JPS60234584A - 組換プラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

更に詳しくは新規な発現ベクターを含む組換プラスミド
、この組換プラスミドで形質転換した細菌及びこの細菌
を用いてヒト成長ホルモンを製造する方法に関するもの
である。 組換ＤＮ△技術の出現により、有用なポリペプチドを生
産させることが試みられている。 規在のところ、クローニングの大部分は犬Ｂａを宿主と
する系（ＥＫ系）において行われている。 ＥＫ計でのプラスミド由来のクローニングとしては １）大腸菌内で安定に増殖する ２ン外来性ＤＮＡと試験管内相検体が作成できる３）大
腸菌内に移入できる ４）組換体をもつ宿主を薬剤耐性やバクテリオシン産生
などの遺伝的マτカ一によって検出できる などの条件を有するものが使用されている。 （蛋白質、核酸、酵素、２６（４）、４３５（１９８１
）　）組換プラスミドを大腸菌などの細胞に導入して発
現させる場合に、その細胞の転写と翻訳の仕組みに合っ
たプロを一ターやリポソーム付着信号（　Ｓ．　Ｄ．配
列）などの遺伝情報の発現シグナルをあらかじめ異種蛋
白質の情報を持つＤＮＡに接続して組換プラスミドに組
み込んでおく必要がある。 この場合、異種蛋白質をコードする遺伝子をホモローガ
スな蛋白質をコードする遺伝子又はその一部と連結して
、その異種蛋白質をホモローガス蛋白質又はその一部と
の融合蛋白質として発現させる方法と異種蛋白質を］一
部する遺伝子の翻訳開始コドン近傍の翻訳支配領域をプ
ロモーター下流のＳ．Ｄ．配列に接続して、直接目的の
異種蛋白質を生産させる方法がある。 ＥＫ系では遺伝情報の発現シグナルとラクトースやトリ
プトファンオペロンのプロモーターがよく用いられる。 この様な系では情報発現量が、数多くの遺伝子に採用さ
れている合目的手段である、その遺伝子の産物によって
自己調節される機構を備えている。 大腸菌野生株では１〜リプトファン、オペロンは少なく
も３つの別個の調節形式の支配下にある。 代謝レベルでの自己調節としてフィードバック阻害の作
用がある。ｔｒｐ　Ｅ及びｔｒｐ−Ｄポリペプチド複合
体にトリプトファンが結合し、その結果その複合体が合
成径路に参加するのを阻止する。 遺伝子転写レベルでの調節の場合、トリプトファンは抑
制因子として働き、アポレプレッサー蛋白に結合して活
性レプレッサー蛋白となってオペレーターに作用し、オ
ペロン転写を抑止する。 最後は、ｍＲＮＡの翻訳レベルを介した調節でオペロン
の転写率がプロモーターと第１構造道伝子の間に存在す
るアテニュエーターで減少覆るアテニュエーションと呼
ばれる機構である。アテニュエーションの程度は細胞内
のトリプトファンのｌＩｊ［によって支配されていると
見られる。 トリプトファンプロモーターを効果的に発現させるため
にはこれらの自己調節機構を解除させる必要がある。 そのひとつの方法として、トリプトファン・レプレッサ
ーを不活性化してオペレータ−を解放することが挙げら
れる。１−リブトファンＡべＯンの構造上オペレーター
を取り除くことは困雌であり、インドールアクリル酸、
あるいはインドールプロピオン酸などのトリプトファン
アナログをトリプトフアンとともに培地に加えて、蛋白
質合成を行わせる条件でトリプトファンンどアポレプレ
ッサー蛋白の結合を拮抗的に阻害させる方法が用いられ
ている。 もう１つの方法として、トリプトファン存在下でトリプ
トファンプロモーターからの転写を効果　。 的に進行させるために、トリプトファンオペロンのプロ
モーターと第１構造遺伝子の間に存在するアテニュエー
ターを除くか修飾することが考えられる。 ヒト成長ホルモン（以下ｈ　Ｇ　Ｈと略記する）の産生
については、Ｔｒｐ　Ｅ　３伝子の一部を欠失させたト
リプトファンオペロンのＴｒｐ　Ｄ　遺伝子の途中にｉ
ＧＨ　ｉ転子を接続させて、ｈ叶をＴｒｐ　Ｄ蛋白質の
一部との融合蛋白質として生産させる方法が開示されて
いる（特開昭５６−１４５２２１号）。 またＴｒｐ　Ｅ　遺伝子のＳ、　Ｄ、配列の下流に設け
た監し■サイトに天然の遺伝子と一部のコドンが相異す
る合成遺伝子を組込み、ｈＧＨを直接発現させる方法も
知られている（第５回分子生物学会、昭和５７年１２月
１０日）。 特開昭５６−１４５２２１号公報には、更にトリプトフ
ァンオペロンのアッテニュエータ一部分を欠失させ、こ
れに異種蛋白質をコードする遺伝子を組込むことによっ
てその異種蛋白質を発現でさるとして、Ｔｒｐ　Ｌの８
．０．領域の下流にＥｃｏＲ■４ナイトを設けこれにｈ
ＧＨ３］伝子を組込んだプラスミド、Ｉ）ＨＧＨ−２０
７を調整し、これを大腸菌中で発現させることによって
ｈＧＩ＋を直接生産させることができたとしている。 しかし一般的には、トリプトファンオペロンのアッテニ
ュエータ一部分を欠失させ、これに異種蛋白質を］−ド
覆る雇転子を組込み、自己増殖可能のプラスミドを調製
して大股菌中へ組込んだとしても、その異種蛋白質を直
接発現できるとは必ずしも期待できない。翻訳開始点と
Ｓ、　Ｏ，配列、更にはプリブナウ配列等との間の距離
の大小、コドンフレームの合否、組込まれた異種蛋白遺
伝子の差異等によって、これが発現するかどうかは微妙
であるからである。 特開昭５６−１４５２２１号公報中ではＴｒｐ　ＬのＳ
、　Ｄ、配列はＡＡＡＡＧＣＧＴであるとされている［
もっとも後に一部の発明者らによってこの部分の塩基配
列は＾ＡＡＡＡＡＧＧＴであるとされでいるのでその様
に読まるべきである。またＳ、Ｄ配列はこのうちのＧＧ
Ｔであると訂正されティる。（Ｒ，Ｌ、　ＲＯｄＯｒｉ
（］ＬｌｅＺ他編、「Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ：　５ｔｒｕ
ｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　Ｊ　１９８２
年ｐｒａｅｇｅｒ発行、４６２〜４８１頁参照）］。そ
してｐＨＧＨ−２０７ではこの配列に続さＸｂａ　Ｉサ
イト及び匹ｏＲ■サイトを右づる ５°＾ＴＣＴＡＧ静ＴＴＣＴ３’ ＴＡＧＡＴＣＴＴＡＡＧへ の配列が続き、これに八ＴＧ（Ｎｅｔ）で始まるｈＧＨ
３３ｉ伝子が接続されている。本発明者らの研究によれ
ばＴｒｐ　ＬのＳ、　Ｏ，配列部分は上記配列の゛ＡＡ
ＧＧ部分であるので、ＤＨＧＩ＋−２０７ではＳ、Ｄ配
列とｈＧＩＩ開始コドンの距離は１３塩基対である。 本発明者らは前述した合成ｈＧＨを直接発現できるトリ
プトファンプロモーター・オペレーターを含むプラスミ
ド系について研究した結果本発明に到達した。なお本明
［１書注Ａ、　Ｃ，Ｇ及び■はそれぞれデオキシアデニ
ル酸残基、デオキシシチジル酸残基、デオキシグアニル
酸残基およびチミジル酸残基を表わす。 本発明は、メツセンジャーＲＮＡ転写開始点より蛋白質
をコードする塩基配列の翻訳開始点までの塩基配列が （式中ＸはＴ　、ＴＡ、　ＴＡＴＧ、またはＴＡＴＣＧ
Ａを表し、Ｘ。 はその相補塩基または相補塩基鎖であるＡ　、　ＡＴ。 ＡＴＡＧまたはＡＴＡＧＣＴを表す）で表されるＤＮＡ
シーケンスを有する細菌由来のトリプトファン　プロモ
ーター・オペレーターと、このＤＮ＾シーケンスの３゛
下流に続く異種蛋白質をコードＪ８迫伝子を含み、大腸
菌中で、自己増殖可能でかつその異種蛋白質を発現する
ことのＣきる組換プラスミドを提供するものである。 第１図に本発明の＠換プラスミドの制限酵素開裂地図を
示す。異種蛋白質をコードする遺伝子はＣ１ａ　Ｉ開裂
部位と５ａ３１開裂部位との間に挿入されている。■は
１〜リプトフアンプロモーターオペレーターのｍＲＮＡ
転写開始部位を示す。本発明の組換プラスミドではこの
部位からＣｌａ　Ｉ認識部位までの間が上述したシーケ
ンスからなっている。 またｔｒｐリーダー領域の８．０．配列を含んでいる（
中央部枠で囲ったＡＡＧＧ部分）。 ＴＴＣに のシーケンスは、具体的には以下の通りである。 ３゜末端の枠内は９−１見一■認識部位を示づ。 本発明者らは（１）．　（２）．　（３）および（４）
を持つプラスミドを、それぞれｐＧｌ＋−１８，　ｐＧ
Ｈ−１−９，　ｐＧＨ−Ｌ１？およびｐＧ｝ｌ−Ｌ１３
と命名した。本発明の紺換ブラスミ．ドにコードされて
いる異種蛋白質はヒト成長ボルモンであり、前記ＤＮＡ
シーケンスのＣｌａＩｇ識部位に続きＳａｔ　工開裂部
位で終るこれをコードする遺伝子は ３０ ５゜ＡＴＧＴＴＣＣＣＡＡＣＴ八ＴＴＣＣＡＣＴＧＡＧ
ＴＣＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＧＧＧＴＴＧＡＴＡＡＧＧＴ
ＧＡＣＴＣＡＧＣＧＧＡＣ６０ ＴＴＣＧＡＴＡＡＣＧＣＧＡＴＧＣＴＧＣＧＴＧＣＧＣ
ＡＴＣＧＴＡＡＧＣＴＡＴＴＧＣＧＣＴＡＣＧＡＣＧＣ
ＡＣＧＣＧＴＡＧＣＡＣＴＧＣＡＣＣＡＡＣＴＧＧＣＴ
ＴＴＣＧＡＣＡＣＴＴＡＣＣＡＧＧＡＣＧＴＧＧＴＴＧ
ＡＣＣＧＡＡＡＧＣＴＧＴＧＡＡＴＧＧＴＣ１２０ ＧＡＧＴＴＣＧＡＡＧＡＡＧＣＡＴＡＣ＾ＴＣＣＣＧＡ
ＡＡＧ八ＡＣＴＣＡＡＧＣＴＴＣＴＴＣＧＴＡＴＧＴＡ
ＧＧＧＣＴＴＴＣＴＴ１５０ ＣＡＧＡＡＡＴＡＣＡＧＣＴＴＣＣＴＴＣＡＧＡＡＣＣ
Ｃ’ＡＣＡＧＧＴＣＴＴＴＡＴＧＴＣＧＡＡＧＧＡＡＧ
’ＴＣＴＴＧＧＧＴＧＴＣ１８０ ＡＣＣＴＣＧＴＴＧＴＧＴＴＴ（ＪＣＴＧＡＡＡＧ丁Ａ
丁ＣＣＣＧＴＧＧＡＧＣＡＡＣＡＣＡＡＡＧＡＧＡＣＴ
ＴＴＣＡＴＡＧＧＧＣ２１０ ＡＣＣＣＣＴＴＣＴＡＡＣＣＧＣＧＡＡＧＡＧＡＣＣＣ
ＡＧＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡＧＡＴＴＧＧＣＧＣＴＴＣＴ
ＣＴＧＧＧＴＣＧＴＣ２４０ ＡＡＡＴＣＧＡＡＣＣＴＴＧＡＡＣＴＧＣＴＴＣＧＴＡ
ＴＣＴＣＧＴＴＴＡＧＣＴＴＧＧＡＡＣＴ丁ＧＡＣＧＡ
ＡＧＣＡＴＡＧＡＧＣ２７０ ＣＴＧＣＴＴＣＴＣＡＴＴＣＡＧＴＣＧＴＧＧＣＴＧＧ
ＡＧＣＣＡＧＡＣＧ八八ＧＡＧＴＡＡＧＴＣＡＧＣＡＣ
ＣＧＡＣＣＴＣＧＧＴ３００ ＧＴＡＣＡＧＴＴＣＣＴＧＣＧＴＴＣＧＧ丁ＴＴＴＣＧ
ＣＡＡＡＣＣＡＴＧＴＣＡＡＧＧＡＣＧＣＡＡＧＣＣＡ
ＡＡＡＧＣＧＴＴＴＧ３３０ Ｔ　Ｃ　Ａ　ＣＴ　Ｇ　Ｇ　Ｔ＾ＴＡＣＧＧＴＧＣＧ丁
ＣＴＧＡＣＡＧＴ＾八ＣＡＧＴＧＡＣＣ八ＴＡＴＧＣＣ
ＡＣＧＣＡＧＡＣＴＧＴＣＡＴＴＧ３６０ ＧＴＴＴ＾Ｃ６＾ＣＣＴＧＣＴＧ八＾ＡＧ八ＣＣＴＴＧ
ＡＡＧＡＡＣＡＡＡＴＧＣＴＧＧＡＣＧＡＣＴＴＴＣＴ
ＧＧＡＡＣＴＴＣＴＴ３９０ ＧＧＧＡＴＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＡＴ（ｉＧＧＴＣＧＣ
ＣＴＧＧＡ＾ＣＣＣＴＡＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＴＡＣＣ
ＣＡＧＣＧＧＡＣＣＴＴ４２０ Ｇ＾ＴＧＧＴＴＣＡＣＣＡＣＧＣＡＣ．．ＴＧＧＴＣＡ
ＧＡＴＣＴＴＣＣＴＡＣＣ八八ＧＴＧＧＴＧＣＧＴＧＡ
ＣＣ八ＧＴＣＴＡＧ＾八Ｇ４５０ ＡＡＡＣＡＧＡＣＴＴＡＣＴＣＣＡＡＡＴＴＣＧＡＴＡ
ＣＴＡＡＣＴＴＴＧＴＣＴＧＡＡ’ＴＧＡＧＧＴＴＴＡ
八ＧＣＴ＾ＴＧＡＴＴＧ４８０ ＴＣＴＣＡＴＡＡＣＧＡＴＧＡＴＧＣＴＣＴＧＣＴＧＡ
ＡＡＡＡＣＡＧＡＧＴＡＴＴＧＣＴＡＣＴＡＣＧＡＧＡ
ＣＧＡＣＴＴＴＴＴＧ５１０ ■＾ＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＴＡＣＴＧＴＴＴＣＣＧＴＡ
ＡＡＧ八ＴＡＴＧＣＣＧＧＡＣＧＡＣＡＴＧＡＣＡＡＡ
ＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡ５４０ ＡＴＧＧＡＴＡ八ＡＧＴｒＧ八ＡＡＣＴＴＴＣＣＴＧＣ
ＧＴＡＴＣＴＡＣＣＴＡＴＴＴＣＡＡＣＴＴＴＧＡＡＡ
ＧＧＡＣＧＣＡＴＡＧ５７０ ＧＴＴＣＡＧＴＧＴＣＧＴＴＣＴＧＴＴＧＡＡＧＧＧＴ
ＣＧＴＧＴＣＡＡＧＴＣＡＣＡＧＣＡＡＧＡＣＡＡＣＴ
ＴＣＣＣＡＧＣＡＣＡで表される塩基配列がらなるもの
