JPS584799A - 成熟ソ−マチンの遺伝暗号を有するdna配列 - Google Patents
成熟ソ−マチンの遺伝暗号を有するdna配列Info
- Publication number
- JPS584799A JPS584799A JP56200803A JP20080381A JPS584799A JP S584799 A JPS584799 A JP S584799A JP 56200803 A JP56200803 A JP 56200803A JP 20080381 A JP20080381 A JP 20080381A JP S584799 A JPS584799 A JP S584799A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- thaumatin
- dna
- sequence
- linker
- plasmid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
- C07K14/43—Sweetening agents, e.g. thaumatin, monellin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は完成(maturθ )ソーマチンの各種対立
遺伝子形を暗号化するDNA配列および前記DNA配列
を包含するクローニング媒質、および転換された微生物
におけるそれらの使用に関する0 ソーマチンはタウマドコツカス・ダニエリ(Thaum
atococcus daniellii ) の
果実の仮種皮に由来するタンパク質である。ソーマチン
は重量基準でショ糖より1600倍甘く、分子基準では
ショ糖より105倍甘い。西部社会において、ショ糖の
とり過きは多くの健康問題を起こしている。
遺伝子形を暗号化するDNA配列および前記DNA配列
を包含するクローニング媒質、および転換された微生物
におけるそれらの使用に関する0 ソーマチンはタウマドコツカス・ダニエリ(Thaum
atococcus daniellii ) の
果実の仮種皮に由来するタンパク質である。ソーマチン
は重量基準でショ糖より1600倍甘く、分子基準では
ショ糖より105倍甘い。西部社会において、ショ糖の
とり過きは多くの健康問題を起こしている。
それ故にショ糖の代りに低カロリー甘味料を用いる多く
の試みがなされている。しかしこれらの幾つかはありう
る副作用からみて最近禁止された。
の試みがなされている。しかしこれらの幾つかはありう
る副作用からみて最近禁止された。
従って、天然の低カロリー甘味料に対する、そしてこの
ような甘味料の経済的製造法に対する要求がある。分子
生物学における耀近の進歩は特別な真核生物タンパク質
を暗号化する構造遺伝子を微生物宿主細胞中に導入し、
前記遺伝子を形質転換された宿主細胞中で表現させ、そ
れにより望むタンパク質を生産することを可能にした。
ような甘味料の経済的製造法に対する要求がある。分子
生物学における耀近の進歩は特別な真核生物タンパク質
を暗号化する構造遺伝子を微生物宿主細胞中に導入し、
前記遺伝子を形質転換された宿主細胞中で表現させ、そ
れにより望むタンパク質を生産することを可能にした。
自然の状態でタンパク質をそれらの未修飾形で暗号化す
る真核生物由来の多くの遺伝子は組換えDNA分子にそ
のま″>適用できない。それは自然の遺伝子は伝令RN
A (mRNA) に金談れていないイントロンと
呼ばれるDNA配列を含むからである。これらイントロ
ンに置かれた情報はmRNAの翻訳過程前に真核生物細
胞中に移される。本発明者が知る限り、細菌はこのよう
なイントロンをRNAレベルで除去することができず、
それ故に真核生物の自然の遺伝子を原核生物の宿主細胞
に使用できる前にRNAレベルでこれらイントロン上に
置かれた遺伝情報を除去する必要がある。
る真核生物由来の多くの遺伝子は組換えDNA分子にそ
のま″>適用できない。それは自然の遺伝子は伝令RN
A (mRNA) に金談れていないイントロンと
呼ばれるDNA配列を含むからである。これらイントロ
ンに置かれた情報はmRNAの翻訳過程前に真核生物細
胞中に移される。本発明者が知る限り、細菌はこのよう
なイントロンをRNAレベルで除去することができず、
それ故に真核生物の自然の遺伝子を原核生物の宿主細胞
に使用できる前にRNAレベルでこれらイントロン上に
置かれた遺伝情報を除去する必要がある。
mRNAレベルでイントロンを除去する能力を有する微
生物宿主細胞において、自然の遺伝子を原理上適用でき
るが、それはこれらが前記微生物宿主細胞中で有効であ
るレギユロンの支配下に撫かれる限りにおいてである。
生物宿主細胞において、自然の遺伝子を原理上適用でき
るが、それはこれらが前記微生物宿主細胞中で有効であ
るレギユロンの支配下に撫かれる限りにおいてである。
本発明においては、真核生物由来の、特に植物由来の遺
伝情報を微生物の特に細菌の宿主細胞中で表現が効果的
に起こるような状態で導入する組換えDNA技術を使用
する。
伝情報を微生物の特に細菌の宿主細胞中で表現が効果的
に起こるような状態で導入する組換えDNA技術を使用
する。
本発明をよりよく理解するため、記述中で用いた最も重
要な用藺を定義することにする。
要な用藺を定義することにする。
レギユロンはプロモーターとオベレー・ター領域からな
るDNA配列である。
るDNA配列である。
構造遺伝子は鋳型(mRNA) を通して特別なポリ
ペプチドに特治のアミノ酸配列を暗号化するDNA配列
である。
ペプチドに特治のアミノ酸配列を暗号化するDNA配列
である。
プロモーターはRNAポリメラーゼが転写の開始のため
結合するレギユロン内のDNA配列である。
結合するレギユロン内のDNA配列である。
オペレーターはリルッサータンパク質が結合し、従って
RNAポリメラーゼが隣接プロモーターへ結合するのを
妨げるレギユロン内のDNA配列である。
RNAポリメラーゼが隣接プロモーターへ結合するのを
妨げるレギユロン内のDNA配列である。
誘導物質はリプレッ廿−タンパク質を不活性化し、オペ
レーターを自由にし、そしてRNAポリメラーゼをプロ
モーターへ結合させて転写を開始させる物質である。
レーターを自由にし、そしてRNAポリメラーゼをプロ
モーターへ結合させて転写を開始させる物質である。
完成ソーマチンとは完全に修飾されたタンパク質(佐吠
A )の対立遺伝子形の一つを意味する。
A )の対立遺伝子形の一つを意味する。
クローンニング媒質 適当な宿主細胞への転換後自己複
製を許すDNA配列(完全なレプリコン)を包含する非
染色体二本鎖DNAシラスミドまたはファージ。
製を許すDNA配列(完全なレプリコン)を包含する非
染色体二本鎖DNAシラスミドまたはファージ。
ファージまたはバクテリオファージ 適当な細菌宿主細
胞中で複製できる細菌性ウィルス。
胞中で複製できる細菌性ウィルス。
解読わ(mRNA レベルでコドンからポリペプチド
への同右の翻訳が起こるようなわくへ3個ひと続きのヌ
クレオチド(コドン)の集合−(/列 遺伝子からR
NAをつくる過程。
への同右の翻訳が起こるようなわくへ3個ひと続きのヌ
クレオチド(コドン)の集合−(/列 遺伝子からR
NAをつくる過程。
sy mRNAからポリペプチドをつくる過程。
表現 ポリペプチドをつくるため構造遺伝子により受け
る過程。これは少なくとも転写と翻訳とを含む多くの過
程の結合である。
る過程。これは少なくとも転写と翻訳とを含む多くの過
程の結合である。
完成ソーマチン遺伝子とは、完全に処理された(完成し
た)形でソーマチンの種々な対立遺伝子を暗号化する伝
令RNAの部分と正確に同じ情報含有榴(コドンの配列
順序)を有する二本dlDNA配列を意味する。便利さ
だけの理由でas D N Aの一本鎖だけを本文なら
びに図面に示した。
た)形でソーマチンの種々な対立遺伝子を暗号化する伝
令RNAの部分と正確に同じ情報含有榴(コドンの配列
順序)を有する二本dlDNA配列を意味する。便利さ
だけの理由でas D N Aの一本鎖だけを本文なら
びに図面に示した。
対立遺伝子形をコード化する構造1−伝子(11)
前記構造遺伝子の表現を調節する特別なりNA配列 を包含する組換えプラスミドが提供される。これら特別
なりNA配列は誘導可能または構成的なレギユロンの何
れかからなる。特に適当な誘導可能レイユロンはディー
、ブイ、ゴデル(D、V、 Goe−aael)等、N
ature 281 、544−548 (1978)
により記述された二重1ac UV 5系からなる。
前記構造遺伝子の表現を調節する特別なりNA配列 を包含する組換えプラスミドが提供される。これら特別
なりNA配列は誘導可能または構成的なレギユロンの何
れかからなる。特に適当な誘導可能レイユロンはディー
、ブイ、ゴデル(D、V、 Goe−aael)等、N
ature 281 、544−548 (1978)
により記述された二重1ac UV 5系からなる。
目8 埒叩 宥ご まに 目ギ
目8I 開部 恣べ 焔舅 トx 差回路?
