FI65447C - Foerfarande foer framstaellning av en bakterie som innehaolleren foer tillvaexthormon kodande nukleotidsekvens - Google Patents

Description

65447

Menetelmä kasvuhormonia koodaavan nukleotidisekvenssin sisältävän bakteerin valmistamiseksi

Jakamalla erotettu hakemuksesta 781675 5 Tämä keksintö koskee menetelmää kasvuhormonia koodaavan nukleotidisekvenssin sisältävän bakteerin valmistamiseksi.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, 10 että a) mRNA eristetään aivolisäkesoluista homogenoimalla ne ribonukleaasia inhiboivan aineen läsnäollessa, jona aineena voidaan käyttää esimerkiksi noin 4 mol/1 guanidiniumtiosyanaattia ja 0,05...1,0 mol/1 /$-mer- 15 kaptoetanolia sisältävää liuosta pH:ssa 5,0...8,0, jolloin siis mRNA:n ribonukleaasihajoamista ei tapahdu, b) valmistetaan saadusta mRNA:sta sinänsä tunnetulla tavalla käänteistransskriptaasientsyymin avulla sellainen cDNA, jolla on kasvuhormonia koodaava nukleotidisekvens- 20 si, ja mainittu cDNA muutetaan kaksisäikeiseksi, c) liitetään restriktioendonukleaasin tunnistuskoh-tasekvenssit saadun kaksisäikeisen cDNA:n päihin sinänsä tunnetulla tavalla, jolloin restriktioendonukleaasina on sama entsyymi kuin seuraavassa kohdassa d), jonka jälkeen 25 cDNA katkaistaan mainitun restriktioendonukleaasin avulla siten, että muodostuu kohesiivisia päitä, d) avataan bakteerin plasmidivektori restriktioendonukleaasin avulla, esimerkiksi Hind III:n, Hsu I:n tai Eco Rl:n avulla, sinänsä tunnetulla tavalla esimerkiksi in- 30 kuboimalla pH:ssa 7,6 37°C:ssa 2 tunnin ajan, jotta saadaan avattu plasmidivektori, jolla on kohesiiviset päät, e) hydrolysoidaan kohdassa d) saadun plasmidivek-torin 5'-fosfaattipääteryhmät käsittelemällä esimerkiksi alkalisella fosfataasilla pH:ssa 8,0 65°C:ssa 30 minuutin 35 ajan, jolloin kohdassa d) mainitut kohesiiviset päät eivät 2 65447 voi liittyä toisiinsa, f) liitetään kohdan e) mukaisesti käsitelty plas-midivektori ja kohdassa c) saatu cDNA sinänsä tunnetulla tavalla inkuboimalla DNA-ligaasin ja ATP:n läsnäollessa, 5 esimerkiksi pH:ssa 7,6 14°C:ssa tunnin ajan, käyttäen plas- midivektorin moolista ylimäärää, ja g) sekoitetaan bakteeri, kuten E. coli-bakteeri, esimerkiksi E. coli X-1776, ja kohdassa f) saatu reaktiotuote, jotta saadaan kasvuhormonia koodaavan nukleotidi-10 sekvenssin sisältävä bakteeri.

Tässä selityksessä käytetään seuraavia symboleja ja lyhenteitä: DNA - deoksiribonukleiinihappo 15 RNA - ribonukleiinihappo

cDNA - komplentaarinen DNA

(syntetisoitu entsymaattisesti mRNA-sekvenssistä) mRNA - lähetti-RNA tRNA - siirtäjä-RNA

20 dATP - deoksiadenosiinitrifosfaatti dTTP - deoksitymidiinitrifosfaatti dGTP - deoksiguanosiinitrifosfaatti dCTP - deoksisytidiinitrifosfaatti A - adeniini 25 T - tyrniini G - guaniini C - sytosiini

Tris - 2-amino-2-hydroksietyyli-1,3-propaanidioli EDTA - etyleenidiamiinitetraetikkahappo 30 ATP - adenosiinitrifosfaatti TTP - tymidiinitrifosfaatti 65447 l

Hind III-tunnistuskohta --sekvenssi A VAGCTT, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Hind III-endonukleaasin avulla Hsu I-tunnistuskohta - sekvenssi A lAGCTT, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Hsu I-endonukleaasin avulla.

5 Hae III-tunnistuskohta - sekvenssi GG Ice, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Hae III-endonukleaasin avulla.

Col El - kolisiini El:ää muodostava plasmidi poly dA - polydeoksiadenylaatti 10 oligo ^12-18 " oligodeoksitymidylaatti (12-18 emästä)

Alu I-tunnistuskohta - sekvenssi AG ^CT, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Alu I-endonukleaasin avulla.

Bam HI-tunnistuskohta - sekvenssi G ^GATCC, spesifisesti 15 lohkaistu nuolen Bam HI - endonukleaasin avulla.

Bgl I-tunnistuskohta - sekvenssi GCCNNNN J'NGGC, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Bgl I-endonukleaasin avulla (Huom: N tarkoittaa nukleotidia).

Eco Rl-tunnistuskohta - sekvenssi G ^AATTC, spesifisesti 20 lohkaistu nuolen kohdalla Eco RI-endonukleaasin avulla.