である。 本発明の組換プラスミドのトリプトフッ７ン　プロモー
ター・オペレーターは細菌由来のものであり、その５°
末端と異種蛋白質をコードする遺伝子の３゛末端との間
に、アンピシリン耐性を発現することのできるＤＮＡシ
ーケンスとこの組換プラスミドを自己増殖可能とするＤ
ＮＡシーケンスとを含むものである。 このアンピシリン耐性をコードするＤＮＡシーケンスと
自己増殖を可能とづ゛るＩ）ＮＡクシ−ンスからなるシ
ーケンスの３°末端は１〜リブトフアン１０１−ターオ
ペレーターの５°末端と第１図の地図上■の点で接続さ
れ、またその５°末端は後者の５ａ、４　■開裂部位で
接続されている。第１図の地図の■の点の近傍のＤＮ八
へ−ケンスとしくは、「■　「■ を例示することができる。また、その１〜リブ１ヘフア
ン　プロモーター・オペレーターは大胆菌由来であるこ
とが好ましく、そのメッセンジｊｙ−ＲＮ＾転写開始点
までの塩基配列としては、 ＡＡＴＴ八八ＧへへＮ’八Ｇ−へＮ’）−ＣＴＣＡ八Ｇ
ＧへＧＣ八Ｃへ　ＣＣＣＧ丁ＴＣＴＧＧＡＴＡＧＡＧＴ
ＴＣＣＧＣＧＴＧへＧＧＧＣへへＧＡＣＣＴへ丁ＡＴＧ
ＴＴＴＴＴｒＧＣＧＣＣＧへＣへＴＣへＴＡＡＣＧＧＴ
ＴＣＴＡＣ＾へへへＡへＣＧ　ＣＧ　Ｇ　ＣＴ　Ｇ　’
ｒ　Ａ　Ｇ　ｉへＴＴＧＣＣ＾＾ＧＴＧＧＣへへへ■へ
ＴＴＣＴＧＡへＡＴＧＡＧＣＴＧＴＴＧＡＣ＾ＡＣＣＧ
ＴＴＴＡＴ＾ＡＧＡＣ丁ｒＴＡＣＴＣＧＡＣ＾へＣＴＧ
Ｔ（式中Ｎは八、Ｇ、Ｃまたは■を表し、Ｎｏはその相
補塩基を表し、０は約１６０ないし約１８０特に約１１
０の整数を表す）で表される塩基配列を持つものを例示
することができる。かつまた、そのトリプトファン　プ
ロモーター・オペレーターの５°末端と異種蛋白質をコ
ードする遺伝子の３゛末端との間のＤＮＡシーケンスは
ｐＢＲ３２２由来であることが望ましく、具体的にはｐ
ＢＲ３２２の制限地図上」興Ｒ１ｆｉ識部位の中心の八
（相補鎖についＣは■）から反時計方向へ向って」虱Ｉ
開裂部位の■（相補鎖についてはＧ　まて　）の３７１
２塩基鎖（相補鎖については３１０８塩基鎖）に相当す
るシーケンスを例示することができる。 本発明の組換プラスミドは例えば第２図ないし第４図に
示す様にして調整りることができる。 第２図１　に既知のプラスミドｐｔｒｐｅ　Ｄ５−１　
［Ｇｅｎｅ、９．２７（１９８０）参照］の制限酵素開
裂地図を示す。 このプラスミドを制限酵素ＨｉｎｆＩで消化して約５０
０塩基対のＨｉｎｆＩ　−Ｈ１ｎｆＩ断片をとり出す。 第２図２　にこの断片の塩基配列を示す。 一方、公知のプラスミドｐＢＲ３２２［第２図中３　で
示す。Ｇｅｎｅ、２．９５（１９７７）参照］をＥｃｏ
Ｒ■で消化して開裂させる。切り出したＨｉｎｆＩ　−
ＨｌｎｆＩ　断片の両末端をＴ５ＤＮ＾ポリメ、ラーゼ
ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲ■切断部に挿入し、４のプラス
ミドを調整する。 次に第３図に示す様に４をＥｃｏＲＩで部分消化して　
■　のＥｃｏＲＩ部位のみを切断し、Ｔ４　ＤＮＡボリ
メラー１で修復後、Ｔ４ＯＮ＾リガーゼにより接着を行
い、このＩ’ｃｏＲＩて部位を消失させる（５）。 続いてこれをＥｃｏＲＴとＢａｍＨ■で二重消化して　
ｐＢ８３２２由来のシーケンス部分のＥｃｏＲ■とＢａ
ｍＨＩ部位の間の領域［第３図５の■の　部分１をも欠
失させる。このようにして得られるプラスミド（第３図
６）を“ｐＯｃＴ２−９”と略称する。　ｐＯｃＴ２−
９は、４．３　Ｋ＋）　（にｂａｓｅ　ｐａｉｒ）を有
し、慣用の方法、例えばコーエンらの方法［Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　Ｕ、Ｓ、Ａ、
、　６９．２１１０（１９７２）　］　ニヨッテ大腸菌
ニ形質転換してＡＩＩＩＦＩ　、　Ｔｃ　をマーカーと
してクローニングすることができる。細胞当りのコピー
数は、２０〜３０個／ｃｅｌｌである。 ■で切断する。次いで、制限酵素Ｂａｔ　３１で両末端
こうして得たｐＯｃＴ２−９の残った江叶工部位を江靜
から約３０　ｂ、ｐ、を除去し、除去した部分に化学合
５゛３゜ 成した虹ａニリンカー　ＡＡＴＣＧＡＴＴ　をＴ４ＤＮ
ＡＴＴＡＧＣＴＡＡ ガーゼを用いて挿入閉環しｐＣＴ　１プラスミド（７）
を調製する（第３図参照）。 得られたプラスミドｐＣＴ　ｉはＩ）ＯＣＴ２−９の場
合と同様、大腸菌に形質転換してクローニングおよび増
幅を行うことができ、ベクターとして有用である。 以上のようにして得られるプラスミドＩ）ＣＴ　１は、
例えばマクサム・ギルバート法［Ｈａｘａｍ　＆Ｇ１１
ｂｅｒｔ、ＰＮＡＳ、７４，５６０（１９７７）　］に
よってシーケンシングを行い確認する。 得られたプラスミドｐＣＴ　１を１ｌｐａ　Ｉおよび（
リュエで二重消化し、ポリアクリドアミド電気泳動によ
って長い方の断片、即ちｐＣＴ　ｉからリーダ領域のリ
ポソーム付着部位、アテニュエーター領域、第１構造遺
伝子であるｔｒｐ　Ｅのリポソーム付着部位を取り除い
た断片を得る。この断片に ５°ＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＧ−Ｘ−ＡＴ
ＣＧ八Ｔ　へ３゜ＴＴＣＡＡＧＴＧＣ＾ＴＴＴＴＴＣＣ
Ｃ−Ｘ−ＴＡＧＣＴＡＧＣで表わされる合成りＮＡ　（
式中ＸおよびＸ゛は前記同様の意味を表わす。）を挿入
し、Ｔ４ＤＮ八リガーゼを用いて接着閉環ケる。 この様にして得られたプラスミドをＣａｌ　ＩおよびＳ
ａｔ　Ｉで切断し、ポリアクリルアミド電気泳動によっ
て長い方の断片を得る。これに５°末端（１鎖）がＣ１
ａ　Ｊ構造、３゛末＠（１鎖）がシリー■構造を有し、
前述したＤＮＡシーケンスからなるヒト成長ホルモン遺
伝子を挿入し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで接着すると、ヒト
成長ホルモン遺伝子の組込まれた有用な新規プラスミド
ρＧＨ−Ｌ８．　ｐＧＨ−Ｌ９．　ｐＧＨ−Ｌｌｌおよ
びｐＧＨ−１１３を得ることができる（第４図参照）。 これらのプラスミドの調製に用いることのできる前述し
た合成りＮＡおよび合成ヒト成長ホルモン遺伝子は以下
の様に調製することができる。 まず各ＤＮＡシーケンスの各部分を構成するオリゴヌク
レオチドを例えば、固相法により合成する。 固相法の担体としては、１％ジビニルベンゼンを含むポ
リスチレン樹脂［に、Ｈｉｙｏｓｌ＋ｉ　ｅｔ　ａｌ、
　ＮｕｃｌｅｉＣＡＣｉｄＳ　Ｒｅｓ、　、　８．５５
０７（１９８０）参照］又はシリヵゲ／Ｌ／　［Ｍ、Ｄ
、Ｈａｔｔｅｕｃｃｉ、Ｈ，Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、
　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、、　１０３．３
１８５　（１９８１）参照１が好ましい。 各７ラグメントの３°末端を構成する４種類のデオキシ
ヌクレオシド、リーなわら、デオキシシチジン、デオキ
シアデノシン、デオキシグアノシン、チミジンを常法に
よりそれぞれ５°−ジメトキシトリチル化３−コハク酸
エステルとリ−る［Ｂｒｏｋａ　Ｃ。 ｅｔ　ａｌ、　ＮＬＩＣｌｅｉＣＡＣｉｄＳ　Ｒｅｓ、
、　ａ、　５４６１〜５４７１（１９８０）参照］。 これを前記担体のアミノ基と結合したもの（ヌクレオシ
ド担体）を、前記オリゴヌクレオチドの３゜末端に用い
る。次いで、これらの３゛末端ヌクレオシド担体に、偶
数個のｒ−Ａキシリボヌクレオチドよりなるオリゴヌク
、レオチドについては、３°末端より第二番目に相当す
るモノヌクレオチド［ＡおよびＣについてはＮ−ベンゾ
イル化、ＧについてはＮ−イソプリル化して保護したも
の。おのおの５′−０１１を４，４−ジメトキシトリチ
ル化、かつ３゛−リン酸をモノ（オル１〜クロルフエニ
ル）Ｊ−チル化して保護］を、奇数個のデオキシリボヌ
クレオチドよりなるオリゴヌクレオチ、ドについては３
°末端Ｊ、り第二および第三番目に相当するジヌクレオ
チドまたは第二ないし第五番目に相当するテ１〜ラヌク
レオチド（各保護については同前）を、縮合剤を用いて
結合さセる。縮合剤としては、メシチレンスルホニル−
３−二トロ］−リアゾリド（Ｈ３ＮＴ）　、２゜４．６
−１−リイソプロピルベンゼンスルホニル−３−二トロ
１−リアゾリド（ＴＰＳＮｒ　）　、メチシチジンスル
ホニルーテトラゾリド（Ｈ３Ｔｅ）　、２，４．６−ｔ
−リイソプロピルベンげンスルホニルーテトラゾリド（
ＴＰＳＴｅ　）等が適当である。 さらに前者のオリゴメクレ第１１〜については、同様に
保護した第三および第四番目に相当するジヌクレオチド
、第五および第六番目に相当するジヌクレオチド・・・
・・・または第六ないし第九番目に相当するテトラペプ
チド、第拾ないし第拾三番目に相当するテトラペプチド
・・・・・・と、後者のオリゴヌクレオチドについては
第四および第五番目、第六および第七番目・・・・・・
と各ジヌクレオチドを同様にして５°方向へ順次結合さ
ける。但し必要に応じて途中でモノヌクレオチドやトリ
ヌクレオチドを用いてもよい。 この調製法を第５図に示した。同図中Ｐはポリスチレン
の１ｘジビニルベンゼンとの共重合体を、ｂｚおよびｉ
ｂはベンゾイル基およびイソブチリル基を、Ｂはｂ７．
＾、１ｌ）Ｇ、ｂｚＣまたは■を、８°はＡ、Ｇ、Ｃま
たはＴを、　ＤＨＴｒは４，４−ジメトキシトリチル基
を、＾ｒはオルトクロロワ１ニル基を、ＢＳＡはベンゼ
ンスルホン酸のメチレンジクロリドーメタノール混合溶
媒（容量比７；３〉溶液（２％）を、ＤＨＡＰは４−ジ
メチルアミノピリジンの０．１４８ピリジン溶液を、■
ＮＧ−Ｐ＾０は１，１，３．３−テトラメチルグユニジ
ウム２−ピリジンアルドキシメートのジオキサン−水混
合溶媒（容量比９・１）溶液（０，５Ｍ　）を示す。 上記、ジヌクレオチドは、４種類のヌクレオチドの順列
により１６種類が必要であるが、その合成法は、例えば
次の第６図に示す方法によることができる。 ただし、ＤＨＴｒは、４’、４’−ジメトキシトリチル
基、Ｂ及びＢｏは６−Ｎ−ベンゾイルアデニン−９−イ
ル基、４−Ｎ−ベンゾイルシトシン−１−イル基、２−
Ｎ−イソ−ブチリルグアニン−９−イル基、チミン−１
−イル基から選ばれ、同−又は異なってもよい。Ｈ３Ｎ
Ｔはメシチレンスルホニル−３−ニトロトリアゾリドを
示す。これらのジヌクレオチドへの保護基導入°は公知
の方法［例エバ蛋白ｉＴ　核Ｍ　ＲＭ、２６（４）、　
２５９（１９８１）フにより容易に行うことができる。 またテトラヌクレオブトはこうして１７だジヌクレオチ
ドの適当な種類を用い、ジヌクレオチド調製の場合と同
様にして結合させて調製することができる。 ｍＲＮＡ転写同始点より翻訳下位派点までのＤＮＡシー
ケンスを組込むための合成ＯＮ八については、この様に
して ５°ＡＡＣＴＡＧＴＡＣＧＣＡＡＧＴＴ　（以下’ｏｏ
という）３゛ ３°ＴＴＧＡＴＣＡＴＧＣＧＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡＴ　
（以下’ｏｏという）５゜ ”ＣＡＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＧ−Ｘ−ＡＴ　（Ｄ下　Ｌ
Ｉｏｌという　）３“ 但しＸがＴＡ（Ｕｏｌ−２）、ＴＡＴＣ（Ｕｏ、３）お
よび■＾ＴＣＧＡ”０ｌ−４）の３種 ３°ＴＴＴＴＣＣＣ−Ｘ’−ＴへＧＣ（以下’０１とい
う）但しＸがＡＴ（Ｌ。１−２１．ＡＴＡＧ（Ｌｏｌ、
）および＾ＴＡＧＣＴ（Ｌｏｌ−４）の３種 の各オリゴヌクレオチドを調製し、これを第７図にしめ
す様に各オリゴヌクレオブードの５゛末端を酵素的にリ
ン酸化したのち、Ｕ　と［。およびＵ３Ｏ とＬｌをアニール（ハイブリダイズ）させ、更に生成し
た二重鎖をＴ４ＤＮ＾リガーゼで連結して得ることがで
