾ＧＴＴＴＣＡＡＡＡＡＡＡＴ ３゜５゜ Ｌ１２ ＴＣＧＧＧＴＣＡＣＧＧＣＡ丁Ｔ ３
゜５゜ １１３ ＣＡＧＡＧ丁ＣＡＡＣＣＧＧＧＴ
３゜５′ Ｌｌ４ ＧＡＧＴＣＧＡ丁ＡＣＣＡＣＧＡＣＡ
ＡＣ３゜５゜ １１５ ＡＡＧＡＧＴＴＣＣＡＧＴＧＴＴＴＧ
３゜５゜ Ｌｌ６ ＧＴＧＧＧＴＡＧＴＧＧＴＧＣＡＧＴ ３
゜５゜ Ｌｌ７ ＾ＧＡＧＣＴＴＴＣＡＣＧＡＡＧＧＴ
”５゜ １１８ ＧＴＴＴＡＣＣＡＴＣＣＡＴＴＧＴＣ３゜
［１９５°Ｇ＾＾ＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＧＣＣＴ ３
゜［２０５°ＧＧＴＧＴＣＧＡＴＧＣＧＧＡＴ ”Ｌ２
１５°ＡＧＡＡＣＡＣＡＴＡＣＧＣＡＡＧＣ３゜５°
３゜１２２ ＧＡＡＣ
ＡＧＣＣ丁ＴＡＣＧＡＧＡＣ及び［２３５°Ｙ’ＡＡＣ
３゜ で表わされるオリゴヌクレオチド（式中ｘ、 ｘ’、Ｙ
及びＹ゛は前記同様である）の相互に相補性のある組合
せ（ＵｌとＬｌ又は Ｕｌ、とＬｌ、ならびにＵ２とＵ
２、Ｕ３とＵ３、Ｕ４とＵ４、Ｕ とり、Ｌｌ６と Ｕ
６、ｔＪ、とＵ７、Ｕ８とＬ １Ｕ９とＵ９、Ｕｌ。と
り、。、ＵｌｌとＬｌｌ、Ｕ１２と ’１２・ Ｕ１３
と’１３・ Ｕ１４と’１４・ Ｕ１５と’１５・ Ｕ
１６と’１６・ Ｕｌｌと’１７・ Ｕ１８と Ｌｌ８
・Ｕ１９と１１９− Ｕ３Ｏとし２Ｇ”２１とＵ２１
− Ｕ２２とＬ２□及びＵ２３とＬ２３）を選び、各
組合せ毎に両者を水素結合させて二本鎖オリゴヌクレオ
チドとしたとき、相互に完全に接着し得る複数個の組合
せのオリゴヌクレオチドの群をリガーゼの存在下で結合
させて４個以上の日本鎖ＯＮへ断片を調製し、これを更
にリガーゼの存在で結合させることによってｗＡ製する
ことができる。Ｘ 、 Ｘ’、 Ｙ及びＹ”として特に
好ましい配列はすでに述べた通りである。
を製造する方法を提供するものである。本発明のβ−Ｎ
ＧＦ ３１伝子セグメントは以Ｆの式、Ｕｌ又はＵｌ、
及びＵ２ないし Ｕ２３ならびにＬｌ又はＬｌ・及びＬ
２ないし’２３、即ち ５゜ 旧 ＣＣＡＴＡＴＧＴＣＣＴＣＣ３゜、 ５′ 旧 ＧＡＴＣＴＴＣＸＴＣＣ丁ｃｃ”５゜ ０２ ＴＣＴＣＡＣＣＣＧＡＴＣＴＴＣ”５゜ １１３ ＣＡＣＣＧＴＧＧＣＧＡＡＴＴＣ３
゜Ｕ４ ５’ＴＣＴＧＴＴＴＧＣＧＡＴＴＣＣ３゜０
５ ＧＴＴＴＣＴＧＴＡＴＧＧＧＴＴ ３゜５゜ １６ ＧＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＣＡＣＴ ３゜５゜ ５゛ ０７ ＧＣＴＡＣＣＧＡＣＡＴＣＡＡＡＧＧ ３゜
０８ ＴＡＡＡＧＡＡＧＴＡＡＴＧＧＴＴＣ３゜５
゛ Ｕ９ ＴＧＧＧＣＧＡＡＧＴＴＡＡＣＡＴＴ
３’５゜ ｕｌｏ ”ＡＡＴＡＡＣＴＣＣＧＴＡＴＴＣ３゜ｕ１
１５°ＡＡＧＣＡＡＴＡＴＴＴＴＴＴＴ ３゜Ｕ１２
５°ＧＡＡＡＣＴＡＡＡＴＧＣＣＧＴ ”ｕ１３５°
ＧＡＣＣＣＧＡＡＣＣＣＧＧＴＴ ３゜０１４ ”Ｇ
ＡＣＴＣＴＧＧＴＴＧＴＣＧＴＧＧ ”ｕ１５５°ＴＡ
ＴＣＧＡＣＴＣＣＡＡＡＣＡＣＴ ”ｕ１６５°ＧＧＡ
ＡＣＴＣＴＴＡＣＴＧＣＡＣＣ”ｕ１７５°ＡＣＴＡＣ
ＣＣＡＣＡＣＣＴＴＣＧＴ ３゜ｕ１８５°ＧＡＡＡＧ
ＣＴＣＴＧＡＣＡＡＴＧＧ ３゜ｕ１９５°ＡＴＧＧＴ
ＡＡＡＣＡＧＧＣＡＧＣＴ ３゜０２Ｇ ”丁ＧＧ
ＣＧＴＴＴＣＡ丁ＣＣＧＣＡＴ ３゜０２１ ”Ｃ
ＧＡＣＡＣＣＧＣＴＴＧＣＧＴＡＴ ３゜Ｕ２２ ５°
ＧＴＧＴ丁ＣＴＧＴＣＴＣＧＴＡＡＧ ３°及ヒｕ２
３５°ＧＣＴＧＴＴＣＧＴＴＹ ３゜ならびに ５゜ ＬＩ ＧＴＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＣ＾ＴＡＴ
３゜、５゜ ＬＩ ＧＴＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＸＧＡＡ３゜５′ Ｕ２ ＣＣＡＣＧＧＴＧＧＡＡＧＡＴＣＧＧ ３゜
５゜ Ｕ３ ＣＡＡＡＣＡＧＡＧ八八ＴＴＣＧ
へへ５′ Ｕ４ ＾ＣＡＧ八＾ＡへＧＧＡ＾丁ＣＧ”５“ Ｕ５ ｒＴＧＴｃＡｃｃＡＡｃｃｃＡＴ ３゜５
゛ １６ ＴＣＧＧＴＡＧＣＡＧＴＧＧＴＴ ”５゛ １７ ＴＴＣＴＴｒＡＣＣＴＴＴＧＡ丁Ｇ３
゜５゜ Ｕ８ ＴＣＧＣＣＣＡＧ八＾ＣＣＡＴＴへＣ
３゜５゜ １９ ＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＧＴＴＡＡＣＴ ”５
゜ １１０ ＡＴＴＧＣＴＴＧＡＡＴ＾ＣＧＧ ３゜５
゜ Ｌｌｌ［＾ＧＴＴＴＣＡＡＡＡＡＡＡＴ ３゜５゜ Ｌ１２ ＴＣＧＧＧＴＣＡＣＧＧＣＡ丁Ｔ ３
゜５゜ １１３ ＣＡＧＡＧ丁ＣＡＡＣＣＧＧＧＴ
３゜５′ Ｌｌ４ ＧＡＧＴＣＧＡ丁ＡＣＣＡＣＧＡＣＡ
ＡＣ３゜５゜ １１５ ＡＡＧＡＧＴＴＣＣＡＧＴＧＴＴＴＧ
３゜５゜ Ｌｌ６ ＧＴＧＧＧＴＡＧＴＧＧＴＧＣＡＧＴ ３
゜５゜ Ｌｌ７ ＾ＧＡＧＣＴＴＴＣＡＣＧＡＡＧＧＴ
”５゜ １１８ ＧＴＴＴＡＣＣＡＴＣＣＡＴＴＧＴＣ３゜
［１９５°Ｇ＾＾ＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＧＣＣＴ ３
゜［２０５°ＧＧＴＧＴＣＧＡＴＧＣＧＧＡＴ ”Ｌ２
１５°ＡＧＡＡＣＡＣＡＴＡＣＧＣＡＡＧＣ３゜５°
３゜１２２ ＧＡＡＣ
ＡＧＣＣ丁ＴＡＣＧＡＧＡＣ及び［２３５°Ｙ’ＡＡＣ
３゜ で表わされるオリゴヌクレオチド（式中ｘ、 ｘ’、Ｙ
及びＹ゛は前記同様である）の相互に相補性のある組合
せ（ＵｌとＬｌ又は Ｕｌ、とＬｌ、ならびにＵ２とＵ
２、Ｕ３とＵ３、Ｕ４とＵ４、Ｕ とり、Ｌｌ６と Ｕ
６、ｔＪ、とＵ７、Ｕ８とＬ １Ｕ９とＵ９、Ｕｌ。と
り、。、ＵｌｌとＬｌｌ、Ｕ１２と ’１２・ Ｕ１３
と’１３・ Ｕ１４と’１４・ Ｕ１５と’１５・ Ｕ
１６と’１６・ Ｕｌｌと’１７・ Ｕ１８と Ｌｌ８
・Ｕ１９と１１９− Ｕ３Ｏとし２Ｇ”２１とＵ２１
− Ｕ２２とＬ２□及びＵ２３とＬ２３）を選び、各
組合せ毎に両者を水素結合させて二本鎖オリゴヌクレオ
チドとしたとき、相互に完全に接着し得る複数個の組合
せのオリゴヌクレオチドの群をリガーゼの存在下で結合
させて４個以上の日本鎖ＯＮへ断片を調製し、これを更
にリガーゼの存在で結合させることによってｗＡ製する
ことができる。Ｘ 、 Ｘ’、 Ｙ及びＹ”として特に
好ましい配列はすでに述べた通りである。
この様なオリゴヌクレオチド、の群としては、１群
■°群 ＩＩ群Ｕ１〜Ｕ３
Ｕ１°〜Ｕ３ Ｕ４〜Ｕ８Ｌ −１又は Ｌ−Ｌ
、１４〜Ｌ８ １ ３ １° ３ ＩＩＩ群 ＩＶ群 Ｖ群Ｕ９
〜Ｕ１３Ｕ１４〜Ｕ１８Ｕ１９〜Ｕ２３Ｌ９〜Ｌ１３
・ Ｌ１４〜’１ｇ 及び’１９〜Ｌ２３の群を例
示することができる。この群を用いて本発明のβ−ＮＧ
Ｆを調製する例を第１図にポす。
■°群 ＩＩ群Ｕ１〜Ｕ３
Ｕ１°〜Ｕ３ Ｕ４〜Ｕ８Ｌ −１又は Ｌ−Ｌ
、１４〜Ｌ８ １ ３ １° ３ ＩＩＩ群 ＩＶ群 Ｖ群Ｕ９
〜Ｕ１３Ｕ１４〜Ｕ１８Ｕ１９〜Ｕ２３Ｌ９〜Ｌ１３
・ Ｌ１４〜’１ｇ 及び’１９〜Ｌ２３の群を例
示することができる。この群を用いて本発明のβ−ＮＧ
Ｆを調製する例を第１図にポす。
リガーゼを用いてオリゴヌクレオチドまたは二本鎖ＤＮ
Ａ断片を結合させる際には、あらかじめこれらの５°側
が反応にあずかる成分の５°末端はリン酸化としておく
。
Ａ断片を結合させる際には、あらかじめこれらの５°側
が反応にあずかる成分の５°末端はリン酸化としておく
。
第１図で、これらの成分は横線で示す。一端に黒点を付
しであるものは、その５°末端がリン酸化されているこ
とを示す。
しであるものは、その５°末端がリン酸化されているこ
とを示す。
これを前記担体のアミノ基と結合したもの（ヌクレオシ
ド担体）を、前記オリゴヌクレオチドの３゛末端に用い
る。次いで、これらの３°末末端ヌクレオシド体に、偶
数個のデオキシリボヌクレオチドよりなるオリゴヌクレ
オチドについては、３°末端より第二番目に相当するモ
ノヌクレオチド［＾およびＣについてはＮ−ベンゾイル
化、ＧについてはＮ−イソプリル化して保シしたもの。
ド担体）を、前記オリゴヌクレオチドの３゛末端に用い
る。次いで、これらの３°末末端ヌクレオシド体に、偶
数個のデオキシリボヌクレオチドよりなるオリゴヌクレ
オチドについては、３°末端より第二番目に相当するモ
ノヌクレオチド［＾およびＣについてはＮ−ベンゾイル
化、ＧについてはＮ−イソプリル化して保シしたもの。
おのおの５゜−ＯＨを４．４゛−ジメトキシトリチル化
、かつ３°−リン酸をモノ（オルトクロルフェニル）エ
ーテル化して保護］を、奇数個のデオキシリボヌクレオ
チドよりなるオリゴヌクレオチドについては３°末端よ
り第二および第三番目に相当するジヌクレオチド（おの
おの保護については前と同じ）を、縮合剤を用いて結合
させる。縮合剤としては、メシチレンスルホニル−３−
二ト０トリアゾリド（Ｈ８ＮＴ）、２．４．６−トリイ
ソプロビルベンゼンスルホニルー３−二トロトリアゾリ
ド（ＴＰＳＮＴ ） 、メチシチレンスルホニルーテト
ラゾリド（Ｈ８Ｔｅ） 、２，４．６−ドリイソブロビ
ルベンゼンスルホニルーテトラゾリド（ｒｐ、ｓＴｅ
）等が適当である。
、かつ３°−リン酸をモノ（オルトクロルフェニル）エ
ーテル化して保護］を、奇数個のデオキシリボヌクレオ
チドよりなるオリゴヌクレオチドについては３°末端よ
り第二および第三番目に相当するジヌクレオチド（おの
おの保護については前と同じ）を、縮合剤を用いて結合
させる。縮合剤としては、メシチレンスルホニル−３−
二ト０トリアゾリド（Ｈ８ＮＴ）、２．４．６−トリイ
ソプロビルベンゼンスルホニルー３−二トロトリアゾリ
ド（ＴＰＳＮＴ ） 、メチシチレンスルホニルーテト
ラゾリド（Ｈ８Ｔｅ） 、２，４．６−ドリイソブロビ
ルベンゼンスルホニルーテトラゾリド（ｒｐ、ｓＴｅ
）等が適当である。
ざらに前者のオリゴヌクレオチドについては、同様に保
護した第三および第四番目に相当するジヌクレオチド、
第五および第六番目に相当するジヌクレオチド・・・・
・・と、後者のオリゴヌクレオチドについては第四およ
び第五番目、第六および第七番目・・・・・・と各ジヌ
クレオチドを同様にして５゛方向へ順次結合させる。但
し必要に応じて途中でモノヌクレオチド、トリヌクレオ
チド、テトラヌクレオチドなどを用いてもよい。
護した第三および第四番目に相当するジヌクレオチド、
第五および第六番目に相当するジヌクレオチド・・・・
・・と、後者のオリゴヌクレオチドについては第四およ
び第五番目、第六および第七番目・・・・・・と各ジヌ
クレオチドを同様にして５゛方向へ順次結合させる。但
し必要に応じて途中でモノヌクレオチド、トリヌクレオ
チド、テトラヌクレオチドなどを用いてもよい。
この調製法を第２図に示した。同図中Ｐはポリスチレン
の１ｚジビニルベンゼンとの共重合体を、ｂｚおよび１
ｂはベンゾイル基およびイソブチリル基を、Ｂはｂｚ＾
、 ｉｂＧ、 ｂｚＣまたは丁を、Ｂ′はＡ、Ｇ、Ｃま
たは■を２ＤＨＴｒは４，４°−ジメトキシトリチル基
を、Ａｒはオルトクロロフェニル基を、 ＢＳＡはベン
ゼンスルホン酸のメチレンジクロリド−メタノール混合
溶媒（容１比７：３ ’）溶液（２％）ｅ、ＤＨＡＰＬ
ｔ ４−ジメチルアミノピリジンの０．１４８ピリジン
溶液を、ＴＨＧ−ＰＡＯは１，１，３．３−テトラメヂ
ルグユニジウム２−ピリジンアルドキシメートのジオキ
サン−水混合溶媒（容量比９：１）溶液（０，５Ｍ ）
を示す。
の１ｚジビニルベンゼンとの共重合体を、ｂｚおよび１
ｂはベンゾイル基およびイソブチリル基を、Ｂはｂｚ＾
、 ｉｂＧ、 ｂｚＣまたは丁を、Ｂ′はＡ、Ｇ、Ｃま
たは■を２ＤＨＴｒは４，４°−ジメトキシトリチル基
を、Ａｒはオルトクロロフェニル基を、 ＢＳＡはベン
ゼンスルホン酸のメチレンジクロリド−メタノール混合
溶媒（容１比７：３ ’）溶液（２％）ｅ、ＤＨＡＰＬ
ｔ ４−ジメチルアミノピリジンの０．１４８ピリジン
溶液を、ＴＨＧ−ＰＡＯは１，１，３．３−テトラメヂ
ルグユニジウム２−ピリジンアルドキシメートのジオキ
サン−水混合溶媒（容量比９：１）溶液（０，５Ｍ ）
を示す。
上記ジヌクレオチドは、４種類のヌクレオチドの順列に
より１６種類が必要であるが、その合成法は、例えば次
の第３図に示す方法によることができる。
より１６種類が必要であるが、その合成法は、例えば次
の第３図に示す方法によることができる。
ただし、ＤＨＴｒは、４’、４’−ジメトキシトリチル
基、８及び８’は６−トベンゾイルアデニンー９−イル
基、４−Ｎ−ベンゾイルシトシン−１−イル基、２−Ｎ
−イソ−ブチリルグアニン−９−イル基、チミン−１−
イル基から選ばれ、同−又は異なってもよい。Ｈ８ＮＴ
はメシチレンスルホニル−３−ニトロトリアゾリドを示
す。これらのジヌクレオチドへの保護基導入は公知の方
法［例えば蛋白質核酸酵素、２６（４）、２５９（１９
８１）Ｊにより容易に行うことができる。
基、８及び８’は６−トベンゾイルアデニンー９−イル
基、４−Ｎ−ベンゾイルシトシン−１−イル基、２−Ｎ
−イソ−ブチリルグアニン−９−イル基、チミン−１−
イル基から選ばれ、同−又は異なってもよい。Ｈ８ＮＴ
はメシチレンスルホニル−３−ニトロトリアゾリドを示
す。これらのジヌクレオチドへの保護基導入は公知の方
法［例えば蛋白質核酸酵素、２６（４）、２５９（１９
８１）Ｊにより容易に行うことができる。
１プラスミド及びそのＩＩ製」
本発明の第三は本発明のβ−ＮＧＦ遺伝子セグメントを
含む組換えプラスミドを提供するものである。即ち、式
（１）で表わされるＭＡ基配列のヒトβ−ＮＧＦ遺伝子
セグメントを含み微生物中で自己増殖可能な組換えプラ
スミドを提供するものである。そして好ましくはヒトβ
−ＮＯＦ ］伝子の上流にこの遺伝子を発現可能に支配
するプロモーター・オペレーター系を含み、そのプロモ
ーター・オペレーター系の上流とヒトβ−ＮＧＦ遺伝了
の下流との間にプラスミドを自己増殖可能とする部分お
よび薬剤耐性をコードする部分を含むものである。
含む組換えプラスミドを提供するものである。即ち、式
（１）で表わされるＭＡ基配列のヒトβ−ＮＧＦ遺伝子
セグメントを含み微生物中で自己増殖可能な組換えプラ
スミドを提供するものである。そして好ましくはヒトβ
−ＮＯＦ ］伝子の上流にこの遺伝子を発現可能に支配
するプロモーター・オペレーター系を含み、そのプロモ
ーター・オペレーター系の上流とヒトβ−ＮＧＦ遺伝了
の下流との間にプラスミドを自己増殖可能とする部分お
よび薬剤耐性をコードする部分を含むものである。
プロモーター・オペレーター系としては、アッテネータ
ー部分を欠く、細菌のトリプトファン・プロモーター・
オペレーター系を例示することができる。
ー部分を欠く、細菌のトリプトファン・プロモーター・
オペレーター系を例示することができる。
本発明の組換えプラスミドは本発明のβ−ＮＧＦ道伝子
セグメントを慣用の方法で適当なベクタープラスミドに
組込むことにより調製することができる。特にその上流
及び下流に制限酵素開裂末端を持つ本発明のβ−ＮＧＦ
３！１伝子セグメントはその様なプラスミドの相当す
る開裂部位、例えば−りａ Ｉ 、 」ｌＩＩ 、 Ｓ
ａｌ Ｉ等の部位へ容易に組込むことができる。
セグメントを慣用の方法で適当なベクタープラスミドに
組込むことにより調製することができる。特にその上流
及び下流に制限酵素開裂末端を持つ本発明のβ−ＮＧＦ
３！１伝子セグメントはその様なプラスミドの相当す
る開裂部位、例えば−りａ Ｉ 、 」ｌＩＩ 、 Ｓ
ａｌ Ｉ等の部位へ容易に組込むことができる。
本発明のｌ換えプラスミドは大腸菌などの微生（Ｘ及び
Ｘｏは前記同様の意味を表わす）であるものが特に好ま
しい。 この様な配列を持つプラスミドは、例えばｐＧ
ｌｌ−ＬシリーズのｐＧＨ−１９フラスミトヲＢｆＬＬ
Ｔｆ及ヒＳａｌ Ｉｔ’消化し、生成する二つのＯＮ
＾断片のうち大きな断片に、本発明のヒトβ−ＮＧＦ遺
伝子セグメントで上流側に式（３）で表わされる末端配
列を持ち、下流側に式（４）で表わされる末端配列を持
つものを接看閏環さ往ることによって調製できる。第５
図にこの調製を図示した。この様にしてプラスミドｐＨ
