JPS5978692A - バクテリオフア−ジからバクテリアを保護する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、自然界に存在するバクテリオファージからバ
クテリア（細菌）を保護する方法、およびこの方法に使
用するクローニングベクター並びに形質転換体に関する
。 組換えＪ）　Ｎ　Ａを含有する細菌培養体の大規模なフ
ァージ感染という問題ｋ　解決できるという理由で、本
発明は特に重要である。このことが有利である理由は、
目的生産物を暗号化

【７た組換えＪ）ＮＡが宿主細胞に
導入された後、この宿主細胞がバクテリオファージ感染
から保護ンΣれることか、必須ではないにせよ、望まし
いからである。形質転換培養体がバクテリオファージに
感染され易いということは周知であり、感染すれば全個
体が溶菌することから、このような保護は極めて重要と
なる。生産物の遺伝子（による発現ｉＴｊ、目的とする
生合成が実行されるに十分な期間生存し得る宿主細胞に
依存するのであるから、感染を受けた培養体の生産能は
低下する。 微生物のファージ感染は周知の現象である。バクテリア
に感染した場合のウィルス、即ちバクテリオファージは
、通常、宿主の細胞膜に接触し、吸着し、これと反応す
る。吸着することによりファージの染色体または遺伝物
質は宿主細胞に入り込み、宿主の細胞機構が服従する、
新しいファージの生産にのみ陸用される工程が開始され
る。宿主細胞は成熟したファージで満たされ、次いで溶
菌するが、これは通常、最初の感染から約３０分以内に
起る。この新しいファージは感染性であり。 利用できる宿主細胞が全て破壊されるまで、このす・１
り）しが繰り返される。 Ｅ、　Ｃ０１ｉの大規模発酵による組換えＤ　Ｎ　Ａ技
術の応用Ｑユ、これまで前記のようなファージ感染の問
題によって妨げられてきた。′４ｆ実、種／２のバクテ
リオファージフローラが関係している感染が、目的生産
物の生合成を阻み、不可能にする主要な因子である１、
この問題は、大規模発酵の際には極めて重大となり、Ｅ
、ｃｏｌｊ形質転換個体の多額なかつ決定的な損失をも
たらすことになる。 本発明は、天然におけるバクテリオファージ感染からバ
クテリア形質転換体を保護するだめの安価で効果的な手
段を提供することにより、このバクテリオファージの問
題を解決するものである。 これは、１−（ｈａ１１部位を含有する外来性Ｄ　、Ｎ
　Ａを消化する制限系を、宿主細胞に供給することＧ′
こよってなされる。このＪＩｈａ　Ｕ部位は、天然に存
在するほとんどのウィルスに見いだされており、故に本
発明は広範囲の厄介なバクテリオファージに対して有効
である。即ち、ファージＩ）　Ｎ　Ａが本発明に係る宿
主細胞の適所に入ると、ｌ１ｈａ　ＩＪ制限エンドヌク
レアーゼが、このＩ）ＮＡをＨｈａ　１１部位で消化し
、ファージを非機能性かつ無害なものとする。 このようにして宿主細胞のバクテリアに天然に存在する
バクテリオファージから保護され、培養体の生産性が確
保されるのである。この方法は、有利である＆Ｊかりて
なく、本技術分野における著しい進歩をなすものである
。 Ｅ、ｃｏ」ｉ　　および曲のバクテリアの大規模発酵に
併うバクテリオファージの問題３七解決する方法は、他
にはほとんど無い。事実、バクテリオファージ感染は極
めて無菌の条件下でも起こり、一度感染すれば、これを
除くのは極めて困難であることが知られている。かかる
除去は可能でにあるが、それ（１非常に繁雑で、しかも
時間および損失生産物の点＆ｃ：ｌ−・いて高価につく
。 以Ｆ″に訛載−ｒる本発明の理解を助けるために、以下
に用語を定義する。 機能的ポリプチド：回収可能な、生物学的に活ｔ’Ｊユ
な、全゛Ｃ外来性のポリペプチド−１１：Ｊ、Ｉ−前駆
体；外来１（！：ポリベグチドと内性ポリペプチドの一
部または全てからなる、回収可能な生物学的に活性なポ
リペプチド；特異的に開裂ｉｊＪ能な、生物学的（・こ
不活性化する内性（固有の）ポリペプチドおまひ外来性
ポリペプチドからなる、回収＋ｉＪ能な生物学的に不活
性な融合ポリペプチド；もしくは酵素機能を有するポリ
ペプチド。 融合遺伝子生産物：内性ポリペプチドの全部斗たは１部
と融合した回収可能な外来性ポリペプチド。 マーカー：染色体上または組換え１）　Ｎ　Ａクローニ
ングベクター上の位置および機能が既知の遺伝子または
それらの組合せ。 形質転換体；形質転換を受けだ受容菌宿主細胞。 感受性バクテリア：ファージ存在下で増殖すると感染を
受けるバクテリア。 制限フラグメント：１またはそれ以」二の制限酵素の作
用によって生成した、プラスミド、他のベクター捷たは
染色体ＤＮＡのあらゆる線状部分まだはその全体。 挿入異性体：１個のＪ）　Ｎ　Ａフラグメントが、受容
体１）　Ｎ　Ａの２またはそれ以上の適合部位のうち０
１箇所に挿入されて生成する、２捷たはそれ以１−の用
油な組換えｌ）　Ｎ　Ａ分子のうちの１個。 Ｉｔ　−、Ｍ系：制限：Ｉチ・よび修飾系。 ＡｌＩ３−　アンピノリン酬性表現型。 Ａ１１ｌ１１”　　アンピシリン感受性表現型。 ＋ｐ、シ１１．テトラリーイクリン耐性耐性型現型Ｉ＋
０１；　９　、テトラザイクリン感受性表現型。 具体的には、本発明は、組換えＤ　Ｎ　Ａクローニング
ベクターによりバクテリアを形質転換させることからな
る　天然に存在するバクテリオファージから該バクテリ
アを保護する方法に関するものであり、かかるベクター
に、 １）該バクテリアに制限活性および同起源（Ｃｏｇｎａ
ｔｅ）△ よび、 ３）該バクテリアにおいて機能的ポリペプチドを発現す
る遺伝子、 含有することを特徴とするものである　（／こだし、１
）」二重の天然に存在するバクテリオファージに、該バ
クテリアに伺与された制限部１’ｌ：と同じ特異性の制
限部位を有する二重らぜん（２本鎖）ＩＩＮＡを含み、 ２）該修飾活性に、該バクテリアにおいて、制限活性に
先）′／Ｘつて発現される）。 特異的活性の制限部位を有する二重らせんＩ）　ＮＡを
持った天然のバクテリオファージから、ノくクチリアを
保護する方法Ｕこ有用７に組換えクロ−ユニ・グベクタ
ーは、 １）　ａ）同起源の修飾活性、および ｂ）該制限部位と同じ特異性の制限活性、を、調和よく
、かつ連続的Ｃ・ζ発現する遺伝子を含む１）　Ｎ　Ａ
セグメント、 ２）該バクテリアにおいて機能する複製単位（レプリコ
ン）、および、 ３）該バクテリアにおいて機能的ポリペプチドを発現す
る遺伝子、 を、結紮（寸たは結合）　（Ｉｉｇａ、ｂｅ）すること
により調製される。 さらに本発明に、前記方法に使用されるクローニングベ
クターおよび形質転換体に関し、本発明は、組換え１．
、）　Ｎ　Ａにより暗号化された生産物を生産する微生
物の大規模発酵の成功計確実Ｃ・てするだめに、重要で
ある。制限および修ｌｉ系が存在しないと、多くの培養
体はバクテリオファージの感染を受け、そのために目的
生産物の生物学的生帝は低下する。 本発明を例示する為に、ｌＩａｅｍｏｐｈｉ］、ｕｓ　
ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓのｌ１ｈａ１．１制限−修飾
系を使用する。１（１１ａ、　ＩＩ且−Ａ１系を含む遺
伝Ｔ−は密接に連結しており、１ｌｈａ　Ｉ＋制限工／
ドヌクレアーゼおよび同起源の酵素メチラーゼを合成す
る。Ｉ：ＩｈａＬｌ制限酵素は、（３Ａ　Ｎ　Ｔ　Ｃ−
とＣｉ’　Ｎ　Ａ　Ｕ いう配列を持つ／ξ二重らせんｌ）　Ｎ　Ａ　（以下、
との配列を１．１１−＋ａ、　Ｉ−１リ−イトと呼称す
る）を認識、開裂［７、一方、同起ｄ・；１の修飾系は
、前述の配列を含むヌクレオチドをメチル化する。メチ
ラーゼ酵素修飾系は、１．’、Ｉｂａ　ＩＩ制限酵素が
生合成される前に発現されねば、ならないことに、当業
著には理解されるであろう。この」：うにして、Ｈｈａ
　１１　１ｔ　−Ｍ系を含む組節［１１＋ａ、　１１消
化から保護されるが、１ｌｈａｌｌザイトを含む非修飾
外来性二重らせん１）　Ｎ　Ａ　Ｉｉ、その消化を受け
ることになる。こうした理由で、１１）〕ａ１１１、（
、−Ｍ系は本発明を例示するという目的にとつ−Ｃ理想
的な系となる。 さらに、詳細には、本発明は、プラスミドｐｌ）Ｊｌ　
０＋７）〜２．７　ｋｂ　、Ｐｓｔ　Ｉ　制限７　ラク
メ７１・ｋインシュリンＡ鎖のプラスミドｐＪ、Ａ　７
　、＼４△１にクローンすることで例示される。プラス
ミドｐ、ＩＡ７△４へ１に、■弓、　ｃｏｌｉ　のトリ
プトファンプロモーター、抗生物質耐性マーカー、およ
びヒトインシュリンのＡポリペプチド鎖、Ｌ：融合した
Ｅ、　ＣＯ’１．ｉ　Ｋ　１２ｔｒｐｌ！＋蛋白質の一
部分′２含む融合遺伝子生産物を発現する遺伝子を含有
している。プラスミドｐＩＡ７△４へ１の制限サイトお
よび機能地図を・、添１・１の第１図に示す。 ブラスミ１．ｐＩ）１１　Ｑの〜２．７　ｋｂ　Ｉ’ｓ
ｌ；　Ｉフラク゛メン）　ｉ−，１：、Ｉ（ｈａ　［１
に対して特異的な制限および修飾遺伝子を含む。グラス
ミ１９１月１０　ｉｍ、Ｊ：　、ＮｏｒｔｈｅｒｎＩ＆
ｇｉｏｎａｌ　ｌ＆５ｅａｒｃｈ　１．ａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ　（１’ｅｏｒｉａ、、　１１１ｉ、ｎＯｉ、ｓ在
）に寄託され、永久ストックカルチャー　コレク／ヨン
の一部とな壬）ている菌株、ｌ’；、　ｃｏ：＋、ｊ　
Ｋ　１２　２９４／　ｐυ＋１０から分＃／−ｒること
がてきる。これはグラスミド’　ｐｌ）ｌ　ｌ　Ｏの空
寸しい供給源および保存源Ｊニジて、受理番号”１５０
９７の一口で、誰でも人Ｔ′−１ｊｆ能である。 取り決めについて述べると、符号１ΔＪは除去を意味す
る。例えば、１△イ１係ｏ　Ｈ，ｌ　−Ｘｂ’ａ、　Ｉ
　」という符合が後に記載されているプラスミド＆’−
１、”ｃｏ　Ｉｔ　ｌおよびＸｂａ、　Ｉ制限酵素サイ
トの間のヌクレオチド配列が、これらの酵素の消化によ
り除去さ７′１．たプラスミドを表わす１．捕便のため
、ある神の除去は番号で表わすこととする。即ち、親プ
ラスミ）＞　ｐＪｕｔ　３２２におけるテトラザイクリ
ン面１姓遺伝でに先行するｒ’ｊｃＯ１口認識サイトの
最初の塩基対（１−ｂｐ、Ｉ　）　Ｊ：り始まって、１
−△１」は、ｂｐｌ〜３０の除去（即ち△’？ＪＣＯＩ
ローＪ　ｊｊ、ｎ　ｄ　ＩＩＩ　）、およびその結果と
してテトラサイクリンプロモーター／オペレーター系が
作動できなくなることを意味する。１へ２」は、ｂｐｌ
〜３７５の除去（即ちＡＥｃｍＪロー１３ａｍ月１）、
およびその結果として起こるテＩ・ラリーイクリングヮ
モーター／オペレーターおよびテＩ・ラザイクリン耐１
住を暗号化している構造遺伝子の一部分、の両者の除去
を意味する。 そして「△４」は、ｔｒｐオペロンノラグメノトがらｔ
ｒｐＤボリペグチドの構造遺伝子を取り除くｂｐ〜９０
０−〜１５０ｏの除六を意味する。 グラスミドｐＤＩＩｏの〜２．７　ｋｂ　Ｉ’ｓｔ　ｌ
　、ＩｌｈａｌｌＲ−Ｍ遺伝子含有制限フラグメントの
ゲラスミうなバクテリアを、天然に存在するバクテリオ
ファージ感物から守る。プラ、スミドｐ　Ｉ’　１．ｔ
　２６とｐｐＨ・２７の各々の制限サイト地図を、誰何
の第２図（（示す。 さらに本発明を例示説明するため（（、新規プラスミド
ｐ、Ｐ　１ｔ２　ＢおよびｐＪ’Ｒ１２２８を組み立こ
ることもできる。プラスミドｐ　Ｐ　Ｉｔ２３とｐＰＪ
１７１２２８は、プラスミドｐＤ１１０の〜２．７　ｋ
ｌ）Ｐｓｔ　ｉ　１．Ｉｈａｌ（・−へ１遺伝子含有制
限フラグメノトをグラスミドｐ　、１．　Ｂ　７Δ４へ
１に挿入する結果生成する。プラスミドｐ　１．　Ｊ３
７△４△１ば、Ｅ、　ｃｏｌｉ　　のトリプトファンプ
ロモーター、抗−生物質耐性マーカー、およびヒトイン
ンユリンのＩ３ポリペプチド鎖と融合した１°：、　ｃ
ｏｊｊ　　Ｋ　１２　ｔｒｐ　ｌ＞蛋白質の一部分を含
む融合遺伝子生産物を発現する遺伝子を含有している。 プラスミドｐ　Ｐ　Ｉｔ２　ＢおよびｐＰＩＬＩ　２２
８も壕だ、例えば種／７のＥ’、　ｃｏ］、ｉ菌株のよ
うなバクテリア応天然Ｇ・こ存在−ｊ−るバクテリオフ
