FI86993C - Foerfarande foer skyddande av en bakterie mot en i naturen foerekommande bakteriofag - Google Patents

Description

1 86993

Menetelmä bakteerin suojaamiseksi luonnossa esiintyvää bakteriofaagia vastaan

Kyseessä oleva keksintö koskee menetelmää E. coll 5 K12-isäntäsolun suojaamiseksi, joka sisältää plasmidin, joka pystyy ekspressoimaan ihmisen proinsuliinin tai ihmisen insuliinin yhden A-ketjun tai B-ketjun, bakteriofaagi-infektiota vastaan, joka bakteriofaagi elää vapaasti ympäristössä ja sisältää kaksisäikeistä DNA:ta, jolla on Hhall 10 restriktio- ja modifikaatioaktiivisuutta.

Kyseessä oleva keksintö on erityisen tärkeä, koska se ratkaisee yhdistelmä-DNA:ta sisältävien bakteeriviljel-mien laajan faagi-infektion ongelman. Tämä on edullista, koska kun kerran haluttua tuotetta koodaava yhdistelmä-15 DNA transformoidaan isäntäsoluun, on toivottavaa, ellei välttämätöntä, että isäntäsolu suojataan bakteriofaagi-infektiota vastaan. Sellainen suojaus on ratkaiseva, koska transformantti-viljelmät ovat tiettävästi herkkiä bakte-riofaagille, joka infektoidessaan hajoittaa kokonaisia 20 populaatioita. Koska tuotteen geneettinen ekspressio riip puu siitä, että isäntäsolut jäävät eloon riittävän pitkäksi aikaa, jotta toivottu biosynteesi tapahtuu, infektoitu-jen viljelmien tuotantokyky vähenee.

Mikro-organismien faagi-infektio on tunnettu ilmiö. 25 Tavallisesti virus tai bakteriofaagi bakteeri-infektion tapauksessa suorittaa kontaktin, adsorpoituu ja reagoi isännän solumembraanin kanssa. Adsorptio tekee mahdolliseksi faagi-kromosomin tai geneettisen materiaalin menemisen isäntäsolun sisälle sekä tapahtumasarjan alun, jos-30 sa isännän solukoneisto valloitetaan ja käytetään yksinomaan uuden faagin valmistamiseen. Isäntäsolu täyttyy kypsillä faageilla, ja sitten tapahtuu hajoaminen, tavallisesti noin 30 minuutissa infektion alkuhetkestä. Uudet faagit ovat infektoivia, ja sykli toistuu siihen asti, 35 kunnes kaikki saatavissa olevat isäntäsolut on tuhottu.

2 86993 Tähän mennessä yhdistelmä-DNA-tekniikan hyväksi käyttöä E. colilla suoritetussa suuren mittakaavan käymisessä on estänyt edellä mainittu faagi-infektio-ongelma. Oikeastaan infektioon liittyvä vaih+dleva bakteriofaagi-5 floora on päätekijä, joka estää haluttujen tuotteiden biosynteesin ja sekaantuu siihen. Tämä ongelma tulee voimakkaammaksi suuren mittakaavan käymisen aikana, ja tuloksena voi olla kallisarvoinen ja äkillinen E. colia transfor-manttipopulaatioiden menetys.

10 Kyseessä oleva keksintö ratkaisee bakteriofaagion- gelman antamalla käyttöön huokeita ja tehokkaita keinoja bakteeritransformanttien suojaamiseksi luonnossa esiintyvää bakteriofaagia vastaan. Tämä tapahtuu siten, että annetaan käyttöön isäntäsoluja, joissa on restriktiojärjes-15 telmä, joka pilkkoo Hhall-kohdan sisältävän vieraan DNA:n. Hhall-kohta on useimmissa luonnossa esiintyvissä viruksissa, joten sen tähden kyseessä oleva keksintö on tehokas kiusallisten bakteriofaagien laajaa joukkoa kohtaan. Täten, kun faagi-DNA menee isäntäsoluun kyseessä olevan kek-20 sinnön tapauksessa, Hhall-restriktioendonukleaasi pilkkoo DNA:n Hhall-kohdalta ja tekee faagin toimintakyvyttömäksi ja vaarattomaksi. Tällä tavalla bakteereiden isäntäsoluja suojataan luonnossa esiintyviä bakteriofaageja vastaan, mikä varmistaa viljelmän tuotantokyvyn. Tämä ei ole ai-25 noastaan edullista, vaan se edustaa myös tekniikan alan edistysaskelta.

Hyvin harvoja, jos mitään, muita menetelmiä on kuvattu ratkaisemaan bakteriofaagi-ongelmaa, joka liittyy E. colilla ja muilla bakteereilla suuressa mittakaavassa suo-30 ritettavaan käymiseen. Oikeastaan bakteeri-infektion tie detään tapahtuvan vieläpä mitä erinomaisimmin aseptisissa olosuhteissa ja, kun se on kerran läsnä, bakteriofaageja on tunnetusti vaikea poistaa. Vaikka sellainen eliminointi on mahdollista, se on erittäin hankalaa ja kallista ajan 35 ja tuotantotappion vuoksi.

3 86993

Kyseessä olevan keksinnön yhteydessä käytettäväksi määritellään alempana seuraavat termit.

Toiminnallinen polypeptidi - talteen otettava, bioaktiivinen, täysin heterologinen polypeptidi tai prekurso-5 ri, talteen otettava bioaktiivinen polypeptidi, joka käsittää heterologisen polypeptidin ja osan homologista po-lypeptidiä, talteen otettava bioinaktiivinen fuusiopoly-peptidi, joka käsittää heterologisen polypeptidin sekä bio-inaktiivisen homologisen polypeptidin, joka voidaan 10 pilkkoa spesifisesti, tai polypeptidi, jolla on entsymaattista toimintaa.

Yhdistetty geenituote - talteen otettava, heterologinen polypeptidi, joka on liitetty kokonaisen homologisen polypeptidin tai sen osan kanssa.

15 Markkeri - geeni tai yhdistelmä geenejä, joilla on tunnettu toiminta tai sijainti kromosomilla tai yhdistel-mä-DNA:ta kloonaava vektori.

Transformantti - vastaanottava isäntäsolu, jossa on tapahtunut transformaatio.

20 Herkkä bakteeri - bakteeri, joka infektoituu, kun se kasvaa faagin läsnäollessa.

Restriktiofragmentti - mikä tahansa lineaarinen osa tai kokonainen plasmidi, muu vektori tai kromosomaalinen DNA, jota on valmistettu yhden tai useamman restriktioent-25 syymin avulla.

Insertionaalinen isomeeri - yksi kahdesta tai useammasta mahdollisesta yhdistelmä-DNA-molekyylistä, jotka ovat muodostuneet, kun DNA-fragmentti insertoidaan yhteen kohtaan kahdesta tai useammasta yhteen sopivasta koh-30 dasta, jotka sijaitsevat vastaanottaja-DNA:11a.

R-M-järjestelmä - restriktio - ja muunnosjärjestelmä.

AmpR - ampisilliinille resistentti fenotyyppi.

Amp* - ampisilliinille herkkä fenotyyppi.

35 TetR - tetrasykliinille resistentti fenotyyppi.

Tets - tetrasykliinille herkkä fenotyyppi.

4 86993

Kyseessä oleva keksintö koskee erityisesti menetelmää bakteerin suojaamiseksi luonnossa esiintyvää bakterio-faagia vastaan. Menetelmälle on tunnusomaista, että isän-täsolutransformoidaan 5 a) A-ketjua ekspressoivalla plasmidilla, joka on valmistettu kloonaamalla plasmidin pDIlO, jolla on kuvassa 2 esitetty restriktiokartta, noin 2,7 kb:n PstI-fragmentti plasmidiin ρΙΑ7Δ4Δΐ, jolla on kuvassa 1 esitetty restriktiokartta; tai 10 b) B-ketjua ekspressoivalla plasmidilla, joka on valmistettu kloonaamalla plasmidin pDIlO, jolla on kuvassa 4 esitetty restriktiokartta, noin 2,7 kb:n PstI-fragmentti plasmidiin ρΙΒ7Δ4Δΐ, jolla on kuvassa 3 esitetty restriktiokartta; tai 15 c) proinsuliinia ekspressoivalla plasmidilla, joka on valmistettu liittämällä yhteen plasmidin pPR27, jolla on kuvassa 2 esitetty restriktiokartta, noin 6,2 kb:n Ava- I-BglII restriktiofragmentti ja plasmidin ρΗΙ7Δ4Δΐ, jolla on kuvassa 5 esitetty restriktiokartta, noin 2,3 kb:n Ava-20 I-BglII-restriktiofragmentti; sillä rajoituksella, että modifikaatioaktiivisuus ekspressoituu isäntäsolussa ennen restriktioaktiivisuutta.

Haemophilus haemolyticuksen Hhall restriktiomodifi-kaatio-järjestelmää käytetään valaisemaan kyseessä olevaa 25 keksintöä. Geenit, jotka käsittävät Hhall R-M-järjestelmän, ovat läheisesti liittyneet yhteen ja johtavat Hhall restriktio-endonukleaasin sekä myös läheisen metylaasient-syymin synteesiin. Hhall-restriktio-entsyymi tunnistaa ja

pilkkoo kaksisäikeisen DNA:n, jossa on sekvenssi 30 GANTC

CTNÄG' alemPana Hhall-kohta, kun taas yhteenkuuluva modifikaatio-järjestelmä metyloi nukleotidit, jotka käsittävät edellä mainitun sekvenssin. Aiheeseen perehtyneet ymmärtävät, että metylaasi-entsyymi-modifikaatiojärjestelmä täytyy ekspressoida, ennenkuin Hhall-restriktio-entsyymi on 35 biosyntetisoitu. Seokset, jotka sisältävät Hhall R-M-jär- 5 86993 jestelmän, suojataan täten HhaII:lla tapahtuvaa hajottamista vastaan, mutta hajoaminen tapahtuu vieraassa ei-mo-difioidussa, kaksisäikeisessä DNA:ssa, joka sisältää Khali I -kohdan. Sen tähden Hhall R-M järjestelmä on ihanteelli-5 nen kyseessä olevan keksinnön valaisemistarkoituksiin.

Lähemmin esimerkkinä kyseessä olevasta on plasmi-din pDUO noin 2,7 kb:n Pstl-restriktiofragmentin kloonaus insuliinin A-ketjun plasmidiin ρΙΑ7Δ4Δΐ. Plasmidi ΡΙΑ7Δ4Δ1 sisältää E. coli tryptofaanipromoottorin, anti-10 bioottiresistenssimarkkereita sekä geenin, joka ekspressoi yhdistetyn geenin tuotetta, joka käsittää E. coli K12 trp E-proteiinin, joka on yhdistetty ihmisen insuliin A-poly-peptidi-ketjun kanssa. Restriktiokohta sekä plasmidin ΡΙΑ7Δ4Δ1 toiminnallinen kartta esitetään liitteenä ole-15 vien piirrosten kuvassa 1.

Plasmidi pDI10:n ~2,7kb Pstl-fragmentti sisältää geenit restriktiota ja modifikaatiota varten yhdessä Hhall :n spesifisyyden kanssa. Plasmidi pDUO voidaan eristää E. coli K12 294/pDI10:sta, kannasta, joka on tallennettu 20 ja sisällytetty pysyvään kantakokoelmaan, Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois. Se on yleisön saatavilla plasmidi pD110:n edullisena lähteenä ja kanta-varastona talletusnumerolla B-15097.