Ｆ７をＩｌｌ！ｊすることができる。
Ｘｏは前記同様の意味を表わす）であるものが特に好ま
しい。 この様な配列を持つプラスミドは、例えばｐＧ
ｌｌ−ＬシリーズのｐＧＨ−１９フラスミトヲＢｆＬＬ
Ｔｆ及ヒＳａｌ Ｉｔ’消化し、生成する二つのＯＮ
＾断片のうち大きな断片に、本発明のヒトβ−ＮＧＦ遺
伝子セグメントで上流側に式（３）で表わされる末端配
列を持ち、下流側に式（４）で表わされる末端配列を持
つものを接看閏環さ往ることによって調製できる。第５
図にこの調製を図示した。この様にしてプラスミドｐＨ
Ｆ７をＩｌｌ！ｊすることができる。
なお、プラスミドｐＧＨ−１９を持つ［、コリ菌株、Ｌ
ｃｏｌｉ ｐＨＧ−１９は通商産業省工業技術院微生物
工業技術研究所に微工研菌寄第７６０６号として寄託さ
れている。
ｃｏｌｉ ｐＨＧ−１９は通商産業省工業技術院微生物
工業技術研究所に微工研菌寄第７６０６号として寄託さ
れている。
「形質転換体」
本発明の組換プラスミドは慣用の方法で［例えばコーエ
ンら、プＯシーデングス・オブ・ザ争ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏ。
ンら、プＯシーデングス・オブ・ザ争ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏ。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、） ｔｌ、ｓ、
Ａ、、 ６９巻、２１１０頁（１９７２）〕容易に
Ｅ、コリなどの微生物に形質転換できる。
Ａ、、 ６９巻、２１１０頁（１９７２）〕容易に
Ｅ、コリなどの微生物に形質転換できる。
こうして、プラスミドｐＨ０３３でＥ、コリ／ ８８１
０１株を形質転換しで得た菌株、”Ｅ、コリ／ ｐＮＤ
３３及び同ｐＮＦ７で形質転換された菌株、Ｅ、コリ／
ｐＨ）７は通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託され、以下の寄託番号が与えられている。
０１株を形質転換しで得た菌株、”Ｅ、コリ／ ｐＮＤ
３３及び同ｐＮＦ７で形質転換された菌株、Ｅ、コリ／
ｐＨ）７は通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託され、以下の寄託番号が与えられている。
エシエロンｔｚ −Ｄす（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏ！ｉ）／ ｐＮ０３３ 微工研菌奇第８１３１号 エシエロン１７−Ｄす（Ｆｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ）／ｐＮＤ ７ 微工研菌寄第８１３２号 これらの菌株の菌学的性質はアンピシリン耐性を獲得し
ていることとβ−ＮＯＦ蛋白質を発現し、産生ずること
以外に宿主菌株と変りはなく、同様の条件で容易に培養
することができる。またアンピシリン添加培地を用いる
ことができる。
ｏ！ｉ）／ ｐＮ０３３ 微工研菌奇第８１３１号 エシエロン１７−Ｄす（Ｆｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ）／ｐＮＤ ７ 微工研菌寄第８１３２号 これらの菌株の菌学的性質はアンピシリン耐性を獲得し
ていることとβ−ＮＯＦ蛋白質を発現し、産生ずること
以外に宿主菌株と変りはなく、同様の条件で容易に培養
することができる。またアンピシリン添加培地を用いる
ことができる。
本発明の形質転換されたＬコリ菌株はこれを栄養培地中
で培養することによってヒトβ−ＮＧＦ １１伝子を効
率よく増幅することができる。また本発明のβ−ＮＧＦ
遺伝子の上流にその発現を支配し、かつ可能とするプロ
モーター・オペレーター系、特にそのアッテネーター部
分を欠如するトリプトファン・プロモーター・オペレー
ター系を持つものは、ヒトβ−ＮＧＦを直接又はヒト成
長ホルモンのＮ末端側の一部との融合蛋白質の形で発現
し、菌体内に蓄積する。この場合（トリプトファン・プ
ロモーター・オペレーター系のとき）ヒトβ−ＮＧＦの
産生（ｍＲＮＡ合成）はインドールアクリル酸の添加に
よって強く誘導される。
で培養することによってヒトβ−ＮＧＦ １１伝子を効
率よく増幅することができる。また本発明のβ−ＮＧＦ
遺伝子の上流にその発現を支配し、かつ可能とするプロ
モーター・オペレーター系、特にそのアッテネーター部
分を欠如するトリプトファン・プロモーター・オペレー
ター系を持つものは、ヒトβ−ＮＧＦを直接又はヒト成
長ホルモンのＮ末端側の一部との融合蛋白質の形で発現
し、菌体内に蓄積する。この場合（トリプトファン・プ
ロモーター・オペレーター系のとき）ヒトβ−ＮＧＦの
産生（ｍＲＮＡ合成）はインドールアクリル酸の添加に
よって強く誘導される。
この融合蛋白質は次のよなアミノ酸配列を有する。
ｌｅｔ ｐｈｅ ｐｒｏ ｔｈｒ ｉｌｅ ｐｒｏ ｌ
ｅｕ ｓｅｒ ａｒＱ Ｉｅｕｐｈｅ ａｓｐ ａｓｎ
ａｌａ ｌｅｔ ｌｅｕ ａｒｇ ａｌａ ｈｉｓ
ａｒＱＩｅｕ ｈｉｓ ｇｌｎ ｌｅｕ ａｌａ ｐｈ
ｅ ａｓｐ ｔｈｒ ｔｙｒ ｇｌｎＧｌｔｌ ｐｈ
ｅ ｇｌｕ ｇｌｕ ａｌａ ｔｙｒ ｉｌｅ ｐ
ｒｏ ＋ｙｓ ｇｌｕ（ｌｌｎ ｌｙｓ ｔｙｒ
ｓｅｒ ｐｈｅ ｌｅｕ ｇｌｎ ａｓｎ ｐｒｏ
ｇｌｎｔｈｒ ｓｅｒ Ｉｅｕ ＣｙＳＩ）ｈｅ
Ｓｅｒ ｇｌｕ ｓｅｒ ｉｌｅ ｐｒ。
ｅｕ ｓｅｒ ａｒＱ Ｉｅｕｐｈｅ ａｓｐ ａｓｎ
ａｌａ ｌｅｔ ｌｅｕ ａｒｇ ａｌａ ｈｉｓ
ａｒＱＩｅｕ ｈｉｓ ｇｌｎ ｌｅｕ ａｌａ ｐｈ
ｅ ａｓｐ ｔｈｒ ｔｙｒ ｇｌｎＧｌｔｌ ｐｈ
ｅ ｇｌｕ ｇｌｕ ａｌａ ｔｙｒ ｉｌｅ ｐ
ｒｏ ＋ｙｓ ｇｌｕ（ｌｌｎ ｌｙｓ ｔｙｒ
ｓｅｒ ｐｈｅ ｌｅｕ ｇｌｎ ａｓｎ ｐｒｏ
ｇｌｎｔｈｒ ｓｅｒ Ｉｅｕ ＣｙＳＩ）ｈｅ
Ｓｅｒ ｇｌｕ ｓｅｒ ｉｌｅ ｐｒ。
ｔｈｒ ｐｒｏ ｓｅｒ ａｓｎ ａｒｇ １ＪＩｕ
ｇｌｎ ｔｈｒ ａｌｎ ｇｌｎＩｙｓ ｓｅｒ ａｓ
ｎ Ｉｅｕ ｇｌｕ ｌｅｕ ｌｅｕ ａｒｇ
ｉｌｅ ｓｅｒ１ｅｕ ｌｅｕ ｌｅｕ ｉｌ
ｅ ｇｌｎ ｓｅｒ ｔｒｐ Ｉｅｕ ｇｌｕ ｐｒ
。
ｇｌｎ ｔｈｒ ａｌｎ ｇｌｎＩｙｓ ｓｅｒ ａｓ
ｎ Ｉｅｕ ｇｌｕ ｌｅｕ ｌｅｕ ａｒｇ
ｉｌｅ ｓｅｒ１ｅｕ ｌｅｕ ｌｅｕ ｉｌ
ｅ ｇｌｎ ｓｅｒ ｔｒｐ Ｉｅｕ ｇｌｕ ｐｒ
。
ｖａｌ ｇｌｎ ｐｈｅ Ｉｅｕ ａｒａ ｓｅｒ
ｖａｌ ｐｈｅ ａｌａ ａｓｎｓｅｒ ｌｅｕ
ｖａｌ ｔｙｒ ｇｌｙ ａｌａ ｓｅｒ ａｓｐ
ｓｅｒ ａｓｎ１Ｇ ｖａｌ ｔｙｒ ａｓｐ Ｉｅｕ ｌｅｕ ｌ
ｙｓ ａｓｐ ｌｅｕ ｇｌｕ ｇｌｕｌ２Ｇ Ｑｌ’ｌ ｉｃｅ ａｌｎ ｔｈｒ ｌｅｕ
ｌｅｔ ！ＪＩＶ ａｒＱ ｌｅｕ ｇｌｕ
ｌ ’３０ ａｓｐ ａｌｙ ｓｅｒ ｐｒｏ ａｒａ ｔｈｒ
ｇｌｙ ｏｌｎ ｉｌｅ ｐｈａｌｌｅ Ｇｌｕ Ｇ
ｌｙ Ａｒｇ ＳＥＲＳＥＲＳＥＲＨＩＳ ＰＲＯ［Ｌ
ＥＰＩＥ ＨＩＳ ＡＲＧ ＧＬＶ ＧＬｔｌ
ＰＩＩＥ ＳＥＲＶＡＬ ＣＹＳ ＡＳＰＳ
ＥＲＶＡＬ ＳＥＲＶＡＬ ＴＲＰ ＶＡＬ
ＧＬＹ ＡＳＰ ＬＹＳ ＴＨＲＴＨＲ八ＬＡ
ＴＨＲＡＳＰ ＩＬＥ ＬＹＳ ＧＬＹ Ｉ
Ｙｓ ＧＬＵ ＶＡＬＭＥＴ ＶＡＬ Ｌｕ１
ｌ ＧＬＹ ＧＬＵ ＶＡＬ ＡＳＮ ＩＬ
Ｅ ＡＳＮ ＡＳＮＳＥＲＶＡＬ ＰＨＥ Ｌ
ＹＳ ＧＬＮ ＴＹＲＰＩＥ ＰＨＥ ＧＬＵ
ＴＨＲＬＹＳ ＣＹＳ ＡＲＧ ＡＳＰ
ＰＲＯＡＳＮ ＰＩＩＯＶＡＬ ＡＳＰ ＳＥＲ
Ｇ ＧＬＹ ＣＹＳ ＡＲＧ ＧＬＹ ＩＬＥ
ＡＳＰ ＳＥＲＬＹＳ ＨＩＳ ＴＲＰＡＳＮ
ＳＥＲＴＹＲＣＹＳ ＴＨＲＴＨＲＴＩＩＲＨｌｓ
ＴＨＲＰＨＥＶＡＬ ＬＹＳ ＡＬＡ ＬＥＵ
ＴＨＲＭＥＴ ＡＳＰ ＧＬＹ ＬＹＳ
ＧＬＮ０Ｇ ＡＬＡ ＡＬＡ ＴＲＰ ＡＲＧ ＰＩＥ ＩＬＥ
ＡＲＧ ＩＬＥ ＡＳＰ ＴＩＩＲＡＬＡ
ＣＹＳ ＶＡＬ Ｃ’ｌ’Ｓ ＶＡＬ ＬＥＩ
Ｊ ＳＥＲＡＲＧ ＬＹＳ ＡＬＡＶＡＬ Ａ
ＲＧ 菌体内に蓄積されたβ−ＮＧＦ及びそのヒト成長ホルモ
ンとの融合蛋白質は菌体を溶菌させたのら、通常の生理
活性蛋白質回収法によって分離回収することができる。
ｖａｌ ｐｈｅ ａｌａ ａｓｎｓｅｒ ｌｅｕ
ｖａｌ ｔｙｒ ｇｌｙ ａｌａ ｓｅｒ ａｓｐ
ｓｅｒ ａｓｎ１Ｇ ｖａｌ ｔｙｒ ａｓｐ Ｉｅｕ ｌｅｕ ｌ
ｙｓ ａｓｐ ｌｅｕ ｇｌｕ ｇｌｕｌ２Ｇ Ｑｌ’ｌ ｉｃｅ ａｌｎ ｔｈｒ ｌｅｕ
ｌｅｔ ！ＪＩＶ ａｒＱ ｌｅｕ ｇｌｕ
ｌ ’３０ ａｓｐ ａｌｙ ｓｅｒ ｐｒｏ ａｒａ ｔｈｒ
ｇｌｙ ｏｌｎ ｉｌｅ ｐｈａｌｌｅ Ｇｌｕ Ｇ
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ＥＰＩＥ ＨＩＳ ＡＲＧ ＧＬＶ ＧＬｔｌ
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Ｊ ＳＥＲＡＲＧ ＬＹＳ ＡＬＡＶＡＬ Ａ
ＲＧ 菌体内に蓄積されたβ−ＮＧＦ及びそのヒト成長ホルモ
ンとの融合蛋白質は菌体を溶菌させたのら、通常の生理
活性蛋白質回収法によって分離回収することができる。
例えば培養終了後、菌体を遠心分離により収繭し、リン
酸緩衝液中で超音波、リゾチーム、フレンヂプレス、ダ
イノミル等の処理をして得られる上清液を硫安分画ある
いはゲル濾過により目的の蛋白質分画をうる。更に高純
度を必要とするときは抗体カラム法で精製することもで
きる。β−ＮＯＦ又はそのヒト成長ホルモンとの融合蛋
白質が細胞壁に吸着されているときはグアニジン処理を
行って完全に抽出し、これを再活性化して高い収率で回
収することもできる。
酸緩衝液中で超音波、リゾチーム、フレンヂプレス、ダ
イノミル等の処理をして得られる上清液を硫安分画ある
いはゲル濾過により目的の蛋白質分画をうる。更に高純
度を必要とするときは抗体カラム法で精製することもで
きる。β−ＮＯＦ又はそのヒト成長ホルモンとの融合蛋
白質が細胞壁に吸着されているときはグアニジン処理を
行って完全に抽出し、これを再活性化して高い収率で回
収することもできる。
本発明の微生物による産生されたヒト成長ホルモンとの
融合蛋白質はその融合部位に血液凝固因子Ｘａの！！！
ｍ１部位（Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ） ｅｌＬ
、、この酵素で処理することによって完全かつ付加アミ
ノ酸残基のないヒトβ−ＮＧＦとすることができる。
融合蛋白質はその融合部位に血液凝固因子Ｘａの！！！
ｍ１部位（Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ） ｅｌＬ
、、この酵素で処理することによって完全かつ付加アミ
ノ酸残基のないヒトβ−ＮＧＦとすることができる。
この処理は前述の公知の方法に準じで行うことができる
。またその生成物である天然型ヒト β−ＮＧＦも前述
の方法で精製分離することができる。
。またその生成物である天然型ヒト β−ＮＧＦも前述
の方法で精製分離することができる。
［実施例Ｊ
以下本発明を実施例によりさらに詳しく説明する。なお
実施例中で略号で示した試薬は以下の通りである。
実施例中で略号で示した試薬は以下の通りである。
標準緩衝液： ５０ａＮ Ｔｒｉｓ−１ｉｉ！ ｐｌ
ｆ ７．５３５ｍＨＮａＣｌ２ ３５ ｇ＋Ｈ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌＴ
ｒｉｓ−ＮａＣ１：１０ｉ＋ＨＴｒｉｓ−塩酸緩衝液、
０．１４ＨＮａＣｌ 、 ｐＨ８゜ ＴＥ−蔗糖 ：２５駕蔗糖（Ｉ１１／Ｖ）、５０鴎ＨＴ
ｒｉｓ−塩酸緩衝液、 １ｍＨＥ口ＴＡｐＨ８゜ リゾチーム ：ｔＯｘｙｔ／１ｔｄｌリゾチーム、０．
２５ＨＴｒｉｓ−塩酸緩衝液、ｐ１１８゜０．５ＨＥＤ
ＴＡ： ｐＨ８゜ ＰＮａＳＱ： ０．０４Ｍ酢酸緩衡緩衝液ｈ ５）に１
０１１１！Ｊ／ｄの濃度に溶かし、１００℃で５分間加
熱処理する。
ｆ ７．５３５ｍＨＮａＣｌ２ ３５ ｇ＋Ｈ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌＴ
ｒｉｓ−ＮａＣ１：１０ｉ＋ＨＴｒｉｓ−塩酸緩衝液、
０．１４ＨＮａＣｌ 、 ｐＨ８゜ ＴＥ−蔗糖 ：２５駕蔗糖（Ｉ１１／Ｖ）、５０鴎ＨＴ
ｒｉｓ−塩酸緩衝液、 １ｍＨＥ口ＴＡｐＨ８゜ リゾチーム ：ｔＯｘｙｔ／１ｔｄｌリゾチーム、０．
２５ＨＴｒｉｓ−塩酸緩衝液、ｐ１１８゜０．５ＨＥＤ
ＴＡ： ｐＨ８゜ ＰＮａＳＱ： ０．０４Ｍ酢酸緩衡緩衝液ｈ ５）に１
０１１１！Ｊ／ｄの濃度に溶かし、１００℃で５分間加
熱処理する。
Ｌｙｔｉｃ Ｍｉｘｔｕｒｅ：０．１％非イオン系界面
活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、 ５０ｓＨＴｒｉｓ−塩酸緩衝液、 ６２．５ｍＨＥＤＴＡ 、ｐＨ８゜ ポリエチレングリコール（ＰＦＧ）６０００ ： １級
の粉末５８ ＮａＣｌ ＣｓＣｌ：固体。
活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、 ５０ｓＨＴｒｉｓ−塩酸緩衝液、 ６２．５ｍＨＥＤＴＡ 、ｐＨ８゜ ポリエチレングリコール（ＰＦＧ）６０００ ： １級
の粉末５８ ＮａＣｌ ＣｓＣｌ：固体。
ＦＢ溶液：エチジウムブロマイドを水に対して４．６７
■／Ｉ１１になるよう溶解しく調製。
■／Ｉ１１になるよう溶解しく調製。
ＴＥ： １０＋ｅＨＴｒｉｓ−塩酸緩衝液、１ｇ＋）ｌ
ＥＤＴＡ、 ｐＨ７，４゜ＴＥ−ｓａｒｋｏｓｙｌ：
１０ａＮ Ｔｉｒｓ−塩酸緩衝液、１ｇＨＥＤＴＡ、
０．３８％５ｏｄｉｕ＋＋＋Ｎ−Ｌａｕｒｏｙｌ
５ａｒｋｏｓｉｎａｔｅ 、 ｐＨ７，４゜ＴＥＮ：
１０１８ Ｔｉｒｓ−塩酸緩衝液、１１８ ＥＤＴＡ、
０．１ＨＮａＣｌ、ｐＨ７，４゜ 実施例１ ［オリゴヌクレオチドの合成］ （１） ｄＣＧＡＴＡＴＧＴＣＣＴＣＣ（Ｕ １）合成
５°−（４，４°−ジメトキシトリチル）デオキシシチ
ジン担体（１００μｍｏｌ／ｇ前記ポリスチレン樹脂５
０１１Ｇ）をピリジン中−夜室温で放置し次のような操
作により綜合反応を行った。
ＥＤＴＡ、 ｐＨ７，４゜ＴＥ−ｓａｒｋｏｓｙｌ：
１０ａＮ Ｔｉｒｓ−塩酸緩衝液、１ｇＨＥＤＴＡ、
０．３８％５ｏｄｉｕ＋＋＋Ｎ−Ｌａｕｒｏｙｌ
５ａｒｋｏｓｉｎａｔｅ 、 ｐＨ７，４゜ＴＥＮ：
１０１８ Ｔｉｒｓ−塩酸緩衝液、１１８ ＥＤＴＡ、
０．１ＨＮａＣｌ、ｐＨ７，４゜ 実施例１ ［オリゴヌクレオチドの合成］ （１） ｄＣＧＡＴＡＴＧＴＣＣＴＣＣ（Ｕ １）合成
５°−（４，４°−ジメトキシトリチル）デオキシシチ
ジン担体（１００μｍｏｌ／ｇ前記ポリスチレン樹脂５
０１１Ｇ）をピリジン中−夜室温で放置し次のような操
作により綜合反応を行った。
操 作
１）ジクロロメタン−メタノール（７：３ 、 Ｖ／Ｖ
）２１により３回洗浄。
）２１により３回洗浄。
２）２％ベンゼンスルホン酸溶液（溶媒ジクロロメタン
−メチルアルコール、７：３ ） ２＋ａｌで２分間処
理した後、同じ混合溶媒で３回洗浄する操作を繰返して
発色のなくなることを確かめた。
−メチルアルコール、７：３ ） ２＋ａｌで２分間処
理した後、同じ混合溶媒で３回洗浄する操作を繰返して
発色のなくなることを確かめた。
３）ピリジン２１により３回洗浄。
４）５°−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ−ペ
ンゾイルデオキシチミジリルーＥｌ（０−クロロフェニ
ル）−１ベンゾイルデオキシシトシン３°（０−クロロ
フェニル）ホスフェートのピリジン溶液（０，２１１、
同波クレオヂド２０＋ｅｇを含む）を加え溶媒を減圧留
去した。
ンゾイルデオキシチミジリルーＥｌ（０−クロロフェニ
ル）−１ベンゾイルデオキシシトシン３°（０−クロロ
フェニル）ホスフェートのピリジン溶液（０，２１１、
同波クレオヂド２０＋ｅｇを含む）を加え溶媒を減圧留
去した。