Eco RII-tunnistuskohta - sekvenssi IcCAGG tai icCTGG, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Eco RII-endonukleaasin avulla.

Hae II-tunnistuskohta - sekvenssi AGCGcIt, AGCGci-C, 25 GGCGC tai GGCGclc, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Hae Il-endonukleaasin avulla.

Hha I-tunnistuskohta - restriktioendonukleaasi (saatu Haemophilus aegyptious-mikro-organismista Hinc II-tunnistuskohta - sekvenssi GTTAAC, GTTGAC, 30 GTCAAG tai GTCGAC, spesifisesti lohkaistu Hinc II-endonukleaasin avulla.

Pst I-tunnistuskohta - sekvenssi CTGCA * G, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Pst I-endonukleaasin avulla.

Sai I-tunnistuskohta - sekvenssi G ^TCGAC, spesi-35 fisesti lohkaistu nuolen kohdalla Sai I-endonukleaasin avulla.

4 65447

Sst I - tunnistuskohta - sekvenssi GAGCT^C, spesifisesti lohkaistu nuolen kohdalla Sst I-endonukleaasin avulla.

DNA:n emässekvenssin biologinen merkitys on siinä, että se on geneettisen informaation säilytyspaikka. On 5 tunnettua, että DNA:n emässekvenssi on koodi, jonka mukaisesti kaikkien solun valmistamien proteiinien aminohappojen järjestys määräytyy. Lisäksi sekvenssin osilla saattaa olla tehtävänä säädellä proteiinin valmistusajankohtaa ja määrää. Säätely-yksiköiden luonne tunnetaan vaillinaisesti. 10 Kunkin säikeen emässekvenssiä käytetään templaattina, kun DNA replikoituu solunjakaantumisessa.

Tapa, jolla DNA:n emässekvenssi-informaatiota käytetään proteiinien aminohappojärjestyksen määräämiseen, on pääpiirteiltään sama kaikilla elävillä organismeilla.

15 On osoitettu, että jokainen proteiineissa tavallisesti esiintyvä aminohappo määräytyy yhden tai useamman trinukleo-tidin eli triplettisekvenssin mukaan. Näin ollen jokaista proteiinia varten on olemassa vastaava DNA-segmentti, joka sisältää proteiinin aminohappojärjestystä vastaavan 20 triplettisekvenssin. Geneettinen koodi on esitetty seu-raavassa taulukossa.

Geneettinen koodi

Fenyylialaniini (Phe) TTK Histidiini (His) CAK

Leusiini (Leu) XTY Glutamiini (Gin) CAJ

25 Isoleusiini (Ile) ATM Asparagiini (Asn) AAK

Metioniini (Met) ATG Lysiini (Lys) AAJ

Väliini (Vai) GTL Asparagiinihappo (Asp) GAK

Seriini (Ser) QRS Glutamiinihappo (Glu) CAJ

Proliini (Pro) CCL Kysteiini (Cys) TGK

30 Treoniini (Thr) ACL Tryptofaani (Try) TGG

Alaniini (Ala) GCL Arginiini (Arg) WGZ

Tyrosiini (Tyr) TAK Glysiini (Gly) GGL

Päätesignaali TAJ

Päätesignaali TGA

35 Avain: Jokainen kolmen kirjaimen tripletti tarkoittaa DNA:n trinukleotidia, jossa on 5'-pää vasemmalla ja 3'-pää 65447 oikealla; kirjaimet edustavat puriini- ja pyrimidiiniemäk-siä, joista nukleotidisekvenssi muodostuu.

A = adeniini G * guaniini 5 C = sytosiini T = tyrniini

X = T tai C, jos Y on A tai G X = G, jos Y on C tai T Y = A, G, C tai T, jos X on C 10 Y - A tai G, jos X on T

W = C tai A, jos Z on A tai G W = C, jos Z on C tai T Z = A, G, C tai T, jos W on C Z = A tai G, jos W on A 15 QR = TC, jos S on A, G, C tai T

QR = AG, jos S on T tai C S * A, G, C tai T, jos QR, on TC S = T tai C, jos QR on AG J = A tai G 2 0 K = T tai C

L = A, T, C tai G M = A, C tai T

Transskriptioksi nimitetään ensimmäistä vaihetta siinä biologisessa prosessissa, jolla nukleotidisekvenssi-25 informaatio transformoidaan aminohapposekvenssiksi . Tässä vaiheessa kopioidaan ensin RNA:lla se DNA-segmentti, jonka sekvenssi määrittelee valmistettavan proteiinin. RNA on samanlainen polynukleotidi kuin DNA paitsi, että deoksi-riboosi on korvattu riboosilla ja tymiinin tilalla käyte-30 tään urasiilia. RNA:n emäkset voivat asettua samanlaisiksi emäspareiksi kuin DNA:n emäkset. Näin ollen DNA-nukleo-tidisekvenssin RNA-transskriptio on komplementaarinen kopioitavan sekvenssin kanssa. Tällainen RNA on niineltään lähetti-RNA (rnRNA), koska sen tehtävänä on toimia välittä- 6 65447 jänä solun geneettisen järjestelmän ja proteiineja syntetisoivan järjestelmän välillä.