1屍 部l シ炬 汐1 首足
1騎 BRE2 日M Hi 円革韮
aF EM 閂H■ 窪目罐8 目6
沼6 固6 にi 路定臣8
四ご 臣8 吊と ≦淀 臣と■
EHWfl、jfl 短墓 斃諸円詫 汐炬
罐8 目8 =わ 架ギ鰭躍
日? 自己 餌8 旨8 88−日
−(J E−1−υE−切H山Qのト
じυ H< <Cり 自ト
〉じ6M i40 55 間両 計
畳墓■ 1 ■ 已屍 岬i:i !i’
:論乏 目8 目上 垢8 目6
目8畦 畦 :;:j B * ij
u :; 3ツH出躍 8< く。 襲藁 日ミ 目躍
日ギ目自 目8 目8 目8 に8
深炬ビ く 足 畦 I l ■ 口承 わg 潤百 謳ビ pCりu Ocp Z○目目
むt に8 埒訃 I認 に旨 C2朗其 1 開扉 if、E mU 瞑O臼Q 部じ −じ 自Oφ<<< じじ む? 円屍 ≦1 臣8 ≦淀 ≦淀 園ビ 誤8 QQ uU 山E−1uh目目
まに まに 田藁 げ乾 ■ 複属 珪 −Q 削U 部じ L
A〇−ト エυ 国Q 工O ト1<E−1<ωトドく Ω−O切U 部0 ηQψ く gctv (JE−1he
h<1 翻 ■ I <リ へE@ 氏U
ψじ く。
目8I 開部 恣べ 焔舅 トx 差回路?
1屍 部l シ炬 汐1 首足
1騎 BRE2 日M Hi 円革韮
aF EM 閂H■ 窪目罐8 目6
沼6 固6 にi 路定臣8
四ご 臣8 吊と ≦淀 臣と■
EHWfl、jfl 短墓 斃諸円詫 汐炬
罐8 目8 =わ 架ギ鰭躍
日? 自己 餌8 旨8 88−日
−(J E−1−υE−切H山Qのト
じυ H< <Cり 自ト
〉じ6M i40 55 間両 計
畳墓■ 1 ■ 已屍 岬i:i !i’
:論乏 目8 目上 垢8 目6
目8畦 畦 :;:j B * ij
u :; 3ツH出躍 8< く。 襲藁 日ミ 目躍
日ギ目自 目8 目8 目8 に8
深炬ビ く 足 畦 I l ■ 口承 わg 潤百 謳ビ pCりu Ocp Z○目目
むt に8 埒訃 I認 に旨 C2朗其 1 開扉 if、E mU 瞑O臼Q 部じ −じ 自Oφ<<< じじ む? 円屍 ≦1 臣8 ≦淀 ≦淀 園ビ 誤8 QQ uU 山E−1uh目目
まに まに 田藁 げ乾 ■ 複属 珪 −Q 削U 部じ L
A〇−ト エυ 国Q 工O ト1<E−1<ωトドく Ω−O切U 部0 ηQψ く gctv (JE−1he
h<1 翻 ■ I <リ へE@ 氏U
ψじ く。
ミ8 埒百 固定 シ坏 罐8む?
埒叩 臣8 冑百 目躍QOω(J
+o りa oh瓢8 む已
目8 目8 臣8罐旨 ≦U 瞭
8 ゴ? 看8>Q c+Lvuh
>Q (JE−1目8 目8 シ矩
にi 圧目OU −〇
2■ 部ト −ト瓢8 目
8 l8 (支)浣 円躍責eM EN
iH苺l 芥と 巨d属#
特開昭58−4799(4)栖吹Aは(完成)ソ
ーマチンのアミノ酸配列と長 DNA配列を示す。a−ABはソーマチン遺伝子におけ
る対立型変異を示す。
埒叩 臣8 冑百 目躍QOω(J
+o りa oh瓢8 む已
目8 目8 臣8罐旨 ≦U 瞭
8 ゴ? 看8>Q c+Lvuh
>Q (JE−1目8 目8 シ矩
にi 圧目OU −〇
2■ 部ト −ト瓢8 目
8 l8 (支)浣 円躍責eM EN
iH苺l 芥と 巨d属#
特開昭58−4799(4)栖吹Aは(完成)ソ
ーマチンのアミノ酸配列と長 DNA配列を示す。a−ABはソーマチン遺伝子におけ
る対立型変異を示す。
もう一つの適当な誘導可能レギユロンはエフ。
リ − (’F 、 Lee ) 等、 J
’、 Mol、 Biol、 121 、
195〜217 (1978) およびケイ、バート
ラン1(K。
’、 Mol、 Biol、 121 、
195〜217 (1978) およびケイ、バート
ラン1(K。
Bertrand )等、EiCienC8189,2
2〜26 (1975)により記述されたトリプトファ
ン系の構成成分である。本発明者はこのトリプトファン
系を修正して第1図記寸・!、の一層適当な系を得た。
2〜26 (1975)により記述されたトリプトファ
ン系の構成成分である。本発明者はこのトリプトファン
系を修正して第1図記寸・!、の一層適当な系を得た。
この修正された系においで、トリプトファン アツテニ
ュエータータンパク質をコード化する情報は除かれる一
カリポソーム結合部位を保っている。
ュエータータンパク質をコード化する情報は除かれる一
カリポソーム結合部位を保っている。
本発明による絹換えプラスミドはバタテリオファージM
13、flのfd、の遺伝子■llの 修正タンパク顎
/リボンーム結合部位からなるD N A配列を包含す
る〔ビー、エム、ジー、エフ、ファンウエーセ゛ンビー
ク(P 0M 、 G 、 F 、 van Wez
enbeek)等、 Gen811.129〜148
(1980) )、そしテコノものは本出舶者の知る限
り真核生物遺伝子の表現1 に未だ使われていない。
13、flのfd、の遺伝子■llの 修正タンパク顎
/リボンーム結合部位からなるD N A配列を包含す
る〔ビー、エム、ジー、エフ、ファンウエーセ゛ンビー
ク(P 0M 、 G 、 F 、 van Wez
enbeek)等、 Gen811.129〜148
(1980) )、そしテコノものは本出舶者の知る限
り真核生物遺伝子の表現1 に未だ使われていない。
本発明による絹換えプラスミドにおいて、レギユロンは
構造遺伝子に的接結合するこさもあれば、ヌクレオチド
順序CAT (N)nGAATTO(N’)nATG
(式%式% よびN′はヌクレオチドA、T、GまたはOの何れかで
あるか、たたし二本鎖構造にもいてNとN′は同転対称
構造が存在する。ようなものであることを条件とする)
