FI74732B - Dna-oeverfoeringsvektor, vilken innehaoller en nukleotidsekvens som kodar foer tillvaexthormon. - Google Patents

Description

1 74732

Kasvuhormonia koodaavan nukleotidisekvenssin sisältävä DNA-siirtovektori

Jakamalla erotettu hakemuksesta 781675 5 Tämä keksintö koskee kasvuhormonia koodaavan nukleotidisekvenssin sisältävää DNA-siirtovektoria, jota voidaan käyttää mikro-organismin transformoinnissa.

Keksinnön mukaiselle DNA-siirtovektorille on 10 tunnusomaista, että se sisältää ihmisen kasvuhormonia koodaavan deoksinukleotidisekvenssin, joka on seu-raava: 5'— ttk1ccl2acl3atm4ccl5x6ty6qr7s7w8gz8x9ty9ttk10gak1,aak12 GCL13ATG14X15TY15W16GZ16GCL17CAK18W19GZ19X20Ty20CAK21CAJ22X23TY23 15 GCL24TTK25GAK26ACL27TAK28CAJ29GAJ30TTK31GAJ32GAJ33GCL34TAK35ATM36 CCL37AAJ38GAJ39CAJ40AAJ41TAK42QR43S43TTK44X45TY45CAJ46AAK47CCL48 CAJ49ACL50QR51s51x52TY52TGK53TTK54QR55S55GAJ56QR57S57A™58 ccl59acl60ccl61qr62s62aak63w64gz64gaj65gaj66acl67caj68caj69aaj70 QR71S71AAK72X73TY73GAJ74X75TY75X76TY76W77GZ77A™78QR79S79X80TY80X81 2C TY81X82TY82A™83CAJ84QR85S85TGG86X87TY87GAJ88CCL89GTL90CAJ91 TTK92X93TY93W94GZ94QR95S95GTL96TTK97GCL98AAK99iR100S100X101TY101 GTL1 02TAK103^104GCL105QR106S106GAK107QR108S108^109GTL110 TAK111GAK112X11 3TY11 3X11 4TY11 4*^11 5GAK11 6X11 7™11 7GAJ118GAJ11 9 GGL120A™121CAJ122ACL123X124TY124ATG125GGL126W127GZ127X128TY128 25 GAJl 29GAK1 30GGL1 31QRi 32Si 32CCL, 33Wi 34GZ, 3^ 35GGL1 3^3, A™1 38TTK1 39AAJl 40CAJ1 41ACL1 42TAK1 43QR1 44S1 44AAJ1 45TTK1 46 GAK1 47ACL1 48^*1 49QR150S150CAK15V52^153GAK154GCL155 X156TY156X157TY157AAJi58 ***159TAK160GGL161X162TY162X163TY163TAK164 TGK16 5TTK166W16 7GZ16 7^^^168GAK16 9ATG170GAK171 1 7 2GTL1 7 3GAJ1 7 4 30 ACL175TTK176X4 7yTY177W4 7gGZ178aTM17gGTL18QCAJ181TGK102W183 GZ183QR184S184GTL185GAJ186GGL187QR188S188TGK189GGL190 ttk191---3', jossa 2 74732 A on deoksiadenyyli, G on deoksiguanyyli, C on deoksisytosyyli, T on tymidyyli, 5 J on A tai G, K on T tai C, L on A, T, C tai G, M on A, C tai T, X on T tai C, jos Y on A tai G, ja C, jos Y n J n n 10 on C tai T, Y on A, G, C tai T, jos X on C, ja A tai G, n J n jos X on T, n

Wn on C tai A, jos Zon G tai A, ja C, jos Z on C tai T, n 15 Z on A, G, C tai T, jos W on C, ja A tai G, n n jos W on A, J n QRn on TC, jos Sn on A, G, C tai T, ja AG, jos S on T tai C, n

Sn on A, G, C tai T, jos QRn on TC, ja T tai C, 20 jos QR on AG, n ja alanumero n tarkoittaa ihmisen kasvuhormonin sen aminohapon asemaa, jota nukleotidisekvenssi vastaa geneettisen koodin mukaisesti ja aminohapot on numeroitu aminopäästä lukien.

25 Tässä selityksessä käytetään seuraavia symbole ja ja lyhenteitä:

DNA - deoksiribonukleiinihappo RNA - ribonukleiinihappo cDNA - komplementaarinen DNA

30 (syntetisoitu entsymaattisesti mRNA-sekvenssistä)

mRNA - lähetti-RNA tRNA - siirtäjä-RNA

dATP - deoksiadenosiinitrifosfaatti dTTP - deoksitymidiinitrifosfaatti 35 dGTP - deoksiguanosiinitrifosfaatti dCTP - deoksisytidiinitrifosfaatti A - adoniini, T - tyrniini, G - guaniini 3 74732 C - sytosiini

Tris - 2-amino-2-hydroksietyyli-l,3-propaanidioli EDTA - etyleenidiamiinitetraetikkahappo ATP - adenosiinitrifosfaatti 5 TTP - tymidiinitrifosfaatti

Hind III-tunnistuskohta - sekvenssi A ^AGCTT, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Hind ΙΙΙ-endonukleaasin avulla Hsu I-tunnistuskohta - sekvenssi A IaGCTT.spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Hsu I-endonukleaasin avulla.

10 Hae III-tunnistuskohta - sekvenssi GG Ice, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Hae ΙΙΙ-endonukleaasin avulla.

Col El - kolisiini El:ää muodostava plasmidi poly d A - polydeoksiadenylaatti 15 oligo d Ti2-18 “ oligodeoksitymidylaatti (12-18 emästä)

Alu I-tunnistuskohta - sekvenssi AG ^CT, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Alu I-endonukleaasin avulla.

BAm HI-tunnistuskohta - sekvenssi G |GATCC, spesifisesti 20 lohkaistu nuolen Bam HI - endonukleaasin avulla.

Bgl I-tunnistuskohta - sekvenssi GCCNNNN ^NGGC, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Bgl I-endonukleaasin avulla (Huom: N tarkoittaa nukleotidia).

Eco Rl-tunnistuskohta - sekvenssi G ^AATTC, spesifisesti 25 lohkaistu nuolen kohdalla Eco Rl-endonukleaasin avulla.

Eco RII-tunnistuskohta - sekvenssi icCAGG tai IcCTGG, spesifisesti . lohkaistu nuolen kohdalla Eco RII-endonukle-aasin avulla.

Hae II-tunnistuskohta - sekvenssi AGCGcIt, AGCGC«tc, 30 GGCGC \It tai GGCGC A C, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Hae II-endonukleaasin avulla.

Hinc II-tunnistuskohta - sekvenssi GTTAAC, GTTGAC, GTCAAG tai GTCGAC, spesifisesti lohkaistu Hinc II-endonukleaasin avulla.

35 Pst I-tunnistuskohta - sekvenssi CTGCA ^G , spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Pst I-endonukleaasin avulla.

Sai I-tunnistuskohta - sekvenssi G ^TCGAC, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Sai I-endonukleaasin avulla.

4 74732 4

Sst I - tunnistuskohta - sekvenssi GAGCT^C, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Sst I-endonukleaasin avulla.

DNA:n emässekvenssin biologinen merkitys on siinä, että se on geneettisen informaation säilytyspaikka. On 5 tunnettua, että DNA:n emässekvenssi on koodi, jonka mukaisesti kaikkien solun valmistamien proteiinien aminohappojen järjestys määräytyy. Lisäksi sekvenssin osilla saattaa olla tehtävänä säädellä proteiinin valmistusajankohtaa ja määrää.. Säätely-yksiköiden luonne tunnetaan vaillinaisesti. 10 Kunkin säikeen emässekvenssiä käytetään templaattina, kun DNA replikoituu solunjakaantumisessa.

Tapa, jolla DNA:n emässekvenssi-informaatiota käytetään proteiinien aminohappojärjestyksen määräämiseen, on pääpiirteiltään sama kaikilla elävillä organismeilla.

15 On osoitettu, että jokainen proteiineissa tavallisesti esiintyvä aminohappo määräytyy yhden tai useamman trinukleo-tidin eli triplettisekvenssin mukaan. Näin ollen jokaista proteiinia varten on olemassa vastaava DNA-segmentti, joka sisältää proteiinin aminohappojärjestystä vastaavan 20 triplettisekvenssin. Geneettinen koodi on esitetty seu-raavassa taulukossa.

Geneettinen koodi

25 Penyylialaniini (Phe) TTK Histidiini (His) CAK

Leusiini (Leu) XTY Glutamiini (Gin) CAJ

Isoleusiini (Ile) ATM Asparagiini (Asn) AAK

Metioniini (Met) ATG Lysiini (Lys) AAJ

Väliini (Vai) GTL Asparagiini-

30 Seriini (Ser) QRS happo (Asp) GAK

Proliini (Pro) CCL Glutamiini-

Treoniini (Thr) ACL happo (Glu) GAJ

Alaniini (Ala) GCL Kysteiini (Cys) TGK

Tyrosiini (Tyr) TAK Tryptofaani (Try) TGG

35 Päätesignaali TAJ Arginiini (Arg) WGZ

Päätesignaali TGA Glysiini (Gly) GGL

5 74732

Avain: Jokainen kolmen kirjaimen tripletti tarkoittaa DNA:n'trinukleotidia, jossa on 5,-pää vasemmalla ja 3’-pää oikealla. Kirjaimet edustavat puriini- ja pyrimidiiniemäk-siä, joista nukleotidisekvenssi muodostuu.

5 A = adeniini G = guaniini C = sytosiini T = tyrniini

X = T tai C, jos Y on A tai G, ja 10 X = G, jos Y on C tai T

Y = A, G, C tai T, jos X on C, ja

Y : A tai G, jos X on T

W = C tai A, jos Z on A tai G

W = C, jos Z on C tai T

15 Z = A, G, C tai T, jos W on C, ja

Z = A tai G, jos W on A QR = TC, jos S on A, G, C tai T QR = AG, jos S on T tai C S = A, G, C tai T, jos QR on TC 20 S = T tai C, jos QR on AG

J = A tai G

K = T tai C

L = A, T, C tai G M = A, C tai T

25 Transskriptioksi nimitetään ensimmäistä vaihetta siinä biologisessa prosessissa, jolla nukleotidisekvenssi-informaatio muunnetaan aminohapposekvenssiksi. Tässä vaiheessa kopioidaan ensin RNA:lla se DNA-segmentti, jonka sekvenssi määrittelee valmistettavan proteiinin. RNA on 30 samanlainen polynukleotidi kuin DNA paitsi, että deoksi-riboosi on korvattu riboosilla ja tymiinin tilalla käytetään urasiilia. RNA:n emäkset voivat asettua samanlaisiksi emäspareiksi kuin DNA:n emäkset. Näin ollen DNA-nukleo-tidisekvenssin RNA-transskriptio on komplementaarinen ko-35 pioitavan sekvenssin kanssa. Tällainen RNA on nimeltään lähetti-RNA (mRNA), koska sen tehtävänä on toimia välittä- 6 74732 jänä solun geneettisen järjestelmän ja proteiineja syntetisoivan järjestelmän välillä.

Solun sisällä käytetään mRNA:ta templaattina siinä monimutkaisessa prosessissa, johon sisältyy lukuisia ent-5 syymejä ja solujärjestelmiä, ja joka johtaa tietyn amino happosekvenssin syntymiseen. Tätä prosessia nimitetään mRNA:n translaatioksi.

Usein esiintyy myös lisävaiheita, joissa translaa-tioprosessissa syntetisoitu aminohapposekvenssi muunnetaan 10 funktionaaliseksi proteiiniksi.

Monet lääketieteen tai tutkimuksen kannalta merkittävät proteiinit sijaitsevat korkeampien organismien, kuten selkärankaisten, soluissa tai ovat näiden solujen valmistamia. Näitä ovat mm. peptidihormonit, kuten kasvuhor-15 moni. Näitä proteiineja on usein vaikea eristää käyttökelpoisia määriä, ja tämä ongelma on varsin vaikea ihmisistä peräisin olevien proteiinien kohdalla. Näin ollen tarvitaan menetelmiä, joilla tällaisia proteiineja voidaan valmistaa riittäviä määriä soluissa organismin ulkopuolella. Tietyis-20 sä tapauksissa on mahdollista saada aikaan sopivia solu- linjoja, joita voidaan pitää elossa kudosviljelyteknii-kalla. Kudosviljely on kuitenkin hidasta, elatusaine kallista, olosuhteiden säätely tarkkaa ja saanto pieni. Lisäksi on usein vaikeata säilyttää solulinja vakiona siten, et-25 tä halutut erityisominaisuudet säilyvät.

Sitä vastoin mikro-organismeja, kuten bakteereja, on suhteellisen helppo viljellä kemiallisesti määritellyissä elatusaineissa. Fermentointitekniikka on pitkälle kehittynyttä. Organismien viljeleminen nopeasti ja suurilla 30 saannoilla on mahdollista. Lisäksi eräät mikro-organismit ovat geeniensä ja ominaisuuksiensa puolesta perusteellisesti tutkittuja ja tunnettuja.