Solun sisällä käytetään mRNArta templaattina siinä monimutkaisessa prosessissa, johon sisältyy lukuisia entsyy-5 mejä ja solujärjestelmiä, ja joka johtaa tietyn aminohapposekvenssin syntymiseen. Tätä prosessia nimitetään mRNA:n translaatioksi.

Usein esiintyy myös lisävaiheita, joissa translaatio-prosessissa syntetisoitu aminohapposekvenssi muunnetaan 10 funktionaaliseksi proteiiniksi. Insuliini on esimerkki tästä.

Insuliinin välitön prekursori on yksittäinen poly-peptidi, nimeltään proinsuliini, joka sisältää kaksi insuliiniketjua, A ja B, joita yhdistää peptidi C 15 Cks. Steiner, D.F., Cunningham, D., Spigelman, L. ja Aten, B. Science 157 , 697 (1967)). Viimeaikaisen tiedon mukaan insuliinin mRNA:n alkuperäinen translaatiotuote ei ole proinsuliini vaan preproinsuliini, joka sisältää 20 lisäami-nohappoa proinsuliinin aminopäässä Cks. Cahn., S.J., 20 Keim, P. ja Steiner D.F., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 73, 1961* (1976) ja Lomedico, P.T. ja Saunders, G.F., Nucl.

Acids. Res. 3 , 381 ( 1976)). Preproinsuliinin rakenne voidaan esittää seuraavasti: NHg(pre-peptidi)-ketju B-(ketju O-ketju A-C00H.

25 Monet lääketieteen tai tutkimuksen kannalta merkit tävät proteiinit sijaitsevat korkeampien organismien, kuten selkärankaisten, soluissa tai ovat näiden solujen valmistamia. Näitä ovat mm. insuliinihormoni, muut peptidihor-monit, kuten kasvuhormoni, verenpainetta säätelevät hor-30 monit ja monet teollisesti, lääketieteellisesti tai tutkimuksellisesti merkittävät hormonit. Näitä proteiineja on usein vaikea eristää käyttökelpoisia määriä, ja tämä ongelma on varsin vaikea ihmisistä peräisin olevien proteiinien kohdalla. Näin ollen tarvitaan menetelmiä, 35 joilla tällaisia proteiineja voidaan valmistaa riittäviä määriä soluissa organismin ulkopuolella. Tietyissä tapauk- 7 65447 sissa on mahdollista saada aikaan sopivia solulinjoja, joita voidaan pitää elossa kudosviljelytekniikalla. Kudosviljely on kuitenkin hidasta, elatusaine kallista, olosuhteiden säätely tarkkaa ja saanto pieni. Lisäksi on usein vaikeata säilyttää solu-5 linja vakiona siten, että halutut erityisominaisuudet säilyvät.

Sitä vastoin mikro-organismeja, kuten bakteereja, on suhteellisen helppo viljellä kemiallisesti määritellyissä elatusai-neissa. Fermentointitekniikka on pitkälle kehittynyttä. Organismien viljeleminen nopeasti ja suurilla saannoilla on mahdollis-10 ta. Lisäksi eräät mikro-organismit ovat geeniensä ja ominaisuuk-siensa puolesta perusteellisesti tutkittuja ja tunnettuja.

Näin ollen on erittäin toivottavaa pystyä siirtämään lääketieteellisesti merkittävän proteiinin geneettinen koodi organismista, joka tavallisesti tekee proteiinin, sopivaan mikro-15 organismiin. Tällä tavalla mikro-organismi voi syntetisoida proteiinia säädellyissä kasvuolosuhteissa ja proteiinia voidaan saada haluttu määrä. Vamistuskustannuksia voidaan ehkä myös oleellisesti pienentää, jos proteiinia syntetisoidaan tällaisella menetelmällä. Lisäksi mahdollisuus eristää ja siirtää tietyn proteiinin val-20 mistuksen määrittelevä geneettinen sekvenssi mikro-organismiin, jonka geneettinen tausta tunnetaan hyvin, tarjoaa suuriarvoisen tutkimuskeinon, kun halutaan tietää, kuinka tämän proteiinin synteesi on säädelty ja kuinka proteiinia muokataan synteesin jälkeen. Geneettisiä sekvenssejä voidaan myös transformoida niin, että saa-25 daan terapeuttisilta tai funktionaalisilta ominaisuuksiltaan muuntuneita proteiineja.

Tämän keksinnön mukainen menetelmä on monivaiheinen menetelmä, joka sisältää entsyymien katalysoimia reaktioita. Näiden entsyvmirekatioiden luonnetta selostetaan tähän mennessä tiedossa 30 olevien seikkojen perusteella.