Mitä tulee yleisiin merkitsemistapoihin, symboli 25 "Δ" merkitsee poistoa. Täten esimerkiksi viittaus plasmi diin, jota seuraa ’^EcoRI-Xbal", kuvaa plasmidia, josta nukleodidisekvenssi EcoRI ja Xbal- restriktio-entsyymi-kohtien väliltä on poistettu hajoittamalla noilla entsyymeillä. Mukavuussyistä tiettyjä poistoja merkitään nume-30 rolla. Täten aloitus parenteraalisessa plasmidissa pBR322 tetrasykliiniresistenssiä vastaavaa geeniä edeltävän EcoRI -tunnistuskohdan ensimmäisestä emäsparista ("bp"), "Δ1" merkitsee bp 1 - 30:n poistoa (se on, AEcoRIHind III) ja sen seurauksena tetrasykliini-promoottori/operaattori-jär-35 jestelmä estyy; "Δ2" merkitsee bp 1 - 375:n (se on ΔΕσοΚΙ- 6 8 6 S S 3

BamHI) poistoa ja sen seuraksena sekä tetrasykliini-promoottori /operaattorin että tetrasykliiniresistenssiä koo-daavaa rakennegeenin osan poistoa; ja "δ4" merkitsee bp ~900 - “1500:n poistoa trp operonifragmentista eliminoi-5 maila trp D polypeptidiä vastaava rakennegeeni.

Plasmidin pDI10:n, “2,7kb PstI Hhall R-M-geenin sisältävän restriktiofragmentin kloonaus plasmidi pIA7A4Al:lla saa aikaan uudet plasmidit pPR26 ja pPR27. Molemmat plasmidit suojaavat bakteereita, kuten esimerkik-10 si eri E. colin kantoja luonnossa esiintyvän bakteriofaa-gin aiheuttamaa infektiota vastaan. Kunkin plasmidin pPR26 ja pPR27 restriktiokohdan kartta esitetään liitteenä olevien piirrosten kuvassa 2.

Uudet plasmidit pPR28 ja pPR1228 voidaan myös 15 konstruoida kyseessä olevan keksinnön lisäesimerkeiksi. Plasmidit pPR28 ja pPR1228 muodostuvat, kun plasmidin pDUO “2,7kb PstI Hhall R-M-geenin sisältävä restriktio-fragmentti insertoidaan plasmidiin ρΙΒ7Δ4Δΐ. Plasmidi ΡΙΒ7Δ4Δ1 sisältää E. colin tryptofaani-promoottorin, an-20 tibioottiresistanssimarkkereita sekä geenin, joka ekspres-soi yhteenliitetyn geenin tuotteen, joka käsittää E. coli K12 trp E proteiinin; joka on liitetty ihmisen insuliinin B-polypeptidi-ketjun kanssa. Plasmidit pPR28 ja pPR 1228 myös suojaavat bakteereita, kuten esimerkiksi erilaisia E. 25 colin kantoja, luonnossa esiintyvää bakteriofaagia vastaan. Plasmidin ρΙΒ7Δ4Δΐ toiminnallinen kartta ja restrik-tiokohta sekä kumpikin plasmideista pPR28 ja pPR1228 esitetään vastaavasti liitteenä olevien piirrosten kuvissa 3 ja 4.

: 30 Plasmidin pPR27, “6,2kb Aval-Bglll Hhall R-M-gee- nin sisältävän restriktiofragmentin ja plasmidin ΡΗΙ7Δ1Δ4 “2,3kb Ava I-BglII restriktiogragmentin yhteenliittämisen tuloksena syntyy uusi plasmidi pPR29. Plasmidi ρΗΙ7Δ4Δΐ sisältää E. colin tryptofaani-promoottorin, an-‘ : 35 tibioottiresistenssimarkkereita sekä geenin, joka ekspres- 7 86993 soi yhdistetyn geenin tuotteen, joka käsittää osan E. coli K12 trp E-proteiinia ihmisen proinsuliinipolypeptidiin liittyneenä. Plasmidi pPR29 antaa restriktio- ja modifi-kaatioaktiivisuuden ja suojaa täten bakteereita, kuten 5 esimerkiksi erilaisia E. colin kantoja, luonnossa esiintyvän bakteriofaagin aiheuttamaa infektiota vastaan. Kummankin plasmidin ρΗΙ7Δ4Δΐ ja pPR29 restriktiokohta ja toiminnallinen kartta esitetään vastaavasti liitteenä olevien piirrosten kuvissa 5 ja 6.

10 E. colia koskeva geneettinen ja biokemiallinen in formaatio tekee sen sopivaksi ja edulliseksi isännäksi kyseessä olevan keksinnön mukaisiin tarkoituksiin. Ennen kaikkea, koska E. coli K12 on yhdistelmä-DNA-tekniikalla yhdisteiden biologiseen valmistukseen valittu isäntäsolu, 15 kyseessä olevan keksinnön käyttökelpoisuus tuon organismin kannoille on selvästi edullista. Kuten edellä on esitetty, E. colin avulla suoritettava suuren mittakaavan käyminen on erittäin vaikeaa siihen liittyvän faagi-infek-tion vuoksi. Kyseessä oleva keksintö ratkaisee olellisesti 20 tämän ongelman, ja se tekee täten mahdolliseksi biosyn-teettisten tuotteiden kaupallisen valmistuksen.

Kyseessä olevaa keksintöä voidaan soveltaa esim. kantoihin E. coli K12, E. coli K12 294 (julkaistu kirjoituksessa Goeddel et ai., 1979, Proc. Nat. Acad. Sei. USA - 25 76:106), E. coli K12 RV 308 (julkaistu kirjoituksessa

Mauer et ai., 1980, J. Mol. Biol. 139:147), E. coli K12 C600 (julkaistu kirjoituksessa Backman, 1972, Bacteriol. Rev. 36:526), E. coli K12 600Rk-Mk-( julkaistu kirjoituksessa Chang ja Cohen, 1974, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 30 71:1030), E, coli K12 HB101 (Boliver et ai., 1977, Gene 2:75), E. coli K12 BE827 ATCC 31911).

Kyseessä olevan keksinnön mukaisiin edullisiin kloonausvektoreihin kuuluvat plasmidit pPR27, pPR28 sekä pPR29 ja edullisiin transformantteihin kuuluvat E. coli 35 K12 RV 308/pPR27, E. coli K12 RV308/pPR29. Näillä ja kai- 8 86993 kiila muilla kyseessä olevan keksinnön suoritusmuodoilla on yhteisenä piirteenä suojata bakteereita luonnossa esiintyvän bakteriofaagin aiheuttamaa infektiota vastaan. Sen tähden, kyseessä oleva keksintö tekee mahdolliseksi 5 yhdistelmä-DNA:n sisältävien mikro-organismien käymisen suuressa mittakaavassa ilman faagi-infektion, solujen hajoamisen ja biosynteettisen kapasiteetin samanaikaisen menetyksen huomattavaa vaaraa.

Seuraavat esimerkit valaisevat kyseessä olevaa kek-10 sintöä yksityiskohtaisemmin. Kuvataan myös varsinaisia menettelytapoja keksinnön konstruoimiseksi, mikäli se on tarkoituksenmukaista.

Esimerkki 1

Plasmidi pDH0:n eristys ja valmistaminen 15 Noin 1 pg plasmidi-pDI10-DNA:ta (eristetty E. coli K12 294/pDI10, NRRL B-15097:stä suurin piirtein Bazaralin ja Helinskin eristysmenetelmän mukaisesti, 1968, J. Mol. Biol. 36:185) liuotettiin TE-puskuriin [1 mM Tris-HCl, pH 7,8] noin 20 pg/ml:n konsentraatioon. Koska E. coli K12 20 294 on Rk*Mk*-isäntä, plasmidi-DNA voidaan eristää EcoK- spesifisyyden mukaisen metylaation avulla. Noin 5 μΐ liuosta (sisältäen noin 0,1 pg DNA:ta) laimennettiin 50 pl:ksi SSC/10:ssä (SSC = standardi keittosuolaliuossit-raattipuskuri ja SSC/10 sisältää noin 15 mM NaCl:a ja 1,5 25 mM Na3-sitraattia, pH 7). Noin 25 μΐ SSC/10-DNA-liuosta sekoitettiin sitten 50 μ1:η kanssa E. coli K12 C600Rk'Mk':n riittävää suspensiota.

Sopiva E. coli K12 C600Rk‘Mk‘:n (Chang ja Cohen, 1974, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 71:1030) suspensio val- 30 mistettiin tavanomaisin, hyvin tunnetuin menetelmin. Sen mukaisesti tuoreita yliyön ikäisiä viljelmiä, jotka olivat L-liemessä (Miller, 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) esikasvatettiin 1/10 tuoreessa L-liemessä ja 35 kasvatettiin 37 °C:ssa 1 tunnin ajan. Koottiin kaikkiaan 9 86993 660 Klett-yksikköä soluja, pestiin 2,5 ml:11a 100 mM Na-Cl:a, suspendoitiin 2,5 ml:aan 150 mM CaCl2:a ja inkuboi-tiin huoneenlämpötilassa 20 minuutin ajan. Solut koottiin, lietettiin uudelleen 0,5 ml:aan liuosta, joka käsitti 150 5 mM CaCl2:a ja 10 % glyserolia, jäähdytettiin jäiden päällä 3-5 minuuttia, ja sitten ne jäädytettiin. Riittävästi jäähdytettyjen solujen suspensiot varastoitiin nestemäiseen typpeen käyttöön saakka. Varastointi ja säilytys ei vaikuttanut haitallisesti elinkykyisyyteen eikä kovalent-10 tisesti sidotulla, rengasmaisella plasmidi-DNA:11a suoritettavan transformaation frekvenssiin. Solususpensio sulatettiin jäähauteessa ja sekoitettiin 1/2 tilavuuden kanssa DNA:ta transformaatiota varten. Transformaatioseosta jäähdytettiin jäiden päällä 20 minuutin ajan, kuumakäsi-15 teltiin 42 °C:ssa 1 minuutin ajan, jäähdytettiin jäiden päällä 10 minuutin ajan ja laimennettiin sitten 5,7 tilavuudella L-lientä ja lopuksi inkuboitiin 37 eC:ssa 90 minuutin ajan.

Transformantit eristettiin kasvattamalla L-agaril-20 la, joka sisälsi tetrasykliiniä 12,5 pg/ml. Eristetyt transformantit testattiin tetrasykliiniresistanssin ja ampisilliiniherkkyyden varmistamiseksi ja muodostettiin haluttu E. coli K12 C600Rk"Mk‘/pDI10-transformantteja. Sopivia pesäkkeitä käytettiin kovalenttisesti suljetun rengas-25 maisen DNA:n eristämiseen Bazaralin ja Helinskin 1968 kuvaamalla tavalla. Plasmidin rakenne varmistettiin kartoittamalla restriktiokohdat.

Esimerkki 2

Plasmidi ρΙΆ7Δ:4Δΐ:n konstruktio 30 A. Plasmidi pBRHtrp:n konstruktio

Plasmidi pGMl sisältää E. colin tryptofaani-opero-nin, jossa on deleetio ΔΙ.Ε1413 (Miozzari, et ai., 1978, J. Bacteriology, 1457-1466), ja sen tähden se ekspressoi fuu-sioproteiinia, joka käsittää trp-ohjaajan 6 ensimmäistä 35 aminohappoa ja arviolta kaksi kolmasosaa trp E-polypepti- 10 86993 distä (tässä yhteydessä myöhemmin merkitty konjunktiossa LE’:na) sekä trp D-polypeptidin kokonaisuudessaan, kaikki ovat trp-promoottori-operaattori-järjestelmän säätelyn alaisia. E. coli K12 W3110tna2trpAl02/pGMl on tallennettu 5 American Type Culture Collectioniin (ATCC nro 31622), ja pGMl saattaa olla kannasta tavanomaisesti poistettu alla kuvatuissa menetelmissä suoritettavaa käyttöä varten.