５）縮合剤、メシチレンスルホニル−３−ニトロトリア
ゾリド（２０ｍｇ ）のピリジン溶液（０，２ｍ１）を
加え４０℃、２０分間放置した。
ゾリド（２０ｍｇ ）のピリジン溶液（０，２ｍ１）を
加え４０℃、２０分間放置した。
６）ピリジン２１により２回洗浄。
７） ０．１Ｍジメチルアミノピリジンのピリジン溶液
（１，８１１）及び無水酢酸（０，２１１１１）を加え
３分間放置した。
（１，８１１）及び無水酢酸（０，２１１１１）を加え
３分間放置した。
８）ピリジン２１により３回洗浄。続いて上記２）以降
の操作を５°−（４，４°−ジメトキシトリチル）−ト
ベンゾイルデオキシチミヂリルーｐ−（ｏ−クロロフェ
ニル）デオキシシトシン−３°−（０−クロロフェニル
）ホスフェートに変えて５°−（４，４−ジメトキシト
リチル）−Ｎ−ベンゾイルデオキシシリシリル−１）−
（０−クロロフェニル）デオキシシトシン−３’−（０
−クロロフェニル）ホスフェートを用いて行い、さらに
同様の保ｖＩ！基を有するｄＧＴ、 ｄＡＴ、及びｄＣ
Ｇを用いて順次５°方向へＤＭＡ鎖を延長した後、樹脂
を０．５Ｍトリメチルグアンジウムービリジン−２−ア
ルドオキシメート［Ｃ，Ｂ、Ｒｅｅｓｅ ｅｔ ａｌ、
。
の操作を５°−（４，４°−ジメトキシトリチル）−ト
ベンゾイルデオキシチミヂリルーｐ−（ｏ−クロロフェ
ニル）デオキシシトシン−３°−（０−クロロフェニル
）ホスフェートに変えて５°−（４，４−ジメトキシト
リチル）−Ｎ−ベンゾイルデオキシシリシリル−１）−
（０−クロロフェニル）デオキシシトシン−３’−（０
−クロロフェニル）ホスフェートを用いて行い、さらに
同様の保ｖＩ！基を有するｄＧＴ、 ｄＡＴ、及びｄＣ
Ｇを用いて順次５°方向へＤＭＡ鎖を延長した後、樹脂
を０．５Ｍトリメチルグアンジウムービリジン−２−ア
ルドオキシメート［Ｃ，Ｂ、Ｒｅｅｓｅ ｅｔ ａｌ、
。
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ、、 ２７２７ （
１９７８） ］の］オキサンー水９：１ ）の溶液（ｌ
＃１１り中３８１１．ｊ問振とうした。
１９７８） ］の］オキサンー水９：１ ）の溶液（ｌ
＃１１り中３８１１．ｊ問振とうした。
樹脂を５０駕ピリジン水により洗浄し炉液と洗液を合せ
て減圧濃縮し、外法に濃アンモニア水（１５〆）を加え
密栓して５５℃で５時間加温した。アンモニアを留去し
、ピリジニウム型強酸性陽イオン交換樹脂（ｄｏｗｅｘ
５Ｇ、商標） ２ｄを加え、樹脂を５０！ピリジン
水により洗浄し、炉液と洗液を合せて濃縮した。濃縮液
に少厖の水を加え酢酸エチルでオキシムを抽出して除い
た。水層を水で希釈し、その一部を分取してジメトキシ
トリチル基の定量を行い全体の聞を推定した。ジメトキ
シトリチル基の分子吸光係数を７１ 、７００とすると
７７．４ Ａ２５４ユニツトから１μｓｏｌの粗オリゴ
ヌクレオチドが合成されたことがわかった。
て減圧濃縮し、外法に濃アンモニア水（１５〆）を加え
密栓して５５℃で５時間加温した。アンモニアを留去し
、ピリジニウム型強酸性陽イオン交換樹脂（ｄｏｗｅｘ
５Ｇ、商標） ２ｄを加え、樹脂を５０！ピリジン
水により洗浄し、炉液と洗液を合せて濃縮した。濃縮液
に少厖の水を加え酢酸エチルでオキシムを抽出して除い
た。水層を水で希釈し、その一部を分取してジメトキシ
トリチル基の定量を行い全体の聞を推定した。ジメトキ
シトリチル基の分子吸光係数を７１ 、７００とすると
７７．４ Ａ２５４ユニツトから１μｓｏｌの粗オリゴ
ヌクレオチドが合成されたことがわかった。
水層を減圧乾固し残渣に８０％酢ＷＪ１０ｄ’を加え２
５℃、３０分聞保った後溶媒を留去し、残渣を水と酢酸
エチルに溶解した。水層を濃縮した後、イオン交換クロ
マトグラフィーにかけた。イオン交換体はＤＥＡＥ−Ｔ
ＯＶＯＩ）ｅａｒｌ ６５０３ （商標）を用いた。
５℃、３０分聞保った後溶媒を留去し、残渣を水と酢酸
エチルに溶解した。水層を濃縮した後、イオン交換クロ
マトグラフィーにかけた。イオン交換体はＤＥＡＥ−Ｔ
ＯＶＯＩ）ｅａｒｌ ６５０３ （商標）を用いた。
これをカラム（０，７ｘ２１ａ）につめ７Ｍ尿素、２０
＋ｅＨトリス−塩駿緩衡液（ｐＨ７，５）中、０．１〜
０．３Ｈの食塩濃度勾配で溶出する。紫外線吸収により
オリゴヌクレオチドを検出し、中央部をとりセルロース
膜を用いて透析によりｆｌ１２塩し、１２．３＾ ユ
ニツト（６００μｇ）を得た。ＩＩＰＬｃ（Ｃ，８シリ
力ゲル担体）および−次元ホモクロマトグラフィーで単
一であることにより純度を確認した。
＋ｅＨトリス−塩駿緩衡液（ｐＨ７，５）中、０．１〜
０．３Ｈの食塩濃度勾配で溶出する。紫外線吸収により
オリゴヌクレオチドを検出し、中央部をとりセルロース
膜を用いて透析によりｆｌ１２塩し、１２．３＾ ユ
ニツト（６００μｇ）を得た。ＩＩＰＬｃ（Ｃ，８シリ
力ゲル担体）および−次元ホモクロマトグラフィーで単
一であることにより純度を確認した。
（２） ｄＴＡＴＡＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＧＴＧ （Ｌ
１）の合成Ｕ１の場合と同様にして５’−（４，４−
ジメトキシトリデル）グアニン担体を用い、まず５’−
（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ−イソブヂリル
デオキシグアノシリル−９（０−クロロフェニル）−Ｎ
−ベンゾイルデオキシチミジン３°−（０−クロロフェ
ニル）ホスフェートを用いた他はＵｌの場合と同様に縮
合を行った。
１）の合成Ｕ１の場合と同様にして５’−（４，４−
ジメトキシトリデル）グアニン担体を用い、まず５’−
（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ−イソブヂリル
デオキシグアノシリル−９（０−クロロフェニル）−Ｎ
−ベンゾイルデオキシチミジン３°−（０−クロロフェ
ニル）ホスフェートを用いた他はＵｌの場合と同様に縮
合を行った。
さらに第１−２中下線で示した単位で保ＲＩＭを有する
シタクレオチドを用いてＵｌの場合と同様にしてＯＮ＾
鎖延長、脱保護基及び生成物の精製分離を行い１１ ５
．６ Ａ２６Ｇユニツト（２８０μｇ）を得た。
シタクレオチドを用いてＵｌの場合と同様にしてＯＮ＾
鎖延長、脱保護基及び生成物の精製分離を行い１１ ５
．６ Ａ２６Ｇユニツト（２８０μｇ）を得た。
同様にしてＵ 、Ｕ 、・・・・・・Ｕ 、Ｕ ・
及びし２３゜・・・・・・Ｌ 、Ｌ ・を構成する
オリボタフレ第チド（第１表）を５°−（４，４°−ジ
メトキシトリチル）デオキシグアノシン担体、 ５’−
（４，４°−ジメトキシトリチル）デオキシアデノシン
担体、５°−（４，４−ジメトキシトリチル）デオキシ
シチジン担体及び５°（−４，４’−ジメトキシトリチ
ル）チミジン担体を用い、第１−１および１−２表記載
のシーケンス部位の下線で示した単位で、各々保護基を
有するモノ−またはジヌクレオチドをＵｌ及びＬｌの場
合と同様にし［３’末端側から５°側へ向って順次縮合
させ、脱保護基及び精製分離を行って調製した。得られ
たオリゴヌクレオチドを第１−１および１−２表に示す
。
及びし２３゜・・・・・・Ｌ 、Ｌ ・を構成する
オリボタフレ第チド（第１表）を５°−（４，４°−ジ
メトキシトリチル）デオキシグアノシン担体、 ５’−
（４，４°−ジメトキシトリチル）デオキシアデノシン
担体、５°−（４，４−ジメトキシトリチル）デオキシ
シチジン担体及び５°（−４，４’−ジメトキシトリチ
ル）チミジン担体を用い、第１−１および１−２表記載
のシーケンス部位の下線で示した単位で、各々保護基を
有するモノ−またはジヌクレオチドをＵｌ及びＬｌの場
合と同様にし［３’末端側から５°側へ向って順次縮合
させ、脱保護基及び精製分離を行って調製した。得られ
たオリゴヌクレオチドを第１−１および１−２表に示す
。
第１−１表
０１ ”ＣＧＡＴＡＴＧＴＣＣＴＣＣ３゜旧゛ ５
°ＧＡＴＣ丁ＴＣ八ＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴＴＣＣＴＣ
Ｃ３゜ｕ２５°ＴＣＴＣＡＣＣＣＧＡＴＣＴＴＣ３′０
６ ５°ＧＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＣＡＣＴ ３゜１１７
５°ＧＣＴＡＣＣＧＡＣＡＴＣＡＡＡＧＧ ３゜１１
８ ５°ＴＡＡＡＧＡＡＧＴＡＡＴＧＧＴＴＣ３゜１１
１２ ”ＧＡＡＡＣＴＡＡＡＴＧＣＣＧＴ ３゜ｔ１
１３ ”ＧＡＣＣＣＧＡＡＣＣＣＧＧＴＴ ３゜ｕ１
４５°ＧＡＣＴＣＴＧＧＴＴＧＴＣＧＴＧＧ ３゜ｕ１
５５°ＴＡＴＣＧＡＣＴＣＣＡＡＡＣＡＣＴ ３゜ｕ１
６５°ＧＧＡＡＣＴＣＴＴＡＣＴＧＣＡＣＣ”１１１７
”ＡＣＴＡＣＣＣＡＣＡＣＣＴＴＣＧＴ ”ｕ１９
５°ＡＴＧＧＴＡＡＡＣＡＧＧＣＡＧＣＴ ３゜第１−
２表 １３ ＣＡＡＡＣＡＧＡＧＡＡＴＴＣＧ ”５゜ ［４＾ＣＡＧＡＡＡＣＧＧＡＡＴＣＧ ３゜５゛ １５ ＴＴＧＴＣＡＣＣＡＡＣＣＣＡＴ ”５′ Ｌ６ ＴＣＧＧＴＡＧＣＡＧＴＧＧＴＴ ３゜５゜ Ｌｌ１ ５°ＡＧＡＡＣＡＣＡＴＡＣＧＣＡＡＧＣ３゜
実施例２ 合成神経成長因子遺伝子フラグメントＩ 、 Ｉ’、
ＩＩ。
°ＧＡＴＣ丁ＴＣ八ＴＣＧＡＡＧＧＴＣＧＴＴＣＣＴＣ
Ｃ３゜ｕ２５°ＴＣＴＣＡＣＣＣＧＡＴＣＴＴＣ３′０
６ ５°ＧＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＣＡＣＴ ３゜１１７
５°ＧＣＴＡＣＣＧＡＣＡＴＣＡＡＡＧＧ ３゜１１
８ ５°ＴＡＡＡＧＡＡＧＴＡＡＴＧＧＴＴＣ３゜１１
１２ ”ＧＡＡＡＣＴＡＡＡＴＧＣＣＧＴ ３゜ｔ１
１３ ”ＧＡＣＣＣＧＡＡＣＣＣＧＧＴＴ ３゜ｕ１
４５°ＧＡＣＴＣＴＧＧＴＴＧＴＣＧＴＧＧ ３゜ｕ１
５５°ＴＡＴＣＧＡＣＴＣＣＡＡＡＣＡＣＴ ３゜ｕ１
６５°ＧＧＡＡＣＴＣＴＴＡＣＴＧＣＡＣＣ”１１１７
”ＡＣＴＡＣＣＣＡＣＡＣＣＴＴＣＧＴ ”ｕ１９
５°ＡＴＧＧＴＡＡＡＣＡＧＧＣＡＧＣＴ ３゜第１−
２表 １３ ＣＡＡＡＣＡＧＡＧＡＡＴＴＣＧ ”５゜ ［４＾ＣＡＧＡＡＡＣＧＧＡＡＴＣＧ ３゜５゛ １５ ＴＴＧＴＣＡＣＣＡＡＣＣＣＡＴ ”５′ Ｌ６ ＴＣＧＧＴＡＧＣＡＧＴＧＧＴＴ ３゜５゜ Ｌｌ１ ５°ＡＧＡＡＣＡＣＡＴＡＣＧＣＡＡＧＣ３゜
実施例２ 合成神経成長因子遺伝子フラグメントＩ 、 Ｉ’、
ＩＩ。
ＩＩＩ 、 ＩＶ及びｖの合成
（１）合成神経成長遺伝子フラグメント■の合成上）ホ
したオリゴヌクレオチドの合成で得られたオリゴヌクレ
オチドＵ 、Ｕ 、Ｕ 及びＬ 、Ｌｌ ２
３ １ ２、［３を次の反応を行い、合成神経成長囚子道伝子フ
ラグメント■を得た。
したオリゴヌクレオチドの合成で得られたオリゴヌクレ
オチドＵ 、Ｕ 、Ｕ 及びＬ 、Ｌｌ ２
３ １ ２、［３を次の反応を行い、合成神経成長囚子道伝子フ
ラグメント■を得た。
０．２−５マイクロキユーリーの ［γ−３２Ｐ ］
ＡＴＰ（１，２ｘｌＯＣｐｓ、／μｍ）１μｍ、各オリ
ゴヌクレオチド００Ｇ、２（＾２６０）と、６μＩμｍ
の１４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造株製造）０．
５μｍを２μＩのカイネーション緩衝液［２５０１Ｎ
トリス−ＨＣｌ ａｌｌ ８．０１５０ｍ ＨＨｏＣ
ｌ２１５０ｇｇ Ｈ２−メルカプトエタノール１５腸Ｍ
スペルミン］にＦＢＷＩシたちのを混合し、３７℃２０
分間インキュベートした、それからＡＴＰ ２０ｓＨ
の０．０２５μＩを加え、更に４５１ｉｎ反応させた。
ＡＴＰ（１，２ｘｌＯＣｐｓ、／μｍ）１μｍ、各オリ
ゴヌクレオチド００Ｇ、２（＾２６０）と、６μＩμｍ
の１４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造株製造）０．
５μｍを２μＩのカイネーション緩衝液［２５０１Ｎ
トリス−ＨＣｌ ａｌｌ ８．０１５０ｍ ＨＨｏＣ
ｌ２１５０ｇｇ Ｈ２−メルカプトエタノール１５腸Ｍ
スペルミン］にＦＢＷＩシたちのを混合し、３７℃２０
分間インキュベートした、それからＡＴＰ ２０ｓＨ
の０．０２５μＩを加え、更に４５１ｉｎ反応させた。
更に２０ｓＨＡＴＰ １μｍを追加し４５１ｎ反応さ
せ１０ｓＨトリス−）１ｃＩ （ｐｕ ８．０）および
１ｓＨＥＤＴＡを加え１０Ａ２６ｏ／μｍとした。
せ１０ｓＨトリス−）１ｃＩ （ｐｕ ８．０）および
１ｓＨＥＤＴＡを加え１０Ａ２６ｏ／μｍとした。
これらのフラグメントをアニールするため、反応混合物
をライゲーションＭ衝液（３３０ｓＮ トリス−１１ｃ
Ｉ ｐＨ７，６／３３ａ＋ １４ ＨｏＣ１２／
２．５ｓＨＡＴＰ） ５μｍ中で７０℃２分間
加熱し、それからゆっくり室温まで冷却した。次に２−
メルカプトエタノール（２−ＥｔＳＨ０，２Ｍ ）
１．３μｍを加えた、反応混合物を１３℃に冷却後Ｔ４
ＯＮ＾リガーゼ（宝酒造株製３゛５０μ／μｍ） ２μ
ｌを加え２時間インキュベートした。
をライゲーションＭ衝液（３３０ｓＮ トリス−１１ｃ
Ｉ ｐＨ７，６／３３ａ＋ １４ ＨｏＣ１２／
２．５ｓＨＡＴＰ） ５μｍ中で７０℃２分間
加熱し、それからゆっくり室温まで冷却した。次に２−
メルカプトエタノール（２−ＥｔＳＨ０，２Ｍ ）
１．３μｍを加えた、反応混合物を１３℃に冷却後Ｔ４
ＯＮ＾リガーゼ（宝酒造株製３゛５０μ／μｍ） ２μ
ｌを加え２時間インキュベートした。
その後、６５℃で５分間加熱して反応を停止させた。
生成したＯＮへの７ラグメントをフェノール処理後エタ
ノールを加え沈澱させ遠心分離し１０％アクリルアミド
ゲル電気泳動（１５０Ｖ／ ２．５時間）に付し、その
後ゲルから抽出し、エタノールにて沈澱後、遠心分離し
て１０ＩＭトリスーＨＣｌ （ｐＨ８，０） ／１μＨ
ＥＤＴＡ溶液に溶解した。
ノールを加え沈澱させ遠心分離し１０％アクリルアミド
ゲル電気泳動（１５０Ｖ／ ２．５時間）に付し、その
後ゲルから抽出し、エタノールにて沈澱後、遠心分離し
て１０ＩＭトリスーＨＣｌ （ｐＨ８，０） ／１μＨ
ＥＤＴＡ溶液に溶解した。
各０．０５ Ａ ユニット（Ｑ ２．０Ｍｇ）こ
うして下記フラグメントを得た。
うして下記フラグメントを得た。
５°ＣＧＡＴＡＴＧＴＣＣＴＣＣＴＣＴＣＡＣＣＣＧ＾
ＴＣＴＴＣＣＡＣＣＧＴＧＧＣ、ＴＡＴＡＣＡＧＧＡＧ
ＧＡＧＡＧＴＧＧＧＣＴＡＧＡＡＧＧ丁ＧＧＣＡＣＣＧ
ＧＡＡＴＴＣ” ＣＴＴＡＡＧＡＧＡＣＡＡＡＣ ＴＣＴＧＴＴＴＧＣＧＡＴＴＣＣＧＴＴＴＣＴＧＴＡＩ
Ｉ、 ＧＣＴＡＡＧＧＣＡ
ＡＡＧＡＣＡＴＴＧＧＧＴＴＧＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＣ
ＡＣＴＧＣＴＡＣＣＧＡＣ＾ＣＣＣＡＡＣＣＡＣＴＧＴ
ＴＴＴＧＧＴＧＡＣＧ＾ＴＧＧＣＴＧＡＴＣＡＡＡＧＧ
ＴＡＡＡＧＡＡＧＴＡＡＴＧＧＴＴＣ３゜ＴＡＧＴＴＴ
ＣＣ＾ＴＴＴＣＴＴＣ＾ＴＴ＾ＣＣＡＡＧＡＣＣＣＧＣ
Ｔ５° ＴＧＧＧＣＧＡＡＧＴＴＡＡＣＡＴＴＡＡ丁Ａ
ＡＣＴＣＣＧＴＡＴＴＣＡＡＧＩ Ｉ Ｉ ：
ＴＣＡＡＴＴＧＴＡ＾ＴＴ＾ＴＴＧＡＧＧＣＡＴ＾
ＡＧＴＴＣいてこれを旦工とＢａｗｌ Ｉで二重消化し
てｐＢ８３２２由来のシーケンス部分のＥｃｏＲＩとＢ
ａｍＨＩ部位の間の領域をも欠失させた。このようにし
て得られたプラスミド（、Ｌ）を“ｐＯｃＴ２−９”と
命名し１＝。 ｐＯｃ丁２−９は、４．３ Ｋｂ （Ｋ
ｂａｓｅ ｐａｉｒ）を有し、コーエンらの方法［Ｐ
ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、 Ｓｃｉ。
ＴＣＴＴＣＣＡＣＣＧＴＧＧＣ、ＴＡＴＡＣＡＧＧＡＧ
ＧＡＧＡＧＴＧＧＧＣＴＡＧＡＡＧＧ丁ＧＧＣＡＣＣＧ
ＧＡＡＴＴＣ” ＣＴＴＡＡＧＡＧＡＣＡＡＡＣ ＴＣＴＧＴＴＴＧＣＧＡＴＴＣＣＧＴＴＴＣＴＧＴＡＩ
Ｉ、 ＧＣＴＡＡＧＧＣＡ
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ＡＧＴＴＣいてこれを旦工とＢａｗｌ Ｉで二重消化し
