JPS584799A - 成熟ソ−マチンの遺伝暗号を有するｄｎａ配列 - Google Patents
成熟ソ−マチンの遺伝暗号を有するｄｎａ配列Info
- Publication number
- JPS584799A JPS584799A JP56200803A JP20080381A JPS584799A JP S584799 A JPS584799 A JP S584799A JP 56200803 A JP56200803 A JP 56200803A JP 20080381 A JP20080381 A JP 20080381A JP S584799 A JPS584799 A JP S584799A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- thaumatin
- dna
- sequence
- linker
- plasmid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
- C07K14/43—Sweetening agents, e.g. thaumatin, monellin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は完成（ｍａｔｕｒθ ）ソーマチンの各種対立
遺伝子形を暗号化するＤＮＡ配列および前記ＤＮＡ配列
を包含するクローニング媒質、および転換された微生物
におけるそれらの使用に関する０ ソーマチンはタウマドコツカス・ダニエリ（Ｔｈａｕｍ
ａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄａｎｉｅｌｌｉｉ ） の
果実の仮種皮に由来するタンパク質である。ソーマチン
は重量基準でショ糖より１６００倍甘く、分子基準では
ショ糖より１０５倍甘い。西部社会において、ショ糖の
とり過きは多くの健康問題を起こしている。
遺伝子形を暗号化するＤＮＡ配列および前記ＤＮＡ配列
を包含するクローニング媒質、および転換された微生物
におけるそれらの使用に関する０ ソーマチンはタウマドコツカス・ダニエリ（Ｔｈａｕｍ
ａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄａｎｉｅｌｌｉｉ ） の
果実の仮種皮に由来するタンパク質である。ソーマチン
は重量基準でショ糖より１６００倍甘く、分子基準では
ショ糖より１０５倍甘い。西部社会において、ショ糖の
とり過きは多くの健康問題を起こしている。
それ故にショ糖の代りに低カロリー甘味料を用いる多く
の試みがなされている。しかしこれらの幾つかはありう
る副作用からみて最近禁止された。
の試みがなされている。しかしこれらの幾つかはありう
る副作用からみて最近禁止された。
従って、天然の低カロリー甘味料に対する、そしてこの
ような甘味料の経済的製造法に対する要求がある。分子
生物学における耀近の進歩は特別な真核生物タンパク質
を暗号化する構造遺伝子を微生物宿主細胞中に導入し、
前記遺伝子を形質転換された宿主細胞中で表現させ、そ
れにより望むタンパク質を生産することを可能にした。
ような甘味料の経済的製造法に対する要求がある。分子
生物学における耀近の進歩は特別な真核生物タンパク質
を暗号化する構造遺伝子を微生物宿主細胞中に導入し、
前記遺伝子を形質転換された宿主細胞中で表現させ、そ
れにより望むタンパク質を生産することを可能にした。
自然の状態でタンパク質をそれらの未修飾形で暗号化す
る真核生物由来の多くの遺伝子は組換えＤＮＡ分子にそ
のま″＞適用できない。それは自然の遺伝子は伝令ＲＮ
Ａ （ｍＲＮＡ） に金談れていないイントロンと
呼ばれるＤＮＡ配列を含むからである。これらイントロ
ンに置かれた情報はｍＲＮＡの翻訳過程前に真核生物細
胞中に移される。本発明者が知る限り、細菌はこのよう
なイントロンをＲＮＡレベルで除去することができず、
それ故に真核生物の自然の遺伝子を原核生物の宿主細胞
に使用できる前にＲＮＡレベルでこれらイントロン上に
置かれた遺伝情報を除去する必要がある。
る真核生物由来の多くの遺伝子は組換えＤＮＡ分子にそ
のま″＞適用できない。それは自然の遺伝子は伝令ＲＮ
Ａ （ｍＲＮＡ） に金談れていないイントロンと
呼ばれるＤＮＡ配列を含むからである。これらイントロ
ンに置かれた情報はｍＲＮＡの翻訳過程前に真核生物細
胞中に移される。本発明者が知る限り、細菌はこのよう
なイントロンをＲＮＡレベルで除去することができず、
それ故に真核生物の自然の遺伝子を原核生物の宿主細胞
に使用できる前にＲＮＡレベルでこれらイントロン上に
置かれた遺伝情報を除去する必要がある。
ｍＲＮＡレベルでイントロンを除去する能力を有する微
生物宿主細胞において、自然の遺伝子を原理上適用でき
るが、それはこれらが前記微生物宿主細胞中で有効であ
るレギユロンの支配下に撫かれる限りにおいてである。
生物宿主細胞において、自然の遺伝子を原理上適用でき
るが、それはこれらが前記微生物宿主細胞中で有効であ
るレギユロンの支配下に撫かれる限りにおいてである。
本発明においては、真核生物由来の、特に植物由来の遺
伝情報を微生物の特に細菌の宿主細胞中で表現が効果的
に起こるような状態で導入する組換えＤＮＡ技術を使用
する。
伝情報を微生物の特に細菌の宿主細胞中で表現が効果的
に起こるような状態で導入する組換えＤＮＡ技術を使用
する。
本発明をよりよく理解するため、記述中で用いた最も重
要な用藺を定義することにする。
要な用藺を定義することにする。
レギユロンはプロモーターとオベレー・ター領域からな
るＤＮＡ配列である。
るＤＮＡ配列である。
構造遺伝子は鋳型（ｍＲＮＡ） を通して特別なポリ
ペプチドに特治のアミノ酸配列を暗号化するＤＮＡ配列
である。
ペプチドに特治のアミノ酸配列を暗号化するＤＮＡ配列
である。
プロモーターはＲＮＡポリメラーゼが転写の開始のため
結合するレギユロン内のＤＮＡ配列である。
結合するレギユロン内のＤＮＡ配列である。
オペレーターはリルッサータンパク質が結合し、従って
ＲＮＡポリメラーゼが隣接プロモーターへ結合するのを
妨げるレギユロン内のＤＮＡ配列である。
ＲＮＡポリメラーゼが隣接プロモーターへ結合するのを
妨げるレギユロン内のＤＮＡ配列である。
誘導物質はリプレッ廿−タンパク質を不活性化し、オペ
レーターを自由にし、そしてＲＮＡポリメラーゼをプロ
モーターへ結合させて転写を開始させる物質である。
レーターを自由にし、そしてＲＮＡポリメラーゼをプロ
モーターへ結合させて転写を開始させる物質である。
完成ソーマチンとは完全に修飾されたタンパク質（佐吠
Ａ ）の対立遺伝子形の一つを意味する。
Ａ ）の対立遺伝子形の一つを意味する。
クローンニング媒質 適当な宿主細胞への転換後自己複
製を許すＤＮＡ配列（完全なレプリコン）を包含する非
染色体二本鎖ＤＮＡシラスミドまたはファージ。
製を許すＤＮＡ配列（完全なレプリコン）を包含する非
染色体二本鎖ＤＮＡシラスミドまたはファージ。
ファージまたはバクテリオファージ 適当な細菌宿主細
胞中で複製できる細菌性ウィルス。
胞中で複製できる細菌性ウィルス。
解読わ（ｍＲＮＡ レベルでコドンからポリペプチド
への同右の翻訳が起こるようなわくへ３個ひと続きのヌ
クレオチド（コドン）の集合−（／列 遺伝子からＲ
ＮＡをつくる過程。
への同右の翻訳が起こるようなわくへ３個ひと続きのヌ
クレオチド（コドン）の集合−（／列 遺伝子からＲ
ＮＡをつくる過程。
ｓｙ ｍＲＮＡからポリペプチドをつくる過程。
表現 ポリペプチドをつくるため構造遺伝子により受け
る過程。これは少なくとも転写と翻訳とを含む多くの過
程の結合である。
る過程。これは少なくとも転写と翻訳とを含む多くの過
程の結合である。
完成ソーマチン遺伝子とは、完全に処理された（完成し
た）形でソーマチンの種々な対立遺伝子を暗号化する伝
令ＲＮＡの部分と正確に同じ情報含有榴（コドンの配列
順序）を有する二本ｄｌＤＮＡ配列を意味する。便利さ
だけの理由でａｓ Ｄ Ｎ Ａの一本鎖だけを本文なら
びに図面に示した。
た）形でソーマチンの種々な対立遺伝子を暗号化する伝
令ＲＮＡの部分と正確に同じ情報含有榴（コドンの配列
順序）を有する二本ｄｌＤＮＡ配列を意味する。便利さ
だけの理由でａｓ Ｄ Ｎ Ａの一本鎖だけを本文なら
びに図面に示した。
対立遺伝子形をコード化する構造１−伝子（１１）
前記構造遺伝子の表現を調節する特別なりＮＡ配列 を包含する組換えプラスミドが提供される。これら特別