ァージから保護する。 グラスミドｐ　ｉ　Ｂ　７へ４へ１およびプラスミド１
．＋　１坩２８と１〕門Ｊ２２８の各々の制限サイト並
びに機能地図を、それぞれ添何の第３図すよひ第４図に
示す。 プラスミドｐＩ’　１ｔ２７の６．２　ｋｂ　Ａｖａ　
ｌ　−１３ｇ’Ｌ　１１１１ｈａ　ＩＩ　”・−Ｍ遺伝
子含有制限フラグメントと、グラスミドｐＩ：＋］　７
　△ｌ　△４の〜２．３　ｋｂ　ＡＶａ、　１．−８ｇ
１１１制限フラグメントとのリゲー／ヨン（結合）の結
果、新規プラスミドｐ、ＰＲ２９が生成する。プラスミ
ドｐ、１Ｉ１７Δ４△１は、Ｅ、　ＣＯ］ｉのトリグト
フフ′ンブロモー　ター、抗生物質耐性マーカー、およ
びヒトのプロインシュリンポリペプチドと融合し生産物
を発現する遺伝子を含有している。プラスミドｐ　Ｉ’
　Ｉｔ２９　ＩｒＪ−１制限および修飾活性を付鳥いか
くして例えば種１ｔの綻ｃＯ１ｉ菌株のようなバクテリ
アは、天然に存在するバクテリオファージの感染から守
られる。プラスミドｐＨ１７へ４へ１お、ｌ：びｐＰｌ
（，２ｇの制限サイトおよび機能地図は、そ−ｈぞれ添
イマ］の第５図および第６図に示した。 本発明に極めて多方面！で渡る応用性を有し、ぞの合成
が、組換えＤ’Ｎ　Ａクローニングベクターを含む１．
）　Ｎ　Ａにより規定されるが、ある“いは内性（固有
の）代謝経路により規定されるあらゆる物質の生産に本
発明方法を適用することが１きる。 本発明の説明の目的に好捷しい組換えｉ）　Ｎ　Ａクロ
ーニングベクターはプラスミドであるが、バクテリオフ
ァージ、コスミド、および他のベクターも捷だ使用する
ことができ、それは当業者には明らかであろう。本発明
は、その修飾１幾能が制限機能に先立って整合的（調和
まくり発現される１ｗす、△ いかなる制限および修飾系のだめの遺伝子も使用できる
。不発萌：ノ）有用Ｉ牛（・ゴ、クローニング−ベクタ
ー中にクローンされたマーカー捷／ζは他の遺伝子とｔ
９１−無関係−Ｃあろので、商業的゛４たは研究的両値
を有する１′ｉ／こＱまそれ以−ｌ二の遺伝子−をｔｔ
１つ組換え菌株もしくは他の菌株に対し、本発明を適用
することがＩＩＪ能である。 本究明の好ましい態様（−１、天然に存在する〕くクデ
リＡファージからバクテリアを保護ｒるために１１ｈａ
、　ＩＩ特異性を有するプラスミド担持の制限ＩＬ−よ
び修飾遺伝子−を使用することである。さらに、他の特
異性を持ったＲ　−Ｍ系遺伝子を使用することもできる
。これらの遺伝子には、例えは］ゝＳシｌＨ，−Ｍ系（
Ｗａ］ｄｅｒ等、　１９８１　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、Ａｃａ、ｄ。 ＨＣｌ、　Ｉ’　Ｓ　Ａ　７８（：３）　１５０３）、
ｌ・：＋：　（１・ｌ（，１Ｉｔ　−Ｍ系（＋Ｉａ、ｃ
ｋ等、　１９８０　、　、Ｆｅｄ、Ｐｒｏｃ、　Ｆｅｄ
、　Ａｍ、　８ｏｃ、ＩＣｘｐ、　１３ｉｏＬ　３９　
：１８７５）、およびＴａｑｌ　ｔｔ−Ｍ系（Ｌａ、ｎ
ｎ−１１ｓｉａｊｎ等、　Ｉ　９８２　、　　ｌ”ｅｄ
ｅｒａ、ｔｉｏｎＰｒｏｃ、　４１　：　５４２７　）
がある。Ｔａｑｌ、　Ｒ−Ｍ系の遺伝子は、へＩａｎｎ
等による１９７８，０ｅｎｅ３　：　９７に記載の方法
と実質的に同様の方法によって、’ｒｈｅｒｍｕｓ　ａ
ｑｕａｔｉｃｕｓ　’１’Ｔ−１（Ｌｌｒｏｃｋ　　：
ｔ、−よびＪ’ｒｅｅｚｅ、　　ｌ　９５９　、　Ｊ、
　ｏｆ　ＢａｃＬｅｒｊａｌｏｇｙ、９８　（１）：　
　２　８　９　　、　　ｔｙｐｅ　　５ｔｒａｉｎ　　
Ａ’１’（］（’　）Ｉ６２　５１０４　　）から常法
によりクローンすることができる。ｌ　Ｉ　ｈ　ａｌｌ
Ｒ−Ｍ系と同様、この修飾遺伝子は制限遺伝子より前に
発現されねばならない。ｒｌｌ］ａ、　１１−４だは他
のＩｔ　−Ｍ系直伝子と別個に、寸た１１組み合わぜて
上記遺伝子群を使用すると、天然ＶＣ育在するバクテリ
オファージからバクテリアを保護することができ、従っ
てこれらもまた本発明の範囲に属する。 天然に存在するｙくクアリオファージからバクテリアを
保護する本発明方法は、■Φ、７２の有用な生産物を発
現する遺伝子を有するベクターを含有する宿主細胞に適
用することができる。１（１Ｍ遺伝ｒ−は別個のベクタ
ーに保持されＣいギもよいが、１（・−Ａ４遺伝）は、
有用な生産物を発現する１貞伝子°ｉ含むプラスミド中
に、同時にクロー　ンすることが望ましい。有用なポリ
ペプチド生産物を発現する遺伝子は、天然に存在するも
のであっても非天然のものであってもよく、また一部は
天然のもので一部は合成もしくは非天然のものであって
もよい。 より詳細（Ｃ述べると、Ｈ，−Ｍ系遺伝子は、ヒトのグ
レープロインシュリン、ヒトのグロインンユリン、ヒト
インシュリンＡ鎖、ヒトインンユリン！３鎖、ヒト成長
ホルモン、ヒト以外の成長ホルモン、牛成長ホルモン、
ヒト以外のインシュリン、ヒトインターフェロン、ヒト
以外のインターフェロン、ウィルス抗原、ウロキナーゼ
、抗生物質耐性ｅ　、ｆ＝Ｊ１−、するあらゆる酵素、
あらゆるペプチドホルモン、あらゆるペプチド酵素、ま
たは実質的に研究もしくは商業的ｆｆｆｌｉｆ直を有す
る他のあらゆるペプチド類を暗号化し、発現する遺伝子
を含むプラスミド中にクローンすることが可能である。 本発明のある実施態様においては、プラスミドの複製お
よびポリペプチド生産物の発現は、それぞＪＬｐＭ１月
からのｐｏｌ　Ａ遺伝子要求レプリコン（Ｈｏｌｖａ、
ｒ、１９７９．　　Ｌｉｆ　ｅ　Ｓｃｉ、　　２５　　
：８０７〜８１８に開示されている）およびｔｒｐプロ
モーターによって決定される。他のレプリコンおよびプ
ロモーターも、それらが特定の保護されるべきバクテリ
ア形質転換体中において機能する限り＆、Ｕ、１史川す
ることができる。当業者に汀、牛１定のバクテリアにと
ってどのレプリコンおよＯ・ブロモ　ターの使用が好ま
しいかは、既知であるか、または容易に決定できるであ
ろう。他のレプリコンの例としては、Ｃ０１１り１．Ｎ
Ｒ１、Ｈ，ｒ＜　２．１目（６１，Ｓ（］１０１、ｉｔ
　Ｐ　１、ｌｔＰ、４．１゛のレプリコン等があり、Ｅ
、　ｃｏｌｉ　Ｋ　１２中で複製を行なうバクテリオフ
ァージもこれらに含まれるが、これらＵこ限定される訳
でｉｄない。他のプロモーターの例としては、バクテリ
オファージλＰＩＪプロモータ　、リボプロティンプロ
モーター、］、ａ、Ｃプｒｊモーター、リボゾーム蛋白
質重たはＩｔ　Ｎ　Ａプロモーターなどが含、・ｔＪ−
Ｌるが、これらに限定される訳で杓なく、事実１−他の
いかなるプロモーターも含寸れる。種々ｐレプリコンお
よびプロモーターを組み立て、本発明のＩｔ　−ＡＩ系
遺伝子含有ベクターに使用することができるということ
は、当業者にに１理解できるであろう。 Ｅ、　Ｃｏ１１に関しては、遺伝学的および生化学的情
報が豊富であるので、Ｅ、ｃｏｌｉが本発明目的に沿っ
た簡便で好ましい宿主バクテリアである。さらに、１つ
、ｃｏｌｉ　　Ｋ　ｌ　２は組換えＩ−）　Ｎ　Ａ技術
による物質の生物学的生産Ｖことって選り抜きの宿主で
あるから、この微生物の菌株に対して本発明を適用でき
ることは、極めて有利である。既述したように、Ｅ、　
ｃｏｌｊＯ大規模発酵は、ファージ感染に付随した困１
α１ｆが伴なう。本発明はこの問題を実質的に解決し、
それ（でより生合成生産物の商業的生産（Ｌｌ’ｔＪ’
能にするものである。 本発明方法は１種類の属、種寸だは菌株に限定されるも
のではなく、Ｉｔ　−Ｍ系遺伝＝ｒ−をクローンしイｊ
ｊＺ）微生物々らｊ−ｆいかなるものＶこも使用′丈る
ことかできる。例えば、本発明Ｑま一般に原核生物に適
用でき、さらに詳細Ｖこは、刷ｃｏｌｉ、ｌ弓、　ｃｏ
ｌｉＫ　１２．１′Ｊ、　ｃｏｌｉ　Ｋ　ｌ　２　２９
４　（０ｏｅｄｄ、ｅｌ等。 １９７９　、　ｌ’ｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、　ｔ１８Ａ　７６：１０６に記載）、Ｅ、　ｃ
ｏｉｊ−Ｋ　１２ＲＶ　３　Ｑ　３　（Ｍ３ｕｅｒ等　
　１　ｇＢ□　、、１．Ｍａ］、Ｂｉｏｌ、Ｉ　３９　
：　Ｌ４７に記載）、Ｅ、　ｃｏｌｊ　Ｋｌ　２　Ｃ６
００（Ｂａ＋：：ｈｍａｎ、　Ｉ　９７２゜Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ、Ｉｔｅｖ、　３６　：　５２６　　Ｋ記載）
、１号。 Ｃ０１ｉ　ｔ＜　１２　Ｃ（３Ｑ　Ｑ　Ｈ，に−Ｍｋ−
（Ｃｂａ、ｎｇおよび（’：ｏ　ｂ　ｅ　ｎ　。 １９７４、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　８ｃｊ、
、　ＵＳＡ　７］；１０３０　に記載ン、１す、　　ｃ
ｏコ１Ｋ１２１１１稍０１（１う０１１−ｖｅｒ等、１
９７７．０ｅｎｅ　２ニア５に記載）、■気ｃｏｌｉ　
Ｋ１２ＢＥ８２７　Ａ’ｌ’ＣＣ３１９１１，Ｂ、、１
．ｃｉｌｌ、ｕＳ。 Ｂａ、　ｃ　ｊ、　］コｕｓ　　５ｕｂｔｉｌｉｓ、　
　Ｂａｃｊ、１．’１．ｕＳ　ｅｈｕｒｉｎｇｊｅｎＳ
ｊ、ｅ。 Ｂａｃｉｌｌｕｅ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍｖ　５ｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、　８ｔｒｅｐ１；＋〕−ｃｏｃ
ｃｕＳ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｉｓ、５ｔｒｅｐ＋、
ｏｍｙｃｅｓ、Ａｇｒｏｂａｃ−しｅｒｉｕｍ、５ｅｒ
ｒａｔｉａ、　Ｉ’ｓｅｕｄｏｍｏｎａ、ｓ％　’ｉ含
むノ（クチリアに適用できるが、これらに限定されるも
のでＶ′、１なく、バクテリオファージ感染を受は易く
、１（、−Ｍ系遺伝子をそれにクローンできる〕くクチ
リアならば、いかなるものも使用可能である。 本発明の打型しいクローニングベクターＧ１、シラスミ
ドｐＪ’ｌＬ；ビア、ｐ　Ｉ）　ＪＬ２　ｇ、および１
）１ゝ１（・２９であおよびＥ、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２１
ＬＶ３Ｑ８／ｐｌ’ｌｌ・２９が金型れる。これらの、
および他のす−〈ての本発明のｍ４施態様は、天然に存
在するバクテリオファージ感染からバクテリアを保護す
るという共通の′特徴を分かち持つものであり、故Ｑｃ
本発明ｒよ、ファージ感染、溶菌、およびこれらに併う
生合成能の損失という実際の危険を併うことなく、組換
えＩ）　Ｎ　Ａ含有微生物の大規模発酵を行なうことを
可能にするものである。 以下の実施例において本発明をより詳細に説明する。本
発明についての説明、ら・まひ本発明５’ｆ構成する具
体的７ン方法を、適宜記載した。 実施例１　プラスミドｐＤ１１０の分離および調製 プラスミドｐｌ）１．１０のＤＮＡ約１　／ｌ（１（Ｅ
、　ｃｏｌｉＫ１２２９４／ｐＪ）１１０（”’ＲＬ　
　　［３−１５０９７）から、Ｉ３ａ、ｚａ　ｒ　ａ、
１およびＨｅ１ｉｎｓｋｊ　　によりＪｌＭＯｌ。 １３ｉｏ１．３６　：　Ｉ　８５　（１９６８）に記載
の分１＋ｊｋ方法に実質的に従って分離〕を、ＴＩり緩
衝液Ｃ］　ｍ　ＭのＥ　ｌ）　ｉ”　Ａ　（エチレンジ
アミン四酢酸）と１０ｍＭのトリス−１１ＣＩｏｐＨ７
，８）に約２０　ｔ’ｇ／ｎｌ’の濃度となる様に溶解
する。ｌ！；、Ｃ０１１Ｋ　１２　２９４は１乞ｋ　Ｍ
ｋ　　宿主であるので、グラスミドＩ）ＮＡｉ、ｊ。 ＥｃｏＫ特異性に従ってメチル化に上り分ｔｅｎｔ：で
きる。 この溶液約５．ｉｅ（約Ｏ１μビのＪ）　Ｎ　Ａを含有
）足、Ｓ’ＳＣ／ＩＱ（８８Ｇ−標準食塩クエン酸緩衝
液、Ｓ　Ｓ　Ｃ／　ｌ　Ｑ［ＮａＣ１１５ｍへ′１およ
びクエン酸ナトリウム（Ｎａａ）　　１．５ｍＭを含有
、ｐｌ＋７）Ｅ↓す５０ｔｔｅ、に希釈−ノ”る。次い
てこの８８（−：　／１０．　１）ＮＡ溶液約２５　Ｉ
Ｉ（ｌｔ　夙ｃｏｌｉ　ｒ（１２Ｃ６００１（、ｋ−Ｍ
ｋ−（ＩＪ）Ｊンピテント１匠濁液５０ｐ（！と混ｉ７
７る。 ”、　ＣＯｌ、Ｋｌ　２Ｃ５ＱＱ　Ｉｔｋ−八＋ｋ（（
：ｈａｒ＋ｇ　＃’＋、ヨヒＣｏｈｅｎによる１　９７