てｐＢ８３２２由来のシーケンス部分のＥｃｏＲＩとＢ
ａｍＨＩ部位の間の領域をも欠失させた。このようにし
て得られたプラスミド（、Ｌ）を“ｐＯｃＴ２−９”と
命名し１＝。 ｐＯｃ丁２−９は、４．３ Ｋｂ （Ｋ
ｂａｓｅ ｐａｉｒ）を有し、コーエンらの方法［Ｐ
ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、 Ｓｃｉ。
、 Ｕ、Ｓ、Ａ、、 ６９．２１１０（１９７２） ］
ニヨッテ大腸菌に形質転換してＡＩＨＤ 、 Ｔｃ
をマーカーとしてクローニングした。
ニヨッテ大腸菌に形質転換してＡＩＨＤ 、 Ｔｃ
をマーカーとしてクローニングした。
こうして得た ｐＯｃＴ２−９の残った江ＯＲ工部位を
ＥｃｏＲ■で切断した。次いで、制限酵素Ｂａｔ ３１
で両末端から約３０ ｂ、ｐ、を除去し、除去した部分
に化学合ガーゼを用いて挿入閉環しｐＣＴ １プラスミ
ド（７）を調製した。
ＥｃｏＲ■で切断した。次いで、制限酵素Ｂａｔ ３１
で両末端から約３０ ｂ、ｐ、を除去し、除去した部分
に化学合ガーゼを用いて挿入閉環しｐＣＴ １プラスミ
ド（７）を調製した。
得られたプラスミドｐＣＴ １はｐＯｃＴ２−９の場合
と同様、大腸菌に形質転換してクローニングおよび増幅
を行った。こうして得たプラスミドｐＣＴ １を、マク
サム・ギルバート法［Ｈａｘａｍ ＆ Ｇ１１ｂｅｒｔ
、ＰＮＡＳ、７４，５６０（１９７７） ］によってシ
ーケンシングを行い確認した。
と同様、大腸菌に形質転換してクローニングおよび増幅
を行った。こうして得たプラスミドｐＣＴ １を、マク
サム・ギルバート法［Ｈａｘａｍ ＆ Ｇ１１ｂｅｒｔ
、ＰＮＡＳ、７４，５６０（１９７７） ］によってシ
ーケンシングを行い確認した。
得られたプラスミドｐＣＴ １を１ｌｐａ ＩおよびＣ
ｌａ 工で二重消化し、ポリアクリドアミド電気泳動に
よって長い方の断片、即ちｐＣＴ １からリーダー領域
のりボソーム付着部位、アテニュエーター領域、第１＃
Ｉ造遺伝子であるｔｒｐ Ｅのリポソーム付着部位を取
り除いた断片を得た。この断片に５°ＡＡＧＴＴＣＡＣ
ＧＴ＾ＡＡＡＡＧＧＧＴＡ＾丁ＣＧＡＴ３゜ＴＴＣ八Ａ
へＴＧＣＡＴＴＴＴＴＣＣＣＡＴＴ＾ＧＣＴ＾ＧＣＣで
表わされる合成りＮＡを挿入し、■４ＤＮＡリガー
ゼを用いて接着閉環した。
ｌａ 工で二重消化し、ポリアクリドアミド電気泳動に
よって長い方の断片、即ちｐＣＴ １からリーダー領域
のりボソーム付着部位、アテニュエーター領域、第１＃
Ｉ造遺伝子であるｔｒｐ Ｅのリポソーム付着部位を取
り除いた断片を得た。この断片に５°ＡＡＧＴＴＣＡＣ
ＧＴ＾ＡＡＡＡＧＧＧＴＡ＾丁ＣＧＡＴ３゜ＴＴＣ八Ａ
へＴＧＣＡＴＴＴＴＴＣＣＣＡＴＴ＾ＧＣＴ＾ＧＣＣで
表わされる合成りＮＡを挿入し、■４ＤＮＡリガー
ゼを用いて接着閉環した。
この様にして得られたプラスミドをＣａｌ 工およびＳ
ａｌ 工で切断し、ポリアクリルアミド電気泳動によっ
て長い方の断片を得た。これに５°末端（圧銅）がＣｌ
ａ 工構造、３゛末端（正値）がジａｌ Ｉ構造を有し
、前述したＯＮ＾シーケンスからなるヒト成長ホルモン
遺伝子を挿入し、■４ＤＮＡリガーゼで接着して、ヒト
成長ホルモン遺伝子の組込まれたプラスミドｐＧＩＩ−
Ｌ９を得ることができた。
ａｌ 工で切断し、ポリアクリルアミド電気泳動によっ
て長い方の断片を得た。これに５°末端（圧銅）がＣｌ
ａ 工構造、３゛末端（正値）がジａｌ Ｉ構造を有し
、前述したＯＮ＾シーケンスからなるヒト成長ホルモン
遺伝子を挿入し、■４ＤＮＡリガーゼで接着して、ヒト
成長ホルモン遺伝子の組込まれたプラスミドｐＧＩＩ−
Ｌ９を得ることができた。
直接発現型 ｐＮＤ−３３及びｐＨ０１，３９プラスミ
ドｐＧ１１−１９ （微工研 菌寄第７６０６号） ５
μｇを標準緩衝液６ μｍを加えた水２０μｍに溶解し Ｃ１ａＩ ５ｕを加え３７℃ ５時間消化した。反応
液のＮａＣｌを１８０ｍＨになる様加え、ざらに５ａ１
１４００を添加して３７℃で９０分間消化した。反応液
をフェノール抽出後、エタノール沈殿を行ってＤＮＡを
回収し、５％アクリルアシドゲル電気泳動に付し、長い
二ｑ＠ＯＮへ部分を抽出し約３μσの直鎖状二重１ｉＤ
Ｎ八であるベクターＤＮＡ ｐＧＩｌ−Ｌ−９／Ｃｌａ
Ｉ −８ａｌＩを得た。
ドｐＧ１１−１９ （微工研 菌寄第７６０６号） ５
μｇを標準緩衝液６ μｍを加えた水２０μｍに溶解し Ｃ１ａＩ ５ｕを加え３７℃ ５時間消化した。反応
液のＮａＣｌを１８０ｍＨになる様加え、ざらに５ａ１
１４００を添加して３７℃で９０分間消化した。反応液
をフェノール抽出後、エタノール沈殿を行ってＤＮＡを
回収し、５％アクリルアシドゲル電気泳動に付し、長い
二ｑ＠ＯＮへ部分を抽出し約３μσの直鎖状二重１ｉＤ
Ｎ八であるベクターＤＮＡ ｐＧＩｌ−Ｌ−９／Ｃｌａ
Ｉ −８ａｌＩを得た。
得られたベクターＤＮＡ ｐＧＨ−Ｌ−９／Ｃ１ａ Ｉ
−３ａｌ ｌ０１５ｇｇ／μｍ漠度の液３μｍと直接
発現用のセト神経成長因子の遺伝子（５°末端にＣＩａ
Ｉサイトを有し３′末端には５ａｌｔサイトをもつ塩基
配列）のカイネーション混合液（０，３μｇ１μｍ）３
μｍとを１１２０８μｍに希釈し、ライゲーション緩衝
液４μ＋ 、 ０．２Ｎ−２−メルカプトエタノール
後Ｔ４−ＯＮ＾リガーゼ（３５０ｔｌ／μｌ） １μ＋
で２０℃・２０時間反応させた。フェノール処理後、反
応液からエタノールにて沈殿させＤＮＡを回収して組換
プラスミドｐＨ０ ３３を得た。
−３ａｌ ｌ０１５ｇｇ／μｍ漠度の液３μｍと直接
発現用のセト神経成長因子の遺伝子（５°末端にＣＩａ
Ｉサイトを有し３′末端には５ａｌｔサイトをもつ塩基
配列）のカイネーション混合液（０，３μｇ１μｍ）３
μｍとを１１２０８μｍに希釈し、ライゲーション緩衝
液４μ＋ 、 ０．２Ｎ−２−メルカプトエタノール
後Ｔ４−ＯＮ＾リガーゼ（３５０ｔｌ／μｌ） １μ＋
で２０℃・２０時間反応させた。フェノール処理後、反
応液からエタノールにて沈殿させＤＮＡを回収して組換
プラスミドｐＨ０ ３３を得た。
一方、プラスミドｐＧｌｌ−Ｌ９に代えてプラスミドｌ
）ＣＴ１を用いて同様に処理して組換プラスミドＩ）Ｎ
Ｏ１３９を得た。
）ＣＴ１を用いて同様に処理して組換プラスミドＩ）Ｎ
Ｏ１３９を得た。
形質転換及びスクリーニング
組換プラスシトＰＮＤ−３３（ １．５ｇｇ７２０μ
ｍ濃度のもの）１０μｍと大腸菌ＨＢ１０１をＬ ｂｒ
ｏｔｈ ５＋ｅｌで一晩培養し、更に １００μｍであ
らためて培養、０．１５八６６Ｇになったら３０分間氷
冷した。遠心分離後、沈殿物を５０ｍＨｃａｃ１２ ５
Ｇｍｌに懸濁、６０分間水冷後、遠心し５０ ｍＨ Ｃ
ａＣ１２−２０％ ａｌｙｃｅｒｏｌ １０ｍｌにＷ
Ａ？１したカルシウム処理菌０，１１を混合、０℃に保
った。４２℃に６０秒間加熱した後、室温に戻した。
ｍ濃度のもの）１０μｍと大腸菌ＨＢ１０１をＬ ｂｒ
ｏｔｈ ５＋ｅｌで一晩培養し、更に １００μｍであ
らためて培養、０．１５八６６Ｇになったら３０分間氷
冷した。遠心分離後、沈殿物を５０ｍＨｃａｃ１２ ５
Ｇｍｌに懸濁、６０分間水冷後、遠心し５０ ｍＨ Ｃ
ａＣ１２−２０％ ａｌｙｃｅｒｏｌ １０ｍｌにＷ
Ａ？１したカルシウム処理菌０，１１を混合、０℃に保
った。４２℃に６０秒間加熱した後、室温に戻した。
Ｌ−ｂｒｏｔｈ （ Ｂａｃｔｏ − Ｔｒｙｐｔｏ
ｎｅ− １ｇ， ｙｅａｓｔ −ＥＸｔｒａＣｔ
ｏ．ｓｇ， ＮａＣＩ Ｇ．５ Ｑ 、 ｇｌｕｃ
ｏｓｅ ｏ．１ｇを水１（ｌｏａｆで溶解 ｐＨ７．２
に調製したもの）１１を加えて３７℃・３０〜６０分イ
ンキュベートした。 次に１３、ＯＯＯｒｐｇ＋で５分
間遠心し、上清をすてた後、沈殿をＬ−ｂｒｏｔｈ ０
．３ａｌに懸濁させた。０，１１ずつ寒天培地（Ｂａｃ
ｔｏ −Ｔｒｙｐｔｏｎｅ １ｇ、 Ｙｅａｓｔ ｅ
ｘｔｒａｃｔＯ，５ａ 、 Ｈａ（Ｊ ０．５ｇ 、
ｇｌｕｃｏｓｅ ０．１ｇに寒天１．５ｇとアンピシリ
ン３−〇を加えたもの） ３枚に広げ各コロニーより得
られたプラスミド画分の制限酵素開裂地図が予定したＯ
Ｈ口３３のそれと一致するコロニーを選択した。
ｎｅ− １ｇ， ｙｅａｓｔ −ＥＸｔｒａＣｔ
ｏ．ｓｇ， ＮａＣＩ Ｇ．５ Ｑ 、 ｇｌｕｃ
ｏｓｅ ｏ．１ｇを水１（ｌｏａｆで溶解 ｐＨ７．２
に調製したもの）１１を加えて３７℃・３０〜６０分イ
ンキュベートした。 次に１３、ＯＯＯｒｐｇ＋で５分
間遠心し、上清をすてた後、沈殿をＬ−ｂｒｏｔｈ ０
．３ａｌに懸濁させた。０，１１ずつ寒天培地（Ｂａｃ
ｔｏ −Ｔｒｙｐｔｏｎｅ １ｇ、 Ｙｅａｓｔ ｅ
ｘｔｒａｃｔＯ，５ａ 、 Ｈａ（Ｊ ０．５ｇ 、
ｇｌｕｃｏｓｅ ０．１ｇに寒天１．５ｇとアンピシリ
ン３−〇を加えたもの） ３枚に広げ各コロニーより得
られたプラスミド画分の制限酵素開裂地図が予定したＯ
Ｈ口３３のそれと一致するコロニーを選択した。
寒天培地で増した菌を５ＴＥＴ ｂｕｆｆｅｒ（８％
５ｕｃｒｏｓｅ。
５ｕｃｒｏｓｅ。
５０ｅＨＴｒｉｓ−ＨＣｊ！ （ｐＨ８，０）、
５０ｍＨＥ［ｌＴ八 、 ５％ＴｒｉｔＯｎ ｘ １
ｏｏ）に懸濁させた。
５０ｍＨＥ［ｌＴ八 、 ５％ＴｒｉｔＯｎ ｘ １
ｏｏ）に懸濁させた。
リゾデーム（１０１（１／ １１１１０．２５ＨＴｒｉ
ｓ−ＩＩｃｊ！（１）Ｈ８，Ｏ）） ２０μｍを加えて
沸騰水中で６０秒間加熱した後、１３． ＧＯＯｒｐｍ
で１０分間遠心した。
ｓ−ＩＩｃｊ！（１）Ｈ８，Ｏ）） ２０μｍを加えて
沸騰水中で６０秒間加熱した後、１３． ＧＯＯｒｐｍ
で１０分間遠心した。
上清に１ｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ Ｏ，５ｎ＋ｌを加えて
一２０℃に３０分間放置、１３． ＧＯＯｒｐｍで１０
分間遠心した後、沈澱を■［緩衝液５０μｌに溶解し、
１ｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ ８０μｌを加えて一２０℃に
３０分間放置、１３．０ＯＯｒｐ−で１０分間遠心した
後、沈殿を乾燥させた。
一２０℃に３０分間放置、１３． ＧＯＯｒｐｍで１０
分間遠心した後、沈澱を■［緩衝液５０μｌに溶解し、
１ｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ ８０μｌを加えて一２０℃に
３０分間放置、１３．０ＯＯｒｐ−で１０分間遠心した
後、沈殿を乾燥させた。
沈殿を８２０２３．５μ＋に溶解し、Ｂｕｆｆｅｒ ６
μｌとＣ１ａｌ （１０ｕ／μＩ ） ０．５μＩ
を加えテ３７℃′ｃ６０分間反応させた後、５８ Ｎａ
Ｃｊ！ １．２μＩ と ５ａｉｌ（８ｕ／μＩ）１
．５μｍを加えて ３７℃でさらに９０分間反応させた
。
μｌとＣ１ａｌ （１０ｕ／μＩ ） ０．５μＩ
を加えテ３７℃′ｃ６０分間反応させた後、５８ Ｎａ
Ｃｊ！ １．２μＩ と ５ａｉｌ（８ｕ／μＩ）１
．５μｍを加えて ３７℃でさらに９０分間反応させた
。
得られた液をフェノール処理し、エタノール沈殿後５％
ＰＡＧＥにて電気泳動に付し、β−ＮＧＦ遺伝子セグメ
ントを含む目的のＤＮＡを大量に得た。
ＰＡＧＥにて電気泳動に付し、β−ＮＧＦ遺伝子セグメ
ントを含む目的のＤＮＡを大量に得た。
融合蛋白質発現型 −ＰＨ１０
プラスミドｐＧＩＩ−１９（微工研 菌寄第７６０６号
）５μａを標準緩衝液６μｍにｌｌ濁し、ａｇ＋ ｒｒ
１２Ｕ及び５ａｌ１３２ｕを加え３７℃２時間消化し
た。
）５μａを標準緩衝液６μｍにｌｌ濁し、ａｇ＋ ｒｒ
１２Ｕ及び５ａｌ１３２ｕを加え３７℃２時間消化し
た。
反応液をフェノール抽出した後、エタノール沈殿を行っ
てＤＮＡを回収。５％アクリルアシドグル電気泳動に付
し、長い二重ｇ（ＤＮＡ部分を抽出し、約３μｇの直鎖
状二重鎖ＤＮＡであるベクターＤＮＡ ｐＧｆ（−Ｌ９
／ Ｂｇｌ ｌｌ−３ａｔ Ｉを得た。
てＤＮＡを回収。５％アクリルアシドグル電気泳動に付
し、長い二重ｇ（ＤＮＡ部分を抽出し、約３μｇの直鎖
状二重鎖ＤＮＡであるベクターＤＮＡ ｐＧｆ（−Ｌ９
／ Ｂｇｌ ｌｌ−３ａｔ Ｉを得た。
得られたベクターＤＮＡ ｐＧＨ−１９／Ｂａｌ ｌｌ
−８ａｔ Ｔ（０，５μｇ／μｍ）３μｍと、５°末
端にａｇ＋ ｕサイトを有しそれにつづ＜ ｌ１ｅ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒａ （７） ７ ミ／酸コドンの塩
基配列を介しヒト神経成長因子の遼伝子（３°末端にＳ
ａｔ Ｉサイトそれにつづ＜ ５ｔｏｐｅｃｌｃｏｄｅ
ｎ）のカイネーション混合液（Ｏ１３μｇ／μｍ）を３
μｍにｌ−１２０８μｍを加え、ライゲーション緩衝液
４μＩ０．２８２−メルカプトエタノール１μｍ中ｔ’
Ｔ４−ＤＮＡＩＪガーゼ（３５０ｕ／ μｌ ） １
μｍで２０℃・２０時間反応させた。
−８ａｔ Ｔ（０，５μｇ／μｍ）３μｍと、５°末
端にａｇ＋ ｕサイトを有しそれにつづ＜ ｌ１ｅ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒａ （７） ７ ミ／酸コドンの塩
基配列を介しヒト神経成長因子の遼伝子（３°末端にＳ
ａｔ Ｉサイトそれにつづ＜ ５ｔｏｐｅｃｌｃｏｄｅ
ｎ）のカイネーション混合液（Ｏ１３μｇ／μｍ）を３
μｍにｌ−１２０８μｍを加え、ライゲーション緩衝液
４μＩ０．２８２−メルカプトエタノール１μｍ中ｔ’
Ｔ４−ＤＮＡＩＪガーゼ（３５０ｕ／ μｌ ） １
μｍで２０℃・２０時間反応させた。
フェノール処理後、反応液からエタノールにて沈殿させ
ＤＮＡを回収、直接発現型と同様にして形質転換を行い
、形質転換株Ｅ、コリ／ＰＮＦ７を得た。
ＤＮＡを回収、直接発現型と同様にして形質転換を行い
、形質転換株Ｅ、コリ／ＰＮＦ７を得た。
こうして得た［、コリ／ｐＮＦ７を同様にしてリガーゼ
処理イソプロパツール沈殿させた。沈殿をＨ２Ｏ−２０
，６ｕ１ニ溶解し、ｂｕｆｆｅｒ ６μｌ 、 ５８
ＮａＣ１Ｏ１９μｌ 、 ＢりＩ ＩＩ
（８ｕ／ｌ ） １μｍ、 Ｓａｌ −１（８
１１／μｌ）１．５μｍを加えて３７℃で９０分間反応
させた。次にＲＮａＳｅ −＾ （１０１Ｇ ／ｍｌ）
０．２μｍを加え３７℃３０分間反応させた。
処理イソプロパツール沈殿させた。沈殿をＨ２Ｏ−２０
，６ｕ１ニ溶解し、ｂｕｆｆｅｒ ６μｌ 、 ５８
ＮａＣ１Ｏ１９μｌ 、 ＢりＩ ＩＩ
（８ｕ／ｌ ） １μｍ、 Ｓａｌ −１（８
１１／μｌ）１．５μｍを加えて３７℃で９０分間反応
させた。次にＲＮａＳｅ −＾ （１０１Ｇ ／ｍｌ）
０．２μｍを加え３７℃３０分間反応させた。
得られた液をフェノール処理し、エタノール沈殿後５％
ＰＡＧＥにて電気泳動に付し、β−ＮＯＦ遺伝子セグメ
ントを含む目的のＤＮＡを大量に得た。
ＰＡＧＥにて電気泳動に付し、β−ＮＯＦ遺伝子セグメ
ントを含む目的のＤＮＡを大量に得た。
実施例５ （発現）
実施例４で得られた Ｅ、コリ／ ｐＮＤ−３３，Ｅ、
コリ／ＰＮＦ７を下に示ず培地５１で一晩培養した。
コリ／ＰＮＦ７を下に示ず培地５１で一晩培養した。
Ｈａ２１１ＰＯ４０，５５ａ
にＩｔ２ＰＯ４０，２゜
ＮａＣ１，０６５ｇ
Ｎ１１４（Ｊ！ Ｏ，ｔ。
ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ０．２ｇｇ１ｕｃ
ｏｓｅ ｏ、４ｇＨＣｌＳＯ４，Ｏ，１ｍ
ｍｏｌ ＣａＣＪ１２０．０１ ｍｍｏｌ ｔｈｉａｌｌｌｉｎｅ−１１ＣＩ！ １１１１ｇ
ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ ２ ｍｇ次に上で得ら
れた培養液１００μｍをＨ（ＩｃＩ２−０．２％ｃａｓ
ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ−０，４％ Ｇｌｕｃｏｓｅ−Ａ
Ｉｌｌｐｉｌｌｉｎ（２０Ｕｇ／ｌ）−チアミン（１０
Ｕｇ／ｌ）の培地５１で培養、 １時間後 ３−ｉｎ
ｄｏｌａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ ′（１０ｎ＋