からなるD N A リンカ−を含む新親出発コドンお
よびEc oRエニー位を介して間1号的に結合するこ
さもある。
構造遺伝子に的接結合するこさもあれば、ヌクレオチド
順序CAT (N)nGAATTO(N’)nATG
(式%式% よびN′はヌクレオチドA、T、GまたはOの何れかで
あるか、たたし二本鎖構造にもいてNとN′は同転対称
構造が存在する。ようなものであることを条件とする)
からなるD N A リンカ−を含む新親出発コドンお
よびEc oRエニー位を介して間1号的に結合するこ
さもある。
回転対称構造とはNが例えばAにより表わされる1礪合
、N′は相袖的地基Tにより表わされねばならないこと
を音吐する。
、N′は相袖的地基Tにより表わされねばならないこと
を音吐する。
ある場合には、レギユロンと構造遺伝子との間の110
序AATTが除去されたとき表甲の収量が白土するとい
うことになる。
序AATTが除去されたとき表甲の収量が白土するとい
うことになる。
本発明による完成(完全に修飾された)ソーマチンの各
種対立遺伝子形を暗月に直す構造遺伝子を含む微生物ク
ローニング#質が得られ、種々なソーマチンが幾つかの
工程を実行することにより生産されるが、そのうぢ最も
本質的なものは次の通りである: nl ソーマチンの伝令RN A (mRNA)の学
齢およ精製、 f21 このmRNAから二本鎖DNA(deDNA
)への転換、 (3) ポリーdo尾を有するdsDNAの組立て、
(4+ 718 DNA−ポリーaC分子のエンド
ヌクレアーゼPstニー開裂およびポIJ −clG−
尾プラスミドpBR322D N Aへの加入、(5)
転換とクローン選択、 (61RNA/DNA 交雑および生体外翻訳による挿
入部の性質の決定、 T71DNAおよびRNA配列の分析による挿入部の性
質の二1チェック、 (8)完成の完全に修飾されたソーマチンを暗号化する
DNAを製造、 (9)%別な転写8組節DNA間列を包含するプラスミ
ドの組立て、およびD N A −IJンカーおよびD
NA−プライマーの化学的合成、 (Hl・ 構成的または誘導可能レギユロンおよび結ば
れたソーマチン遺伝子を包含するプラスミドの組立て、
および該プラスミドによるE 、coli の転換、 01)前記組換えフ0ラスミドを含むJ coli細胞
の培養、およびソーマチンの検出と単離。
種対立遺伝子形を暗月に直す構造遺伝子を含む微生物ク
ローニング#質が得られ、種々なソーマチンが幾つかの
工程を実行することにより生産されるが、そのうぢ最も
本質的なものは次の通りである: nl ソーマチンの伝令RN A (mRNA)の学
齢およ精製、 f21 このmRNAから二本鎖DNA(deDNA
)への転換、 (3) ポリーdo尾を有するdsDNAの組立て、
(4+ 718 DNA−ポリーaC分子のエンド
ヌクレアーゼPstニー開裂およびポIJ −clG−
尾プラスミドpBR322D N Aへの加入、(5)
転換とクローン選択、 (61RNA/DNA 交雑および生体外翻訳による挿
入部の性質の決定、 T71DNAおよびRNA配列の分析による挿入部の性
質の二1チェック、 (8)完成の完全に修飾されたソーマチンを暗号化する
DNAを製造、 (9)%別な転写8組節DNA間列を包含するプラスミ
ドの組立て、およびD N A −IJンカーおよびD
NA−プライマーの化学的合成、 (Hl・ 構成的または誘導可能レギユロンおよび結ば
れたソーマチン遺伝子を包含するプラスミドの組立て、
および該プラスミドによるE 、coli の転換、 01)前記組換えフ0ラスミドを含むJ coli細胞
の培養、およびソーマチンの検出と単離。
下肥の詳細な記述は本発明を印明するものである。
痔を液体窒素下で粉砕する。フェノールでのタンパク制
柚l:)I後、ケイ。ニス、カービイ(K、S。
柚l:)I後、ケイ。ニス、カービイ(K、S。
Kirby ) (1965) Biochem、 J
、 96.266〜269、ニー、ライ−がビス(U、
Vl/iegers )およびエッチ、ヒルッ(H,
H1]z ) FKBS Letters 23 。
、 96.266〜269、ニー、ライ−がビス(U、
Vl/iegers )およびエッチ、ヒルッ(H,
H1]z ) FKBS Letters 23 。
77〜82により記述された手順に従いLiO4による
RNAの選択的沈殿を行なう。伝令RNAを含むポリ−
Aをオリゴ−d、T−セルロースカラム上に何回か通す
ことにより回収し、このメツセンジ4 ヤー混合物からソーマチン−暗号化mRNAをポリアク
リルアミドデル電気泳動により単離する。これをエッチ
、アビブ(H,Aviv )およびビー、レーダー(P
、 Leder ) (1972)、Proc、Nat
l、Acaa。
RNAの選択的沈殿を行なう。伝令RNAを含むポリ−
Aをオリゴ−d、T−セルロースカラム上に何回か通す
ことにより回収し、このメツセンジ4 ヤー混合物からソーマチン−暗号化mRNAをポリアク
リルアミドデル電気泳動により単離する。これをエッチ
、アビブ(H,Aviv )およびビー、レーダー(P
、 Leder ) (1972)、Proc、Nat
l、Acaa。
Sci、U、S、 A、69.1408〜1412およ
びジエー、ダブリュー、ディピース(J、W、 Dav
ies )およびビー、カエスベルグ(P、 Kaes
berg) (1973)、J、 Virol、12.
1434〜1441により記述されたように小麦胚系で
mRNAの翻訳によりチェックする。
びジエー、ダブリュー、ディピース(J、W、 Dav
ies )およびビー、カエスベルグ(P、 Kaes
berg) (1973)、J、 Virol、12.