きる。 合成ヒト成長ホルモン遺伝子のＯＮ＾シーケンスについ
ては、これをＡ部分（５°末端八から１３１番目のＧま
で）、Ｂ部分（１３２番目０より４１５番目八まへ）及
びＣ部分く４１６番目■゛以降３°末端まで）の３部分
に分けて、各部分を別個に合成したのち、これを連結す
ることによって調製することができる。これらの各部分
はまた、後述の実施例１の調製例で例示した様に、その
ＤＮＡシーケンスを構成することのできるオリゴヌクレ
オチドを前述した同相法で調製し、これを適当な群に分
け、各群について、第８図ないし第９図に示した様に各
オリゴヌクレオチドの５゛末端をリン酸化したのち、ア
ニールしてハイブリダイズ、させ、口Ｎ＾リガーゼで結
合させ、精製単離して各部分を構成することのできる二
ＩＩＩ）ＮＡＩＩｉ片とする。こうして得られた二重鎖
ＤＮ八へ片を再びＤＮＡリガーゼを用いて結合させへ部
分、Ｂ部分およびＣ部分の各部分に当る二重鎖ＯＮ＾セ
グメントを構成する。なおこれらの各部分の両末端を構
成したオリゴヌクレオチド（即ちｕＣＯ５’Ｃ０１ＵＣ
１２および［Ｃ１ｌ　）にはクローニング等の都合上余
分なヌクレオチドを付加しであるので必要に応じて適当
なベクターに組込んでクローニング及び増幅を行ったの
ち、二重鎖ＤＮＡ断片をＤＮＡリガーゼで結合させる際
にこれらの余分のヌクレオチドを除去するため、適当な
制限酵素を加える。これらの酵素はＣ部分についてはり
１」および匪■である。 こうして得られる＾、ＢおよびＣ部分はさらにＤＮＡリ
ガーゼで相互に結合され５°末端にＣｌａ　Ｉテール、
３°末端に５ａｔ−■テールを有する合成ヒト成長ホル
モン遺伝子が得られる。こうして得られる合成遺伝子は
前述した様にしてベクタープラスミドに組込み本発明の
組換えプラスミドを調製することができる（第４図参照
）。 本発明の組換えプラスミドは大腸菌内で自己増殖可能で
あり、かつその際菌体内に安定に保持される。コピ数は
約２０ないし３０であり、クロラムフェニルコールによ
って増加させることができる。 本発明の組換えプラスミドは、これを含む菌体からリゾ
チーム、界面活性剤等による溶菌を合む”Ｃ１ｅａｒｅ
ｄ　Ｉｙｓａｔｅ”法、フェノールによる抽出、エタノ
ール等による沈澱、エチジウムプロミド−塩化セシウム
等による密度勾配遠心沈降、アガロースゲル電気泳動、
液体フロントグラフィ等による分離などの慣用の方法の
組合せによって容易に抽出精製することができる。 本発明の組換えプラスミドは慣用の方法［例えばコーエ
ンら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、　Ｓｃｉ、、
　Ｕ、Ｓ、八、、　６９．２１１０（１９７２）　］に
よって大腸菌に容易に形質転換することができる。こう
してＥ、Ｃｏ１１　Ｋ１２／ＨＢ　１０１（Ｐｒｏ−１
ｅｕ−ｔｈｉ−１ａｃＹ−ｈｓｄＲ−ｏｎ（ｉ八−ｒｐ
ｓＬ２０　ａｒａ−１４，４１ａｌＫ２．Ｘｙｌ−！ｉ
、ｍｔｌ−１，５Ｌｊｐ［４４）［Ｈｅｔｈｏｄ　ｉｎ
　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１，９７９）、ｐ８，２６２
］に形質転換して得られた菌株、「、コリ　ｐＧｌｌ−
１，８，Ｅ、コリ　ｐｅｎ−１１−９，Ｅ、コリ　ｐＧ
ｌｌ−１１１お上び［、ニコリ　ｐＧｌｌ−１，１３（
それぞれ［、コリ　ｐＧｌｌ−１，８、＋＋ＧＩＩ−１
．−９．　ｐＧｌ−Ｌ、−１１およびｐＧＨ−１１３を
保有）は昭和５９年５月８日付で通商産業省工業技術員
微生物工業技術研究所に寄託されている。寄託番号は以
下の通り−Ｃある。 Ｊ、蝦ｐＧＨ−Ｌ８　微工研菌寄第７６０５号Ｅ、　ｃ
ｏｌｉ　ｐＧＨ−１９微Ｉ研菌寄第７６０６　号」、姐
旦ｐＧＨ−１１１微工研菌寄第７６０７号Ｊ、蝦ｐＧ＋
＋−１１３微工研菌寄第７６０８号これらの菌株の菌学
的性質はアンピシリン耐性を獲ｑ＊シていることとじ１
−成長ホルモン（Ｎ−メチＡニルソｚ　１−１−　Ｌ：
Ｉビン）を発現し、産生すること以外に宿Ｊユ菌株ど変
り

【、１なく、同様の条件で容易に培養することができ
る。またアンピシリン添加培地を用いることがＣきる。 本発明の形質転換された１コリ菌株はこれを栄養培地中
で培養することによってヒト成長ホルモンを直接発現し
、菌体内に蓄積する。このヒト成長ホルモンの産生（ｍ
ＲＮＡ合成）はインドールアクリル酸の添加によって強
く誘導される。 菌体内に蓄積されたヒト成長ホルモンは菌体を溶菌させ
たのら、通常の生理活性蛋白質回収法によって分離回収
することができる。ヒト成長ホルモンは疎水性が強く、
かつ細胞壁に吸容する傾向が認められ、必ずしも充分に
抽出されない場合があるが、グアニジン処理を行って完
全に抽出し、これを再活性化して高い収率Ｃ回収するこ
ともできる。 本発明の形質転換きれたに１りは効率よくヒト成長ホル
モン（Ｎ−メチオニルソマｉ〜トロピン）を発現できる
。特にヒＩ〜成長ホルモン逍伝子のための８口、配列か
ら翻訳開始点までの塩基数が９ケのプラスミド（ＬＩＣ
Ｉ＋−１，９）を持つ菌株（ＬコリｐＧＨ−Ｃ９は大量
のヒト成長ホル［ンを産生ずることができる。 以下本発明を実施例によりさらに詳しく説明づ−る。な
お実施傍注で略号で示した試薬は以Ｆの通りである。 Ｔｒｉｓ−ＮａＣｌ：１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−塩皇緩衡液
、０．１４８　Ｎ’ａＣ１１ｐＨ８゜ ＴＥ−蔗糖：２５ｘ蔗糖（Ｗ／Ｖ）、 ５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液、１ｍＨＥＤＴＡ　１
ｐ＋＋　８．。 リゾチーム　：　１０ｍ９　ｙ’　ｍＱリゾチーム、０
．２５ＨＴｒｉｓ−塩酸緩衝液、ｐＨ８゜Ｏ，５ＨＥＤ
Ｔ八ｌへ　Ｉ）１１　８．。 ＰＮａｓｅ：　０．０４Ｍ酢酸緩衡液（Ｐｂ　５）に１
０ｍ９／（Ｂｆｌの濃度に溶かし、１００℃で５分間加
熱処理する。 Ｌｙｔｉｃ　Ｍｉｘｔｕｒｅ：０．１％非イＡン系Ｗ面
活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００＞　、 ５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液、 ６２．５ｍＨＥＤＴＡ　、　ｐＨ８゜ ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００　：　１級
の粉末５８　ＮａＣｌ　ＣｓＣｌ：固体。 ＥＢ溶液：エチジウムブロマイドを水に対して４．６７
ｍｇ／ｄになるよう溶解して調製。 ＴＥ：　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−塩ｉ！緩衡液、１ｍＨＥ
ＤＴＡ、ｐＨ７，４゜ ＴＥ−ｓａｒｋｏｓｙｌ：　１０ｍＭ　Ｔｉｒｓ−塩酸
緩衝液、１ｍＨＥＤＴＡｌｏ、３８％ＳｏｄｉｕｍＮ−
Ｌａｕｒｏｙｌ　５ａｒｋｏｓｉｎａｔｅ　、　ｐＨ７
，４゜ＴＥＮ：　１０ｍＨＴｉｒｓ−塩酸緩衝液、１ｍ
ＨＥＤＴＡ、０．ＩＨＮａＣｌ、ｐＨ７，４゜ ［ＡリゴヌクレＡブト１１合成］ （１）ｄＣＡＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＧＴＡＡＴ（υ０１
−２１の合成５°（４，４−ビメトキシ］・リチル）チ
ミジン担体く１００μｍｏｌ／ｇ前記ボリスヂレン樹脂
２０ａｙ　）をピリジン中−夜室温で放直し次のような
操作により綜合反応を行った。 操作 １）ジクロロメタン−メタノール（７：３　、Ｖ／Ｖ　
）　２ｄにより３回洗浄。 ２）２％ベンゼンスルホン酸溶液（溶媒ジクロロメタン
−メチルアルコール、７：３）２Ｉｒｄｌで２分間処理
した後、同じ混合溶媒で３回洗浄する操作を繰返して発
色のなくなることを確めた。 ３）ピリジン２ａｉ！により３回洗浄。 ４）５°−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ−ペ
ンゾイルデオキシアデニリルーＰ（ｏ−クロロフェニル
）　−Ｎ−ベンゾイルデオキシアデノシン３−（ｏ−ク
ロロフェニル）ホスフェートのピリジン溶液（０，２ｔ
ｄ。 同ジヌクレオチド２０ｍｇを含む）を加え溶媒を減圧留
去した。 ５）縮合剤、メシチレンスルホニル−３−ニトロトリア
ゾリド（２０ｍｇ）のピリジン溶液（０，２１ｄ＞を加
え４０℃、２０分間放置した。 ６）ピリジン２〆により２回洗浄。 ７）　０．１Ｍジメチルアミノピリジンのピリジン溶液
（１，８＃Ｉｌり　Ｊ５Ｊ：（ｆ無水酢酸（０，２ｓｄ
りを加え１０分間放置した。 ８）ピリジン２ｄにより３回洗浄。続いて上記２）以降
の操作を５’−（４，４−ツメ１〜キシトリチル）−Ｎ
−ペンゾイルデオキシアデニリルーＰ−（ｏ−クロロフ
ェニル）デオキシアデノシン−３°−（０−クロロフェ
ニル）ホスフェートに代えて５’−（４，４−ジメトキ
シトリチル）−Ｎ−イソブチリルデオキシグアニリルー
ｐ−（０−クロロフェニル）チミジン−３−（ｏ−クロ
ロフェニル）ホスフェートを用いて行い、さらに同様の
保護基を右ｔ　ル、ｄＧＧ、　ｄＡＡ、　ｄＡＡ、　ｄ
ＴＡ、　ｄＣＧ　オ、Ｊ：　Ｕ　ｄＣＡを用いて順次５
°方向へＤＭＡ鎖を延長した後、樹脂を０．５Ｈｌ−リ
メチルグアニジウムーピリジンー２−アルドオキシメー
ト［Ｃ，Ｂ、　Ｒｅｅｓｅ　ｃｌ、　ａｌ、、　Ｔｅｔ
ｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、、　２７２７（１９７８
）］のジオキ勺ンー水（９：１　）の溶液（Ｉｄ）中３
８時間振とうした。樹脂を５０％ピリジン水により洗浄
し炉液と洗液を合せて減圧濃縮し、残渣に濃アンモニア
水（１５ｄ）を加え密栓して５５℃で５時間加温した。 アンモニアを留去し、ピリジニウム型強酸性陽イオン交
換樹脂（ｄｏｗｅｘ　５０．商標＞　２ｄを加え、樹脂
を５０′Ｘピリジン水により洗浄し、炉液と洗液を合せ
て濃縮した。濃縮液に少量の水を加え酢酸エチルでオキ
シムを抽出して除いた。水層を水で希釈し、その一部を
分取してジメトキシトリチル基の定量を行い全体の量を
推定した。ツメ１〜キシ］〜リチル基の分子吸光係数を
７１．７００とすると７７．４＾２．４ユニツトから１
．０８μｍｏｌの粗オリゴヌクレオチドが合成されたこ
とがりかっＩｃ　０ 水層を減圧乾固し残渣に８０％酢酸１０ｇを加え２５℃
、３０分間保った後溶媒を留去し、残渣を水と酢酸エチ
ルに溶解した。水層を濃縮した後、イオン交換クロマト
グラフィーにかけた。イオン交換体はＤＥＡＥ−Ｔｏｙ
ｏｐｅａｒｌ　６５０Ｓ　（商標）ヲ用イタ。コレをカ
ラム（０，７ｘ　２１０）につめ７Ｈ尿素、２０ｍ旧〜
すスー塩酸緩衡液（ｐｌ＋７．５）中、０．１〜０．３
Ｈの食塩濃度勾配ぐ溶出する。紫外線吸収によりオリゴ
ヌクレオチドを検出し、中央部をとりセルロース膜を用
いて透析により脱塩し、１２．３Ａ２６ｏユニツト（６
１５μｇ）ヲ得り。Ｉ（Ｐｌ、Ｃ（Ｃ１８シＩＪ　力’
ｊ　）Ｉｉ担体）および−次元ホモクロマトグラフィー
で単一であることにより純痕を確認した。 ２）　［ｄＡＡｃＴＡＧＴ八ｃＧｃＡＡＧへＴ（υｏｏ
’の合成］’０１−２の場合ど同様にして５°−（４，
４−ジメトキシトリデル）チミジン担体を用い、まず５
°−（４，４゜−ジメトキシトリデル）　３’−Ｐ−（
ｏ−クロロフェニル）デミジル酸を用いてＵ。１−２の
場合と同様にして縮合反応を行った。引続き第１表中下
線で示した単位で保護基を右づ゛るジヌクレオチドを用
いて’０１−２の場合と同様にして５゛方向へのＤＮ＾
鎖の延長、脱保護基および生成物の精製分離を行い、Ｕ
ｏｏ　１１．０八２６０コ−ニット（５５０μｇ）を得
た。 ３）　［ｄＴＴＧＡＴＣＡＴＧＣＧＴＴＣＡＡＧＴＧＣ
ＡＴ（１−００）　］５’−（４，４−ジメトキシトリ
デル）−Ｎ−ベンゾイルデオキシアデノシン３−（０−
クロロフェニル）ホスフェ−１−を用いた他は１１ｏｏ