ｏ／ １ｅｌエタノール）２０μｍを加え２４時間培養
した。
ｏｓｅ ｏ、４ｇＨＣｌＳＯ４，Ｏ，１ｍ
ｍｏｌ ＣａＣＪ１２０．０１ ｍｍｏｌ ｔｈｉａｌｌｌｉｎｅ−１１ＣＩ！ １１１１ｇ
ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ ２ ｍｇ次に上で得ら
れた培養液１００μｍをＨ（ＩｃＩ２−０．２％ｃａｓ
ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ−０，４％ Ｇｌｕｃｏｓｅ−Ａ
Ｉｌｌｐｉｌｌｉｎ（２０Ｕｇ／ｌ）−チアミン（１０
Ｕｇ／ｌ）の培地５１で培養、 １時間後 ３−ｉｎ
ｄｏｌａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ ′（１０ｎ＋
ｏ／ １ｅｌエタノール）２０μｍを加え２４時間培養
した。
培養終了後、遠心分離機で１３．ＯＯＯｒｐｍ ５分
間遠心後、菌体を集めた。
間遠心後、菌体を集めた。
その一部をＳａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ −６２，５ａ
＋ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（１１１１６，８） 、
２％ＳＯ３５ｍＨＥＤＴ＾、 １０％ ｇｌｙｃｅｒｏ
ｌ。
＋ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（１１１１６，８） 、
２％ＳＯ３５ｍＨＥＤＴ＾、 １０％ ｇｌｙｃｅｒｏ
ｌ。
３５ ｉＨ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ 、
０．００１％ ＢＰＢ −に懸濁、佛騰水中で５分間
加熱した後、遠心分離し、その上清について、０．１％
５Ｏ３−１５％ＰＡＧＥで電気泳動を行いＥ、コリ／
ｐＮＤ−３３からは分子量１．３Ｘ １０’のもの、Ｅ
、コリ／ＤＮＦ７からは分子け３．０Ｘ １０’のもの
が得られた。
０．００１％ ＢＰＢ −に懸濁、佛騰水中で５分間
加熱した後、遠心分離し、その上清について、０．１％
５Ｏ３−１５％ＰＡＧＥで電気泳動を行いＥ、コリ／
ｐＮＤ−３３からは分子量１．３Ｘ １０’のもの、Ｅ
、コリ／ＤＮＦ７からは分子け３．０Ｘ １０’のもの
が得られた。
この電気泳動パターンを第５図に示ず。
このパターンをデンシトメーターでスキｔンニングを行
い、生成同を計算した。その結果 Ｅ、コリ／１）ＮＯ
３３については全蛋白質の７ｚのβ−ＮＧＦ、Ｅ、コリ
／ｐＮＦ７ニツイテハ同Ｕ ＜ １４％ （７） ＨＧ
Ｉ＋−β−ＮＧＦ融合蛋白質の生成を認めた。
い、生成同を計算した。その結果 Ｅ、コリ／１）ＮＯ
３３については全蛋白質の７ｚのβ−ＮＧＦ、Ｅ、コリ
／ｐＮＦ７ニツイテハ同Ｕ ＜ １４％ （７） ＨＧ
Ｉ＋−β−ＮＧＦ融合蛋白質の生成を認めた。
実施例 ６
Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｘａによるｆ
ｕｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎからのＮＧＦの切断 ５Ａの８９−ｃａｓ ｍｅｄｉｕｍ中Ｅ、コリ／ｐＮＦ
７をＩＡＡで１ｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｌ／た後１２時間培
養し、集菌し、約１０ｇ（湿重量）を得た。これを超音
波破砕し、１０．０００ｒｐｍ １５分４℃で遠心し沈
澱をえた。これを７８尿素−１０ｉＨＴｒｉｓ −ＨＣ
ｊ！ （ｐＨ７，５）−２０ｍＨメルメルトエタノール
溶液５０Ｉｄ、に溶解し、１０．ＯＯＯｒｐｍ、 １５
分４℃で遠心して沈澱を除き、上清を同溶液にて１００
−とし、同溶液にて平衡化したＤＥＡＥ−セルローズ（
φ２．８ｘｌＳｃｍ）のカラムにかけ０から １．３Ｈ
の食塩（全量１１）による直線１１１度勾配法にＪ：り
蛋白質を溶出し約７ｄずつ分画し、各フラクションを５
Ｏ３−１２，５％ＰＡＧＥにより目的物を検出し、水に
対して透析して約１２ＩＩｔｇのｆｕｓｅｄ ｐｒｏｔ
ｅｉｎをえた。この約ａｏμ（Ｊを１００ｍＨＴｒｉｓ
−ｆｌｃＩ２（ｐＨ８，０）中ｒａｃｔｏｒ Ｘａ１μ
Ｕにより３１℃１．５時間加水分解し分解物をアクリル
アミド電気泳動に付し、ＮＧＦと推定される分子量１３
，０００の分画を得た。
ｕｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎからのＮＧＦの切断 ５Ａの８９−ｃａｓ ｍｅｄｉｕｍ中Ｅ、コリ／ｐＮＦ
７をＩＡＡで１ｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｌ／た後１２時間培
養し、集菌し、約１０ｇ（湿重量）を得た。これを超音
波破砕し、１０．０００ｒｐｍ １５分４℃で遠心し沈
澱をえた。これを７８尿素−１０ｉＨＴｒｉｓ −ＨＣ
ｊ！ （ｐＨ７，５）−２０ｍＨメルメルトエタノール
溶液５０Ｉｄ、に溶解し、１０．ＯＯＯｒｐｍ、 １５
分４℃で遠心して沈澱を除き、上清を同溶液にて１００
−とし、同溶液にて平衡化したＤＥＡＥ−セルローズ（
φ２．８ｘｌＳｃｍ）のカラムにかけ０から １．３Ｈ
の食塩（全量１１）による直線１１１度勾配法にＪ：り
蛋白質を溶出し約７ｄずつ分画し、各フラクションを５
Ｏ３−１２，５％ＰＡＧＥにより目的物を検出し、水に
対して透析して約１２ＩＩｔｇのｆｕｓｅｄ ｐｒｏｔ
ｅｉｎをえた。この約ａｏμ（Ｊを１００ｍＨＴｒｉｓ
−ｆｌｃＩ２（ｐＨ８，０）中ｒａｃｔｏｒ Ｘａ１μ
Ｕにより３１℃１．５時間加水分解し分解物をアクリル
アミド電気泳動に付し、ＮＧＦと推定される分子量１３
，０００の分画を得た。
参考例（原料の潤製）
特願昭５９−９２０８４号明ａＳ中に記載された通り、
以下の様にしてＩｌＭした。
以下の様にしてＩｌＭした。
［オリゴヌクレオチドの合成］
（１） ｄｃＡｃＧＴＡＡＡＡＡＧＧＧＴＡＡｒ （
Ｕｏ、−２）の合成５°（４，４°−ビメトキシトリチ
ル）チミジン担体（１００μ＋１０１／Ｇ前記ポリスチ
レン樹脂２０■）をピリジン中−夜室温で放置し次のよ
うな操作により縮合反応を行った。
Ｕｏ、−２）の合成５°（４，４°−ビメトキシトリチ
ル）チミジン担体（１００μ＋１０１／Ｇ前記ポリスチ
レン樹脂２０■）をピリジン中−夜室温で放置し次のよ
うな操作により縮合反応を行った。
操作
１）ジクロロメタン−メタノール（７：３ 、Ｖ／Ｖ
） ２ｄにより３回洗浄。
） ２ｄにより３回洗浄。
２）２％ベンゼンスルボン酸溶液（溶媒ジクロロメタン
−メチルアルコール、７：３＞２ｄで２分間処理した後
、同じ混合溶媒で３回洗浄する操作を繰返して発色のな
くなることを確めた。
−メチルアルコール、７：３＞２ｄで２分間処理した後
、同じ混合溶媒で３回洗浄する操作を繰返して発色のな
くなることを確めた。
３）ピリジン２ＪＩ１１！により３回洗浄。
４）５°−（４，４°−ジメトキシトリデル）−Ｎ−ペ
ンゾイルデオキシアデニリルーＰ（ｏ−クロ［コフェニ
ル） −Ｎ−ベンゾイルデオキシアデノシン３’−（ｏ
−クロロフェニル）ホスフェートのピリジン溶液（０，
２ｄ。
ンゾイルデオキシアデニリルーＰ（ｏ−クロ［コフェニ
ル） −Ｎ−ベンゾイルデオキシアデノシン３’−（ｏ
−クロロフェニル）ホスフェートのピリジン溶液（０，
２ｄ。
同ジヌクレオチド２０■を含む）を加え溶媒を減圧留去
した。
した。
５）縮合剤、メシチレンスルホニル−３−ニトロトリア
ゾリド（２０ｙｉ ）のピリジン溶液（０，２ｄ）を加
え４０℃、２０分間放置した。
ゾリド（２０ｙｉ ）のピリジン溶液（０，２ｄ）を加
え４０℃、２０分間放置した。
６）ピリジン２＃１１１により２回洗浄。
７） ０．１Ｍジメヂルアミノビリジンのピリジン溶液
（１，１３ｍ）および無水酢酸（０，２ｍ＞を加え１０
分間放置した。
（１，１３ｍ）および無水酢酸（０，２ｍ＞を加え１０
分間放置した。
８）ピリジン２ｍにより３回洗浄。続いて上記２）以降
の操作を５’−（４，４°−ジメトキシトリチル）−Ｎ
−ペンゾイルデオキシアデニリルーＰ−（０−クロロフ
ェニル）デオキシアデノシン−３°−（０−クロロフェ
ニル）ホスフェートに代えて５°−（４，４°−ジメト
キシトリチル）−Ｎ−インブヂリルデオキシグアニリル
−Ｐ−（０−クロロフェニル）チミジン−３°−（０−
クロロフェニル）ホスフェートを用いて行い、さらに同
様の保護基を有するｄＧＧ、 ｄＡＡ、 ｄＡＡ、 ｄ
ＴＡ、 ｄＣＧおよびｄＣ八を用いて順次５°方向へＤ
ＭＡ鎖を延長した後、樹脂を０．５Ｍ トリメチルグア
ニジウム−ピリジン−２−フルドオキシメート［Ｃ，Ｂ
、 Ｒｅｅｓｅ ｅｔ ａｌ、、 Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ
ｏｎ Ｌｅｔｔ、、 ２７２７（１９７８）］のジオキ
サン−水（９：１ ）の溶液（１ｄ）中３８時間振とう
した。樹脂を５０％ピリジン水により洗浄し炉液と洗液
を合せて減圧濃縮し、残漬に濃アンモニア水（１５ｄ
）を加え密栓して５５℃で５時間加温した。アンモニア
を留去し、ピリジニウム型強酸性陽イオン交換樹脂（ｄ
ｏｖｅｘ ５０．商標）２−を加え、樹脂を５０％ピリ
ジン水により洗浄し、炉液と洗液を合せて濃縮した。濃
縮液に少量の水を加え酢酸エチルでオキシムを抽出して
除いた。水層を水で希釈し、その一部を分取してジメト
キシトリチル基の定ｋｔを行い全体の吊を推定した。ジ
メトキシトリチル基の分子吸光係数を７１．７００とす
ると７７．４ Ａ２５４ユニツトから １０８μｓｏｌ
の粗オリゴヌクレオチドが合成されたことがわかった。
の操作を５’−（４，４°−ジメトキシトリチル）−Ｎ
−ペンゾイルデオキシアデニリルーＰ−（０−クロロフ
ェニル）デオキシアデノシン−３°−（０−クロロフェ
ニル）ホスフェートに代えて５°−（４，４°−ジメト
キシトリチル）−Ｎ−インブヂリルデオキシグアニリル
−Ｐ−（０−クロロフェニル）チミジン−３°−（０−
クロロフェニル）ホスフェートを用いて行い、さらに同
様の保護基を有するｄＧＧ、 ｄＡＡ、 ｄＡＡ、 ｄ
ＴＡ、 ｄＣＧおよびｄＣ八を用いて順次５°方向へＤ
ＭＡ鎖を延長した後、樹脂を０．５Ｍ トリメチルグア
ニジウム−ピリジン−２−フルドオキシメート［Ｃ，Ｂ
、 Ｒｅｅｓｅ ｅｔ ａｌ、、 Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ
ｏｎ Ｌｅｔｔ、、 ２７２７（１９７８）］のジオキ
サン−水（９：１ ）の溶液（１ｄ）中３８時間振とう
した。樹脂を５０％ピリジン水により洗浄し炉液と洗液
を合せて減圧濃縮し、残漬に濃アンモニア水（１５ｄ
）を加え密栓して５５℃で５時間加温した。アンモニア
を留去し、ピリジニウム型強酸性陽イオン交換樹脂（ｄ
ｏｖｅｘ ５０．商標）２−を加え、樹脂を５０％ピリ
ジン水により洗浄し、炉液と洗液を合せて濃縮した。濃
縮液に少量の水を加え酢酸エチルでオキシムを抽出して
除いた。水層を水で希釈し、その一部を分取してジメト
キシトリチル基の定ｋｔを行い全体の吊を推定した。ジ
メトキシトリチル基の分子吸光係数を７１．７００とす
ると７７．４ Ａ２５４ユニツトから １０８μｓｏｌ
の粗オリゴヌクレオチドが合成されたことがわかった。
水層を減圧乾固し残渣に８０％酢酸１０ｄを加え２５℃
、３０分間保った後溶媒を留去し、残渣を水と酢酸エチ
ルに溶解した。水層を濃縮した後、イオン交換クロマト
グラフィーにかけた。イオン交換体はＤＥＡＥ−Ｔｏｙ
ｏｐｅａｒｌ ６５０３ （商標）を用いた。これを
カラム（０，７ｘ２１ａ）につめ７Ｈ尿素、２０ｍＮ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）中、０．１〜０．３
Ｈの食塩濃度勾配で溶出する。紫外線吸収によりオリゴ
ヌクレオチドを検出し、中央部をとりセルロース膜を用
いて透析により脱塩し、１２．３Ａ ２６ｏユニツト＜
６１５μｏ ＞を得た。ＩＩＰＩｃ （Ｃ１８シＩＪ
カ’ｙ’ ）Ｉし担体）および−次元ホモクロマトグ
ラフィーで単一であることにより純度を確認し７．−０
２） ［ｄＡＡｃＴ八ＧＴＡへＧｃＡＡＧＴＴ（ＩＩｏ
。）の合成１’０１−２の場合と同様にして５’−（４
，４°−ジメトキシトリチル）チミジン担体を用い、ま
ず５°−（４，４゜−ジメトキシトリチル） ３’−Ｐ
−（ｏ−クロロフェニル）デミジル酸を用いてＵ。１−
２の場合と同様にして縮合反応を行った。引続き第２−
１表中下線で示した単位で保！：ｌ！！ｍを有するジヌ
クレオチドを用いて’０１−２の場合と同様にして５゛
方向へのＤＮＡ ＠の延長、脱保ｖ！１基および生成物
の精製分離を行い、Ｕｏｏｌｌ、ＯＡ２６．ユニット（
５５０μｇ）を得た。
、３０分間保った後溶媒を留去し、残渣を水と酢酸エチ
ルに溶解した。水層を濃縮した後、イオン交換クロマト
グラフィーにかけた。イオン交換体はＤＥＡＥ−Ｔｏｙ
ｏｐｅａｒｌ ６５０３ （商標）を用いた。これを
カラム（０，７ｘ２１ａ）につめ７Ｈ尿素、２０ｍＮ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）中、０．１〜０．３
Ｈの食塩濃度勾配で溶出する。紫外線吸収によりオリゴ
ヌクレオチドを検出し、中央部をとりセルロース膜を用
いて透析により脱塩し、１２．３Ａ ２６ｏユニツト＜
６１５μｏ ＞を得た。ＩＩＰＩｃ （Ｃ１８シＩＪ
カ’ｙ’ ）Ｉし担体）および−次元ホモクロマトグ
ラフィーで単一であることにより純度を確認し７．−０
２） ［ｄＡＡｃＴ八ＧＴＡへＧｃＡＡＧＴＴ（ＩＩｏ
。）の合成１’０１−２の場合と同様にして５’−（４
，４°−ジメトキシトリチル）チミジン担体を用い、ま
ず５°−（４，４゜−ジメトキシトリチル） ３’−Ｐ
−（ｏ−クロロフェニル）デミジル酸を用いてＵ。１−
２の場合と同様にして縮合反応を行った。引続き第２−
１表中下線で示した単位で保！：ｌ！！ｍを有するジヌ
クレオチドを用いて’０１−２の場合と同様にして５゛
方向へのＤＮＡ ＠の延長、脱保ｖ！１基および生成物
の精製分離を行い、Ｕｏｏｌｌ、ＯＡ２６．ユニット（
５５０μｇ）を得た。
３） ［ｄＴＴＧＡＴＣＡＴＧＣＧＴＴＣＡＡＧＴＧＣ
ＡＴ（Ｌｏｏ） ］５°−（４，４°−ジメトキシトリ
チル）−トベンゾイルデオキシアデノシン３’−（ｏ−
クロロフェニル）ボスフェートを用いた他はｕｏｏの場
合と同様にし゛で第一段の縮合を行った。さらに第２−
１表中下線で示した単位で保護基を有するジヌクレオチ
ドを用いてＵ。１−２の場合と同様にしてＤＮＡ鎖延長
、脱保護基および生成物の精製分離を行い、Ｌｏ。８．
６ Ａ２６０ユニツト（４３０μり）を得た。
ＡＴ（Ｌｏｏ） ］５°−（４，４°−ジメトキシトリ
チル）−トベンゾイルデオキシアデノシン３’−（ｏ−
クロロフェニル）ボスフェートを用いた他はｕｏｏの場
合と同様にし゛で第一段の縮合を行った。さらに第２−
１表中下線で示した単位で保護基を有するジヌクレオチ
ドを用いてＵ。１−２の場合と同様にしてＤＮＡ鎖延長
、脱保護基および生成物の精製分離を行い、Ｌｏ。８．
６ Ａ２６０ユニツト（４３０μり）を得た。
４） ［ｄＣＡＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＧＴＡＴＣＡＴ（
ＩＩｏｌ−３）および［ｄＣＡＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＧ
ＴＡＴＣＧＡＡＴ （Ｕｏｌ−４）の合成］’０１−２
の場合と同様にして５’−（４，４°−ジメトキシトリ
チル）チミジン担体を用い、５°−（４，４°−ジメト
キシトリチル）−Ｎ−ペンゾイルデオキシアデニリルー
Ｐ（ｏ−クロロフェニル）デオキシアデノシン３°（０
−クロロフェニル）ホスフェートおよびこれに代えて５
°−（４，４°−ジメトキシトリチル）−トベンゾイル
デオキシシチジリルーＰ−（ｏ−クロロフェニル）デオ