Näin ollen on erittäin toivottavaa pystyä siirtämään lääketieteellisesti merkittävän proteiinin geneettinen 35 koodi organismista, joka tavallisesti tekee proteiinin so pivaan mikro-organismiin. Tällä tavalla mikro-organismi voi syntetisoida proteiinia säädellyissä kasvuolosuhteissa 7 74732 ja proteiinia voidaan saada haluttu määrä. Valmistuskustannuksia voidaan ehkä myös oleellisesti pienentää, jos proteiinia syntetisoidaan tällaisella menetelmällä. Lisäksi mahdollisuus eristää ja siirtää tietyn proteiinin val-5 mistuksen määrittelevä geneettinen sekvenssi mikro-organismiin, jonka geneettinen tausta tunnetaan hyvin, tarjoaa suuriarvoisen tutkimuskeinon, kun halutaan tietää, kuinka tämän proteiinin synteesi on säädelty ja kuinka proteiinia muokataan synteesin jälkeen. Geneettisiä sekvenssejä voi-10 daan myös muuntaa niin, että saadaan terapeuttisilta tai funktionaalisilta ominaisuuksiltaan muuttuneita proteiineja.

Menetelmä, johon keksintö liittyy, on monivaiheinen menetelmä, joka sisältää entsyymien katalysoimia reaktioi-15 ta. Näiden entsyymireaktioiden luonnetta selostetaan tähän mennessä tiedossa olevien seikkojen perusteella.

Käänteistransskriptaasi (DNA-polymeraasi) katalysoi RNA-templaattisäikeen kanssa komplementaarisen DNA:n synteesiä RNA-templaatin, DNA-templaatin ja neljän deoksi-20 nukleosiditrifosfaatin, dATP, dGTP, dCTP ja dTTP, läsnä ollessa. Reaktio lähtee käyntiin DNA-templaatin ei-kova-lenttisella sitoutumisella mRNA:n 3'-päähän ja sen jälkeen seuraa tarvittavien deoksinukleotidien asteittainen liittäminen kasvavan ketjun 3'-päähän mRNA-nukleotidisekvenssin 25 määritteleminä emäspareina. Saatua molekyyliä voidaan pitää hiusneularakenteena, joka sisältää alkuperäisen RNA:n liittyneenä yksittäisellä DNA-säikeellä komplementaariseen DNA-säikeeseen. Käänteistransskriptaasi kykenee myös katalysoimaan samanlaisen reaktion käyttämällä yksisäikeistä 30 DNA-templaattia, jolloin saatu tuote on kaksisäikeinen DNA-hiusneula, jonka toisessa päässä säikeitä yhdistää yk-sisäikeinen DNA, ks. Aviv, H. ja Leder, P., Proc.Natl.

Acad. Sei. USA 69, 1408 (1972) ja Efstratiadis, A., Kafa-tos, F.C., Maxam, A.F. ja Maniatis, T., Cell 7, 279 (1976). 35 Restriktioendonukleaasit ovat entsyymejä, jotka pystyvät hydrolysoimaan fosfodiesterisidoksia kaksisäi-keisessä DNA:ssa niin, että DNA-säikeeseen muodostuu kat- 8 74732 koskohta. Jos DNA on suljetun silmukan muotoinen, silmukan rakenne muuttuu lineaariseksi. Tämän tyyppisen entsyymin pääasiallinen ominaisuus on siinä, että sen hydrolyyttinen vaikutus kohdistuu vain sellaiseen kohtaan, jossa on tiet-5 ty nukleotidisekvenssi. Tätä sekvenssiä nimitetään restrik-tioendonukleaasin tunnistuskohdaksi. Restriktioendonukle-aaseja on eristetty useista eri lähteistä ja karakterisoitu tunnistuskohtiensa nukleotidisekvenssien perusteella. Jotkut restriktioendonukleaasit hydrolysoivat fosfodieste-10 risidokset samasta kohdasta kummassakin säikeessä niin, että syntyy tylppä pää. Eräät katalysoivat sellaisten sidosten hydrolyysiä, joita erottaa toisistaan muutama nukleotidi, ja molekyylin kumpaankin päähän syntyy vapaa yk-sisäikeinen alue. Tällaiset yksisäikeiset päät ovat itse-15 komplementaarisia ja siten kohesiivisia, ja niitä voidaan käyttää hydrolysoidun DNA:n uudelleenliittämiseen. Koska tietyn entsyymin voidaan ennustaa pilkkovan saman tunnis-tuskohdan omaavia DNA-molekyylejä, syntyy samat kohesiivi-set päät, ja näin ollen on mahdollista yhdistää restriktio-20 endonukleaasilla käsiteltyjä heterologisia DNA-sekvenssejä muihin samalla tavalla käsiteltyihin sekvensseihin, ks. Roberts, R.J. Crit. Rev. Biochem. 4, 123 (1976). Restrik-tiokohdat ovat kuitenkin melko harvinaisia, mutta restrik-tioendonukleaasien käyttökelpoisuutta on voitu parantaa 25 syntetisoimalla sellaisia kaksisäikeisiä oligonukleotide- ja, joissa on tunnistuskohtasekvenssi. Näin ollen voidaan melkeinpä mikä tahansa DNA-segmentti liittää mihin tahansa toiseen segmenttiin siten, että molekyylin päihin liitetään tarvittava restriktio-oligonukleotidi, tuote asete-30 taan tarvittavan restriktioendonukleaasin vaikutukselle alttiiksi niin, että syntyy tarvittavat kohesiiviset päät, ks. Heyneker, H.L., Shine, J., Goodman, H.M., Boyer, H.W., Rosenberg, J., Dickerson, R.E., Narang, S.A., Itakura, K., Lin, S. ja Riggs, A.D., Nature 263, 748 (1976) ja Scheller, 35 R.H., Dickerson, R.E., Boyer, H.W., Riggs, A.D. ja Itakura, K., Science 196, 177 (1977).

9 74732 S1-endonukleaasi on yleisentsyymi, joka kykenee hydrolysoimaan yksisäikeisen DNA:n fosfodiesterisidoksia tai kaksisäikeisessä DNArssa olevia yksisäikeisiä liitoskohtia, ks. Vogt, V.M., Eur. J. Biochem. 33, 192 (1973).

5 DNA-ligaasi on entsyymi, joka kykenee katalysoi maan fosfodiesterisidoksen syntymisen kahden sellaisen DNA-segmentin välille, joissa on 5'-fosfaatti ja 3'-hyd-roksyyli, vastaavasti, ja jollainen saattaa muodostua kahdesta DNA-fragmentista, joita kohesiiviset päät pitä-10 vät yhdessä. Entsyymin normaalina toimintatapana pidetään sitä, että se yhdistää toisen säikeen rinnalle syntyvät useat tytär-DNA-fragmentit toisiinsa. DNA-ligaasi voi kuitenkin sopivissa olosuhteissa katalysoida sellaisten tylppien päiden yhtymisen, joissa kaksi tylppäpäistä mole-15 kyyliä yhtyy kovalenttisesti, ks. Sgaramella, V., Van de

Sande, J.H. ja Khorana, H.G., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 67, 1468 (1970).

Alkalinen fosfataasi on yleisentsyymi, joka kykenee hydrolysoimaan fosfaattiestereitä, DNA:n 5'-päätefosfaatit 20 mukaanluettuina.

Mainitun monivaiheisen menetelmän osavaiheessa sijoitetaan tietty DNA-fragmentti DNA-vektoriin, kuten plas-midiin. Plasmidi on nimitys, jota käytetään mistä tahansa itsenäisesti replikoituvasta DNA-yksiköstä, joka on mikro-25 bisolussa eikä kuulu isäntäsolun omaan genomiin. Plasmidi ei ole geneettisesti sitoutunut isäntäsolun kromosomiin. Plasmidi-DNA esiintyy rengasmaisina kaksisäikeisinä molekyyleinä, joiden molekyylipaino tavallisesti on muutama

Q

miljoona, joidenkin jopa yli 10 , ja ne edustavat taval-30 lisesti vain pientä prosenttimäärää solun kokonais-DNA: sta. Plasmidi-DNA voidaan tavallisesti suuren kokoeronsa vuoksi erottaa isäntäsolun DNA:sta. Plasmidit voivat replikoitua isäntäsolun jakaantumisnopeudesta riippumatta ja joskus niiden jakaantumisnopeutta voidaan säädellä kasvu-35 olosuhteita muuttamalla. Vaikka plasmidi esiintyykin suljettuna renkaana, siihen voidaan keinotekoisesti liittää DNA-segmentti niin, että syntyy molekyylipainoltaan suu- 10 74 7 32 rempi rekombinoitu plasmidi, jonka replikoitumiskyky ja geenien ekspressioitumiskyky eivät ole oleellisesti muuttuneet. Näin ollen plasmidi toimii hyödyllisenä vektorina, joka siirtää DNA-segmentin uuteen isäntäsoluun. Re-5 kombinoitua DNA:ta käyttävään teknologiaan soveltuvia plasmideja ovat varsinkin sellaiset, jotka sisältävät va-lintatarkoituksiin sopivia geenejä, kuten geenejä, jotka aiheuttavat lääkeaineiden vastustuskykyä.

Kyky siirtää tietyn korkeamman organismin normaa-10 lille aineenvaihdunnalle välttämättömän proteiinin geneet tinen koodi mikro-organismiin, kuten bakteeriin, avaa merkittäviä mahdollisuuksia tällaisten proteiinien tuottamiselle viljelemällä. Tämä taas tarjoaa merkittäviä mahdollisuuksia tällaisten proteiinien määrän lisäämiselle tai 15 korvaamiselle sellaisilla proteiineilla, jotka on valmistettu transformoiduilla mikro-organismeilla, kun korkeamman organismin kyky tuottaa tällaisia proteiineja on puutteellinen ja voidaan ajatella esimerkiksi mahdollisuutta saada aikaan symbioottinen suhde tämän keksinnön avulla 20 syntetisoidun mikro-organismin ja kroonista tai äkillistä puutostautia sairastavan ihmisen välille, jolloin tässä selostetulla tavalla geneettisesti transformoitu mikro-organismi siirrostettaisiin tai muulla tavalla liitettäisiin ihmiseen kompensoimaan ihmisen aineenvaihdunnassa 25 ilmenevää patologista puutteellisuutta.

Esimerkkeinä tähän keksintöön kuuluvista spesifisistä DNA-sekvensseistä siirretään rotan kasvuhormonin ja ihmisen kasvuhormonin rakennegeeni bakteeriin. Kyseisessä prosessissa haluttu solukko eristetään ensin paran-30 netulla menetelmällä. mRNA eristetään soluista muuttumattomana uudella menetelmällä, jossa RNA-aasiaktiivisuus on käytännöllisesti katsoen kokonaan hävitetty. Vahingoittumaton mRNA puhdistetaan uutteesta pylväskromatografisesti ja se saatetaan käänteistransskriptaasientsyymin vaikutuk-35 selle alttiiksi komplementaarisen säikeen (cDNA) synteti- soimisessa tarvittavien neljän deoksinukleosiditrifosfaa-tin läsnäollessa. Tässä ensimmäisessä vaiheessa käänteis- 11 74732 transskriptaasin avulla saatuun tuotteeseen kohdistetaan menettely, jolla ribonukleotidisekvenssi poistetaan selektiivisesti. Jäljelle jäänyttä deoksinukleotidisekvenssiä, joka on komplementaarinen alkuperäisen mRNArn kanssa, 5 inkuboidaan toisessa reaktiossa käänteistransskriptaasin tai DNA-polymeraasin kanssa neljän deoksinukleosiditri-fosfaatin läsnäollessa. Saatu tuote on kaksinkertainen cDNA, jonka komplementaariset säikeet ovat liittyneet toisiinsa yksinkertaisella säikeellä toisesta päästä. Siten 10 tämä tuote käsitellään yksinkertaiselle säikeelle spesifisellä nukleaasilla, joka katkaisee yksinkertaisen yhdistävän säikeen. Saatua kaksisäikeistä cDNA:ta pidennetään lisäämällä kumpaankin päähän tietty DNA, joka sisältää restriktioentsyymin tunnistuskohdan sekvenssin. Lisäys 15 katalysoidaan DNA-ligaasi-entsyymilla. Tämän jälkeen pidennetty cDNA käsitellään restriktioendonukleaasilla, joka tuottaa itsekomplementoituvat yksisäikeiset päät kak-soissäikeen kummankin säikeen 5'-päähän.