なりＮＡ配列は誘導可能または構成的なレギユロンの何
れかからなる。特に適当な誘導可能レイユロンはディー
、ブイ、ゴデル（Ｄ、Ｖ、 Ｇｏｅ−ａａｅｌ）等、Ｎ
ａｔｕｒｅ ２８１ 、５４４−５４８ （１９７８）
により記述された二重１ａｃ ＵＶ ５系からなる。
前記構造遺伝子の表現を調節する特別なりＮＡ配列 を包含する組換えプラスミドが提供される。これら特別
なりＮＡ配列は誘導可能または構成的なレギユロンの何
れかからなる。特に適当な誘導可能レイユロンはディー
、ブイ、ゴデル（Ｄ、Ｖ、 Ｇｏｅ−ａａｅｌ）等、Ｎ
ａｔｕｒｅ ２８１ 、５４４−５４８ （１９７８）
により記述された二重１ａｃ ＵＶ ５系からなる。
目８ 埒叩 宥ご まに 目ギ
目８Ｉ 開部 恣べ 焔舅 トｘ 差回路？
１屍 部ｌ シ炬 汐１ 首足
１騎 ＢＲＥ２ 日Ｍ Ｈｉ 円革韮
ａＦ ＥＭ 閂Ｈ■ 窪目罐８ 目６
沼６ 固６ にｉ 路定臣８
四ご 臣８ 吊と ≦淀 臣と■
ＥＨＷｆｌ、ｊｆｌ 短墓 斃諸円詫 汐炬
罐８ 目８ ＝わ 架ギ鰭躍
日？ 自己 餌８ 旨８ ８８−日
−（Ｊ Ｅ−１−υＥ−切Ｈ山Ｑのト
じυ Ｈ＜ ＜Ｃり 自ト
〉じ６Ｍ ｉ４０ ５５ 間両 計
畳墓■ １ ■ 已屍 岬ｉ：ｉ ！ｉ’
：論乏 目８ 目上 垢８ 目６
目８畦 畦 ：；：ｊ Ｂ ＊ ｉｊ
ｕ ：； ３ツＨ出躍 ８＜ く。 襲藁 日ミ 目躍
日ギ目自 目８ 目８ 目８ に８
深炬ビ く 足 畦 Ｉ ｌ ■ 口承 わｇ 潤百 謳ビ ｐＣりｕ Ｏｃｐ Ｚ○目目
むｔ に８ 埒訃 Ｉ認 に旨 Ｃ２朗其 １ 開扉 ｉｆ、Ｅ ｍＵ 瞑Ｏ臼Ｑ 部じ −じ 自Ｏφ＜＜＜ じじ む？ 円屍 ≦１ 臣８ ≦淀 ≦淀 園ビ 誤８ ＱＱ ｕＵ 山Ｅ−１ｕｈ目目
まに まに 田藁 げ乾 ■ 複属 珪 −Ｑ 削Ｕ 部じ Ｌ
Ａ〇−ト エυ 国Ｑ 工Ｏ ト１＜Ｅ−１＜ωトドく Ω−Ｏ切Ｕ 部０ ηＱψ く ｇｃｔｖ （ＪＥ−１ｈｅ
ｈ＜１ 翻 ■ Ｉ ＜リ へＥ＠ 氏Ｕ
ψじ く。
目８Ｉ 開部 恣べ 焔舅 トｘ 差回路？
１屍 部ｌ シ炬 汐１ 首足
１騎 ＢＲＥ２ 日Ｍ Ｈｉ 円革韮
ａＦ ＥＭ 閂Ｈ■ 窪目罐８ 目６
沼６ 固６ にｉ 路定臣８
四ご 臣８ 吊と ≦淀 臣と■
ＥＨＷｆｌ、ｊｆｌ 短墓 斃諸円詫 汐炬
罐８ 目８ ＝わ 架ギ鰭躍
日？ 自己 餌８ 旨８ ８８−日
−（Ｊ Ｅ−１−υＥ−切Ｈ山Ｑのト
じυ Ｈ＜ ＜Ｃり 自ト
〉じ６Ｍ ｉ４０ ５５ 間両 計
畳墓■ １ ■ 已屍 岬ｉ：ｉ ！ｉ’
：論乏 目８ 目上 垢８ 目６
目８畦 畦 ：；：ｊ Ｂ ＊ ｉｊ
ｕ ：； ３ツＨ出躍 ８＜ く。 襲藁 日ミ 目躍
日ギ目自 目８ 目８ 目８ に８
深炬ビ く 足 畦 Ｉ ｌ ■ 口承 わｇ 潤百 謳ビ ｐＣりｕ Ｏｃｐ Ｚ○目目
むｔ に８ 埒訃 Ｉ認 に旨 Ｃ２朗其 １ 開扉 ｉｆ、Ｅ ｍＵ 瞑Ｏ臼Ｑ 部じ −じ 自Ｏφ＜＜＜ じじ む？ 円屍 ≦１ 臣８ ≦淀 ≦淀 園ビ 誤８ ＱＱ ｕＵ 山Ｅ−１ｕｈ目目
まに まに 田藁 げ乾 ■ 複属 珪 −Ｑ 削Ｕ 部じ Ｌ
Ａ〇−ト エυ 国Ｑ 工Ｏ ト１＜Ｅ−１＜ωトドく Ω−Ｏ切Ｕ 部０ ηＱψ く ｇｃｔｖ （ＪＥ−１ｈｅ
ｈ＜１ 翻 ■ Ｉ ＜リ へＥ＠ 氏Ｕ
ψじ く。
ミ８ 埒百 固定 シ坏 罐８む？
埒叩 臣８ 冑百 目躍ＱＯω（Ｊ
＋ｏ りａ ｏｈ瓢８ む已
目８ 目８ 臣８罐旨 ≦Ｕ 瞭
８ ゴ？ 看８＞Ｑ ｃ＋Ｌｖｕｈ
＞Ｑ （ＪＥ−１目８ 目８ シ矩
にｉ 圧目ＯＵ −〇
２■ 部ト −ト瓢８ 目
８ ｌ８ （支）浣 円躍責ｅＭ ＥＮ
ｉＨ苺ｌ 芥と 巨ｄ属＃
特開昭５８−４７９９（４）栖吹Ａは（完成）ソ
ーマチンのアミノ酸配列と長 ＤＮＡ配列を示す。ａ−ＡＢはソーマチン遺伝子におけ
る対立型変異を示す。
埒叩 臣８ 冑百 目躍ＱＯω（Ｊ
＋ｏ りａ ｏｈ瓢８ む已
目８ 目８ 臣８罐旨 ≦Ｕ 瞭
８ ゴ？ 看８＞Ｑ ｃ＋Ｌｖｕｈ
＞Ｑ （ＪＥ−１目８ 目８ シ矩
にｉ 圧目ＯＵ −〇
２■ 部ト −ト瓢８ 目
８ ｌ８ （支）浣 円躍責ｅＭ ＥＮ
ｉＨ苺ｌ 芥と 巨ｄ属＃
特開昭５８−４７９９（４）栖吹Ａは（完成）ソ
ーマチンのアミノ酸配列と長 ＤＮＡ配列を示す。ａ−ＡＢはソーマチン遺伝子におけ
る対立型変異を示す。
もう一つの適当な誘導可能レギユロンはエフ。
リ − （’Ｆ 、 Ｌｅｅ ） 等、 Ｊ
’、 Ｍｏｌ、 Ｂｉｏｌ、 １２１ 、
１９５〜２１７ （１９７８） およびケイ、バート
ラン１（Ｋ。
’、 Ｍｏｌ、 Ｂｉｏｌ、 １２１ 、
１９５〜２１７ （１９７８） およびケイ、バート
ラン１（Ｋ。
Ｂｅｒｔｒａｎｄ ）等、ＥｉＣｉｅｎＣ８１８９，２
２〜２６ （１９７５）により記述されたトリプトファ
ン系の構成成分である。本発明者はこのトリプトファン
系を修正して第１図記寸・！、の一層適当な系を得た。
２〜２６ （１９７５）により記述されたトリプトファ
ン系の構成成分である。本発明者はこのトリプトファン
系を修正して第１図記寸・！、の一層適当な系を得た。
この修正された系においで、トリプトファン アツテニ
ュエータータンパク質をコード化する情報は除かれる一
カリポソーム結合部位を保っている。
ュエータータンパク質をコード化する情報は除かれる一
カリポソーム結合部位を保っている。
本発明による絹換えプラスミドはバタテリオファージＭ
１３、ｆｌのｆｄ、の遺伝子■ｌｌの 修正タンパク顎
／リボンーム結合部位からなるＤ Ｎ Ａ配列を包含す
る〔ビー、エム、ジー、エフ、ファンウエーセ゛ンビー
ク（Ｐ ０Ｍ 、 Ｇ 、 Ｆ 、 ｖａｎ Ｗｅｚ
ｅｎｂｅｅｋ）等、 Ｇｅｎ８１１．１２９〜１４８
（１９８０） ）、そしテコノものは本出舶者の知る限
り真核生物遺伝子の表現１ に未だ使われていない。
１３、ｆｌのｆｄ、の遺伝子■ｌｌの 修正タンパク顎
／リボンーム結合部位からなるＤ Ｎ Ａ配列を包含す
る〔ビー、エム、ジー、エフ、ファンウエーセ゛ンビー
ク（Ｐ ０Ｍ 、 Ｇ 、 Ｆ 、 ｖａｎ Ｗｅｚ
ｅｎｂｅｅｋ）等、 Ｇｅｎ８１１．１２９〜１４８
（１９８０） ）、そしテコノものは本出舶者の知る限
り真核生物遺伝子の表現１ に未だ使われていない。
本発明による絹換えプラスミドにおいて、レギユロンは
構造遺伝子に的接結合するこさもあれば、ヌクレオチド
順序ＣＡＴ （Ｎ）ｎＧＡＡＴＴＯ（Ｎ’）ｎＡＴＧ
（式％式％ よびＮ′はヌクレオチドＡ、Ｔ、ＧまたはＯの何れかで
あるか、たたし二本鎖構造にもいてＮとＮ′は同転対称
構造が存在する。ようなものであることを条件とする）
からなるＤ Ｎ Ａ リンカ−を含む新親出発コドンお
よびＥｃ ｏＲエニー位を介して間１号的に結合するこ
さもある。
構造遺伝子に的接結合するこさもあれば、ヌクレオチド
順序ＣＡＴ （Ｎ）ｎＧＡＡＴＴＯ（Ｎ’）ｎＡＴＧ
（式％式％ よびＮ′はヌクレオチドＡ、Ｔ、ＧまたはＯの何れかで
あるか、たたし二本鎖構造にもいてＮとＮ′は同転対称
構造が存在する。ようなものであることを条件とする）
からなるＤ Ｎ Ａ リンカ−を含む新親出発コドンお
よびＥｃ ｏＲエニー位を介して間１号的に結合するこ
さもある。
回転対称構造とはＮが例えばＡにより表わされる１礪合
、Ｎ′は相袖的地基Ｔにより表わされねばならないこと
を音吐する。
、Ｎ′は相袖的地基Ｔにより表わされねばならないこと
を音吐する。
ある場合には、レギユロンと構造遺伝子との間の１１０
序ＡＡＴＴが除去されたとき表甲の収量が白土するとい
うことになる。
序ＡＡＴＴが除去されたとき表甲の収量が白土するとい
うことになる。
本発明による完成（完全に修飾された）ソーマチンの各
種対立遺伝子形を暗月に直す構造遺伝子を含む微生物ク
ローニング＃質が得られ、種々なソーマチンが幾つかの
工程を実行することにより生産されるが、そのうぢ最も
本質的なものは次の通りである： ｎｌ ソーマチンの伝令ＲＮ Ａ （ｍＲＮＡ）の学
齢およ精製、 ｆ２１ このｍＲＮＡから二本鎖ＤＮＡ（ｄｅＤＮＡ
）への転換、 （３） ポリーｄｏ尾を有するｄｓＤＮＡの組立て、
（４＋ ７１８ ＤＮＡ−ポリーａＣ分子のエンド
ヌクレアーゼＰｓｔニー開裂およびポＩＪ −ｃｌＧ−
尾プラスミドｐＢＲ３２２Ｄ Ｎ Ａへの加入、（５）
転換とクローン選択、 （６１ＲＮＡ／ＤＮＡ 交雑および生体外翻訳による挿
入部の性質の決定、 Ｔ７１ＤＮＡおよびＲＮＡ配列の分析による挿入部の性
質の二１チェック、 （８）完成の完全に修飾されたソーマチンを暗号化する
ＤＮＡを製造、 （９）％別な転写８組節ＤＮＡ間列を包含するプラスミ