キシアデニン３°（０−クロロフェニル）ホスフェート
を用いて最初の縮合反応を行った。
ＩＩｏｌ−３）および［ｄＣＡＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＧ
ＴＡＴＣＧＡＡＴ （Ｕｏｌ−４）の合成］’０１−２
の場合と同様にして５’−（４，４°−ジメトキシトリ
チル）チミジン担体を用い、５°−（４，４°−ジメト
キシトリチル）−Ｎ−ペンゾイルデオキシアデニリルー
Ｐ（ｏ−クロロフェニル）デオキシアデノシン３°（０
−クロロフェニル）ホスフェートおよびこれに代えて５
°−（４，４°−ジメトキシトリチル）−トベンゾイル
デオキシシチジリルーＰ−（ｏ−クロロフェニル）デオ
キシアデニン３°（０−クロロフェニル）ホスフェート
を用いて最初の縮合反応を行った。
引続き第２−１表中下線で示した単位で保護基を有する
ジヌクレオチドを用いてＵ。１−２の場合と同様にして
ＤＮＡ鎖延長、脱保護基および生成物の精製分離を行い
、ＩＪ ８．４６２６ｏユニツト（４２０μｇ）、
およびＵ １１．６＾２６０ユニツト （５８０
μｇ）を得た。
ジヌクレオチドを用いてＵ。１−２の場合と同様にして
ＤＮＡ鎖延長、脱保護基および生成物の精製分離を行い
、ＩＪ ８．４６２６ｏユニツト（４２０μｇ）、
およびＵ １１．６＾２６０ユニツト （５８０
μｇ）を得た。
５）［ｄ丁ＴＴＴＣＣＣＡＴＴＡＧＣ（Ｌ。１−２）
、ｄＴＴＴＴｃｃｃＡＴＡＧＴＡＧｃ （Ｌｏｌ、、３
）、ｄＴＴＴＴＣＣＣＡＴ＾ＧＣＴＴ＾ＧＣ（Ｌｏｌ、
）の合成１５’−（４，４’−ジメトキシトリデル）デ
オキシシチジン担体を用い、５’−（４，４°−ジメト
キシトリチル）−Ｎ−イソプブリルデオキングアノシン
３°（０−クロロフェニル）ホスフェートおよび５°−
（４，４°−ジメトキシトリチル）−トベンゾイルデ第
４：シアデニリル−Ｐ−（０−クロロフェニル）デオキ
シグアノシン３゛（Ｏ−クロロフェニル）ホスフェート
を用いて’０１−２ ’００の場合と同様にして第一段
の縮合を行った。さらに第２−１表中下線で示した単位
で保護基を有するジヌクレオチドを用いてＵ。１−２の
場合と同様にしてＤＮＡ鎖延長、脱係ａ基および生成物
の精製分離を行い、［８，８Ａ２６ｏユニット（４４０
μＱ）、１ ９．５ Ａ２６．ユニット（４７５μｇ
） ＃にヒ１０１−４１１．２ Ａ２６０ ユニｙト（
５６０μｇ）を得た。
、ｄＴＴＴＴｃｃｃＡＴＡＧＴＡＧｃ （Ｌｏｌ、、３
）、ｄＴＴＴＴＣＣＣＡＴ＾ＧＣＴＴ＾ＧＣ（Ｌｏｌ、
）の合成１５’−（４，４’−ジメトキシトリデル）デ
オキシシチジン担体を用い、５’−（４，４°−ジメト
キシトリチル）−Ｎ−イソプブリルデオキングアノシン
３°（０−クロロフェニル）ホスフェートおよび５°−
（４，４°−ジメトキシトリチル）−トベンゾイルデ第
４：シアデニリル−Ｐ−（０−クロロフェニル）デオキ
シグアノシン３゛（Ｏ−クロロフェニル）ホスフェート
を用いて’０１−２ ’００の場合と同様にして第一段
の縮合を行った。さらに第２−１表中下線で示した単位
で保護基を有するジヌクレオチドを用いてＵ。１−２の
場合と同様にしてＤＮＡ鎖延長、脱係ａ基および生成物
の精製分離を行い、［８，８Ａ２６ｏユニット（４４０
μＱ）、１ ９．５ Ａ２６．ユニット（４７５μｇ
） ＃にヒ１０１−４１１．２ Ａ２６０ ユニｙト（
５６０μｇ）を得た。
こうして調製したオリゴヌクレオチドの１１ Ｐ Ｌ
Ｃでのリテンション・タイムおよび叶へＥ〜セルロース
を用いた一次元ホモクロマトグラフイでのＲＩＩｌ値を
第２−１表に示す。
Ｃでのリテンション・タイムおよび叶へＥ〜セルロース
を用いた一次元ホモクロマトグラフイでのＲＩＩｌ値を
第２−１表に示す。
６）［Ａ部分を構成するオリゴヌクレオチドの調製］合
成ヒト生長ホルモン遺伝子のＡ部分を構成すべきオリゴ
ヌクレオチド（第２−２表記載のＵＡｏ〜Ｕ および’
ＡＯ〜’Ａ６の１４個）を５°−（４，４−ジメへ６ トキシトリヂル）デオキシグアノシン担体、 ５゜−’
（４，４°−ジメトキシトリチル）チミジン担体および
５’−（４，４°−ジメトキシトリチル）デオキシシチ
ジン担体を用い、第２−２表記載のシーケンス部位の下
線で示した単位で、各々保護基を有するモノ−ジヌクレ
オチドまたはテトラヌクレオチドをＵ およびＵ。０
の場合と同様にして３°末端側から５゛側へ向って順次
縮合させ、脱保護基および精製分離を行って調製した。
成ヒト生長ホルモン遺伝子のＡ部分を構成すべきオリゴ
ヌクレオチド（第２−２表記載のＵＡｏ〜Ｕ および’
ＡＯ〜’Ａ６の１４個）を５°−（４，４−ジメへ６ トキシトリヂル）デオキシグアノシン担体、 ５゜−’
（４，４°−ジメトキシトリチル）チミジン担体および
５’−（４，４°−ジメトキシトリチル）デオキシシチ
ジン担体を用い、第２−２表記載のシーケンス部位の下
線で示した単位で、各々保護基を有するモノ−ジヌクレ
オチドまたはテトラヌクレオチドをＵ およびＵ。０
の場合と同様にして３°末端側から５゛側へ向って順次
縮合させ、脱保護基および精製分離を行って調製した。
得られたオリゴヌクレオチドのクロマトグラフィーデー
タを第２−２表に示ず。
タを第２−２表に示ず。
７）［Ｂ部分を構成するオリゴヌクレオチドの調製１合
成ヒト生長ホルモン膚伝子の８部分を構成づべきオリゴ
ヌクレオチド（第２−３表記載の’８０〜Ｕ および
’ＢＯ〜［Ｂ１８の３９個）を５°−（４，４”−ジメ
トキシトリチル）チミジン担体、５°−（４，４’−ジ
メトキシトリデル）デオキシアデノシン担体、５°−（
４，４°−ジメトキシトリチル）デオキシグアノシン担
体、および５’−（４，４°−ジメトキシトリチル）デ
オキシシチジン担体を用い、第２−３表記載のシーケン
ス部位の下線で示した単位で、各々保護基を有するモノ
−またはジヌクレオチドをＵ。１−２およびＵ。０の場
合と同様にして３°末端側から５゛側へ向って順次縮合
させ、脱保Ｗ！基および精製分離を行って調製した。得
られたオリゴヌクレオチドのクロマトグラフィーデータ
を第２−３表に示す。
成ヒト生長ホルモン膚伝子の８部分を構成づべきオリゴ
ヌクレオチド（第２−３表記載の’８０〜Ｕ および
’ＢＯ〜［Ｂ１８の３９個）を５°−（４，４”−ジメ
トキシトリチル）チミジン担体、５°−（４，４’−ジ
メトキシトリデル）デオキシアデノシン担体、５°−（
４，４°−ジメトキシトリチル）デオキシグアノシン担
体、および５’−（４，４°−ジメトキシトリチル）デ
オキシシチジン担体を用い、第２−３表記載のシーケン
ス部位の下線で示した単位で、各々保護基を有するモノ
−またはジヌクレオチドをＵ。１−２およびＵ。０の場
合と同様にして３°末端側から５゛側へ向って順次縮合
させ、脱保Ｗ！基および精製分離を行って調製した。得
られたオリゴヌクレオチドのクロマトグラフィーデータ
を第２−３表に示す。
８）［Ｃ部分を構成するオリゴヌクレオチドの調１１］
合成ヒト生長ホルモン遺伝子のＣ部分を構成すべきオリ
ゴヌクレオチド（第２−４表記載のＵ。０〜ＵＣ１２お
よびｔＣＯ〜ＬＣ１１の２５個）を５°−（４，４°−
ジメトキシトリチル）デオキシグアノシン担体、５°−
（４，４°−ジメトキシトリデル）デオキシアデノシン
担体、５’−（４，４°−ジメトキシトリチル）デオキ
シシチジン担体および５°−（４，４’−ジメトキシト
リチル）チミジン担体を用い、第２−４表記載のシーケ
ンス部位の下線で示した単位で、各々保Ｗｔ基を有する
七ノーまたはジヌクレオチドを’０１−２およびＵ。０
の場合と同様にして３°末端側から５°側へ向って順次
縮合させ、脱保ＷＩ基および精製分離を行って調製した
。得られたオリゴヌクレオチドのクロマトグラフィーデ
ータを第２−４表に示す。
合成ヒト生長ホルモン遺伝子のＣ部分を構成すべきオリ
ゴヌクレオチド（第２−４表記載のＵ。０〜ＵＣ１２お
よびｔＣＯ〜ＬＣ１１の２５個）を５°−（４，４°−
ジメトキシトリチル）デオキシグアノシン担体、５°−
（４，４°−ジメトキシトリデル）デオキシアデノシン
担体、５’−（４，４°−ジメトキシトリチル）デオキ
シシチジン担体および５°−（４，４’−ジメトキシト
リチル）チミジン担体を用い、第２−４表記載のシーケ
ンス部位の下線で示した単位で、各々保Ｗｔ基を有する
七ノーまたはジヌクレオチドを’０１−２およびＵ。０
の場合と同様にして３°末端側から５°側へ向って順次
縮合させ、脱保ＷＩ基および精製分離を行って調製した
。得られたオリゴヌクレオチドのクロマトグラフィーデ
ータを第２−４表に示す。
られた。
Ｃ１ｅａｒｅｄ １ｙｓａｔｅにその１／１０重量のＰ
ＥＧ粉末および１／１０容量の５８８ａＣｌを加え、マ
グネヂックスターラーで完全に溶解さＶた。０℃で１晩
放置した後、１０．００Ｏｒｐｍ 、 ｉｏ分分速遠心
た。沈澱を上清から分離した後、これを３１ｄ、のＴＥ
によく溶かしさらに少鉛のＴＥを加えＣ全体を正確に４
．１６−にした。
ＥＧ粉末および１／１０容量の５８８ａＣｌを加え、マ
グネヂックスターラーで完全に溶解さＶた。０℃で１晩
放置した後、１０．００Ｏｒｐｍ 、 ｉｏ分分速遠心
た。沈澱を上清から分離した後、これを３１ｄ、のＴＥ
によく溶かしさらに少鉛のＴＥを加えＣ全体を正確に４
．１６−にした。
これに５．ＯＯｇ ＣｓＣｌ、０．５ｄ ＥＢ溶液を加
えよく混合した。
えよく混合した。
２容のエタノールを加え、０℃、２０分放置後１０．Ｏ
ｏｏｒｐｍで１０分ｆｆｌ遠心し、上清をよく除き、沈
澱番９ｄのＴＥ−３ａｒｋｏｓｙｌによく溶かし、す’
３ニ少１１７）Ｔ［−３ａｒｋｏｓｙｌで９．５２９に
調製した。これにｉｏｇ ｃｓＣｌ、１ｄ Ｅ８溶液を
混ぜて約２０℃、３６，０ＯＯｒｐｌで３６時間遠心し
た。ブラックランプ（３６０ｎａ）照射下プラスミドＣ
ＣＤＮＡバンドを幅狭く回収した。
ｏｏｒｐｍで１０分ｆｆｌ遠心し、上清をよく除き、沈
澱番９ｄのＴＥ−３ａｒｋｏｓｙｌによく溶かし、す’
３ニ少１１７）Ｔ［−３ａｒｋｏｓｙｌで９．５２９に
調製した。これにｉｏｇ ｃｓＣｌ、１ｄ Ｅ８溶液を
混ぜて約２０℃、３６，０ＯＯｒｐｌで３６時間遠心し
た。ブラックランプ（３６０ｎａ）照射下プラスミドＣ
ＣＤＮＡバンドを幅狭く回収した。
ＴＩＥＮ ｔ’平衡化した５ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−
４８カラム（０，８ｘ２０α）に、得られたＣＣＤＮＡ
画分（０，８ｄ）をそのまま加え、ＴＥＮで自然流出法
によりグル濾過を行った。波長２５４ｎｍにおける吸光
度でモニターして約５ａｌ！のｖｏｉｄ ｖｏｌｕｍｅ
ＳＤＮ八画へ、ＲＮＡ１分、ざらに続いてＦＢおよび
Ｃ３ＣＩが流出した。ＯＮ＾画分に相当する最初のピー
クを集めてＴＥに透析してほぼ純粋なプラスミドＤＮＡ
を得た。
４８カラム（０，８ｘ２０α）に、得られたＣＣＤＮＡ
画分（０，８ｄ）をそのまま加え、ＴＥＮで自然流出法
によりグル濾過を行った。波長２５４ｎｍにおける吸光
度でモニターして約５ａｌ！のｖｏｉｄ ｖｏｌｕｍｅ
ＳＤＮ八画へ、ＲＮＡ１分、ざらに続いてＦＢおよび
Ｃ３ＣＩが流出した。ＯＮ＾画分に相当する最初のピー
クを集めてＴＥに透析してほぼ純粋なプラスミドＤＮＡ
を得た。
プラスミドＩ）ＨＧＨＣ−１ｌ６１Ｕｇを得た。
［合成ＨＧＨ遺伝子の調整」
ｐＧＨｃ−１５０，ｃｚｇ ヲ２０ＩＩＨＴｒｉｓ
Ｈｃｌ（ｐＨ７，５）−１０ａＨβ−ＥｔＳｌｌ−１７
５ｍＨＮａＣＮａＣ１−１ＯＨｇＣｊ！２中Ｂｇ、９
ｌｌ３７．５Ｕ。
Ｈｃｌ（ｐＨ７，５）−１０ａＨβ−ＥｔＳｌｌ−１７
５ｍＨＮａＣＮａＣ１−１ＯＨｇＣｊ！２中Ｂｇ、９
ｌｌ３７．５Ｕ。
Ｓａｔ ｌ７５Ｕを加え、３７℃１１時間インキュベー
トし反応停止、フェノール処理後、ＤＮＡをエタノール
沈でんさせ、５％ ポリアクリルアミド電気泳動に付し
た。ゲルから、抽出を行いＩＩＧＩＩ Ｃ部分遺伝子１
．５μｒｇを得た。ＩＩＧＩＩ Ａ Ｂ部分遺伝子４μ
ｇ、Ｃ部分遺伝子１．３ｔｌＱ １．ニーＤＮＡリガー
Ｕ３．６１１ （ベーリンガー・マンハイム）を加え
て、２０℃２０時間結合反応を行わせた。反応停止後、
ＣＩ！ａ１１６Ｕを加え、３７℃８゜５時間インキュベ
ートし、更にＮａＣｊ！ ２００５Ｍ。
トし反応停止、フェノール処理後、ＤＮＡをエタノール
沈でんさせ、５％ ポリアクリルアミド電気泳動に付し
た。ゲルから、抽出を行いＩＩＧＩＩ Ｃ部分遺伝子１
．５μｒｇを得た。ＩＩＧＩＩ Ａ Ｂ部分遺伝子４μ
ｇ、Ｃ部分遺伝子１．３ｔｌＱ １．ニーＤＮＡリガー
Ｕ３．６１１ （ベーリンガー・マンハイム）を加え
て、２０℃２０時間結合反応を行わせた。反応停止後、
ＣＩ！ａ１１６Ｕを加え、３７℃８゜５時間インキュベ
ートし、更にＮａＣｊ！ ２００５Ｍ。
β−ＥｔＳＨ１０ｇ＋Ｈになるように加えた後、Ｓａｌ
ｌ５０ｔｌを加え、３７℃１４．５時間インキュベー
トした。反応停止後、フェノール処理し、エタノール沈
でんを行った。
ｌ５０ｔｌを加え、３７℃１４．５時間インキュベー
トした。反応停止後、フェノール処理し、エタノール沈
でんを行った。
合成ＨＧＩＩ ３１ｆ伝子ＤＮＡ約１μｇを得た。、こ
のＤＮＡについてマクサム・１＝ルバート法によりシー
ケンシングを行い、これが前述した塩基配列からなるも
のであることを確認した。
のＤＮＡについてマクサム・１＝ルバート法によりシー
ケンシングを行い、これが前述した塩基配列からなるも
のであることを確認した。
ｐ８Ｒ３２２プラスミド１μ９にＥｃｏＲＩとＴｒｉｓ
−ＨＣＪ ＨｇＣｊ！２．７１８ β−メルカプトＸ
タ／ −／Ｌ／ カらなるＱＨ７，４の緩衝液２１μ
ｍおよび水を加えて総４ｔ３０μオとし、３１℃、９０
分同友応させた。反応液をフェノール抽出し、水相にエ
タノールを加えてＥｃｏＲＩ切断片を沈澱させて回収し
、水１０μｌに再溶解した。
−ＨＣＪ ＨｇＣｊ！２．７１８ β−メルカプトＸ
タ／ −／Ｌ／ カらなるＱＨ７，４の緩衝液２１μ
ｍおよび水を加えて総４ｔ３０μオとし、３１℃、９０
分同友応させた。反応液をフェノール抽出し、水相にエ
タノールを加えてＥｃｏＲＩ切断片を沈澱させて回収し
、水１０μｌに再溶解した。
一方ｐｔｒｐ ＥＤ５−１プラスミド５ｕＱ Ｇ−ｌｌ
ｉｎｆＩ １００緩衡液（ｐＨ７，５） ４５μＡおよ
び水を加えて総社５０μオとし、３７℃、１２０分間反
応させた。フェノール抽出およびエタノール沈澱により
ＯＮ八へラグメントを回収し、２０μｍ水に再溶解した
。
ｉｎｆＩ １００緩衡液（ｐＨ７，５） ４５μＡおよ
び水を加えて総社５０μオとし、３７℃、１２０分間反
応させた。フェノール抽出およびエタノール沈澱により
ＯＮ八へラグメントを回収し、２０μｍ水に再溶解した
。
このｌｌｉｎｆＩ断片を含む水溶液１０μオにＴ４ＤＨ
Ａボリメ−ｙ−セ０．２Ｕ 、各５ｉＨ（７） ｄＡＴ
Ｐ、 ｄＧＴＰ、 ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ各２．５μ
Ａ１を含むｐＨ８，７の緩衝液２５μオならびに水を加
えて総量を７５μオとし３１℃で３０分間反応を行った
。反応液のフェノール抽出およびエタノール沈澱を行い
得られた沈澱を乾燥させ、１０ｓ）ｌ Ｔｒｉｓ １
１ｃｉｌ！ −１ｍＨＥＤＴＡ （ＴＥ）を含む１）Ｈ
８，Ｏの緩衝液１０μオに溶解した。この溶液５μｍを
５゜ ＧＧＡＡＴＴＣＣ Ｅｃｏｌｌ ニリンカー ＣＣＴＴＡＡＧＧ” ’５０
ｐ １０ｊ、ポリヌクレオチドキナーゼ１ｕを含む緩
衝液５μＡ中３７℃９０分反応さぼた。得られた溶液１
μｍと緩衝液１３μｍ、丁４◎ＮＡリガーゼ１Ｕを加え
て２０℃で１５時間反応させた。反応液をフェノール抽
出し、エタノール沈澱させて生成物を回収し、これをＴ
Ｅ−緩衝液１０μｍに溶解した。この溶液に ＥｃｏＲＩ４１７緩衡液３６．ｃｚＪヲ加エテ３７℃テ
３Ｆｔｆ間反応させた。反応液をフェノール抽出したの
ちエタノール沈でんを行い、乾燥させ、緩衝液１０μオ
に溶解した。こうして得たｔｒｐプロモーター・オペレ
ータを含むＯＮ八へラグメントの溶液１０μＡとｐＢＲ