４　、　Ｐｒｏｃ、Ｎａ、ｔ、　Ａｃａ、ｄ、　５ｃｉ
ＵＳＡ　７１：１０３０に記載）のコンピテント野ン蜀
液Ｃａｔ、当業者により常套の方法で調製される。した
かつ−〔、新しい一夜経過した１・−ブロスｌ］へ４ｔ
ｌｌ−ｅｒ。 １　９　７　２　　、　　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　　
ｊ、ｎ　　Ｍｏ１．ｅｃｕ’、１．ａ、ｒ　　Ｕｅｎｅ
しｉｃｅ。 にＯ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　　ｌ１ａｒｂｏｒ　　Ｌａｂ
ｏｒａ、ｔ；ｏｒｙ　（（：＜ｌｄ　　Ｓｐｒ団４（１
１ａ、ｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ在）による〕中の
培養ヲ・、新しいＬ−ブロス中で副次培養（１，、／１
０　）Ｌ、３７０で１時間増殖させる。計６６０．１（
］、　ｅ　ｔ、　を単位のｔ（ＩＩ　ｌ１ｆｌＪ全収穫
し、１００ｍＭのＮ　ａＣ」、　’；１．５　ｎｌｅで
洗浄し、１５０　ｔｎ　Ａ４の’；ａ’−’１２２．５
＋ｍにＬｊ？ｍＬ、室＋ＲＴ　２０分間インキュベー１
・する。この細＋１ｉ！！を取り、１５０　Ｉｎ　Ａ４
の（，１ａＣ］、　２および１０％のグリセロールを含
む溶液０５１扉に再懸濁し、氷で３〜５分間令囚ｊし、
次いで凍結させる。この凍結したコンピナンｌ−細）回
りよ、使用時まで液体窒素中（ｌこ保存する。保存ない
し貯蔵は、共有結合で閉環した環状プラスミド１）　Ｎ
　Ａ　（ｉｔｌ　、Ｊ、る形質転換類ＩＷはンｌζＱよ
生存能力（ｌζ悪影響を及はさなかった。この細胞懸濁
液を水泡中で溶かし、形質転換用１）　Ｎ　Ａ　１／２
容量と混合する。 この形質転換混合物を氷で２０分間冷却し、４２Ｃで１
分間の熱ンヨツクを匂え、氷で１０分間冷却し、次いて
１・−ブロス５．７容量で希釈し、最後に：３７＜ｙで
９０分間インギュベー　１・する。 形質転換体は、デトラザイクリ７１２．５１ｉｇ、／ｌ
ｕｉを含有する１・−寒天上で増殖させることにより、
分離する。分雛物のテトラサイクリン耐性およびアンピ
シリ／感受性を試験により確認し、目的とスルＥ、　ｃ
ｏｌ、ｊ　Ｋ　Ｉ　２　Ｃ６００ｌＬｋ−Ｍｋ−／ｐＪ
）Ｉ　Ｉ　Ｏ形質転換体であることを確認した。Ｂａｚ
ａ、ｒａＩ　　および適当なコロニーを、共有結合で閉
環した環状ＩＪＮＡを分離するために使用した。このプ
ラスミドの構造を、制限サイト地図を作成することによ
り確１都した。 実施例２　プラスミドル■へ７ハ４・へ１の組み立ＣＡ
、グシスミドｐＢ　ｌ（・■１ｔｒｐの組み立てプラス
ミドｐ（３八１１は、７・１汁：　Ｉ　４１３といつ欠
失ヲ有するＥ、　ｃ　０１　ｉのトリグトファンオペロ
ンを担っており（Ａ’１ｉｏｚｚａ、ｒｉ等、１９７８
　、１１．　ＩＳａｃｔｅｒｊｏ−ａｌｏｇ、　　１４
５７〜１４６６　）、このＩ’ｔめｔ　ｒ　ｐリーダ　
の最初の６個のアミノ酸と、はぼ最後の１／３のシｙ−
ｐ１′；ポリペプチドからなる削（合蛋白（以Ｉ・、合
せて１・Ｅ　と記載する）、並びにｔ］−ρ１）ポリペ
プチドの全体を発現する（こＪＣ１つは全こし］ｐプロ
モーター−オペレーター系の支配Ｆにある）。１′：。 ｃｏｌｊ　　Ｋ１２　　Ｗ３１　１０　　ｔｎａ２　ｔ
ｒｐ△１０２／ｐＯＡ４　１　　Ｆｌ、Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ　ｉ’ｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ＣＯ」−Ｊ、ｅｃｔ
ｉｏｎに寄託さ：ｈＣおＩ）（ＡＴＣＣ／Ｉ６３］６２
２　）、ｐＵＡ４１　ｔ（Ｋ　以下に述べる方法に従っ
て使用のために、この菌株から常套の方法で取得するこ
とができる、上記プラスミド約２０／’ｐ；を制限酵素
１．’ｖｕｌＪで消化すると、５個の部位で開裂する。 次にこの遺伝子断片を、ｌ’ＪｃＯＩ口　リンカ−（配
列：　ｐＤ　Ａ　Ｔ　ＣｉＡ　Ａ　Ｔ　ｉ’　ＣＡ　１
．”　（ｉを有する自己相補的オリコヌレチドからなる
）と結合し、て、後にｌ’ｒ　０□　、１（、Ｉザ・Ｃ
トを有するシラスミドにクローンするだめのＩ弓Ｃｏ１
（・１開裂ザイトを供給する。ｐ（３Ｍｌから得られた
この１．）　Ｎ　Ａフラグメント２０ｔｉｇを、５′−
リン酸化合成オリゴヌクレオチドｐ　ＯＡ　Ｔ　（Ｉ　
Ａ　Ａ　ｉ”Ｉ”　ＣＡ　ｉ’０２００ピコモルの存在
下、Ｔ、Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼ緩衝Ｗ　（２０ｍ　Ｍのト
リス（ｐＨ７，６）、０．５　Ｉｎ　ＭのＡ　ｉ冒）、
ｌＱｍＭのへ４ｇＣ１２，５ｍＭのジチオトレイトール
）中、’Ｉ’４１）ＮＡリガーゼ１０単位で一夜４゛Ｃ
で処理する。次いで７０°Ｃで１０分間加熱してリゲー
／ヨンを停止さぜる。リンカ−をＩりｃｏｌ（・１消化
により開裂し、Ｅｃｏ几Ｉ末端を有するようになつ／ζ
フラグメントを５係ポリアクリルアミドゲル電気泳動く
以下ｌ−１’　Ａ　ＯＥ　Ｊと呼称する）を用いて分離
する。最も大きな３個Ｄフラグメントを、まずエチジウ
ムプロミドＣ・こより染色し、次に紫外線を用いてその
位置を決定し、所望の部位をゲルより切り離すことによ
りゲルから分所１する。 ゲル断片の各々を３００μｅの、Ｉ　Ｘ　ｉ’１３Ｆと
共に透析バッグに入れ５．ＩＸ’ｌ’旧゛；緩衝液（１
’　１目ら緩衝液は水Ｉｌ中にトリス塩基１０：　８、
−ｍ、硼酸５．５ｇｍＮａ、　２　Ｅ　１）”Ｔ’　Ａ
　、　□ｇ　ｇｍを含有する）中で１時間、１００■で
電気泳動に付−ｒ。水性溶液を・透析バッグより集め、
フェノール抽出、クロロポルム抽出を行ない、ＮａＣ」
について、２Ｍとする。このｌ）　Ｎ　Ａ　’？ｉ。 エタノール沈殿後、水中に回」［Ｖする。得られたＥＣ
□ＲＩ粘着末端を有するｔｒｐプロモーター／オペＬ／
−ター含有遺伝子は、次ぐと述べる方法により同定され
るが、その結果テトラザイクリン感受１′／ｌプンスミ
ド中にフラグメントが挿入され、このプラスミドはプロ
モーター／オペレーターの挿入りこよりテトラサイクリ
ン耐性となる。以下に述へるＪ）ＮＡフラグメントの分
離は全て、上述したＪ）　Ａ　（月・Ｃ５およびそれに
続く電気溶離法によって行なわれる。 テトラサイクリン耐性を発現するプラスミドプラスミド
ｐ１３Ｈ，ｌｌ　ｌ　（Ｈｏｄ、ｒｊ、ｇｕｅｚ等、１
９７９゜Ｎｕｃｌｅｊｃ　Ａｃ１ｄ、ｓ　Ｒｅ５ｅａ、
ｒｃｈ　６　、３２６７〜３２８７）はアンピアリン耐
性を発現する。これはまだ、テトラサイクリン耐性直伝
子をも含有するが、これに関ｔうするプロモーターを欠
くのでこの面ｊ性を発現しない。よってこのプラスミド
はテトラサ・ｒクリン感受性である。Ｅｃ　Ｏ”　’ザ
イトにプロモー。 ター／オペレーター系を導入することにより、このグラ
スミドをテトラサイクリン耐性とすることができるン グラスミドｐＨＩＬｌ、ｌ　１をＥＣ０Ｉｔ　ｌ　ｔｌ
こより消化する。 この酵素をフェノール抽出、次いでクロロホルム抽出し
て除去し、ｌ）　Ｎ　Ａをエタノール沈殿後、水中に回
収する。得られたＩ）　Ｎ　Ａ分子を、上記実施例２Ａ
で得られた３種のｌ）　Ｎ　Ａフラグメントとそれぞれ
個別に混合し、前述のようにｌ’４１）　Ｎ　Ａ　ＩＪ
ガーゼでリゲーションする。反応混合物中シこ存在する
ｌ）　Ｎ　Ａ　′ｆｆ：、標準的な技法（ｆｌｅｒｓｈ
ｆｊ、ｅ：ｌｄ等。 １９７４、　ｌ’ｒｏ、　Ｎａｔ、Ａｃａｄ−１’ｆｃ
ｉ、　Ｌ１８Ａ　７１　：３４５５〜３４５９　参照）
Ｑこまり、コンビテンｌ−１“：。 ｃｏ］１Ｋ１２を形質転換させるのに使用し、次にこめ
バクテリアを、アンピンリン２０　ｐｇ、／ｍｅ　−Ｌ
−ｉひテトラサイクリン５　ｐｇ／　ｍｌ！　ｆ含有す
るＬ　Ｈ）１７−板（Ｍｊ、１１ｅｒ、　　１９７２　
）に蒔く。 数詞のテトラサイクリン耐柑叡口二一を選択し、そのプ
ラスミド１）　Ｎ　Ａを分離してｐ　ＨＲ１ｌ　ｌ；　
ｒｌ。 命名した。目的とするフラグメントの存在は、ｆｌｌｌ
限酵素分析により確認した。グラスミド１．＋１３１Ｌ
ＩＩｔｒ−ｐは、アンピシリン耐性を与えるβ−ラクタ
マーゼを発現し、ｔｒｐプロモーター／オーペレータ−
を含むＩ）　Ｎ　Ａフラグメントを含有する。この１．
）　Ｎ　Ａ　７ラグメントは、ｔｒｐリーダーの最初の
６個Ｑ）アミノ酸と、ｔｒｐＥポリペグチドの最後の約
１／／３ζカ〜融合したものからなる第１の蛋白（１，
＋（、！：ｎｌ称１−る）、ｔｒｐ１〕ポリペゾチドの
ほぼ前半分＆ζ４目・ｒｌ−ｊ−る第２の蛋白（Ｄ’と
呼称′！る）、およびテトラヅーィクリン１制性遺伝子
Ｃてよって暗号化される第３の蛋白質を・も暗号化して
い乙。 Ｃ，プラスミドｐ　Ｓ　＋’）へ１７△２の組み立てグ
ラスミドｐＩ（則ｌ　ｊ；ｒｐをＥｃｏ　ｌ（、Ｉ制限
酵素で消化し、１′Ａ（目゛：および電気溶削によって
分離することにより得られたフラグメントを、１“ＣＣ
０１０消化７”ラスミドｐ８０Ｍ　１１　（Ｊｔａｋｕ
ｒａ等、１９７７゜Ｓｃｉ、　１９８　：１０５６　、
イギリス国公告特許第２゜００７．６７６　Ａ号参照）
と混合する。混合物を′１゛４１）　Ｎ　Ａリガーゼを
用いてリゲーションし、得られたＩ）　Ｎ　Ａを前述の
ごとく１弓、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　２９４に導入する。形
質転換バクテリアをアンピノリン含有平板上で選択し、
得られたアンピアリンｉｔ　ｌ＜）コロニーをコロニー
雑種形成（ｃｏコｏｎｙ　ｈｙｂｒｊｄｊｚａい０ｒｌ
）　←０ｒｕｅｎｓしｅｊ−ｎ等　、　　１９７５．１
’ｒｏｃ、　Ｎａｔ：、Ａｃａｄ。 Ｓｃｉ、’　ＵＳＡ　　７２：３９５１〜３９６５）［
よってスクリ一ングする。　ｐＢ’ＲＩＩ　’ｔｒｐ、
’より分離し、次いで１″′で放射活性標識化したｔｒ
、ｐプロモーター／オペレーター含有フラグメントを上
記の方法における探査手段（プローベ）として［吏用す
る１、数個のコロニーがコロニー雑種形成（こより陽１
′１゛を示したので、これらを選択し／こ。プラスミド
Ｄ　Ｎ　Ａ　ｆ。 分離し、酵素Ｂ　ｇ　１１Ｉち・よびＨａｍｌ、、ｌ　
１の二重消化による制限分析により、挿入されたフラグ
メントの方向を決定する。ｔｒｐプロモーター／オペレ
ーターを適切な方向で含有する目的プラスミドを持った
コロニーヲ、アンピンリン１０μｇ／ｍｅ　ｆ　含有す
ルＬ　１３培地（Ａ４’１１１ｅｒ　、　Ｉ　９７２　
）上で培養する。目的プラスミドＨｐＳＯＭ７へ２と命
名し、以Ｆし′こ述べる組み立てに使用した。 】、　１３ｇコ、　１．１およびＢＣｏｌ、（・１制限
ザイ）を暗号鎖の各々５′および３′末端に有する、Ｉ
−Ｒ；４ｉ　リペゾチドの遠１′Ｘ′Ｌ（端部）領域の
コトノを含む遺伝子フラグメントの組み立て グラスミドｐＳＯＭ７Δ２を１１４　ｎｄ　ＩＩＩで消
化、次いで１・１り暗号化領域内の１３ｇ］、　Ｉｆ制
限す゛イトを越えて消化するように選択した条件ト−で
ラムダニキノヌクレアーゼ（５から３へのエキソヌクレ
アーゼ）で消化する。１１１ｎｄ　ＩＩＩ　で消化した
９８０Ｍ７　／＼２約２０Ｉｒｇ’＆緩衝液（グリメン
緩衝ｅ　２０　ｍ　Ｍ　、ｐｉｔ９６、ＭｇＣ１２１ｒ
ｒ＋Ｍ、β−メルカプトエタノール１ｍＭ）に溶Ｈする
。得られた混合物をラムダエキソヌクセアーヒで室温下
、６０分間処理「る。 得られた反応混合物をフェノール抽出し、クロロホルム
抽出し、次いでエタノール沈殿を行なう。 Ｌｌり遺伝子フラグメントの遠位末端Ｇ′ζ１°Ｉｃ（
＞　Ｉｔ　１残基を作るため、プライマー３２　ｐ　（
２（じｉ”　０１’　０　（ｋＡ　ｉ”　ＯＡ　’ｒを
、改良ホスホトリエステル法（（！１ｅ６等＋　１９７
８．　ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．　
ＬＩ８Ａ７５：５７６５参照）により合成し、ラムダエ
キソヌクレアーゼ処理によって得られたＪ、、　Ｅ’遺
１へ１フラグメントの１本鎖末端と雑種形成させも。こ