ドの組立て、およびＤ Ｎ Ａ −ＩＪンカーおよびＤ
ＮＡ−プライマーの化学的合成、 （Ｈｌ・ 構成的または誘導可能レギユロンおよび結ば
れたソーマチン遺伝子を包含するプラスミドの組立て、
および該プラスミドによるＥ 、ｃｏｌｉ の転換、 ０１）前記組換えフ０ラスミドを含むＪ ｃｏｌｉ細胞
の培養、およびソーマチンの検出と単離。
種対立遺伝子形を暗月に直す構造遺伝子を含む微生物ク
ローニング＃質が得られ、種々なソーマチンが幾つかの
工程を実行することにより生産されるが、そのうぢ最も
本質的なものは次の通りである： ｎｌ ソーマチンの伝令ＲＮ Ａ （ｍＲＮＡ）の学
齢およ精製、 ｆ２１ このｍＲＮＡから二本鎖ＤＮＡ（ｄｅＤＮＡ
）への転換、 （３） ポリーｄｏ尾を有するｄｓＤＮＡの組立て、
（４＋ ７１８ ＤＮＡ−ポリーａＣ分子のエンド
ヌクレアーゼＰｓｔニー開裂およびポＩＪ −ｃｌＧ−
尾プラスミドｐＢＲ３２２Ｄ Ｎ Ａへの加入、（５）
転換とクローン選択、 （６１ＲＮＡ／ＤＮＡ 交雑および生体外翻訳による挿
入部の性質の決定、 Ｔ７１ＤＮＡおよびＲＮＡ配列の分析による挿入部の性
質の二１チェック、 （８）完成の完全に修飾されたソーマチンを暗号化する
ＤＮＡを製造、 （９）％別な転写８組節ＤＮＡ間列を包含するプラスミ
ドの組立て、およびＤ Ｎ Ａ −ＩＪンカーおよびＤ
ＮＡ−プライマーの化学的合成、 （Ｈｌ・ 構成的または誘導可能レギユロンおよび結ば
れたソーマチン遺伝子を包含するプラスミドの組立て、
および該プラスミドによるＥ 、ｃｏｌｉ の転換、 ０１）前記組換えフ０ラスミドを含むＪ ｃｏｌｉ細胞
の培養、およびソーマチンの検出と単離。
下肥の詳細な記述は本発明を印明するものである。
痔を液体窒素下で粉砕する。フェノールでのタンパク制
柚ｌ：）Ｉ後、ケイ。ニス、カービイ（Ｋ、Ｓ。
柚ｌ：）Ｉ後、ケイ。ニス、カービイ（Ｋ、Ｓ。
Ｋｉｒｂｙ ） （１９６５） Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｊ
、 ９６．２６６〜２６９、ニー、ライ−がビス（Ｕ、
Ｖｌ／ｉｅｇｅｒｓ ）およびエッチ、ヒルッ（Ｈ，
Ｈ１］ｚ ） ＦＫＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２３ 。
、 ９６．２６６〜２６９、ニー、ライ−がビス（Ｕ、
Ｖｌ／ｉｅｇｅｒｓ ）およびエッチ、ヒルッ（Ｈ，
Ｈ１］ｚ ） ＦＫＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２３ 。
７７〜８２により記述された手順に従いＬｉＯ４による
ＲＮＡの選択的沈殿を行なう。伝令ＲＮＡを含むポリ−
Ａをオリゴ−ｄ、Ｔ−セルロースカラム上に何回か通す
ことにより回収し、このメツセンジ４ ヤー混合物からソーマチン−暗号化ｍＲＮＡをポリアク
リルアミドデル電気泳動により単離する。これをエッチ
、アビブ（Ｈ，Ａｖｉｖ ）およびビー、レーダー（Ｐ
、 Ｌｅｄｅｒ ） （１９７２）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、Ａｃａａ。
ＲＮＡの選択的沈殿を行なう。伝令ＲＮＡを含むポリ−
Ａをオリゴ−ｄ、Ｔ−セルロースカラム上に何回か通す
ことにより回収し、このメツセンジ４ ヤー混合物からソーマチン−暗号化ｍＲＮＡをポリアク
リルアミドデル電気泳動により単離する。これをエッチ
、アビブ（Ｈ，Ａｖｉｖ ）およびビー、レーダー（Ｐ
、 Ｌｅｄｅｒ ） （１９７２）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、Ａｃａａ。
Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、 Ａ、６９．１４０８〜１４１２およ
びジエー、ダブリュー、ディピース（Ｊ、Ｗ、 Ｄａｖ
ｉｅｓ ）およびビー、カエスベルグ（Ｐ、 Ｋａｅｓ
ｂｅｒｇ） （１９７３）、Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、１２．
１４３４〜１４４１により記述されたように小麦胚系で
ｍＲＮＡの翻訳によりチェックする。
びジエー、ダブリュー、ディピース（Ｊ、Ｗ、 Ｄａｖ
ｉｅｓ ）およびビー、カエスベルグ（Ｐ、 Ｋａｅｓ
ｂｅｒｇ） （１９７３）、Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、１２．
１４３４〜１４４１により記述されたように小麦胚系で
ｍＲＮＡの翻訳によりチェックする。
２、 ソーマチンｍＲＮＡから二本＠ Ｄ Ｎ Ａへの
変換精製ソーマチンｍＲＮＡをジー、エヌ、プエル（Ｇ
、Ｎ、 Ｂｕｅｌ ）等、Ｊ、 Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、
２５３．２４７１〜２４８２ （１９７８）により記述
された手順に従い、ＡＭＶ逆伝写で複写して一本鎖ＤＮ
Ａ分子をつくる。こ（１：） ｃＤＮＡ をその拶ニー
、アール、ディビス（Ａ。
変換精製ソーマチンｍＲＮＡをジー、エヌ、プエル（Ｇ
、Ｎ、 Ｂｕｅｌ ）等、Ｊ、 Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、
２５３．２４７１〜２４８２ （１９７８）により記述
された手順に従い、ＡＭＶ逆伝写で複写して一本鎖ＤＮ
Ａ分子をつくる。こ（１：） ｃＤＮＡ をその拶ニー
、アール、ディビス（Ａ。
Ｒ，Ｄａｖｉｓ ） ％、Ｇｅｎθ１０．２０５〜２１
８ （１９８［１）により記述された手順に従い、１５
ｃｏｌｉ Ｄ Ｎ Ａ −ポリメラーゼにより二本
鎖分子に変える。この二本鎖ＤＮＡ捨写のループ構造を
８１−ヌクレアーゼ消化により除く。
８ （１９８［１）により記述された手順に従い、１５
ｃｏｌｉ Ｄ Ｎ Ａ −ポリメラーゼにより二本
鎖分子に変える。この二本鎖ＤＮＡ捨写のループ構造を
８１−ヌクレアーゼ消化により除く。
１ ベ
ロ ポリ−６０尾を有する二本Ｑ Ｄ Ｎ Ａの組立て
望む長さのＤＮＡ分子はアール、ロイチョウ１ζフリイ
（ＲｏＲｏｙｃｈ、０ｕｄｈｕｒｙ ）等、Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ ３．８６６〜８７
７ （１９７６）により記述された手順に従い、ポリア
クリルアミドヶゞルー電気泳動、ケゝルからの抽出、お
よび末端トランスフェラーゼによるボＩＪ ｄｏでの尾
部結合により得られる。
望む長さのＤＮＡ分子はアール、ロイチョウ１ζフリイ
（ＲｏＲｏｙｃｈ、０ｕｄｈｕｒｙ ）等、Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ ３．８６６〜８７
７ （１９７６）により記述された手順に従い、ポリア
クリルアミドヶゞルー電気泳動、ケゝルからの抽出、お
よび末端トランスフェラーゼによるボＩＪ ｄｏでの尾
部結合により得られる。
４ プラスミドｐＢＲ３２２におけるｄｓ Ｄ Ｎ Ａ
−ｄ。
−ｄ。
分子の統合
フ０ラスミドｐＢＲ３２２をβ−ラクタマーーＶ遺伝子
にある識別部位のところでプラスミドを開裂する制β１
・・エンドヌクレアーセ゛’ Ｐｅｔ工 で処理し、そ
の後ｐＢＲろ２２の直線化されたＤＮＡＫポリ−６０尾
を末端トランスフェラーゼ゛により供給する。このボＩ
Ｊ −ｄ、０尾をつけたＤＮＡ分子をアニールしてポリ
ーｄＧ尾をつけたプラスミド１）ＢＲ３２２とする。
にある識別部位のところでプラスミドを開裂する制β１
・・エンドヌクレアーセ゛’ Ｐｅｔ工 で処理し、そ
の後ｐＢＲろ２２の直線化されたＤＮＡＫポリ−６０尾
を末端トランスフェラーゼ゛により供給する。このボＩ
Ｊ −ｄ、０尾をつけたＤＮＡ分子をアニールしてポリ
ーｄＧ尾をつけたプラスミド１）ＢＲ３２２とする。
５、転換およびクローン選択
このようにして得たプラスミドをｃａｃｔ２−処理Ｅ、
Ｃ０１１細胞に転移させる。転換後交雑プラスミＩ
′Ｊ ドＤ Ｎ ｌ＞分子を含む細胞なテｉ・ラサイクリンに
対する耐性に基づき選択する。陽性コロニイをエッチ、
シー、パーンポイム（ＨｌＯ，Ｂ１．ｒｎｂｏｉｍ ）
およびジエイ、ドリイ（Ｊ、 ＤＯｌｙ） 、 Ｎ
ｕｃｌ、ｅｉｃ Ａｃ１ｃ１．８Ｒｅｓｅａｒｃｈ、
７．１５１３〜１５２３ （１９７９＞により概述され
た迅速シラスミド抽出法と単離されたＴ） Ｎ Ａのエ
ンドヌクレアーゼＰｓｔ−■−消化との組合わせにより