Plasmidi-DNA, jossa on saman restriktioendonukleaa-20 sin tunnistuskohta, käsitellään entsyymillä siten, että polynukleotidisäie katkeaa ja muodostuu itsekomplementoituvat yksisäikeiset nukleotidisekvenssit 5'-päihin. Yksi-säikeisten päiden 5'-päätefosfaattiryhmät poistetaan, jotta plasmidi ei pystyisi muodostamaan isäntäsolua trans-25 formoivaa rengasrakennetta. Valmistettua cDNA:ta ja plas-midi-DNA:ta inkuboidaan yhdessä DNA-ligaasin läsnäollessa. Kuvatuissa reaktio-olosuhteissa voi elinkelpoinen suljettu rengasplasmidi-DNA syntyä vain, jos siihen sisältyy cDNA-segmentti. cDNA-sekvenssin sisältävä plasmidi siirre-30 tään tämän jälkeen sopivaan isäntäsoluun. Sellaiset solut, jotka ovat saaneet elinkelpoisen plasmidin, tunnistetaan kasvatuksessa pesäkkeistä, joilla on plasmidille kuuluva geneettinen ominaisuus, kuten lääkkeenvastustuskyky. Tämän jälkeen viljellään niitä puhtaita bakteerikantoja, joissa 35 on cDNA-sekvenssin sisältävä rekombinoitu plasmidi, ja rekombinoitu plasmidi eristetään uudelleen. Tällä tavalla voidaan valmistaa suuria määriä rekombinoitua plasmidi- 12 74732 DNA:ta ja spesifinen cDNA-sekvenssi voidaan eristää tästä endonukleolyyttisellä lohkaisulla sopivan restriktioentsyy-min avulla.

Tämä Keksintö liittyy menetelmään, jolla tietyn nuk-5 leotidisekvenssin omaava DNA-molekyyli voidaan eristää ja siirtää mikro-organismiin ja alkuperäinen DNA:n nukleoti-disekvenssi löytää replikoitumisen jälkeen organismista.

Menetelmän eri vaiheet voidaan jakaa neljään ryhmään.

10 1. Halutun solukon eristäminen korkeammasta orga nismista

Tietyn proteiinin geneettiselle koodille on olemassa kaksi mahdollista lähdettä, nimittäin lähdeorganismin DNA tai DNA:n RNA-transskriptio. Yhdysvaltain kansallisten 15 terveysinstituuttien (National Institutes of Health) tä mänhetkisten turvallisuusvaatimusten mukaan ihmisen geenejä, olivatpa ne millaisia tahansa, voidaan sijoittaa rekombinoituun DNA:hän ja sen jälkeen bakteereihin vain silloin, kun geenit ovat perusteellisesti puhdistettuja, 20 tai kun käytössä on erityisen suuria riskejä sisältävälle työskentelylle tarkoitetut tilat (P4), ks. Federal Register, Voi. 41, No. 131, 1967-07-07, s. 27902-27943. Näin ollen missä tahansa ihmisen proteiinin valmistukseen tähtäävässä menetelmässä, kuten tämän keksinnön sisältämässä mene-25 telmässä, on lähdettävä sellaisen spesifisen mRNA:n eristämisestä, joka sisältää halutun proteiinin koodin. Tässä toimintatavassa on lisäksi se etu, että solusta uutettu mRNA voidaan puhdistaa helpommin kuin solusta uutettu DNA. Varsinkin on mahdollista käyttää hyväksi sitä seikkaa, 30 että pitkälle erikoistuneissa organismeissa, kuten selkärankaisissa, on tietyissä paikoissa tiettyjä solukkoja, joiden tehtävänä on tuottaa jotakin kyseeseen tulevaa proteiinia. Vaihtoehtoisesti tällainen solukko voi esiintyä jossakin organismin kehitysvaiheessa. Suurin osa täl-35 laisen solukon soluista eristetystä mRNA:sta sisältää halutun nukleotidisekvenssin. Näin ollen eristettävän solukon ja eristysmenetelmän valinnassa voidaan ottaa huo- 13 74732 mioon ne edut, joita eristettävän mRNA:n alkuperäinen puhtausaste tarjoaa.

Useimmissa kudoksissa, rauhasissa ja elimissä soluja yhdistää kuituinen sidekudos, joka on koostunut pääasias-5 sa kollageenista, mutta voi kudoksesta riippuen sisältää myös muita rakenneproteiineja, polysakkarideja ja kiven-näisainevarastoja. Solujen eristäminen tietystä kudoksesta edellyttää menetelmiä, joilla solut voidaan irrottaa sidekudoksesta. Tietyn erikoistuneen solutyypin eristämi-10 nen ja puhdistaminen sisältää näin ollen kaksi päävaihetta, jotka ovat solujen erottaminen sidekudoksesta ja halutun solutyypin erottaminen muun tyyppisistä kudoksen soluista.

Usein on todettu, että halutun mRNAjn osuutta voi-15 daan lisätä, jos käytetään hyväksi solun kykyä reagoida ulkoisiin ärsykkeisiin. Esimerkiksi hormonikäsittely saattaa aiheuttaa halutun mRNA:n tuotannon lisääntymisen. Muita menetelmiä ovat kasvatus tietyssä lämpötilassa ja/tai tietyssä ravinteessa tai muussa kemiallisessa aineessa.

20 Eristettäessä rotan kasvuhormonin mRNA:ta viljeltyjen rotan aivolisäkesolujen käsittely kilpirauhashormonilla ja glukokortikoideilla lisäsi synergistisesti kasvuhormonin mRNA:n määrää merkittävästi.

2. mRNA:n uuttaminen 25 Tärkeä piirre tässä keksinnössä on se, että solu- uutteesta poistetaan RN-aasiaktiivisuus käytännöllisesti katsoen kokonaan. Uutettava mRNA on yksisäikeinen poly-nukleotidi, jossa ei ole mitään komplementaarista säiettä. Näin ollen yhdenkin fosfodiesterisidoksen hydrolyyttinen 30 katkeaminen sekvenssissä tekisi koko molekyylin kykenemät tömäksi siirtämään vahingoittumatonta geneettistä sekvenssiä mikro-organismiin. Kuten edellä mainittiin, RN-aasi on laajalle levinnyt ja se on hyvin aktiivinen ja poikkeuksellisen pysyvä. Sitä on iholla, se kestää tavalli-35 set lasitavaroiden pesumenetelmät ja joskus se kontaminoi orgaaniset kemikaalit.

14 74732 Tässä keksinnössä käytetään kaotrooppisen anionin, kaotrooppisen kationin ja disulfidisidoksia pilkkovan rea-genssin yhdistelmää solujen rikkomisen aikana ja kaikkien niiden operaatioiden aikana, jotka tarvitaan käytännölli-5 sesti katsoen proteiinittoman RNA:n aikaansaamiseksi.

Sopivien kaotrooppisten ionien valinta riippuu niiden vesiliukoisuudesta ja saatavuudesta. Sopivia kaotroop-pisia kationeja ovat mm. guanidinium, karbamoyyliguanidium, guanyyliguanidinium, litium tms. Sopivia kaotrooppisia 10 anioneja ovat mm. jodidi, perkloraatti, tiosyanaatti, dijodisalisylaatti tms. Tällaisten anionien ja kationien muodostamien suolojen suhteellinen tehokkuus määräytyy niiden liukoisuuden mukaan. Esimerkiksi litiumdijodisali-sylaatti on voimakkaampi denaturantti kuin guanidiniumtio-15 syanaatti, mutta sen liukenevuus on vain noin 0,1 mol/1 ja se on myös suhteellisen kallista. Guanidiniumtiosya-naatti on etusijalle asetettava kationi-anioniyhdistelmä, koska sitä on helposti saatavissa ja sen liukenevuus vesiliuoksiin on hyvä, jopa noin 5 mol/1.

20 Tioliyhdisteiden, kuten B-merkaptoetanolin, tiede tään rikkovan tioli-disulfidivaihtoreaktiolla proteiinien molekyylinsisäisiä disulf idisidoksia. (5-merkaptoetanolin lisäksi tunnetaan useita sopivia tioliyhdisteitä, kuten ditiotreitoli, kysteiini, propanolidimerkaptaani tms.

25 Vesiliukoisuus on tarpeellinen vaatimus, sillä tioliyhdis- tettä pitää olla läsnä suuri ylimäärä molekyylinsisäisiin disulfideihin verrattuna, jotta vaihtoreaktio tapahtuisi käytännöllisesti katsoen täydellisesti, β-merkaptoetano-li on asetettava etusijalle, koska sitä on helposti saata-30 vissa kohtuulliseen hintaan.

Tietyn kaotrooppisen suolan tehokkuus on suoraan verrannollinen sen väkevyyteen, kun halutaan inhiboida RN-aasi uutettaessa RNA:ta soluista tai kudoksista. Edullinen väkevyys on sen vuoksi suurin käytännössä toteutet-35 tavissa oleva väkevyys. Sen, että tässä keksinnössä onnistutaan säilyttämään mRNA vahingoittumattomana uuton aikana, arvellaan johtuvan siitä nopeudesta, jolla RN-aasi ,5 74732 denaturoituu, ja denaturoitumisasteesta. Näin ilmeisesti selittyy guanidiniumtiosyanaatin paremmuus hydrokloridiin nähden, vaikka hydrokloridi on denaturointiaineena vain hieman heikompi. Denaturointiaineen tehokkuus määritellään 5 siksi kynnysväkevyydeksi, joka tarvitaan proteiinin täydel liseen denaturoimiseen. Toisaalta proteiinien denaturoitu-misnopeus riippuu usein denaturantin väkevyyden suhteesta kynnysarvoon 5-10 potenssiin korotettuna, ks. Tanford, C.A., Adv. Prot. Chem. 23, 121 (1968). Kvalitatiivisesti 10 tämä suhde merkitsee sitä, että guanidiniumhydrokloridia vain hieman tehokkaampi denaturantti pystyy denaturoimaan proteiinin monta kertaa nopeammin samana konsentraationa. RN-aasidenaturaation kinetiikan ja mRNA:n säilymisen välistä suhdetta soluista tapahtuvan uuton aikana ei nähtä-15 västi ole havaittu eikä tutkittu ennen tätä keksintöä.

Jos edellä oleva analyysi on oikea, pitäisi edullisen denaturantin olla sellainen, jolla on matala kynnysväkevyys denaturoinnissa ja suuri vesiliukoisuus. Tämän vuoksi gua-nidiniumtiosyanaatti on edullisempi kuin litiumdijodisali-20 sylaatti, vaikka viimeksimainittu on voimakkaampi denatu rantti, sillä guanidiniumtiosyanaatti on liukoisempi, ja näin ollen sitä voidaan käyttää sellaisena väkevyytenä, että RN-aasi inaktivoituu nopeammin. Edellä oleva analyysi selittää myös, miksi guanidiniumtiosyanaatti, joka on hieman 25 voimakkaampi denaturantti, on edullisempi kuin lähes yhtä liukoinen hydrokloridi.

Disulfidisidoksia katkaisevan reagenssin käyttö yhdessä denaturantin kanssa tekee mahdolliseksi jälkimmäisen vaikutuksen ja tehostaa sitä, koska RN-aasimolekyyli muut-30 tuu kokonaan avautuneeksi. Tioliyhdisteen ajatellaan auttavan denaturointiprosessin etenemistä, koska se estää nopean denaturoinnin, joka voi tapahtua, jos molekyylin-sisäiset disulfidisidokset jätetään koskemattomiksi. Lisäksi mRNA-valmisteen sisältämä RN-aasiepäpuhtaus säilyy 35 käytännöllisesti katsoen inaktiivisena, vaikka denaturant-tia ja tiolia ei olisikaan läsnä. Disulfidisidoksia katkaisevat reagenssit, joissa on tioliryhmiä, ovat jossain ie 74732 määrin tehokkaita minä tahansa konsentraationa, mutta on edullista käyttää suurta tioliryhmien ylimäärää molekyy-linsisäisiin disulfidisidoksiin verrattuna, jolloin vaihtoreaktio saadaan ajetuksi molekyylinsisäisten di-5 sulfidisidosten katkeamisen suuntaan. Toisaalta, koska monet tioliyhdisteet ovat pahanhajuisia ja suurten väkevyyksien kanssa on epämiellyttävä työskennellä, on käytännön syistä olemassa väkevyyden yläraja. Kun 8-merkap-toetanolia käytetään vahingoittumattoman RNA: n erottami-10 seen, on alueella 0,05-1,0 mol/1 olevat väkevyydet ha vaittu tehokkaiksi, ja optimaalisen väkevyyden katsotaan olevan 0,2 mol/1.

Väliaineen pH voi olla missä tahansa välillä 5,0- 8,0, kun mRNA uutetaan soluista.

15 Solujen rikkomisen jälkeen RNA erotetaan solun proteiineista ja DNA:sta. Tähän tarkoitukseen on kehitetty useita menetelmiä. Tavallinen menetelmä on etanoli-saostus, jolla RNA saostetaan selektiivisesti. Tämän keksinnön sisältämässä menetelmässä on edullisempaa jättää 20 saostusvaihe pois ja kerrostaa homogenaatti suoraan 5,7 mol/1 cesiumkloridilluokseen sentrifugiputkessa ja sen jälkeen suorittaa sentrifugointi julkaisussa Glisin, V., Crkvenjakov, R. ja Buys, C., Biochemistry 12, 2633 (1974) kuvatulla tavalla. Tämä menetelmä on edullinen, koska RN-25 aasille vahingollinen ympäristö voidaan säilyttää koko ajan ja saadaan hyvällä saannolla RNA:ta, joka ei sisällä DNA:ta eikä proteiinia.