の場合ど同様にして第一段の綜合を行った。さらに第１
表中下線で示した単位で保護基を右り′るジヌクレオチ
ドを用いてυｏ１−２の場合と同様にしてＯＮ＾鎖延長
、脱保護基および生成物の精製分離を行い、Ｌｏｏ８．
６Ａ２６゜ユニット（４３０μｇ）を１９だ。 ４）　［ｄＣＡＣＧＴＡ八Ａ＾ＡＧＧへＴ八ＴＣ八Ｔ（
へ１ｏへ−３）および［ｄＣＡＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＧ
ＴＡＴＣＧＡＡＴ　（ＩＩｏｌ、、４）　ノ合成］”０
１−２の場合と同様にして５°−（４，４°−ジメトキ
シトリチル）デミジン担体を用い、５°−（４，４−ジ
メトキシトリチル）−Ｎ−ペンゾイルデオキシアデニリ
ルーＰ（ｏ−クロロフェニル）デオキシアデノシン３°
（０−クロロフェニル）ホスフェートおよびこれに代え
て５°−（４，４−ジメトキシトリチル）−Ｎ−ペンゾ
イルデオキシシチジリルーＰ−（０−クロロフェニル）
デオキシアデノシン３′（０−クロロフェニル）ホスフ
ェ−１・を用いて最初の縮合反応を行った。 引続き第１表中下線で・示した単位で保護基を有するジ
ヌクレオチドを用いてＵ。１−２の場合と同様にしてＤ
Ｎ＾鎖延長、脱保護基および生成物の精製分離を行い、
Ｉｆ　８．４　Ａ２６ｏ：ｒニット（４２０μ０）１−
３ 、およびＵ　１１．６八２６０ユニツト　（５８０μｇ
）１−４ を得た。 ５）［ｄＴＴＴＴＣＣＣＡＴＴ八ＧＣ（Ｌｏｌ−へ）　
、ｄＴＴＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴ八ＧＣ（１，０ｌ−３へ
　、ｄＴＴＴＴＣＣＣ＾ＴＡＧＣＴＴＡＧＣ（Ｌ。１−
４）の合成］５’−（４，４°−ジメトキシ１ヘリデル
）デオキシシチジン担体を用い、５’−（４，４’−ジ
メトキシ１−リチル）−Ｎ−イソブチリルデオキシグア
ノシン３°（０−クロロフェニル）ホスフェートおよび
５°−（４，４°−ジメトキシトリデル）−Ｎ−ペンゾ
イルデオキシアデニリルーＰ−（ｏ−クロロフェニル）
デオキシグアノシン３°（０−クロロフェニル）ホスフ
ェートを用いて’０１−２　’００の場合と同様にして
第一段の縮合を行った。さらに第１表中下線で示した単
位で保護基を有するジヌクレオチドを用いてＵ。１−２
の場合と同様にしてＤＮＡ鎖延長、脱保護基および生成
物の精製分離を行い、Ｌ　８．８＾２６０ユニツト（４
１−２ ４０μｇ）、［９５＾２６０ユニツト（４７５μｇ）１
−３ およびＬｏｌ−４１１，２＾２６０−’ニラｌ−（５６
０μｇ）を得た。 こうし′Ｃ調製したオリゴヌクレオチドの１１　Ｐ　Ｌ
　Ｃでのリテンション・タイムＪ′３よびＤＥＡＥ−セ
ルロースを用いた一次元ホモクロマトグラフィでのＲｍ
値を第１表に示す。 ６）［Ａ部分を構成するオリゴヌクレオチドの調製］合
成ヒト生長ホルモン遺伝子のＡ部分を構成すべきオリゴ
ヌクレオチド（第２表記載の’ＡＯ〜’Ａ６および　［
ＡＯ〜　’Ａ６の１４個）を５’−（４，４−ジメトキ
シトリチル）デオキシグアノシン担体、５−（４，４−
ジメトキシトリチル）チミジン担体および５°−（４，
４−ジメトキシトリチル）デオキシシチジン担体を用い
、第２表記載のシーケンス部位の下線で示した単位で、
各々保護基を有するモノ−ジヌクレオチドまたはテトラ
ヌクレオチドをＵ。１−２およびＵ。０の場合と同様に
して３゛末端側から５°側へ向って順次縮合させ、脱保
護基および精製分離を行って調製した。 得られたオリゴヌクレオチドのクロマトグラフィ［ｌ１
ｌＲＮＡ転写開始点より翻訳開始点まＣのＤＮＡシーケ
ンスを組込むための合成ＯＮへの調製１上述したオリゴ
ヌクレオチドの合成で得られたオリゴヌクレオチドＵ。 ０．υｏ１−４および［。０．’０１−４を ’ｏｏ・’０１−２　’００・”０１−３’　”００・
”０１−４［００・［０１−２［００・１０１−３　お
よび’ｏｏ・’０１−４３群に分１プで、それぞれの群
につき次の反応を行った。ただし、［［および’０１−
４にっ０１−２＋　０１−３ いてはカイネーションを行わなかった。 ０．２５マイクロキユーリーの［γ−３２Ｐ］八ＴＰ（
〜５０　Ｃｉ／ｉ＋ｍｏｌ）　：４リゴヌクレオチド（
０，５μｇ）と０．７Ｕの■４ポリヌクレオチドキナー
ゼ（宝酒造■製）を５μｍのカイネーション緩衡液［５
０ｍＭトリス−ＨＣｊ！　、ｐＨ８，０／１０ｍＨＨｇ
Ｃ４／１０ｍＨβ　−メルカプトエタノール／２ｍＮス
ペルミジン／　０．Ｉ　ＨＫＣＩ！］に溶解したものを
混合し、３７℃で２０分間インキユニベートした。それ
からＡＴＰ　（１０ナノモル）を加え、更に１時間反応
さけた。９０℃、５分間加熱して、キプー巳を失活さ１
！た。これらのフラグメントをアニールづ−るため、反
応混合物を、β　−メルカプトエタノール（β−［ｔＳ
Ｈ）を除いたライゲージコン緩衡液（６６ｍｌ〜リスー
ＩＩＣＪ２　、ｐＨ７，６／６．６　ｒｎｌＨＨｇＣ４
１０，５ｍＨＡＴＰ　）中で、７０℃で２分間加熱し、
それからゆっくり室温まで冷却した。次にＡＴＰとβ−
ＥｔＳＨを１０１１１８の濃度になる様反応混合液に加
えた。反応混合液を１３℃に冷却後、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ（宝酒造＠Ｊ製）　（１，２１１）を加え、１５時間
同じ温度でインキュベートした。その後、６５℃で５分
間加熱して反応を停止させた。更にＮａＣｊ！を１００
ｍＭになるように加え、Ｈｌ）ａＩ３０Ｕを加え、３７
℃、１５時間反応を行った。生成したＤＮＡの７ラグメ
ントをフェノール処理後２００μＡのエタノールを加え
て沈澱させ、これを遠心分離後１５％アクリルアミドゲ
ル電気泳動（１５０Ｖ／２．５時間）に付し、その後、
ゲルから抽出を行って精製した。 得られたＤＮＡフラグメントはマクサム・ギルバート法
でシーケンシングを行い、構造を確認した。 （２）〜（４）式で表わされるＤＮＡフラグメントをそ
れぞれ ００３　Ａ　ユニット（１５μｇ） ６０ ０．０３　八　ユニット（１，５μｇ）６０ ０．０３　八　ユニット（１５μｇ）得た。 ６０ ［合成ｈＧＨ遺伝子ＡＢ部分の調製］ 上述したオリゴヌクレオチドの合成で得られたＡ８部分
を構成すべきオリゴヌクレオチドをＵ、ＵＵ、Ｕ（１５
よヒＵＡ５．υＡ６ＡＯＡＩＡ２　＾４ ’ＡＯ・’−Ａｌ　［Ａ２・’−Ａ　４　’　Ａ　５・
’Ａ６の３群に分け、その各々について［ｍＲＮＡ転写
開始点より翻訳開始点までのＤＮＡシーケンスを組込む
ための合成りＨへの調製］の場合と同様にして５°−リ
ン酸化、ライゲーションを行い、更にそれらを混合して
反応を継続した。この反応液に［ｍＲＮＡ転写開始点よ
り翻訳開始点までのＤＮＡシーケンスを組込むための合
成りＮＡの調製］の場合と同様に制限酵素Ｃｌａ　Ｉ　
（ベーリンガー・マンハイム社製）４５ユニツトを加え
て、３１℃で１時間インキュベート〜した。 ５ｘポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、その後ゲ
ルから抽出を行って精製した。この結果、次式に示す本
発明のヒト生長ホルモン遺伝子のＡ部分１０μｇを得た
。 ５°ＣＧＡＴＡＴＧＴＴＣＣＣＡ八ＣＴＡＴＴＣＣＡＣ
ＴＧＡＧへＣＧＣＣＴＧＴＡ　Ｔ　ＡＣＡＡＧＧＧ　Ｔ
　ＴＧＡ　ＴＡＡＧＧＴ　ＧＡＣＴ　ＣＡ　Ｇ　ＣＧＧ
ＡＣＴＴＣＧＡＴＡＡＣＧＣＧ＾ＴＧＣＴＧＣＧＴＧＣ
ＧＣ＾ＴＣＧＴＡＡＧＣＴＡＴＴＧＣＧＣＴＡＣＧＡＣ
ＧＣＡＣＧＣＧＴＡＧＣＡＣＴＧＣＡＣＣＡＡＣＴＧＧ
ＣＴＴＴＣＧＡＣＡＣＴＴＡＣＣＡＧＧＡＣＧＴＧＧＴ
ＴＧＡＣＣＧＡＡＡＧＣＴＧＴＧＡＡＴＧＧＴＣＧＡＧ
Ｔ　Ｔ　ＣＧＡＡ　Ｇ　ＡＡＧＣＡ　Ｔ　ＡＣＡ　Ｔ　
ＣＣＣＧＡＡ　ＡＧＡＡＣＴＣＡＡＧＣＴＴＣＴＴＣＧ
ＴＡＴＧＴＡＧＧＧＣＴＴＴＣＴＴＣ５・ ＧＴＣＴＴＴＡ 上述したオリゴヌクレオチドの合成で得られたＢ部分を
構成すべきオリゴヌクレオチドをｕ　−ｕ　ｕ　〜ｕ　
ｕ　〜ｕ ８０　８４　Ｂ５　８９　ＢＩＯ８１４Ｌ　〜し　Ｌ　
〜［［〜し ＢＯＢ４　８５　Ｂ６　８１０　Ｂ１４および υＢ１５　〜”Ｂ１９ ［Ｂ１５〜［Ｂ１８ の４群に分け、各群毎に［　ＩＩＩＲＮＡ転写開始点よ
り翻訳開始点までのＤＮＡシーケンスを組込むための合
成ＤＮＡの調製］の場合と同様にして５゜リン酸化、ラ
イゲーションおよび精製を行った。 ５゜ＡＧ　Ａ　ＡＡ　Ｔ　Ａ　ＣＡ　ＧＣ　Ｔ　ＴＣＣ
　Ｔ　ＴＣＡＧＡＡ　ＣＣ　ＧＡ　ＣＡ　ＧＴＧＴＣＧ
ＡＡＧＧＡＡＧＴＣＴＴＧＧＧＴＧＴＣＡＣＣＴＣＧＴ
ＴＧＴＧＴＴＴＣＴＣＴＧＡＡＡＧＴＡＴＣＣＣＧＴＧ
ＧＡＧＣＡＡＣＡＣ＾静ＧＡＧＡＣＴＴＴＣＡＴＡＧＧ
ＧＣＡＣＣＣＣＴＴＣＴＡＡＣＣＧＣＧＡＡＧＡＧ　３
’ＴＧＧＧＧ＾＾ＧＡＴＴＧＧＣＧＣＴＴＣＴＣＴＧＧ
ＧＴＣ（以下フラグメントＢ−Ｉという》１５μＱ１５
゜ＡＣＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＴＣＧＡＡＣＣＴＴＧＡＡ
ＣＴＧＣＴＴＣＧＴ八丁ＣＴＣＧＧＴＣＴＴＴＡＧＣＴ
丁ＧＧＡＡＣＴ丁ＧＡＣＧＡＡＧＣＡＴＡＧＡＧＣＣＴ
ＧＣＴＴＣＴＣＡＴＴＣＡＧＴＣＧＴＧＧＣＴＧＧＡＧ
ＣＣＡＧＡＣＧＡＡＧＡＧＴＡＡＧＴＣＡＧＣＡＣＣＧ
ＡＣＣＴＣＧＧＴＧＴＡＣＡＧ　３゜ ＣＡＴＧＴＣ＾＾ＧＧＡＣ （以下フラグメントＢ−Ｉという》１１μｇ、”　ＴＴ
ＣＣＴＧＣＧＴＴＣＧＧＴＴＴＴＣＧＣＡＡＡＣＧＣＡ
ＡＧＣＣＡＡＡＡＧＣＧＴＴＴＧＴＣＡＣＴＧＧＴ＾Ｔ
ＡＣＧＧＴＧＣＧＴＣＴＧＡＣＡＧＴ＾ＡＣＡＧＴＧＡ
ＣＣＡＴＡＴＧＣＣＡＣＧＣＡＧＡＣＴＧＴＣＡＴＴＧ
ＧＴＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＣＴＧ＾＾ＡＧＡＣ　３゜Ｃ
ＡＡ＾ＴＧＣＴＧＧＡＣＧＡＣＴＴＴＣＴＧＧＡＡＣＴ
Ｔ（以下フラグメントＢ−１１Ｉという）３０μｇ１５
゜ＣＴＴＧＡＡＧＡＡ ＣＴＴ ＧＧＧ＾ＴＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＡＴＧＧＧＴＣＧＣＣ
ＴＧＧＡ八ＣＣＣＴ＾ＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＴＡＣＣＣ
ＡＧＣＧＧＡＣＣＴＴ　−ＧＡＴＧＧＴＴＣＡＣＣＡＣ
ＧＣＡＣＴＧＧＴＣＡＧＡＴＣＴＧ　３゜ＣＴＡＣＣＡ
ＡＧＴＧＧＴＧＣＧＴＧＡＣＣＡＧＴＣＩ八ＧＡＣＡＧ
ＣＴ（以下フラグメントＢ−ＩＶという）１０μｇを得
た。 得られたＡ部分５μ９、フラグメントＢ−’Ｉ　７．５
μａ　，　Ｂ−ＩＩ　５μｏ　，　Ｂ−１１　７．５μ
ｇ，及ヒＢ−ＩＶ　５１１を用い、同様にリン酸化反応
、結合反応を行った後、制限酵素ＣｕａＩ６０ユニット
を加えて、３７℃で８時間インキユベートした。次いで
、制限酵素ＪＩＡｍ（宝酒造■製）７５ユニットおよび
ＮａｆＪを１０５ｍＨになるように加えて３１℃で１４
時間インキユベートし、反応停止後、ＯＮ＾をフェノー
ル処理後エタノールで沈澱させ、５％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動に付し、その後ゲルから抽出を行って精
製した。この結果、次式に示す本発明のヒト生長ホルモ
ン遺伝子のＡＢ部分４μｇを得た。 ５゜　ＡＧＡＡＡＴ＾ＣＡＧＣＴＴＣＣ丁ＴＣＡＧＡＡ
ＣＣＣＡＣＡＧＴＧＴＣＧＡＡＧＧＧＴＣＴＴＧＧＧＴ
ＧＴＣＡＣＣＴＣＧＴＴＧＴＧＴｒｒＣｒＣＴＧＡＡＡ
ＧＴＡＴＣＣＣＧＴＧＧＡＧＣＡＡＣＡＣＡＡ八ＧＡＧ
ＡＣＴＴＴＣ＾ＴＡＧＧＧＣ八ＣＣＣＣＴＴＣＴＡＡＣ
ＣＧＣＧ八＾ＧＡＧＡＣＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡ
ＧＡＴＴＧＧＣＧＣＴＴＣＴＣＴＧＧＧＴＣＧＴＣＡＡ
Ａ丁ＣＧＡＡＣＣＴＴＧＡＡＣＴＧＣＴＴＣＧＴＡＴＣ
ＴＣＧＴＴＴ＾ＧＣＴＴＧＧ八＾ＣＴＴＧＡＣＧ＾＾Ｇ