大きい挿入部を有するシラスミドに対してふるい分目す
る。
Ｃ０１１細胞に転移させる。転換後交雑プラスミＩ
′Ｊ ドＤ Ｎ ｌ＞分子を含む細胞なテｉ・ラサイクリンに
対する耐性に基づき選択する。陽性コロニイをエッチ、
シー、パーンポイム（ＨｌＯ，Ｂ１．ｒｎｂｏｉｍ ）
およびジエイ、ドリイ（Ｊ、 ＤＯｌｙ） 、 Ｎ
ｕｃｌ、ｅｉｃ Ａｃ１ｃ１．８Ｒｅｓｅａｒｃｈ、
７．１５１３〜１５２３ （１９７９＞により概述され
た迅速シラスミド抽出法と単離されたＴ） Ｎ Ａのエ
ンドヌクレアーゼＰｓｔ−■−消化との組合わせにより
大きい挿入部を有するシラスミドに対してふるい分目す
る。
選ばれたクローンから１０μｇのプラスミドＤＮＡが単
離され、後にこれをジアゾテートを付けた（ 、Ｄ Ｂ
Ｍ ）紙円板に固定する。不動化されたシラスミ１Ｄ
ＮＡ分子を、Ｄ Ｎ Ａ挿入部の性質を測定するため、
ジエイ、ジー、ウィリアムス（Ｊ。
離され、後にこれをジアゾテートを付けた（ 、Ｄ Ｂ
Ｍ ）紙円板に固定する。不動化されたシラスミ１Ｄ
ＮＡ分子を、Ｄ Ｎ Ａ挿入部の性質を測定するため、
ジエイ、ジー、ウィリアムス（Ｊ。
Ｇ、 Ｗｉｌｌｉａｍｓ ）等、Ｃｅ１１．１７．９０
３〜９１３（１９７９）により概述されたように交雑／
試験管内翻訳法に用いる。
３〜９１３（１９７９）により概述されたように交雑／
試験管内翻訳法に用いる。
７゜ Ｄ Ｎ Ａ／ＲＮ Ａ配列分析による挿入部（１
１）の性質の決定 ソーマチン挿入部のヌクレオチド配列分析はニー、エム
、マキサム（ＡｌＭ、 Ｍａｘａｍ ）およびダシリュ
ー、ギルバート（Ｗ、Ｇ１１ｌ）＋３ｒｔ ）、Ｍｅｔ
ｈｏｄｓｉｎ ＥｎＺ７ｍ０１０ｇ７．編集者エル、グ
ロスマン（Ｌ、１ＧｒＯｓｓｍａｎ ）およびケイ、モ
ルディプ（Ｋ６Ｍｏ１−ｄａｖｅ）、ニューヨーク、ア
カデミツク プレス、１９８０年６５巻（１）、４９９
〜５６０頁に概述された化学分解法により、またジエイ
、マート（Ｊ、 Ｍａａｔ ）およびニー、ジエイ、エ
ッチ、スミス（Ａ、Ｊ、Ｈ，Ｓｍ１ｔｈ ）、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃ１５ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。
１）の性質の決定 ソーマチン挿入部のヌクレオチド配列分析はニー、エム
、マキサム（ＡｌＭ、 Ｍａｘａｍ ）およびダシリュ
ー、ギルバート（Ｗ、Ｇ１１ｌ）＋３ｒｔ ）、Ｍｅｔ
ｈｏｄｓｉｎ ＥｎＺ７ｍ０１０ｇ７．編集者エル、グ
ロスマン（Ｌ、１ＧｒＯｓｓｍａｎ ）およびケイ、モ
ルディプ（Ｋ６Ｍｏ１−ｄａｖｅ）、ニューヨーク、ア
カデミツク プレス、１９８０年６５巻（１）、４９９
〜５６０頁に概述された化学分解法により、またジエイ
、マート（Ｊ、 Ｍａａｔ ）およびニー、ジエイ、エ
ッチ、スミス（Ａ、Ｊ、Ｈ，Ｓｍ１ｔｈ ）、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃ１５ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。
５、４５６７〜４５４５ （１９７８）により概説され
たジデオキシ／ニック翻訳法により行う。ソーマチンｍ
ＲＮＡのヌクレオチド配列についてのこれ以上の情報は
ディ、ジム？−７（Ｄ、 Ｚｉｍｍｅｒｎ ） および
ビー。
たジデオキシ／ニック翻訳法により行う。ソーマチンｍ
ＲＮＡのヌクレオチド配列についてのこれ以上の情報は
ディ、ジム？−７（Ｄ、 Ｚｉｍｍｅｒｎ ） および
ビー。
カエスベルグ（Ｐ 、Ｋａｅｓｂｅｒｇ ）、Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ。
、 Ｎａｔｌ。
Ａａａｄ、Ｓｃｉ、Ｄ、８．Ａ、７５．４２５７〜４２
６１ （１９７８）により概説、されたように、連鎖停
止阻害剤存在下に、ソーマチンｍＲＮＡ鋳型上でのＡＭ
’Ｖ−逆トランスクリゾターゼによるゾライマー付は合
成によって１ 日 間接的に誘導された。このスクリーニングは、就中ソー
マチンｍＲＮＡ の殆ど完全な複製を含むシラスミド
１）ＵＲ１００を与える。
６１ （１９７８）により概説、されたように、連鎖停
止阻害剤存在下に、ソーマチンｍＲＮＡ鋳型上でのＡＭ
’Ｖ−逆トランスクリゾターゼによるゾライマー付は合
成によって１ 日 間接的に誘導された。このスクリーニングは、就中ソー
マチンｍＲＮＡ の殆ど完全な複製を含むシラスミド
１）ＵＲ１００を与える。
ニー、ジエイ、エッチ、スミス、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｌ
ａａ Ｒｅ５０．６．８３１〜８４８ （１９７９）に
より概説されたｐＵＲ１００のエキソヌクレアーゼ川処
理により、才たはビー、グローネンボーン（Ｂ、Ｇｒｏ
ｎｅｎｂｏｒｎ）およびジエイ、メツシング（Ｊ０Ｍθ
ｓｓｉｎｇ ）、Ｎａｔｕｒｅ２７２．２７５〜２７７
（１９７８） Ｋ 、、ｌ：すＲＮ’ｉｔすしたＭ１
３におけるクローニングにより一本４ＪＤＮＡが得られ
る。ソーマチンｍＲＮＡと同じ極性を有する一本鎖ＤＮ
Ａを、プライマーとして役立つ化学的に合成されたオリ
ゴヌクレオチド（５′）ｐＴＯＡＧＧＯＡＧＴＡＧＧＧ
ｃＡ□Ｈ（３’）を用いる相補的ＤＮＡ合成のための鋳
型として用いた。二本Ｑ Ｄ Ｎ Ａの熱変性後、化学
的に合成されたオリゴヌクレオチド（５’） ｐＧＯＯ
ＡＯＣＴＴＯＧｏＨ（ｆｆ） をプライマーとして使
用するこきにより相補的ＤＮＡがＤＮＡ合成のだ Ｑ めの鋳型として役立つ。次にこの二本鎖ＤＮＡを８１ヌ
クレアーゼで処理する。完成ソーマチン遺伝子の組立て
を第２図で説明する。
ａａ Ｒｅ５０．６．８３１〜８４８ （１９７９）に
より概説されたｐＵＲ１００のエキソヌクレアーゼ川処
理により、才たはビー、グローネンボーン（Ｂ、Ｇｒｏ
ｎｅｎｂｏｒｎ）およびジエイ、メツシング（Ｊ０Ｍθ
ｓｓｉｎｇ ）、Ｎａｔｕｒｅ２７２．２７５〜２７７
（１９７８） Ｋ 、、ｌ：すＲＮ’ｉｔすしたＭ１
３におけるクローニングにより一本４ＪＤＮＡが得られ
る。ソーマチンｍＲＮＡと同じ極性を有する一本鎖ＤＮ
Ａを、プライマーとして役立つ化学的に合成されたオリ
ゴヌクレオチド（５′）ｐＴＯＡＧＧＯＡＧＴＡＧＧＧ
ｃＡ□Ｈ（３’）を用いる相補的ＤＮＡ合成のための鋳
型として用いた。二本Ｑ Ｄ Ｎ Ａの熱変性後、化学
的に合成されたオリゴヌクレオチド（５’） ｐＧＯＯ
ＡＯＣＴＴＯＧｏＨ（ｆｆ） をプライマーとして使
用するこきにより相補的ＤＮＡがＤＮＡ合成のだ Ｑ めの鋳型として役立つ。次にこの二本鎖ＤＮＡを８１ヌ
クレアーゼで処理する。完成ソーマチン遺伝子の組立て
を第２図で説明する。
９ａ、 、ＯラスミドｐＵＲ２ｒ］１０組立て二重１ａ
ｃレギユロン（ｌａｃ ＵＶ ５ ） を包含する２
８５塩基対を含む断片をｐＫＢ ２６８の制限エンドヌ
クレアーゼＢａｏ Ｒ工開裂により得る〔ケイ、バンク
マン（Ｋ、Ｂａｃｋｍｈｎ ）およびエム、ブタシュン
（Ｍ、Ｐｔａｅｈｎｅ ）、０８１１１３．６５〜７１
（１９７８） ）。
ｃレギユロン（ｌａｃ ＵＶ ５ ） を包含する２
８５塩基対を含む断片をｐＫＢ ２６８の制限エンドヌ
クレアーゼＢａｏ Ｒ工開裂により得る〔ケイ、バンク
マン（Ｋ、Ｂａｃｋｍｈｎ ）およびエム、ブタシュン
（Ｍ、Ｐｔａｅｈｎｅ ）、０８１１１３．６５〜７１
（１９７８） ）。
コノ断片をｐＢＲ３２２ＤＮＡ ノＲｃｏＲＩ部位に結
紮する。右方向に１ａＯレギユロンを有するシラスミド
Ｄ ＩＪ Ａ （第４図）をＪ ｃｏｌｉ ＲＮ Ａ
ポリメラーゼの存在でＢｃｏＲ工により部分的に開裂さ
せる。制限エンドヌクレアーゼ ヒンｌ’ ｌ開裂部位
から最も遠いＢｃＯＲＩ開裂部位が優先的に攻撃される
。直線化されたＤＮＡを８１ヌクレアーゼで処理し、ア
ガロースデル電気泳動により精製し、’Ｉ”４ ＤＮＡ
−リが−ゼによる結紮により環状にし、その後Ｅ、コリ
ーの転換に用いる。テトラサイクリン耐性転換体から正
しい構造（第６図）を有するｐＵＲ７ ２０１が得られる。
紮する。右方向に１ａＯレギユロンを有するシラスミド
Ｄ ＩＪ Ａ （第４図）をＪ ｃｏｌｉ ＲＮ Ａ
ポリメラーゼの存在でＢｃｏＲ工により部分的に開裂さ
せる。制限エンドヌクレアーゼ ヒンｌ’ ｌ開裂部位
から最も遠いＢｃＯＲＩ開裂部位が優先的に攻撃される
。直線化されたＤＮＡを８１ヌクレアーゼで処理し、ア
ガロースデル電気泳動により精製し、’Ｉ”４ ＤＮＡ