Noin 20 pg plasmidia uutettiin restriktioentsyy-millä PvuII, joka pilkkoo plasmidin viidestä kohdasta. 10 Seuraavaksi geenifragmentit yhdistettiin EcoRI-kytkijöiden avulla (käsittäen itse täydentävän oligonukleotidin, jonka sekvenssi on: pCATGAATTCATG) antaen käyttöön EcoRI-kohdan sisältävään plasmidiin tapahtuvaa myöhempää kloonausta varten. 20 pg DNA-fragmentteja, jotka oli saatu 15 pGMlrstä, käsiteltiin 10 yksiköllä T4 DNA-ligaasia 200 pi-komoolin läsnäollessa 5'-fosforyloitua synteettistä oli-gonukleotidiä pCATGAATTCATG sekä 20 pl:ssa T4 DNA-ligaasi-puskuria (20 mM tris, pH 7,6, 0,5 mM ATP, 10 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitolia) 4 °C:ssa, yli yön. Sitten liuosta kuu-20 mennettiin 10 minuutin ajan 70 eC:ssa sidonnan pysäyttämiseksi. Kytkijät pilkottiin EcoRI-uuton avulla ja fragmentit, joissa nyt oli EcoRI-päät, erotettiin käyttämällä 5-prosenttista polyakryyliamidigeelielektroforeesia (tässä yhteydessä myöhemmin merkitty "PAGE":ksi). Kolme suurinta 25 fragmenttia erotettiin geelistä värjäämällä ensin etidium-bromidilla ja paikallistamalla sitten fragmentit ultraviolettivalon avulla ja leikkaamalla sitten geelistä kiinnostavat osat. Kukin geelifragmentti, 300 pl:n kanssa 0,lx TBE:a, pantiin dialyysipussiin ja elektroforeesiin, jossa 30 niihin kohdistettiin 100 voltin jännite yhden tunnin ajan 0,lxTBE-puskurissa (TBE-puskuri sisältää: 10,8 g tris- emästä, 5,5 g boorihappoa, 0,09 g Na2EDTA:a 1 litrassa H20:a). Vesiliuos koottiin dialyysipussista, uutettiin fenolilla, uutettiin kloroformilla ja tehtiin 0,2 M:ksi nat-35 riumkloridin suhteen. DNA saatiin sitten takaisin vedessä 11 86993 etanolisaostuksen jälkeen. Trp promoottori/operaattorin sisältävä geeni, jossa oli EcoRI tahmeat päät, identifioitiin seuraavassa kuvatulla menetelmällä, joka vaatii fragmenttiin insertion tetrasykliinille herkkään plasmidiin, 5 josta promoottori/operaattori-insertion avulla tulee tetrasykliinille resistentti. Kaikki tämän jälkeen kuvatut DNA-fragmentti-eristykset suoritetaan PAGE:a käyttäen, jonka jälkeen seuraa edellä kuvattu elektroeluutiomenetel-mä.

10 B. Trp promoottori/operaattorin säätelyn alaisena tetrasykliiniresistenssiä ekspressoivan plasmidi pBRHtrp:n konstruktio sekä Trp promoottori/operaattorin sisältävän DNA-fragmentin, joka on eristetty edellä kohdassa A kuvatulla tavalla, identifiointi ja amplifikaatio 15 Plasmidi pBRHl (Rodriquez, et.ai., 1979, Nucleic

Acids Research 6, 3267-3287) ekspressoi ampisilliiniresis-tenssiä ja sisältää tetrasykliiniresistenssin geenin, mutta jos se ei ole liittynyt promoottorin kanssa, plasmidi ei ekspressoi resistenssiä. Plasmidi on sen mukaisesti 20 tetrasykliinille herkkä. Jos EcoRI-kohtaan viedään pro-moottori/operaattorijärjestelmä, plasmidi voidaan siten tehdä tetrasykliinille resistentiksi.

Plasmidi pBRHl:a uutettiin EcoRI:llä. Entsyymi poistettiin fenoliuuton avulla, jonka jälkeen uutettiin • 25 kloroformilla, ja DNA saatiin takaisin vedessä etanolilla suoritetun saostuksen jälkeen. Syntyvä DNa-molekyyli yhdistettiin, erillisessä reaktioseoksessa, kunkin kolmen DNA-fragmentin kanssa, jotka oli saatu yllä, esimerkissä 2A, ja kytkettiin T4 DNA-ligaasilla kuten edellä on kuvat-30 tu. Reaktioseoksessa oleva DNA käytettiin transformoimaan kykenevä E. coli K12 294 standardi menetelmin (Hershfield et ai., 1974, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 71:3455-3459), ja bakteerit siveltiin sitten LB-levyille (Miller, 1972), jotka sisälsivät ampisilliinia 20 pg/ml ja tetrasykliiniä 35 5 pg/ml.

12 86993

Valittiin useita tetrasykliinille resistenttejä pesäkkeitä, ja plasmidi-DNA eristettiin ja merkittiin pBRHtrprksi. Toivotun fragmentin läsnäolo varmistettiin restriktioentsyymi-analyysin avulla. Plasmidi pBRH trp 5 ekspressoi β-laktamaasia, suoden ampisilliiniresistens-sin, ja sisältää DNA-fragmentin, johon sisältyy trp pro-moottori/operaattori. DNA-fragmentti koodaa myös ensimmäisen proteiinin (merkitty LE':ksi), joka käsittää trp-oh-jaajän ensimmäiset kuusi aminohappoa ja lähes viimeisen 10 kolmanneksen trp E-polypeptidistä, toisen proteiinin (merkitty D':ksi), joka vastaa trp D polypeptidin lähes ensimmäistä puolikasta, sekä kolmannen proteiinin, jonka tetrasykliinille resistenttigeeni koodaa.

C. Plasimidi pS0M7A2:n konstruktio 15 Plasmidia pBRHtrp uutettiin EcoRI-restriktioent- syymillä ja syntyvä fragmentti, joka oli eristetty PAGE:n ja elektroeluution avulla, yhdistettiin EcoRI:llä uutetun plasmidin pSOMll kanssa (Itakura et ai., 1977, Sei. 198: 1056, Ison Britannian patenttijulkaisu nro 2 007 676A) . 20 Seos kytkettiin T4 DNA-ligaasin avulla, ja muodostuva DNA transformoitiin E. coli K12 294:ään aiemmin kuvatulla tavalla. Transformanttibakteerit valittiin ampisilliinia sisältävillä levyillä, ja syntyvät ampisilliinille resistentit pesäkkeet seulottiin pesäkehybridisaation avulla 25 (Gruenstein et ai., 1975, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 72: 3951-1965). Trp promoottori/operaattorin sisältävää fragmenttia, joka oli eristetty pBRH trp:stä ja sitten leimattu radioaktiivisesti p32:lla, käytettiin koettimena yllä esitetyssä menetelmässä. Useiden pesäkkeiden osoitettiin 30 olevan positiivisia pesäkehybridisaation suhteen, ja siitä syystä ne valittiin. Plasmidi-DNA eristettiin ja määritet-. . tiin kiinnitettyjen fragmenttien orientaatio restriktio- analyysin perusteella käyttämällä entsyymejä Bglll ja Bam-HI kaksoisuutossa. Pesäkkeet, jotka sisälsivät halutun 35 plasmidin promoottori/operaattori-fragmentin kanssa sopi- i3 86993 vasti suuntautuneena, kasvatettiin LB-elastusaineessa (Miller, 1972), joka sisälsi ampilisilliiniä 10 pg/ml. Haluttu plasmidi merkittiin pS0M7A2:ksi, ja sitä käytettiin alla kuvattuihin, myöhempiin konstruktioihin.

5 D. Plasmidin pTrp24:n konstruktio 1. Geenifragmentin konstruktio, joka käsittää LE'-polypep-tidin distaalisten alueiden kodonit ja jossa on Bglll ja Eco Rl restriktiokohdat vastaavasti koodaavan säikeen 5'-ja 3'-päissä 10 Plasmidi pS0M7A2 uutettiin Hind Illrllä, jonka jälkeen uutettiin lambda-eksonukleaasilla (5' - 3'-eksonuk- leaasi) olosuhteissa, jotka oli valittu siten, että pilkkominen tapahtuu Bgllll-restriktio-kohdan toisella puolella LE'-koodaasalueen sisällä. Noin 20 pg Hind III:llä uu-15 tettua pSOM7A2:a liuotettiin puskurissa (20 mM glysiini-puskuria, pH 9,6, 1 mM MgCl2, 1 mM β-merkaptoetanolia). Syntyvää seosta käsiteltiin 5 yksiköllä lambdaeksonukleaa-sia, 60 minuutin ajan, huoneenlämpötilassa. Saatu reaktio-seos uutettiin sitten fenolilla, uutettiin kloroformilla 20 ja saostettiin etanolilla.

EcoRI-tähteen aikaansaamiseksi LE'-geenifragmentin distaaliseen päähän, syntetisoitiin 32pCCTGTGCATGAT käyttämällä parannettua fosfotriesteri-menetelmää (Crea et ai., 1978, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 75:5765) ja hyb-.25 ridisoitiin lambda-eksonukleaasiuutosta muodostuvan LE'- geenifragmentin yksisäikeiseen päähän. Hybridisaatio suoritettiin liuottamalla 20 pg lambda-eksonukleaasilla kä-siteltyä plasmidi pS0M7A2:n HindiII-uuttamistuotetta 20 pl:ssa H20 ja yhdistämällä 6 pl:n kanssa liuosta, joka si-30 sältää noin 80 pikomoolia 5'-fosforyloitua oligonukleoti-diä, jota on edellä kuvattu. Synteettinen fragmentti hyb-ridisoitiin LE'-koodaussekvenssin 3'-päähän ja jäljelle jäävä yksisäikeinen osa LE'-fragmentista täydennettiin Klenow-polymeraasi I:llä käyttäen dATPrä, dTTP:ä, dGTP:ä 35 sekä dCTP:ä. Klenow-polymeraasi I on DNA-polymeraasi I:n 14 86993 proteolyyttisellä pilkkomisella saatu fragmentti. Se sisältää 5'-*3' polymerointiaktiivisuutta, 3 T-*5T eksonukleo-lyyttistä aktiivisuutta, mutta siinä ei oleparentaalient-syymin 5 ’-*3' -eksonukleolyyttistä aktiivisuutta (Kornberg, 5 1974, W.H. Freeman ja Co., SFO, 98).

Reaktioseos kuumennettiin täten 50 °C:een, ja sen annettiin hitaasti jäähtyä 10 °C:een, jonka jälkeen lisättiin 4 μΐ Klenow-entsyymiä. Huoneenlämpötilassa suoritettiin 15 minuutin pituisen inkuboinnin jälkeen, jota seura-10 si 30 minuutin pituinen inkubointi 37 °C:ssa, reaktio pysäytettiin lisäämällä 5 μΐ 0,25 molaarista EDTAita. Reaktioseos uutettiin fenolilla, sitten kloroformilla ja seostettiin etanolilla. Sen jälkeen DNA pilkottiin restriktio-entsyymillä Bglll ja fragmentit erotettiin PAGE:11a. Gee-15 listä saatu autoradiogrammi toi ilmi 32P:llä leimatun fragmentin, jonka pituus oli odotettu, noin 470 bp, ja joka saatiin elektroeluution avulla. Kuten on esitetty, tällä fragmentilla LE'(d) on Bglll-pääte ja tylppä pää, joka soveltuu yhteen alukkeen alun kanssa.

20 2. Plasmidin pThglrn konstruktio

Plasmidi pThal konstruoitiin kiinnittämällä syntetisoitu tymosiini alfa l:n geeni plasmidi pBR 322:een. Tymosiini alfa l:tä koodaavan DNA:n synteesiin kuuluu 16 oligonukleotidin, jotka on esitetty kakspäisin nuolin 25 liitteenä olevien piirrosten kuvassa 7, synteesi ja sitä seuraava yhdistäminen (Tx T16:n välityksellä). Metioniinin kodoni ATG kiinnitettiin N-päähän, ja 5'-päät konstruoitiin yksisäikeisten, tarttuvien päiden avulla, jotta helpotetaan yhdistäminen plasmideihin, jotka on pilkottu Eco-30 RI:llä ja BamHl:llä. Kuten on täysin ymmärrettävissä, Bgl-II-kohta geenin keskellä auttaa yhdistelmäplasmidien analysointia.

Oligodesoksiribonukleotidit - T16 syntetisoitiin muunnetun fosforiesteri-menetelmän avulla käyttämällä täy-35 sin suojattuja tridesoksiribonukleotidi-rakenneyksiköitä 15 86993 (Itakura et ai., 1977, Science 198:1056, ja Crea et ai., 1978). Erilaiset oligodesoksiribonukleotidit on esitetty alla taulukossa 1.