Edellä kuvatulla menetelmällä saadaan soluhomoge-naatin koko RNA puhdistetuksi. Tästä RNAtsta on kuiten-30 kin haluttua mRNA:ta vain osa. Puhdistusta jatkettaessa käytetään hyväksi sitä seikkaa, että korkeampien organismien soluissa mRNA:ta prosessoidaan transskription jälkeen siten, että siihen liitetään polyadenyylihappoa. Tällainen poly-A-sekvenssejä sisältävä mRNA voidaan erot-35 taa selektiivisesti kromatografiapylväässä, jossa on täytteenä selluloosaa, johon on liitetty oligotymidylaat-tia, ks. Avis, H. ja Leder, P., edellä. Edellä kuvattu 17 74732 menetelmä on sopiva silloin, kun tarvitaan käytännöllisesti katsoen puhdasta, vahingoittumatonta ja translaatio-kelpoista mRNA:ta RN-aasia runsaasti sisältävistä lähteistä. mRNA:n puhdistus ja sen jälkeiset in vitro-toi-5 menpiteet voidaan suorittaa käytännöllisesti katsoen samalla tavalla mille tahansa mRNArlle huolimatta lähde-organismista .

Tietyissä tapauksissa, kuten käytettäessä kudos-viljelmäsoluja mRNA-lähteenä, RN-aasiepäpuhtaus voi olla 10 niin vähäinen, ettei edellä kuvattua RN-aasin inhibointia tarvita. Tällöin ennestään tunnetut RN-aasiaktiivisuuden poistomenetelmät riittävät.

3. cDNA:n muodostaminen Tässä yhteydessä viitataan kuvioon 1, jossa on 15 kaavioesitys menetelmän jäljellä olevista vaiheista. En simmäisenä vaiheena on puhdistetun mRNA:n kanssa komplementaarisen DNA-sekvenssin muodostaminen. Tämän reaktion entsyymiksi valitaan käänteistransskriptaasi, vaikka periaatteessa voitaisiin käyttää mitä tahansa sellaista ent-20 syymiä, joka kykenee muodostamaan komplementaarisen DNA- säikeen käyttämällä mRNA:ta templaattina. Reaktio voidaan suorittaa ennestään tunnetuissa olosuhteissa siten, että mRNA:ta käytetään templaattina ja neljän deoksinukleosidi-trifosfaatin seosta DNA-säikeen prekursorina. On edullis- 25 ta, jos yksi deoksinukleosiditrifosfaateista on merkitty 32 α-asemassa P-atomilla, sillä sen avulla voidaan seurata reaktiota, se toimii merkkinä erotusmenetelmissä, kuten kromatografiässä ja elektroforeesissa, ja sen avulla voidaan tehdä kvantitatiivisia päätelmiä, ks. Efstratiadis, 30 A., et ai., edellä.

Kuten kuviosta ilmenee, käänteistransskriptaasin reaktiotulos on kaksisäikeinen hiusneularakenne, jossa RNA-säiettä ja DNA-säiettä yhdistää toisiinsa ei-kovalent-tinen sidos.

35 Käänteistransskriptaasireaktion tuote poistetaan reaktioseoksesta tunnetuilla menetelmillä. On havaittu ,8 74732 hyödylliseksi käyttää fenoliuuton, kromatografiän ("Sepha-dex ^G-l00", Pharmacia Inc., Uppsala, Ruotsi) ja etanoli-uuton yhdistelmää.

Kun cDNA on syntetisoitu entsymaattisesti, RNA-temp-5 laatti voidaan poistaa. Ennestään tunnetaan useita menetel miä, joilla RNA voidaan hajottaa selektiivisesti DNA:n läsnäollessa. Alkalinen hydrolyysi on edullinen menetelmä, koska se on hyvin selektiivinen ja sitä voidaan helposti säädellä pH:n avulla.

10 Alkalisen hydrolyysin ja neutraloinnin jälkeen 32 P:llä merkitty cDNA voidaan haluttaessa väkevöidä etanoli saostuksella.

Tällaisen kaksisäikeisen hiusneula-cDNA:n syntetisointi tapahtuu sopivan entsyymin, kuten DNA-polymeraasin 15 tai käänteistransskriptaasin avulla. Reaktio-olosuhteet 32 ovat aikaisemmin kuvatun kaltaiset, a- P:llä merkitty nukleosiditrifosfaatti mukaanluettuna. Käänteistransskrip-taasia saadaan useista lähteistä. Linnun Myeloblastosis-virus on edullinen lähde. Virusta valmistaa tohtori D.J.

20 Beard, Life Sciences Incorporated, St. Petersburg, Florida,

National Institutes of Health'in kanssa tekemällään sopimuksella.

Kun cDNA-hiusneula on muodostettu, saattaa olla edullista puhdistaa se reaktioseoksesta. Kuten aikaisem-25 min mainittiin, on edullista käyttää fenoliuuttoa, kromatograf iaa ("SephadeiPb-100") ja etanolisaostusta, kun DNA halutaan saada puhdistetuksi proteiiniepäpuhtauksista.

Hiusneularakenne voidaan muuntaa tavalliseksi kak-sisäikeiseksi DNA-rakenteeksi siten, että komplementaari-30 siä säikeitä yhdistävä yksittäinen säie poistetaan. On olemassa useita entsyymejä, jotka kykenevät spesifisesti hydrolysoimaan DNA:n yksisäikeisiä osia. Tähän tarkoitukseen hyvin sopiva entsyymi on Aspergillus oryzaesta eristetty S1-nukleaasi (valmistaja Miles Research Products, 35 Elkhart, Indiana). Kun DNA-hiusneularakenne käsitellään S1-nukleaasilla, saadaan hyvällä saannolla sellaisia molekyylejä, joissa on emäsparipäät. Tämän jälkeen suorite- 19 7473? taan uutto, kromatografia ja etanolisaostt.s, kuten edellä on kuvattu. Efstratiadis et ai. ovat edellä mainitussa julkaisussa selostaneet mRNA:n kaksisäikeisten cDNA-transskrip-tioiden syntetisointia käänteistransskriptaasin ja S1-nuk- 5 leaasin avulla.

Tylppäpäisten cDNA-molekyylien osuutta voidaan mahdollisesti lisätä, jos suoritetaan käsittely E. colin DNA-polymeraasi I:llä neljän deoksinukleosiditrifosfaatin läsnäollessa. Entsyymin eksonukleaasiaktiivisuuden ja po-10 lymeraasiaktiivisuuden yhteisvaikutus toimii siten, että ulkoneva 31-pää poistuu ja ulkoneva 5'-pää täyttyy. Näin voidaan varmistaa, että mahdollisimman suuri määrä cDNA-molekyylejä osallistuu seuraavan vaiheen liittämisreaktioi-hin.

15 Keksinnön mukaisen menetelmän seuraavassa vaihees sa käsitellään cDNA-tuotteen päät niin, että kuhunkin päähän saadaan restriktioendonukleaasin tunnistuskohdan sekvenssi. Käytännön syyt määräävät päihin liitettävän DNA-fragmentin valinnan. Päihin lisättävä sekvenssi vali-20 taan restriktioendonukleaasin perusteella ja tämä puoles taan valitaan sen DNA-vektorin perusteella, johon cDNA liitetään. Valittavassa plasmidissa pitäisi olla vähintään yksi kohta, johon restriktioendonukleaasin katkaisu-vaikutus voi kohdistua. Esimerkiksi plasmidi pMB9 sisäl-25 tää yhden tunnistuskohdan entsyymille Hind III. Hind III eristetään Haemophilus influenzaesta ja puhdistetaan seu-raavalla menetelmällä: Smith, H.O. ja Wilcox, K.W., J.

Mol.Biol. 51, 379 (1970). Haemophilus aegyptious-orga-nismin entsyymi Hae III puhdistetaan seuraavalla menetel-30 mällä: Middleton, J.H., Edgell, M.H. ja Hutchinson III, C.A., J. Virol. 10, 42 (1972). Haemophilus suis-organis-min entsyymi, Hsu I, katalysoi saman paikkaspesifisen hydrolyysin samassa tunnistuskohdassa kuin Hind III. Näin ollen näitä kahta entsyymiä voidaan pitää funktionaali-35 sesti vaihtoehtoisina.

Kaksois-cDNA:n päihin liittämistä varten on edullista käyttää kemiallisesti syntetisoitua kaksisäikeistä 20 74732 dekanukleotidia, joka sisältää Hind III:n tunnistuskohdan. Kaksisäikeisen dekanukleotidin sekvenssi on esitetty kaviossa 1, ks. Heyneker, H.L., et ai. ja Scheller, R.H., et ai. edellä. Alalla työskenteleville on tarjolla useita 5 tällaisia tunnistuskohtasekvenssejä, ja tästä syystä on mahdollista valita kaksois-DNA:n päät, kussakin tapauksessa tarvittavalle restriktioendonukleaasille sopiviksi.

Restriktiokohtasekvenssien liittäminen cDNA:n päihin voidaan toteuttaa menetelmällä, jota nimitetään tylp-10 pään päähän liittämiseksi, ja jolloin katalysoidaan DNA-ligaasilla, joka on puhdistettu seuraavalla menetelmällä: Panet, A., et ai., Biochemistry 12, 5045 (1973). Edellä mainitut Sgaramella, V., et ai. ovat selostaneet tylppään päähän liittämisreaktiota. Tylppään päähän liittämisessä, 15 jossa reaktio tapahtuu tylppäpäisen cDNA:n ja suuren mo- laarisen ylimäärän kanssa kaksisäikeistä dekanukleotidia, joka sisältää Hind III endonukleaasin tunnistuskohdan, saadaan tuotteeksi cDNA, jonka kummassakin päässä on Hind III:n restriktiokohtasekvenssi. Kun reaktiotuote käsitel-20 lään Hind ΙΙΙ-endonukleaasilla, tapahtuu katkeaminen re- striktiokohdassa ja muodostuu yksisäikeiset itsekomplemen-toituvat 5'-päät, kuten kuviosta 1 ilmenee.

4. Yhdistelmä-DNA:n siirtovektorin muodostaminen Periaatteessa voitaisiin käyttää monenlaisia virus-25 ja plasmidi-DNA-molekyylejä muodostettaessa rekombinaatte- ja juuri kuvatulla tavalla valmistetun cDNA:n kanssa. Pää-vaatimuksia ovat, että DNA:n siirtovektori kykenee menemään isäntäsoluun ja replikoituinaan siellä, ja vektorilla pitäisi olla sellainen geneettinen ominaisuus, jonka avul-30 la voidaan erottaa ne isäntäsolut, jotka ovat saaneet vek torin. Yleisistä turvallisuussyistä pitäisi valinta kuitenkin rajoittaa koetyyppiin soveltuviin siirtovektorila-jeihin NIH:n ohjeita noudattaen, ks. edellä. Tällä hetkellä käyttöön hyväksyttyjä sopivia siirtovektoreita ovat mm. 35 useat bakteriofagilambdajohdannaiset (ks. esim. Blattner, F.R., Williams, B.G., Blechl, A.E., Denniston-Thompson, K., Faber, H.E., Furlong, L.A., Grunwald, D.J., Kiefer, 21 74732 D.O., Moore, D.D., Schumm, J.W., Sheldon, E.L. ja Smithies, 0., Science 196, 161 (1977) ja col E1-plasmidijohdannaiset (ks. esim. Rodriquez, R.L., Bolivar, S., Goodman, H.M., Boyer, H.W. ja Betlach, M.N., ICN-UCLA Symposium on 5 Molecular Mechanisms In the Control of Gene Expression, D.P. Nierlich, W.J. Rutter, C.F. Fox, Eds. (Academic Press, NY, 1976) ss. 471-477). Col El:stä johdetuille plasraideil-le on ominaista suhteellisen pieni koko, sillä niiden mo-lekyylipaino on muutaman miljoonan luokkaa, ja se, että 10 normaaliolosuhteissa plasmidi-DNA:n kopioiden luku isän- täsolua kohti on 20-40, mutta se saadaan nostetuksi tuhanteen tai sitäkin suuremmaksi, kun isäntäsolut käsitellään kloramfenikolilla. Isäntäsolun kyky suurentaa sisältämään-sä geenimäärää tekee tietyissä olosuhteissa tutkijan sää-15 dellessä mahdolliseksi sen, että isäntäsolu tuottaa pääasiassa plasmidigeenien koodaamia proteiineja. Näin ollen tällaiset col E1-johdannaiset ovat edullisia siirto-vektoreita tämän keksinnön sisältämässä menetelmässä. Sopivia col E1-johdannaisia ovat mm. plasmidit pMB-9, jonka 20 sisältämä geeni aiheuttaa vastustuskyvyn tetrasykliinille, ja pBR313, pBR315, pBR316, pBR317 ja pBR322, jotka sisältävät tetrasykliiniresistenssin geenin ja ampisilliini-resistenssin geenin. Resistenssiä aiheuttavan geenin läsnäolo tarjoaa sopivan keinon, jolla voidaan valita solut, 25 jotka ovat infektoituneet plasmidilla, sillä tällaiset pesäkkeet kasvavat lääkkeen läsnäollessa, mutta jos plas-midia ei ole, solut eivät kasva. Tämän selityksen sisäl-tämissä esimerkeissä käytettiin col E1:stä johdettua plas-midia, joka sisälsi em. resistenssigeenin ja yhden Hind 30 III-tunnistuskohdan.