1434〜1441により記述されたように小麦胚系で
mRNAの翻訳によりチェックする。
2、 ソーマチンmRNAから二本@ D N Aへの
変換精製ソーマチンmRNAをジー、エヌ、プエル(G
、N、 Buel )等、J、 Biol Chem、
253.2471〜2482 (1978)により記述
された手順に従い、AMV逆伝写で複写して一本鎖DN
A分子をつくる。こ(1:) cDNA をその拶ニー
、アール、ディビス(A。
変換精製ソーマチンmRNAをジー、エヌ、プエル(G
、N、 Buel )等、J、 Biol Chem、
253.2471〜2482 (1978)により記述
された手順に従い、AMV逆伝写で複写して一本鎖DN
A分子をつくる。こ(1:) cDNA をその拶ニー
、アール、ディビス(A。
R,Davis ) %、Genθ10.205〜21
8 (198[1)により記述された手順に従い、15
coli D N A −ポリメラーゼにより二本
鎖分子に変える。この二本鎖DNA捨写のループ構造を
81−ヌクレアーゼ消化により除く。
8 (198[1)により記述された手順に従い、15
coli D N A −ポリメラーゼにより二本
鎖分子に変える。この二本鎖DNA捨写のループ構造を
81−ヌクレアーゼ消化により除く。
1 ベ
ロ ポリ−60尾を有する二本Q D N Aの組立て
望む長さのDNA分子はアール、ロイチョウ1ζフリイ
(RoRoych、0udhury )等、Nucle
ic Ac1dsResearch 3.866〜87
7 (1976)により記述された手順に従い、ポリア
クリルアミドヶゞルー電気泳動、ケゝルからの抽出、お
よび末端トランスフェラーゼによるボIJ doでの尾
部結合により得られる。
望む長さのDNA分子はアール、ロイチョウ1ζフリイ
(RoRoych、0udhury )等、Nucle
ic Ac1dsResearch 3.866〜87
7 (1976)により記述された手順に従い、ポリア
クリルアミドヶゞルー電気泳動、ケゝルからの抽出、お
よび末端トランスフェラーゼによるボIJ doでの尾
部結合により得られる。
4 プラスミドpBR322におけるds D N A
−d。
−d。
分子の統合
フ0ラスミドpBR322をβ−ラクタマーーV遺伝子
にある識別部位のところでプラスミドを開裂する制β1
・・エンドヌクレアーセ゛’ Pet工 で処理し、そ
の後pBRろ22の直線化されたDNAKポリ−60尾
を末端トランスフェラーゼ゛により供給する。このボI
J −d、0尾をつけたDNA分子をアニールしてポリ
ーdG尾をつけたプラスミド1)BR322とする。
にある識別部位のところでプラスミドを開裂する制β1
・・エンドヌクレアーセ゛’ Pet工 で処理し、そ
の後pBRろ22の直線化されたDNAKポリ−60尾
を末端トランスフェラーゼ゛により供給する。このボI
J −d、0尾をつけたDNA分子をアニールしてポリ
ーdG尾をつけたプラスミド1)BR322とする。
5、転換およびクローン選択
このようにして得たプラスミドをcact2−処理E、
C011細胞に転移させる。転換後交雑プラスミI
′J ドD N l>分子を含む細胞なテi・ラサイクリンに
対する耐性に基づき選択する。陽性コロニイをエッチ、
シー、パーンポイム(HlO,B1.rnboim )
およびジエイ、ドリイ(J、 DOly) 、 N
ucl、eic Ac1c1.8Research、
7.1513〜1523 (1979>により概述され
た迅速シラスミド抽出法と単離されたT) N Aのエ
ンドヌクレアーゼPst−■−消化との組合わせにより
大きい挿入部を有するシラスミドに対してふるい分目す
る。
C011細胞に転移させる。転換後交雑プラスミI
′J ドD N l>分子を含む細胞なテi・ラサイクリンに
対する耐性に基づき選択する。陽性コロニイをエッチ、
シー、パーンポイム(HlO,B1.rnboim )
およびジエイ、ドリイ(J、 DOly) 、 N
ucl、eic Ac1c1.8Research、
7.1513〜1523 (1979>により概述され
た迅速シラスミド抽出法と単離されたT) N Aのエ
ンドヌクレアーゼPst−■−消化との組合わせにより
大きい挿入部を有するシラスミドに対してふるい分目す
る。
選ばれたクローンから10μgのプラスミドDNAが単
離され、後にこれをジアゾテートを付けた( 、D B
M )紙円板に固定する。不動化されたシラスミ1D
NA分子を、D N A挿入部の性質を測定するため、
ジエイ、ジー、ウィリアムス(J。
離され、後にこれをジアゾテートを付けた( 、D B
M )紙円板に固定する。不動化されたシラスミ1D
NA分子を、D N A挿入部の性質を測定するため、
ジエイ、ジー、ウィリアムス(J。
G、 Williams )等、Ce11.17.90
3〜913(1979)により概述されたように交雑/
試験管内翻訳法に用いる。
3〜913(1979)により概述されたように交雑/
試験管内翻訳法に用いる。
7゜ D N A/RN A配列分析による挿入部(1
1)の性質の決定 ソーマチン挿入部のヌクレオチド配列分析はニー、エム
、マキサム(AlM、 Maxam )およびダシリュ
ー、ギルバート(W、G11l)+3rt )、Met
hodsin EnZ7m010g7.編集者エル、グ
ロスマン(L、1GrOssman )およびケイ、モ
ルディプ(K6Mo1−dave)、ニューヨーク、ア
カデミツク プレス、1980年65巻(1)、499
〜560頁に概述された化学分解法により、またジエイ
、マート(J、 Maat )およびニー、ジエイ、エ
ッチ、スミス(A、J、H,Sm1th )、Nucl
eic Ac15 Re5earch。
1)の性質の決定 ソーマチン挿入部のヌクレオチド配列分析はニー、エム
、マキサム(AlM、 Maxam )およびダシリュ
ー、ギルバート(W、G11l)+3rt )、Met
hodsin EnZ7m010g7.編集者エル、グ
ロスマン(L、1GrOssman )およびケイ、モ
ルディプ(K6Mo1−dave)、ニューヨーク、ア
カデミツク プレス、1980年65巻(1)、499
〜560頁に概述された化学分解法により、またジエイ
、マート(J、 Maat )およびニー、ジエイ、エ
ッチ、スミス(A、J、H,Sm1th )、Nucl
eic Ac15 Re5earch。
5、4567〜4545 (1978)により概説され
たジデオキシ/ニック翻訳法により行う。ソーマチンm
RNAのヌクレオチド配列についてのこれ以上の情報は
ディ、ジム?−7(D、 Zimmern ) および
ビー。
たジデオキシ/ニック翻訳法により行う。ソーマチンm
RNAのヌクレオチド配列についてのこれ以上の情報は
ディ、ジム?−7(D、 Zimmern ) および
ビー。
カエスベルグ(P 、Kaesberg )、Proc
、 Natl。
、 Natl。
Aaad、Sci、D、8.A、75.4257〜42
61 (1978)により概説、されたように、連鎖停
止阻害剤存在下に、ソーマチンmRNA鋳型上でのAM
’V−逆トランスクリゾターゼによるゾライマー付は合
成によって1 日 間接的に誘導された。このスクリーニングは、就中ソー
マチンmRNA の殆ど完全な複製を含むシラスミド
1)UR100を与える。
61 (1978)により概説、されたように、連鎖停
止阻害剤存在下に、ソーマチンmRNA鋳型上でのAM
’V−逆トランスクリゾターゼによるゾライマー付は合
成によって1 日 間接的に誘導された。このスクリーニングは、就中ソー
マチンmRNA の殆ど完全な複製を含むシラスミド
1)UR100を与える。
ニー、ジエイ、エッチ、スミス、NucleicAcl
aa Re50.6.831〜848 (1979)に
より概説されたpUR100のエキソヌクレアーゼ川処
理により、才たはビー、グローネンボーン(B、Gro
nenborn)およびジエイ、メツシング(J0Mθ
ssing )、Nature272.275〜277
(1978) K 、、l:すRN’itすしたM1
3におけるクローニングにより一本4JDNAが得られ
る。ソーマチンmRNAと同じ極性を有する一本鎖DN
Aを、プライマーとして役立つ化学的に合成されたオリ
ゴヌクレオチド(5′)pTOAGGOAGTAGGG
cA□H(3’)を用いる相補的DNA合成のための鋳
型として用いた。二本Q D N Aの熱変性後、化学
的に合成されたオリゴヌクレオチド(5’) pGOO
AOCTTOGoH(ff) をプライマーとして使
用するこきにより相補的DNAがDNA合成のだ Q めの鋳型として役立つ。次にこの二本鎖DNAを81ヌ
クレアーゼで処理する。完成ソーマチン遺伝子の組立て
を第2図で説明する。
aa Re50.6.831〜848 (1979)に
より概説されたpUR100のエキソヌクレアーゼ川処