Taulukko 1 5 Synteettiset oligonukleotidit tymosilni 1-geeniä varten HPLC-analyysi retentioaika

Yhdiste Sekvenssi Pituus min)* T: A-A-T-T-C-A-T-G-T-C 10 17,4 10 T2 T-G-A-T-G-C-T-G-C-T-G-T-T-G-A 15 24,3 T3 T-A-C-T-T-C-T-T-C-T-G-A 12 20,3 T4 G-A-T-T-A-C-T-A-C-T-A-A-A 13 22,0 T5 G-C-A-G-C-A-T-C-A-G-A-C-A-T-G 15 24,8 T6 G-A-A-G-T-A-T-C-A-A-C-A 12 20,1 15 T7 A-G-T-A-A-T-C-T-C-A-G-A-A 13 22,6 T8 A-A-G-A-T-C-T-T-T-A-G-T 12 20,2 T9 G-A-T-C-T-T-A-A-G-G-A-G 12 20,4 T10 A-A-G-A-A-G-G-A-A-G-T-T 12 21,1

Tu G-T-C-G-A-A-G-A-G-G-C-T 12 20,5 20 T12 G-A-G-A-A-C-T-A-A-T-A-G 12 20,4 T13 C-T-T-C-T-T-C-T-C-C-T-T 12 19,9 T14 T-T-C-G-A-C-A-A-C-T-T-C 12 20,5 T15 G-T-T-C-T-C-A-G-C-C-T-C 12 20,2 T16 G-A-T-C-C-T-A-T-T-A 10 17,2 25 * Ympäristön lämpötilassa

Esimerkkinä yllä esitetystä synteesistä on seuraava menetelmä fragmentin T15 valmistamiseksi, mikä on esitetty 30 yhteenvetona liitteenä olevien piirrosten kuvassa 8. T15:n synteesissä käytetyt erilaiset nukleotidifragmentit on kuvassa numeroitu. Käytetyt lyhennykset ovat seuraavat: TPSTe, 2,4,6-tri-isopropyylibentseenisulfonyylitetratso-li; BSA, bentseenisulfonihappo; TLC, ohutlevykromatogra-35 f ia; HPLC, suurpainenestekromatografia; DMT, 4,4'-dimetok- sitrityyli; CE, 2-syanoetyyli; R, pkloorifenyyli; Bz, i6 86993 bentsoyyli; An, anisoyyli; iBu, isobutryyli; Py, pyridii-ni; AcOH, etikkahappo; Et3N, trietyyliamiini.

Täysin suojatuista tridesoksiribonukleotideistä 4 (85 mg, 0,05 mmoolia) ja 2 (180 mg, 0,1 mmoolia) poistet-5 tiin 5'-hydroksyyleissä sijaitseva suojaus käsittelemällä niitä 2 %:lla BSArlla kloroformi/metanolissa 7:3 (tilav./ tilav.) (10 ja 20 ml vastaavasti) 10 minuutin ajan 0 °C-:ssa. Reaktiot pysäytettiin lisäämällä kyllästettyä ammo-niumbikarbonaatin vesiliuosta (2 ml), uutettiin klorofor-10 millä (25) ja pestiin vedellä (2 x 10 ml). Orgaaniset kerrokset kuivattiin (magnesiumsulfaatti), väkevöitiin pieniin tilavuuksiin (noin 5 ml) ja seostettiin lisäämällä petrolieetteriä (35 - 60 °C:n jae). Värittömät saostumat koottiin sentrifugoiden, ja ne kuivattiin eksikaattorissa 15 tyhjössä, jotta saatiin vastaavasti 6 ja 8, joista kumpikin oli homogeeninen piihappogeeli - tie:n perusteella (Merck 60 F254, kloroformi/metanoli, 9:1) .

Trimeerit 1 ja 3 (270 mg, 0,15 mmoolia; 145 mg, 0,075 mmoolia) muutettiin fosfodiestereikseen (5 ja 7) 20 käsittelemällä niitä trietyyliamiini/pyridiini/vesiseok-sella (1:3:1, tilav./tilav., 10 ml) 25 minuutin ajan ympäristön lämpötilassa. Reagenssit poistettiin pyöröhaihdut-tajalla, ja jäännökset kuivattiin haihduttamalla toiste-tusti vedettömän pyridiinin kanssa (3 x 10 ml). Trimeeri 25 8 (0,05 mmoolia) ja trimeeri 7 yhdistetiin TPSTe:n kanssa (50 mg, 0,15 mmoolia) vedettömässä pyridiinissä (3 ml) ja reaktioseos jätettiin tyhjöön, ympäristön lämpötilaan, kahdeksi tunniksi. TLC-analyysi osoitti 95 % trimeeri 8:sta muuttuneen heksameeri-tuotteeksi (tehty näkyväksi 30 paljastamalla DMT-ryhmä 10 %:lla rikkihapolla suoritetun ruiskutuksen ja 60 °C:ssa suoritetun kuumennuksen avulla. Reaktio tukahdutettiin lisäämällä vettä (1 ml), ja liuotin haihdutettiin alennetussa paineessa. Sen jälkeen, kun py-ridiini oli poistettu haihduttamalla rinnakkain tolueenin 35 kanssa, poistettiin suojaavat ryhmät heksameerin 5’-ase- i7 86 99 ‘5 masta 2 %:lla BSA:lla (8 ml) kuten edellä on kuvattu tri-meerlen 4 ja 2 suhteen. Tuote (10) puhdistettiin piihap-pogeelipylväässä (Merck 60H, 3,5 x 5 cm) kloroformi/meta-noli-seoksella (98:2 95:5, tilav./tilav.) suoritetulla 5 vaihe-gradienttiluutiolla. Jakeet, jotka sisälsivät tuotteen 10 haihdutettiin kuiviksi.

Samalla tavalla trimeeri 5 kytkettiin 6:een ja täysin suojattu tuote puhdistettiin piihappogeelillä. Tästä viimeksi mainitusta tuotteesta poistettiin suojaryhmä 3’-10 päästä käyttäen trietyyliamiini/pyridiini/vesiseosta, ku ten edellä on kuvattu, fragmentin 9 saamiseksi.

Lopuksi kytkettiin heksameerit 9 ja 10 vedettömässä pyridiinissä (2 ml) TPSTe:n avulla (75 mg, 0,225 mmoolia), joka toimi kondensoivana aineena. Kytkennän päätyttyä (4 15 tuntia, ympäristön lämpötila) reaktioseos haihdutettiin pyöröhaihduttajalla ja jäännös kromatografoitiin piihappogeelillä. Tuote 11 (160 mg) saatiin seostamalla petroli-eetterillä, ja se näytti olevan homogeenista TLC:llä. Osasta yhdistettä 11 (20 mg), joka oli pyridiinissä (0,5 20 ml) suojaus poistettiin täydellisesti käsittelemällä sitä väkevöidyllä ammoniumhydroksidilla (7 ml, 8 tuntia, 60 °C) ja sen jälkeen käsittelemällä 80 %:isessa etikkahapossa (15 minuuttia, ympäristön lä.mpötila). Etikkahapon haihduttamisen jälkeen kiinteä jäännös liuotettiin 4 %:iseen 25 ammoniumhydroksidin vesiliuokseen (tilav./tilav., 4 ml), ja sitä uutettiin etyylieetterillä (3 x 2 ml). Vesijae väkevöitiin 1-2 ml:ksi ja osa siitä pantiin HPLC:hen 12:n puhdistamiseksi. Pääpiikkiä vastaavat jakeet yhdistettiin (noin 2 O.D254-yksikköä) ja väkevöitiin noin 5 ml-30 :ksi. Lopullisesta tuotteesta 12 poistettiin suolat Bio- geeli P-2:lla (1,5 x 100 cm) eluoimalla 20 %:lla etanolin vesiliuoksella, konsentroitiin kuivaksi ja liotettiin uudelleen veteen (200 μΐ), jotta saatiin liuos, jonka A254 = 10. 12:n sekvenssi varmistettiin kaksisuuntaisen sekvens-35 sianalyysin avulla.

ie 86993 Täydellinen tymosiini alfa 1 geeni koottiin 16 synteettisestä oligonukleotidistä menetelmin, joita aiemmin on kuvattu yksityiskohtaisesti somatostatiinin, (Itakura et. ai., 1977), insuliinin (Goeddel et ai., 1979) ja kas-5 vuhormoonin suhteen (Goeddel, Heyneker, et ai., 1979, Nature 281:544). Kymmenen mikrogramman erät oligonukleoti-dejä T2:stä T15:een fosforyloitiin kvantitatiivisesti [ γ-32p]-ATP:llä (New England Nuclear) T4-polynukleotidiki-naasin läsnäollessa (Goeddel et ai., 1979), jotta saatiin 10 noin 1 Ci/mmooli-suuruiset spesifiset aktiivisuudet. Ra-diomerkatut fragmentit puhdistettiin geelielektroforeesil-la, joissa käytettiin 20 % polyakryyliamidi/7M urea-gee-liä, ja eluoitujen fragmenttien sekvenssit varmistettiin kaksidimensionaalisellaelektroforeesi/homokromatografial-15 la (Jay et ai., 1974, Nucleic Acids Res. 1:331), joka suoritettiin osittaisista käärmeenmyrkkyuutteista. Fragmentit Ti ja T16 jätettiin fosforyloimatta, jotta minimoitiin ei toivottu polymeroituminen seuraavien ligaatioreaktioiden aikana. Nämä oligonukleotidit (2 pg kutakin) koottiin nel-20 jään ryhmään, joissa kussakin oli neljä fragmenttia (katso kuva 9 seuraavien piirrosten yhteydessä), T4 DNA-ligaasin avulla käyttäen julkaistuja menetelmiä (Goeddel et ai., 1979). Reaktiotuotteet puhdistettiin geelielektroforeesin avulla 15 %:isella polyakryyliamidigeelillä, joka sisälsi ...'25 7M ureaa (Maxam ja Gilbert, 1977, Proc. Nat. Sei. USA 71:3455). Neljä eristettyä tuotetta sidottiin yhteen, ja reaktioseos analysoitiin 10 %:isella polyakryyliamidigee-lielektroforeesilla. DNA, joka oli tymosiini alfa 1-geenin koon alueella (90 - 105 emäsparia) elektroeluoitiin.

30 Plasmidia pBR322 (0,5 pg) käsiteltiin BamHl ja Eco- RI restriktioendonukleaaseilla, ja fragmentit erotettiin polyakryyliamidigeelielektroforeesin avulla. Suuri fragmentti saatiin geelistä elektroeluution avulla, ja sen jälkeen se sidottiin koottuun, synteettiseen DNA:han ; 35 (Goeddel, Heyneker, et ai., 1979). Tätä seosta käytettiin « 86993 E. coli K12:n transformaatioon. Viisi prosenttia trans-formaatioseosta siveltiin LB-levyille, jotka sisälsivät ampisilliiniä 20 pg/ml. Neljä ampisilliinille resistenttiä pesäkettä, jotka saatiin, olivat herkkiä tetrasyklii-5 nille, viitaten tetrasykliiniresistanssigeeniin tapahtuneesta kiinnittymisestä. Näistä neljästä pesäkkeestä saatujen plasmidien analyysi osoitti, että kussakin tapauksessa plasmidi, jota merkittiin pThal:llä, sisälsi (a) Bglll-kohdan, jota ei ollut pBR322:ssa itsessään, ilmais-10 ten täten tymosiini alfa 1-geenin läsnäolon, kuten on esitetty kuvassa 7, sekä (b) fragmentin, jossa oli noin 105 emäsparia, jotka oli saatu aikaan BamHI/EcoRI-pikkomisen avulla. Plasmidi pThal:n konstruktiotie (ei mittasuhteiltaan oikea) esitetään liitteenä olevien piirrosten kuvassa 15 9, jossa voimakkaat pilkut ilmaisevat 5'-fosfaatti-ryhmien sijainnin.