ＣＡＴ八ＧＡＧＣＣＴＧＣＴＴＣＴＣ＾ＴＴＣＡＧＴＣ
ＧＴＧＧＣＴＧＧＡＧＣＣＡＧＡＣＧＡＡＧＡＧＴＡＡ
ＧＴＣＡＧＣＡＣＣＧＡＣＣＴＣＧＧＴＧＴＡＣＡＧＴ
ＴＣＣＴＧＣＧｒ１’ＣＧＧＴＴＴＴＣＧＣ八＾ＡＣＣ
ＡＴＧＴＣＡＡＧＧＡＣＧＣＡＡＧＣＣＡＡＡＡＧＣＧ
ＴＴＴＧＴＣＡＣＴＧＧＴＡＴ＾ＣＧＧＴＧＣＧＴＣＴ
ＧＡＣＡＧＴＡＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＴ＾ｒＧＣＣＡＣ
ＧＣＡＧＡＣＴＧＴＣＡＴＴＯＧＴＴＴ＾ＣＧＡＣＣＴ
ＧＣＴＧ＾＾ＡＧＡＣＣ丁ＴＧ＾八Ｇ八八Ｃ＾＾＾ＴＧ
ＣＴＧＧＡＣＧＡＣＴＩＴＣＴＧＧＡＡＣＴＴＣＴＴＧ
ＧＧＡＴＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＡＴＧＧＧＴＣＧＣＣｒ
ＧＧＡ八ＣＣＣＴＡＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＴＡＣＣＣＡ
ＧＣＧＧＡＣＣＴＴＧＡＴＧＧＴＴＣＡＣＣＡＣＧＣＡ
ＣＴＧＧＴＣＡＧＡＴＣＴＧ　５，ＣＴ＾ＣＣＡＡＧＴ
ＧＧＴＧＣＧＴＧＡＣＣＡＧＴＣＴＡＧ八ＣＡＧＣＴＥ
　合ｔＣ　ｈＧ｝ｌ　遺伝”Ｆ　Ｇ　Ｍ分（７）調’Ｘ
Ｊ］上述したオリゴメクレオチドの合成で１７られたＣ
部分を構成すべき１リゴヌクレＡチドをｕ−ｕｕ　〜ｕ
　おヨヒｌＩＣ９〜ｕｃ１２Ｃｏ　Ｃ４　Ｃ５　Ｃ８ ’ｃｏ〜’−Ｃ４　’Ｃ５〜’Ｃ８　１Ｃ９〜ＩＣ１２
の３群に分け、各群毎に［　ｍＲＮＡ転写間始点より翻
訳開始点までのＤＮＡシーケンスを組込むための合成Ｄ
ＮＡの調製］の場合と同様にして５−リン酸化、ライゲ
ーションおよび精製を行った。 ５゜ＡＧＣＴＴ＾ＴＣＧ＾ＴＡＴＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣ
ＡＴ＾ＧＣＴ＾ＴＡＣＧＴＣＴ八６八ＡＧ八Ａ八Ｃ八Ｇ
ＡＣＩ　Ｉ八Ｃ’ｌＣＣＡ八八ＴＴＣＧ八■八ＣＴＡＡ
Ｃ丁ＴＴＧｒＣＴＧ八八ｌ’ＧＡＧＧｒＴＴ八八Ｇ］へ
ＴＧＡＴＴＧＴＣＴＣ八■八八ＣＧ八ＴＧ八ＴＧＣＴＣ
ＴＧ　５，八Ｇ八ＧＴ八ＴＴＧＣＴＡＣＴＡＣＧＡＧＡ
ＣＧ八ＣｒＴＴＴ（以下フングメン］一〇−Ｉという）
７．２μｇ１５゜　ＣＴＧ＾八ＡＡＡＣ ＴＧ ＴＡＣＧＧＣＣＴＧＣ丁ＧＴ＾ＣＴＧＴ丁ＴＣＣＧＴＡ
八ＡＧ八丁八ＴＧＣＣＧＧ八ＣＧＡＣＡＴＧＡＣ八八八
ＧＧＣＡＴＴＴＣＴ八八ＴＧＧ＾■八八ＡＧＴＴＧ八八
ＡＣＴＴＴＣ　５，■＾Ｃ’Ｃ　Ｔ　Ａ　Ｔ　Ｔ　Ｔ　
Ｃ　Ａ　Ａ　Ｃ　Ｔ　Ｔ　Ｔ　Ｇ　Ａ八八ＧＧＡＣＧＣ
ＡＴＡ（以下フラグメン１〜Ｃ−■という）７、２μ９
および ５゜ＣＴＧＣＧＴＡＴＣ Ｇ ＧＴＴＣＡＧＴＧＴＣＧＴＴＣＴＧＴＴＧＡＡＧＧＧＴ
ＣＧＴＧＴＣＡＡＧＴＣＡＣＡＧＣ八八ＧＡＣＡＡＣＴ
ＴＣＣＣＡＧＣＡＣ八ＧＧＣＴＴＣＴ静ＴＡＧ　５， ＣＣＧ八＾ＧＡＴＴ＾ＴＣＡＧＣＴ （以下フラグメンｔ−　ｃ　−　ｍという）７．２μｇ
を得た。 得られたフラグメン１一Ｃ一．−：［３．６μり．Ｃ−
４３６μｇ及びＣ−ｍ７．２μ９を用い、上記と同様に
リン酸化反応、結合反応を行った後、制限酵素りａＩ（
ベーリンガー・マンハイム社製）４５ユニットを加えて
、３７℃で６時間インキユベートした。 次いで、制限酵素鎚し■（宝酒造側製）１２０ユニット
、ＮａＣＩ２　１３５ｍＨ，　ＤＴＴ５ｍＭを加えテ３
７℃テ１８時間インキユベートし、反応停止後、ＤＮＡ
をエタノールで沈澱させ、５％ポリアクリルアミドゲル
電気泳動に付し、その後ゲルから抽出を行って精製した
。 この結果、次式に示す本発明のヒト生長ボルモン遺伝子
のＣ部分０．５μ９を得た。 ”’ＣＧＡＴ＾ＴＧＣＡＧ＾ＴＣＴＴＣＴＡＴＡＣＧＴ
ＣＴＡＧＡＡＧ ＡＡＡＣＡＧＡＣＴＴＡＣＴＣＣＡＡＡＴＴＣＧＡＴＡ
ＣＴＡＡＣＴＴＴＧＴＣＴＧ八八ＴＧＡＧＧＴＴＴＡＡ
ＧＣＴＡＴＧＡＴＴＧＴＣＴＣＡＴＡＡＣＧＡＴＧＡＴ
ＧＣＴＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＡＣＡＧＡＧＴＡＴＴＧＣ
Ｔ＾ＣＴＡＣＧＡＧＡＣＧ八ＣＴＴＴＴＴＧＴＡＣＧＧ
ＣＣＴＧＣＴＧＴ八ＣＴＧＴＴＴＣＣＧＴＡＡＡＧＡＴ
＾ＴＧＣＣＧＧＡＣＧ八Ｃ八ＴＧＡＣＡＡＡＧＧＣ＾ｌ
’　Ｔ　Ｔ　Ｃ　Ｔ八ＡＴＧＧ八ＴＡＡＡＧＴＴＧＡ＾
八ＣＴＴＴＣＣＴＧＣＧＴＡＴＣ■八ＣＣＴ＾ＴＴＴＣ
ＡＡＣＴＴＴＧＡＡＡＧＧＡＣＧＣＡＴ＾ＧＧＴＴＣＡ
ＧＴＧＴＣＧＴＴＣＴＧＴＴＧＡＡＧＧＧＴＣＧＴＧＴ
ＣＡＡＧＴＣＡＣ八ＧＣ八＾ＧＡＣＡＡＣＴＴＣＣＣＡ
ＧＣＡＣＡＧＧＣＴＴＣＴＡＡＴＡＧ３゜ ５゜ ＣＣＧＡＡＧＡＴＴ八ＴＣＡＧＣＴ プラスミトｐｃＴ１　３　ｕｇヲｃｊｌａ　Ｉ６Ｕ加エ
テ３７℃１時間インキコベ−１〜後、ＤＴＴ　５ｍＨ，
　ＮａＣ１！　−１５０ｍＨになるように加え、Ｓａｌ
■８Ｕを添加し、３７℃　１時間インキユベートした。 反応停止後、フェノール処理し、エタノールでロＮ八を
沈でんさせ、ベクター　ＤＮＡ　２．５μりを得た。 このベクターＤＮＡ　１．２μＱとＣ部分遺伝子０．０
５μｇをＤＮＡリガーげ０１２Ｕを加えて２０℃２０時
間結合させた。 反応停止後、フェノール処理を行い、ＤＮＡをエタノー
ルを沈でんさせた。このうちの１７４を用いてＥ，コリ
　Ｋ１２／κｍ７２３　ｉ（Ｓｔｒ．ｈｉｓ，ｓｅｃ　
Ａ／ＳｕＰ　＋ｇａｌ，ｄｅ１，Ｊ．Ｈ．Ｂ（１９７６
）　Ｎ￥２　４２７−４３９を前述したコーエンらの方
法で形質転換し、アンピシリン耐性でテトラサイクリン
感受性を指標にクローニングを行った。得られた形質転
換株をＰＢＢ培地（ペブトン１０Ｑ１肉エキス１０ｇ　
，　ＮａＣｊｔ　２．５ｇ　１酵母エキス２ｇ水１１　
、ｐＨ７．０　）に３１℃で通気培養してブラスミドを
増幅した。菌が２〜５ｘｌ０８／Ｉｄまで生えたところ
でクロラムフエニ］一ルを最終激麿約１５０μ（］／ｄ
になるように加え、そのまま３７℃で８時間培養した。 培養液４００ｄから集めた菌体（約１！＋）を約３０ｄ
のＴｒｉｓ−ＮａＣｌに懸濁し、容ｍ　４（＋＋ｄ！の
冷ＪＪ遠心機用遠心管に移し、７，　ＯＯＯｒｐｍ、７
分間遠心して沈澱させた。１０ｄのＴＥ一蔗糖を加えて
懸濁し、０℃５分間放置後２ｍの０．５ｍＨ　ＥＤＴＡ
を加え、さらに０℃、１０分簡四いた。これにＩＧｄの
Ｌｙｔｉｃ　Ｍｉｘｔｕｒｅを一気に加え、遠心管を数
回反転して全体を均一にした。そのまま０℃で１５分間
ＩＩｌ防後、０℃で１５，０００〜１８，０００ｒｐｍ
　，　３０分間遠心した。十清を静かに別の遠心管に移
した。約３０ｄのｃｌＯａｒｅｄ　Ｉｙｓａｔｅが冑ら
れた。 ｃｌｅａｒｅｄ　Ｉｙｓａｔｅにその１／１０ｆｆ’ｒ
ｔのＰＥＧ粉末および１／１０容量の５８　ＮａＣｌを
加え、マグネチツクスターラ−で完全に溶解させた。０
℃で′１晩放置した後、１０．００Ｏｒｐｍ　、　１０
分間遠心した。沈澱を上清から分離した後、これを３ｄ
の■［によく溶かしさらに少量のＴＥを加えて全体を正
確に４．７６ｄにした。 これに５．ＯＯｇ　ＣｓＣ１，０，５ｓ＋ｅＦＢ溶液を
加えよく混合した。 ２容のエタノールを加え、０℃、２０分放置後１０．Ｏ
ｏｏｒｐｍで１０分間遠心し、上清をよく除き、沈澱を
９ｄのＴＥ−３ａｒｋｏｓｙｌにＪ：＜溶かし、さらに
少量のＴ［−３ａｒｋｏｓｙｌ　（９，５２ｇに調製し
た。これに１０ｇ　ＣｓＣ１、ｉｙ　ｒＢ溶液をｉｆｆ
　Ｉ！（＜−Ｊ　２０’Ｃ１３６，ＯＯＯｒｐｍで３６
時間遠心した。ブラックノンブ（３６０ｎｍ　）照射下
プラスミドｃｃＤＮＡバンドを幅狭く回収した。 ＴＥＮ　テ平衡化した５ｅｐＨａｒＯ３ｅ　Ｃｆ、−４
８カラム（０８Ｘ　２０ａＲ）に、得られたｃｃＤＮＡ
画分（０，８ｄ）をそのまま加え、ＴｒＮ　Ｐ自然流出
法によりグルか過を行った。波長２５４ｎｍにおりる吸
光麿でモニターして約５ｄのｖｏｉｄ　ｖｏｌｕｍｅ　
、　ＤＮ＾画分、ＦＩＮＡ画分、さらに続いてＥＢおよ
びＣｓＣｌが流出した。ＤＮＡ両分に相当する 最初のピークを集めてＴＥに透析してほぼ純粋なプラス
ミドＤＮＡを得た。 プラスミドｐＨＧ１１ｃ−１１（３１μりを得た。 ［合成ＨＧＨ遺伝子の調整］ ｐＧＨＣ−１５０μｃｌを２０ＩＩＩＨＴｒｉｓ　ＨＣ
ｉ！（ｐＨ７，５）−１０ｍＨβ−ＥｔＳＨ−１７５ｍ
ＨＮａＣｊ！−１０ｍＨ８ｇＣ４中Ｂｇｊｌ　’ｆｌ　
３７．５Ｕ。 ５ａｌＩ７５Ｕを加え、３７℃１７１１￥間イン４゛−
Ｌベートし反応停止、７Ｆノール処理後、ＤＮＡを１タ
ノール沈でんさせ、５％　ポリアクリルアミド電気泳動
に付した。ゲルから、抽出を行いＩＩＧＨＣ部分遺伝子
１．５μ［ｇを得た。■叶ΔＢ部分道伝子４μす、Ｃ部
分遺伝子１３μｑにＤＮＡリガーゼ３．６＋１　（ベー
リンガー・マンハイム）を加えて、２０℃２０時間結合
反応を行わせた。反応停止、後、ＣＩ！ａ１１６Ｕを加
え、３７℃８５時間インキ−７へ−１〜し、更にＮａＣ
１！　２００ｍＨ。 β−ＥｔＳＨ１０ｍＨになるように加えた後、川■５０
０を加え、３７℃１４．５時間インキコベートした。反
応停止後、フェノール抽出し、１−タノール沈でんを行
った。 合成ＨＧＩＩ　ｍ伝了ＤＮへ約１１１ｇを得た。このＤ
ＮＡについでマクサムパにルバ− ングを行い、これが前述した塩其配列からなるものであ
ることを確認した。 ｐＢＲ３２２プラスミド１μすにＥｃｏＲ　工とＴｒｉ
ｓ−ＨＣＪ　Ｈ（ｌｃ１２、７ｎ＋Ｈ　β−メルカプト
エタノールか、らなるｐＨ７、４の緩衝液２７１ｉおよ
び水を加えて総量、３０μ夕とし、３７℃、９０分間反
応させた。反応液をフェノール抽出し、水相にエタノー
ルを加えてＥｃｏＲ　Ｉ切断片を沈澱させて回収し、水
１０μＡに再溶解した。 一方１）ｔｒｌｌ　ＥＢ５−１プラスミド５μ９にＨｉ
ｎｆ１１０１Ｊ緩衡液（ＤＨ　７．５）　４５μＡおよ
び水を加えて総量５０μｍとし、３７℃、１２０分間反
応させた。フェノール抽出およびエタノール沈澱により
ＤＮＡフラグメントを回収し、２０μｌ水に再溶解した
。 このＩｌｉｎｆＩ断片を含む水溶液１０μＡに丁，　Ｄ
ＮＡポリメラーゼ０．２Ｕ　１各５ｎ＋ＨのｄＡＴＰ，
　ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ各２５μｍ、を含
むｐＨ８．７の緩衝液２５μｍならびに水を加え（総量
を７５μＡとし３７℃で３０分間反応を行った。反応液
のフェノール抽出およびエタノール沈澱を行い得られた
沈澱を乾燥さけ、１０ｍＨ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ！　−１
ｍＨ　ＥＤＴ＾（■［）を含むｐＨ８．０の緩衝液１０
μＡに溶解した。この溶液５μＡを５。 ＧＧＡＡＴＴＣＣ 、Ｌ」Ｌ９ＲＩリンカ−　ＣＣＴＴ八ＡＧへ５。 ５０　ｐ　ｍｏｊ！　、ポリヌクレオチドキナーゼ１ｕ
を含む緩衝液５μＡ中３７℃９０分反応させた．、得ら
れた溶液１μＡと緩衝液１３μＡ、■４０ＨＡリガーゼ
１υを加えて２０℃で１５時間反応させた。反応液をフ
ェノール抽出し、エタノール沈澱させて生成物を回収し
、これをＴＥ−緩衝液１０μＡに溶解した。この溶液に ＥｃｏＲ　■４０緩衡液３６μＡを加えて３７℃で３時
間反応させた。反応液をフェノール抽出したのちエタノ
ール沈でんを行い、乾燥させ、緩衝液１０μｍに溶解し
た。こうして得たｔｒｐプロモーター・オペレータを含
むＤＮＡフラグメントの溶液１０μＡとＰＢＲ３２２を
ＥｃｏＲＴで切断したフラグメント１０μＡ丁、　ＤＮ
Ａリガーゼ１１１を加え２０℃１５時間反応させ１．１
ｍつ１．　テ得りＩ）ＢＲ３２２ノＥＣＯＲＩ部位にｐ
ｔｒｐ　［Ｄ５−１由来のｔｒｐプロモーター・オペレ
ータを含むシーケンスを挿入した環状ＤＮＡ　１μ９に
ＥｃｏＲ工１１を加えて総１３０μＡとし、３７℃で６
００分間反応せてこのＤＮＡを部分消化し、フェノール
処理を行って反応を停止させた。エタノール沈でん後、
Ｔ［１０７１１ｋｍとかし、各５＋１１８　ｄＡＴＰお