理により、才たはビー、グローネンボーン(B、Gro
nenborn)およびジエイ、メツシング(J0Mθ
ssing )、Nature272.275〜277
(1978) K 、、l:すRN’itすしたM1
3におけるクローニングにより一本4JDNAが得られ
る。ソーマチンmRNAと同じ極性を有する一本鎖DN
Aを、プライマーとして役立つ化学的に合成されたオリ
ゴヌクレオチド(5′)pTOAGGOAGTAGGG
cA□H(3’)を用いる相補的DNA合成のための鋳
型として用いた。二本Q D N Aの熱変性後、化学
的に合成されたオリゴヌクレオチド(5’) pGOO
AOCTTOGoH(ff) をプライマーとして使
用するこきにより相補的DNAがDNA合成のだ Q めの鋳型として役立つ。次にこの二本鎖DNAを81ヌ
クレアーゼで処理する。完成ソーマチン遺伝子の組立て
を第2図で説明する。
9a、 、OラスミドpUR2r]10組立て二重1a
cレギユロン(lac UV 5 ) を包含する2
85塩基対を含む断片をpKB 268の制限エンドヌ
クレアーゼBao R工開裂により得る〔ケイ、バンク
マン(K、Backmhn )およびエム、ブタシュン
(M、Ptaehne )、081113.65〜71
(1978) )。
cレギユロン(lac UV 5 ) を包含する2
85塩基対を含む断片をpKB 268の制限エンドヌ
クレアーゼBao R工開裂により得る〔ケイ、バンク
マン(K、Backmhn )およびエム、ブタシュン
(M、Ptaehne )、081113.65〜71
(1978) )。
コノ断片をpBR322DNA ノRcoRI部位に結
紮する。右方向に1aOレギユロンを有するシラスミド
D IJ A (第4図)をJ coli RN A
ポリメラーゼの存在でBcoR工により部分的に開裂さ
せる。制限エンドヌクレアーゼ ヒンl’ l開裂部位
から最も遠いBcORI開裂部位が優先的に攻撃される
。直線化されたDNAを81ヌクレアーゼで処理し、ア
ガロースデル電気泳動により精製し、’I”4 DNA
−リが−ゼによる結紮により環状にし、その後E、コリ
ーの転換に用いる。テトラサイクリン耐性転換体から正
しい構造(第6図)を有するpUR7 201が得られる。
紮する。右方向に1aOレギユロンを有するシラスミド
D IJ A (第4図)をJ coli RN A
ポリメラーゼの存在でBcoR工により部分的に開裂さ
せる。制限エンドヌクレアーゼ ヒンl’ l開裂部位
から最も遠いBcORI開裂部位が優先的に攻撃される
。直線化されたDNAを81ヌクレアーゼで処理し、ア
ガロースデル電気泳動により精製し、’I”4 DNA
−リが−ゼによる結紮により環状にし、その後E、コリ
ーの転換に用いる。テトラサイクリン耐性転換体から正
しい構造(第6図)を有するpUR7 201が得られる。
9b、プラスミドpUR301の組立て約510塩基対
のDNA断片が、ptrp ED 5の制限エンドヌク
レアーゼH1nf工開裂により得られた〔アール、ニー
、ハルレーウエル、 (R,A。
のDNA断片が、ptrp ED 5の制限エンドヌク
レアーゼH1nf工開裂により得られた〔アール、ニー
、ハルレーウエル、 (R,A。
Hallewel )およびニス、エムテージ(S 、
Ti!mtage )、Genθ9.27〜47 (
1980) )。この断片をFi、 coliRNAポ
リメラーゼ存在下制限エンドヌクレアーゼTaq工で開
裂させる。trpレギユロンにおけるTaq X部位〔
ケイ、パートランド(K、Bertrana )等、
5ience、 189.22〜26 (1975)お
よびエフ。
Ti!mtage )、Genθ9.27〜47 (
1980) )。この断片をFi、 coliRNAポ
リメラーゼ存在下制限エンドヌクレアーゼTaq工で開
裂させる。trpレギユロンにおけるTaq X部位〔
ケイ、パートランド(K、Bertrana )等、
5ience、 189.22〜26 (1975)お
よびエフ。
リー(IP、Lee )等1.r、 1ao1.Bj、
ol、 tl、195〜217 (1978)により記
述〕を選択的に保護し、このようにしてtrpレギユロ
ン(第1図)からなる264塩基対を含む断片を得る。
ol、 tl、195〜217 (1978)により記
述〕を選択的に保護し、このようにしてtrpレギユロ
ン(第1図)からなる264塩基対を含む断片を得る。
次にこの断片を131 ヌク1/アーゼで処理し、m
coRニリンカー(5′)pGGAAT T OOou
(3’)で鈍端結紮し、Ec oR工で切断し、その
後pBR322の FicoFtニ一部位でクローニン
グゝする。
coRニリンカー(5′)pGGAAT T OOou
(3’)で鈍端結紮し、Ec oR工で切断し、その
後pBR322の FicoFtニ一部位でクローニン
グゝする。
正しい方向にあるtrp L/ギュロンを有するプラス
ミドpUB 300 (第1図)を単離した。Hlna
1部位から最も遠いBcoRニー開裂部位をエチジウ
ムプロミドの存在下EcoR工によるpUR3QQ D
NAの部分開裂によりそしてS1ヌクレアーゼ処理によ
り除去する。線状11 tJ A分子をT4DNAIJ
ガーゼにより再環化する。テトラサイクリン耐性転換体
から第1図に概説された構造をもつpUR301が得ら
れる。
ミドpUB 300 (第1図)を単離した。Hlna
1部位から最も遠いBcoRニー開裂部位をエチジウ
ムプロミドの存在下EcoR工によるpUR3QQ D
NAの部分開裂によりそしてS1ヌクレアーゼ処理によ
り除去する。線状11 tJ A分子をT4DNAIJ
ガーゼにより再環化する。テトラサイクリン耐性転換体
から第1図に概説された構造をもつpUR301が得ら
れる。
9c、プラスミドルD式401の組立て269塩渣対を
含む断片(DNA配列1128〜1379)を制御l−
,エン1?ヌ々レアーゼTaq工および↓(ae li
を用いる’RFM13DnA(ビー、エム、シー、エフ
、ブイ、ウエーゼンビーク(P。
含む断片(DNA配列1128〜1379)を制御l−
,エン1?ヌ々レアーゼTaq工および↓(ae li
を用いる’RFM13DnA(ビー、エム、シー、エフ
、ブイ、ウエーゼンビーク(P。
M、 G、 F、V、Wezenbeelc )等、G
ene 11.129〜148(1980) )の消化
により得、そのTaq I部位を14. coli
D N Aポリメラーゼを用いる4Vja fM反応に
より鈍端とし、断片をその後制限醇索Mnlφ工で部分
消化する。この部分的生成物をT4DNAポリメラーゼ
およびS1ヌクレアーゼの連続作用で処理し、その後E
coRニーリンカ−(5’)plJGMTTOO□H0 (6′)で鈍端結紮し、次にEcoR工で処理し、そし
てpBR322のEcoRI部位で結紮する。制限酵素
分析およびDNA配列分析により、FicORI開裂部
位が1416遺伝子’%l1ll DNA配列のリポソ
ーム結合部位を丁度越えて位置するシラスミドが得られ
る。
ene 11.129〜148(1980) )の消化
により得、そのTaq I部位を14. coli
D N Aポリメラーゼを用いる4Vja fM反応に
より鈍端とし、断片をその後制限醇索Mnlφ工で部分
消化する。この部分的生成物をT4DNAポリメラーゼ
およびS1ヌクレアーゼの連続作用で処理し、その後E
coRニーリンカ−(5’)plJGMTTOO□H0 (6′)で鈍端結紮し、次にEcoR工で処理し、そし
てpBR322のEcoRI部位で結紮する。制限酵素
分析およびDNA配列分析により、FicORI開裂部
位が1416遺伝子’%l1ll DNA配列のリポソ
ーム結合部位を丁度越えて位置するシラスミドが得られ
る。
本発明者等はM13 レギユロンを有するシラスミド
(ヌクレオチド1128からヌクレオチr1291〜1
297)が表現に適したレギユロンであることを見出し
た。Hlnd 1部位から最も遠いEcoR工開裂部位
はpUR301に対して本質的に記述したようにしで除
かれる。pUR401の完全な組立てを第4図に示す。
(ヌクレオチド1128からヌクレオチr1291〜1
297)が表現に適したレギユロンであることを見出し
た。Hlnd 1部位から最も遠いEcoR工開裂部位
はpUR301に対して本質的に記述したようにしで除
かれる。pUR401の完全な組立てを第4図に示す。
9(1,IJンカーおよびゾライマーの化学的合成オリ
ボデキシヌクレオチドの合成は5’−o−レブリニルデ
オキシヌクレオシド−3’−0−2,2゜2−トリクロ
ロエチル−2−クロロフェニルホスフェートをデオキシ
ヌクレオシド−3’−0−2゜2 、2− トIJ ク
ロロエチル−2−クロロフェニルホスフェートとのカッ
シリングにより行なわれる。
ボデキシヌクレオチドの合成は5’−o−レブリニルデ
オキシヌクレオシド−3’−0−2,2゜2−トリクロ