3. Käsitellyn pThal ja LE'(d)-fragmentin reaktio

Plasmidi pThal sisältää geenin, joka määrää ampi-silliiniresistenssin, sekä geenin, joka määrää tymosiini 20 alfa l:n ja joka kloonataan 5'-koodaussäiepäästään EcoRI kohtaan ja 3'-päästään BamHI-kohtaan. Tymosiinogeeni sisältää myös Bglll-kohdan. Tymosiini-geeni sisältää myös Bglll-kohdan. Plasmidin aikaansaamiseksi, joka voi ottaa vastaan edellä valmistetun LE'(d)-fragmentin, pTHal uutet-25 tiin EcoRI:llä, mitä seurasi Klenow-polymeraasi I-reaktio dTTP:n ja dATP:n kanssa EcoRI-tähteiden tylpistämiseksi. Syntyvän tuotteen BglII-uuttaminen sai aikaan lineaarisen DNA-fragmentin, joka sisälsi geenin ampisilliiniresistens-siä varten ja, vastakkaisissa päissään, tahmeaa Bglll-täh-30 teen ja tylpän pään. Syntyvä tuote voitiin käyttää uudelleen reaktioon LE'(d)-fragmentin kanssa, joka sisältää Bglll-tahmean pään sekä tylpän pään, T4-ligaasin läsnäollessa plasmidin pTrp24.muodostamiseksi. Näin tehtäessä muodostetaan uudelleen EcoRI-kohta asemassa, jossa tylpän 35 pään sitominen tapahtuu.

20 8 6 9 9 3 E. Plasmidin PS0M7a2ä4 konstruktio pTrp24:n peräkkäinen uutto BglII:llä ja EcoRIrllä, jota seuraa PAGE ja elektroeluutio, tuottaa fragmentin, 5 jossa on kodonit LE'(d)-polypeptidiä varten sekä Bglll tanmea pää j a EcoRl tahmea pää 3'-koodauspäätteensä vieressä. LE'(d)-fragmentti voidaan kloonata plasmidin pSOM7A2 Bglll-kohtaan LE'-polypeptidi/somatostatiini fuus-ioproteiinin muodostamiseksi, joka ekspressoidaan trypto-10 faani-promoottori/operaattorin säätelyn alaisena. Tämän tekemiseksi tarvitaan (1) pSOM7A2:n osittais EcoRI-kohdan pilkkomiseksi distaalisesti tryptofaani-promoottori/ope-raattoriin nähden sekä (2) primeerisekvenssin oikea valinta, jotta säilytetään kodonin lukusuunta oikein ja muodos-15 tetaan uudelleen EcoRI-pilkkoutumiskohta.

Täten laimennettiin 16 pg plasmidia pSOM7A2 200 pl:aan puskuria, joka sisälsi 20 mM Tris:ä, pH 7,5, 5 mM MgCl2:a, 0,02 % NP40-detergenttiä ja 100 mM NaCl:a, ja käsiteltiin 0,5 yksiköllä EcoRI:a. 15 minuutin jälkeen 37° 20 C:ssa reaktioseos uutettiin fenolilla, uutettiin klorofor milla, saostettiin etanolilla ja sen jälkeen uutettiin BglII:llä. Suurempi syntyvä fragmentti eristettiin PAGE-menetelmällä ja sitä seuraavan elektroeluution avulla. Tämä fragmentti sisältää kodonit "LE'(p)" Le'-polypepti--•• 25 din proksimaalista päätä varten, t.s. kodonit vastasuun-taan BglII-kohdasta. Tämä fragmentti liitettiin seuraavak-si yllä mainittuun LE'(d)-fragmenttiin T4 DNA-ligaasin läsnäollessa plasmidin pSOM7A2A4 muodostamiseksi, joka siirrettäessä E. coli 294:ään valmisti tehokkaasti fuusio-30 proteiinia, joka käsitti täydellisesti uudelleen kokoon pannun LE-polypeptidin sekä somatostatiinin tryptofaani-promoottori/operaattorin säätelyn alaisena.

21 86993 F. Lineaarisen DNA: n, jossa on Pstl-tähde 3'päässä ja Bglll-tähde 5'-päässään, konstruktio sitomalla tetra-sykliiniresistenssiä määräävä geeni

Plasmidi pBR322 uutettiin HindIII:llä ja esiinpis-5 tävät Hindlll-päät pilkottiin Sl-nukleaasin avulla. Sl-nukleaasi-uuttoon kytkeytyi HindIII:llä pilkotun pBR322:n 10 pg:n erän käsittely 30 pl:ssa Sl-puskuria (0,3 MNaCl:a, 1 mM ZnCl2:a, 25 mM natriumasetaattia, pH 4,5) 300 yksiköllä Sl-nukleaasia 30 minuutin ajan 15 eC:ssa. Reaktio 10 pysäytettiin lisäämällä 1 μΐ 30 x Sl-nukleaasin pysäytys-liuosta (0,8 M trisemästä, 50 mM EDTA:a). Seos uutettiin fenolilla, uutettiin kloroformilla, saostettiin etanolilla ja sitten se uutettiin EcoRI:llä edellä kuvatulla tavalla. Syntyvällä fragmentilla, joka saatiin PAGE-menetelmällä ja 15 sitä seuraavan elektroeluution avulla, on EcoRI-tahmea pää ja tylppä pää, jonka koodaussäie alkaa nukleotidi tymidii-nillä. Slrllä uutettu Hindlll-tähde, joka alkaa tymidii-nillä, voidaan liittää Klenow-polymeraasi I:llä käsiteltyyn Bglll-tähteeseen niin, että Bglll-restriktio-kohta 20 muodostuu uudelleen sitoutumisen yhteydessä.

Sen tähden plasmidi pS0M7A2, joka oli valmistettu esimerkissä 2C, uutettiin Bglll:lla ja muodostuvat Bglll-tahmeat päät tehtiin kaksisäikeisiksi käsittelemällä Klenow-polymeraasi I:llä käyttäen kaikkia neljää desoksi-• 25 nukleotiditrifosfaattia. Syntyvän tuotteen EcoRIpilkkomi- nen, jota seurasi pienen fragmentin PAGE sekä elektroeluu-tio, tuotti lineaarisen palan DNA:ta, joka sisälsi trypto-faani-promoottori/operaattorin sekä LE' "propoksimaalisen" sekvenssin kodonin vastasuuntaan Bglllkohdasta ("LE'(p)"). 30 Tuotteella oli EcoRI-pää ja tylppä pää tuloksena Bglll-kohdassa tapahtuneesta täydennyksestä. Kuitenkin Bglll-kohta on järjestetty uudelleen sitomalla tylppä pää edellä Siiliä uutetun Hindlll-fragmentin tylppään päähän. Täten kaksi fragmenttia yhdistettiin T4 DNA-ligaasin läsnäolles-35 sa, jotta plasmidi pHKYlO muodostettiin uudelleen renkaak- 22 86 9 9 3 si, joka transformaation avulla pantiin lisääntymään kykeneviin E. coli 294-soluihin. Valittiin tetrasykliinille resistentit solut, joissa oli yhdistelmä-plasmidi pHKYlO, ja plasmidi-DNA uutettiin. BglII:lla ja Pstl:lla suori-5 tettu uuttaminen, jota seurasi PAGE-menetelmällä suoritettu suuren fragmentin eristäminen ja elektroeluutio, tuotti halutun lineaarisen palan DNA:ta, jolla oli PstI ja Bgll-tahmeat päät. Tämä DNA-fragmentti, joka oli täten valmistettu pHKY10:sta, sisältää replikaation alkukohdan ja on 10 sen tähden käyttökelpoinen komponentti plasmidin ΡΙΑ7Δ4Δ1 konstruktiossa, jossa molemmat geenit, jotka koo-daavat trp LE'-polypeptidifuusioproteiinia sekä tetrasyk-liiniresistenssiä, ovat trp-promoottori/operaattorin sää-telemiä.

15 G. Trp-promoottori/operaattorin sisältämän lineaa risen DNA:n konstruktio

Esimerkissä 2E valmistetulle plasmidille ρβΟΜ7Δ2Δ4 suoritettiin osittais EcoRI-uutto ja sen jälkeen Pstl-uut-to. Syntyvä fragmentti sisälsi trp-promoottori/operaatto-20 rin, ja se eristettiin PAGE-menetelmällä ja sitä seuraavan elektroeluution avulla. Osittais EcoRI-uutto oli välttämätön, jotta saatiin fragmentti, joka oli pilkottu somatos-tatiini-geeni 5'-pään vierestä, mutta se ei ollut pilkottu EcoRI-kohdasta, joka sijaitsee ampisilliiniresistenssigee-25 nin ja trp-promoottori/operaattorin välissä. Ampisilliini- resistenssi, joka on hävinnyt ampisilliiniresistenssigee-nissä suoritetun Pstl-pilkkomisen seurauksena, voidaan palauttaa sitomalla lopullisen pHKYlO lineaarisen DNA-johdannaisen kanssa, joka on valmistettu edellä esitetyssä 30 esimerkissä 2F.

H. Insuliinin λ-ketjun rakennegeenin eristäminen

Insuliinin A-ketjun rakennegeeni saatiin plasmidin pIAl uuttamisella, joka suoritettiin EcoRI:n ja BamHI:n avulla, plasmidin konstruktio on julkaistu kirjoituksessa ·.’ 35 Goeddel et ai., 1979, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 76:106.

23 8 6 9 92

Haluttu fragmentti puhdistettiin PAGE:n ja elektroeluution avulla ja sillä oli EcoRI- ja BamHIpäätteet.

1. Insuliinin A-ketjun rakennegeenin, Trp-promoot-tori/operaattorin sekä PstI- ja BglII-päätteet sisältävän 5 pHKY10:n lineaarisen DNA-fragmentin sitominen

Insuliinin A-ketjun rakennegeeni, lineaarinen DNA-fragmentti, joka sisälsi trp-promoottori/operaattorin (valmistettu esimerkissä 2G) sekä pHKYlOrn lineaarisen DNA-fragmentin (valmistettu esimerkissä 2F) sidottiin yh-10 teen kuvassa 1 esitetyssä suuntauksessa halutun plasmidin ρΙΑ7Δ4Δΐ:η muodostamiseksi. Plasmidi ρΙΑ7Δ4Δΐ voidaan valita helposti, ampisilliini - ja tetrasykliiniresistenssin palautumisen vuoksi.

Esimerkki 3 15 Plasmidin ρΙΒ7Δ4Δΐ konstruktio

Haluttu plasmidi rakennettiin esimerkin 2A-J mukaisesti, paitsi että lopullisessa sidonnassa käytettiin rakennegeeniä, joka määrää insuliinin B-ketjua pikemmin kuin insuliinin A-ketjua. Insuliinin B-ketjun rakennegeeni 20 saatiin plasmidin pIBl EcoRI- ja BamHI-uuton avulla, plasmidin pIBl konstruktio on esitetty julkaisussa Goeddel et ai., 1979. Insuliinin B-ketjua koodaava DNA-fragmentti puhdistettiin PAGE:n ja elektroeluution avulla ja sillä oli EcoRI ja BamHI-päätteet.

- 25 Plasmidi ρΙΒ7Δ4Δΐ esitetään kuvassa 3 ja voidaan helposti valita ampisilliini- ja tetrasykliiniresistenssin palautumisen vuoksi.

Esimerkki 4

Plasmidin ρΗΙ7Δ4Δΐ konstruktio 30 Kaavio plasmidin ρΗΙ7Δ4Δΐ:η valmistamiseksi on esi tetty liitteenä seuraavien piirrosten kuvassa 11.