−リが−ゼによる結紮により環状にし、その後Ｅ、コリ
ーの転換に用いる。テトラサイクリン耐性転換体から正
しい構造（第６図）を有するｐＵＲ７ ２０１が得られる。
９ｂ、プラスミドｐＵＲ３０１の組立て約５１０塩基対
のＤＮＡ断片が、ｐｔｒｐ ＥＤ ５の制限エンドヌク
レアーゼＨ１ｎｆ工開裂により得られた〔アール、ニー
、ハルレーウエル、 （Ｒ，Ａ。
のＤＮＡ断片が、ｐｔｒｐ ＥＤ ５の制限エンドヌク
レアーゼＨ１ｎｆ工開裂により得られた〔アール、ニー
、ハルレーウエル、 （Ｒ，Ａ。
Ｈａｌｌｅｗｅｌ ）およびニス、エムテージ（Ｓ 、
Ｔｉ！ｍｔａｇｅ ）、Ｇｅｎθ９．２７〜４７ （
１９８０） ）。この断片をＦｉ、 ｃｏｌｉＲＮＡポ
リメラーゼ存在下制限エンドヌクレアーゼＴａｑ工で開
裂させる。ｔｒｐレギユロンにおけるＴａｑ Ｘ部位〔
ケイ、パートランド（Ｋ、Ｂｅｒｔｒａｎａ ）等、
５ｉｅｎｃｅ、 １８９．２２〜２６ （１９７５）お
よびエフ。
Ｔｉ！ｍｔａｇｅ ）、Ｇｅｎθ９．２７〜４７ （
１９８０） ）。この断片をＦｉ、 ｃｏｌｉＲＮＡポ
リメラーゼ存在下制限エンドヌクレアーゼＴａｑ工で開
裂させる。ｔｒｐレギユロンにおけるＴａｑ Ｘ部位〔
ケイ、パートランド（Ｋ、Ｂｅｒｔｒａｎａ ）等、
５ｉｅｎｃｅ、 １８９．２２〜２６ （１９７５）お
よびエフ。
リー（ＩＰ、Ｌｅｅ ）等１．ｒ、 １ａｏ１．Ｂｊ、
ｏｌ、 ｔｌ、１９５〜２１７ （１９７８）により記
述〕を選択的に保護し、このようにしてｔｒｐレギユロ
ン（第１図）からなる２６４塩基対を含む断片を得る。
ｏｌ、 ｔｌ、１９５〜２１７ （１９７８）により記
述〕を選択的に保護し、このようにしてｔｒｐレギユロ
ン（第１図）からなる２６４塩基対を含む断片を得る。
次にこの断片を１３１ ヌク１／アーゼで処理し、ｍ
ｃｏＲニリンカー（５′）ｐＧＧＡＡＴ Ｔ ＯＯｏｕ
（３’）で鈍端結紮し、Ｅｃ ｏＲ工で切断し、その
後ｐＢＲ３２２の ＦｉｃｏＦｔニ一部位でクローニン
グゝする。
ｃｏＲニリンカー（５′）ｐＧＧＡＡＴ Ｔ ＯＯｏｕ
（３’）で鈍端結紮し、Ｅｃ ｏＲ工で切断し、その
後ｐＢＲ３２２の ＦｉｃｏＦｔニ一部位でクローニン
グゝする。
正しい方向にあるｔｒｐ Ｌ／ギュロンを有するプラス
ミドｐＵＢ ３００ （第１図）を単離した。Ｈｌｎａ
１部位から最も遠いＢｃｏＲニー開裂部位をエチジウ
ムプロミドの存在下ＥｃｏＲ工によるｐＵＲ３ＱＱ Ｄ
ＮＡの部分開裂によりそしてＳ１ヌクレアーゼ処理によ
り除去する。線状１１ ｔＪ Ａ分子をＴ４ＤＮＡＩＪ
ガーゼにより再環化する。テトラサイクリン耐性転換体
から第１図に概説された構造をもつｐＵＲ３０１が得ら
れる。
ミドｐＵＢ ３００ （第１図）を単離した。Ｈｌｎａ
１部位から最も遠いＢｃｏＲニー開裂部位をエチジウ
ムプロミドの存在下ＥｃｏＲ工によるｐＵＲ３ＱＱ Ｄ
ＮＡの部分開裂によりそしてＳ１ヌクレアーゼ処理によ
り除去する。線状１１ ｔＪ Ａ分子をＴ４ＤＮＡＩＪ
ガーゼにより再環化する。テトラサイクリン耐性転換体
から第１図に概説された構造をもつｐＵＲ３０１が得ら
れる。
９ｃ、プラスミドルＤ式４０１の組立て２６９塩渣対を
含む断片（ＤＮＡ配列１１２８〜１３７９）を制御ｌ−
，エン１？ヌ々レアーゼＴａｑ工および↓（ａｅ ｌｉ
を用いる’ＲＦＭ１３ＤｎＡ（ビー、エム、シー、エフ
、ブイ、ウエーゼンビーク（Ｐ。
含む断片（ＤＮＡ配列１１２８〜１３７９）を制御ｌ−
，エン１？ヌ々レアーゼＴａｑ工および↓（ａｅ ｌｉ
を用いる’ＲＦＭ１３ＤｎＡ（ビー、エム、シー、エフ
、ブイ、ウエーゼンビーク（Ｐ。
Ｍ、 Ｇ、 Ｆ、Ｖ、Ｗｅｚｅｎｂｅｅｌｃ ）等、Ｇ
ｅｎｅ １１．１２９〜１４８（１９８０） ）の消化
により得、そのＴａｑ Ｉ部位を１４． ｃｏｌｉ
Ｄ Ｎ Ａポリメラーゼを用いる４Ｖｊａ ｆＭ反応に
より鈍端とし、断片をその後制限醇索Ｍｎｌφ工で部分
消化する。この部分的生成物をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ
およびＳ１ヌクレアーゼの連続作用で処理し、その後Ｅ
ｃｏＲニーリンカ−（５’）ｐｌＪＧＭＴＴＯＯ□Ｈ０ （６′）で鈍端結紮し、次にＥｃｏＲ工で処理し、そし
てｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位で結紮する。制限酵素
分析およびＤＮＡ配列分析により、ＦｉｃＯＲＩ開裂部
位が１４１６遺伝子’％ｌ１ｌｌ ＤＮＡ配列のリポソ
ーム結合部位を丁度越えて位置するシラスミドが得られ
る。
ｅｎｅ １１．１２９〜１４８（１９８０） ）の消化
により得、そのＴａｑ Ｉ部位を１４． ｃｏｌｉ
Ｄ Ｎ Ａポリメラーゼを用いる４Ｖｊａ ｆＭ反応に
より鈍端とし、断片をその後制限醇索Ｍｎｌφ工で部分
消化する。この部分的生成物をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ
およびＳ１ヌクレアーゼの連続作用で処理し、その後Ｅ
ｃｏＲニーリンカ−（５’）ｐｌＪＧＭＴＴＯＯ□Ｈ０ （６′）で鈍端結紮し、次にＥｃｏＲ工で処理し、そし
てｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位で結紮する。制限酵素
分析およびＤＮＡ配列分析により、ＦｉｃＯＲＩ開裂部
位が１４１６遺伝子’％ｌ１ｌｌ ＤＮＡ配列のリポソ
ーム結合部位を丁度越えて位置するシラスミドが得られ
る。
本発明者等はＭ１３ レギユロンを有するシラスミド
（ヌクレオチド１１２８からヌクレオチｒ１２９１〜１
２９７）が表現に適したレギユロンであることを見出し
た。Ｈｌｎｄ １部位から最も遠いＥｃｏＲ工開裂部位
はｐＵＲ３０１に対して本質的に記述したようにしで除
かれる。ｐＵＲ４０１の完全な組立てを第４図に示す。
（ヌクレオチド１１２８からヌクレオチｒ１２９１〜１
２９７）が表現に適したレギユロンであることを見出し
た。Ｈｌｎｄ １部位から最も遠いＥｃｏＲ工開裂部位
はｐＵＲ３０１に対して本質的に記述したようにしで除
かれる。ｐＵＲ４０１の完全な組立てを第４図に示す。
９（１，ＩＪンカーおよびゾライマーの化学的合成オリ
ボデキシヌクレオチドの合成は５’−ｏ−レブリニルデ
オキシヌクレオシド−３’−０−２，２゜２−トリクロ
ロエチル−２−クロロフェニルホスフェートをデオキシ
ヌクレオシド−３’−０−２゜２ 、２− トＩＪ ク
ロロエチル−２−クロロフェニルホスフェートとのカッ
シリングにより行なわれる。
ボデキシヌクレオチドの合成は５’−ｏ−レブリニルデ
オキシヌクレオシド−３’−０−２，２゜２−トリクロ
ロエチル−２−クロロフェニルホスフェートをデオキシ
ヌクレオシド−３’−０−２゜２ 、２− トＩＪ ク
ロロエチル−２−クロロフェニルホスフェートとのカッ
シリングにより行なわれる。
ホスホトリエステル法として知られるこの方法は１、
１ 〔ジエイ、エフ、エム、ド、ルーイ（、Ｔ、Ｆ＋Ｍ、（
ｌθＲｏｏｉｊ ）等、Ｒｅａｌ、 Ｔｒａｖ、 Ｏｈ
ｉｍ、Ｐａｙｓ −Ｂａｓ匝、５６７〜５４８ （１９
７９）ＶＬより記述〕、活性亜鉛によるトリクロロエチ
ル基の間装除去とそれに続＜２．４．６−ドリイソプロ
ビルベンセ゛ンスルホニルー６−ニトロ−１，２，４−
トリアゾールの助けを用いる実際のカップリング反応を
含む。
１ 〔ジエイ、エフ、エム、ド、ルーイ（、Ｔ、Ｆ＋Ｍ、（
ｌθＲｏｏｉｊ ）等、Ｒｅａｌ、 Ｔｒａｖ、 Ｏｈ
ｉｍ、Ｐａｙｓ −Ｂａｓ匝、５６７〜５４８ （１９
７９）ＶＬより記述〕、活性亜鉛によるトリクロロエチ
ル基の間装除去とそれに続＜２．４．６−ドリイソプロ
ビルベンセ゛ンスルホニルー６−ニトロ−１，２，４−
トリアゾールの助けを用いる実際のカップリング反応を
含む。
デオキシアデノシン、デオキシシチジンおよびデオキシ
グアノシンにおけるアミン基はそれぞれベンゾイル基、
４−メトキシベンゾイル基およびベンゾイル基により＆
［する。末端ヌクレオシドの３′−ヒドロキシ基の保護
にはベンゾイル基が用いられる。最後の段階ですべての
保護基はそれぞれフッ化テトラブチルアンモニウムおよ
び績アンモニア水との反応により除去される。
グアノシンにおけるアミン基はそれぞれベンゾイル基、
４−メトキシベンゾイル基およびベンゾイル基により＆
［する。末端ヌクレオシドの３′−ヒドロキシ基の保護
にはベンゾイル基が用いられる。最後の段階ですべての
保護基はそれぞれフッ化テトラブチルアンモニウムおよ