Käänteistransskriptaasi (DNA-polymeraasi) katalysoi RNA-templaattisäikeen kanssa komplementaarisen DNA:n synteesiä RNA-templaatin, DNA-templaatin ja neljän deoksinukleosiditrifosfaatin, dATP, dGTP, dCTP ja dTTP, läsnäollessa. Reaktio lähtee käyntiin 35 DNA-templaatin ei-kovalenttisella sitoutumisellamRNA:n 3'-päähän ja sen jälkeen seuraa tarvittavien deoksinukleoditien asteittainen liittäminen kasvavan ketjun 3'-päähän mRNA-nukleotidisekvenssin 8 65447 määritteleminä emäspareina. Saatua molekyyliä voidaan pitää hiusneularakenteena, joka sisältää alkuperäisen RNA:n liittyneenä yksittäisellä DNA-säikeellä komplementaariseen DNA-säikeeseen. Käänteistransskriptaasi kykenee myös kata-5 lysoimaan samanlaisen reaktion käyttämällä yksisäikeistä DNA-templaattia, jolloin saatu tuote on kaksisäikeinen DNA-hiusneula, jonka toisessa päässä säikeitä yhdistää yksisäikeinen DNA, ks. Aviv, H. ja Leder, P., Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 69, 1408 (1972) ja Efstratiadis, A., Kafatos, 10 F.C., Maxam, A.F. ja Maniatis, T., Cell 7, 279 (1976).

Restriktioendonukleaasit ovat entsyymejä, jotka pystyvät hydrolysoimaan fosfodiesterisidoksia kaksisäikeises-sä DNA:ssa niin, että DNA-säikeeseen muodostuu katkoskohta.

Jos DNA on suljetun silmukan muotoinen, silmukan rakenne 15 muuttuu lineaariseksi. Tämän tyyppisen entsyymin pääasiallinen ominaisuus on siinä, että sen hydrolyyttinen vaikutus kohdistuu vain sellaiseen kohtaan, jossa on tietty nukleotidisekvenssi. Tätä sekvenssiä nimitetään restriktio-endonukleaasin tunnistuskohdaksi. Restriktioendonukle-20 aaseja on eristetty useista eri lähteistä ja karakterisoitu tunnistuskohtieiisa nukleotidisekvenssin perusteella.

Eräät restriktioendonukleaasit hydrolysoivat fosfodiesteri-sidokset samasta kohdasta kummassakin säikeessä niin, että syntyy tylppä pää. Eräät katalysoivat sellaisten sidosten 25 hydrolyysiä, joita erottaa toisistaan muutama nukleotidi, ja molekyylin kumpaankin päähän syntyy vapaa yksisäikeinen alue. Tällaiset yksisäikeiset päät ovat itsekomplementaa-risia ja siten kohesiivisia, ja niitä voidaan käyttää hydrolysoidun DNA:n uudelleenliittämiseen. Koska tietyn 30 entsyymin voidaan ennustaa pilkkovan saman tunnistuskoh-dan omaavia DNA-molekyylejä, syntyy samat kohesiiviset päät, ja näin ollen on mahdollista yhdistää restriktio-endonukleaasilla käsiteltyjä heterologisia DNA-sekvensseja muihin samalla tavalla käsiteltyihin sekvensseihin, ks.

35 Roberts, R.J. Crit. Rev. Biochem. 4, 123 (1978). Restrik- tiokohdat ovat kuitenkin melko harvinaisia, mutta restriktio- 9 65447 endonukleaasien käyttökelpoisuutta on voitu parantaa syntetisoimalla sellaisia kaksisäikeisiä oligonukleotideja, joissa on tunnistuskohtasekvenssi. . Näin ollen voidaan melkeinpä mikä tahansa DNA-segmentti liittää mihin tahansa 5 toiseen segmenttiin siten, että molekyylin päihin liitetään tarvittava restriktio-oligonukleotidi, tuote asetetaan tarvittavan restriktioendonukleaasin vaikutukselle alttiiksi,niin että syntyy tarvittavat kohesiiviset päät (ks. Heyneker, H.L., Shine, J., Goodman, H.M., Boyer, H.W., 10 Rosenberg, J., Dickerson, R.E., Narang, S.A., Itakura, K., Lin, S. ja Riggs, A.D., Nature 263, 748 (1976) ja Scheller, R.H., Dickerson, R.E., Boyer, H. W., Riggs, A.D. ja Itakura, K., Science 196 , 177 ( 1977)).

Sl-endonukleaasi on yleisentsyymi, joka kykenee 15 hydrolysoimaan yksisäikeisen DNA:n fosfodiesterisidoksia tai kaksisäikeisessä DNA:ssa olevia yksisäikeisiä liitoskohtia f ks. Vogt, V.M., Eur. J. Biochem. 33 , 192 ( 1973 )).

DNA-ligaasi on entsyymi, joka kykenee katalysoimaan fosfodiesterisidoksen syntymisen kahden sellaisen DNA-seg-20 mentin välille, joissa on 5'-fosfaatti ja 3'-hydroksyyli, vastaavasti, ja jollainen saattaa muodostua kahdesta DNA-fragmentista, joita kohesiiviset päät pitävät yhdessä. Entsyymin normaalina toimintatapana pidetään sitä, että se yhdistää toisen säikeen rinnalle syntyvät useat tytär-DNA-25 fragmentit toisiinsa. DNA-ligaasi voi kuitenkin sopivissa olosuhteissa katalysoida sellaisten tylppien päiden yhtymisen, joissa kaksi tylppäpäistä molekyyliä yhtyy kovalent-tisesti( ks. Sgaramella, V., Van de Sande, J.H. ja Khorana, H.G., Proc. Nat 1. Acad. Sei. USA 67 , 1468 (1970)).