A. Plasmidin pS0M7A4Al konstruktio

Haluttu konstruktio on analoginen esimerkissä 21 esitetyn konstruktion kanssa. Täten sidottiin lineaarinen 35 DNA-fragmentti, joka sisälsi trp-promoottori/operaattorin 24 86 993 (valmistettu esimerkissä 2G) sekä pHKY10:n lineaarinen DNA-fragmentti (valmistettu esimerkissä 2F) tavanomaisella tavalla plasmidin pSOMll somatostatiinigeenin sisältävään EcoRI-BamHI-restriktiofragmenttiin. Plasmidi pSOMll 5 voidaan konstruoida olennaisesti Itakuran et ai. ohjeiden mukaisesti, 1977, Science 198:1056 sekä ison Britannian patenttijulkaisun nro 2 007 676A mukaisesti. Haluttu plasmidi pSOM7A4Al voidaan valita helposti ampisilliiniresis-tenssin palautumisen vuoksi.

10 B. Proinsuliinin 32 N-terminaalista aminohappoa koodaavan synteettisen geenin valmistus

Taulukossa 2 esitettyjen 18 oligonukleotidin sarja valmistettiin ensimmäisenä vaiheena pantaessa kokoon proinsuliinin 32 ensimmäistä aminohappoa koodaavaa geeniä.

15 Yksittäiset nukleotidit on identifioitu kirjaimin A, T, C tai G, jotka edustavat emäksiä adeniini, tyrniini, sytosiini tai guaniini, jotka erottavat toisen nukleotidin toisesta. Viime kädessä konstruoitu koko geenin nukleotidi-sekvenssi esitetään kuvassa 10.

25 869S3

Taulukko 2

Synteettisiä oligonukleotidejä somatostatiinigeeniä varten Yhdiste Sekvenssi

Hl AATTCATGTT

5 H2 CGTCAATCAGCA

H3 CCTTTGTGGTTC

H4 TCACCTCGTTGA

H 5 TTGACGAACATG

H6 CAAAGGTGCTGA

10 H7 AGGTGAGAACCA

H8 AGCTTCAACG

B1 AGCTTTGTAC

B2 CTTGTTTGCGGT

B3 GAACGTGGTTTC

15 B4 TTCTACACTCCT

B5 ' AAGACTCGCC

B6 AACAAGGTACAA

B7 ACGTTCACCGCA

B8 GTAGAAGAAACC

20 B9 AGTCTTAGGAGT

BIO' GATCCGGCG

Kuvassa 10 synteettiset nukleotidit on esitetty sulkumerkkien välissä ja ne on alleviivattu. Nämä oligo-,25 nukleotidit syntetisoitiin triesteri-menetelmällä, Crea, et ai., 1978, Proc. Nat. Arad. Sei. USA 75:5765,

Itakura, et ai., 1975, J. Biol. Chem. 250:4592 sekä Itakura et ai., 1975, J. Am. Chem. Soc. 97:7327. Joitakin oligonukleotideistä käytettiin konstruoitaessa geeniä ih-30 mlsen insuliinin B-ketjua varten kuten aiemmin Crea et ai., 1978, ja Goeddel et ai., 1979, ovat kuvanneet. Kaksi oligonukleotidiä (B5' ja BIO') sisällyttävät Hpall ja terminaaliset BamHI ja terminaaliset BamHI- sekä EcoRI-rest-riktiokohdat. Terminaaliset kohdat ovat erityisesti käyt-35 tökelpoisia kloonaustarkoituksiin.

26 86993

Kahdeksan oligonukleotidiä H1-H8, joita aiemmin käytettiin ihmisen insuliinin B-ketjun geenin vasemman puolen kokoonpanoon (Goeddel, et ai., 1979), sisältävät kodonit B-ketjun geenin 1-3 aminohappoa varten sekä myös 5 yhden metioniiniyksikön N-päätteessä. B-ketjun geenin oikea puoli konstruoitiin oligonukleotideistä Blt B2, B3, B4, B5', B6, B7, B8, B9, B10' liittämällä T4 DNA-ligaasin avulla olellisesti Goeddel, et al.:n, 1979, esityksen mukaisesti. Tuloksena oleva geenifragmentti koodaa 14-30 aminohappoa 10 ilmisen insuliinin B-ketjussa sekä sillan muodostavaa ketjua ensimmäistä arginiini-yksikköä. Hpall-restriktiokohta on sisällytetty geenisekvenssiin samassa lukukehyksessä ja samoin sijaiten kuin Hpall-kohta ihmisen insuliinigeenis-sä. Sen jälkeen, kun liittämällä saatu geenifragmentti oli 15 puhdistettu polyakryyliamidigeelielektroforeesin avulla ja suurin DNA-nauha oli eluoitu, fragmentti käännettiin Hind- III-BamHI-pilkkomaan plasmidiin pBR322. Syntynyt plasmidi, pB3:ksi merkitty, siirrettiin E. coli K12 294:ään (ATCC nro 31 446) transformaation avulla. Plasmidi antoi resis-20 tenssin antibiootteja ampisilliiniä ja tetrasykliiniä kohtaan, ja sen havaittiin sisältävän halutun nukleotidisek-venssin Maxam, et al.:n menetelmällä määritettynä, 1977, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74:560.

Kaksi fragmenttia, 58 emäsparia käsittävä pB3:n 25 HindiII-BamHI-fragmentti sekä 46 emäsparia käsittävä pBHl:n EcoRI-Hindlll-fragmentti (julkaistu kirjoituksessa Goeddel et ai., 1979) liitettiin, jotta saatiin fragmentti, jolla on EcoRI sekä BamHI-päätteet. Tämä fragmentti liitettiin EcoRI:llä ja BamHI:llä pilkottuna plasmidiin 30 pBR322 oleellisesti Goeddel et al.:n, 1979, esittämällä tavalla. Syntynyt plasmidi, merkitty pIB:ksi, kloonattiin sitten E. coli K12 294:ään. Tavanomaisen amplifikaation ja eristämisen jälkeen plasmidi pIB3 pilkottiin EcoRIja Hpa-II-restriktioentsyymillä synteettisen geenifragmentin val-35 mistamiseksi (fragmentti 1, kuva 11), joka koodaa N-termi- 27 86993 naalisia proinsuliinin aminohappoja, joita metioniini edeltää. Synteettinen geeni eristettiin tavanomaisesti polyakryyliamidigeelielektroforeesin avulla.

C. Ihmisen proinsuliinin 50 C-terminaalista ami-5 nohappoa koodaavan cDNA:n eristäminen

Kaavio halutun cDNA:n saamiseksi on esitetty liitteenä seuraavien piirrosten kuvassa 12. Sen kanssa yhdenmukaisesti syntetisoitiin dekanukleotidi pCCGGATCCGGTTTieT, joka sisälsi sekä BamHI-tunnistussekvenssin sekä noin 20 10 tähteen 3'-polytymidyylihappoalueen, ja sitä käytettiin aloittamaan AMV käänteistranskriptaasi cDNA-synteesiä varten. Aluke valmistettiin käyttämällä terminaalista desok-sinukleotidyyli-transferaasia (Enzo-Biochem, 200 yksikköä) 1 pmoolin kanssa BamHl-dekanukleotidiä 6 ml:n reaktiotila-15 vuudessa, joka sisälsi 1,5 x 10*4 pmoolia TTP:tä. Reaktio suoritettiin 37 °C:ssa, yhden tunnin ajan, Chang, et al.:n puskurijärjestelmässä, 1978, Nature 275:617.

Ihmisen insulinooma-kudoksen antoi käyttöön Institute fiir Diabetes f or schung, Munchen, Länsi-Saksa. Aihee-20 seen perehtyneille on selvää, että ihmisen insulinooma-kudos on helposti saatavissa ja se saadaan helposti monista eri lähteistä. Ihmisen insulinooma-kudoksen Poly A mRNA (2,5 pg) eristettiin olellisesti Ullrich, et al.:n menetelmän mukaisesti, 1977, Science 196:1313 ja sitten se ; 25 muutettiin kaksisäikeiseksi cDNA:ksi olellisesti Wickensin et ai. mukaisesti, 1978, J. Biol Chem. 253:2483. Täten 80 pl:n reaktiotilavuutta, joka sisälsi 15 mM TrisHCl:a (pH

8,3, 42 °C:ssa), 21 mM KCl:a, 8 mM 14 MgCl2:a, 30 mM 8-mer-kaptoetanolia, 2 mM aluketta dCCGGATCCGGTTl8T sekä 1 mM • 30 dNTPs:a esi-inkuboitiin 0 °C:ssa. Sen jälkeen, kun AMV

käänteistranskriptaasi oli lisätty, seosta inkuboitiin 15 minuutin ajan 42 °C:ssa. Syntyvä RNA/DNA denaturoitiin tavanomaisin menetelmin.

Komplementaarinen cDNA-säie syntetisoitiin 150 μ1:η 35 reaktiotilavuudessa, joka sisälsi 25 mM Tris-HCl:a (pH

28 86993 8,3), 35 mM KCl:a, 4 mM MgCl2:a, 15 mM 8-merkaptoetanolla 1 mM dNTPs:a ja 9 yksikköä DNA-polymeraasi I:a (Klenow-fragmentti). Seosta inkuboitiin 15 °C:ssa 90 minuutin ajan, jonka jälkeen inkuboitiin 15 tunnin ajan 4 °C:ssa.

5 Sl-nukleaasi-käsittely suoritettiin sitten 2 tunnin ajan 37 °C:ssa käyttämällä 1 000 yksikköä Sl-nukleaasia (Miles Laboratoties, Elkhart, Indiana) oleellisesti Wickensin et ai., 1978, esittämien ohjeiden mukaisesti. Kaksisäikeisel-le cDNA:lle (0,37 pg) suoritettiin elektroforeesi 8 %-10 :isella polyakryyliamidigeelillä ja eluoitiin DNA-fragmen-tit, jotka olivat suurempia kuin 500 emäsparia. Oligode-soksisytidyylihappotähteitä lisättiin fragmenttien 3'-päihin käyttämällä terminaalista desoksinukleotidyylitransfe-raasia oleellisesti menetelmän mukaan, jonka Maizel Jr. on 15 eisttänyt, 1971, Meth. Virol. 5:180. dC-päätteiset cDNA-fragmentit liitettiin lämpökäsittelyn avulla pBR322:een, jota oli ensin uutettu Pstl-restriktioentsyymillä ja jonka päähän oli sitten liitetty desoksiguanidyylihappo käyttämällä terminaalista desoksinukleotidyylitransferaasia. 20 Syntyvät plasmidit transformoitiin E. coli K12 294:ään ja kloonattiin. Eristettiin pesäkkeet, jotka olivat resistenttejä tetrasykliinille mutta herkkiä ampisilliinille, ja ne seulottiin plasmidien suhteen, joissa oli kolme Pst- I-restriktiokohtaa. Sellainen restriktio-malli ilmaisee 25 proinsuliinin geenin, Sures et ai., 1980, Science 208:57.

Yksi plasmidi, pH1104, joka sisälsi 600 emäsparian siirrännäisen (insert), antoi ennakoidun Pstl-restriktio-tyypin ja sisälsi BamHI-kohdan 3'-polyA:n ja polyGC:n välissä, jotka oli liitetty cDNA:n valmistuksen aikana. Osa 30 liitännäisen nukleotidisekvenssistä on esitetty kuvassa 10. Tämä sekvenssi eroaa vähän (AT [alleviivattu] korvannut GC-parin) aiemmin Sures et al.:n, 1980, ja Bellin et ai., 1979, Nature 282:525, esittämästä sekvenssistä, koska käytetty mRNA oli kudoksesta, joka oli eristetty eri yksi-35 löstä.

29 8 6992 D. Ihmisen proinsuliinia koodaavan geenin kokoonpano

Kaavio, jota on käytetty ihmisen proinsuliinia koodaavan geenin kokoonpanoon, on esitetty liitteenä olevien 5 piirrosten kuvassa 11.