の雑種形成は、水２０１１１！中ＶｃクラスミドｐｓＯ
Ｍ７△２＋７）ラムダエキソヌクレアーゼ処理した［ｌ
ｉ、＋１ｄ　ｌｉｔ　消化生成物２０１１ｇヲ、容解し
、上記の５−リン酸ｆヒオリゴヌクレオチド約８０ピコ
モルを含有する溶液６ｐ（ｌと混合することによって行
なう。合成フラグメントはＬ　Ｅ暗号配列の３′末端と
雑種形成（７，１・訃］フラグメントの残りの１本鎖部
分は、ｄ　Ａ　ｉ’　ｌ）、Ｋｌｅｎｏｗ）　　ポリメ
ラービ１によりこれを満たす。 クレナウボリメラーゼ■は、Ｉ）　Ｎ　Ａポリメラーゼ
１の蛋白質分解酵素Ｖこよる開裂Ｖこよって得もれる。 この酵素ｉＪ：５−）３’のポリメリゼ−／ヨン活性お
よび３　）５のエキンヌクレオリチソク活１’有するが
、親酵素の５→３エキノヌクレオリチツク活性（１持′
つていない（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ、　　１９７４．Ｗ、Ｉ
Ｉ、　１堝。、−ｍａｎ　ａｎｄ　Ｄ（３ＳＦｏ、　９
８参照９゜反応混合物を５０°Ｃに加熱し７、徐々に１
０°ｃｔて冷却し、その後フレナラ酵素４ｔｔｅを加え
る。室温で１５分間、次いで３７°Ｃ−ｃ　３０分間イ
ンキュベーｈＬｆＣ後１，２５　モルノＥ　ｌ）　ｉ、
’　Ａ　５ｐｅ’ａ：添ｊ）ｎ　Ｌで反応を停止させる
。反応混合物をフェノール抽出、クロロホルム抽出し・
次いでエタノール沈殿する。次いてこのＪ）ＮＡを制限
酵素Ｂｇコ、　ＩＪて開裂し、フラグメントをｒ’　Ａ
　ＯＥにより分離する。このゲルから得たオートラジオ
グラムにより、目的とする約４７０ｂｐの長さの　Ｐ標
識化フラグメントが得られたことを確認し、これを電気
溶離によって回収し／し概説した様に、このフラグメン
ト１．１り（ｄ）は、１３ｇ１．　ＩＩ末端お・よびプ
ライマーの開始点に一致した鈍感末端を有する。 ２グラスミドｐ’ｌ”ｈｒｌｌの組みヴＣプラスミドｐ
′’ｈｒｚ　ｌ　ｉｆ、チモシノ〆１１を暗号化ｒる合
成遺伝ｆをプラスミドｐ１．３　Ｒ・３２２に挿入する
ことにより組み守、でる。チモンンσ１を暗号化するＩ
）Ｎ　Ａは、第７図の両端矢印によって示した１６個の
オリゴヌクレオチド＜　Ｉｌｌ、〜”’＋６）の合１ノ
ｙ、とそれに続くリゲ　ソヨンＶこよって調製し７’ｊ
ＯＮ末端に八’Ｉ　ｅ　ｔコドンであるＡ　ｉ’　＜３
を挿入し、５′末端（１，１’＋ｃｏ　Ｉ（、Ｉ　ト１
３２１ＨＩ　ＩＩ　ｌによって開裂させンクプラスミド
と結合させ易くするため、１本鎖粘着末端（相補末端）
とする。容易に理）〕子さＦしるであろうが、遺伝子中
央部の１＜ｇＪ、　Ｉｔシーイトは組換えグラスミドの
分析に役立つ。 オリボデオキ／リボヌクレオチド′■゛１〜”’１６　
ｉｄ、完全に保護したトリデオキンリボヌクレオヂド構
成ブロックを用いて、ホスホトリエステル変法Ｖこより
合成する（　Ｊｔａ、ｋｕｒａ等、　１９７７、５ｃｊ
ｅｎｃｅ　１９８：　１０５６．およびＣｒｅａ等、１
９７８参照）　。Ｊｉｒｉ　／。 のオリゴデオキシリボヌクレオチドを以下つ表１１（示
した。 表　　１ チモンンα・１遺伝子のだめの合成オリコヌクレオヂド
イ 上記化合物の合成に、添付の第８図に要約した、フラグ
メンｌ’　”’Ｉ５を合成する以下（／′Ｃ記載した方
法によって代表される。′ｖ１５の合［ｉ３：に使用す
る種々のヌクレオチドを、番号を付けてこの図りこ示し
た。使用Ｌ　＊−略語ｒ、Ｉ以下のとおりである目）　
８　ＩＩＩ　、　＝　２゜４、６−　）　ＩＪ　’Ｉ　
：／　プロピルベンゼンスルホニルテトラゾール、ＨＳ
　Ａ−ベンゼ／スルホン酸；ＴＩノ（ニー薄層クロマト
グラフィー；　Ｊｌ　ｌ’　Ｉ・（゛−高速液体クロマ
トグラフイー；　１）　ｌ’、４１”　＝　４，４−ジ
メナトキシトリチル；　ＣＩ！１−２−ンアノエチル；
　Ｉｆ、　−、−１）　−クロロフェニル；ＢＦペンソ
イＩし；　Ａｎ＝アニノイル；１Ｂｕ＝イノブチリ／ｌ
／　；　Ｐｙ＝ピリジン；ＡＣ（、）ＩＩ：二酢酸；　
Ｅｔ：＋Ｎ＝Ｉ−リエチルアミン。 完全に保護したトリデオキノリボヌクレオチト４　（３
５ＩＩ＋！／　、　、０５＋１１　ｍｏｌ　）および２
（！８０〃ｌｙ。 、　ｌ　ｍ　ｍｏｌ、）を、ノロロホルム、／メタノー
ルし一７／３　（Ｖ／Ｖ）　、それぞれ１０および２０
１？１１〕中、２係Ｉｓ　Ｓ　ＡでＱ”Ｃ，１０分間処
牝づ−ることにより、５′−水酸基位を脱保護する。飽
和炭酸水素アンモニウム水（２−）を添加して反応を停
止させ、クロロホルム（２５ｍｄ　）で抽出い水＆（１
０ｎψＸ２回）「ろ。有１．Ｊ層を乾燥（硫酸Ｊグネ／
ウム）し、少量（約５７ｚＪ　）に濃縮し石油エーテル
（３５゜〜６０（］留分）を加えて沈殿千゛トせる。無
色の沈殿全遠沈（、で集め、減圧下テンケータ　中−ご
乾燥−Ｊ−ると旦および旦か得られ、こＩしらＣ１゛／
リプノゲルＩＩ＋１、　ｅ　（八Ｉｅｒｃｋ　５０Ｉ’
２！１５４．　　クロロ、にルーム／メタノール−９，
，／１．）により、それそＩＬ均一なも・つと＃つかっ
た。 Ｅａｔ：体ｌ　オ、１：ヒ３　（２７０１，７！／、　
、１５ｍｍｏｌ　、ｂ−、＋こび１４５　ｉｎ！７＋　
、０７５　ｍ　：ｎ、＋１　）　’ｆＪ：、周囲温ＩＡ
Ｉｍで２５分間トリエチルアミン／ピリジン／水（１：
３：ｉ。 ｖ／ｖ　、　１０ｎｔｅ　）で処理することにより、各
／、の４ニスホ一ジエステルｆ本（Ａおよび７）に凹ｉ
Ｑ　ｆ　；巳１、試薬１−ロータリーエノくボレーンヨ
ンシこより除き、残留物を無水ピリジン（ｌｃＤｍＸ３
回）をυ［ｊえ−この蒸発を反復して乾燥する。三量体
、８　（，０５ｍｍｏ１）および三址体ヱを、無水ピリ
ジン（３ｎＴｌり中、ｌ”ＰＳＴｅ　（５０ｍ９　、．
１５ｍｍｏｌ）　と合わせ、この反応混合物を周囲温度
、減圧下で２時間放置する。 １冒・Ｃ分析ｉｃ　Ｊ：　り、９５俤の三量体旦が大量
体に変換しＣいることが確認された（１０％硫酸を噴霧
後６０”Ｃに加熱することによりＩ）　Ｍ　ｉ’グルー
プを検出−ｒることにより肉眼観察）。水（１ｎＩｅ）
を添７Ｊｌｌ　ｔ、て反応を鎮め、溶媒を減圧Ｆて留去
する。 トルエンを加えてピリジンを共弊蒸［＋ｉ　ｉ′−上・
ｌ　１’ｊ：　！Ａ、（ミの六附体全上記三司体Ａおよ
び乞に述へ／このと同様にして２％ｔＢＡ（ｓｍｇ）を
用いで処理し、５′位台で脱保護する１、この生成物（
２）をノリ力ゲル力ラム（〜１ｅｒｃｋ　６０Ｊ、Ｉ　
、　３．５　Ｘ　５ｃｍ　）　＆Ｃ入１ｔ、クロロホル
ム７．／メタノ−ルの段階的勾配溶出（９８２から９５
．５まで。ｖ／ｖ　）により精製する。 生成ｉ吻１０を含む分画を蒸発乾固−１ｒる。 同様にし−こ、三星体互を旦と結合させ、完全に保みシ
フ／ξ生成！吻を直接、／り力ゲル上精製−ｒる。この
生成物を、上記のようにトリエチルアミン／ピリジン／
水により処理して３′末端秀：脱保護し、フラグメント
旦を得る。 最後に、ｉ’ＰｓＴｅ　（７５ｍｇ、　、’２２５ｍｍ
ｏ］−）　　を縮合剤として用い、六量体−９および１
０を無水ピリジン中で結合させる。反応完結後（４時間
、周囲温度）、混合物をロータリーエ・くボレーターＶ
こかけ、残留物ｆｆ：ソリ力ゲルクロマ（・グラフにか
ける。石油エーテル沈殿Ｖこよって得られた生成物置（
１６０１１１９）ｉ、Ｊ：、′Ｉ″Ｌ　（、’　＆コ”
ｓ　イテ均−Ｔ　、り　ツｉｔ。 ピリジン（，５媚）　（１（入れた化合物上」の一部分
（２０＋１！９　）　”ｇ）、濃水酸「ヒア／モニウム
処理（７−Ｓ、８時間、６０°Ｃ）により完全に脱保護
し、引へ１跣へ８０　％　（ζ１酸中て処理（１５分間
、周…］温度）−１石。１！１１酸を留去後、固体残留
物で４チ水１裳［１ニア／モニウム欠（ｖ／ｖ　、　　
４　ｍｅ　）　Ｋ　’ａ　Ｉ管し、エチルエーテル（２
７７１ＸＳ回）で抽出する。水層？Ｃ１〜２〃ｆに濃縮
いその一部を１１０・Ｃにかけて上λを精製する。上背
なピーりに相当する分画εブー・°ししく約２０．１）
、２５４　　単位）、約５７ｚｚｄ　ｌ’こ６型線才る
。最終生５ｖ物１２を、Ｂｔｏ　−ｇｅＩＰ−２（１，
５Ｘ　１００ｃｍ）上、２０係水性エタノール（ｌこよ
り溶出ざげ゛Ｃ脱ｌ見１１、蒸発乾固し、水（／！ＯＯ
／〕ｅ）に再懸濁させ′〔Ａ２Ｓ＋＝ＩＯの溶液ケ得る
。１２の配列は二次元配列分析により確認した。 ソマトスタチン（Ｉｔａｋｕｒａ等、１９７７）、イン
シュリン（（２ｏｅｄｄ＋＋−１４ｊｊ　、　ｌ　９７
９　）、および成Ｊソホルモン（０ｏｅｄｄｅｌ　、　
１ｌｅｙｎｅｋｅｒ等、　１９７９　、　Ｎａ、、ｔｕ
ｒｅ２８１：５４４）に′ついて詳細に記載された方法
に従い、１６の合成オリゴヌクレオチ１から完全なチモ
シンａ１遺伝子を組み立てる。オリゴヌクレオチド１゛
２からｌ１１１５壕での１０　ｐｇ、肝を、′Ｉ゛４ポ
リヌクレオオチドキナーセ（（−３ｏｅｄ、ｄｅｌ等、
１９７９）の存在下で、１−１−”　Ｐ　Ｊ　−、Ａ　
’Ｉ”　Ｉ’　（Ｎｅｗ　Ｅｒ＋＋！’Ｊａｎｄｆヒ Ｎｕｃｌ、ｅａｒ）により定量的リン酸τ行な）と、約
１０１　、／’？？ｌ　１１１０　’ｌの比ｌ舌ＩＩｔ
を得る。放射線Ｑこ上り標識したフラグメントを、２０
％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルを用いた電気泳動
によって精製１−１溶離したフラグメントの配列を、蛇
ｊが部分消化（′（二よる一次元電気泳動／ホモクロマ
トグラフィー（、Ｊａｙ等　、　　１９７４．　　Ｎｕ
Ｃコｅｔ・−、Ａｃ１ｄ：；　　Ｈｅｓ、　　Ｉ　：３
３１）を用いて確認した。フラグメント＝１１１．よび
′ｒ１６は、次工程のリゲーノヨン反応の際の望ましく
ないボリメリ化４：最小限に抑えるため、リン酸化３１
・せずにおく。これらオリゴヌクレオチド（それぞれ２
μｇ）は、ｉ’ｈ　Ｊ）　Ｎ　Ａ　リガーゼにより、文
献に記１１アの方法（００ｅａａｅ１等、１９７９）Ｋ
；用いてそ−れそれ４個のフラグメントから成る４個の
グループ（第９ 添付の図往企参照）に組み立てる、反応生５Ｖ、物ｉ−
Ｉ、△ ７Ｍの尿素を含有する１５％ポリアクリルアミドゲル上
のゲル電気泳動（八Ｉａｘａ、ｍおよびｇ］１ｂｅｒｔ
。 １９７７、　”ｒｏｃ、　Ｎ、ｑｔ、　Ａｃａ、、ａ、
、　８ｃｊ、１．Ｊｓ、Ａ　７１　：３４５５）により
精製する。４個の単離した生成物・工・リゲ−ンヨ／し
、反応混合物を１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（こかけろと、チモノノ７１Ｚ１遺伝Ｐの人きさく９０
〜１０５塩基対）のｌ）　Ｎ・〜か電気溶離される。 プラスミドｐＢＨ３２２（０５７咄）を制限工、／トヌ
クレアーゼＢａｍ　Ｉｆ　Ｉ　粋よひｌ）：ｃｔツ１（
、Ｉｔ、　ｌで処（ｉｌ　１．、フラグメントをポリア
クリルアミドゲル電気泳動にヨリ分離する。大きいフラ
グメントを電気溶出によりゲルから回収し、組み立てた
合成ＩＪ　Ｎ　Ａと結合させる（　０ｏｅｄｄｅｌ、　
Ｉ：１ｅｙｎｅｋｅｒ等、１９７９）。 この混合物を］気ｃｏｌｉ　Ｋｌ　２　２９４　の形質
転換に使用・する。形質転換した混合物の５％金、アシ
ビンリン２０μｇ／７７Ｔｌを含有するＬ　Ｂ平板に蒔
く。得られた４個のアンピノリン耐性コロニーＦＪ−テ
トラザイクリン感受性であり、これにテトラザイクリン
面１性遺伝子への挿入を示唆している。これら４個のコ
ロニーから得られたプラスミドの分析の結果、いずれの
場合にもこのプラスミ）（ｐＴｈｌｚ　ｌと呼称）は、 △ θｌ遺伝子の存在を示している）；−０ｔＬで、（ｂ）
　　１３ａｍ　Ｉｆ　Ｉ　／　Ｅｃｏ　１口開裂によっ
て生し／こ約１０５哩基対のフラグメントを含有する、 ことがわかった。プラスミドｐＴｈＣｚｌの組み立て手
順を・添付の第９図に示した（一定倍率ではない）。５
−リン酸基は黒丸で示した。 ３処Ｊ！ｌ　ｐＴｈｌｚ　＋　、！：　ｌノＩ’ｒ　（
ｄ、）　７　ラフＪ　７　ト（Ｄ反応プラスミドｐＴｈ
　／７　Ｊ　ＩＱ、アンビアリン面１　ｕ１三に一指定
する遺伝子と、その５暗号鎖末端ｆ　ｌ’ｌｃｏ　］、
Ｌ　Ｉザイトに、そして３′末端を１３ａｍ１］１サイ