ロエチル−2−クロロフェニルホスフェートをデオキシ
ヌクレオシド−3’−0−2゜2 、2− トIJ ク
ロロエチル−2−クロロフェニルホスフェートとのカッ
シリングにより行なわれる。
ホスホトリエステル法として知られるこの方法は1、
1 〔ジエイ、エフ、エム、ド、ルーイ(、T、F+M、(
lθRooij )等、Real、 Trav、 Oh
im、Pays −Bas匝、567〜548 (19
79)VLより記述〕、活性亜鉛によるトリクロロエチ
ル基の間装除去とそれに続<2.4.6−ドリイソプロ
ビルベンセ゛ンスルホニルー6−ニトロ−1,2,4−
トリアゾールの助けを用いる実際のカップリング反応を
含む。
1 〔ジエイ、エフ、エム、ド、ルーイ(、T、F+M、(
lθRooij )等、Real、 Trav、 Oh
im、Pays −Bas匝、567〜548 (19
79)VLより記述〕、活性亜鉛によるトリクロロエチ
ル基の間装除去とそれに続<2.4.6−ドリイソプロ
ビルベンセ゛ンスルホニルー6−ニトロ−1,2,4−
トリアゾールの助けを用いる実際のカップリング反応を
含む。
デオキシアデノシン、デオキシシチジンおよびデオキシ
グアノシンにおけるアミン基はそれぞれベンゾイル基、
4−メトキシベンゾイル基およびベンゾイル基により&
[する。末端ヌクレオシドの3′−ヒドロキシ基の保護
にはベンゾイル基が用いられる。最後の段階ですべての
保護基はそれぞれフッ化テトラブチルアンモニウムおよ
び績アンモニア水との反応により除去される。
グアノシンにおけるアミン基はそれぞれベンゾイル基、
4−メトキシベンゾイル基およびベンゾイル基により&
[する。末端ヌクレオシドの3′−ヒドロキシ基の保護
にはベンゾイル基が用いられる。最後の段階ですべての
保護基はそれぞれフッ化テトラブチルアンモニウムおよ
び績アンモニア水との反応により除去される。
リンカ−(5’)pOATGAATTOATG□H(3
’)の組立ての一例を第5図に示す。
’)の組立ての一例を第5図に示す。
6
8に記載のソーマチン暗号づけDNA断片をT4DNA
りが一ゼを用いて合成Fic oRエニーンカ−(5′
)pOAT(N)rlGAATTO(N’)nATGo
H(3つにより針部結紮し、FicoRI テ開裂し、
ソノ後プラスミドpUR2o1、pUR301およびp
UR401のEc oRエニー裂部位に結紮し、第6図
に示したような方向でソーマチン暗号づけ挿入部を有す
る組換えシラスミドを、E。
りが一ゼを用いて合成Fic oRエニーンカ−(5′
)pOAT(N)rlGAATTO(N’)nATGo
H(3つにより針部結紮し、FicoRI テ開裂し、
ソノ後プラスミドpUR2o1、pUR301およびp
UR401のEc oRエニー裂部位に結紮し、第6図
に示したような方向でソーマチン暗号づけ挿入部を有す
る組換えシラスミドを、E。
C011の転換およびテトラサイクリン剛性転換体の選
択後に単離した。上記プラスミドにおいて、化学的に合
成されたリンカ−に由来するAATT順序はエチジウム
プロミドの存在下KcoRIを用いるシラスミドの開裂
により削除でき、線状部分はアガロースデル電気泳動に
より単離され、S1ヌクレアーゼで処理され、そしてT
41Jガ一ゼ作用により再環化される。
択後に単離した。上記プラスミドにおいて、化学的に合
成されたリンカ−に由来するAATT順序はエチジウム
プロミドの存在下KcoRIを用いるシラスミドの開裂
により削除でき、線状部分はアガロースデル電気泳動に
より単離され、S1ヌクレアーゼで処理され、そしてT
41Jガ一ゼ作用により再環化される。
AATTの削除後に得られるシラスミドは制限酵素分析
により検出された。
により検出された。
11、組換えプラスミドを含むE、coli細胞の培養
−−2−−1−1“−一−−□−−−−−−−□−一−
−−−一一一−−−□□−−□□とソーマチンの検出 正しい方向と解読わく中にレギユロンと完成ソーマチン
遺伝子との間のリンカ−にAATT配列を有する、ある
いは有しないフ0ラスミドpUR520またはpUR5
30またはpUR540を含むE、 coli細胞をそ
の発育に最適の条件下で培養する。これら培養条件は細
胞中に存在するプラスミドの型により変化するか、常に
選択圧を維持するため適当な抗生物質の存在下で行なう
。これら条件下でシラスミドpUR520またはpUR
530またはpUR540の何れかを含む細胞は相当な
量の完成ソーマチンを生じた。タンパク儒ソーマチンの
存在は、定性的にはS、D、S、i、I′気泳動により
また甘味に関する生理学的試験により、そして定量的に
は酵素結合した免役吸収剤分析(ELISA)により実
証された。
−−2−−1−1“−一−−□−−−−−−−□−一−
−−−一一一−−−□□−−□□とソーマチンの検出 正しい方向と解読わく中にレギユロンと完成ソーマチン
遺伝子との間のリンカ−にAATT配列を有する、ある
いは有しないフ0ラスミドpUR520またはpUR5
30またはpUR540を含むE、 coli細胞をそ
の発育に最適の条件下で培養する。これら培養条件は細
胞中に存在するプラスミドの型により変化するか、常に
選択圧を維持するため適当な抗生物質の存在下で行なう
。これら条件下でシラスミドpUR520またはpUR
530またはpUR540の何れかを含む細胞は相当な
量の完成ソーマチンを生じた。タンパク儒ソーマチンの
存在は、定性的にはS、D、S、i、I′気泳動により
また甘味に関する生理学的試験により、そして定量的に
は酵素結合した免役吸収剤分析(ELISA)により実
証された。
次のプラスミドを含有するE、coli 菌体はATO
C! に寄託されている。
C! に寄託されている。
pUR520−ATOO39014
pUR522−ATOO39016
pUR523−ATOO39017
6
pUR531−ATOO39015゜
第1図は1)UR301への転換とその構造を示した図
であり、第2図は完成ソーマチンを暗号化するDNA配
列の組立てを示し、第6図はpUR201の構造を示し
、第4図はプラスミドpUR401の完全な組立てを示
し、第5図はD N A、 IJンカーの組立てを示し
、第6図はシラスミドpUR520、pUR530およ
びpUR540の組立てを示す。 代理人 浅 利 皓 7 第1頁の続き 0発 明 者 ルツボ・エデンス オランダ国マースルイス・アル ベルト・シュバイッードレーフ 9 0発 明 者 ロベルト・クロック オランダ国ブラールデインゲン ・ヴイルゲンドレーフ29 0発 明 者 ジャン・マート オランタ国モンスター・モレン ストラーセ2 昭和57年 り月 77日 特許庁長官殿 1、事件の表示 昭和56年特許願第200803 号 2、発明の名称 DNA配列 3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住 所 氏名 ユニリーバ−ナームローゼ ペンノートシャー
プ(名 称) 4、代理人 電 話 (211) 3651 (代表)氏 名
(6669) 浅 村 皓5、補正命令
の日付 昭和S7年 0月30日 6、補正により増加する発明の数 7、補正の対象 明細書 図面の浄書 (内容に変更なし) 8、補正の内容 別紙のとおり 明細書の浄書(内容に変更な〜しa
であり、第2図は完成ソーマチンを暗号化するDNA配
列の組立てを示し、第6図はpUR201の構造を示し
、第4図はプラスミドpUR401の完全な組立てを示
し、第5図はD N A、 IJンカーの組立てを示し
、第6図はシラスミドpUR520、pUR530およ
びpUR540の組立てを示す。 代理人 浅 利 皓 7 第1頁の続き 0発 明 者 ルツボ・エデンス オランダ国マースルイス・アル ベルト・シュバイッードレーフ 9 0発 明 者 ロベルト・クロック オランダ国ブラールデインゲン ・ヴイルゲンドレーフ29 0発 明 者 ジャン・マート オランタ国モンスター・モレン ストラーセ2 昭和57年 り月 77日 特許庁長官殿 1、事件の表示 昭和56年特許願第200803 号 2、発明の名称 DNA配列 3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住 所 氏名 ユニリーバ−ナームローゼ ペンノートシャー
プ(名 称) 4、代理人 電 話 (211) 3651 (代表)氏 名
(6669) 浅 村 皓5、補正命令
の日付 昭和S7年 0月30日 6、補正により増加する発明の数 7、補正の対象 明細書 図面の浄書 (内容に変更なし) 8、補正の内容 別紙のとおり 明細書の浄書(内容に変更な〜しa
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 I’ll 4m=宍AおよびBK紀戦の守成ソーマチ
ンの種々な対立遺伝子形を暗号化するDNA配列。 (2) 完成ソーマチンの種々な対立遺伝子形を暗号