Synteettinen geenisegmentti, joka koodaa proinsu-liinin 31 ensimmäistä aminohappoa, fragmentti 1 kuvassa 11, saatiin 50 pg:sta plasmidia pIB3 käyttämällä restrik-tioendonukleoaaseja EcoRl ja Hpall kuten edellä on kuvat-10 tu. Tämä fragmentti sisältää myös kodoni-ATG:n metioniinia varten esi-proinsuliinin "esisekvenssin" sijasta.

cDNA-segmentti, joka koodaa aminohappoja 32 - 86, sekä translaation lopetuskodonit ja mRNA:n 3'-alue, jota ei ole luettu, saatiin 40 pg:sta plasmidia pHI104 käsitte-15 lemättä ensin BamHI- ja sitten Hpall-restriktioentsyymeil- lä. Kaksi fragmenttia eristettiin polyakryyliamidigeeli-elektroforeesin ja sitä seuraavan elektroeluution avulla. Geenifragmentit yhdistettiin käsittelemällä T4 DNA-ligaa-silla 20 pl:ssa ligaasi-puskuria (Goeddel et ai., 1979), 20 4 °C:ssa 24 tunnin ajan. Seos laimennettiin 50 pl:lla H20:ta, uutettiin tavanomaisesti sekä fenolilla että kloroformilla ja saostettiin sitten etanolilla.

Syntyvää DNA:ta käsiteltiin BamHI- sekä EcoRI-rest-riktioentsyymeillä, jotta saatiin nämä kohdat uudelleen 25 syntymään ja poistettua geenipolymeerit. Koottu proinsu-liinigeeni eristettiin polyakryyliamidigeelielektroforee-sin avulla ja liitettiin käyttämällä T4 DNA-ligaasia) EcoRl :llä ja BamHI:llä uutettuun plasmidi pBR322:een. Syntyvä DNA transformoitiin E. coli K12 294tään, ja muodostu-• 30 neet pesäkkeet seulottiin tetrasykliiniherkkyyden ja ampi- silliiniresistenssin suhteen. Plasmidi pHI3, joka on eristetty eräästä sellaisesta pesäkkeestä, sisälsi halutun proinsuliinigeenin, joka sen jälkeen karakterisoitiin nuk-leotidisekvenssianalyysin perusteella.

30 86993 E. Plasmidin konstruktio ihmisen proinsuliinin sisältävän, epätodellisen proteiinin ekspressiota varten Täydellinen ihmisen proinsuliinin geeni, metionii-nia koodaava N-terminaalinen kodoni mukaanluettuna, saa-5 tiin plasmidista pHl3 käsittelemällä EcoRI- ja BamHI-rest-riktioentsyymeillä. Haluttu fragmentti puhdistettiin gee-lielektroforeesin avulla, ja sitten se sidottiin (käyttäen T4 DNA-ligaasia) plasmidin pS0M7A4Al PstlEcoRI (osit-tais)uutolla saatuun tuotteeseen sekä suurempaan plasmidin 10 pHKYlO (valmistettu esimerkissä 2F) Pstl-Bglll-fragmen-teista.

pSOM7A4Al-fragmentti konstruoitiin osittaisella EcoRI-uutolla, jota seurasi täydellinen Pstl-uutto. Syntyvä fragmentti sisälsi trp promoottori/operaattorin, ja 15 se eristettiin PAGE:n avulla, jota seurasi elektroeluutio. Osittainen EcoRI-uutto oli välttämätön, jotta saatiin fragmentti, joka oli pilkottu somatostatiinigeenin 5'-pään vierestä, mutta ei ollut pilkottu EcoRI-kohdasta ampisil-liiniresistenssigeenin ja trp-promoottori/operaattorin vä-20 listä. Ampisilliiniresistenssi, joka oli hävinnyt ampisil-liiniresistenssigeenissä suoritetussa PstI-leikkauksessa, voidaan palauttaa sitomalla lopullisen pHKYlO lineaarisen DNA-johdannaisen kanssa, joka on valmistettu edellä esitetyssä esimerkissä 2F.

25 Noin 1 pg täydellistä ihmisen proinsuliinigeeniä, jossa on EcoRI- ja BamHi-päätteet, 4 pg Pstl-EcoRI(osittaisi ρε0Μ7Δ4Δΐ-fragmenttia ja noin 1 pg pHKYlOrn Pstl-Bglll-fragmenttia liitettiin yhteen 4 °C:ssa, 24 tunnin aikana, käyttäen T4 DNA-ligaasia ligaasi-puskurissa.

30 Yhdistetty DNA-seos transformoitiin E. coli K12 294:ään oleellisesti Goeddel et al.:n, 1979, esittämän menetelmän mukaisesti. Valittiin pesäkkeet, jotka kasvo!-vat sekä ampisilliinillä että tetrasykliinillä, ja SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesin avulla, Maizel, Jr., 35 1971, havaittiin niiden sisältävän haluttua plasmidia 31 8699 5 ΡΗΙ7Δ4Δ1 ja ekspressoivan proteiinia, jolla oli molekyyli-paino, joka oli odotettu trp LE'-proinsuliini-fuusion perusteella. Plasmidi ρΗΙ7Δ4Δΐ, joka ekspressoi edellä mai-5 nittua proteiinia, luonnehdittiin täydellisesti DNA-sek- venssin ja restriktiokohtien suhteen, jotka olivat liitetyssä geenissä ja myös vektorissa. Plasmidia ρΗΐ7Δ4Δΐ kuvataan liitteenä seuraavien piirrosten kuvassa 5 ja se voidaan helposti valita ampisilliini- ja tetrasykliinire-10 sistenssin säilymisen perusteella.

Esimerkki 5 pDI10:n ~2,7Ttb PstI-fragmentin eristäminen

Plasmidin pDUO ~2,7kb PstI-fragmentti sisältää geenit restriktiota ja modifikaatiota varten, jolloin 15 niillä on HhaII:n spesifisyys. Noin 15 pg kovalenttisesti sidottua, renkaanmuotoista pDI10:a, joka oli eristetty E. coli K12 294/pDI10:sta, uutettiin täydellisesti 37 °C:ssa Pstl-restriktioentsyymin kanssa. Reaktioseos sisälsi noin 35 μΐ pDIlO-liuosta (valmistettu esimerkissä 1), 15 μΐ 10 20 x PstI-puskuria (100 mM MgCl2:a, 500 mM (NH4)2S04:a sekä 200 mM Tris-HCl:a, pH 7,5), 15 μΐ härän seerumia albumiinia (1 mg/ml), 77,5 μΐ H20:a ja 17,5 μΐ Pstl-restriktioentsyymiä (1 New England Biolabs-yksikkö μΐ). Restriktioentsyymillä käsitelty DNA fraktioitiin AGE:n avulla (agaroosigeeli-25 elektroforeesi) geeleissä, jotka sisälsivät 0,8 % agaroo-sia TBE:ssä (10,8 g Tris-emästä, 5,5 g boorihappoa ja 0,09 g Na2EDTA:a 1 litrassa H20:a), 1,5 tunnin ajan 220 volttia käyttäen. Vyöhykkeet tehtiin näkyviksi värjäämällä eti-diumbromidilla (0,5 pg/ml) ja tarkastelemalla ultraviolet-: 30 tivalon alla. Haluttu fragmentti poistettiin ja elektro- eluoitiin TBE:hen 1 tunnin aikana 150 volttia käyttäen. DNA sidottiin DEAE-selluloosa-(Whatman DE52) pylvääseen, joka oli tasapainotettu tasapainotuspuskurilla (0,1 M K-Cl:a ja 10 mM Tris-HCl:a, pH 7,8). Pylväs pestiin tasa-35 painotuspuskurilla, ja DNA eluoitiin eluutiopuskurilla (1 32 8 6 9 9 3 M NaCl:a ja 10 mM Tris-HCl:a, pH 7,8). Eluaatin Na+±onin konsentraatlo säädettiin veden avulla noin 0,35 M:ksi, ja sitten DNA saostettiin lisäämällä kaksi tilavuutta 100 %:sta etanolia ja jäähdyttämällä -20 °C:een yön yli. Ha-5 luttu saostuma koottiin sentrifugoimalla, kuivattiin ja liuotettiin TE:hen.

Esimerkki 6

Pstl:llä uutetun plasmidi pIA7A4Al:n eristäminen

Noin 0,5 pg plasmidia ρΙΑ7Δ4Δΐ, joka on valmistettu 10 esimerkissä 2, uutettiin 3 tunnin ajan 37 °C:ssa Pstl-restriktioentsyymin avulla oleellisesti esimerkissä 5 kuvatun menetelmän mukaisesti. Restriktioentsyymillä käsiteltyä DNA:ta uutettiin kerran fenolilla ja kaksi kertaa kloroformi:isoamyylialkoholilla (24:1) standardimenetelmiä 15 käyttäen. Liuos sekoitettiin 0,1 tilavuuden kanssa 3 M na-triumasetaattia, pH 8, ja saostettiin lisäämällä 2,2 tilavuutta etanolia ja jäähdyttämällä -20 °C:een yön yli. Haluttu saostuma koottiin sentrifugoiden, kuivattiin ja liuotettiin TE:hen.

20 Esimerkki 7

PstI:llä uutetun plasmidin pIB7A4Al eristäminen

Noin 0,5 pg plasmidia ρΙΒ7Δ4Δΐ, joka oli valmistettu esimerkissä 3, uutettiin 3 tunnin ajan 37 °C:ssa Pstl-restriktioentsyymillä oleellisesti esimerkin 5 mu-: 25 kaisella menetelmällä. Restriktioentsyymillä käsiteltyä DNA:a uutettiin kerran fenolilla ja kaksi kertaa kloroformi :isoamyylialkoholilla (24:1) käyttäen standardi menetelmiä. Liuos sekoitettiin 0,1 tilavuuden kanssa 3 M natriumasetaattia, pH 8, ja se saostettiin lisäämällä 2,2 30 tilavuutta 100 %:ista etanolia ja jäähdyttämällä -20 °C-:een yli yön. Haluttu saostuma koottiin sentrifugoiden, ·: kuivattiin ja liuotettiin TE:hen.

86993

Esimerkki 8

Plasmldin pDIlO ~2.Tkb PstI-fragmentin liittäminen Pstl-:llä uutettuun plasmldiin ρΙΑ7Δ4Δΐ

Noin 0,2 pg Pstl:llä uutettua plasmldla ρΙΑ7Δ4Δΐ 5 sekä 1,1 pg plasmldin pDIlO ~2,7kb Pstl-fragmenttia sekoitettiin 400 pl:ssa TE/10:tä (1 mM Tris-HCl:a, pH 7,8, 0,1 mM Na2EDTA:a). Sen jälkeen, kun oli lisätty 0,1 tilavuutta 3 M natriumasetaattia, pH 8, DNA saostettiin lisäämällä 2,2 tilavuutta 100 %:ista etanolia ja jäähdyttämällä 10 -20 eC:een yön yli. Haluttu saostuma koottiin sentrifugoi- den, ja sitten se kuivattiin. Liittäminen suoritettiin 3,3 pl:n reaktiotilavuudessa, joka sisälsi 2 pl DNA:ta H20:ssa, 0,6 pl 5 x kinaasi-ligaasi-puskuria (50 mM MgCl2:a, 25 mM ditiotreitolia, 250 mM Tris-HCl:a, pH 7,8, ja 25 % glyse-15 rolia), 0,6 pl 0,66 mMATP:a sekä 0,1 pl T4 DNA-ligaasia (1 yksikkö/pl). Reaktioseosta inkuboitiin yli yön 15 °C:ssa. Esimerkki 9

Plasmldin pDIlO ~2,7kb PstI-fragmentin liittäminen Pstl-:llä uutettuun plasmldiin ρΐΒ7Δ4Δΐ 20 Haluttu liittäminen suoritettiin oleellisesti esi merkin 8 ohjeen mukaisesti, paitsi että käytettiin Pstl-:llä uutettua plasmidia ρΙΒ7Δ4Δΐ plasmldin ρΙΑ7Δ4Δΐ sijasta. Reaktioseosta inkuboitiin yön yli 15 °C:ssa.