トにクローンした、チモンンｔｚ　ｌを指定する遺伝子
、を含む。 このチモシン遺伝子はまた８ｃｊ−１，１サイトヲも有
する。上で調製したＬＥ’（ａ）フラグメンｌ−を受は
入れることのできるプラスミドを作るため、ｐ　ｉ”　
ＩＩ　／７１をＩζｃｏ　Ｈ，Ｊ消化した後、そのＥＣ
０Ｉｔ　Ｊ残部を鈍感末端トｆル目的テｃｌＴＴ　Ｐオ
Ｊ：、（Ｊ−ｄ　Ａ　ｉ’　Ｐ４用いたクレナウボリメ
ラーゼ１反応に刺す。得られた生ｊ戎物を＋ｓｇ］、ｌ
Ｉ消化すると、アンピンリン耐性遺伝子と、両端にそれ
ぞれ粘Ｍｔ＜Ｅ　Ｂｇｌ、　１４残部と鈍感末端を有す
る真線状１）ＮＡフラグメントか生成する。この生成物
に、Ｂｇｌ　１．１粘着末端および鈍感末端を有−３−
るＬＥ’（ａ）フラグメントと、′■゛１リガー再 ′Ｉ″ｒｐ２４を形成させることができる。この過程に
おいて、鈍感末端のリゲーンヨンが起こった位置にＩ弓
Ｃ０１（・１ザイトが再生される。 １矢プラスミドｐＳ〇八４７／＼２・へ４の組み立て１
”’ｒ　ｐ２４　　ｆ　Ｂｇｌ　１１およびＬ：（：Ｏ
Ｉ（、Ｉで順次消化し、次いでＰ　Ａ　（３Ｅおよび電
気溶離を行なうと、３′末端に隣接したＥｃｏ　Ｒ，Ｉ
粘着末端しよび８ｃｊ、　ＩＩ粘着末端を併うＬ　ｌ！
Ｉ（ａ）ポリペプチドのだめのコトンを有するフラグメ
ントを得る。この１・Ｅ’　（ａ　）フラグメントは、
プラスミドｐｓｏｍ７△２のり」１１ザイトにクローン
することができ、トリプトファンプロモーター／オペレ
ーターの制御−トに発現されるＬｌ）ポリペプチド／ソ
マトスフチン融合蛋白質がη″敗する。このためＶＣＶ
、Ｋ、（ｊ）トリブトファンフロモーター／オペレータ
一部（ｉから離れたＥｃｏ　１１１サイトを・間装さぜ
る／こめの、ｐｓｏｍ７△２０Ｅｃｏ　ＩＬ　Ｉによる
部分消ｆヒ；おまひ、（２）コドンの読み取り枠を適切
Ｖこ維持し、ｌ＞ｃｔ）１０開裂サイトを再生するだめ
の、ブライマー配列の適切な選択、 を必要とする。 即ち、プラスミドｐｓ　ｏｍ　７　△２　１６μｇ　’
Ｆｃ、２０ｍ　へ１の　ト　リ　ス　（ｐＨ７，５）　
　、　　５　ｍ　へ１のへ！ａ（ユコ　２、．０２係の
Ｎ　１’　４０洗浄剤、オＪ：　ヒ１０　Ｃｍ　Ａ４　
（７）　Ｎａｃｌ　ｆ含有する緩衝液２００　ｔｔｌ！
で希釈し、ＥｃｍＩ口　、５単位で処理する。３７°Ｃ
で１５分経過後、反応混き物をフェノール抽出、クロロ
ボルム抽出、エタノール沈殿し、次いで４３ｇ１　［１
て消化する。大きい方の７ラグメント２１’　Ａ　（，
２１去、次いて電気溶離て分離する。このフラグメント
は、１・１号ポリペプチドの近Ｍ末端の為のコドンｌ　
Ｉ−”’　（ｐ）　Ｊ　、即ち、１３ｇ］−ＩＩザイト
から上流のコト／ヲ含んでいる・次にこのフラグメント
ラ」二重Ｌ　Ｅ　（ｄ）フラグメントと、Ｔ、　ｌ）　
Ｎ　Ａリガーゼの存在下でリゲー７ヨンし、グラスミド
ｐｓ　ｏｍ　７へ２へ４を形成さぜる。このプラスミド
汀、Ｅ、Ｃ０１ｉ　２９４ＶＣ導入すルト、トリプトフ
ァンプロモーター りこおいて、完全に再構成されたＬ　Ｅポリペプチドと
ノマトスタチンより敗る融合蛋白質を・効率良く生産す
る・ プラスミドｐＢ１ｔ３２２をＨ　ｌｎ　ａ　Ｉｌｌて消
化し、突出１−　／３　Ｉｆ　ｎｄ．　Ｉｌｌ末端を８
１ヌクレア−セ消ｆヒする。 この８■ヌクレアーゼ消化は、Ｓ１緩衝Ｗ　（　、　３
Ａ４のＮ　ａ（Ｅ　１　　、　　１ｍＭ　の　ＺｎＣ１
２、　２　　５　　ｍ　　Ｍ　のｒｌｉ１′酸　ブー　
トリウム。ｐＨ　４．　５　）　３　０ｕｌｌ中のＩｌ
ｉｎｄ　ＩＩＩ開裂ｐＢＨ３２２１０１ｚｇを、Ｓ１ヌ
クレア一ゼ３００単位で１５°Ｃで３０分間処理して行
なう。反応（・−ｘ　３　０　ＸＳ１ヌクレアーゼ停止
溶液（、８Ｍのトリス塩基、５　０　ｍ　ＭのＥ　ｌ）
　Ｔ　Ａ　）　Ｉ　Ｉｌｅを添加して終止させる。 反応混合物をフェノール抽出し、クロロホルム抽出し、
エタノール沈殿し、次いで前述のより（／こＥｃ。 １（・Ｉ消化を行なう。Ｉ’　Ａ　Ｃｉ　Ｅ法、次いて
電気溶離により得られたフラグメントは、ＥＣ０１目粘
着末端、および暗号鎖がチミジ／ヌクレオチ）・かもは
じする鈍感末端を有する。チミジンから始する８１消化
＋１ｎｄ　ＩＩＩ残部に、クレナウポリメラーセ用で処
理したＢｇｌ　１．１残部と混合し、リゲーンヨンによ
ってＢｇｌ．　１１制限サイトヲ再生することができる
。 以上のように、実施例２Ｃて調製したプラスミドｐ　８
Ｕ八４７△２をｌｓｇｌ．　Ｉ＋消化し、イ！Ｉられだ
１舅１１１粘着末端を、４個のチオキシヌクレオチドト
リホスフェートを全て使用してフレナラポリメラーゼｌ
処理により二本鎖とする。得られた生成物の町０１０開
裂後、その小さなフラグメン１−　ｒ，１　１’　Ａ　
（冊弓処理および電気溶離すると、トリプトファンプロ
モーター／オペレーターおよび、１３ｇＩＩＪザイトか
（ｐ）Ｊ）を有するＤ　Ｎ　Ａの線状断片か得られる。 この生成物は、ｌ’ｔｃ０１０末端およびｌ（Ｂ７１　
ＩＩザイトを補完してできた鈍感末端を有する。しかし
ながらこの１３ｇｌ　ＩＩサイトに、該鈍感末端金」二
詔Ｓ１消化１１ｉｎｄ　ＩＩＩ　フラグメントの鈍感末
端とリゲーノヨンすることにより再構成される。即ち、
２個のフラグメント（、　’Ｉ”、　ｌ）　Ｎ　Ａリガ
ーゼの存在下でリゲーンヨンしてプラスミドｐ　Ｉ−Ｉ
　Ｋ　Ｙ　（　０として再閉環させるが、このプラスミ
ドは、コンビテントな］゛）。 ｃｏｌｊ　２９４細胞に導入して増殖さぜる。組換えプ
ラスミ）−Ｉ〕Ｈ　ｌぐＹＩＯを担ったテトラザイクリ
ン削性細Ｊ胞を選択し、そのプラスミドＩ）　Ｎ　Ａを
抽出する。Ｂｌ？；ＩＩＩおよびＩ’ｅｔ　ｌで消化し
、Ｉ”　Ａ　（−冊り法および電気溶離（ｔこより、大
きなフラグメントヲ単離すると、目的とするＩ’Ｓｔ　
ｌおよびＢｇｌ　ＩＩ粘着末端を有する線状ＩＪ　Ｎ　
Ａ断片が得られる。このようにしてｐＪ．］　Ｋ．　Ｙ
　１　０から調製し／こＩ）　Ｎ　Ａフラグメントｉｒ
．Ｉ、複製起源を含んでいるので、ｌ；ｒｐ＋・１゛〕
ボリペブチド融合蛋白質遺伝子およびテトラザイクリン
耐性遺伝子の両者がｔｒｐプロモーター／オペレーター
の制＠ｊ下ｖＣするシラスミドｐ　、Ｉ　Ａ　７△４△
１の組み立ての際の１つの構成成分として有用である。 （ｊ、Ｔｒｐプロモーター／オペレーターを有する線状
１）ＮＡの組汐・立て 実施例２１・〕で調製したグラスミドｐ　Ｓ　（、）へ
１７△２ｆ・４を部分的１’：ＣＯＩｔ　ｌ消化、次い
でＩ’ｓｔ、ｌ消化に付す。得られたフラグメント＆−
、Ｉｔｒ−ｐプロモーター／オペレーターを含み、ＰＡ
ＧＥ法、次いで電気溶離にかけて分離する。部分的１！
：ｃＯＲ１消化は、ソマトスタチン遺伝子の５末端付近
では開裂されるが、アンピンリン耐性遺伝子とｔｒｐプ
ロモーター／オペレーターの間に存在するＥｃｏ　Ｉｔ
　］サイトでは開裂されないフラグメントを取得するた
め（（必要である。アンピシリン耐性遺伝子の中のＰｅ
ｔｌを切断することによって失わわたアンピシリン耐性
は、」二重実施例２Ｆで調製した最終的な線状ｐＨＫＹ
ＩＱＩＪＮＡ誘導体とのリゲーションにより回復させる
ことができる。 ■、インシュリンＡ鎖構造遺伝子の分離インシュリンＡ
鎖の構造遺伝子は、グラスミドｐＩＡ１のＥＣＯＲ，Ｉ
およびＬ（ａ、ｍ　Ｈｌ消化に、、ｌ：ツて得られる。 このプラスミドの組み立ては、（３０ｄｄ、ｅｌ等によ
るＩ’ｒＯＣ，Ｎａｔ、　ＡＣａ（１，Ｓｃｊ、、Ｕ、
８　Ａ　７６：１０６（１９７９）に記載されている。 目的生成物（（１ｌ’　Ａ（１１）および電気溶離によ
り精製され、ｌ！；００１口およびＩｓａｍｌ、−１１
末端を有している。 １、インシュリンＡ鎖構造遺伝子、Ｉｌｌ　ｒ　ｐブロ
モ−ター／オペレーター、セよびＰｅｔｌ並びに１）Ｂ
１゜１１末端を有するｐＨＫ　Ｙ　Ｉ　Ｏ線状１）　Ｎ
　Ａ−イラグメントのリゲーンヨン インシュリンＡ鎖構造遺伝子、ｌ；ｒｐプロモーター／
オペレーター含有線状１．）　Ｎ　Ａフラグメント（実
施例２（］で調製）、およびｐＩＩＫ　Ｙ　ｌ　Ｏ，銹
状ＤＮＡフラグメント（実施１９１Ｊ２Ｆで調製）を、
第１図に示す方向でリゲーションし、目的プラスミドｐ
　ｉ　Ａ　７△４ΔＩｆ：生成させる。グラスミドｐ　
ｌ　Ａ　７へ４へ１は、アンピシリンおよびテトラサイ
クリン酬性を回復しているため、容易に選択できる。 実施例３　グラスミドル目（７ハ４△Ｉの組・夕立でイ
ンシュリンＡ６ＪでになくインシュリンＢ鎖を指定する
構造遺伝子を最終的リゲーションに使用−Ｊ’る以外は
、実施例２Ａ−１に従って所望のプラスミドを組み立て
る。インシュリン■３鎖構造遺伝ｒ・ｕ、シラスミドｐ
ｉＢ１（その組みケでは（ｊｏｅｄｄｅｌ等、１９７９
、に記載）のＥＣＯＩ口およびＢａｍ１．Ｉ　ｌ消化に
よって得られる。インシュリンＢ鎖を暗号化するＩ）　
Ｎ　Ａフラグメントｕ、Ｐ　Ａ　（Ｅ　Ｅおよび電気溶
離により精製される。これに、＆Ｊ）１１．．１および
１３ａ、ｎＨｉ末端を有している。 プラスミドｐｌＢ７△４△１は第３図に示した。 このプラスミドはアンピシリンおよびテトラザイクリン
劇性を回復しているため、容易に選択できる、。 実施例４　シラスミドｐｌＨ７へ４Δ１の組み立てグラ
スミドｐＨ１，７△４△１の組み立ての様式を第１１図
（に示す。 目的とする組み立ては、実施例２１に・ボへたのと同様
の方法である。即ち、Ｌｒｐプロモー　ター／オペレー
ターを有する線状１）ＮＡフラグノント（実施例２Ｇで
調製）および、ｒ＋ｔ＜ｙ　Ｉ　Ｏ線状１）ＮＡフラグ
メント（実施例２Ｆで調製）を、常法によ７プラスミド
ｐｓＯＭ１１の、ソマトスフチン遺伝子含有１＞ｃｏ　
Ｉｔ　ｌ　−Ｂａ、ｎＩＩ　ｌ制限７　ラクメ７　トＶ
ＣＩＪケー７ヨンスル。フラスミｌ’　ｐ　５（−１Ａ
Ｉ　、１１１４山、ａｋｕｒａ等、１９７９．５ｃｉｅ
ｎｃｅ　Ｉ　９８　：　１０５６およびイギリス国公告
特許第２００７６７６Ａ弓の記載と実質的に同様の方法
で組み立てることができる。所望のプラスミドｐｓＯＭ
７△４へ１はアンピシリン耐性を回復しているため、容
易に選択できる。 グロインゾユリンの最初の３２個のアミノ酸化・暗号化
する遺伝子の組み立ての第一段階として、表２に示した
ｌ連の１８のオリゴヌクレオチドを調製する。個々のヌ
クレオチドは、塩基アデニン、チミン、シトシン、グア
ニンを表わす文字Ａ、′Ｖ、（づ、Ｇによって示し、こ
れによりヌクレオチドを互いに識別１１］能とする。最
終的に組み立てられた遺伝子全体のヌクレオチド配列を
第１０図に示す。 表２ ソマトスタチン遺伝子のだめの合成オリゴヌクレオチド
ＩＩＩ　　　　　　　ＡＡｉ’ＴｃＡｌ”０’門゛１１
２　　　　　　　　ＤＯＴｃＡＡＴＤＡＯＣＡ１１３　
　　　　　　　Ｄｃ’ｌ”ＴＴＯＴ（ｊ（３Ｔ７＋’（
”１１４　　　　　　　１’　ＯＡ　に　ｃｉ”　（１
：Ｏｉ’　Ｔ（ｉ　Ａ１１５　　　　　　　１、’ＴＯ
ＡＣ（’；ＡＡ（：Ａ　’ｌ”Ｄ１１６　　　　　　　
　に　Ａ　Ａ　Ａ　Ｏに　ｉ’　０　（シｉ”　に　Ａ
８７　　　　　　　　ＡＯＯＴＯＡＯＡＡＤ（’、Ａ１
１Ｂ　　　　　　　　　　　　　Ａ　Ｏ（！ｉ’　ｉ’
　ＤＡ　Ａ　ｃに旧　　　　　　Ａ　Ｏに　ｉ”門”０
ＴＡ（Ｅ１３２　　　　　　　　Ｃ′目Ｉ　Ｇ４１１０
’（ｊ　Ｇ（ｉ（Ｅ　ｌ’１４３　　　　　　　　にＡ
ＡｃＯＴ（ｉ（ｊＴｉ”Ｔｌ１ｓ４　　　　　　　１’
Ｔ（：ＴＡ（！Ａ　ＣＴｃ（：ｌ’Ｂ　５’　　　　　
　　Ａ　Ａ　Ｇ　Ａ　に　ｉ”　ｃＵ　Ｄ　Ｇ１３６　
　　　　　　　ＡＡｃＡＡＯＧＴＡＣＡＡＨ７ＡＣＯＴ
’ｌ”ＣＡＤＣＧＯＡ Ｂ８　　　　　　　Ｇ’！”ＡＧＡＡＧＡＡＡＣ（：Ｂ
ｇ　　　　　　　ＡＵＴＯ’■’　Ａ　ＯＵ　Ａ　Ｇ　
ｉ’Ｂ１０　　　　　　　　（ＪＡＴＣＣＯＯＣＧこの
合成ヌクレオチドは、第１０図中で角括弧の間に下線を
何して示した。これらのオリゴヌクレオチドは、トリエ
ステル法（Ｃ１ｒ３　ａ等、１９７８゜Δ ７３２７参照）’Ｌより合成した。このオリゴヌクレオ
チドのうち幾つかは、ヒトイン／ニリンＢ鎖遺伝−ｒの
組み立てに使用された（　Ｃｒｅａ等、１９７８　。 および”０ｅｄｄｅ１等、１９７９参照）。２個のオリ