Alkalinen fosfataasi on yleisentsyymi, joka kykenee hydrolysoimaan fosfaattiestereitä, DNA:n 51-päätefosfaatit mukaanluettuina.

Tämän keksinnön mukaisen menetelmän osavaiheessa sijoitetaan tietty DNA-fragmentti DNA-vektoriin, kuten 35 plasmidiin. Γ] asm idi on nimitys, jota käytetään mistä tahansa itsenäisesti replikoituvasta DNA-yksiköstä, joka on 10 65447 • raikrobisolussa eikä kuulu isäntäsolun omaan genomiin. Plas-midi ei ole geneettisesti sitoutunut isäntäsolun kromosomiin. Plasmidi-DNA esiintyy rengasmaisina kaksisäikeisinä molekyyleinä, joiden molekyylipaino tavallisesti on muutama 8 5 miljoona, joidenkin jopa yli 10 , ja ne edustavat tavallisesti vain pientä prosenttimäärää solun kokonais-DNA:sta. Plasmidi-DNA voidaan tavallisesti suuren kokoeronsa vuoksi erottaa isäntäsolun DNA:sta. Plasmidit voivat replikoitua isäntäsolun jakaantumisnopeudesta riippumatta ja joskus nii-10 den jakaantumisnopeutta voidaan säädellä kasvuolosuhteita muuttamalla. Vaikka plasmidi esiintyykin suljettuna renkaana, siihen voidaan keinotekoisesti liittää DNA-segmentti niin, että syntyy molekyylipainoltaan suurempi rekombinoitu plasmidi, jonka replikoitumiskyky ja geenien ekspressiokyky 15 eivät ole oleellisesti muuttuneet. Näin ollen plasmidi toimii hyödyllisenä vektorina, joka siirtää DNA-segmentin uuteen isäntäsoluun. Rekombinoitua DNA:ta käyttävään teknologiaan soveltuvia plasmideja ovat varsinkin sellaiset, jotka sisältävät valintatarkoituksiin sopivia geenejä, kuten geenejä, 20 jotka aiheuttavat lääkeaineiden vastustuskykyä.

11 65 447

Esimerkkeinä tähän keksintöön kuuluvista spesifisistä DNA-sekvens-seistä siirretään rotan kasvuhormonin ja ihmisen kasvuhormonin rakenne-geeni Dakteeriin. Näin ollen voidaan ajatella, että menetelmää voidaan hyvin soveltaa minkä tahansa korkeammalta 5 organismilta, kuten selkärankaiselta, otetun DNA-sekvenssin siirtämiseen bakteeri-isäntään. Tässä yhteydessä korkeampi organismi määritellään miksi tahansa erilaistuneita kudoksia sisältäväksi eukaryoottiseksi organismiksi, joihin kuuluvat mm. hyönteiset, nilviäiset, kasvit ja selkärankaiset, 10 nisäkkäät mukaanluettuina, joihin puolestaa kuuluvat nautaeläimet, siat, kädelliset ja ihminen.

Kyseisessä prosessissa haluttu solukko eristetään ensin parannetulla menetelmällä. mRNA eristetään soluista muuttumattomana uudellh menetelmällä, jossa RNA-aasi-15 aktiivisuus on käytännöllisesti katsoen kokonaan hävitetty. Vahingoittumaton mRNA puhdistetaan uutteesta pylväs-kromatografisesti ja se saatetaan käänteistransskriptaasi-entsyymin vaikutukselle alttiiksi komplementaarisen säikeen (cDNA) syntetisoimisessa tarvittavien neljän 20 deoksinukleosiditrifosfaatin läsnäollessa. Tässä ensimmäisessä vaiheessa käänteistransskriptaasin avulla saatuun tuotteeseen kohdistetaan menettely, jolla ribonukleotidi-sekvenssi poistetaan selektiivisesti. Jäljelle jäänyttä deoksinukleotidisekvenssiä, joka on komplementaarinen al-25 kuperäisen mRNA:n kanssa, inkuboidaan toisessa reaktiossa käänteistransskriptaasin eii DNA-polymeraasin kanssa neljän deoksinukleosiditrifosfaatin läsnäollessa. Saatu tuote on kaksinkertainen cDNA, jonka komplementaariset säikeet ovat liittyneet toisiinsa yksinkertaisella säikeellä toi-30 sesta päästä. Siten tämä tuote käsitellään yksinkertaiselle 12 65447 säikeelle spesifisellä nukleaasilla, joka katkaisee yksinkertaisen yhdistävän säikeen. Saatua kaksisäikeistä cDNA:ta pidennetään lisäämällä kumpaankin päähän tietty DNA, joka sisältää restriktioentsyymin tunnistuskohtasekvenssin.

5 Lisäys katalysoidaan DNA-1 igaasi-entsyymillä. Tämän jälkeen pidennetty cDNA käsitellään restriktioendonukleaasilla, joka tuottaa itsekomplementoituvat yksisäikeiset päät kaksois-säikeen kummankin säikeen 5’-päähän.