Plasmidi pBR322 on pitkälle karakterisoitu.

Bolivar, F. et ai. (Gene 2 (1977) 95) on kuvannut tämän plasmidin syntetisoinnin ja karakterisoinnin. Plasmidin pBR322 molekyylipaino on 2,7 x 10 daltonia (Bolivar, F., 35 Gene 4 (1978) 121), ja se sisältää ampisilliiniresistens-

R R

sin (Ap tn) ja tetrasykliiniresistenssin (Te :n) aiheut- tavat geenit. Edellä mainitussa Ap -geenissä on yksi 22 7 4 7 3 2 £ endonukleaasin Pst 1 tunnistuskohta. Te -geenissä on yksi tunnistuskohta kullekin seuraavista endonukleaaseista:

Hind III, Sal I ja Bam HI. Lisäksi pBR322 sisältää yhden Eco RI:n tunnistuskohdan, kaksi Hind II:n tunnistuskohtaa, 5 viisi Eco RII:n tunnistuskohtaa, kolme Bgl I:n tunnistuskohtaa, 12 Alu I:n tunnistuskohtaa, 12 Hae II:n tunnistuskohtaa ja 17 Hae III:n tunnistuskohtaa. Tunnistuskohdat on merkitty renkaan muotoiseen pBR322-plasmidiin sivul- p la 103 Bolivarin et ai. julkaisussa. Ap -geeni häviää loh-10 kaistaessa plasmidi Pst I:n tunnistuskohdasta ja liitet-täessä vierasta DNA:ta siihen. Samoin Te häviää lohkaistaessa pBR322 endonukleaaseilla Hind III, Vai I tai Bam I ja liitettäessä vierasta DNA:ta niiden tunnistuskohtaan. Liitettäessä DNA Pst I:n tunnistuskohtaan muodostuu rekom- 15 binaatiomolekyylejä, jotka voidaan todeta kannoista, jotka c ovat sekä ampisilliinisensitiivisiä (Ap ) että tetrasyk-liiniresistenttejä (Te ) samoin liittämällä DNA Hind III:n Sai I:n tai Bam HI:n tunnistuskohtaan muodostuu rekombi-naatiomolekyylejä, jotka voidaan todeta kannoista, jotka 20 ovat sekä ampisilliiniresistenttejä että tetrasykliini- sensitiivisiä. Siirtovektori, joka sisältää johonkin edellä mainittuun neljään tunnistuskohtaan liitettyä vierasta DNA:ta, voidaan karakterisoida siirtovektorin lääkeaine-resistenssiominalsuuksien perusteella eli siitä, onko se 25 ampisilliinisensitiivinen ja tetrasykliiniresistentti tai ampisilliiniresistentti ja tetrasykliinisensitiivinen. Siirtovektori voidaan edelleen karakterisoida poistamalla siihen liitetty vieras DNA, määrittämällä muodostuneiden kahden tuotteen molekyylipaino ja vertaamalla näitä läh-30 töaineiden molekyylipainoihin. Lisäksi karakterisointia voidaan täydentää merkitsemällä siirtovektoriin eri endo-nukleaasien tunnistuskohdat. Siirretyn DNA-molekyylin sekvenssi voidaan myös määrittää. Mainitun plasmidin pBR322 koko nukleotidisekvenssi on esitetty J. Sutcliffen väitös-35 kirjassa "Nucleotide Sequence of pBR322", Harvard University, Cambridge, Massachusetts, USA.

23 74732

Samoin plasmidia pBR313 on pitkälle karakterisoitu. Tämän plasmidin syntetisoinnin ja karakterisoinnin ovat kuvanneet Bolivar, F. et ai. (Gene 2, (1977) 75). Plasmidin pBR313 molekyylipaino on 5,8 x 10^ daltonia, ja se £ 5 sisältää ampisilliiniresistenssin (Ap ) ja tetrasykliini- resistenssin (Te ) aiheuttavat geenit. Plasmidin pBR313 £

Te -geenissä on yksi tunnistuskohta kullekin seuraavista nukleaaseista: Hind III, Sal I ja Bam HI. Plasmidin pBR313 tunnistuskohdat eri endonukleaaseille on määritetty täydel-10 lisesti, ja tästä tuloksena saatu tunnistuskohtakartta on esitetty sivulla 84 Bolivarin et ai. julkaisussa. Liitettäessä vierasta DNA:ta Hind III:n, Sai I:n tai Bam HI:n tunnistuskohtaan tetrasykliiniresistenssi häviää. Täten yhdistelmä-DNA-molekyylejä löydetään kannoista, jotka ovat 15 sekä ampisilliiniresistenttejä että tetrasykliinisensitii- visiä. Siirtovektori voidaan karakterisoida lääkeainere-sistenssiominaisuuksien, siirretyn DNA-sekvenssin, restrik-tioentsyymien tunnistuskohtakartan ja edellä mainittujen molekyylipainojen perusteella.

20 Kolmas plasmidi, jota on pitkälle karakterisoitu, on pMB9. Tämän plasmidin valmistusmenetelmän ovat esittäneet Rodriguez, R.L. et ai. (edellä) ja Bolivar, F. et ai. (Gene 2 (1977) 75). Plasmidin pBM9 molekyylipaino on 3,5

x 10^ daltonia, ja se sisältää tetrasykliiniresistenssin R

25 (Te ) aiheuttavan geenin. Tämä plasmidi sisältää yhden tunnistuskohdan kullekin seuraavista endonukleaaseista:

Eco Rl, Hind III, Sal I ja Bam HI. Näistä kolmen jälkim-

O

mäisen tunnistuskohdat sijaitsevat Te -geeneissä. Liitettäessä vierasta DNA:ta Hind III:n, Sai I:n tai Bam HI:n 30 tunnistuskohtaan tetrasykliiniresistenssi häviää. Siirto- vektori, joka sisältää vierasta DNA:ta joissakin näistä kohdista, voidaan karakterisoida tämän ominaisuuden perusteella. Tämä siirtovektori voidaan edelleen karakterisoida määrittämällä siirretyn DNA-molekyylin sekvenssi, ver-35 taamalla molekyylipainoja ja tunnistuskohta-analyysillä, kuten edellä on kuvattu.

24 74732

Plasmidia pSClOI on pitkälle karakterisoitu. Cohen, S.H. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70 (1973) 1293) ovat kuvanneet tämän plasmidin syntetisoinnin ja alustavan karakterisoinnin. Karakterisointia ovat täydentäneet Cohen, 5 S.N. et ai. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70 (1973) 3240,

Boyer, H.W. et ai. (Recombinant Molecules), Beers, R.F. ja Basset, E.G., Raven Press, New York, s. 12 (1977) ja Cohen, S.N. et ai. (Recombinat Molecules, s. 91). Plasmidin pSC101 molekyylipaino on 5,8 x 10° daltonia, ja se si-10 sältää tetrasykliiniresistenssin (Te ) aiheuttavan geenin.

t>

Te -geeni sisältää yhden tunnistuskohdan kullekin seuraa-vista endonukleaaseista: Hind III, Sal I ja Bam HI. Lisäksi plasmici pSd01 sisältää yhden Eco RI:n tunnistuskohdan, yhden Hpa I:n tunnistuskohdan, yhden Sma I:n tun-15 nistuskohdan ja neljä Hinc II:n tunnistuskohtaa. Tetra-sykliiniresistenssi häviää halkaistaessa pSC101 endonuk-leaaseilla Hind III, Sal I tai Bam HI ja liitettäessä vierasta DNA:ta näiden tunnistuskohtaan. Liitettäessä DNA Hind III:n, Sai I:n tai Bam HI:n tunnistuskohtaan re-20 kombinaatiomolekyylejä löydetään viljelmistä, jotka ovat tetrasykliinisensitiivisiä. Siirtovektori, joka sisältää johonkin edellä mainittuun kolmeen kohtaan liitettyä vierasta DNA:ta, voidaan karakterisoida siirtovektorin re-sistenssiominaisuuksien perusteella. Siirtovektori voidaan 25 edelleen karakterisoida (a) poistamalla siirretty vieras DNA-sekvenssi, määrittämällä molekyylipainot ja vertaamalla niitä keskenään, (b) laatimalla tunnistuskohtakartta ja (c) määrittämällä siirretyn DNA-molekyylin sekvenssi.

Voidaan käyttää useita vektoreita transformoitaes-30 sa Bacillus subtilista. Nämä vektorit on johdettu mikro- organismista Staphylococcus aureus (ks. Fordanescu, S., J. Bakteriol. 124 (1974) 597 ja Ehrlich, S.D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 1680). Näillä plasmideilla on määrätty resistenssi ja niillä on määrättyjä restriktio-35 endonukleaasikohtia. Esimerkiksi plasmidilla pC194 aikaan saadaan resistenssiä klooriamfenikolille (Cm), se sisältää yhden ainoan Hind ΙΙΙ-kohdan ja sen molekyylipaino 25 7 4 7 32 on 1,8 x 10^ daltonia. Vieras DNA liittyy siten plasmidm pC194 Hind III-kohtaan. Vieraan DNS:n sisältävä siirto- vektori voidaan karakterisoida sen resistenssin perus-£ teella (Cm ). Siirtovektori voidaan myös karakterisoida 5 poistamalla liitetty DNA määrittelemällä kahden tuotteen molekyylipaino, verrattuna lähtöaineiden molekyylipainoon. Voidaan myös määrittää liitetyn DNA:n sekvenssi.

Sopivan isännän valinnassa on monia mahdollisuuksia samoin kuin plasmidin valinnassa. Tässä selostukses-10 sa kuvattuihin menetelmiin on kehitetty E. colikanta X-1776, jonka NIH on hyväksynyt, kun käytetään P2-työsken-telytiloja, ks. Curtiss III, R., Ann. Rev. Microbiol. 30, 507 (1976). E. coli RR-1 on sopiva, kun P3-työskentely-tilat ovat käytettävissä.

15 Rekombinoidut plasmidit muodostetaan siten, että sekoitetaan keskenään restriktioendonukleaaseilla käsiteltyä plasmidi-DNA:ta ja cDNA:ta, jonka pääteryhmät ovat vastaavasti käsitellyt. Plasmidi-DNA:ta käytetään suuri molaarinen ylimäärä cDNA:han verrattuna, jotta cDNA-seg-20 mentit muodostaisivat mahdollisimman vähän kombinaatteja toistensa kanssa. Aikaisemmissa menetelmissä tämä on johtanut siihen, että suurin osa kierrossa olevista plasmi-deista on sellaisia, jotka eivät sisällä cDNA-fragment-tia. Näin ollen valintaprosessista on tullut vaivalloi-25 nen ja aikaavievä. Aikaisemmin tämä ongelma on ratkaistu siten, että on yritetty rakentaa sellaisia DNA-vektoreita, joissa on restriktioendonukleaasin tunnistuskohta sopivan merkkigeenin keskellä siten, että rekombinantin liittäminen jakaa geenin ja samalla geenin koodaama toiminta 30 häviää.

On edullista käyttää sellaista menetelmää, jolla niiden pesäkkeiden lukumäärä saadaan mahdollisimman pieneksi, joista rekombinoitua plasmidia etsitään. Menetelmässä toimitaan siten, että restriktioendonukleaasil-35 la katkaistu plasmidi-DNA käsitellään alkalisella fosfa- taasilla (valmistaja Worthington Biochemical Corporation, Freehold, New Jersey). Alkalinen fosfataasi poistaa 5'- 26 74732 päiden fosfaatit endonukleaasin synnyttämistä plasmidin päistä ja estää plasmidi-DNA:n itseligaation. Näin ollen renkaanmuodostus ja samalla transformaatio riippuu siitä, että tapahtuu 5'-fosforyloidut päät sisältävän DNA-frag-5 mentin liittyminen. Kuvattu menetelmä vähentää ilman re-kombinaatiota tapahtuvan transformaation suhteellista 4 esiintymistä määrään, joka on alle 1-10 .

Tämä keksintö perustuu siihen, että DNA-ligaasin katalysoima reaktio tapahtuu DNA:n 5'-fosfaattipääteryh-10 män ja DNA:n 3'-hydroksyylipääteryhmän välillä. Jos 5'- fosfaatti puuttuu, ei liittymisreaktiota tapahdu. Kun kaksisäikeiset DNA:t pitää yhdistää, on olemassa kolme tilannetta, kuten taulukosta 1 ilmenee.