よびｄＴＴＰを含む溶液２．５μＡ、Ｔ４ＤＮＡポリメ
ラーゼ０，２Ｕおよび緩衝液２５μｍを加え、３７℃３
０分間反応させ、フェノール抽出、エタノール沈澱を行
い、沈澱を５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＪ！、１０ｍＭ　
ＨｇＣｊ！、、、０．５ｍＭ　ＡＴＰ、１０ｎ＋Ｈβ−
Ｆｔｓｌｌ（１）Ｈ７，４）緩衝液５０μＡに溶解した
。これにＤＮＡリガーゼ１Ｕを加え、２０℃１５時間反
応した。フェノール処理後、エタノール沈でんを行い、
乾燥した後、緩衝液３０μオに溶解、これにＲａｍ　ｔ
ｌ　Ｉ　ＩＵを加え３１℃２時間反応させた。 フェノール抽出、エタノール沈澱を行ったのち沈澱を１
０μｍ緩衡液緩衝液し、ｐｔｒｐ　ＥＤ５−１の旧ｎｆ
エフラグメントの場合と同様にして、ｄＮＴＰで付も末
端を満したのち、あらかじめ１０　ｐ　ｍｏｌの±ＲＩ
リンカー　５°ＧＧＡＡＴ’ｒＣＣ ＣＣＴＴＡＡＧＧ５°　の５°末端をリン酸化して加え
ＤＮＡリガーゼ１ｕ２０℃１５時間反応さゼてＥｃｏＲ
■リンカーを付加した。更にこれをＥｃｏＲ■で４０．
３７℃２時間で消化した。 こうして得たＥｃｏＲＩテールを両端に持つ二重鎖ＤＮ
Ａ　１μりに緩衝液５０μｉ　Ｔ４ＤＮＡリガーゼＩＩ
Ｉを加えて総ｆｆ１５１１１ｊｌとし２０℃で反応させ
ブラスミ１−”ＰＯＣＴ２−９　ヲ生成さμｋ。 この反応液でｐＨＧ１１ｃ−１のばあと同様にしく、Ｅ
。 コリに１２／にｎ＋７２３を形質転換、抽出精製を行い
、プラスミドｐＯｃＴ２−９を大量に得た。 こうして得たｐＯｃＴ２−９プラスミド３０μＱをｐＢ
Ｒ３２２の場合と同様にしてｒｃｏＲＩで消化し、フ】
ノール抽出、エタノールにＪ、る沈澱を行い、得られた
沈澱を乾燥さゼた緩衝液′６０μＡに溶解し、そのうち
、６１１　（３μｎ）を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！
（ｐＨ８，１）６００ｍＨＮａＪ１２ｍＨＨｇＣ４，１
２ｍＭ　ＣａＣ４，１ｍＭ　ｒＤＴＡ中Ｂａｌ　３１４
０を加えて３０℃で５分間反応させたのち、フェノール
抽出を行って反応を停止させ、エタノール沈澱させ、２
１μＡの緩衝液に再溶解させた。 この溶液のうち、１μＡ　（１Ｕｇ）に５゛＾ＡＴＣＧ
＾ＴＴ ５゜ シ■リンカ−ＴＴＡＧＣＴＡＡ　１２．５　ｐ　ｍｏｌ
、■４ＯＮＡリガーゼ１【１、緩衝液４μｍを加え２０
℃１５時間で反応させた。 フェノール抽出、Ｊタノール沈澱後、０．２μｇの口Ｎ
＾反応混合液を用いて「、コリ　にｍ７２３を形質転換
した。得られた各形質転換株中のプラスミドＤＮＡをＣ
Ｉ！ａ　工１０．３７℃９０１ｔ、ｌＴ間、ＲＮａｓｅ
　Ａ　Ｏ，２μｏ３７℃３０時間反応を行い、更にＴａ
ｇ　Ｊ　１．ＧＵを加え、６５℃−夜反応させた。フェ
ノール処理後５ｘポリアクリルアミドゲル電気泳動を行
い、Ｔａｑ　Ｉ−ＣＩａＩフラグメントが−Ｉ　４１Ｊ
＋（ｄ近のｂのを選んだ。 選んだプラスミドを含む形質転換株８個についＣ１ｐＯ
ｃＴ２−９の場合と同様に増幅ならびにプラスミドＤＮ
Ａの精製分動を行い、各々１００〜２５０μｇのプラス
ミドを得た。これらＤＮＡについ−Ｃ１マキリム・ギル
バーｌ−法により、塩基配列を調ｌ′＼、ｔｒｐＥの８
８口２配列のｊ−１後に堡１丁リンカ−の挿入されてい
るプラスミドＤＮＡをｐｃＴｌと名（Ｊｌすｌこ。 このプラスミドはｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ切断部位（
平滑化されたＥｃｏＲＩサイ１〜が消えＣいる）から時
副廻りに（ＩＩＩ）式の■ど■の間の配列を介して大腸
菌トリプトフン・ン　プロ七−タ−オペレーターに引続
（ＴｒｐＥ道伝了遺伝部が挿入され、またｐＢＲ３２２
の上記ＥｃｏＲＩ切断部位から時計形りに影１旧勺イト
までの全シーケンスとＢａｍ　ＩＩＩリイ１〜より下流
に約１５ｂｐの欠失どＣＩａＪ’！＋イ１−のｆ」加に
より、ｔｒｐＬＪ伝了ど接続されて環状どなっている約
４．３にす、ｐ　のプラスミドＣある。 得られたプラスミドｐｃｌ　１のＣＩ！ａ　ｌ−８ａｌ
　Ｉノラグメント　１μす、合成１１ＧＨ３ｉ伝了０．
３μす、■４ＤＮＡリガー１：　０．６１１　（宝酒造
）を用い、６ｔ３ｍＭＴｒｉｓ　Ｉｆ（Ｊ！（ｐＨ７、
（ｉ）　−（ｉ、６ｍＭ　ＨｇＣｌ、−０，５ｍＭ　Ａ
ＴＰ　。 １０ｍＨβ−ＥｔＳＩＩ中２０℃２２分間反応させた。 反応を停止させ、７１ノール処理、エタノール沈でん後
、ｐｃＴｌのクローニゲの場合と同様にして大賜菌ＨＢ
　１０１に形質転換およびり［１−ニングを行つＩご　
。 更に同プラスミドの場合と同様にしてＨＧＨｇｅｎｅを
含むプラスミドを右づる形質転換株について、増幅およ
びブラスミ１−の精製分離を行い、プラスミド　Ｉ］Ｈ
ＧＩ１１　１３２μ　ｇ　を得　た　。 このプラスミドはｐｃＴ１プラスミドのＣＩ！ａ　Ｉナ
イトから時計廻りにｐａｌ　Ｉサイトまでの配列の代り
に合成ＨＧＨｇｅｎｅが時計廻り方向に挿入された約４
．６４にｌ＋、ｐ、のシラスミドである。 こうして冑たｐＨＧ１１ｌプラスミド２０μｇすａ　Ｉ
　１２０３７℃５時間、旧−Ｉ　２０Ｕ、３７℃１５時
間消化、フェノール処理後１タノール沈澱し、　得られ
たＨｐａ■−Ｃｊｌａ丁断片のうち１５μｑ、さきに調
製した（２）式で現わされるＤＮＡフラグメント〜１ｐ
ｍｏｌ、Ｔ４ＤＮ八リガーゼ０．６１２０℃、２２時間
反応させ、フェノール処理、反応停止後、この反応液で
９１１Ｇ１１ｃｍ１の場合と同様にしてＥ、コリ１Ｉ８
１０１に形質転換し、同様にり［Ｊ−ニゲを行い、形質
転換株「、コリ／ｐＧＩｌ−ｌ’９　’ｉｉ’Ｊ　／ζ
ｏ＋１　（］　ＣＴ　２−９の場合と同様にして行られ
た［　−Ｊす／ｐＧＩＩ−１９を培ｊｅ’　Ｕ、ｐｃｎ
＋−［９の増幅、精製、分離を行い、ｌ’１ＧＩＩ−１
９２５１ノリを得た。令ｑられＩこｐＧＨ−Ｌ９１ご゛
ついＣ−ンクリム・１′ルバート法によるシーケンシン
グを行い、このプラスミドがｐＢＲ３２２シラスミドの
ＥｃｏＲＩ認識部位中心のＡ［（＋）鎖相補（−）鎖に
ついては月から反時計方向へ向ってＳａｌ　Ｉ開裂部位
のＴ［（＋）鎖、鎖相補（−）鎖についてはＧまで］の
３７１２に塩基銀［（＋）鎖、鎖相補（−）鎖について
は３７０８塩基鎖］に相当するシーケンスから時計廻り
に（ＴＶ）式のシーケンスおよび（２）式で表わされる
シーケンスが続きざら叫これに引続き前述したヒト成長
ホルモンをコードする遺伝子［（■）式］が、同様に時
計廻りに続き、その末端が、上記ｐＢＲ３２２の二１■
開裂部位と結合している４、！ｊＫｂ、ρ、のプラスミ
ドであることを確認した。 実施例２および３ （２）式で表わされるＤＮＡシーケンスに代えて（３）
おＪ、ひ（４）弐Ｃ表わされるＤＮＡシーケンスを用い
（実施例１と同様にしてｐＨＧＩ＋−１プラスミドの１
ｌｐａ　Ｉ　−Ｃ１ａ　Ｉ　断ハとの接着を行ってプラ
スミドｐＧ＋１−１．１１および−［１３の調製を行い
、ざらに実施例１と同様にし゛Ｃ形質転換株［、コリ／
Ｉ）ＧＨ−Ｌ　９゜Ｅ、コリ／ｐＧＨ−１１３を調製し
、それぞれのプラスミドを得た。 実施例４ ｐｃＴｌ　５０　／ｌを１００μｍの緩衝液中、１ｌｐ
ａ　■ｉｏｕ加え、３７℃５時間反応後、丁ａＱ　Ｉ　
５Ｕ加え、６５℃１５時間反応させた。フェノール処理
後、エタノール沈澱を行い、５％ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で３２　ｂｐのブラグメントを分離精製した
。 一方、ｐＣＴｌ　２μりを３０μＡ緩衡液中、Ｃｊ！ａ
■、１１、、ＬＬ、］　Ｉ　２０を加え、３７℃４時間
反応させた。フェノール処理後、エタノール沈澱を行い
、乾燥させた。精製したＨｐａ　Ｉ−ＴａｑＩフラグメ
ント　１ｕｇと、ｐｃＴ１／ＨｐａＩ’　−Ｃｊ！ａ　
Ｉフラグメントを３０μｊ２の緩衛液中、ＤＮＡリガー
ゼ１ｕを加え、２０℃１５時間反応させた。６５℃５分
間加熱し−Ｃ反応をとめた後、Ｅ、コリ　にｍ７２３に
形質転換した。増幅によりｐｔｒｐ［Ｃ−１を　１７０
μｇ得た。 ｐｔｒｐ　ＬＣ−１２０Ｕｇを緩衛液中ＣＩ！ａ　Ｉ　
１２１１　Ｕ’３７℃５時間消化した。反応液のＮａＣ
１！を１８０ｍＨになる様加え、さらにＳａｌ　■を２
０（Ｉ添加して３７℃で１７時間消化した。反応液を７
１ノール抽出後、エタノール沈澱を行ってＤＮＡを回収
し、５％アクリルアミドゲル電気泳動を行い、長い二重
鎖ＤＮＡ部分を抽出し、約１０μｇの直鎖状二重鎖ＤＮ
ＡであるベクターＤＮＡ　ｐｔｒｐ　ＬＣ−１／Ｃ１！
ａ　ｌ−３ａｌＩを得た。 ｐＨＧＨ−１プラスミド２０ＵｇをｐｔｒｐＬＣ−１の
場合と同様にしてＣｌ２ａ　■およびＳａｌ　工で消化
、アクリルアミドゲル電気泳動を行い、ゲルから抽出に
よりｙ」■およびＳａｔ　（部位をイ１するＩＩＧＨ遺
伝子約１．５μ０を得た。こうして得たｔｌＧＨ遺伝子
０．４１ｔ９とｐｔｒｐ　ＬＣ−１／Ｃｉ！ａ　ｌ−３
ａｌＩベクターＤＮＡ　１　μｌ］に１４ＤＮＡリガー
ゼ０．０９１１を加え、緩衛液中２０℃で２００時間反
応せた。フェノール処理後、反応液からエタノール沈で
んににってＩＮＮ八を回収し、実絶倒１と同様にして１
１１月１１０１に形質転換し、クローニングを行つＣ形
質転換株Ｌコリ／ｐＧＨ−Ｌ８を得た。第１１図にこの
調整法を示す。 実施例５ ８９−０．２％　Ｃａ５ａｌｌｌｉｌＩＯＡＣｉｄ−０
，４％　ＧＩＬＩＣＯ５ｅ−八ｐ（２０μｇ／ｕｔｆｌ
　）−チアミン（１０μａ／１ｔｄｌ　＞を培地で培地
として用い、対数増殖期の初期にインドールアクリル酸
を（４０μ０／ｄ）になるように加えて、形質転換株１
）ＧＨ−Ｌ８．−Ｌ９．−Ｌｌｌおよび−１１３を各２
３時間通気培養した。得られた菌体からｃｌｅａｒｌｅ
ｄ　Ｉｙｓａｔｅを調製した。こうして得たｃｌｅａｒ
ｅｄ　Ｉｙｓａｔｅに硫酸アンモニウムを加えて６０％
飽和とし、４℃で一夜放置後、１５．００Ｏｒｐｍ　３
０分間遠心して沈澱を集め、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ　ｐｌ（７，５ニ溶解し、ｌ１ｌＵ緩衡１−ｃ−ｉ間
透析した。沈澱を除いた後１、この液について標識した
１１ＧＨ抗体を用いてＲＩＡを行った。結果を次表に示
す。 培地１ｍＱ当りの生成量 使用した菌体　（ＲＴ八による値） Ｆ、コリ　／　ｐＧｌｌ−１８１１，５μｇ／ｄ［、コ
リ　／　ｐＧｌｌ−１−９７，７μ（１／ｍｅＦ、コリ
　／　ｐＧＨ−１１１１１，０μａｉｄ。 ［、コリ　／　ｐＧＨ−Ｌ１３　１１．０μｇ／Ｉｄ。 実施例６ 実施例５と同様にして培養を行い培養液０．１ｄから集
めた菌体を５０１１１８　ＴＩ・ｉＳ　Ｈα（ａｌ１８
．０）、５０’ｍＨＦＤＴＡ　、１５％５ｕｃｒｏｓｃ
　Ｏ，０２５％ＳＤＳ、１％ｌｙｓｏｚｙｍｅ溶液０．
　ＩＩｄｋ：懸濁し、０℃３０分間放置した。 これに５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ＤＩ１７．５）、
０．１ｍＨ［ＤＴＡ　。 １５０ｗ＋Ｍ　ＨａＣＩ、１ｍＨ１）ＴＴ　、１００μ
ｇ／ｍｌ！ウシ血清アルブミン、２０％グリセリンおよ
び６８Ｊ！ｉ酸グアニジンを含む緩衝液１−を加え沈澱
を溶解させ１５分間室温に放置した。このうちの２０７
１Ａに対し、塩酸グアニジンを含まない他は同一組成の
緩衛ｉ　ｉｙを加えて１日間室温に放置した。 この溶液について実施例５と同様にとてＲＴＡを行った
ところ次表の結果を得た。 培地１ｍｌ！当たりの生成量 使用した菌体　生成量（ｍｕｎｉｔ　）Ｌコリ　／、ｐ
Ｇｌｌ−１８２１４，２Ｌコリ　／　ｐＧＩＩ−１９３
３７，５しコリ　／　ｐＧＩＩ”ｌｌｌ　２１７．ＩＬ
コリ　／　ｐＧト１１３　２３４．４Ｌコリ　／　ｐＧ
ｌｌ−１（比較例＞　６７．７

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の粗挽プラスミドの特徴的な制限酵素開