Plasmidi-DNA, jossa on saman restriktioendonukleaasin 10 tunnistuskohta, käsitellään entsyymillä siten, että polynukleotidisäie katkeaa ja muodostuu itsekomplementoituvat yksisäikeiset nukleotidisekvenssit 5'-päihin. Yksisäi-keisten päiden 5'-päätefosfaattiryhmät poistetaan, jotta plasmidi ei pystyisi muodostamaan isäntäsolua transformoi-15 vaa rengasrakennetta. Valmistettua cDNA:ta ja plasmidi-DNA: ta inkuboidaan yhdessä DNA-ligaasin läsnäollessa. Kuvatuissa reaktio-olosuhteissa voi elinkelpoinen suljettu rengasplasmidi-DNA syntyä vain, jos siihen sisältyy cDNA-seg-mentti. cDNA-sekvenssin sisältävä plasmidi siirretään tä-20 män jälkeen sopivaan isäntäsoluun. Sellaiset solut, jotka ovat saaneet elinkelpoisen plasmidin, tunnistetaan kasvatuksessa pesäkkeistä, joilla on plasmidille kuuluva geneettinen ominaisuus, kuten lääkkeenvastustuskyky. Tämän jälkeen viljellään niitä puhtaita bakteerikantoja, joissa on cDNA-25 sekvenssin sisältävä rekombinoitu plasmidi, ja rekombinoitu plasmidi eristetään uudelleen. Tällä tavalla voidaan valmistaa suuria määriä rekombinoitua plasmidi-DNA:ta ja spesifinen cDNA-sekvenssi voidaan eristää tästä endonukleolyyt- tisellä lohkaisulla sopivan restriktioentsyymin· avulla.

13 65447 Tämä keksintö koskee menetelmää, jolla tietyn nukleo-tidisekvenssin omaava DNA-molekyyli voidaan eristää ja siirtää mikro-organismiin ja alkuperäinen DNA:n nukleotidisek-venssi löytää replikoitumisen jälkeen organismista, ja jon-5 kan menetelmän eri vaiheet voidaan jakaa neljään ryhmään: 1. Halutun solukon eristäminen korkeammasta organismista

Tietyn proteiinin geneettiselle koodille on olemassa kaksi mahdollista lähdettä, nimittäin lähdeorganismin DNA 10 tai DNA:n RNA-transskriptio. Yhdysvaltain kansallisten ter-veysinstituuttien (National Intitutes of Health) tämänhetkisten turvallisuusvaatimusten mukaan ihmisen geenejä, olivatpa ne millaisia tahansa, voidaan sijoittaa rekombinoituun DNA:han ja sen jälkeen bakteereihin vain silloin, kun geenit 15 ovat perusteellisesti puhdistettuja, tai kun käytössä on erityisen suuria riskejä sisältävälle työskentelylle tarkoitetut tilat (P4), ks. Federal Register, Voi. 41, No. 131, 1967-07-07, ss. 27902 - 27943. Näin ollen millä tahansa ihmisen proteiinin valmistukseen tähtäävällä menetelmällä, 20 kuten tämän keksinnön sisältämällä menetelmällä, on lähdettävä sellaisen spesifisen mRNA:n eristämisestä, joka sisältää halutun proteiinin koodin. Tässä toimintatavassa on lisäksi se etu, että solusta uutettu mRNA voidaan puhdistaa helpommin kuin solusta uutettu DNA. Varsinkin on mahdollista 25 käyttää hyväkseen sitä seikkaa, että pitkälle erikoistuneissa organismeissa, kuten selkärankaisissa, on tietyissä paikoissa tiettyjä solukkoja, joiden tehtävänä on tuottaa jotakin kyseeseen tulevaa proteiinia. Vaihtoehtoisesti tällainen solukko voi esiintyä jossakin organismin kehitysvaiheessa.

30 Suurin osa tällaisen solukon soluista eristetystä mRNA:sta sisältää halutun nukleotidisekvenssin. Näin ollen eristettävän solukon ja eristysmenetelmän valinnassa voidaan ottaa huomioon ne edut, joita eristettävän mRNA:n alkuperäinen puhtausaste tarjoaa.

14 65447

Useimmissa kudoksissa, rauhasissa ja elimissä soluja yhdistää kuituinen sidekudos, joka on koostunut pääasiassa kollageenista, mutta voi kudoksesta riippuen sisältää myös muita rakenneproteiineja, polysakkarideja ja kivennäisaine-5 varastoja. Solujen eristäminen tietystä kudoksesta edellyttää menetelmiä, joilla solut voidaan irrottaa sidekudoksesta. Tietyn erikoistuneen solutyypin eristäminen ja puhdistaminen sisältää näin ollen kaksi päävaihetta, jotka ovat solujen erottaminen sidekudoksesta ja halutun solutyypin erottaminen 10 muun tyyppisistä kudoksen soluista.