び績アンモニア水との反応により除去される。
リンカ−（５’）ｐＯＡＴＧＡＡＴＴＯＡＴＧ□Ｈ（３
’）の組立ての一例を第５図に示す。
’）の組立ての一例を第５図に示す。
６
８に記載のソーマチン暗号づけＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡ
りが一ゼを用いて合成Ｆｉｃ ｏＲエニーンカ−（５′
）ｐＯＡＴ（Ｎ）ｒｌＧＡＡＴＴＯ（Ｎ’）ｎＡＴＧｏ
Ｈ（３つにより針部結紮し、ＦｉｃｏＲＩ テ開裂し、
ソノ後プラスミドｐＵＲ２ｏ１、ｐＵＲ３０１およびｐ
ＵＲ４０１のＥｃ ｏＲエニー裂部位に結紮し、第６図
に示したような方向でソーマチン暗号づけ挿入部を有す
る組換えシラスミドを、Ｅ。
りが一ゼを用いて合成Ｆｉｃ ｏＲエニーンカ−（５′
）ｐＯＡＴ（Ｎ）ｒｌＧＡＡＴＴＯ（Ｎ’）ｎＡＴＧｏ
Ｈ（３つにより針部結紮し、ＦｉｃｏＲＩ テ開裂し、
ソノ後プラスミドｐＵＲ２ｏ１、ｐＵＲ３０１およびｐ
ＵＲ４０１のＥｃ ｏＲエニー裂部位に結紮し、第６図
に示したような方向でソーマチン暗号づけ挿入部を有す
る組換えシラスミドを、Ｅ。
Ｃ０１１の転換およびテトラサイクリン剛性転換体の選
択後に単離した。上記プラスミドにおいて、化学的に合
成されたリンカ−に由来するＡＡＴＴ順序はエチジウム
プロミドの存在下ＫｃｏＲＩを用いるシラスミドの開裂
により削除でき、線状部分はアガロースデル電気泳動に
より単離され、Ｓ１ヌクレアーゼで処理され、そしてＴ
４１Ｊガ一ゼ作用により再環化される。
択後に単離した。上記プラスミドにおいて、化学的に合
成されたリンカ−に由来するＡＡＴＴ順序はエチジウム
プロミドの存在下ＫｃｏＲＩを用いるシラスミドの開裂
により削除でき、線状部分はアガロースデル電気泳動に
より単離され、Ｓ１ヌクレアーゼで処理され、そしてＴ
４１Ｊガ一ゼ作用により再環化される。
ＡＡＴＴの削除後に得られるシラスミドは制限酵素分析
により検出された。
により検出された。
１１、組換えプラスミドを含むＥ、ｃｏｌｉ細胞の培養
−−２−−１−１“−一−−□−−−−−−−□−一−
−−−一一一−−−□□−−□□とソーマチンの検出 正しい方向と解読わく中にレギユロンと完成ソーマチン
遺伝子との間のリンカ−にＡＡＴＴ配列を有する、ある
いは有しないフ０ラスミドｐＵＲ５２０またはｐＵＲ５
３０またはｐＵＲ５４０を含むＥ、 ｃｏｌｉ細胞をそ
の発育に最適の条件下で培養する。これら培養条件は細
胞中に存在するプラスミドの型により変化するか、常に
選択圧を維持するため適当な抗生物質の存在下で行なう
。これら条件下でシラスミドｐＵＲ５２０またはｐＵＲ
５３０またはｐＵＲ５４０の何れかを含む細胞は相当な
量の完成ソーマチンを生じた。タンパク儒ソーマチンの
存在は、定性的にはＳ、Ｄ、Ｓ、ｉ、Ｉ′気泳動により
また甘味に関する生理学的試験により、そして定量的に
は酵素結合した免役吸収剤分析（ＥＬＩＳＡ）により実
証された。
−−２−−１−１“−一−−□−−−−−−−□−一−
−−−一一一−−−□□−−□□とソーマチンの検出 正しい方向と解読わく中にレギユロンと完成ソーマチン
遺伝子との間のリンカ−にＡＡＴＴ配列を有する、ある
いは有しないフ０ラスミドｐＵＲ５２０またはｐＵＲ５
３０またはｐＵＲ５４０を含むＥ、 ｃｏｌｉ細胞をそ
の発育に最適の条件下で培養する。これら培養条件は細
胞中に存在するプラスミドの型により変化するか、常に
選択圧を維持するため適当な抗生物質の存在下で行なう
。これら条件下でシラスミドｐＵＲ５２０またはｐＵＲ
５３０またはｐＵＲ５４０の何れかを含む細胞は相当な
量の完成ソーマチンを生じた。タンパク儒ソーマチンの
存在は、定性的にはＳ、Ｄ、Ｓ、ｉ、Ｉ′気泳動により
また甘味に関する生理学的試験により、そして定量的に
は酵素結合した免役吸収剤分析（ＥＬＩＳＡ）により実
証された。
次のプラスミドを含有するＥ、ｃｏｌｉ 菌体はＡＴＯ
Ｃ！ に寄託されている。
Ｃ！ に寄託されている。
ｐＵＲ５２０−ＡＴＯＯ３９０１４
ｐＵＲ５２２−ＡＴＯＯ３９０１６
ｐＵＲ５２３−ＡＴＯＯ３９０１７
６
ｐＵＲ５３１−ＡＴＯＯ３９０１５゜
第１図は１）ＵＲ３０１への転換とその構造を示した図
であり、第２図は完成ソーマチンを暗号化するＤＮＡ配
列の組立てを示し、第６図はｐＵＲ２０１の構造を示し
、第４図はプラスミドｐＵＲ４０１の完全な組立てを示
し、第５図はＤ Ｎ Ａ、 ＩＪンカーの組立てを示し
、第６図はシラスミドｐＵＲ５２０、ｐＵＲ５３０およ
びｐＵＲ５４０の組立てを示す。 代理人 浅 利 皓 ７ 第１頁の続き ０発 明 者 ルツボ・エデンス オランダ国マースルイス・アル ベルト・シュバイッードレーフ ９ ０発 明 者 ロベルト・クロック オランダ国ブラールデインゲン ・ヴイルゲンドレーフ２９ ０発 明 者 ジャン・マート オランタ国モンスター・モレン ストラーセ２ 昭和５７年 り月 ７７日 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和５６年特許願第２００８０３ 号 ２、発明の名称 ＤＮＡ配列 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住 所 氏名 ユニリーバ−ナームローゼ ペンノートシャー
プ（名 称） ４、代理人 電 話 （２１１） ３６５１ （代表）氏 名
（６６６９） 浅 村 皓５、補正命令
の日付 昭和Ｓ７年 ０月３０日 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象 明細書 図面の浄書 （内容に変更なし） ８、補正の内容 別紙のとおり 明細書の浄書（内容に変更な〜しａ
であり、第２図は完成ソーマチンを暗号化するＤＮＡ配
列の組立てを示し、第６図はｐＵＲ２０１の構造を示し
、第４図はプラスミドｐＵＲ４０１の完全な組立てを示
し、第５図はＤ Ｎ Ａ、 ＩＪンカーの組立てを示し
、第６図はシラスミドｐＵＲ５２０、ｐＵＲ５３０およ
びｐＵＲ５４０の組立てを示す。 代理人 浅 利 皓 ７ 第１頁の続き ０発 明 者 ルツボ・エデンス オランダ国マースルイス・アル ベルト・シュバイッードレーフ ９ ０発 明 者 ロベルト・クロック オランダ国ブラールデインゲン ・ヴイルゲンドレーフ２９ ０発 明 者 ジャン・マート オランタ国モンスター・モレン ストラーセ２ 昭和５７年 り月 ７７日 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和５６年特許願第２００８０３ 号 ２、発明の名称 ＤＮＡ配列 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住 所 氏名 ユニリーバ−ナームローゼ ペンノートシャー
プ（名 称） ４、代理人 電 話 （２１１） ３６５１ （代表）氏 名
（６６６９） 浅 村 皓５、補正命令
の日付 昭和Ｓ７年 ０月３０日 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象 明細書 図面の浄書 （内容に変更なし） ８、補正の内容 別紙のとおり 明細書の浄書（内容に変更な〜しａ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 Ｉ’ｌｌ ４ｍ＝宍ＡおよびＢＫ紀戦の守成ソーマチ
ンの種々な対立遺伝子形を暗号化するＤＮＡ配列。 （２） 完成ソーマチンの種々な対立遺伝子形を暗号
化するＤＮＡ配列および誘導可能な才たは構成的なレギ
ユロンからなる構造遺伝子の表現、を調節する特別なり
ＮＡ配列を包含する絹換えプラスミド。 （３）構造遺伝子の衣用をｉ周部する特別なりＮＡ配列
が二重１ａｃ Ｕ Ｖ ５糸からなる誘導可能なレギュ
ローンを包含する第２拍記載の絹伸えグラスミド（＠６
１シ１記載のシラスミドｐＵＲ５２０）。 （４） 構造遺伝子の表現を調節する特別なりＮＡ配
列が修正されたトリプトファン系を包含する第２項記載
の組換えプラスミド（第６図記載・Ｖのプラスミ ド
ｐＵＲ５３０） 。 （５）模造遺伝子の表現を調節する特別なり Ｎ Ａ配
列が修正されたＭ１３遺伝子■糸を包含する第２項記載
の組換えグラスミド（第６図記載の）０ラスミ ド ｐ
ＵＲ５４０） 。 （口 構造遺伝子をレギユロンのＢｃｏ Ｒ工部位へヌ
クレオチド配列（５’ ）ｐｃＡＴ（Ｎ）ｎＧＡＡＴＴ
Ｏ（Ｎ’）ｎＡＴＧｏＨ（３’） （式中、ｎ ＝Ｑ、
１．２才たはろであり、Ｎ オヨヒＮ ’はヌクレオチ