化するDNA配列および誘導可能な才たは構成的なレギ
ユロンからなる構造遺伝子の表現、を調節する特別なり
NA配列を包含する絹換えプラスミド。 (3)構造遺伝子の衣用をi周部する特別なりNA配列
が二重1ac U V 5糸からなる誘導可能なレギュ
ローンを包含する第2拍記載の絹伸えグラスミド(@6
1シ1記載のシラスミドpUR520)。 (4) 構造遺伝子の表現を調節する特別なりNA配
列が修正されたトリプトファン系を包含する第2項記載
の組換えプラスミド(第6図記載・Vのプラスミ ド
pUR530) 。 (5)模造遺伝子の表現を調節する特別なり N A配
列が修正されたM13遺伝子■糸を包含する第2項記載
の組換えグラスミド(第6図記載の)0ラスミ ド p
UR540) 。 (口 構造遺伝子をレギユロンのBco R工部位へヌ
クレオチド配列(5’ )pcAT(N)nGAATT
O(N’)nATGoH(3’) (式中、n =Q、
1.2才たはろであり、N オヨヒN ’はヌクレオチ
ドA、T、GまたはCの伺イ1かであるか、たたし二本
鎖4(〆、造中の19とN’は回転対イシ]\栴造が存
在するようなものであることを孝、rl−とする)を有
するBcoRI処理D N A IJンカーを経て結合
させる第1項から第5項のいずれか1mに記載の組換え
フ0ラスミド。 (7) ヌクレオチド配列(5’)pOAT(IJ
)n GAATTO(N’)nATGOI>(6つ(式
中、n = Q、1,2またはろであり、NおよびN′
はヌクレオチドA、T、GiたはCの何れかであるか、
ただし封およびN′は二本鎖構造において回転対称構造
が存在するようなものであることを条件とする)を有す
るI) N A−リンカ−〇 (8) 第1項から第7項までのいずれか1項に記載
のプラスミドを包含する少なくさも一つの微生物からク
ローニングされた細菌培養物。 (9) レギユロンとソーマチン遺伝子との間のリン
カ−中に、AATT配列と共にあるいは無しにI)UR
520を含むE、coli細胞を包含する細菌培養物。 Qtj レギユロンとソーマチン遺伝子との間のリン
カ−中に、AATT配列と共にあるいは無しに、pUR
530を含むJ C01i細胞を包含する細菌培養物。 (1ト レギユロンとソーマチン遺伝子との間のリン
カ−中に、AATT配列と共にあるいは無しに、pUR
540を含むE、C01i細I泡を包含する細菌培養物
。 02、第1項から第11角までのいずれか1角に記載の
プラスミドを橡生物のクローニング媒愉中に添加し、転
換された細胞を培養し、前記細胞により生産された′ソ
ーマチンを学齢するこさを特徴とする、ソーマチンの製
造法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB8039855 | 1980-12-12 | ||
GB8039855 | 1980-12-12 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS584799A true JPS584799A (ja) | 1983-01-11 |
JPS615392B2 JPS615392B2 (ja) | 1986-02-18 |
Family
ID=10517943
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP56200803A Granted JPS584799A (ja) | 1980-12-12 | 1981-12-12 | 成熟ソ−マチンの遺伝暗号を有するdna配列 |
JP60140090A Granted JPS6143996A (ja) | 1980-12-12 | 1985-06-26 | ソ−マチンの製造法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP60140090A Granted JPS6143996A (ja) | 1980-12-12 | 1985-06-26 | ソ−マチンの製造法 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4891316A (ja) |
EP (1) | EP0054330B1 (ja) |
JP (2) | JPS584799A (ja) |
AT (1) | ATE22327T1 (ja) |
BR (1) | BR8108074A (ja) |
CA (1) | CA1192151A (ja) |
DE (1) | DE3175357D1 (ja) |
IE (1) | IE52417B1 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS60501290A (ja) * | 1983-05-19 | 1985-08-15 | ユニリ−バ− ナ−ムロ−ゼ ベンノ−トシヤ−プ | 酵母細胞に新しく導入した遺伝子の発現改良 |
JPS63501264A (ja) * | 1985-11-13 | 1988-05-19 | インターナシヨナル ジネテイツク エンジニアリング インコーポレイテツド | タウマチン1類似体をコードするdna |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ZA811368B (en) | 1980-03-24 | 1982-04-28 | Genentech Inc | Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator |
DK489481A (da) * | 1980-11-10 | 1982-05-11 | Searle & Co | Plasmidvektor og frmgangsmaade til fremstilling deraf |
US5525484A (en) * | 1981-01-16 | 1996-06-11 | Genome Therapeutics Corp. | Recombinant DNA means and method for producing rennin, prorenin and pre-prorennin |
BR8205954A (pt) * | 1981-10-14 | 1983-09-13 | Unilever Nv | Sequencia de dna,plasmidio recombinante,cultura bacteriana e microorganismos |
HU204097B (en) | 1982-05-19 | 1991-11-28 | Gist Brocades Nv | Process for producing cloning system relating to kluyveromyces species |
US4666839A (en) * | 1982-12-01 | 1987-05-19 | Amgen | Methods and materials for obtaining microbial expression of polypeptides including bovine prolactin |
AU577334B2 (en) * | 1983-10-11 | 1988-09-22 | International Genetic Engineering, Inc. | Synthetic thaumatin genes |
ATE66251T1 (de) * | 1983-12-23 | 1991-08-15 | Pfizer | Expressionsplasmide fuer die herstellung eines heterologen proteins in bakterien. |
US4935370A (en) * | 1983-12-23 | 1990-06-19 | Pfizer Inc. | Expression plasmids for improved production of heterologous protein in bacteria |
BR8807102A (pt) * | 1987-06-19 | 1989-10-17 | Lucky Biotech Corp | Preparacao de novos adocantes de proteina |
ES2080689B1 (es) * | 1994-04-21 | 1996-09-01 | Urquima Sa | Procedimiento de obtencion de un edulcorante natural proteico. |
AU6674296A (en) * | 1995-06-23 | 1997-01-22 | University Of Hawaii | Recombinant sweet protein mabinlin |