15 Taulukko 1

Tapaus Reagoivat yhdisteet_Ligaasituote_ I 3' 5' 3' 5' -OH H -Ο-,ΡΟ - -O-P-O--- + Δ J + ou n -0P03H2 HO---O-P-O- 20 5' 3' 5' 3' II 3' 5’ 3' 5’ - OH Η,Ο.,Ρ-0- -O-P-O-

+ z J +H O

-OH OH---OH HO--2 25 5' 3' 5' 3' i III 3' 5' -OH HO- ei reaktiota — OH + HO---- 30 5' 3'

Taulukossa 1 on kaksisäikeinen DNA esitetty kaaviol-lisesti yhtenäisinä yhdensuuntaisina viivoina ja niiden vastaavat 5'- ja 3'-pääteryhmät on merkitty hydroksyyleik-35 si (OH) tai fosfaateiksi (OPOgH2). Tapauksessa I on kum massakin reagoivassa molekyylissä päissä 5'-fosfaatti, ja näin ollen molemmat säikeet yhtyvät toisiinsa kovalentti- 27 7 4 7 3 2 sesti. Tapauksessa II on liitettävistä päistä vain toisessa 5'-fosfaatti ja näin ollen vain toinen liitettävistä säikeistä liittyy toiseen kovalenttisesti ja toiseen sähkeeseen jää epäjatkuvuuskohta. Kovalenttisesti liittymä-5 tön säie pysyy assosioituneena liittyneeseen sähkeeseen vetysiltojen avulla, jotka esiintyvät vastakkaisten säikeiden komplementaaristen emäsparien välillä. Tapauksessa III ei kummassakaan reagoivassa päässä ole 5'-fosfaattia eikä yhdistyrnisreaktiota tapahdu.

10 Näin ollen pitää poistaa 5'-fosfaattiryhmä sellai sesta päästä, jonka liittyminen toiseen halutaan estää. Käytettäväksi sopii mikä tahansa 5'-fosfaattiryhmän poistomenetelmä, joka ei muuten vahingoita DNA-rakennetta. Mieluiten käytetään alkalisen fosfataasin katalysoimaa 15 hydrolyysiä.

Edellä kuvattu menetelmä on hyödyllinen myös siinä tapauksessa, että lineaarinen DNA-molekyyli halutaan katkaista kahteen alafragmenttiin, tavallisesti restriktio-endonukleaasia käyttämällä, ja sen jälkeen rekonstruoida 20 alkuperäiseksi sekvenssiksi. Alafragmentit voidaan puhdis

taa erikseen ja haluttu sekvenssi voidaan rekonstruoida yhdistämällä alafragmentit. Tähän tarkoitukseen voidaan käyttää DNA-ligaasia, joka katalysoi DNA-fragmenttien päiden liittymisen toisiinsa, ks. Sgaramella, V., Van de 25 Sande, J.H. ja Khorana, H.G., Proc. Natl. Acad. Sei. USA

67, 1468 (1970). Jos yhdistettävät sekvenssit eivät ole tylppäpäisiä, voidaan käyttää E. colista saatua ligaasia, ks. Modrich, P. ja Lehmann, I.R., J. Biol. Chem. 245, 3626 (1970).

30 Alkuperäisen sekvenssin rekonstruointia restriktio- endonukleaasikäsittelyllä saaduista alafragmenteista parantaa suuresti, jos voidaan käyttää menetelmää, jossa sopimattomien sekvenssien rekonstruoinnilta vältytään. Sopimaton tulos voidaan välttää, jos halutun sekvenssin 35 omaava homogeenisen pituinen cDNA-fragmentti käsitellään reagenssilla, joka kykenee poistamaan 5'-päätefosfaatti-ryhmät cDNArsta ennen kuin homogeeninen cDNA lohkeaa re-striktioendonukleaasin vaikutuksesta. Tässä alkalinen 28 74732 fosfataasi on edullinen entsyymi. 5'-päätefosfaatit ovat rakenteellinen edellytys DNA-ligaasin alafragmentteja yhdistävälle vaikutukselle. Näin ollen sellaisia päitä ei voida yhdistää kovalenttisesti, joissa ei ole 5'-pääte-5 fosfaattia. DNA-alafragmentit voidaan yhdistää vain sel laisiin päihin, jotka sisältävät 51-päätefosfaatin, joka on muodostunut restriktioendonukleaasin eristettyyn DNA: hän kohdistaman katkaisevan vaikutuksen tuloksena.

Edellä selostettu menettely estää sopimattomimman 10 liittymisreaktion, nimittäin sen, että kaksi fragmenttia liittyisi käänteisessä järjestyksessä eli takaosa etuosaan eikä etuosa takaosaan. Muita mahdollisia sivureaktioita, kuten dimeroitumista tai renkaanmuodostusta ei saada estetyiksi, koska nämä tapahtuvat reaktiotyypin II 15 mukaisesti, vrt. taulukkoa 1 edellä. Tällaiset sivureaktiot ovat kuitenkin vähemmän haitallisia, koska ne johtavat fysikaalisesti identifioitaviin ja erotettaviin tuotteisiin, kun taas käänteinen rekombinaatio ei sitä tee.

Edellä kuvattujen menetelmien valaisemiseksi rotan 20 kasvuhormonin cDNA-koodi eristettiin, rekombinoitiin plas- midin kanssa ja siirrettiin E. coliin. Kun E. coli oli replikoitunut voimakkaasti, eristettiin noin 800 nukleotidia sisältävä sekvenssi ja havaittiin, että se sisälsi koodin rotan koko kasvuhormonille sekä osille prekursori-25 peptidiä ja osan translatioitumatonta 5'-aluetta.

Juuri kuvatulla menetelmällä voidaan eristää ja puhdistaa korkeamman organismin geeni, myös ihmisen geeni, ja siirtää se mikro-organismiin, jossa se replikoi-tuu. Selostuksessa kuvataan uusia rekombinoituja plas-30 mideja, jotka sisältävät eristetyn geenin kokonaan tai osia siitä. Selostuksessa kuvataan uusia mikro-organismeja, joita ei tähän mennessä ole löydetty luonnosta, ja joiden geneettinen rakenne sisältää korkeamman organismin geenin. Seuraavissa esimerkeissä kuvataan rekom-35 binoituja plasmideja, jotka sisältävät osia rotan kas-vuhormonigeenistä ja ihmisen kasvuhormonigeenistä, sekä uusia mikro-organismeja, jotka sisältävät mainittuja geenejä.

29 74732

Esimerkki 1 Tässä esimerkissä selitetään rotan kasvuhormonin rakennegeenin DNA-sekvenssin eristys ja puhdistus, rotan kasvuhormonin koko rakennegeenin sisältävän siirtovekto-5 rin syntetisointi ja sellaisen mikro-organismin konstruointi, jossa rotan kasvuhormonin rakennegeeni on geneettisen rakenteen osana.

Kun on kyse muista kuin ihmisestä peräisin olevista geeneistä, turvallisuusmääräykset eivät vaadi cDNA:n 10 eristämistä erikoisen puhtaana. Näin ollen on mahdollista eristää rotan kasvuhormonin rakennegeenin koko cDNA siten, että eristetään elektroforeettisesti noin 800 emäsparia sisältävä DNA, jonka tiedetään vastaavan rotan kasvuhormonin tunnettua aminohapposekvenssiä. Rotan kasvuhormonin 15 mRNA:n lähteenä käytettiin viljeltyjä rotan aivolisäke- soluja, jotka olivat solupolven GH-1 alaklooni, ja joita myy American Type Culture Collection, ks. Tashjian, A.H., et ai., Endochrinology 82, 342 (1968). Kun tällaisia soluja kasvatetaan normaaliolosuhteissa, kasvuhormonin mRNA 20 edustaa vain pientä prosenttiosuutta eli noin 1-3 % RNA:n sisältävästä kokonais-poly-A:sta. Kasvuhormonin mRNA:n tasoa pystyttiin kuitenkin nostamaan kilpirauhashormonien ja glukokortikoidien synergistisellä vaikutuksella. RNA 0 saatiin 5 x 10 soluista, jotka oli kasvatettu suspensio-25 viljelmästä, johon oli 4 vuorokautta ennen solujen talteenottoa lisätty 1 mM deksametasonia ja 10 nM L-trijodityro-niinia. Polyadenyloitu RNA eristettiin viljeltyjen solujen sytoplasmisesta kalvojakeesta, ks. Martial, J.A., Baxter, J.D., Goodman, H.M. ja Seeburg, P.H., Proc. Natl.

30 Acad. Sei. USA 74, 1816 (1977) ja Bancroft, F.C., Wu, G.

ja Zubay, G., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 70, 3646 (1973). mRNA puhdistettiin ja transskriboitiin kaksisäikeiseksi cDNArksi (ks. kantahakemuksen esimerkkejä). Geelielektro-foreesifraktioinnissa havaittiin heikko, mutta silti sel-35 vä kaista, joka vastasi noin 800 emäsparin pituista DNA: ta.

30 7 4 7 3 2

Koko viljeltyjen aivolisäkesolujen mRNA:sta trans-skriboidun cDNA:n käsittely Hha I-endonukleaasilla antoi kaksi elektroforeettisessa erotuksessa ilmenevää suurempaa DNA-fragmenttia, jotka vastasivat noin 320 nukleoti-5 dia (fragmentti A) ja 240 nukleotidia (fragmentti B). Kun fragmenttien A ja B nukleotidisekvenssit analysoitiin kan-tahakemuksen esimerkissä 5 kuvatulla tavalla, havaittiin, että nämä fragmentit olivat todella rotan kasvuhormonin koodin osia, kun verrattiin julkaistuihin rotan kasvuhor-10 monin aminohapposekvenssitietoihin ja muihin tunnettuihin kasvuhormonisekvensseihin, ks. Wallis, M. ja Davies, R.V.N., Growth Hormone and Realted Peptides (Eds., Copecile, A. ja Muller, E.E.) ss. 1-14 (Elsevier, New York, 1976) ja Dayhoff, M.O., Atlas of Protein Sequence and Structure, 15 5, suppl. 2, ss. 120-121 (National Biomedical Research

Foundation, Washington, D.C. 1976). Kun 800 emäsparia sisältävä kaksisäikeinen cDNA eristettiin elektroforeetti-sesti edellä kuvatulla tavalla ja sille suoritettiin samanlainen Hha I-endonukleaasikäsittely, päätuotteiden 20 joukosta löydettiin kaksi fragmenttia, jotka vastasivat pituudeltaan fragmentteja A ja B.

Koska noin 800 emäsparia sisältävää rotan kasvuhormonin cDNA:ta ei puhdistettu restriktioendonukleaasi-käsittelyä varten, oli tarpeen käsitellä DNA parittomien 25 yksisäikeisten päiden poistamiseksi. Tällaisten paritto mien päiden poistaminen tapahtui ennen elektroforeettis-ta erotusta liuoksessa, joka sisälsi 25 μΐ 60 mM Tris-HCl, pH 7,5, 8 mM MgC^* 10 mM β-merkaptoetanolia, 1 mM ATP ja dATP, dTTP, dGTP ja dCTP (200 μΜ kutakin). Kun seos-30 ta inkuboitiin 10 minuuttia 10°C:ssa 1 yksikön kanssa E. colin DNA-polymeraasi I:tä, saatiin ulkonevat 3'-päät poistetuiksi ja ulkonevat 5'-päät täytetyiksi eksonukleo-lyyttisesti. Boehringer-Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana, myy DNA-polymeraasi I:tä.

35 Noin 800 emäsparia sisältävään rotan kasvuhormoniin liitettiin Hind ΙΙΙ-tunnistuskohta kantahakemuksen esi- 31 / / w ^ merkissä 3 kuvatulla tavalla. Plasmidi pBR322, jossa oli ampisilliinille vastustuskyvyn antava geeni ja Hind III-kohta siinä geenissä, joka antaa vastustuskyvyn tetra-sykliinille, käsiteltiin Hind ΙΙΙ-endonukleaasilla ja 5 alkalisella fosfataasilla kantahakemuksen esimerkissä 4 kuvatulla tavalla. Käsiteltyyn plasmidiin liitettiin 800 emäsparia sisältävä rotan kasvuhormonin cDNA DNA-ligaasin avulla kantahakemuksen esimerkin 3 mukaisella tavalla. Ligaasireaktioseos käytettiin E. coli X-1776-solususpen-10 sion transformontointiin kantahakemuksen esimerkissä 4 kuvatulla tavalla. Rekombinanttipesäkkeet valittiin sen perusteella, että ne kasvoivat ampisilliiniä sisältävällä alustalla, mutta eivät alustalla, joka sisälsi 20 \ig/ ml tetrasykliiniä. Saatiin kymmenen sellaista pesäkettä, 15 joissa oli plasmidi, johon oli liittyneenä noin 800 emäs- paria sisältävä osa, joka irtosi Hind ΙΙΙ-katkaisulla.