裂部位を承り物理地図、第２図および第３図は本発明の
組換プラスミドの製造で経由した中間的な二重鎖環状Ｄ
Ｎへの調製を説明覆る図、第４図および第１１図は本発
明のプラスミドの調製を説明する図であり、第５図ない
し第１０図は本発明のＩＩＩ換プラプラスミド部を構成
する合成ｈＧＨ遺伝子各部分の調製を説明する図である
。 図面の浄書（内容に変更なし） 第１図 第９図 ８ ■　■ ［続補正書 昭和５９年５月１０日 特許庁長官　名杉相夫殿 昭和５９年５月９日提出の特許願 ２発明の名称 組換プラスミド ３補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　〒５６９大阪府高槻市日吉台３丁目１１番１４号
自発 ５補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ６補正の内容 （１）明ｍ店の５７頁乃至６０頁 一データを第２表に示す。 １）［Ｂ部分を構成り−るオリゴヌクレオチドの調製］
′合成ヒト生長ホルモン遺伝子のＢ部分を構成すべきオ
リゴヌクレオチド（第３表記載のＵＢｏ””　ＩＪ、１
９および’ＢＯ〜’−８１８の３９個）を５’−（４，
４−ジメトキシトリチル）チミジン担体、５°−（４，
４−ジメトキシトリチル）デオキシグアノシン担体、５
’−（４，４−ジメトキシトリチル）デオキシグアノシ
ン担体、および５’−（４，４−ジメトキシトリデル）
デオキシシチジン担体を用い、第３表記載のシーケンス
部位の下線で示した単位で、各々保ｇｌ基を有するモノ
−また：よジヌクレオチドをＵ。１−２およびＵ。０の
場合と同様にして３°末端側から５°側へ向って順次縮
合させ、脱保護基および精製分離を行って調製した。得
られたオリゴヌクレオチドのクロマトグラフィーデータ
を第３表に示り“。 ８）［Ｃ部分を構成するオリゴヌクレオチドの調製］合
成ヒト生長ホルモン遺伝子のＣ部分を構成すべきオリゴ
ヌクレオチド（第４９表記載の０゜０〜ＵＣ１２および
ＬＣＯ〜ＬＣ１１の２５個）を５°−（４，４−ジメト
キシトリチル）デオキシグアノシン担体、５゛−（４，
４°−ジメトキシトリチル）デオキシアデノシン担体、
５’−（４，４°−ジメトキシトリチル）デオキシシチ
ジン担体および５’−（４，４°−ジメトキシトリチル
）チミジン担体を用い、第４表記載のシーケンス部位の
下線で示した単位で、各々保護基を有するモノ−または
ジヌクレオチドをＵ。１−２およびυｏｏの場合と同様
にして３°末端側から５°側へ向って順次縮合させ、脱
保護基および精製分離を行って調製した。得られたオリ
ゴヌクレＡヂドのクロマトグラフィーデータを第４表に
示す。 手続補正書 昭和５９年１０月６１」 特許庁長官　志賀学殿 １事件の表示 昭和５９年特許願第０９２０８４号 ２発明の名称 組換プラスミド ３補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　〒５６９大阪府高槻市日吉台３丁目１１番１４号
氏名　池原森男 ４補正命令の日付 自発 ５補正の対象 ■　明細書の発明の詳細な説明の欄 ＩＩ　明細書の図面の簡単な説明の欄 ＩＩＩ図面の全文 ６補正の内容 ■　明細書の発明の詳細な説明の欄および明細書の図面
の簡単な説明の欄の補正については以下の通り６明細書
の訂正個所 頁数　１１数　訂正前　訂正後 ２２　５及び６　をトリプトファンと　を培地にともに
培地に ３３　８　第４図　第７図 ３３　９　ｐｔｒｐｅ　Ｄ５−１　ｐＬｒｐＥＤ５−１
３３１４　第２図　第３図 ３４　５　第３図　第４図 ３４　６及び７　第３図　第４図 ３４　１１　Ａｓｐ’　Ａｐ’ ３５　１　第３図　第５図 ３６　８　第４図　第６図および第７図３８１９　第５
図　第８図 ３９１３　第６図　第９図 ４０１９　第１図　第１０図 ４１１５　第８図ないし第９図　第１１図ないし第１５
図４２１８　第４図　第７図 １１１９　ノールを沈でん　ノールで沈でんさせた。　
させた。 ８５　３　第１１図　第１６図および第１７図８１１２
及び１３　第２図および第３図　第２図ないし第５図な
いし第１５図 ７添付書類の目録 （１）訂正した図面　１通

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１》メッセンジャーＲＮＡ転写開始点より蛋白質をコ
   ードする塩基配列の翻訳開始点までの塩基配列が ５゜ＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＧ−Ｘ　−Ａ
   ＴＣＧＡＴ３゜ＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡＴＴＴＴＴＣＣＣ
   −　Ｘ’　−　ＴＡＧＣＴＡ（式中）ｌ．ｔＴ、ＴＡ、
   ＴＡＴＣまたｔ；ＬＴＡＴＣＧＡｔ−表し、Ｘ゛はその
   相補塩基または相補塩基鎖であるＡ　，　ＡＴ、ＡＴＡ
   ＧまたはＡＴ八ＧＣＴを表す〉で表されるＤＮＡシーヶ
   ンスを有する細菌由来のトリプトファン　プロモーター
   ・オペレーターと、．、このＤＮＡシーケンスの３゛下
   流に続く異種蛋白質をコードする遺伝子を含み、大賜菌
   中で、自己増殖可能でかつその異種蛋白質を発現するこ
   とのできる組換プラスミド。 （２）異種蛋白質がヒト成長ホルモンであり、これをコ
   ードする遺伝子が ”　ＡＴＧＴＴＣＣＣＡＡＣＴＡＴＴＣＣＡＣＴＧＡＧ
   ＴＣＧＣＣＴＧ■＾ＣＡＡＧＧＧ丁ＴＧＡ丁ＡＡＧＧＴ
   ＧＡＣＴＣＡＧＣＧＧＡＣＴＴＣＧＡＴＡＡＣＧＣＧＡ
   ＴＧＣＴＧＣＧＴＧＣＧＣＡＴＣＧＴＡＡＧＣＴＡＴＴ
   ＧＣＧＣＴＡＣＧＡＣＧＣＡＣＧＣＧＴＡＧＣＡＣＴＧ
   ＣＡＣＣＡＡＣＴＧＧＣＴＴＴＣＧＡＣＡＣＴＴＡＣＣ
   ＡＧＧＡＣＧＴＧＧＴＴＧＡＣＣＧＡＡＡＧＣＴＧＴＧ
   ＡＡＴＧＧＴＣＧＡＧＴＴＣＧＡＡＧＡＡＧＣ＾１＾Ｃ
   ＡＴＣＣＣＧＡＡＡＧＡＡＣＴＣＡＡＧＣＴＴＣＴＴＣ
   ＧＴ＾ＴＧＴＡＧＧＧＣＴＴＴＣＴＴＣＡＧＡＡＡＴＡ
   ＣＡＧＣＴＴＣＣＴＴＣＡＧＡＡＣＣＣＡＣＡＧＧＴＣ
   ＴＴＴＡＴＧＴＣＧＡＡＧＧ＾＾ＧＴＣＴＴＧＧＧＴＧ
   ＴＣ＾ＣＣＴＣＧＴＴＧＴＧＴＴＴＣＴＣＴＧＡＡＡＧ
   ＴＡＴＣＣＣＧＴＧＧＡＧＣＡＡＣＡＣＡＡＡＧＡＧＡ
   ＣＴＴＴＣＡＴＡＧＧＧＣＡＣＣＣＣＴＴＣＴＡＡＣＣ
   ＧＣＧＡＡＧＡＧＡＣＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＧ八＾Ｇ
   ＾ＴＴＧＧＣＧＣＴＴＣＴＣＴＧＧＧＴＣＧＴＣＡＡＡ
   ＴＣＧＡＡＣＣＴＴＧＡＡＣＴＧＣＴＴＣＧＴＡＴＣＴ
   ＣＧＴＴＴＡＧＣＴＴＧＧＡＡＣＴＴＧＡＣＧＡＡＧＣ
   ＡＴ＾ＧＡＧＣＣＴＧＣＴＴＣＴＣＡＴＴＣＡＧＴＣＧ
   ＴＧＧＣＴＧＧＡＧＣＣ八ＧＡＣＧＡＡＧＡＧＴＡＡＧ
   ＴＣＡＧＣＡＣＣＧＡＣＣＴＣＧＧＴＧＴＡＣＡＧＴＴ
   ＣＣＴＧＣＧＴＴＣＧＧＴＴＴＴＣＧＣＡＡＡＣＣＡＴ
   ＧＴＣＡＡＧＧＡＣＧＣＡＡＧＣＣＡＡＡＡＧＣＧＴＴ
   ＴＧ丁ＣＡＣＴＧＧＴ八丁ＡＣＧＧＴＧＣＧＴＣＴＧＡ
   ＣＡＧＴ＾八Ｃ＾ＧＴＧＡＣＣＡＴＡＴＧＣＣＡＣＧＣ
   ＡＧＡＣＴＧＴＣＡＴＴＧＧＴ丁ＴＡＣＧＡＣＣＴＧＣ
   ＴＧ＾ＡＡＧＡＣＣＴＴＧＡＡＧＡＡＣＡＡＡＴＧＣＴ
   ＧＧＡＣＧＡＣＴＴＴＣＴＧＧＡＡＣＴＴＣＴＴＧＧＧ
   八丁ＣＣＡＧＡＣＣＣ丁ＧＡＴＧＧＧＴＣＧＣＣＴＧＧ
   ＡＡＣＣＣＴ＾ＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＴＡＣＣＣＡＧＣ
   ＧＧＡＣＣＴＴＧＡＴＧＧＴＴＣＡＣＣＡＣＧＣＡＣＴ
   ＧＧＴＣＡＧＡ丁ＣＴＴＣＣＴ八ＣＣ八＾ＧＴＧＧＴＧ
   ＣＧＴ．ＧＡＣＣＡＧＴＣＴ＾ＧＡＡＧ＾ＡＡＣＡＧＡ
   ＣＴＴＡＣＴＣＣＡ八八丁丁ＣＧＡ丁＾Ｃ丁ＡＡＣＴＴ
   ＴＧＴＣＴＧＡＡＴＧＡＧＧＴＴＴＡＡＧＣＴＡＴＧＡ
   ＴＴＧＴＣＴＣＡＴＡＡＣＧＡＴＧＡＴＧＣＴＣＴＧＣ
   ＴＧＡＡＡＡＡＣＡＧＡＧＴＡＴＴＧＣＴＡＣＴＡＣＧ
   ＡＧＡＣＧＡＣＴＴＴＴＴＧＴＡＣＧＧＣＣＴＧ（ＪＧ
   ＴＡＣＴＧＴＴＴＣＣＧＴＡＡＡＧＡＴ＾ＴＧＣＣＧＧ
   ＡＣＧＡＣ’ＡＴＧＡＣＡＡＡＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡＡ
   ＴＧＧＡＴＡＡＡＧＴＴＧＡＡＡＣＴＴＴＣＣＴＧＣＧ
   ＴＡＴＣＴＡＣＣＴ＾ＴＴＴＣＡＡＣＴＴＴＧＡＡＡＧ
   ＧＡＣＧＣＡＴＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＴＣＧＴＴＣＴＧ
   ＴＴＧＡＡＧＧＧＴＣＧＴＧＴＣＡＡＧＴＣＡＣＡＧＣ
   ＡＡＧＡＣＡＡＣＴＴＣＣＣＡＧＣＡＣＡＧＧＣＴＴＣ
   ＴＡ八ＴＡＧ”゜ ＣＣＧＡＡＧ八ＴＴＡＴＣＡＧＣＴ で表される塩基配列からなるものである特許請求の範囲
   第１項記載の絹換ブラスミド。 （３）細菌由来の１−リプトフアン　プロモーター・オ
   ペレーターの５゜末端と異種蛋白質をコードする遺伝子
   の３゜末端との間に、アンピシリン耐性を発現すること
   のできるＤＮＡシーケンスと組換プラスミドを自己増殖
   可能とするＤＮＡシーケンスとを含む特許請求の範囲第
   １項または第２項記載の組換プラスミド。 （４）細菌由来のトリプトフアン　プロモーター・オペ
   レーターが大腸菌由来であり、かつそのメッセンジャー
   ＲＮ＾転写開始点までの塩基配列が、＾ＡＴＴ八ＡＧＧ
   ＴＮ　’八Ｇ−（Ｎ’）。　一ＣＴＣＡＡＧＧＣＧＣＡ
   ＣＴＣＣＣＧＴＴＣＴＧＧＡＴ八ＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧ
   ＴＧＡＧＧＧＣＡＡＧＡＣＣＴＡＴＡＴＧＴＴＴＴＴＴ
   ＧＣＧＣＣＧＡＣＡＴＣ八ＴＡＡＣＧＧＴＴＣＴＡＣ＾
   八ＡＡＡＡＣＧＣＧＧＣＴＧＴＡＧＴＡＴＴＧＣＣＡＡ
   ＧＴＧＧＣ八八八ＴＡＴＴＣＴＧＡＡＡＴＧＡＧＣＴＧ
   ＴＴＧＡＣ八ＡＣＣＧＴＴＴＡＴＡＡＧＡＣＴＴＴＡＣ
   ＴＣＧＡＣＡＡＣＴＧＴＡＴＴ＾ＡＴＣ＾ＴＣＧＡＡＣ
   ＴＡＧＴＴ＾ＡＣＴ＾ＧＴ＾Ｃ　Ｇ　Ｃ　”ＴＡ＾ＴＴ
   ＡＧＴ＾ＧＣＴＴＧＡＴＣＡＡＴＴＧＡＴＣＡＴＧＣＧ
   （式中ＮはＡ，Ｇ，Ｃまたは■を表し、Ｎ゛はその相補
   塩基を表し、ｎは約１６０ないし約１８０の整数を表す
   ）で表される塩基配列を持つものである特許請求の範囲
   第１項ないし第４項のいずれかの項記載の組換プラスミ
   ド。 （５）トリプトフアン　プロモーター・オペレーターの
   ５゜末端と異種蛋白質をコードする遺伝子の３゛末端と
   の間のＤＮＡシーケンスがＩ）ＢＲ　３２２由来である
   特許請求の範囲第３項または第４項記載の組換プラスミ
   ド。 （　６　）　ｐＢＲ　３２２由来のＤＮＡシーケンスが
   ｐＢ’Ｒ　３２２の制限地図上ＥｃｏＲ　Ｉ認識部位の
   中心のＡ（相補鎖については■）から反時計方向へ向っ
   て』１Ｉ　）開裂部位の■（相補鎖についてはＧ　まで
   ）の３７１２塩基鎖（相補鎖については３７０８塩基鎖
   ）に相当するシーケンスである特許請求の範囲第　５項
   記載の組換プラスミド。 （７）メッセンジャーＲＮＡ転写開始点より蛋白質をコ
   ードする塩基配列の翻訳開始点までの塩基配列が ”ＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＡＡＡ八ＡＧＧＧ−Ｘ　一八Ｔ
   ＣＧＡＴ３゜ＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡＴＴＴＴＴＣＣＣ−
   　Ｘ’　−　ＴＡＧＣＴＡ（式中Ｘｔ．ｔＴ，ＴＡ、Ｔ