ゴヌクレオチド（Ｂ５′および＋３　］　０’　）飢１
１ｐａ　Ｉｆ　、Ｆ＝・よび末端ＨａｍＩＪＪ並びに１
５ｃ０１０制限ザイトと合同している。この末端サイト
はクローニングの目的」二極めて有用である。 ヒトインンユリン１３釦遺伝子（Ｇｏ　ｅｄｄ、　ｅ　
］等、１９７９）の左坐分の組み立てのために前に使用
し／こ８個のオリゴヌクレオチド１１１〜１１８は、１
１鎖遺伝子の１〜１３番目のアミノ酸およびＮ末端部の
メチオニン単位の為のコドンを含有している。Ｂ　ＩＪ
Ｊ４の右半分は、０ｏｅｄ、ｄｅｌ等の教示する方法と
実質的に同様にして、］＋１　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼの存
在下１．ｌリボヌクレオチドＢ　１、Ｂ２、Ｈ３，１３
４，１３５′、Ｂ　６．１３７、Ｂ８、］Ａ３およびＢ
ＩＯかしリゲーションにより組み立てる。得られた遺伝
子フラグメントは、ヒトイン／ニリンＢ鎖の１４〜３０
番目のアミノ酸および架橋鎖の最初のアルギニン単位を
暗は化している。ｌ１ｐａｌ制限ザイトハ、ヒトインシ
ュリン遺伝子の［：Ｉｐａ　ＩＪサイトと同じ位置およ
び読み取り枠で、この遺伝子配列中しご組み込まれろ。 ポリアクリルアミドゲル電気泳動ケこより、このリゲー
７ヨンした遺伝子フラグメントヲ精製し、最大のＩ）　
Ｎ　Ａバンドｆ：溶離した後、このフラグメントをＬｌ
ｊ　ｒｅｄ　ｌｉｔおよびＢａｍ１ｌｌて開裂さぜたプ
ラスミドｐＢＩＬ３２２に挿入する。得られたプラスミ
ド（ｐＢ３と呼称）を１弓、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　２９’
ｌ　（）＼ｉ’　（’ＣＡ６３１４４６　）に形質転換
によって挿入する。このプラスミドは、抗生物質アンピ
ッリンとテトラサイクリンに対する耐性を付与し、Ｍａ
、−、＜　ａ　ｍ等（１９７７、Ｉ’ｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｊ、ｔｌｓＡ　　７４：５６０参
照）の方法により決定されたものと同じの目的とするヌ
クレオチド配列を有することがわかった。 ２個の７ラグメ／１・、即ち５８塩基月を待つｐ１３３
の１ｌｉｎｄ　ＩＩＩ　　Ｈａｍ　１１１７ラグ／ント
および４６塩基２＝Ｊ　ｋ持−、ｌ　Ｔ）旧１１　（０
ｏｅｄ、ｄ、ｅ　１等、１９７９ｉｃ記載）のｌ＞ｃｏ
　１（、１，−１１ｉ＋ｉｄ、　ＩＩＩフラグメントを
リゲー７ヨンして、１り。ｏＩｔ　ｌおよび１（ａ、。 ＩＩ　＋末端を有−ノーるフラグメントを作る。このフ
ラグメントｋ　、０ｏｅｄｄｅ１等、１９７９、に記載
の方法と実質的に同様にしてＥ。ｏＩｔ　ｌおよびＨａ
、ｍ　Ｉｔ、　Ｊ制限プラスミ１．１．旧ｔ３２２にリ
ゲー７ヨンする。次いて得られたプラスミド（ｐ１１稲
と呼称）を１り、ｃｏｌｉ　Ｋ］２　２９４にクローン
ｒる１、常套の増殖と分離の後、プラスミドｐｌＢ３　
ｆ　１ｉｃｏ　ＩＬ　ｌおよびＪ■ｐａ　ＩＩ制限酵素
（題より消化し、メチオニンｅごよって先行されるＮ末
端プロイン／ニリンのアミノ酸を暗号化する合成遺伝子
フラグメント（フラグメント１、第１１図）を作成する
。 この合成遺伝子は、常套のポリアクリルアミドゲル電気
泳動により分離する。 添イｑ１の第１２図に、目的とす７１）ｃ　Ｉ）　Ｎ　
Ａを増量する図式を示す。これに従って、１３８．ｍ、
１．Ｉ　ｌ認識配列秒よび約２０残基から成る３′ポリ
チミジル酸領域の両者を含むデカヌクレオチドＩ）　Ｃ
Ｃ（ｊ　Ｇ　Ａ　ｉ’（Ｉ　Ｃ（：　ＧＩｌｌ　Ｉｌｌ
　＋ｐ、８＋１＋　ヲ合成シ、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　合ｔｊ
’ｊ、］にメのＡ　Ｍ　Ｖ逆転写酵素を作動（プライム
）させるためにイ史月ト支る。このフライマーは・　１
．、５　Ｘ　］、　Ｏ＝ｐ　１１１０　］　のｉ’　ｌ
’　Ｐを含有する反応量０．６　ｙｚｄ中、ターミナル
デオギンヌクレオチジルトランスフエラ−ゼ（１’：ｎ
ｚｏ　ｌｓ：ｉｏｃｈｅｍ、　　２Ｑ　Ｑ単位）食用い
、このｌ（ａ、ｔｏ　１．１．１デカヌクレオチドｌ　
／／　１１１０１で調製する０反応ＦＪ、　Ｏｈａ、ｒ
＋ｇ等、　１９７８．　Ｎａ、１．ｕｒｅ　２７５　：
６１７に記、ｌ＆の緩衝液系中、３７°Ｃで１時間行な
う。 ヒトインシュリノーマ（島細胞胛）組織は、Ｉ１１＋＋
いしｕｔｅ　　ｆｉｉｒ　　Ｉ）ｉａｂｅｌ−ｅｓｆｏ
ｒｓｃｈｕｎｇ　（西ドイツ国ミュンー＼ン在）より入
手できる。当業者（・ζは、ヒトインシュリノーマ組織
が容易に入手でき、他の多くの供給源からも取Ｙｊ）　
ｉ’Ｊ能なことが理解されるであろう。ヒトインシュリ
ノーマ組織のポリＡ１１１Ｈ，ＮＡ　（２，５／／ｇ　
）　ｔ、Ｕｌｌｒｉｃｈ等の方法（１９７７゜５ｃｉｅ
ｎｃｅ　１９６　：　１３１３参照）と実質的に同様に
して分離し〜〜Ｖｉｃｋｅｎｓ等の教示する方法（１９
７８゜、１．Ｂ」−ｏｌ、　（、：ｈｅｍ、　２５３　
：２４８３）に実質的に従って、これを二本鎖ｃＤＮＡ
に変換する。１５Ｔｌ昌・１の′１゛ｒｊ　（１−１１
Ｄｉ　（＋）ＩＪ　８．３．４２　”Ｃ）、２１１１昌
！のＫＣｌ、８ｍＭの１４　ＭｇＣｌ２．３０　ｍ　ｌ
ｌ１１のβ−メルカグトエタノール、２　ｍ　Ｍのプラ
イ７−　ｄ　（’；　Ｃ（３（３Ａ　ｉ’ＣＣ（’ｉ　
（ｊ　ｌ■’１ｇ　””、オヨＵ　］　ｍ　ＡＩノｄ　
Ｎ　””’ｓ’ｉｇ含有する反応容量８０１１６をＯ′
Ｃでプレインキユヘートしておく。Ａ　Ｍ　Ｖ逆転写酵
素を添加後、この混合物ｔ　４２　”Ｏで１５分間イン
キュベー１・する。（４％られたＨ、　Ｎ　Ａ　／　Ｄ
　Ｎ　Ａを次いで常法（／（より変相さぜる。 ２５ｍＡＪのＴｒｊｓ−ＩＩＣＩ　（ｐＨ８，３）　、
　３５　ｍ　Ｍの１（Ｃ］、４．　ｍ　ＭのＡ４ｇＣ１
２，１５ｍ　Ｍのβ−メルカフ。 トエタノール、Ｉ　ｍ　Ｍ　ノロ、　Ｎ　Ｔ　、ｌ’ｓ
オＪ、０９１’ｊ’位ノＤ　Ｎ　Ａポリメラーゼ１（ク
レナウンラグノント）を含有する反応容量１５０Ｉｅ中
で、相補的（］１）ＮＡ＠′４を合成する。この混合物
と１５℃で９０分間次いで４°Ｃで１５時間インキュベ
ートする。続１７）−Ｃ１〜’ＶＩＣｋｅｌＨ（等（１
９７８）の教示する方法と実質的に同様（′（シて、Ｓ
１ヌクレアーゼ（ＭｉｎｅｓＬａ、ｂｒａｉ、ｏｒｉｅ
ｓ、　ＥＪ、ｋｈａｒｔ、　Ｉｎｄｉａ、ｎａ　）　１
０００単位を使用し′ＴＪ、８１ヌクレアーゼ消化を−
３７”０で２時間１１な９゜この二本鎖ＣＩ）　Ｎ　Ａ
　（、，３７ｔ）ｇ）を８係ポリアクリルアミドゲル上
で電気泳動して、５００鳴基対以トの大きさのＪ）　Ｎ
　Ａフラグメントを溶離する。Ａ’１ａｉｚｅｌ　＋Ｊ
ｒ、の方法（１９７１、Ｍｅｔｈ、　Ｖｊ、ｒｏ］、。 ５　：　１８０）＆こ実質的に従って、ターミナルテオ
キシヌクレオチジルトランスフエラーゼを使用してオリ
ゴデオキシシチジル酸残基を、このフラグメントの３′
末端に付加する。最初ＶこＰｓｔｌ制限酵素で消化し、
次にターミナルデオキノヌクレオチジルトランスフエラ
ーゼを用いてデオキシグアニジル酸の尾部を（＝Ｊけた
ｐ旧ｔ３２２に、この６０尾部を有するｃＤＮＡフラグ
メントをアニーリングする。 得られたプラスミドｆ　Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ］２　２９４
に導入し、クローンする。テトラサイクリンにＧ１耐性
で、アンピシリンには感受性であるコロニー’を分離し
、３個のＰｓｔｌ制限ザイトヲ持つグラスミドを°スク
リーニングする。この制限ス（９式は、プロインツユリ
ン遺伝子について指摘されている（　８１１ｒ’ｅＳ等
。 １９８０　、５ｃｉｅｎｃｅ　２０８　：　５７参照）
。 ６００の挿入塩基対を含むあるプラスミド、〕ｌ１１１
０４は予憩された１ＦＢｔ１制限型式を有し、Ｃ１，）
　ＮＡ調製の際に導入された３′ボ＋）　Ａ　ｊ；−よ
ひボ＋）　ＯＣの間のＢａｍＪＩ　Ｉザイトヲ含む。挿
入部のヌクレオチド配列の一部を第１０図に示す。この
配列・は、使用し／こｒｒ４ＮＡが異なる個体から分離
されたものであるという理由で、５ｕｒｅｓ等（１９８
０）　および１３ｅ１．］等（１９７９，Ｎａｔｕｒｅ
　２８２：、５２５）により以前報告されたものとは多
少異つＣいる（Ｆ線をイ・］わ したＡＴがＧＣと置き換っている）。 △ ＩＪ、ヒトプロインシュリンを暗号化する遺伝子の組み
立て ヒトプロインシュリンを暗号化する遺伝止の組み立てに
使用した方法を添伺の第１１図に示す。 プロインシュリンの最初の３１個のアミノ酸を暗号化す
る合１ｊ７遺伝子セグメント（第１１図におけるフラグ
メント１）を、前述のように制限エノドヌクｖ７−セＥ
ＣＯＩｔ　ｌおよびＨ，ｐａｌｌを用いて５０／Ｉｇの
プラスミドｐｌＢ３より回収する。このフラグメントに
また、プレプロインツユリンの１曲間列２１の代わりに
メチオニンに相当するＡ　ｉ”　（ｊコドンをも含んで
いる。 翻訳停止コドンとｍＲＮＡの３′非翻訳領域と共に３２
〜８６番目のアミノ酸全暗号化しているＣＩ）　Ｎ　Ａ
遺伝子セグメントａ、４０１ノｇのプラスミ１−ｐ１１
１１０４から、１ず１３８ｍ１１１、次いで１．Ｉｐ、
ａ　ＩＩ制限酵素で処理することによＶ回収できる。二
個（・）フラグメントｔポリアクリルアミドゲル電気泳
動、次いて電気溶離により分離する。これらの遺伝子フ
ラグメントを、２０／７１のリガーゼ緩衝液（Ｕｏｅｃ
ｌ、ｄｅｌ等、１９７９）中、４０．２４時間の′Ｉ″
、　１）　Ｎ　Ａリカ−ゼ処叩により連結させる。この
混庁物ｆ　５０ｇ１ｅのｌｌ２（：１で希釈後、常法に
よりフェノールおよびクロロホルムで抽出し、次いてエ
タノール沈殿する。 得られたＩ）　Ｎ　Ａ　Ｉｄ　Ｈａｍ　Ｉｆ　Ｉおよび
１号ｃｏｔ口制限酵素で処理してこれらの制限サイトを
再生し、遺伝子重合体を除去する。次いで組み立てたプ
ロインツユリン遺伝子をポリアクリルアミドゲル電気泳
動により分離し、ｌ先ｏ　Ｉ（ＩおよびＨａｍ　Ｉｆ　
ｌ消化したグラスミドｐＨ１）、３２２　　にリゲー／
ヨン（Ｔ、　Ｉ）ＮＡＩＪガーゼを使用）する。得られ
た１月くＡを１４゜ｃｏ、ｈｉ　Ｋ１２２９４　しこ導
入し、得られたコロニーをテトラサイクリン感受性およ
びアンビアリン面］性についてスクリーニングする。か
かるコロニーから亦離されたプラスミドＩ〕■１１３は
所望のグロイン／ユリ７遺伝子を含んでいた。これは引
き続きヌクレオチド配列分析（でよりその特ｉ住を決定
した。 メチオニンを暗号化しているＮ末端コドンを含む完全な
ヒトグロインシュリン遺伝子を、ｌｉ；ＣＯ旧およびｌ
−３ａ、ｍ　１．１１制限酵素処理によってプラスミド
ｐｒ−１１３から回収する。所望のフラグメント’ｌゲ
ル電気泳動により精製し、次いでプラスミドｐＳ〇へ１
７へ４△１の１°ｓｔｌ　−ｌ弓ｃｏ　ＩＬ、　ｌ　（
部分）消化物ら・よびプラスミドｐ］［Ｙｌｏ（実施例
１２Ｆで調製）の大きい方のＰｓｔ　ｌ　−Ｂｇｌ、　
ＩＩｌフラグメントリゲーンヨン（Ｔ、　Ｉ）　Ｎ　Ａ
リガーゼを使用）する。 、　８　（）Ｍ　７△４／川フラグメントは、ｌｌ１（
公的Ｉりｃ。 １０消化、次いでＰｓｔｌによる完全消化により組み立
てる。得られたフラグメン目”、１ｔｒｐプロモーター
／オペレ・−ターを有し、］’　Ａ　０１す、次いで電
気溶ｒ（’ｔ　Ｂ’こより分離−「る。部分的ＥＣＯ１
＜、　ｌ消化は、ソマトスタチン遺伝子の５′末端隣接
部で開裂し、かつアンビンリン耐性遺伝子とｔｒｐプロ
モーター／オペレーターの間に存在するＥｃｏ　＋ｔ　
Ｉサイトでは開裂しないフラグメントを得るために心安
である。アンビンリン面１性遺云子領域てＩ’Ｓｔ　１
．　／こより切断されることにより失われたアンビンリ
ン削件ＱＪ、、前述の実施例２Ｆで調製した最終的、〕
ＩｌｌぐＹＩＯ１腺状１）　Ｎ　Ａ誘導体とリゲ−７ヨ
ンすることにより回復する。 １）。ｏｌｏおよびＩＳａｍ１１１末端を有する完全な
ヒトプロインシュリン遺伝予約１１Ｉｇ、ｐＳ〇八１へ