800 emäsparia sisältävää rotan kasvuhormonin DNA: ta eristettiin preparatiivinen määrä rekombinanttikloonis-ta pRGH-1 ja eristetyn DNA:n nukleotidisekvenssi määritet-20 tiin kantahakemuksen esimerkissä 5 kuvatulla tavalla. Löydetty nukleotidisekvenssi sisälsi 5’-päässä alueen, jossa rotan kasvuhormonia vastaavaa translaatiota ei ollut tapahtunut, ja sekvenssin 26 aminohapolle, jotka ovat kasvuhormonin prekursoriproteiinissa ennen eristystä. Taulukos- 25 sa 2 on myös esitetty geenisekvenssistä johdettu mRNA- sekvenssi. Ennustettu aminohapposekvenssi vastaa kohtia 1 ja 8 lukuunottamatta hyvin rotan kasvuhormonin osia, joita Wallis ja Davies ovat selostaneet (vrt. edellä) ja jotka koskevat kohtia 1-43, 65-69, 108-113, 133-143 ja 30 150-190.

32 74732 du au 3 o c o wo wo HU h 3 h ait- 43 π — e >,< e 43 o o . -Jo p-jo a.:— oo n e n e H< e

<3 30 CO WO 3 0 30 C-O 30 O

. , '"J 0)!-> He >.0 — t— 3 H W < H C t-

g'H HO OO OH H C HO C O OO O

Q»D WO WO 30 30 W < H H 3 < Ö p £ < 43 H 3 H >> C < »—I o o

. -g £ U H = U H H OO H C HH CO O

5 5¾ 30 030 3H 030 30 OHO WO <

T} 'dp 3 H (NOH H O CO 3 H H C -3-00 ;>-, < H

ό E > -1 u no e o no o o — h e n e h

Q Q 30 wo OH 30 Π H C C WO O

— -P 34 O H ·—I C i—1 O 3H >, C --1 c H C O

0_gc HO so <0 HU H H oo c:o o

^4Φ0 1-10 CO CO HO HO WO 30 O

Q +* 3 o h e — e ao 3 h >i<; 3 h H

34 w E-· oo < oo 00 n h >0 n < 00 0 P e

CHtÖ 30 30 30 30 600 30 C-O O

'd P W 43 t- HU — U 43 H H O 3 H W < O

C>m HH CO CO Π H CO OO CO o

E :P 0| HU 60 C C H CO O 0.0 30 WO O

H -H g HO t· O WC h O W < i—i H >->C H

Q Η β HC CO CC CO CO MC HC O

"p 34 _ DO 30 CO 3 H HO CO WO O

>>-|(0 3H 3 H i—I C 3 H 30 H < >iC- H

WJU+J HO HO OO HO w H OO HC O

(0 E 4-1 H

Ai Γ S 3 0 HO 3 H DO HO HO 30 O

WE 3 H 3 Η HH 3 Η 43 U HO HH O

C3 HO >U HC HH HC OO HH H

IJ fi i o

4J -H rn 0-0 3H HO 3 C HH 3H WO C

SHE ho HO OO H< HO HH >, O O

Sra HH CO W H OO OO HC OH C

W O

:ιβ· OO CH HH HO 3 H OOH HO C

:(6 (ö C ho w< >, e 3H hh ho 30 o

HCO HO CC HH SC HH CO W H O

H -P

:(0 3-1-) HH 30 COO HO HO OO 30 O -

Ifl 4-1 (0 400 ho HO W< 3 H HO 3 H CO

-H-HW HC CO CO CO SC HO HO H

woe I

πω CO 3 H OCO HH 030 HO 030 30 I

njm> H< 43 H c- ι-H e HO OOH 30 \0 3 H HH I

,g g Λί OO HH OO HC —ΠΟ WC — HO HH

•n C M H H DO HC CD C HO HO HO 3HC

rsl I 30 30 HO-HO 30 HO HO HO —'

-CC W H HO O O CC wc OO OO CO H

- -Η (D Z H

O(0-HK HO HH 30 CO CO 0.0 HH WHO

34 W -P 6 WC 30 HC H< W< WC HC HO H

X CO W < 00.0 0 CC CO HH OH

P > H > ® < HU OO CO HO DC CO HOO

H & frt 'ju 30 HO H< 43 U HC wc 3 0 H

Pq3:(ö(3 e u wh ho oo hc oo e c wee

idW4J-P_, H

H-HWW 3 H DO 3 H 30 3 H DO WC HOC

Ό :(0 (Ο “< p ^ P h H HO HH 3H HC 3 0 O

H:(Ö> C U Hh hc CO HH HU HC WC H

OO·'0'-'^ O U HO DO 30 DO DU DC O

(fi C HO ^ ^ f"" HU H C HC HH H< 3H HC O

H-3-H'SC HO HH OO HC OO HO OOH

x ε w c 3raW π p 30 DO 600 CO 3 0 3 0 0

CC. 3 H HO HC HO H< 3 H HOH

!>,© — < <u oo cc oo ho eo<;

& 4J X 30 00 H wo HO HO 3H 3 H H

3---)3 HO HO H < 30 3 H HU H H H

^;35 CO CO H C WC SC CO HHC

§ s e ° H DO H O DO DO 0.0 OO U C

Ss-P HO hc HO 3 H 3 H WC HOC

^ÖC H U OO OO HO HO CO COH

i|0 § 8 — DC 30 HO 3 H 3 H HH OOU<!

rX n 3 H 4=H 430 HH HO WC HOH

HO H H HC HH CO CO COO

§ 8.3 u « H DO O O O CO OCO HU OWH H

frtJrtS O HO — e OHO HC CMHC 30 00 >- O O

-C-C(0 U CO OO HO OO — OU wc — OH H

"S-Ti !rt u H

Η >> H WC 30 HO 30 00 O WOH

C-P15 P —'O >>C — O 3 H Ht- HO *C U

c oo Η-ί cu >o hc co hcc

(oO. f- 3H HU OC Ο Ο >>U H O Hl O C

{Xjj-j O HO >.e HO HO HO 3 H 3 H H

UliöfO < C O HH HO HO OU SC SC O

8 s Λ ti 3U HU 30 >>0 DO CU HOO

D 3 Π < H C 430 HH HO HC WC 3HO

H+JW ^ UU HC HC OU OU CC >OC

SmiS y c C HO HU DU DC 30 6000

(¾¾¾ < r4-4 wc 430 3 H HC HU HOO

^ ^ w o oo CO HC HU OO CO COH

P CJ

pH H Cu o DO CL υ DO< V ~ ° r-IO rH < μ O Q)H w < 0>H<

HU <u OO HH HO <0 HOO

I o

J p-p 3 H H C H c HO 3 H HOO

U-. HP. "Ί 0 HU 3 O WC 43 t- >,CH

HH CO WH WH CO Hh HHU

33 74732

Esimerkki 2a (i) Esimerkki 1 toistettiin, paitsi että plasmidin pBR322 DNA:n tilalla käytettiin plasmidin pMB9 DNA (valmistusmenetelmä: Rodriguez, R.L., Bolivar, F., Goodman, 5 H.M., Boyer, H.W. ja Betlach, M., ICN-UCLA symposium on

Molecular and Cellular Biology, D.P. Wierlich, W.J. Rutter ja C.F. Fox, Eds., (Academic Press, New York 1976), ss. 471-477). Käytetyt olosuhteet olivat muuten samat kuin esimerkissä 1, paitsi että selektio suoritettiin esimer-10 kin 4 mukaisella tavalla. Yhdistelmäplasmidiin liitetty DNA-fragmentti erotettiin, jolloin saatiin noin 800 emäs-paria sisältävä DNA-fragmentti, jonka nukleotidisekvenssi on esitetty taulukossa 2.

(ii) Esimerkki 1 toistettiin, paitsi että plasmi- 15 din pBR322 DNA:n tilalla käytettiin plasmidin pSC101 DNA:ta, joka oli valmistettu Cohenin et ai. kuvaamalla menetelmällä (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 70 (1973) 1293). Kaikki reaktio-olosuhteet olivat samat, ja selektio suoritettiin samalla tavalla kuin plasmidia pMB9 käytettäessä. 20 Yhdistelmäplasmidiin liitetty DNA-fragmentti erotettiin, jolloin saatiin noin 800 emäsparia sisältävä DNA-fragmentti, jonka nukleotidisekvenssi on esitetty taulukossa 2.

(iii) Esimerkki 1 toistettiin, paitsi että plasmidin pBR322 DNA:n tilalla käytettiin plasmidin pBR313 25 DNA:ta, joka oli valmistettu Bolivarin et ai. kuvaamalla menetelmällä (Gene 2, (1977) 75). Kaikki käytetyt olosuhteet lopullinen selektio mukaanlukien olivat samat. Yhdistelmäplasmidiin liitetty DNA-fragmentti erotettiin, jolloin saatiin noin 800 emäsparia sisältävä DNA-fragmentti, 30 jonka nukleotidisekvenssi on esitetty taulukossa 2.

Esimerkki 2b

Esimerkit 1 ja 2a toistettiin, paitsi että E. colin X-1776 tilalla käytettiin E. colia RR1 tai E. colia HB101. Käytetyt olosuhteet olivat samat, ja saatiin samat tulok-35 set.

34 74732

Esimerkki 3 Tässä esimerkissä selostetaan ihmisen kasvuhormonin koko rakennegeenin eristys ja puhdistus, ihmisen kasvuhormonin koko rakennegeenin sisältävän rekombinoidun 5 plasmidin syntetisointi ja sellaisen mikro-organismin tuottaminen, jossa ihmisen kasvuhormonin koko geeni on geneettisen rakenteen osana.

Ihmisen kasvuhormonin mRNA:n eristys suoritettiin oleellisilta osiltaan esimerkissä 2 kuvatulla tavalla, 10 mutta biologisena lähteenä käytettiin ihmisen aivolisäke-kasvaimen kudosta. Viisi hyvänlaatuista ihmisen aivolisä-kekasvainta, jotka oli poistettu leikkauksella ja nopeasti jäähdytetty nestemäisessä typessä, ja jotka painoivat 0,4-1,5 g kukin, sulatettiin ja jauhettiin 4°C:ssa liuok-15 sessa, joka sisälsi 4 mol/1 guanidiniumtiosyanaattia ja 1 mol/1 merkaptoetanolia ja joka oli puskuroitu pH-arvoon 5. Homogenaatti kerrostettiin 1,2 mlraan 5,7 mol/1 CsCl, joka sisälsi 100 mM EDTA, ja sentrifugoitiin 18 tuntia 15°C:ssa nopeudella 37 000 r/m Beckman-ultrasentrifugin 20 roottorilla SW 50,1 (Beckman Instrument Company, Fullerton,

California). RNA kulkeutui putken pohjalle. Jatkopuhdis-tus tapahtui käyttämällä oligo-dT-pylvästä ja sakkaroosi-gradienttisedimentointia kantahakemuksen esimerkeissä ' 1, 2 ja 3 kuvatulla tavalla. Noin 10 % näin eristetystä 25 RNAssta koodasi kasvuhormonia päätellen reaktioaktiivi- sen aminohappoprekursorin sisällyttämisestä vehnänalkios-ta saatuun antikasvuhormonisaostusmateriaaliin solutto-massa translaatiosysteemissä, ks. Roberts, B.E. ja Patterson, B.M., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 70, 2330 (1973).

30 Ihmisen kasvuhormonin cDNA valmistettiin oleellisilta osiltaan esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Ihmisen kasvuhormonin cDNA fraktioitiin geelielektroforeettisesti ja kloonaukseen valittiin jae, joka liikkui noin 800 nukleotidia vastaavaan kohtaan. Valittu jae käsiteltiin DNA-35 polymeraasi I:llä esimerkissä 2 kuvatulla tavalla ja sen jälkeen näihin liitettiin Hind ΙΙΙ-tunnistuskohdat. Tämän jälkeen cDNA rekombinoitiin DNA-ligaasin avulla 35 7 4 7 3 2 plasmidiin pBR322/ joka oli käsitelty alkalisella fosfa-taasilla. E. coli X-1776 transformoitiin rekombinoidulla DNA:lla ja valittiin kasvuhormonin DNA:n sisältävä kanta. Kasvuhormonin DNA:n sisältävää kantaa kasvatettiin pre-5 paratiivinen määrä ja kasvuhormonin DNA eristettiin nuk- leotidisekvenssin määrittämistä varten. Kasvuhormonin kloonatun DNA:n havaittiin sisältävän ihmisen kasvunormo-nin koko aminohapposekvenssin nukleotidikoodin. Ihmisen kasvuhormonin ensimmäiset 23 aminohappoa ovat HjN-Phe-10 Pro-Thr-Ile-Pro-Leu-Ser-Arg-Leu-P?iE-Asp-Asn-Ala-Met-Leu-

Arg-Ala-His-Arg-IiiS-His-Gln-Leu-, Sekvenssin loppuosa on esitetty taulukossa 3.