   ＡＴＣまたｔ．ｔＴＡＴｃＧＡヲ表し、Ｘ゜はその相補
   塩基または相補塩基鎖である＾、八丁、＾ＴＡＧまたは
   八ＴＡＧＣＴを表す》で表されるＤＮＡシーケンスを有
   する細菌由来のトリプトフ７ン　プロモーター・オペレ
   ーターと、このＤＮＡシーケンスの３゜下流に続く異種
   蛋白質をコードする遺伝子を含み、大腸菌中で、自己増
   殖可能でかつその異種蛋白質を発現することのできる組
   換プラスミドを細胞内に保持する、形質転換された』，
   コリ。 （８）形質転換した組換ブラスミドの異種蛋白質をコー
   ドする遺伝子が ５゜ＡＴＧＴＴＣＣＣＡＡＣＴ＾ＴＴＣＣＡＣＴＧＡＧ
   ＴＣＧＣＣＴＧＴＡＣ＾＾ＧＧＧＴＴＧＡＴＡＡＧＧＴ
   ＧＡＣＴＣＡＧＣＧＧＡＣＴＴＣＧＡＴ＾ＡＣＧＣＧ＾
   ＴＧＣＴＧＣＧＴＧＣＧＣＡＴＣＧＴ＾＾ＧＣＴＡＴＴ
   ＧＣＧＣＴＡＣＧＡＣＧＣＡＣＧＣＧＴＡＧＣ＾ＣＴＧ
   ＣＡＣＣＡＡＣＴＧＧＣＴＴＴＣＧＡＣＡＣＴＴＡＣＣ
   ＡＧＧＡＣＧＴＧＧＴＴＧＡＣＣＧＡＡＡＧＣＴＧＴＧ
   Ａ＾ＴＧＧＴＣＧＡＧＴＴＣＧＡＡＧＡＡＧＣＡＴＡＣ
   ＡＴＣＣＣＧＡＡＡＧＡＡＣＴＣ＾＾ＧＣＴＴＣＴＴＣ
   ＧＴＡＴＧＴＡＧＧＧＣＴＴＴＣＴＴＣＡＧＡＡＡＴＡ
   ＣＡＧＣＴＴＣＣＴＴＣＡＧＡＡＣＣＣＡＣＡＧＧＴＣ
   ＴＴＴＡＴＧＴＣＧＡＡＧＧ＾＾ＧＴＣＴＴＧＧＧＴＧ
   ＴＣＡＣＣＴＣＧＴＴＧＴＧＴＴＴＣＴＣＴＧＡＡＡＧ
   ＴＡＴＣＣＣＧＴＧＧＡＧＣＡＡＣＡＣ＾＾ＡＧＡＧＡ
   ＣＴＴＴＣＡＴＡＧＧＧＣ＾ＣＣＣＣＴＴＣＴ＾ＡＣＣ
   ＧＣＧＡＡＧＡＧＡＣＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡＧ
   ＡＴＴＧＧＣＧＣＴＴＣＴＣＴＧＧＧＴＣＧＴＣ＾ＡＡ
   ＴＣＧ八＾ＣＣＴＴＧ＾八ＣＴＧＣＴＴＣＧＴＡＴＣＴ
   ＣＧＴＴＴＡＧＣＴＴＧＧＡＡＣＴＴＧＡＣＧＡＡＧＣ
   ＡＴ＾ＧＡＧＣＣＴＧＣＴＴＣＴＣＡＴＴＣＡＧＴＣＧ
   ＴＧＧＣＴＧＧＡＧＣＣ＾ＧＡＣＧＡＡＧＡＧＴ八＾Ｇ
   ＴＣＡＧＣＡＣＣＧＡＣＣＴＣＧＧＴＧＴＡＣＡＧＴＴ
   ＣＣＴＧＣＧＴＴＣＧＧＴＴＴＴＣＧＣＡＡＡＣＣＡＴ
   ＧＴＣＡＡＧＧＡＣＧＣＡＡＧＣＣＡ＾＾ＡＧＣＧＴＴ
   ＴＧＴＣＡＣＴＧＧＴＡＴＡＣＧＧＴＧＣＧＴＣＴＧＡ
   ＣＡＧＴＡＡＣＡＧＴＧＡＣＣ＾ＴＡＴＧＣＣＡＣＧＣ
   ＡＧＡＣＴＧＴＣＡＴＴＧＧｎＴＡＣＧＡＣＣＴＧＣＴ
   ＧＡＡＡＧＡＣＣＴＴＧＡＡＧＡＡＣＡＡＡＴＧＣＴＧ
   ＧＡＣＧＡＣＴＴＴＣＴＧＧＡＡＣＴＴＣＴＴＧＧＧＡ
   ＴＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＡＴＧＧＧＴＣＧＣＣＴＧＧＡ
   ＡＣＣＣＴＡＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＴＡＣＣＣＡＧＣＧ
   ＧＡＣＣＴＴＧＡＴＧＧＴＴＣＡＣＣＡＣＧＣＡＣＴＧ
   ＧＴＣＡＧＡＴＣＴＴＣＣＴＡＣＣＡＡＧＴＧＧＴＧＣ
   ＧＴＧＡＣＣＡＧＴＣＴＡクＡＡＧ＾ＡＡＣＡＧＡＣＴ
   ＴＡＣＴＣＣ＾＾ＡＴＴＣＧＡＴＡＣＴＡＡＣＴＴＴＧ
   ＴＣＴＧＡＡＴＧＡＧＧＴＴＴＡＡＧＣＴＡＴＧＡＴＴ
   ＧＴＣＴＣ＾ＴＡＡＣＧＡＴＧＡＴＧＣＴＣＴＧＣＴＧ
   ＡＡＡ＾＾ＣＡＧＡＧＴＡＴＴＧＣＴ＾ＣＴ八ＣＧＡＧ
   ＡＣＧＡＣＴＴＴＴＴＧＴＡＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＴＡ
   ＣＴＧＴＴＴＣＣＧＴ＾＾ＡＧＡＴＡＴＧＣＣＧＧＡＣ
   ＧＡＣ＾ＴＧＡＣＡＡＡＧＧＣＡＴＴＴＣＴ＾ＡＴＧＧ
   ＡＴＡＡＡＧＴＴＧＡＡＡＣＴＴＴＣＣＴＧＣＧＴＡＴ
   ＣＴＡＣＣＴＡＴＴＴＣＡＡＣＴＴＴＧＡＡＡＧＧＡＣ
   ＧＣＡＴＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＴＣＧＴＴＣＴＧＴＴＧ
   ＡＡＧＧＧＴＣＧＴＧＴＣＡＡＧＴＣＡＣＡＧＣＡＡＧ
   ＡＣＡＡＣＴＴＣＣＣＡＧＣＡＣ＾ＧＧＣＴＴＣＴ＾＾
   ■＾Ｇ３゛ ＣＣＧＡＡＧ＾ＴＴ＾ＴＣＡＧＣＴ で表される塩基配列からなる合成ヒト成長ホルモン遺伝
   子である特許請求の範囲第７項記載の［．コリ。 （９）形質転換した組換プラスミドのトリプトファン　
   プロモーター・オペレーターの５゜末端と異種蛋白質を
   コードする辿伝子の３゛末端との間に、アンピシリン耐
   性を発現することのできるＤＮＡシーケンスと組換プラ
   スミドを自己増殖可能とするＤＮＡシーケンスとを含む
   特許請求の範囲第７項または第８項記載の」　コリ。 （１０）形質転換した組換ブラスミドのトリプトフ７ン
   　プロモーター・Ａペレーターが大胆菌由来であり、か
   つそのメッセンジャーＲＮＡ転写開始点までのｍ基配列
   が、 ＡＡＴＴＡＡＧＧＴＮ　’八Ｇ−（Ｎ”）−ｎ ＣＴＣＡ八ＧＧＣＧＣＡＣＴＣＣＣＧＴＴＣＴＧＧ八丁
   八ＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＧＡＧＧＧＣＡＡＧＡＣＣＴ
   ＡＴ八ＴＧＴＴＴＴＴＴＧＣＧＣＣＧＡＣＡＴＣＡ丁Ａ
   八ＣＧＧＴ丁ＣＴＡＣＡＡＡＡＡＡＣＧＣＧＧＣＴＧＴ
   ＡＧＴＡＴＴＧＣＣ八八ＧＴＧＧＣＡ八ＡＴＡ丁ＴＣＴ
   ＧＡ八八ＴＧ八ＧＣ丁ＧＴＴＧＡＣＡＡＣＣＧＴＴＴＡ
   ＴＡＡＧＡＣＴＴ丁ＡＣＴＣＧＡＣＡＡＣＴＧＴＡＴＴ
   ＡＡＴＣＡＴＣＧ八ＡＣＴＡＧＴＴ八ＡＣＴＡＧＴ八Ｃ
   ＧＣ３゜ＴＡＡＴＴＡＧ丁＾ＧＣＴＴＧＡＴＣＡ＾ＴＴ
   ＧＡＴＣ＾ＴＧＣＧ（式中ＮはＡ、Ｇ，Ｃまたは■を表
   し、Ｎ゜はその相補塩基を表し、ｎは約１６０ないし約
   １８０の整数を表す）で表される塩基配列を持つもので
   ある特許請求の範囲第７項ないし第９項のいずれかの項
   記載』．コリ。 （１１）形質転換した組換ブラスミドのトリプトフ７ア
   ン　プロモーター・オペレーターの５゛末端と巽種蛋白
   質を］一ドする遺伝子の３゛末端との間のＯＮ＾シーケ
   ンスがｐＢＲ　３２２由来である特許請求の範囲第９項
   まノこは第１０項記載の１．コリ。 （１２）　ｐＢＲ　３２２由来のＤＮＡシーケンスがｐ
   ＢＲ　３２２の制限地図上ＩＥｃｏＲ　Ｉ認識部位の中
   心の＾（相補鎖については■）から反時計方向へ向って
   Ｓａｔ　Ｔ開裂部位の１（相補鎖についてはＧ　まで）
   の３７１２塩基鎖（相補鎖については３７０８塩基鎖）
   に相当するシーケンスである特許請求の範囲第１１項記
   載の１．コリ。 （１３）メッセンジャーＲＮＡ転写開始点より蛋白質を
   コードする塩基配列の翻訳開始点までのｕｉｕ；ｉ配列
   が ５゜八ＡＧＴＴＣ八ＣＧＴ＾Ａ八ＡＡＧＧＧ−　Ｘ　−
   ＾ＴＣＧＡＴ３゜ＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡＴＴＴＴＴＣＣ
   Ｃ−　Ｘ’　−　ＴＡＧＣＴＡ（式中ＸはＴ，Ｔ八、■
   八ＴＣまたはＴＡＴＣＧＡを表し、Ｘ゜はその相補塩基
   または相補塩基鎖であるＡ　，　ＡＴ，ＡＴＡＧまたは
   ＡＴ八ＧＣＴを表ず）で表されるＤＮＡシーケンスを有
   する細菌由来のトリプトファン　プロモーター・オペレ
   ーターと、このＤＮＡシーケンスの３゜下流に続く異種
   蛋白質をコードする遺伝子を含み、大腸菌中で、自己増
   殖可能でかつその異種蛋白質を発現することのできる組
   換プラスミドを細胞内に保有する、形質転換された』．
   ］りを栄養培地に培養してヒト成長ホルモンを菌体内に
   蓄積させ、これを採取すること、を特徴とするヒト成長
   ホルモンの製造方法。 （１４）異種蛋白質をコードする遺伝子が”　ＡＴＧＴ
   ＴＣＣＣＡＡＣＴＡＴＴＣＣＡＣＴＧＡＧＴＣＧＣＣＴ
   ＧＴＡＣＡＡＧＧＧＴＴＧＡＴＡＡＧＧＴＧＡＣＴＣＡ
   ＧＣＧＧＡＣＴＴＣＧＡＴ八八ＣＧＣＧ八ＴＧＣＴＧＣ
   ＧＴＧＣＧＣＡＴ（，ＧＴＡＡＧＣＴ八ＴＴＧＣＧＣＴ
   ＡＣＧ八ＣＧＣ八ＣＧＣＧＴＡＧＣ八ＣＴＧＣＡＣＣ八
   八ＣＩ’ＧＧＣＴＴＴＣＧＡＣＡＣＴＴ＾ＣＣＡＧＧＡ
   ＣＧＴＧＧＴＴＧＡＣＣＧＡＡ八ＧＣＴＧＴＧＡＡＴＧ
   ＧＴＣＧＡＧＴＴＣＧＡＡＧ八八ＧＣＡＴ＾Ｃ八ＴＣＣ
   ＣＧＡ八＾ＧＡ八ＣＴＣＡＡＧＣＴＴＣＴＴＣＧＴ八Ｔ
   ＧＴＡＧＧＧＣＴＴＴＣＴＴＣＡＧ＾＾＾■＾ＣＡＧＣ
   ＴＴＣＣＴＴＣＡＧＡＡＣＣＣＡＣ八ＧＧＴＣＴＴＴＡ
   ＴＧＴＣＧＡ八ＧＧＡＡＧＴＣＴＴＧＧＧＴＧＴＣＡＣ
   ＣＴＣＧＴＴＧＴＧＴＴＴＣＴＣＴＧＡＡＡＧＴＡＴＣ
   ＣＣＧＴＧＧＡＧＣＡＡＣＡＣＡ＾＾ＧＡＧＡＣＴＴＴ
   ＣＡＴＡＧＧＧＣ＾Ｃ　ＣＣＣＴ　ＴＣ　ＴＡ　Ａ　Ｃ
   ＣＧＣＧＡＡ　Ｇ　Ａ　ＧＡ　Ｃ　Ｃ　ＣＡ　ＧＣ　Ａ
   　ＧＴＧＧＧＧＡＡＧＡＴＴＧＧＣＧＣＴＴＣＴＣＴＧ
   ＧＧＴＣＧ丁ＣＡＡＡＴＣＧＡＡＣＣＴＴＧＡＡＣＴＧ
   ＣＴＴＣＧＴＡＴＣＴＣＧＴＴＴＡＧＣＴＴＧＧＡＡＣ
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   ＣＡＧＧＣＴＴＣＴＡ八ＴＡＧ３゜ ＣＣＧＡＡＧＡＴＴＡＴＣ八ＧＣＴ で表される塩基配列からなる合成ヒト成長ホルモン遺伝
   子である、組換ブラスミドを有するＪ　コリを用いる特
   許請求の範囲第１３項記載の製造方法。 （１５）　ｌ−リブトフアン　プロモーター・オペレー
   ターの５゜末端と巽種蛋白質をコードする遺伝子の３゛
   末端との間に、アンビシリン耐性を発現することのでき
   るＤＮＡシークンスど組換プラスミドを自己増殖可能と
   りるＤＮ八シーケンスとを含む絹換ブラスミドを有する
   ユ．コリを用いる特許請求の範囲第１３項または第１４
   項記載の製造方法。 （１６）トリプトフ７ン　プロモーター・オペレーター
   が大菌由来であり、かつそのメッセンジャーＲＮＡ転写
   開始点まＣの塩基配列が、 ＡＡＴＴＡＡＧＧＴＮ　’八Ｇ−（Ｎ’）．−ＣＴＣＡ
   八ＧＧＣＧＣ八ＣＴＣＣＣＧＴＴＣＴＧＧＡＴ＾ＧＡＧ
   ＴＴＣＣＧＣＧＴＧ八ＧＧＧＣＡＡＧＡＣＣＴ八■ＡＴ
   ＧＴＴＴＴＴＴＧＣＧＣＣＧ八ＣＡＴＣ＾ＴＡＡＣＧＧ
   １’ＴＣＴＡＣＡＡ八八ＡＡＣＧＣＧＧＣＴＧＴＡＧＴ
   八ＴＴＧＣＣ八ＡＧＴＧＧＣＡＡＡＴ八ＴＴＣＴＧＡＡ
   ＾ＴＧＡＧＣＴＧ１’ＴＧＡＣ八ＡＣＣＧ■■■ＡＴＡ
   ＡＧＡＣＴＩＴＡＣＴＣＧＡＣ八八ＣＴＧＩＡＴＴ＾Ａ
   ＴＣ八ＴＣＧ八八ＣＴＡＱＴＴ八八ＣＴ八ＧＴＡＣＧＣ
   ’ＴＡＡＴＴ八ＧＴＡＧＣＴＴＧ＾ＴＣＡＡＴＴＧＡＴ
   Ｃ八ＴＧＣＧ（式中ＮはＡ１Ｇ，Ｃまたは■を表し、Ｎ
   ゜はその相補塩基を表し、ｎは約１６０ないし約１８０
   の整数を表す）で表される塩基配列を持つ組換プラスミ
   ドを有する』．コリを用いる特許請求の範囲第１３項な
   いし第１５項のいずれかの項記載の製造方法。 （１１）トリプトフアン　プロモーター・オペレーター
   の５゜末端と異種蛋白質をコードする遺伝子の３゜末端
   との間のＤＮＡシーケンスがｐＢ８　３２２由来である
   組換プラスミドを有づるＪ　コリを用いる特許請求の範
   囲第１５項まＩ〔は第１６項記載の製造方法。 （１８）　ｐＢＲ　３２２由来のＤＮＡシーケンスがｐ
   ＢＲ　３２２の制限地図上［ｃｏＲ　Ｉ　ｍ識部位の中
   心のＡ（相補鎖については■）から反時計方向へ向って
   Ｓａｔ　１開裂部位の１（相補鎖についてはＧ　まで）
   の３７１２塩基鎖（相補鎖については３７０８塩基鎖）
   に相当するシーケンスである組換プラスミドを有する［
   ．コリを用いる特許請求の範囲第１７項記載の製造方法
   。