1 Usein on todettu, että halutun mRNA:n osuutta voidaan lisätä käyttämällä hyväksi solun kykyä reagoida ulkoisiin ärsykkeisiin. Esimerkiksi hormonikäsittely saattaa aiheuttaa halutun mRNA:n tuotannon lisääntymisen. Muita menetelmiä 15 ovat kasvatus tietyssä lämpötilassa ja/tai tietyssä ravinteessa tai muussa kemiallisessa aineessa.

2. mRNA:n uuttaminen Tärkeä piirre tässä keksinnössä on se, että solu-uutteesta poistetaan RN-aasiaktiivisuus käytännöllisesti katsoen 20 kokonaan. Uutettava mRNA on yksisäikeinen polynukleotidi, jossa ei ole mitään komplementaarista säiettä. Näin ollen yhdenkin fosfodiesterisidoksen hydrolyyttinen katkeaminen sekvenssissä tekisi koko molekyylin kykenemättömäksi siirtämään vahingoittumatonta geneettistä sekvenssiä mikro-organismiin.

25 Kuten edellä mainittiin, RN-aasi on laajalle levinnyt, ja se on hyvin aktiivinen ja poikkeuksellisen pysyvä. Sitä on iholla, se kestää tavalliset lasitavaroiden pesumenetelmät ja joskus se kontaminoi orgaaniset kemikaalit. Haimasolu-uuttei-ta käsiteltäessä vaikeudet ovat erittäin suuret, sillä haima 30 tuottaa ruuansulatusentsyymejä ja on siten hyvin RN-aasipi-toinen. RN-aasiepäpuhtaus koskee kuitenkin kaikkia kudoksia ja tässä selostettua RN-aasiaktiivisuuden tuhoamismenetelmää voidaan soveltaa kaikkiin soluihin.

15 65447 Tässä keksinnössä käytetään kaotrooppisen anionin, kaotrooppisen kationin ja disulfidisidoksia pilkkovan reagens-sin yhdistelmää solujen rikkomisen aikana ja kaikkien niiden operaatioiden aikana, jotka tarvitaan käytännöllisesti kat-5 soen proteiinittoman mRNA:n aikaansaamiseksi.

Sopivien kaotrooppisten ionien valinta riippuu niiden vesiliukoisuudesta ja saatavuudesta. Sopivia kaotrooppi-sia kationeja ovat mm. guanidinium, karbamoyyliguanidinium, guanyyliguanidinium, litium tms. Sopivia kaotrooppisia an-10 ioneja ovat mm. jodidi, perkloraatti, tiosyanaatti, dijodi-salisylaatti tms. Tällaisten anionien ja kationien muodostamien suolojen suhteellinen tehokkuus määräytyy niiden liukoisuuden mukaan. Esimerkiksi litiumdijodisalisylaatti on voimakkaampi denaturantti kuin guanidiniumtiosyanaatti, mutta 15 sen liukenevuus on vain noin 0,1 M ja se on myös suhteellisen kallista. Guanidiniumtiosyanaatti on etusijalle asetettava kationi-anioniyhdistelmä, koska sitä on helposti saatavissa ja sen liukenevuus vesiliuoksiin on hyvä, jopa noin 5 mol/1.

Tiöliyhdisteiden, kuten /S-merkaptoetanolin, tiede-20 tään rikkovan tioli-disulfidivaihtoreaktiolla proteiinien molekyylinsisäisiä disulfidisidoksia. /S-merkaptoetanolin lisäksi tunnetaan useita sopivia tioliyhdisteitä, kuten di-tiotreitoli, kysteiini, propanolidimerkaptaani tms. Vesiliukoisuus on tarpeellinen vaatimus, sillä tioliyhdistettä 25 pitää olla läsnä suuri ylimäärä molekyylinsisäisiin disul-fideihin verrattuna, jotta vaihtoreaktio tapahtuisi käytännöllisesti katsoen täydellisesti,/S-merkaptoetanoli on asetettava etusijalle, koska sitä on helposti saatavissa kohtuulliseen hintaan.

30 Tietyn kaotrooppisen suolan tehokkuus on suoraan ver rannollinen sen väkevyyteen, kun halutaan inhiboida RN-aasi uutettaessa RNA:ta soluista tai kudoksista. Edullinen väkevyys on sen vuoksi suurin käytännössä toteutettavissa oleva väkevyys. Sen, että tässä keksinnössä onnistutaan säilyttä-35 mään roRNA vahingoittumattomana uuton aikana, arvellaan johtuvan siitä nopeudesta, jolla RN-aasi denaturoituu, ja denatu- 16 65447 roitumisasteesta. Näin ilmeisesti selittyy guanidiniumtiosya-naatin paremmuus hydrokloridiin nähden, vaikka hydrokloridi on denaturointiaineena vain hieman heikompi. Denaturointiai-neen tehokkuus määritellään siksi kynnysväkevyydeksi, joka 5 tarvitaan proteiinin täydelliseen denaturoimiseen. Toisaalta proteiinin denaturoitumisnopeus riippuu usein denaturantin väkevyyden suhteesta kynnysarvoon 5 - 10 potenssiin korotettuna, ks. Tanford, C. A., Adv. Prot. Chem. 23, 121 (1968). Kvalitatiivisesti tämä suhde merkitsee sitä, että guanidinium-10 hydrokloridia vain hieman tehokkaampi denaturantti pystyy denaturoimaan proteiinin monta kertaa nopeammin samana konsent-raationa. RN-aasidenaturaation kinetiikan ja mRNA:n säilymisen välistä suhdetta soluista tapahtuvan uuton aikana ei nähtävästi ole havaittu eikä tutkittu ennen tätä keksintöä.