３２２をＥｃｏＲｌ：で切断したフラグメント１０μＡ
丁４ＯＮＡリガーゼ１ｕを加え２０℃１５時間反応させ
、こうして得たｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位にｐｔｒ
ｐ ＥＤ５−１由来のｔｒｐプロモーター・オペレータ
を含むシーケンスヲ挿入シタ環状［ＩＮＡ １／ｌ
１．： ＥＣＯＲＩ １０を加えて総Ｎ）３０μぶと
し、３１℃で６００分間反応せてこのＤＮＡを部分消化
し、フェノール処理を行って反応を停止ざ「た。エタノ
ール沈Ｃん後、丁［１０μｍにとかし、各５１１１８
ｄ＾ＴＰおよびｄＴＴＰを含む溶液２．５１ 、 Ｔ
４ＯＮＡボリメラー１２０．２Ｕ Ｊ３よび緩衝液２５
μＡを加え、３１℃３０分間反応させ、フェノール抽出
、エタノール沈澱を行い、沈澱を５０ｍＨＴｒｉｓ
ＨＣｊ！、１０１１Ｍ ）４（ｌｃ４，０．５１
１８ ＡＴＰ、１０ｆｌＨβ−ＥｔＳＩｌ（ｐＨ７，
４）緩衝液５０μｍに溶解した。これにＤＮＡリガーゼ
１ｕを加え、２０℃１５時間反応した。
Ａボリメ−ｙ−セ０．２Ｕ 、各５ｉＨ（７） ｄＡＴ
Ｐ、 ｄＧＴＰ、 ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ各２．５μ
Ａ１を含むｐＨ８，７の緩衝液２５μオならびに水を加
えて総量を７５μオとし３１℃で３０分間反応を行った
。反応液のフェノール抽出およびエタノール沈澱を行い
得られた沈澱を乾燥させ、１０ｓ）ｌ Ｔｒｉｓ １
１ｃｉｌ！ −１ｍＨＥＤＴＡ （ＴＥ）を含む１）Ｈ
８，Ｏの緩衝液１０μオに溶解した。この溶液５μｍを
５゜ ＧＧＡＡＴＴＣＣ Ｅｃｏｌｌ ニリンカー ＣＣＴＴＡＡＧＧ” ’５０
ｐ １０ｊ、ポリヌクレオチドキナーゼ１ｕを含む緩
衝液５μＡ中３７℃９０分反応さぼた。得られた溶液１
μｍと緩衝液１３μｍ、丁４◎ＮＡリガーゼ１Ｕを加え
て２０℃で１５時間反応させた。反応液をフェノール抽
出し、エタノール沈澱させて生成物を回収し、これをＴ
Ｅ−緩衝液１０μｍに溶解した。この溶液に ＥｃｏＲＩ４１７緩衡液３６．ｃｚＪヲ加エテ３７℃テ
３Ｆｔｆ間反応させた。反応液をフェノール抽出したの
ちエタノール沈でんを行い、乾燥させ、緩衝液１０μオ
に溶解した。こうして得たｔｒｐプロモーター・オペレ
ータを含むＯＮ八へラグメントの溶液１０μＡとｐＢＲ
３２２をＥｃｏＲｌ：で切断したフラグメント１０μＡ
丁４ＯＮＡリガーゼ１ｕを加え２０℃１５時間反応させ
、こうして得たｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位にｐｔｒ
ｐ ＥＤ５−１由来のｔｒｐプロモーター・オペレータ
を含むシーケンスヲ挿入シタ環状［ＩＮＡ １／ｌ
１．： ＥＣＯＲＩ １０を加えて総Ｎ）３０μぶと
し、３１℃で６００分間反応せてこのＤＮＡを部分消化
し、フェノール処理を行って反応を停止ざ「た。エタノ
ール沈Ｃん後、丁［１０μｍにとかし、各５１１１８
ｄ＾ＴＰおよびｄＴＴＰを含む溶液２．５１ 、 Ｔ
４ＯＮＡボリメラー１２０．２Ｕ Ｊ３よび緩衝液２５
μＡを加え、３１℃３０分間反応させ、フェノール抽出
、エタノール沈澱を行い、沈澱を５０ｍＨＴｒｉｓ
ＨＣｊ！、１０１１Ｍ ）４（ｌｃ４，０．５１
１８ ＡＴＰ、１０ｆｌＨβ−ＥｔＳＩｌ（ｐＨ７，
４）緩衝液５０μｍに溶解した。これにＤＮＡリガーゼ
１ｕを加え、２０℃１５時間反応した。
フェノール処理後、エタノール沈でんを行い、乾燥した
後、緩衝液３０μＡに溶解、これにＢａ１Ｉｆ １１ｕ
を加え３７℃２時間反応させた。
後、緩衝液３０μＡに溶解、これにＢａ１Ｉｆ １１ｕ
を加え３７℃２時間反応させた。
フェノール抽出、エタノール沈澱を行ったのち沈澱を１
０μ７緩衡液にとかし、ｐｔｒｐ ＥＤ５−１の旧ｔ＋
４Ｉフラグメントの場合と同様にして、ｄＮ丁Ｐで付着
末端を満したのち、あらかじめ１０ ｐ ＩＲＯＩのＦ
ｃｏＲ１１ノ ンカー ”ＧＧＡ八ＴへＣＣＣＣ
ＴＴＡＡＧＧ５° の５°末端をリン酸化して加えロＨ
Ａリガーゼ１ｕ２０℃１５時間反応させてＥｃｏＲニリ
ンカーを付加した。更にこれをＥｃｏＲ工で４０，３１
℃２時間で消化した。
０μ７緩衡液にとかし、ｐｔｒｐ ＥＤ５−１の旧ｔ＋
４Ｉフラグメントの場合と同様にして、ｄＮ丁Ｐで付着
末端を満したのち、あらかじめ１０ ｐ ＩＲＯＩのＦ
ｃｏＲ１１ノ ンカー ”ＧＧＡ八ＴへＣＣＣＣ
ＴＴＡＡＧＧ５° の５°末端をリン酸化して加えロＨ
Ａリガーゼ１ｕ２０℃１５時間反応させてＥｃｏＲニリ
ンカーを付加した。更にこれをＥｃｏＲ工で４０，３１
℃２時間で消化した。
こうして得たＥｃｏＲＩテールを両端に持つ二重鎖ＤＮ
Ａ １ａｇに緩衝液５０μＡ Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
１υを加えて総６に５１μぶとし２０℃で反応させプラ
スミドＰＯＣＴ２−９を生成させた。
Ａ １ａｇに緩衝液５０μＡ Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
１υを加えて総６に５１μぶとし２０℃で反応させプラ
スミドＰＯＣＴ２−９を生成させた。
この反応液でｐＨＧＨｃ−１のばあと同様にして、［１
コリに１２／Ｋｍ７２３を形質転換、抽出精製を行い、
プラスミドｐＯｃＴ２−９を大量に得た。
コリに１２／Ｋｍ７２３を形質転換、抽出精製を行い、
プラスミドｐＯｃＴ２−９を大量に得た。
こうして得たｐＯｃＴ２−９プラスミド３０μΩをｐＢ
Ｒ３２２の場合と同様にしてｔ’Ｃｏｎ Ｉで消化し、
フェノール抽出、エタノールによる沈澱を行い、得られ
た沈澱を乾燥させた緩衝液６Ｇμｌに溶解し、そのうち
、６μｊ （３μｇ）を２０ｍＨＴｒｉｓ−ｆｌ（Ｊ（
ｐＨ８，１）６００ｓＨＨａ（Ｊ、１２ｍＨＨａＣ１２
二１２ｍＨＣａＣ４，１ａ＋ＨＥｏＴＡ中Ｂａｔ ３１
４１を加えて３０℃で５分間反応させたのら、フェノー
ル抽出を行って反応を停止させ、エタノール沈澱させ、
２１μｌの緩衝液に再溶解させた。
Ｒ３２２の場合と同様にしてｔ’Ｃｏｎ Ｉで消化し、
フェノール抽出、エタノールによる沈澱を行い、得られ
た沈澱を乾燥させた緩衝液６Ｇμｌに溶解し、そのうち
、６μｊ （３μｇ）を２０ｍＨＴｒｉｓ−ｆｌ（Ｊ（
ｐＨ８，１）６００ｓＨＨａ（Ｊ、１２ｍＨＨａＣ１２
二１２ｍＨＣａＣ４，１ａ＋ＨＥｏＴＡ中Ｂａｔ ３１
４１を加えて３０℃で５分間反応させたのら、フェノー
ル抽出を行って反応を停止させ、エタノール沈澱させ、
２１μｌの緩衝液に再溶解させた。
この溶液のうち、７μＡ （１ａｇ）に５°ＡＡＴＣＧ
ＡＴＴ Ｃ１ａ ニリンカー ＴＴＡＧＣＴＡＡ５°１２．．５
ｐ ｍｏｌ、Ｔ４ＤＮＡＩｌｊ−セ１０ 、緩衛液４
μフヲ加、１２０℃１５時間で反応させた。
ＡＴＴ Ｃ１ａ ニリンカー ＴＴＡＧＣＴＡＡ５°１２．．５
ｐ ｍｏｌ、Ｔ４ＤＮＡＩｌｊ−セ１０ 、緩衛液４
μフヲ加、１２０℃１５時間で反応させた。
フェノール抽出、エタノール沈澱後、０．２μＯのＤＮ
Ａ反応混合液を用いて［、コリ にｍ７２３を形質転換
した。得られた各形質転換株中のプラスミドＤＮＡを（
Ｊａ Ｉ １０，３７℃９０時間、ｎＮａ５ｅ Ａ
０．２μ（７３７℃３０時間反応を行い、更にＴａｑ
工１．６Ｕを加え、６５℃−後反応させた。フェノール
処理後５ｘポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、Ｔ
ａｑ ニーＣ１ａＩフラグメントが〜１４１ ｂｐ付近
のものを選んだ。
Ａ反応混合液を用いて［、コリ にｍ７２３を形質転換
した。得られた各形質転換株中のプラスミドＤＮＡを（
Ｊａ Ｉ １０，３７℃９０時間、ｎＮａ５ｅ Ａ
０．２μ（７３７℃３０時間反応を行い、更にＴａｑ
工１．６Ｕを加え、６５℃−後反応させた。フェノール
処理後５ｘポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、Ｔ
ａｑ ニーＣ１ａＩフラグメントが〜１４１ ｂｐ付近
のものを選んだ。
選んだプラスミドを含む形質転換株８個について、ｐＯ
ｃＴ２−９の場合と同様に増幅ならびにプラスミドＤＮ
Ａの精製分離を行い、各々１００〜２５０μｇのプラス
ミドを得た。これらＤＮＡについて、マキサム・ギルバ
ート法により、塩基配列を調べ、ｔｒｐ Ｅ。
ｃＴ２−９の場合と同様に増幅ならびにプラスミドＤＮ
Ａの精製分離を行い、各々１００〜２５０μｇのプラス
ミドを得た。これらＤＮＡについて、マキサム・ギルバ
ート法により、塩基配列を調べ、ｔｒｐ Ｅ。
のＳ、 Ｄ、配列の直後にｃｃａ １リンカ−の挿入さ
れているプラスミドＤＮＡをｐＣＴｌと名付けた。
れているプラスミドＤＮＡをｐＣＴｌと名付けた。
このプラスミドはｐＢＩ１３２２の［’ｃｏＲＩ切断部
位（平滑化されたＦＣＯＲエサイトが消えている）から
時計層りに（ＩＩＩ）式の■と■の間の配列を介して大
腸菌トリプトファン プロモーター オペレーターに引
続＜ ＴｒｐＥ″ｉＩＩ伝子の一部が挿入され、またｐ
ＢＲ３２２の上記ＥｃｏＲ工切断部位から時計層りに８
８−旧サイトまでの全シーケンスとＲａｍ Ｈｌサイト
より下流に約１５ｂｐの欠失とＣ１ａ エサイトの付加
により、ｔｒｐｔ遺伝子と接続されて環状となっている
約４．３Ｋｂ、 Ｅｌ、のプラスミドである。
位（平滑化されたＦＣＯＲエサイトが消えている）から
時計層りに（ＩＩＩ）式の■と■の間の配列を介して大
腸菌トリプトファン プロモーター オペレーターに引
続＜ ＴｒｐＥ″ｉＩＩ伝子の一部が挿入され、またｐ
ＢＲ３２２の上記ＥｃｏＲ工切断部位から時計層りに８
８−旧サイトまでの全シーケンスとＲａｍ Ｈｌサイト
より下流に約１５ｂｐの欠失とＣ１ａ エサイトの付加
により、ｔｒｐｔ遺伝子と接続されて環状となっている
約４．３Ｋｂ、 Ｅｌ、のプラスミドである。
得られたプラスミドｐＣＴ１の（Ｊａ ｌ−８ａｌ Ｉ
７ラグメント１μ０、合成ＨＧ１１遺伝子０．３μｇ１
丁４ＤＮＡ ！Ｊ７ｊ−ｔ’ ０．６Ｕ （宝酒造）
を用い、６６ｍＮＴｒｉｓ ｌＩＣ１（ｐＨ７，６
） −６，６ｅＨＨｇＣ１，、−０，５ｍ１４ Ａ
ＴＰ 。
７ラグメント１μ０、合成ＨＧ１１遺伝子０．３μｇ１
丁４ＤＮＡ ！Ｊ７ｊ−ｔ’ ０．６Ｕ （宝酒造）
を用い、６６ｍＮＴｒｉｓ ｌＩＣ１（ｐＨ７，６
） −６，６ｅＨＨｇＣ１，、−０，５ｍ１４ Ａ
ＴＰ 。
１Ｇ１８β−ＥｔＳＨ中２０中２０カ２２反応を停止さ
せ、フェノール処理、エタノール沈でん後、ｐＣＴｌの
クローニゲの場合と同様にして大腸菌ＨＢ １０１に形
質転換およびクローニングを行った。
せ、フェノール処理、エタノール沈でん後、ｐＣＴｌの
クローニゲの場合と同様にして大腸菌ＨＢ １０１に形
質転換およびクローニングを行った。
更に同プラスミドの場合と同様にしてＨＧＩＩ ｇｅｎ
ｅを含むプラスミドを有９る形質転換株について、増幅
およびプラスミドの精製分離を行い、プラスミドｐＨＧ
１１１１３２μｇを得た。
ｅを含むプラスミドを有９る形質転換株について、増幅
およびプラスミドの精製分離を行い、プラスミドｐＨＧ
１１１１３２μｇを得た。
このプラスミドはｐＣＴ１プラスミドのＣ１ａエナイト
から時計廻りにＳａｌ エサイトまでの配列の代りに合
成１１ＧＩＩ ｇｅｎｅが時計廻り方向に挿入された約
４．６４にす、 Ｄ、のプラスミドである。
から時計廻りにＳａｌ エサイトまでの配列の代りに合
成１１ＧＩＩ ｇｅｎｅが時計廻り方向に挿入された約
４．６４にす、 Ｄ、のプラスミドである。
こうして得たｐＨＧＩ＋−１プラスミド２０μｇ Ｈｐ
ａ 、Ｉ １２１Ｊ３７℃５時間、（Ｊａ Ｔ２Ｏ１
，３７℃１５時間泊化、フェノール処理後エタノール沈
澱し、 得られた１ｌｐａニーＣ１ａ−■所片のうち１
．５μｇ１さぎに調製した（２）式で現わされるＤＮＡ
フラグメント〜１ｐｍｏｌ、Ｔ４ＤＮ八リガーゼ０．６
０２０℃、２２時間反応させ、フェノール処理、反応停
止後、この反応液でｐｌｌＧＩＩｃ−１の場合と同様に
してＥ、コリＨＢ１０１に形質転換し、同様にクローニ
ゲを行い、形質転換株［１、コリ／ｐＧ１１−Ｌ９を得
た。１ｌＯｃＴ２−９の場合と同様にして得られた［９
コリ／ＤＧＨ−Ｌ９を培養し、ｐＧｌｌ−［９の増幅、
精製、分離を行い、Ｉ）ＧＨ−１９２５μｇを得た。得
られたｐＧＨ−１９についてマクサム・ギルバート法に
よるシーケンシングを行い、このプラスミドがｐＢＲ３
２２プラスミドのＥｃｏ ＲＩ ｍ １ｆＦＪ部位中心
のＡ［（÷）鎖相補（−）鎖については月から反時計方
向へ向ってＳａｔ Ｉ開裂部位のＴ［（＋）鎖、鎖相補
（−）鎖についではＧまで］の３７１２に塩基鎖［（＋
）鎖、鎖相補（−）鎖については３７０８塩基鎮］に相
当するシーケンスから時ｔ１廻りに（ＩＶ）式のシーケ
ンスおよび（２）式で表わされるシーケンスが続ぎざら
にこれに引続き前述したヒト成長ホルモンをコードする
遺伝子［（■）式］が、同様に時計廻りに続き、その末
端が、上記ｐ８Ｒ３２２のＳａｔ工開裂部位と結合して
いる４、５にす、ｐ、のプラスミドであることを確認し
た。
ａ 、Ｉ １２１Ｊ３７℃５時間、（Ｊａ Ｔ２Ｏ１
，３７℃１５時間泊化、フェノール処理後エタノール沈
澱し、 得られた１ｌｐａニーＣ１ａ−■所片のうち１
．５μｇ１さぎに調製した（２）式で現わされるＤＮＡ
フラグメント〜１ｐｍｏｌ、Ｔ４ＤＮ八リガーゼ０．６
０２０℃、２２時間反応させ、フェノール処理、反応停
止後、この反応液でｐｌｌＧＩＩｃ−１の場合と同様に
してＥ、コリＨＢ１０１に形質転換し、同様にクローニ
ゲを行い、形質転換株［１、コリ／ｐＧ１１−Ｌ９を得
た。１ｌＯｃＴ２−９の場合と同様にして得られた［９
コリ／ＤＧＨ−Ｌ９を培養し、ｐＧｌｌ−［９の増幅、
精製、分離を行い、Ｉ）ＧＨ−１９２５μｇを得た。得
られたｐＧＨ−１９についてマクサム・ギルバート法に
よるシーケンシングを行い、このプラスミドがｐＢＲ３
２２プラスミドのＥｃｏ ＲＩ ｍ １ｆＦＪ部位中心
のＡ［（÷）鎖相補（−）鎖については月から反時計方
向へ向ってＳａｔ Ｉ開裂部位のＴ［（＋）鎖、鎖相補
（−）鎖についではＧまで］の３７１２に塩基鎖［（＋
）鎖、鎖相補（−）鎖については３７０８塩基鎮］に相
当するシーケンスから時ｔ１廻りに（ＩＶ）式のシーケ
ンスおよび（２）式で表わされるシーケンスが続ぎざら
にこれに引続き前述したヒト成長ホルモンをコードする
遺伝子［（■）式］が、同様に時計廻りに続き、その末
端が、上記ｐ８Ｒ３２２のＳａｔ工開裂部位と結合して
いる４、５にす、ｐ、のプラスミドであることを確認し
た。
［発明の効果］
本発明のβ−ＮＧＦ３ｉ伝子セグメントは大腸菌中で極
めて発現され易く、しかも合成的に容易に調製すること
ができる。また第二発明の方法によれば、このセグメン
トを効率よく製造できる。
めて発現され易く、しかも合成的に容易に調製すること
ができる。また第二発明の方法によれば、このセグメン
トを効率よく製造できる。
本発明の組換プラスミドはこのβ−ＮＧＦ３！伝子セグ
メントを効率よく増幅し、かつ適当な発現系を導入する
ことによって、これによって形質転換された撤物にβ−
ＮＧＦ蛋白質を直接又は融合蛋白質の形での産性能を与
えることができる。
メントを効率よく増幅し、かつ適当な発現系を導入する
ことによって、これによって形質転換された撤物にβ−
ＮＧＦ蛋白質を直接又は融合蛋白質の形での産性能を与
えることができる。
本発明の組換プラスミド（発現型）で形質転換された大
腸菌等の微生物はこれらの形のβ−ＮＧＦ蛋白質を効率
よく産生りることができる。またこの微生物を用いる本
発明のβ−ＮＧＦ蛋白質の製造方法はこの蛋白質を効率
よく製造することができる。更にまた本発明のβ−ＮＧ
Ｆ融合蛋白質は容易に天然形のβ−ＮＧＦに導くことが
できる。
腸菌等の微生物はこれらの形のβ−ＮＧＦ蛋白質を効率
よく産生りることができる。またこの微生物を用いる本
発明のβ−ＮＧＦ蛋白質の製造方法はこの蛋白質を効率
よく製造することができる。更にまた本発明のβ−ＮＧ