ドＡ、Ｔ、ＧまたはＣの伺イ１かであるか、たたし二本
鎖４（〆、造中の１９とＮ’は回転対イシ］＼栴造が存
在するようなものであることを孝、ｒｌ−とする）を有
するＢｃｏＲＩ処理Ｄ Ｎ Ａ ＩＪンカーを経て結合
させる第１項から第５項のいずれか１ｍに記載の組換え
フ０ラスミド。 （７） ヌクレオチド配列（５’）ｐＯＡＴ（ＩＪ
）ｎ ＧＡＡＴＴＯ（Ｎ’）ｎＡＴＧＯＩ＞（６つ（式
中、ｎ ＝ Ｑ、１，２またはろであり、ＮおよびＮ′
はヌクレオチドＡ、Ｔ、ＧｉたはＣの何れかであるか、
ただし封およびＮ′は二本鎖構造において回転対称構造
が存在するようなものであることを条件とする）を有す
るＩ） Ｎ Ａ−リンカ−〇 （８） 第１項から第７項までのいずれか１項に記載
のプラスミドを包含する少なくさも一つの微生物からク
ローニングされた細菌培養物。 （９） レギユロンとソーマチン遺伝子との間のリン
カ−中に、ＡＡＴＴ配列と共にあるいは無しにＩ）ＵＲ
５２０を含むＥ、ｃｏｌｉ細胞を包含する細菌培養物。 Ｑｔｊ レギユロンとソーマチン遺伝子との間のリン
カ−中に、ＡＡＴＴ配列と共にあるいは無しに、ｐＵＲ
５３０を含むＪ Ｃ０１ｉ細胞を包含する細菌培養物。 （１ト レギユロンとソーマチン遺伝子との間のリン
カ−中に、ＡＡＴＴ配列と共にあるいは無しに、ｐＵＲ
５４０を含むＥ、Ｃ０１ｉ細Ｉ泡を包含する細菌培養物
。 ０２、第１項から第１１角までのいずれか１角に記載の
プラスミドを橡生物のクローニング媒愉中に添加し、転
換された細胞を培養し、前記細胞により生産された′ソ
ーマチンを学齢するこさを特徴とする、ソーマチンの製
造法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8039855 | 1980-12-12 | ||
| GB8039855 | 1980-12-12 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS584799A true JPS584799A (ja) | 1983-01-11 |
| JPS615392B2 JPS615392B2 (ja) | 1986-02-18 |
Family
ID=10517943
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56200803A Granted JPS584799A (ja) | 1980-12-12 | 1981-12-12 | 成熟ソ−マチンの遺伝暗号を有するｄｎａ配列 |
| JP60140090A Granted JPS6143996A (ja) | 1980-12-12 | 1985-06-26 | ソ−マチンの製造法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60140090A Granted JPS6143996A (ja) | 1980-12-12 | 1985-06-26 | ソ−マチンの製造法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4891316A (ja) |
| EP (1) | EP0054330B1 (ja) |
| JP (2) | JPS584799A (ja) |
| AT (1) | ATE22327T1 (ja) |
| BR (1) | BR8108074A (ja) |
| CA (1) | CA1192151A (ja) |
| DE (1) | DE3175357D1 (ja) |
| IE (1) | IE52417B1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60501290A (ja) * | 1983-05-19 | 1985-08-15 | ユニリ−バ− ナ−ムロ−ゼ ベンノ−トシヤ−プ | 酵母細胞に新しく導入した遺伝子の発現改良 |
| JPS63501264A (ja) * | 1985-11-13 | 1988-05-19 | インターナシヨナル ジネテイツク エンジニアリング インコーポレイテツド | タウマチン１類似体をコードするｄｎａ |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA811368B (en) | 1980-03-24 | 1982-04-28 | Genentech Inc | Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator |
| DK489481A (da) * | 1980-11-10 | 1982-05-11 | Searle & Co | Plasmidvektor og frmgangsmaade til fremstilling deraf |
| US5525484A (en) * | 1981-01-16 | 1996-06-11 | Genome Therapeutics Corp. | Recombinant DNA means and method for producing rennin, prorenin and pre-prorennin |
| BR8205954A (pt) * | 1981-10-14 | 1983-09-13 | Unilever Nv | Sequencia de dna,plasmidio recombinante,cultura bacteriana e microorganismos |
| HU204097B (en) | 1982-05-19 | 1991-11-28 | Gist Brocades Nv | Process for producing cloning system relating to kluyveromyces species |
| US4666839A (en) * | 1982-12-01 | 1987-05-19 | Amgen | Methods and materials for obtaining microbial expression of polypeptides including bovine prolactin |
| AU577334B2 (en) * | 1983-10-11 | 1988-09-22 | International Genetic Engineering, Inc. | Synthetic thaumatin genes |
| ATE66251T1 (de) * | 1983-12-23 | 1991-08-15 | Pfizer | Expressionsplasmide fuer die herstellung eines heterologen proteins in bakterien. |
| US4935370A (en) * | 1983-12-23 | 1990-06-19 | Pfizer Inc. | Expression plasmids for improved production of heterologous protein in bacteria |
| BR8807102A (pt) * | 1987-06-19 | 1989-10-17 | Lucky Biotech Corp | Preparacao de novos adocantes de proteina |
| ES2080689B1 (es) * | 1994-04-21 | 1996-09-01 | Urquima Sa | Procedimiento de obtencion de un edulcorante natural proteico. |
| AU6674296A (en) * | 1995-06-23 | 1997-01-22 | University Of Hawaii | Recombinant sweet protein mabinlin |
| RU2261275C2 (ru) * | 2002-10-24 | 2005-09-27 | Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук | Способ получения трансгенных растений с повышенной устойчивостью к фитопатогенам |