Esimerkki 10 25 E. coli K12 RV308/pPR26:n ja E. coli K12 RV308/pPR27:n konstruktio ja plasmidien pPR26 ja pPR27 eristäminen

Noin 0,1 pg yhdistettyä DNA:ta, joka oli valmistettu esimerkissä 8, laimennettiin lopulliseen 50 pl:n tilavuuteen SSC/10:llä. DNA transformoitiin sitten kelvolli-.30 seen E. coli K12 RV308:aan oleellisesti esimerkissä 1 esi-. tetyn transformaatio-menetelmän mukaisesti. Halutut E.

coli K12 RV308/pPR26 ja E. coli K12 RV308/pPR27transfor-mantit eristettiin kasvattamalla niitä L-agarilla, joka sisälsi tetrasykliiniä 5 pg/ml. Eristeet tutkittiin tetra-·-’ 35 sykliiniresistenssin ja ampisilliiniherkkyyden varmistami- 34 86 9 93 seksi. Sopivia pesäkkeitä käytettiin kovalenttisesti suljetun, renkaan muotoisen plasmidi-DNA:n eristämiseen, joka suoritettiin olellisesti Bazaralin ja Helinskin, 1968, eristämismenetelmän mukaisesti. Plasmidien rakenne varmis-5 tettiin kartoittamalla restriktioendonukleaasin pilkkomis-kohdat. Saatiin kahden suuntauksen plasmldeja, koska **2,7 kb Pstl-restriktiofragmentin käsittävät plasmididt voidaan insertoida kummassa suunnassa tahansa. Näin ollen molemmat plasmidit pPR26 ja pPR27 ja niitä vastaavat transfor-10 mäntit eristetään edellä esitetyssä menetelmässä.

Esimerkki 11 E. coli K12 RV308/pPR28:n ja E. coli K12 RV308/pPR1228:n konstruktio ja plasmidien pPR28 ja pPRl228 eristäminen

Halutut konstruktiot valmistettiin oleellisesti 15 esimerkin 11 ohjeen mukaisesti, paitsi että käytettiin esimerkin 9 mukaisesti liitettyä DNA:ta esimerkin 8 sijasta. Eristettiin halutut E. coli K12 RV308/pPR28 ja E. coli K12 RV308/pPR1228 transformantit ja niiden vastaavien plasmidien rakenne varmistettiin kartoittamalla restriktioen-20 donukleaasin pilkkomiskohdat. Saatiin kahden suuntauksen plasmidit, koska plasmidit ~2,7kb Pstl-restriktiofragmen-tin käsittävät plasmidit voidaan insertoida kummassa suunnassa tahansa. Niin muodoin molemmat plasmidit pPR28 ja pPRl228 ja niiden vastaavat transformantit eristetään - 25 edellä esitetyllä menetelmällä.

Esimerkki 12 E. coli K12 RV308/pPR29:n konstruktio ja plasmidin pPR29 eristäminen A. Plasmidin pPR27 ~6,2kb Aval-Bglll-fragmentin 30 eristäminen

Plasmidi pPR27 sisältää yksinkertaisen Bglll-rest-riktio-kohdan noin emäsparikoordinaatissa 331 sekä yksinkertaisen Aval-kohdan noin koordinaatissa 2334. Noin 8 pg plasmidia pPR27 (valmistettu esimerkissä 10) uutettiin 35 täydellisesti 37 eC:ssa 150 μ1:η reaktioseoksessa, joka 35 86993 sisälsi 20 mM Tris-HCl:a, pH 7,4, 30 mM NaCl:a ja 16 yksikköä Aval-restriktioentsyymiä (BRL, 2 yksikköä/μΐ). Sen jälkeen, kun oli lisätty 20 μΐ 10 x BglII-puskuria (IM Tris-HCl:a, pH 8,0, 50 mM MgCl2:a ja 600 mM NaCl:a), 25 μΐ 5 H20:a ja 5 μΐ Bglll-restriktioentsyymiä (New England Bio- labs, 1,6 yksikköä/μΐ), reaktiota inkuboitiin 37 °C:ssa 60 minuutin ajan ja sitten 65 °C:ssa 5 minuutin ajan. Rest-riktioentsyymillä käsitelty DNA fraktioitiin AGE:n avulla, ja sitten haluttu fragmentti ~6,2kb saatiin TE:ssä elek-10 troeluution ja DEAE-selluloosakromatografian avulla oleellisesti esimerkin 5 menetelmän mukaisesti.

B. Plasmidin ρΗΙ7Δ4Δΐ fragmentin "2,31(0 Äval-Bglll eristäminen

Plasmidi ρΗΙ7Δ4Δΐ sisältää yksinkertaisen Bglll-15 restriktiokohdan noin emäspari koordinaatin 331 sekä yksinkertaisen Aval-kohdan noin koordinaatin 2614 kohdalla. Noin 15 pg plasmidia ρΗΙ7Δ4Δΐ, joka oli valmistettu esimerkissä 4, uutettiin täydellisesti Aval- ja Bglll-rest-riktioentsyymeillä oleellisesti edellä esimerkissä 12A 20 kuvatun menetelmän mukaisesti. Restriktioentsyymillä käsitelty DNA fraktioitiin AGE:n avulla ja haluttu ~6,2kb fragmentti saatiin TE:ssä elektroeluution ja DEAE-selluloosakromatografian avulla oleellisesti esimerkin 5 mukaisella menetelmällä.

.*“.25 C. Plasmidi pPR27:n ~6,2kb Aval-Bglll-fragmentin liittäminen plasmidi ρΗΙ7Δ4Δΐ:η “2,3kb Aval-Bglll-fragmenttiin .. . Noin 2,3 pg plasmidi pPR27:n (valmistettu esimer kissä 12A) ~6,2kb Aval-Bglll-fragmenttia ja noin 0,85 pg 30 ρΗΙ7Δ4Δΐ:η (valmistettu esimerkissä 12B) fragmenttia “2,3 kb Aval-Bglll sekoitettiin 570 pl:ssa TE:a ja seostettiin etanolilla oleellisesti esimerkin 8 menetelmän mukaisesti. Takaisin saatu DNA yhdistettiin 10,1 pl:ssa reaktioseosta, joka sisälsi 2 pl 5x kinaasi-ligaasi-puskuria, 2 pl 0,66 *. 35 mM ATP:a, 6 pl H20:a ja 0,1 pl T4 DNA-ligaasia (1 yksikkö/ 36 8 6 993 μΐ). Sen jälkeen, kun reaktioseosta oli inkuboitu yön yli 9 °C:ssa, haluttu DNA saatiin takaisin tunnettujen menetelmien mukaisesti.

D. E. coli K12 RV308/pPR29:n konstruktio ja plas-5 midi pPR29:n eristäminen

Haluttu konstruktio saatiin aikaan oleellisesti esimerkin 10 ohjeen mukaan, paitsi että käytettiin sidottua DNA:ta, joka oli valmistettu esimerkin 12C mukaisesti esimerkin 8 sijasta. Haluttu E. coli K12 RV308/pPR29 eris-10 tettiin, ja plasmidin rakenne varmistettiin kartoittamalla restriktioendonukleaasin pilkkomiskohdat.

Edustavat transformantit, joita voidaan konstruoida edellä esitetyn ohjeen mukaisesti, sisältyvät seuraavaan taulukon 2 luetteloon.

37 86993

Taulukko 2

Edustavia transformantteja 1. E. coll K12 294/pPR26 5 2. E. coll K12 294/pPR27 3. E. coll K12 294/pPR28 4. E. coll K12 294/pPR1228 5. E. coll K12 294/pPR29 6. E. coll K12/pPR27 10 7. E. coll K12 C600/pPR26 8. E. coll K12 C600/pPR27 9. E. coll K12 C600/pPR28 10. E. coll K12 C600/pPR1228 11. E. coll K12 C600/pPR29 15 12. E. coli/pPR27 13. E. coll K12 C600Rk'Mk7pPR26 14. E. coll K12 C600Rk"Mk'/pPR27 15· E. coll K12 C600Rk‘Mk'/pPR28 16· E. coli K12 C600Rk'Mk'/pPR1228 20 17. E. coli K12 C600Rk'Mk’/pPR29 18. E. coli K12/pPR28 19. E. coll K12 HB101/pPR26 20. E. coll K12 HB101/pPR27 21. E. coli K12 HB101/pPR28 .•25 22. E. coli K12 HB101/pPR1228 23. E. coll K12 HB101/pPR29 24. E. coll/pPR28 25. E. coli K12 BE827/pPR26 26. E. coli K12 BE827/pPR27 - 30 27. E. coli K12 BE827/pPR28 : 28. E. coll K12 BE827/pPR1228 29. E. coli K12 BE827/pPR29 . : 30. E. coli K12/pPR29 31. E. coli/pPR29

Claims (1)

1. 38 80993 Patenttivaatimus Menetelmä E. coli K12-isäntäsolun suojaamiseksi, joka sisältää plasmidin, joka pystyy ekspressoimaan ihmi-5 sen proinsuliinin tai ihmisen insuliinin yhden A-ketjun tai B-ketjun, bakteriofaagi-infektiota vastaan, joka bak-teriofaagi elää vapaasti ympäristössä ja sisältää kaksi-säikeistä DNA:ta, jolla on Hhall restriktio- ja modifikaa-tioaktiivisuutta, tunnettu siitä, että isäntäsolu- 10 transformoidaan a) A-ketjua ekspressoivalla plasmidilla, joka on valmistettu kloonaamalla plasmidin pDUO, jolla on kuvassa 2 esitetty restriktiokartta, noin 2,7 kb:n PstI-fragmentti plasmidiin ρΙΑ7Δ4Δΐ, jolla on kuvassa 1 esitetty restrik- 15 tiokartta; tai b) B-ketjua ekspressoivalla plasmidilla, joka on valmistettu kloonaamalla plasmidin pDUO, jolla on kuvassa 4 esitetty restriktiokartta, noin 2,7 kb:n Pstl-fragmentti plasmidiin ρΙΒ7Δ4Δΐ, jolla on kuvassa 3 esitetty restrik- 20 tiokartta; tai c) proinsuliinia ekspressoivalla plasmidilla, joka on valmistettu liittämällä yhteen plasmidin pPR27, jolla on kuvassa 2 esitetty restriktiokartta, noin 6,2 kb:n Ava- I-BglII restriktiofragmentti ja plasmidin ρΗΙ7Δ4Δΐ, jolla 25 on kuvassa 5 esitetty restriktiokartta, noin 2,3 kb:n Ava- I-BglII-restriktiofragmentti; sillä rajoituksella, että modifikaatioaktiivisuus ekspressoituu isäntäsolussa ennen restriktioaktiivisuutta. 39 86993 Förfarande för att skydda en E. coli K12-värdcell, som innehäller en plasmid, som förmär uttrycka en av A-5 kedjan eller B-kedjan av humant insulin eller humant pro-insulin mot infektion av en i omgivningen fritt levande bakteriofag, vilken innehäller dubbelsträngat DNA med Hha-II-restriktions- och modifikationsaktivitet, k ä n n e -t e c k n a t därav, att man transformerar värdcellen med 10 a) en plasmid som uttrycker en A-ked och som fram- ställts genom att klona det ca 2,7 kb Pst-fragmentet av plasmiden pDUO, vilken har den i figur 2 angivna restrik-tionskartan, i plasmiden ρΙΑ7Δ4Δΐ, vilken har den i figur 1 angivna restriktionskartan eller 15 b) en plasmid som uttrycker en B-ked och som fram- ställts genom att klona det ca 2,7 kb Pst-fragmentet av plasmiden pDUO, vilken har den i figur 4 angivna restriktionskartan, i plasmiden ρΙΒ7Δ4Δΐ, vilken har den i figur 3 angivna restriktionskartan eller 20 c) en plasmid som uttrycker proinsulin och som er- hällits genom att sammankoppla det ca 6,2 kb Aval-Bglll-restriktionsfragmentet av plasmiden pPR27, vilken har den i figur 2 angivna restriktionskartan och det ca 2,3 kb Aval-Bglll-restriktionsfragmentet av plasmiden ρΗΙ7Δ4Δΐ, 25 vilken har den i figur 5 angivna restriktionskartan, med den begränsningen att modifikationsaktiviteten uttrycks i värdcellen före restriktionsaktiviteten.