36 74732 .J· 3 0 HU HU 3 0 M S- •5 _ OH >>< w < O h (J ϋ

C W -1 ^ e— H < O m3 U in H

n W U 3 U - O 3 mi f 1

g G OH 0 5—t r-4 <3 o -— M CJ

Q S g o _iu > α o o ju <o B M <— o 3 o 3 cj 30 ra <; wo 0<U _ — <3 OH OH >-4 CJ >>o

X Ö) CO OO ,-30 —3 u <o o H

H I v) <j

!> < << 3 < OCO COO HO CO

tog _ 05- C W <! MO W < -< <

jö ^ —·<< < < <o OO

OO CO co >*o WE- o—>o

SaJ w< m < 3 o ·- < oooc- (3 30 <3 < <3 < OO so -->o W 43 O H n

•H 10 — o MO OO 4-1 O CO <DO

E {0 no -lO OH W <; m4 H I

£> CJ O C/3 H <o X < <3 <J M < I

•H H H W< CJU 30 WO COO !

mtn ,- 33 5- OH H< MO I

(ti W ^ it < h <3 Π H H o so < o

a g rO O O CJ

P δ Ί W r- CO r-io MO M <3 30 O

cd> ., *-> < Ο Η -CO OO OH o M t H c u >o H < C/3 H H o o

4->0) He- C < MH C < CO ΟΌ O

cl --!< oo »-, < w <; s h o

•H <C “> ^ o O C/3 < OO < < π H H

O z h <; cj

HO i-3< M< iS U 0) U M < M <3 H

EC 30 H <3 <3 <3 H <3 Η < H <3 O

g-H O f— < Cj ZC ·<ΓθΟ 3 < 30 O 3»U Π O 30 c-

Q <— < OH CN U W< m4 < O

.g 3< OO m3 O — OO <0 OO <

H C — -C CJ

m o OO 30 OO 3 < OO r-o O

tn_2 — < S3— H< s H CH o c "9 JP U t— H h o o Π H m- o o 5>ω m3 ^ eco co so wo wo o

& frt - WO — < --1 < 3M < ?-, < O

aj ΰ o< c< o o oo o < s < ο * Λ mo cj

Jj e HO CO r-to 3< MO HO <

rHffl W< CH OH OO mc O

.y g OO < < >0 m3 o m < < O H

n I—1< MO OO HU MU 4-1 CJ H

n M 5 o o mo w< >s < o— o

iiJ a MH in H HO <0 HH Ο < O

0-¾. HH OO 3 0 WO MO HO H

λ; 2 pf m o r-< >>< so me <

A3 C "tf 30 HO OO -3 < H < <0 O

e r-· m -J ’—i U O

P4Mrico<^ Μ < 30 3< CO wo o

'O }H +J O S O OH OH — < H< H

2Si'fr 3 < OH< m3 O m3 O OO -3 < O

H :d W O O O O HO 3 0 O W O CO O O

•S MO MO OH -T ΪΜ < MO O

Ψ . J 3 < HO HH m3 O — m3 < << O

JL 4—I -S O

S-H OO OH M O HO OO OO O

S.2J r—t H OO W< JZ H JZ H H

>-3;5 OH M< tn H < O HH HH O

Sfr HH MH CO HH OO WO O

Q OO i— < >,< >-· H >%o <

y R 3 0 ¢/3 H OO HH >—< OH H

•R g OCJ 30 OU m-ι CJ CO HU ·—1 O O

.to· r—, -tt HH OH r-i<3 H e C'SH

C (tJ CO OO H< >U OU HH ·—· H H

9 C ,H H <

g-r^rH OU H< 30 CO >> U 30 >> <J

Q W ·· <UO D ►—< Cfl<! <U£-* H C

Ewd HU in i— m3 O <3< OO m3 o oo

QCpC HH OO 30 HO HH 30 WH

-S><2 JC H OH OO -CO OH ?s O

S'SjJ mU HH m3U W < H < m3 O OH

WW[dH< WH 30 HU 600 >iO HU

(tJQ> >>U OOH WC HO 1—4 O OO

.Y Cl, H HO OH CO m3 O <U <0 OO ¢/3 < SO w <

S(Ö,Y <U 30 HU HH OO OHO >> O

X 4)t- OU OO HO vO>>< ·—4 O

U)OE-4 O'- m3 O OH WH HO - HH

E-HCHH HU OU «Ο HO CO 30 -CEp OU H M-iCJ OO W<C “! <

H B Ä 30 V3H I— < < O m < < <, OO

< - υ

N < o MO 600 >>0 >%0 WO —4 CJ

SO MO —4 O —40 J?'-1

CJ HC < CJ OO OO m3 < >U

in 37 747 3 2

Esimerkki 4a (i) Esimerkki 3 toistettiin, paitsi että plasmidin pBR322 DNA:n tilalla käytettiin plasmidin pMB9 DNA:ta, joka oli valmistettu Rodriguezin et ai. kuvaamalla mene- 5 telmällä (edellä). Kaikki reaktio-olosuhteet olivat samat, paitsi että lopullinen selektio suoritettiin kantahakemuk-sen esimerkin 4 mukaisesti. Yhdistelmäplasmidiin liitetty DNA-fragmentti erotettiin edellä kuvatulla tavalla, jolloin saatiin DNA-fragmentti, joka sisälsi noin 800 10 emäsparia ja jonka nukleotidisekvenssi on esitetty esimerkissä 1 .

(ii) Esimerkki 3 toistettiin, paitsi että plasmidin pBR322 DNA:n tilalla käytettiin plasmidin pSC101 DNA: ta, joka oli valmistettu Cohenin et ai. kuvaamalla mene- 15 telmällä (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 70 (1973) 1293).

Käytetyt olosuhteet olivat samat, ja selektio suoritettiin samalla tavalla kuin plasmidi pMB9 käytettäessä. Yhdistelmäplasmidiin liitetty DNA-fragmentti erotettiin edellä kuvatulla tavalla, jolloin saatiin noin 800 emäsparia 20 sisältävä DNA-fragmentti, jonka nukleotidisekvenssi on esitetty esimerkissä 3.

(iii) Esimerkki 3 toistettiin, paitsi että plasmidin pBR322 tilalla käytettiin plasmidin pBR313 DNA:ta, joka oli valmistettu Bolivarin et ai. kuvaamalla menetel- 25 mällä (Gene 2 (1977) 75). Käytetyt olosuhteet lopullinen selektiomenetelmä mukaanlukien olivat samat. Yhdistelmäplasmidiin liitetty DNA-fragmentti erotettiin edellä kuvatulla tavalla, jolloin saatiin noin 800 emäsparia sisältävä DNA-fragmentti, jonka nukleotidisekvenssi on esi-30 tetty esimerkissä 3.

Esimerkki 4b

Esimerkit 3 ja 4a toistettiin, paitsi että E. colin X-1776 tilalla käytettiin E. colia RR1 tai E. colia HB101. Käytetyt olosuhteet olivat samat ja saatiin samat tulok-35 set.

Claims (3)

38 74732

1. Kasvuhormonia koodaavan nukleotidisekvenssin sisältävä DNA-siirtovektori, jota voidaan käyttää mikro-5 organismin transformoinnissa, tunnettu siitä, että siirtovektori sisältää ihmisen kasvuhormonia koodaavan deoksinukleotidisekvenssin, joka on seuraava: 5'-- TTK1CCL2ACL3ATM4CCL5X6TY6QR7S7W8GZ8X9Ty9TTK10GAK1,ΑΑΚ^ GCL1 3ATG1 4X1 5TY1 5W1 gGZ1 gGCL1 ?CAK1 g»., 9GZ-| 9X20TY20CAK21CAJ22X23TY23 18 OCI,24TTK25GAK26ÄCL;,7TAK28CAJ29CAJ30TTK31GAJ32OW33GCL34TAK35ATH36 ccl37aaj38gaj39caj4oAaj41tak42qr43s43ttk44x45ty45caj4(.aak47ccl48 “j49Acl500><5,S51Xs2tY52tgK53TTK540,>55S55GAJ5801.57S57a™58 CCL59ACL60CCI'61O'i62S62AM63,'64Gi!64<:SJ65GiU66ACL67CAJ6eCAJ69ÄM70 QR71S71AAK72X73TY73GAJ74X75TY75X76TY76W77GZ77A™78QR79S79X80TY80X81 TY81X82TY82A™83CAJ84QR85S85TGG86X87TY87GAJ88CCL89GTL90CAJ91 TTK92X93TY93W94GZ94QR95S95GTL96TTK97GCL98AAK99iR100S100X101TY101 GTL1 02TAK103GGL1 04GCL1 05QR1 06S106GAK107QR108S108*^109GTL110 TAK-l 11GAK11 2X11 3TY11 3X114TY114AAJ11 5GAK116X117TY11 7GAJ118GAJ11 9 GGL120A™121CAJ122ACL123X124TY124ATG125GGL126W127GZ127X128TY128 20 GAJ,29GAK,30GGL·,310R,32S,jjCCL,33W,34GZ,3.ACL,^GGL,^CAJ,3, A™1 38TTK1 39AAJ1 40CAJ1 41ACL1 42TAK143QR1 44S1 44AAJ1 45TTK1 46 GAK1 47ACL1 48AAK1 49QR150S1 50CAK151*^1 52®^ 53GAK1 54GCL155 X156TY156X157TY157AAJ158 AAK159TAK160GGL161X162TY162X163TY163TAK164 TGK165TTK166W167GZ1 68GAK169ATG1 70GAK171AAJ172GTL173GAJ1 74 ACL175TTK1 76X1 77TY177W178GZ178A™179GTL1 80CAJ1 81TGK1 82W183 GZ183QR1 84S1 84GTL185GAJ1 86GGL1 87QR188S188TGK1 eg001*! 90 TTK191---3', jossa 39 747 32 A on deoksiadenyyli, G on deoksiguanyyli, C on deoksisytosyyli, T on tymidyyli, 5. on A tai G, K on T tai C, L on A, T, C tai G, M on A, C tai T, X on T tai C, jos Y on A tai G, ja C, jos Y n J n n 10 on C tai T, Y on A, G, C tai T, jos X on C, ja A tai G, n J n J jos X on T, J n W on C tai A, jos Z on G tai A, ja C, jos n J n J J Z on C tai T, n 15. on A, G, C tai T, jos W on C, ja A tai G, n n J jos W on A, n QRn on TC, jos Sn on A, G, C tai T, ja AG, jos S on T tai C, Π S on A, G, C tai T, jos QR on TC, ja T tai C, n n 20 jos QR on AG, n ja alanumero n tarkoittaa ihmisen kasvuhormonin sen aminohapon asemaa, jota nukleotidisekvenssi vastaa geneettisen koodin mukaisesti ja aminohapot on numeroitu aminopäästä lukien.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen vektori, tunnettu siitä, että J on A seuraavissa asemissa: 32, 33, 39, 66, 68, 70, 119, 122 ja 129, J on G seuraavissa asemissa: 29, 30, 38, 40, 30 41, 46, 49, 56, 65, 69, 74, 84, 88, 91, 115, 118, 137, 140, 141, 145, 158, 168, 172, 174, 181 ja 186, K on T seuraavissa asemissa: 25, 31, 35, 42, 53, 111, 130, 153 ja 189, K on C seuraavissa asemissa: 26, 28, 44, 47, 35 54, 63, 72, 92, 97, 99, 103, 107, 109, 112, 116, 139, 143, 146, 147, 149, 151, 152, 154, 159, 160, 164, 165, 166, 169, 171, 176, 182 ja 191, 40 74732 L on A seuraavissa asemissa: 37, 60, 67, 148, 155 ja 175, L on T asemassa 135, L on G seuraavissa asemissa: 59, 90, 102, 123, 5 126, 136, 161, 180 ja 185, L on C seuraavissa asemissa: 24, 27, 34, 48, 50, 61, 89, 96, 98, 104, 105, 110, 120, 131, 133, 142, 173, 187 ja 190, M on T asemassa 58, 10. on C seuraavissa asemissa: 36, 78, 83, 121, 138 ja 179, X on C, Y on A seuraavissa asemissa: 73, 114, 117 ja 156, 15. on G seuraavissa asemissa: 45, 75, 80, 81, 87, 101, 124, 128,162 ja 177, Y on C seuraavissa asemissa: 52, 76, 82, 93, 113, 157 ja 163, W on A seuraavissa asemissa: 64, 94, 127 ja 167, 20 W on C seuraavissa asemissa: 77, 134, 178 ja 1 83, Z on G seuraavissa asemissa: 64, 94, 127, 134 ja 167, Z on C seuraavissa asemissa: 77, 178 ja 183,

25 QR on AG seuraavissa asemissa: 95, 100, 108, 132, 144 ja 188, QR on TC seuraavissa asemissa: 43, 51, 55, 57, 62, 71, 79, 85, 106, 150 ja 184, S on A seuraavissa asemissa: 43, 55 ja 150, 30. on T seuraavissa asemissa: 57, 95, 106 ja 184, S on G asemassa 85, ja S on C seuraavissa asemissa: 51, 62, 71, 79, 100, 108, 132, 144 ja 188.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen vekto ri, siirrettynä mikro-organismiin Escherichia coli, ja replikoituna mainitussa mikro-organismissa. 41 74732