| WO2012115201A1 (ja) | 2011-02-25 | 2012-08-30 | 日本精工株式会社 | 分割軌道輪およびその製造方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4237224A (en) * | 1974-11-04 | 1980-12-02 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University | Process for producing biologically functional molecular chimeras |
| NZ187300A (en) * | 1977-05-27 | 1982-08-17 | Univ California | Dna transfer vector and micro-organism modified to contain a nucleotide sequence equivalent to the gene of a higher organism |
| US4321365A (en) * | 1977-10-19 | 1982-03-23 | Research Corporation | Oligonucleotides useful as adaptors in DNA cloning, adapted DNA molecules, and methods of preparing adaptors and adapted molecules |
| US4336336A (en) * | 1979-01-12 | 1982-06-22 | President And Fellows Of Harvard College | Fused gene and method of making and using same |
| CA1202581A (en) * | 1980-03-27 | 1986-04-01 | Saran A. Narang | Adaptor molecules for dna and their application to synthesis of gene-derived products |
-
1981
- 1981-12-11 BR BR8108074A patent/BR8108074A/pt unknown
- 1981-12-11 DE DE8181201354T patent/DE3175357D1/de not_active Expired
- 1981-12-11 CA CA000392095A patent/CA1192151A/en not_active Expired
- 1981-12-11 EP EP81201354A patent/EP0054330B1/en not_active Expired
- 1981-12-11 IE IE2919/81A patent/IE52417B1/en not_active IP Right Cessation
- 1981-12-11 AT AT81201354T patent/ATE22327T1/de not_active IP Right Cessation
- 1981-12-12 JP JP56200803A patent/JPS584799A/ja active Granted
-
1985
- 1985-06-07 US US06/742,139 patent/US4891316A/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-06-26 JP JP60140090A patent/JPS6143996A/ja active Granted
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60501290A (ja) * | 1983-05-19 | 1985-08-15 | ユニリ−バ− ナ−ムロ−ゼ ベンノ−トシヤ−プ | 酵母細胞に新しく導入した遺伝子の発現改良 |
| JPS63501264A (ja) * | 1985-11-13 | 1988-05-19 | インターナシヨナル ジネテイツク エンジニアリング インコーポレイテツド | タウマチン１類似体をコードするｄｎａ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0054330B1 (en) | 1986-09-17 |
| EP0054330A3 (en) | 1982-09-22 |
| EP0054330A2 (en) | 1982-06-23 |
| JPH0441999B2 (ja) | 1992-07-10 |
| ATE22327T1 (de) | 1986-10-15 |
| DE3175357D1 (en) | 1986-10-23 |
| IE52417B1 (en) | 1987-10-28 |
| US4891316A (en) | 1990-01-02 |
| JPS615392B2 (ja) | 1986-02-18 |
| BR8108074A (pt) | 1982-09-21 |
| CA1192151A (en) | 1985-08-20 |
| JPS6143996A (ja) | 1986-03-03 |
| IE812919L (en) | 1982-06-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107012164A (zh) | CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰功能单元、包含该功能单元的载体及其应用 | |
| JPS584799A (ja) | 成熟ソ−マチンの遺伝暗号を有するｄｎａ配列 | |
| JPS59501096A (ja) | 構造遺伝子の製造および発現 | |
| KR100270195B1 (ko) | 겔로닌 폴리펩타이드를 암호화하는 dna 서열 | |
| JPH0630582B2 (ja) | Ｄｎａ導入ベクタ− | |
| US20230051396A1 (en) | Class ii, type ii crispr systems | |
| Alexandraki et al. | Evolution of α q-and β-tubulin genes as inferred by the nucleotide sequences of sea urichin cDNA clones | |
| CN110300802A (zh) | 用于动物胚胎碱基编辑的组合物和碱基编辑方法 | |
| JPS5978692A (ja) | バクテリオフア−ジからバクテリアを保護する方法 | |
| KR20240055073A (ko) | 클래스 ii, v형 crispr 시스템 | |
| JP2023542976A (ja) | カーゴヌクレオチド配列を転位させるための系および方法 | |
| JP2023539237A (ja) | カーゴヌクレオチド配列を転位させるための系および方法 | |
| JP2612264B2 (ja) | Ｄｎａ配列体 | |
| JPH01211490A (ja) | ヒト神経成長因子遺伝子セグメント | |
| US20190322998A1 (en) | One pot assembly | |
| CN112501171B (zh) | 两条特异性靶向猪Pax7基因的sgRNA导向序列及应用 | |
| CN116615547A (zh) | 用于对货物核苷酸序列转座的系统和方法 | |
| JP2024509048A (ja) | Ｃｒｉｓｐｒ関連トランスポゾンシステム及びその使用方法 | |
| JP2024509047A (ja) | Ｃｒｉｓｐｒ関連トランスポゾンシステム及びその使用方法 | |
| CN116178563A (zh) | 一种dna合成纠错酶及应用 | |
| Joshi | Molecular Biology and Biotechnology | |
| CN115975975A (zh) | 一种室温条件下具有扩增活性的dna聚合酶及其应用 | |
| JPS60234584A (ja) | 組換プラスミド | |
| CN112522269A (zh) | 特异性靶向鸡TYR基因的sgRNA导向序列及应用 | |
| KR20220145324A (ko) | 세균 파스퇴렐라 뉴모트로피카 유래 cas9 단백질의 용도 |