、−，４△１の（部分的）　Ｐｓｔ　ｌ、　−Ｅｃｏ　
ＩＬ　ｌ消化フラグメント４１ｉ、ｇ　、およびｐｉ−
１，ＫＹ　１０のＰｓｔ　Ｉ　−Ｂｇｌ　ＩＩフラグメ
ント約μｇｆｆｉ、ｉ’４Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼを用いて
リゲ△ 一ジョン緩衝液中で４゛Ｃ１２４時間リゲー／ヨンノー
　る　・ リゲーノヨンしたＩ）　Ｎ　Ａ　９１合物は、Ｕｏｅｃ
ｌ−ｄ、ｅｉ等（１９７９）の方法に実質的（（従って
ｌ゛：、ｃｏｌ、ｉ　Ｋ　１２２９４　に導入する、ア
ンピノリンとテトラサイクリンの両者の存在下に生育す
るコロニーを・選択−４−ると、これらのコロニーＦｌ
、８１）８ポリアクリルアミドゲル電気泳動（八１ａｉ
ｚｅｌ、・Ｊｒ、、１９７］、）により、７９ｉ嗜（７
）フラスミトｐＨ１７，ｈ４ム］　ｋ含み、ｌ；　ｒｐ
Ｌ　Ｌ：’−プロインンーリノ融合物かりｒ想される分
子量を有する蛋白で発現することか見出さ÷しブζ。 」二連の蛋白を発現するグラスミドｐＨｒ７　、゛、　
４・＼１は、組み込まれた遺伝子およびベクター両者の
１）ＮＡ配列粋よび制限サイトにより完全にその苛性を
決定した。プラスミドｐ１１１７　ｗ　４ハｌに添イマ
１の第５図に示した。このプラスミド＆１−ア７ピシリ
ンおよびテトラサイクリン耐性全回復しているため、容
易に選択できる。 実施例５　　ｐＤｌｌｏの〜２７ｋ　ｌ）　、Ｉ’ｓｔ
　ｌフラグメントの分離 ゲラスミ１．ｐＪ）Ｊ　］　Ｑの〜２．７　ｋｂ　ＰＳ
ｔ　１フラグメントは、Ｈｈａｌｌに！特異性の制御堰
および修飾遺伝子を含んでいる。町ｃｏ］ｉ　Ｋｌ　２
２９４／　ｐＤＩ　１０から分離した、共有結合で閉環
した環状ｐＨ１１０約１５μｇを、Ｐｓｔ　ｌ制限酵素
により３７′Ｃで完全に消化する。この反応混合物は、
ｐＬ目１０溶液（実施例１でＡ製ン約３５ｔｉｅ、１０
ＸＰｓｔｌ緩衝液（１，００ｍＭのＭｇＣ１−２，５０
ＱｍＭの（Ｎ　ｌ−１＋　）２８０　ａおよび２０’Ｏ
ｍＭの′Ｉ″ｒ　ｉ、　ｓ　−ＨＣｌ。ｐＨ７５）　１
５１１ｅ、牛血Ｗｒフルフミン（１ｍｇ／ｌｎ１．　）
　１５／１６、水７７５／Ｊｅ、およびＪ’ｓｔｌ制限
酵素（ｌ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｒｌｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ
単位／ｌｉ（’ｊ　）　Ｉ　７５ｐｌＪ　’ｉｘ含有し
ている。制限処理したｌ）　Ｎ　Ａを、Ｔ　ＨＥ　（）
リス塩基１０．８ｇｍ、硼酸５、５　ｇ、ｍ　ｓ　Ｎａ
　２　Ｅｌ）ＴＡ　、　Ｑ　９　ｇｍを水１ｅ中に含有
）中の、８係アガロースを含有するＡ　ＯＩＧ　（アガ
ロースゲル電気泳動）により、分画する（１５時間、２
２０ボルト）。このバンドは、エチジウムプロミド（、
５１ｉ（ｔ、／　ｍｌ！　）による染色と紫外光の下で
の観察でｉｊＪ視化Ｊる。所望のフラグメン）を切除し
て、′１゛１旧゛：中で１５０ボルトで１時間電気溶ｐ
；１Ｆする。Ｉ）ＮＡｉ平衡緩衝液（ＫＯｌ、　Ｉ　Ａ
４　Ｊ：、’よひＴｒ　ｉ　５−１１０１１ＱｍＭｏ　
ｐＨ７，８）で平衡化し／仁１）　Ｅ　Ａ　Ｅセル。 −ス（Ｗｌ］ａｔｍａｎ　Ｉ）Ｅ’５２　）と結合させ
、平衡緩衝液でカラムを洗浄後、Ｉ）　Ｎ　Ａを溶離緩
衝ｉ　（Ｎａ、（ニー１１八４およびＩ’ｒｉＢ−［Ｌ
Ｃｌ　ｌ　Ｑ　ｍＭ　０１ｕ１１７．８　）で溶出する
。溶離液を、Ｎａ　　イオン濃度につい−Ｃｉ’Ｊ：は
ぼ、３５Ｍとなるほうに１１２０で調節し、次しここの
Ｉ）ＮＡｌ、１００％エタノール２倍量の添加および一
２０゛Ｃで１晩冷却することにより沈殿させる。目的と
する沈殿を遠沈して集め、乾燥し、Ｉｌｌ　ｔ、”に溶
解する。 実施例３　　Ｐｓｔｌ消化プラスミド［）ＴＡ７へ４へ
１の分離 実施例２で調製したプラスミドル１．Ａフハ４△１約、
５μｇを、実施例５と実質的に同様の方法Ｖこより、Ｐ
ｓｔｌ制限１１￥素で３７″０で３時間消化する。 制限処理した１）ＮＡを、標準手法しこより、フェノー
ルで１回、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４
：１）で２回抽出する１、この溶液を３Δ１の酢酸ナト
リウム（ｐｉｔ　８　）。１容量と混合し、エタノール
２２容駄を添加し一晩−２０”Ｃｒ＆ζン令去ＩＪ−す
ることにより沈殿、＼せる。目的とする沈ＩＩ役ヲコ屯
沈１゜て集め、乾燥し、ＩＩＩ　Ｅに溶解する。 実施例７　．１’ｓｔｌ消化プラスミドＹ〕１Ｂ７へ４
へ１の分離 実施例３で調製（またプラスミドｐ１Ｂ７へ４△ｌ　ｌ
）、５ｐｇｔ、実施例５と実質的に同様（、り方法によ
り、１’ｒ＋１−．１制限酵素で３７′Ｃで３時間消化
する。τＩｌｌ限処理したＩ）　Ｎ　Ａを、標準的手法
により、フェノールテ１　回、クロロホルム゛イソアミ
ルアルく２，’Ｉ　：　ｌ）で２回抽出する。この溶７
１１を３へ４の酢酸ナトリウム（ｐＤＩ８）、１容量と
混合し、１００チエタノール２，２容量を添加し一晩−
２　０　”ｃ　＋ｃ　？令去１）することにより沈殿さ
せる。目的とする沈殿を遠沈して集．Ｖ）、乾燥し、ｊ
ｌｌ　Ｆ，に溶ｊ宵ｒる。 実施例８　プラスミドｐ　ｌ）　１　１　０　（つ〜２
．　７　ｋｂ　Ｉ’ｓｔ■フラグメントの、Ｐｓｔｌ消
化プラスミド△４△ｌへのリゲーション Ｐ８目消化プラスミドｐ　１．　Ａ　７△４，へｌ約．
　２　ｔｉｔｆ−よびプラスミドｐｌ）１１０の〜２．
　７　ｋｂ　Ｉ’Ｓｔ　１　　フラグメント１．　１　
ｐｇ．ｆ：、ＴＥ／１０ビＩ’ｒｉ６−１１（４．１．
　］　ｍＰｗ１（　ｐＨ　７．　８　）、Ｎａ２１４：
ＤＴＡ　　、ｌ　ＩＩＩＡＩ　］　４００１’ｅ　中で
混合する，、３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ１３）、１容
計を添り日ｆ多、このＩ）　Ｎ　Ａを１００％エタノー
ル２２容量の添加および一２０″Ｃで一晩冷却すること
Ｖこより沈殿さぜる。目的とする沈殿全遠沈しーＣＭ．
め、乾燥スル。ｌｈＵ中（７）　ＩＪ　Ｎ　Ａ　２　ｐ
ｅ，　５　Ｘ　キナ−　−Ｌ’　−リガーゼ緩衝液Ｌ　
ＭｇＣ１．２　５０　ｍ　Ｍ　、　ジチ」“ｌ・レイト
−）ｂ２　　５　　ｍＡ４，　　Ｔｒｉｓ−　　１１（
−ｈ　　　２５０　　ｍＭ　　’（　　Ｔａｌ＋７８）
、および２５％グリセロ　ルＪ　、６／Ｉｅ，　、６６
１１、Ｍ　４−）　Ａ　ｉ”　ｌｏ．６　ｐｅ，　オ．
１：　（ｊ：　Ｔ４１）　Ｎ　Ａリガ　ゼ・１１７、６
（１単位／μ６）を含有する反応容量３．　：３　ｐｅ
の溶液中でリゲーションを行なう。この反応混合１勿ｌ
／ユ１５°Ｃで一夜インキユベートする。 実施例９　グラスミドｐｌ）１１０の〜２．　７　ｋｂ
　Ｉ’ｃｔ１フラグメントのｌ’ｓｔｌ消化ブラスミｌ
’　ｐ　ｌ　ＩＳ　７　ｌ。 ４△１へのリゲーション ブラスミドｐＬＡ７Δ４△ｌの代ＡノリにＩ’ｌ；ｉメ
肖化プラスミドｐｌＢ７へ４へｌを使用−ｒる以外性、
実施例８と実質的に同様にして所望の１ノゲ−７ヨンを
遂行する。反応混合物は１５°Ｃで一夜インキユベート
する。 実施例１０　　町ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＲＶ３Ｑ３／ｐＰ
Ｒ，２６および１弓、　ｃｏｌｊ　Ｋ１２　＋ｔｖ３ｏ
ｓ、’ｐｒ’Ｉｔ２７の組み立て並びにグラスミドｐＰ
Ｒ２６とｐ　Ｐ　Ｈ，２７の分離実施例８で調製したリ
ゲーンヨン後のＤ　Ｎ　Ａ約、１μｇｔ、Ｓ　Ｓ　Ｃ／
　ｌ　ＯＶＣＪ：　、！：’　Ｒ終容量５０　ｐｅ　ト
なるように希釈する。この１）ＮＡを、実施１９１月と
実質的に同様の形質転換手法によつ−Ｃ、コノピデント
Ｅ、Ｃ０１ＩＫ１２Ｉ（■３０８に導入する。所望のＥ
。 ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＲＶ３０８／ｐＰＲ２５および１つ
、　Ｃ０１ｊ　Ｋ１２　ＩｔＶ３０８／ｐＰＴＬ２７形
質転換体を、テトラザイクリン５μｇ／祠を含有する１
・寒天上で培養することにより分離する。分離物を試験
してテトラ−リイクリン耐性とアンピシリン感受汁を確
認する。 ｊ３ａＺａｒａｌおよびＨｅ１ｊ　ｎ５ｋｉ　（１９６
８）の分離手法と実質的に同様にして、適当なコロニー
を、共有結合で閉環（７た環状プラスミドＩ）　Ｎ　Ａ
の分離に使用する。このプラスミドの構造を、制限エン
ドヌクレアーゼ開裂サイト地図を作成することにより確
限フラグメントハ、どちらの方向にも挿入され得るので
、２方向のプラスミドか得られる。従ってプラスミドｐ
　ｉ’　Ｒ２６およびｐＰＲ２７、並びにそれら各々の
形質転換体を上記手法において分離する。 実施例１１］り、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２１ｔｖ３０Ｂ／ｐ
Ｐｌｔ２ＢおよびＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＲＶ３０８／
ｐＰＨ１２２８の組み立て並びにプラスミドｐＰ１ｔ２
８とｐＩ’Ｈ，１２２８の分離実施例８で調製（−だリ
ゲーンヨンＩ）　Ｎ　Ａの・代わりに実施例９のものを
使用する以外は、実施例１１と実質的に同様の方法で所
望の組み立てを行なう。 目的とする１つ、　ｃｏｌｉ　Ｋｌ　２ＲＡ・’３０８
／ｐｉ”１１．２８　およヒＥ、ｃｏｌｉ　Ｋｌ　２　
ＪＬＶ３０８／ｐＰ１（１２２８形Ｔｉ転換体を分離し
、各々のグラスミドの構造を、制限エンドヌクレアーゼ
開裂サイト地図の作成により確認−ｆ７）。このグラス
ミドを含む〜２．７　ｋｂ　Ｐｓｔ　Ｉ　　制限フラグ
メントハ、どちらの方向にも挿入され得るので、２方向
のプラスミドが得らホＬる。従ってプラスミドｐ　、１
’　ＩＬ２８およびｐＩ’１ｔ１２２８、並びにそれら
各々の形質転換体を上記手法Ｌ・こおいて分離する。 実施例１２　　睨Ｃ０１ｉ　Ｋ１２１ｔＶ３０８／ｐｌ
’Ｒ２９ノ組み立ておよびプラスミドｐＩ’　Ｒ２９の
分離ゲラスミ）ｐＰＩｔ２７は、塩基対位置はぼコオー
デイネイト３３１に１個のＢｇ」、　ＩＩ制限ザイトは
ぼコオーデイネイト２３３４のＭ　ｉｉ！ｉ　ＩＩＣ１
個のＡＶａ１サイｌ−を有する。シラスミドｐＰｌｔ２
７　（実栴例１０　で調製）約８Ｉ１ｇヲ、３７°Ｃで
、ｉ＋ｒ１８−　ＩｆＣ，＋　２０ｍＡ４　（ｐＨ７，
４）、Ｎａ（−；１　３Ｑ　ｍＭ　、およびＡｖａ、　
Ｉ　ｉｆ川用酵素１６単ｌｉ′／、（１１１０・、２単
位／１１（！　）を含イｊ才る反応液１５０１１ｅ中で
完全に消化する。ここＶこＩＯ×叩］１１緩衝液（１八
１の′ｐ、］８−ＩＩＣ」（＋）１１８．　Ｏ）、Ｍｇ
”　Ｊ　２５０　ｍ　Ｒ１およびＮａ１ｌ　６００＋ｎ
八’Ｊ２０１１／Ｊ１水２５ｐｅ、および１３ｇ１［Ｉ
制限酵素（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ−ａｎｄＢｉＣｌｌａ、ｂ
ｓ、１６単位／　ｔ４Ｊ　）　Ｓ　ｐｅを加え、３７°
Ｃて６０分間、次いで６５゛Ｃで５分間インキュベート
する。この制限処理Ｄ　Ｎ　Ａは、実施例５と実質的に
同様の方法を用いてＡＣＥにより分画化、次いて所望の
〜６２ｋｂフラグメントを電気溶離および１）　Ｅ　Ａ
　Ｅ　セルｏ　−スクロ？　）　り５７　（−Ｈ′コア
　’Ｉ”　Ｉ！；中に回収する。 ゲラスミ１−ｐＨＩ　７　、＼４／司に、」ふｉ−Ｘ対
位置はぼコオーティネ（＋・３３１ｆ／こ１個の１舅１
１１制限ザイト、はぼコオ−ティ不イ）　２６１４の位
置に１個のＡＶａ１ザイトを有する。実施ＩＦＩＪ　４
で調製したグラスミドｐＨ１７，”、４何約１５／１ｇ
’（ｉｘ、＋ｉｅ　実／Ｖ　例１２　Ａと実質的に同様
の方法Ｖこより、ＡｖａｌおよびＨｇ１１１制限酵素（
（て完全に消化する。制限処理した１）ＮＡ山実施例５
と実質的に巨１様の方法により、Ａ（冊゛〕で分画し、
次いで電気溶離ら・よびＩＪ　ｌ！；　Ａ　ＩＩ；セル
ロースクロマトグラフィ−シこよってｉ’　ｌ＝＋中に
回収する。 ゲーノヨン プラスミドｐ　Ｐ　１．（，２７の〜６．２　ｋｂ、　