RU2261275C2 (ru) * | 2002-10-24 | 2005-09-27 | Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук | Способ получения трансгенных растений с повышенной устойчивостью к фитопатогенам |
WO2012115201A1 (ja) | 2011-02-25 | 2012-08-30 | 日本精工株式会社 | 分割軌道輪およびその製造方法 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4237224A (en) * | 1974-11-04 | 1980-12-02 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University | Process for producing biologically functional molecular chimeras |
NZ187300A (en) * | 1977-05-27 | 1982-08-17 | Univ California | Dna transfer vector and micro-organism modified to contain a nucleotide sequence equivalent to the gene of a higher organism |
US4321365A (en) * | 1977-10-19 | 1982-03-23 | Research Corporation | Oligonucleotides useful as adaptors in DNA cloning, adapted DNA molecules, and methods of preparing adaptors and adapted molecules |
US4336336A (en) * | 1979-01-12 | 1982-06-22 | President And Fellows Of Harvard College | Fused gene and method of making and using same |
CA1202581A (en) * | 1980-03-27 | 1986-04-01 | Saran A. Narang | Adaptor molecules for dna and their application to synthesis of gene-derived products |
-
1981
- 1981-12-11 BR BR8108074A patent/BR8108074A/pt unknown
- 1981-12-11 DE DE8181201354T patent/DE3175357D1/de not_active Expired
- 1981-12-11 CA CA000392095A patent/CA1192151A/en not_active Expired
- 1981-12-11 EP EP81201354A patent/EP0054330B1/en not_active Expired
- 1981-12-11 IE IE2919/81A patent/IE52417B1/en not_active IP Right Cessation
- 1981-12-11 AT AT81201354T patent/ATE22327T1/de not_active IP Right Cessation
- 1981-12-12 JP JP56200803A patent/JPS584799A/ja active Granted
-
1985
- 1985-06-07 US US06/742,139 patent/US4891316A/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-06-26 JP JP60140090A patent/JPS6143996A/ja active Granted
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS60501290A (ja) * | 1983-05-19 | 1985-08-15 | ユニリ−バ− ナ−ムロ−ゼ ベンノ−トシヤ−プ | 酵母細胞に新しく導入した遺伝子の発現改良 |
JPS63501264A (ja) * | 1985-11-13 | 1988-05-19 | インターナシヨナル ジネテイツク エンジニアリング インコーポレイテツド | タウマチン1類似体をコードするdna |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0054330B1 (en) | 1986-09-17 |
EP0054330A3 (en) | 1982-09-22 |
EP0054330A2 (en) | 1982-06-23 |
JPH0441999B2 (ja) | 1992-07-10 |
ATE22327T1 (de) | 1986-10-15 |
DE3175357D1 (en) | 1986-10-23 |
IE52417B1 (en) | 1987-10-28 |
US4891316A (en) | 1990-01-02 |
JPS615392B2 (ja) | 1986-02-18 |
BR8108074A (pt) | 1982-09-21 |
CA1192151A (en) | 1985-08-20 |
JPS6143996A (ja) | 1986-03-03 |
IE812919L (en) | 1982-06-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107012164A (zh) | CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰功能单元、包含该功能单元的载体及其应用 | |
JPS584799A (ja) | 成熟ソ−マチンの遺伝暗号を有するdna配列 | |
JPS59501096A (ja) | 構造遺伝子の製造および発現 | |
KR100270195B1 (ko) | 겔로닌 폴리펩타이드를 암호화하는 dna 서열 | |
JPH0630582B2 (ja) | Dna導入ベクタ− | |
US20230051396A1 (en) | Class ii, type ii crispr systems | |
Alexandraki et al. | Evolution of α q-and β-tubulin genes as inferred by the nucleotide sequences of sea urichin cDNA clones | |
CN110300802A (zh) | 用于动物胚胎碱基编辑的组合物和碱基编辑方法 | |
JPS5978692A (ja) | バクテリオフア−ジからバクテリアを保護する方法 | |
KR20240055073A (ko) | 클래스 ii, v형 crispr 시스템 | |
JP2023542976A (ja) | カーゴヌクレオチド配列を転位させるための系および方法 | |
JP2023539237A (ja) | カーゴヌクレオチド配列を転位させるための系および方法 | |
JP2612264B2 (ja) | Dna配列体 | |
JPH01211490A (ja) | ヒト神経成長因子遺伝子セグメント | |
US20190322998A1 (en) | One pot assembly | |
CN112501171B (zh) | 两条特异性靶向猪Pax7基因的sgRNA导向序列及应用 | |
CN116615547A (zh) | 用于对货物核苷酸序列转座的系统和方法 | |
JP2024509048A (ja) | Crispr関連トランスポゾンシステム及びその使用方法 | |
JP2024509047A (ja) | Crispr関連トランスポゾンシステム及びその使用方法 | |
CN116178563A (zh) | 一种dna合成纠错酶及应用 | |
Joshi | Molecular Biology and Biotechnology | |
CN115975975A (zh) | 一种室温条件下具有扩增活性的dna聚合酶及其应用 | |
JPS60234584A (ja) | 組換プラスミド | |
CN112522269A (zh) | 特异性靶向鸡TYR基因的sgRNA导向序列及应用 | |
KR20220145324A (ko) | 세균 파스퇴렐라 뉴모트로피카 유래 cas9 단백질의 용도 |