Ｆ融合蛋白質は容易に天然形のβ−ＮＧＦに導くことが
できる。
第１図ないし第３図は本発明のβ−ＮＧＦ遺伝子セグメ
ントの調製を説明Ｊる図であり、第４図は本発明の組換
えプラスミドの調製を説明する図であり、第５図は本発
明の方法でえられるβ−ＮＧＦのアクリルアミド電気泳
動パターンを説明する図であり、第６図ないし第１１図
は本発明で原料として用いたプラスミドの調製を説明す
る図である。
ントの調製を説明Ｊる図であり、第４図は本発明の組換
えプラスミドの調製を説明する図であり、第５図は本発
明の方法でえられるβ−ＮＧＦのアクリルアミド電気泳
動パターンを説明する図であり、第６図ないし第１１図
は本発明で原料として用いたプラスミドの調製を説明す
る図である。
Claims (32)
- （１）式 【ＤＮＡ配列があります】 で表わされるＤＮＡ配列からなる、ヒト神経成長因子遺
伝子セグメント。 - （２）ヒト神経成長因子遺伝子の上流側末端に、更に式 【ＤＮＡ配列があります】 又は 【ＤＮＡ配列があります】 （式中ＸはＮ末端よりＩｌｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ
で表わされるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を、
Ｘ′はその相補配列を示す）で表わされるＤＮＡ配列を
、またその下流側末端に停止コドンを含み、制限酵素開
裂末端で終る、式 【ＤＮＡ配列があります】 （式中Ｙは最初の停止コドンの第二の塩基から制限酵素
開裂末端の３′末端までを表わし、Ｙ′はＹの相補配列
で、制限酵素開裂末端の５′末端までを表わす）で表わ
されるＤＮＡ配列を有する特許請求の範囲第１項記載の
ヒト神経成長因子遺伝子セグメント。 - （３）上流側に付加されるＤＮＡ配列のＸ及びＸ′が、
式 【ＤＮＡ配列があります】 で表わされる配列である特許請求の範囲第２項記載のヒ
ト神経成長因子遺伝子セグメント。 - （４）下流側に付加されるＤＮＡ配列のＹ及びＹ′が、
式 【ＤＮＡ配列があります】 で表わされる配列である特許請求の範囲第２項又は第３
項のいずれかの項記載のヒト神経成長因子遺伝子セグメ
ント。 - （５）式 ＾５＾′ＣＧＡＴＡＴＧＴＣＣＴＣＣ＾３＾′及び＾５
＾′ＧＴＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＣＡＴＡＴ＾３＾′又は ＾５＾′ＧＡＴＣＴＴＣＸＴＣＣＴＣＣ＾３＾′及び＾
５＾′ＧＴＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＸＧＡＡ＾３＾′なら
びに 【ＤＮＡ配列があります】 及び ＾５＾′Ｙ′ＡＡＣ＾３＾′ で表わされるオリゴヌクレオチド（式中ＸはＮ末端より
Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｒｇで表わされるアミノ酸
配列をコードするＤＮＡ配列を、Ｘ′はその相補配列を
示し、Ｙは最初の停止コドンの第二の塩基から制限酵素
開裂末端の３′末端までを、Ｙ′はＹの相補配列で同じ
制限酵素開裂末端の５′末端までを示す）の相互に相補
性のある組合せを選び、各組合せ毎に両者を水素結合さ
せて二本鎖オリゴヌクレオチドとしたとき、相互に完全
に接着し得る複数個の組合せのオリゴヌクレオチドの群
をリガーゼの存在下で結合させて４個以上の二本鎖ＤＭ
Ａ断片を調製し、これを更にリガーゼの存在で結合させ
ることを特徴とする、式【ＤＮＡ配列があります】 で表わされる配列を含むヒト神経成長因子遺伝子セグメ
ントの製造方法。 - （６）オリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列中のＸ及びＸ′
で表わされるＤＮＡ配列が、式 【ＤＮＡ配列があります】 で表される配列であり、Ｙ及びＹ′で表わされるＤＮＡ
配列が、式 【ＤＮＡ配列があります】 で表わされる配列である特許請求の範囲第５項記載の製
造方法。 - （７）式 【ＤＮＡ配列があります】 で表わされる配列のヒト神経成長因子遺伝子セグメント
を含み、微生物中で自己増殖可能な組換プラスミド。 - （８）ヒト神経成長因子遺伝子の上流にこの遺伝子を発
現可能に支配するプロモーター・オペレーター系を含み
、このプロモーター・オペレーター系の上流とヒト神経
成長因子遺伝子の下流との間に組換えプラスミドを自己
増殖可能とする部分および薬剤耐性をコードする部分を
含む、特許請求の範囲第７項記載の組換えプラスミド。 - （９）プロモーター・オペレーター系が、そのアッテネ
ーター部分を欠く細菌のトリプトファンプロモーター・
オペレーター系である特許請求の範囲第８項記載の組換
プラスミド。 - （１０）ヒト神経成長因子遺伝子の上流側末端に、更に
式 【ＤＮＡ配列があります】 又は 【ＤＮＡ配列があります】 （式中ＸはＮ末端よりＩｌｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ
で表わされるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を、
Ｘ′はその相補配列を示す）で表わされるＤＮＡ配列を
、またその下流側末端に停止コドンを含み、制限酵素開
裂末端で終る、式 【ＤＮＡ配列があります】 （式中Ｙは最初の停止コドンの第二の塩基から制限酵素
開裂末端の３′末端までを表わし、Ｙ′はＹの相補配列
で、制限酵素開裂末端の５′末端までを表わす）で表わ
されるＤＮＡ配列を有するヒト神経成長因子遺伝子セグ
メントを含むものである特許請求の範囲第７項ないし第
９項のいずれかの項記載の組換プラスミド。 - （１１）上流側に付加されるＤＮＡ配列のＸ及びＸ′が
、式 【ＤＮＡ配列があります】 で表わされる配列であるヒト神経成長因子遺伝子セグメ
ントを含むものである特許請求の範囲第１０項記載の組
換プラスミド。 - （１２）下流側に付加されるＤＮＡ配列のＹ及びＹ′が
、式 【ＤＮＡ配列があります】 で表わされる配列であるヒト神経成長因子遺伝子セグメ
ントを含むものである特許請求の範囲第１０項又は第１
１項記載の組換プラスミド。 - （１３）プロモーター・オペレーター系のメッセンジャ
ーＲＮＡ転写開始点よりヒト神経成長因子遺伝子までの
ＤＮＡ配列が、式 【ＤＮＡ配列があります】 で表される配列である特許請求の範囲第８項ないし第１
２項のいずれかの項記載の組換プラスミド。 - （１４）プロモーター・オペレーター系のメッセンジャ
ーＲＮＡ転写開始点よりヒト神経成長因子遺伝子までの
ＤＮＡ配列が、式 【ＤＮＡ配列があります】 （Ｘ及びＸ′は前記同様の意味を表わす）で表される配
列である特許請求の範囲第８項ないし第１２項のいずれ
かの項記載の組換プラスミド。 - （１５）式 【ＤＮＡ配列があります】 で表わされる配列のヒト神経成長因子遺伝子を含み、微
生物中で自己増殖可能な組換えプラスミドを細胞中に保
有するエシェリシャ属に属する微生物。 - （１６）組換プラスミドのヒト神経成長因子遺伝子の上
流にこの遺伝子を発現可能に支配するプロモーター・オ
ペレーター系を含み、このプロモーター・オペレーター
系の上流とヒト神経成長因子遺伝子の下流との間に組換
えプラスミドを自己増殖可能とする部分および薬剤耐性
をコードする部分を含む特許請求の範囲第１５項記載の
微生物。 - （１７）組換プラスミドのプロモーター・オペレーター
系が、そのアッテネーター部分を欠く細菌のトリプトフ
ァン プロモーター・オペレーター系である特許請求の
範囲第１６項記載の微生物。 - （１８）組換えプラスミドのヒト神経成長因子遺伝子の
上流側末端に、式 【ＤＮＡ配列があります】 又は 【ＤＮＡ配列があります】 （式中ＸはＮ末端よりＩｌｅ Ｇｌｕ Ｇｌｖ Ａｒｇ
で表わされるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を、
Ｘ′はその相補配列を示す）で表わされるＤＮＡ配列を
、またその下流側末端に停止コドンを含み、制限酵素開
裂末端で終る、式 【ＤＮＡ配列があります】 （式中Ｙは最初の停止コドンの第二の塩基から制限酵素
開裂末端の３′末端までを表わし、Ｙ′はＹの相補配列
で、制限酵素開裂末端の５′末端までを表わす）で表わ
されるＤＮＡ配列を保有するものである特許請求の範囲
第１５項ないし第１７項記載の微生物。 - （１９）上流側に付加されるＤＮＡ配列のＸ及びＸ′が
、式 【ＤＮＡ配列があります】 で表わされる配列であるヒト神経成長因子遺伝子セグメ
ントを含む組換えプラスミドを保有する特許請求の範囲
第１８項記載の微生物。 - （２０）下流側に付加されるＤＮＡ配列のＹ及びＹ′が
、式 【ＤＮＡ配列があります】 で表わされる配列であるヒト神経成長因子遺伝子セグメ
ントを含む組換えプラスミドを保有する特許請求の範囲
第１８項又は第１９項記載の微生物。 - （２１）プロモーター・オペレーター系のメッセンジャ
ーＲＮＡ転写開始点よりヒト神経成長因子遺伝子までの
ＤＮＡ配列が、式 【ＤＮＡ配列があります】 で表される配列である組換プラスミドを保有する特許請
求の範囲第１６項ないし第２０項のいずれかの項記載の
微生物。 - （２２）プロモーター・オペレーター系のメッセンジャ
ーＲＮＡ転写開始点よりヒト神経成長因子遺伝子までの
ＤＮＡ配列が、式 【ＤＮＡ配列があります】 （Ｘ及びＸ′は前記同様の意味を表わす）で表される配
列である組換プラスミドを保有する特許請求の範囲第１
６項ないし第２０項のいずれかの項記載の微生物。 - （２３）式 【ＤＮＡ配列があります】 で表わされるＤＮＡ配列のヒト神経成長因子遺伝子を含
み、微生物中で自己増殖可能でかつヒト神経成長因子を
発現することのできる組換プラスミドを細胞中に保有す
る、エシェリシャ属に属する微生物を栄養培地に培養し
て、ヒト神経成長因子蛋白質を蓄積させてこれを採取し
、必要に応じて血液凝固因子Ｘａで消化することを特徴
とするヒト神経成長因子の製造方法。 - （２４）ヒト神経成長因子蛋白質を直接発現させる特許
請求の範囲第２３項記載の製造方法。 - （２５）ヒト成長ホルモンのＮ末端側の一部と血液凝固
因子Ｘａの認識部位を有するオリゴペプチド連鎖を介し
て融合された蛋白質の形の遺伝子産物を得、これを血液
凝固因子Ｘａで消化する、特許請求の範囲第２３項記載
の製造方法。 - （２６）ヒト神経成長因子遺伝子の上流に、アッテネー
ター部分を欠く細菌のトリプトファン プロモーター・
オペレーター系を含み、このプロモーター・オペレータ
ー系の上流とヒト神経成長因子遺伝子の下流との間に薬
剤耐性をコードする部分を含むプラスミドを細胞内に保
有する微生物を用いる特許請求の範囲第２３項ないし第
２５項のいずれかの項記載の製造方法。 - （２７）組換えプラスミドのヒト神経成長因子遺伝子の
上流側末端に、更に式 【ＤＮＡ配列があります】 又は 【ＤＮＡ配列があります】 （式中ＸはＮ末端よりＩｌｅ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ
で表わされるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を、
Ｘ′はその相補配列を示す）で表わされるＤＮＡ配列を
、またその下流側末端に停止コドンを含み、制限酵素開
裂末端で終る、式 【ＤＮＡ配列があります】 （式中Ｙは最初の停止コドンの第二の塩基から制限酵素
開裂末端の３′末端までを表わし、Ｙ′はＹの相補配列
で、制限酵素開裂末端の５′末端までを表わす）で表わ
されるＤＮＡ配列を有する微生物を用いる特許請求の範
囲第２６項記載の製造方法。 - （２８）上流側に付加されるＤＮＡ配列のＸ及びＸ′が
、式 【ＤＮＡ配列があります】 で表わされる配列であるヒト神経成長因子遺伝子セグメ
ントを含む組換えプラスミドを保有する微生物を用いる
特許請求の範囲第２７項記載の製造方法。 - （２９）下流側に付加されるＤＮＡ配列のり及びＹ′が
、式 【ＤＮＡ配列があります】 で表わされる配列であるヒト神経成長因子遺伝子セグメ
ントを含む組換えプラスミドを保有する微生物を用いる
特許請求の範囲第２７項又は第２８項記載の製造方法。 - （３０）プロモーター・オペレーター系のメッセンジャ
ーＲＮＡ転写開始点よりヒト神経成長因子遺伝子までの
ＤＮＡ配列が、式 【ＤＮＡ配列があります】 で表される配列である組換プラスミドを細胞内に保有す
る微生物を用いる特許請求の範囲第２７項ないし第２９
項のいずれかの項記載の製造方法。 - （３１）プロモーター・オペレーター系のメッセンジャ
ーＲＮＡ転写開始点よりヒト神経成長因子遺伝子までの
ＤＮＡ配列が、式 【ＤＮＡ配列があります】 （Ｘ及びＸ′は前記同様の意味を表わす）で表される配
列である組換プラスミドを細胞内に保有する微生物を用
いる特許請求の範囲第２７項ないし第２９項のいずれか
の項記載の製造方法。 - （３２）式 【アミノ酸配列があります】 で表わされるヒト神経成長因子融合蛋白質。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60045773A JPS61205485A (ja) | 1985-03-09 | 1985-03-09 | ヒト神経成長因子遺伝子セグメント |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60045773A JPS61205485A (ja) | 1985-03-09 | 1985-03-09 | ヒト神経成長因子遺伝子セグメント |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61205485A true JPS61205485A (ja) | 1986-09-11 |
Family
ID=12728611
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60045773A Pending JPS61205485A (ja) | 1985-03-09 | 1985-03-09 | ヒト神経成長因子遺伝子セグメント |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61205485A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01211490A (ja) * | 1988-02-19 | 1989-08-24 | Tosoh Corp | ヒト神経成長因子遺伝子セグメント |
| EP0859056A2 (en) * | 1988-11-22 | 1998-08-19 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Human nerve growth factor |
-
1985
- 1985-03-09 JP JP60045773A patent/JPS61205485A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01211490A (ja) * | 1988-02-19 | 1989-08-24 | Tosoh Corp | ヒト神経成長因子遺伝子セグメント |
| EP0859056A2 (en) * | 1988-11-22 | 1998-08-19 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Human nerve growth factor |
| EP0859056A3 (en) * | 1988-11-22 | 1999-03-24 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Human nerve growth factor |
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