Ａｖａ、　ｌ−１３ｇ１　Ｉｆフラグメント（実施例１
２Ａで調製）約２．３ｐｇ、およびｐ、ｔｌ　１．７　
へ４　ヘ１の〜２．３　ｋｂ　Ａｖａ、　Ｉ　ＪＳｇｌ
、　ｉＪフラグメント（実施例１２１３で調製）約、８
５１ｔｇをＩＩ＋１！：　５７０１ｉｅ中で混合し、実
施例８と実′Ｈ的ケご同咋の方法でエタノール沈殿させ
る。回収シ／ζＪ）ＮＡを、５×キナーゼ−リガーゼ緩
衝液２ｐど′１，６６打ｌ”　ノＡ””　Ｐ　２　ｐｅ
　−水６７’４　オ、Ｊ：　ヒＴＩ　Ｉ）　Ｎ　Ａ　Ｉ
Ｊ　ｊｊ　−セ（１単Ｉｆｆ　／ｐｅ　）　、　Ｉ　ｐ
１３　’ｘ含む反応液１０．１　／／（４中でリゲ−７
ヨシする。この反応混合物を９０で一夜−ｆンキュヘ−
トし、既知の方法に従って所望の１）ＮＡを回収する。 実施例８て調製したリゲーンヨン後Ｊ）　Ｎ　Ａの代わ
りに実施例１２０のものを使用する以外（１実施例１０
と実質的に同様の方法により、目的とする組み立“ｒ−
１行なう。目的とする１、。。］、４　Ｋ　ｌ　２Ｈν
３０８／ｐＰｌ（２９ヲ分離し、制限エンドヌクレアー
ゼ開裂サイト地図の作成により、このプラスミドの構造
を確認した。 以上に記載の方法に従って組み立て可能な代表的形質転
換体を、以丁の表３ｖこ挙げる。 表　　３ 代表的形質転換体 １、　　Ｅ、　ｃｏｘｉ　　ＫＩ２　２９４／ｐＪ’Ｊ
Ｌ２６２−！≦０匹旦　［１２２９４／ｐ”Ｋ２７３　
　」≧、　　ｃｃとコ、」−Ｉぐ１２　　２９４／ｐ　
Ｐｉｔ２８４　３、二カニ　Ｋ］２　２９４／ｐ”Ｈｌ
２２８５、　　　ｌ≧、　工≧３２−コ４コニ　　ＫＩ
２　　２９４／丁・Ｐ　ＩＬ２　ｇ６　↓６匹二　Ｋ　
１２　、／ｐ　Ｐ　ＩＬ２７７　μ、且暖ユ　Ｋ］２　
　Ｃ６００／ｐＰＨ２６８火、旦旦主土　Ｋ１２　（じ
６　Ｑ　Ｏ／ｐ　Ｐ几２７９　μ９匹旦　Ｋ１２　　”
’６００／ｐｌ’Ｈ２３１０μ、二旦　［１２Ｃ６Ｃｌ
０／ｐｌ’Ｊｕｌ　２２８１１ｔ１匹二　Ｋ１２　　Ｃ
６００／ｐＰＨ，２９１２上・９旦／ｐ　’　ＩＬ２７ １３　　火、　エソ？ユニし　　ＫＩ２　　　Ｃ６Ｈ１
＋、に−八’に一／ｐ門Ｌ２６１．４凹ｃｏｌｉ　　Ｋ
１２　　Ｃ６００Ｈ，、、１ｕｌｌ−／ｐｌ’Ｊ７１５
　　蛇、旦止しエ　Ｋ１２　　Ｃ６ＱＱＲ，、Ｒ・ｌｋ
／ｐｌ’Ｈ１２８１６秒、　　ｃｏｌｉ　　　Ｋ１２　
　＜シロ００Ｈ，に−八゛’　ｋ−／ｐｌ’ＲＩ２２８
１７　　　１；、　　　□９，５とコニ１エ　　　＋（
１２（シロ　　００　　Ｈ，に−八Ｉ　ｋ−／ｐ　Ｉ’
　＋？・２９１８　　μ、三二　Ｋ１２／ｐ　Ｉ’　Ｒ
２８１９、１！：、　ｃｏｌｉ　　ＫＩ２　　Ｈｌ（１
（Ｊｌ／ｐｌ’＋（２６２０μ０図旦　Ｋ１２　１１Ｊ
ＱＩ／ｐｌ’Ｈ・２７２ｊ、　　Ｅ、　ｃｏｌｉ　　Ｋ
、１２　　Ｊ：ＩＢＩＱｌ／ｐＰＨ，２８２４Ｅ、　　
胚ｌ　ｊ、　／　ｐ　Ｊ’　Ｒ２８３１ル　圧ｉ　ｉ　
／　ｐ　ｌ’　Ｉ（，２９

【図面の簡単な説明】

第１図１１プラスミドｐＩＡ７　　／ｌ／Ｉ　の制限サ
イトおよび機能地図、第２図はプラスミド、］　Ｉ’　
Ｒ２６ち・よびｐＰ且２７の制限サイト地図、第３図は
プラスミドｐ１．　Ｂ　７６４△１の制限サイトおよび
機能地図（矢印は転写の方向を示す）、第４図Ｇ１プラ
スミドルＪ”Ｋ２８　オヨＵ　ｐＰ　”１２２８ノ？ｌ
１ｊｆｌｌｔ　”）−・（ト地図、第５図はプラスミド
ｐＩＩ　Ｉ　７　、Ｚ、　４△１の制限サイトおよび機
能地図（矢印な転写の力自社示す）、第６図はプラスミ
ドｐ　Ｐ　Ｉ（，２９の制限サイト地図、第７図ｒ１チ
モシンσ１遺伝子の構造２示す模式図、第８図にフラグ
メン１Ｉ；５の合成方法を示すフローチャート、第９図
はプラスミドｐ、ｉ’　ｈ　／１１の組み立゛Ｃ経路を
・示すフローチャート、第１０図は合成プロイン／ニリ
ン遺伝子のヌクレオチド配列イヒ示ず模式図（アミノ酸
１〜３０、Ｂ鎖、３１〜６５：Ｃ鎖、６６〜８６二Ａ鎖
）、第１１図ｉｒｉプラスミドｐＨＪ７へ４へ１の組み
立て経路を示すフローチャート、第１２図はプラスミド
ル１目ｔ０４の組み立て経路を示すフローチャートであ
る。 ＦＩＧ、１ α ＦＩＧ、　２ ＦＩＧ、　３ 圧 ＦＩＧ、４ ＦＩＧ、５ ＦＩＧ、　６ 第１頁の続き 諺）Ｉｎｔ、　Ｃ１，３識別記号　　　庁内整理番号（
Ｃ１２Ｎ　　１５１００ Ｃ１２Ｒ１／１９　）　　　　　　　　　　　６７６０
−４８（Ｃ１２Ｎ　　１５１００ Ｃ１２Ｒ１１０７）　　　　　　　　　　　６７６０−
４８（Ｃ１２Ｎ　　１５１００ Ｃ１２Ｒ１／４２５）　　　　　　　　　　　６７６０
−４．８（Ｃ１２Ｎ　　１５１００ Ｃ１２Ｒ１／３８　）　　　　　　　　　　　６７６０
−４８（Ｃ１２Ｎ　　１５１００ ＣＩ２　Ｒ１７’４４　）　　　　　　　　　　　６７
６０−４’Ｂ（Ｃ１２Ｎ　　１５１００ Ｃ１２Ｒ１／４６　）　　　　　　　　　　　６７６０
−４８（Ｃ１２Ｎ　　１５１００ Ｃ１２Ｒ１１０４）　　　　　　　　　　　６７６０−
−４８（Ｃ１２Ｎ　　１５１００ Ｃ１２Ｒ１／４６５）　　　　　　　　　　　６７６０
−４８（Ｃ１２Ｎ　　１５１００ Ｃ１２Ｒ１１０１）　　　　　　　　　　　６７６０−
４ＢＯ発　明　者　ポール・ロバート・ロスチック・ジ
ュニア アメリカ合衆国インディアナ４６ １０７ビーチ・グローブ・ヤズー ・ドライブ１５２６番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、組換えＩ）　Ｎ　Ａクローニングベクターによりバ
   クテリアを形質転換させることからなる、天然に存ｒＥ
   −Ｊ−るバクテリオファージから該バクテリアを保護す
   る方法であって、該ベクターが、１）該バクアリアに制
   限活性および同起源修飾活Ｖ１を伺りするｌ）　Ｎ　Ａ
   セグメント、２）該バクテリアにおいて機能するレプリ
   コン、および、 ３）該バクテリア中で機能的ポリペプチドを発現する遺
   伝子、 を含有するととを特徴とする方法（ただし、１）天然に
   存在するバクテリオファージは、該バクテリアに何カさ
   れ／こ制限活性と同じ特異性の制限部位を有する２本鎖
   ｒ）　Ｎ　Ａを含み、２）該修飾活性は、該バクテリア
   において、制限活性に先ｑって発現される）。 ２該バクテリアが、Ｅ、ＣＯｌ　］、”ａＣ１１−、Ｌ
   ｕ８１Ｓｅｒｒａ　ｔｌａ、−Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
   、　５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、　５ｔｒｅｐｔｏ
   ｃｏｃｃｕｓ。 Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ、　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
   ｅｓ、　ｉたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのいずれか
   である、第１項に記載の方法。 ３該バクテリアがＢａｃｉｌｌｕｓ、好ましくは５ｕｂ
   ｔｉ、］ｉｓまたはｔｈｕｒｊ　ｎｇｉｅｎｓｉｓ種で
   ある、第２項に記載の方法。 ４該組換えＩ）　Ｎ　Ａクローニングベクターがプラス
   ミドであり、該バクテリアがＥ、　ｃｏｌｉ、　Ｋ　１
   ２である第１項に記載−の方法。 ５、　ｌ）　Ｎ　ＡセグメントがＰｓｔ　ｌ　制限およ
   び修飾活性、１！ｃｏｌｔｌ制限および修飾活性、１．
   ｆｈａ　ＩＩ制限および修飾活性、またはＴａｑＩ制限
   および修飾活性のいずれかを付与する、第４項に記載の
   方法、６、１ｌｈａ、　ＩＩ制限および修飾活性をイ・
   ｔ−’ｙスるｌ）　Ｎ　Ａセグメントが、グラスミド９
   １月１０の〜２，７ｋｂＰｅｔ　、ｌ制限フラグメント
   である、第５項に写載の方法。 Ａ遺伝子要求１ｑｐＭ、１月レプリコン、。１ｔＫ２レ
   プリコン、ＩＬＫ（３レプリコン、　　ｐＳＣ１０ル）
   ′リコン、１目層レプリコン、Ｉｔ、　Ｐ　４レプリコ
   ン、Ｉｔ゛しブリコノ、または？；、　ｃｏｌｊ、　Ｋ
   　１２中で複製を行なうノ（クテリオファージ由来のレ
   プリコン、のいずれかである、第１頃、第５頃−または
   第６項のｖ）１４れかＵ′こ記載の方法。 ８レプリコンがｐＯＩＡ　遺伝子要求性ｐＭｔｓルフ。 リコンである第７頃に記載の方法。 ９該組換えＩ）　Ｎ　Ａクローニングベクターが、ヒト
   のプレーグロインシュリン、ヒトのプロインシュリン、
   ヒトインシュリンＡ鎖、ヒトインシュリンＢ鎖、ヒト成
   長ホルモン、ヒト以外の成長ホルモン、牛成長ホルモン
   、ヒイ以列のインシュリン、ヒトインターフェロン、ヒ
   ト以外のインターフェロン、ウィルス抗原、ウロキナー
   ゼ、抗生物質針ＶＬ１・ｊｌう、酵素、“あらゆるペプ
   チドホルモン、またはあらゆるペプチド酵素、のいずれ
   かを発現する直伝子である、第７項筺たは第８項に記載
   の方法。 １０プラスミドが、グラスミドｐ　ｌ’　Ｉｔ・２６、
   ｐＩ’ｌ＋・２７・１）ＰＩＬ２８、ｐＩ’１ｔ２９、
   またはｐ　Ｐ　１（，１２し８のいずれかである、第４
   項〜第９項のいずれかに記載の方法。 Ｌｌ、該ハク−ｙ−ＩＪ　アカ、Ｅ、　Ｃ０１ｊ　Ｋ　
   １２　ｚ）　ｎ、ｖ　３０　Ｂ、２９４、Ｃ６００、Ｃ
   ６００ＲｆｆＭ、ｈ、ｌｌＢ１旧、捷たは旧シ８２７、
   のいずれかの菌株である、第１Ｏ項に記載の方法。 １２第１項〜第６項のいずれかに定義した組換えＤＮＡ
   クローニングベクター。 ■３ノ”ラスミドｐＰＩｔ２５、ｐＰｌｔ２７１，１）
   几２８、ｐＰ几２９、　またはｐＰＲ１２２８のいずれ
   かである、第１２項に記載のベクター。 １４、　Ｔａｑ　ｌ制限および修飾活性を付与するＩ）
   　Ｎ　Ａセグメント。 １５、第１項〜第６項のいずれかに定義１．た組換え１
   ）　Ｎ　Ａクローニングベクターを含有する形質転換バ
   クテリア。 Ａｐ；ｒｏｂａｃ　ｔｅｒｉｕｒ＋＋のいずれかである
   、第１５項に記載のバクテリア。 １７グラスミドｐＰＲ２７、ｐｉ’ｔｔ２ＢまたにｐＰ
   ＩＬ２９のいずれかによって形質転換されたＥ、ｃｏｌ
   、ｉ　Ｋ　１２の１ＬＶ３０８菌株、グラスミドｐｐｉ
   ｔ２７、ｌ）　Ｐ　１．（・２８またはｐ　Ｉ’　ＩＣ
   ２９のいずれかによって形質転換された１ツ。 Ｃ’ｌｉ　ｒ＜　ｌ　２の２９４菌株、グラスミドｐｉ
   ’ａ２７によって形質転換されたＥ、　ｃｏｌｉ、Ｋ１
   ２ｃ７）Ｃ６００菌株、グラスミドｐＰ１１・２８によ
   って形質転換され′ｋＥ。 ｃｏｌｊ、　Ｋ　１２　ノＣ６００Ｒｋ−Ｍ　ｋ菌株、
   プラスミ）”ｐ”’２　ｇ　ｖｃよって形′η転換され
   た１つ０ｃｍ］−ｉ　Ｋ１２のＪ、Ｉ　Ｂ１０１菌株、
   　もしくはプラスミドｐ、［’１Ｌ２Ｂによって形質転
   換されたＩＣ０ｃｏｎ　Ｋ　１２のＪ３Ｅ８２７菌株、
   のいずれかである、第１５項または第１６項に記載のバ
   クテリア。 １８プラスミドｐＪ、）　Ｉ　Ｉ　Ｑの〜２．７　ｋｂ
   　、Ｐｓｔ　Ｉ　制限フラグメントをプラスミドｐｌＡ
   ７へ４へｌのＩ’ｓｉ；■消化物にリゲーションするこ
   とからなる、グラスミドＩ）　ｌ’　Ｒ２６またはプラ
   スミドｐｌ’１Ｌ２７の調製方法。 １９、プラスミドｐＩＪ１１Ｏの〜２．７　ｋｂ、１）
   ｓｔｌ制限フラグメントをグラスミドｐ　１．　Ｂ　７
   △４１＼１のＰｓｔ、　１消化物にリゲーションするこ
   とからなる、プラスミドｐｐ　ＩＣ２Ｂ’　４たはプラ
   スミドｐＰ　Ｈ，１２２８の調製方法。 ２０プラスミドｐＩ’１ｔ２７の〜６．２　ｋ　ｌ）　
   Ａｖａ　Ｉ　−Ｂｇｉ　ＩＩフラグメントとフ゛ラスミ
   ドｐＨ１７へ４△ｌの〜２３　ｋｂ　Ａｖａ　Ｉ　−Ｂ
   ｇ１１フラグメントをリゲーションすることからなる、
   プラスミドｐＩ’　１．Ｃ２９の調製方法・