15 Jos edellä oleva analyysi on oikea, pitäisi edullisen denaturantin olla sellainen, jolla on matala kynnysväkevyys denatu-roinnissa ja suuri vesiliukoisuus. Tämän vuoksi guanidinium-tiosyanaatti on edullisempi kuin litiumdijodisalisylaatti, vaikka viimeksimainittu on voimakkaampi denaturantti, sillä 20 guanidiniumtiosyanaatti on liukoisempi, ja näin ollen sitä voidaan käyttää sellaisena väkevyytenä, että RN-aasi inakti-voituu nopeammin. Edellä oleva analyysi selittää myös, miksi guanidiniumtiosyanaatti on edullisempi kuin lähes yhtä liukoinen hydrokloridi (syanaatti on hieman voimakkaampi denatu-25 rantti kuin hydrokloridi).

Disulfidisidoksia katkaisevan reagenssin käyttö yhdessä denaturantin kanssa tekee mahdolliseksi jälkimmäisen vaikutuksen ja tehostaa sitä, koska RN-aasimolekyyli muuttuu kokonaan avautuneeksi. Tioliyhdisteen ajatellaan auttavan 30 denaturointiprosessin etenemistä, koska se estää nopean de-naturoinnin, joka voi tapahtua, jos molekyylinsisäiset di-dulfidisidokset jätetään koskemattomiksi. Lisäksi mRNA-val-misteen sisältämä RN-aasiepäpuhtaus säilyy käytännöllisesti katsoen inaktiivisena, vaikka denaturanttia ja tiolia ei 35 olisikaan läsnä. Disulfidisidoksia katkaisevat reagenssit, joissa on tioliryhmiä, ovat jossain määrin tehokkaita minä 65447 17 tahansa konsentraationa, mutta on edullista käyttää suurta tioliryhmien ylimäärää molekyylinsisäisiin disulfidisidoksiin verrattuna, jolloin vaihtoreaktio saadaan ajetuksi molekyylin-sisäisten disulfidisidosten katkeamisen suuntaan. Toisaalta, 5 koska monet tioliyhdisteet ovat pahanhajuisia ja suurten väkevyyksien kanssa on epämiellyttävä työskennellä, on käytännön syistä olemassa väkevyyden yläraja. Kun /3-merkaptoeta-nolia käytetään vahingoittumattoman RNA:n erottamiseen, on alueella 0,05 - 1,0 M olevat väkevyydet havaittu tehokkaiksi, 10 ja optimaalisen väkevyyden katsotaan olevan 0,2 M.

Väliaineen.pH voi olla välillä 5,0 - 8,0, kun mRNA uutetaan soluista.

Solujen rikkomisen jälkeen RNA erotetaan solun proteiineista ja DNA:sta. Tähän tarkoitukseen on kehitetty useita 15 menetelmiä.

Tavallinen käytetty menetelmä on etanolisaostus, jolla RNA saostetaan selektiivisesti. Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä on edullisempaa jättää saostusvaihe pois ja kerrostaa homogenaatti suoraan 5,7 M cesiumkloridiliuokseen sent-20 rifugiputkessa ja sen jälkeen suorittaa sentrifugointi julkaisussa Glisin, V., Crvenjakov, R. ja Byus, C., Biochemistry 13, 2633 (1974) kuvatulla tavalla. Tämä menetelmä on edullinen, koska RN-aasille vahingollinen ympäristö voidaan säilyttää koko ajan ja saadaan hyvällä saannolla RNA:ta, joka ei sisäl-25 lä DNA:ta eikä proteiinia.

Edellä kuvatulla menetelmällä saadaan soluhomogenaa-tin koko RNA puhdistetuksi. Tästä RNArsta on kuitenkin haluttua mRNA:ta vain osa. Puhdistusta jatkettaessa käytetään hyväksi sitä seikkaa, että korkeampien organismien soluissa 30 mRNA:ta prosessoidaan transskription jälkeen siten, että siihen liitetään polyadenyylihappoa. Tällainen poly-A-sekvens-sejä sisältävä mRNA voidaan erottaa selektiivisesti kromato-grafiapylväässä, jossa on täytteenä selluloosaa, johon on liitetty oligotymidylaattia, ks. Avis, H. ja Leder, P. edel-35 lä. Edellä kuvattu menetelmä on sopiva silloin, kun tarvi- 18 65447 taan käytännöllisesti katsoen puhdasta, vahingoittumatonta ja translaatiokelpoista mRNArta RN-aasia runsaasti sisältävistä lähteistä. mRNAm puhdistus ja sen jälkeiset in varotoimenpiteet voidaan suorittaa käytännöllisesti katsoen sa-5 maila tavalla mille tahansa mRNAtlle huolimatta lähde-organismista.

Tietyissä tapauksissa, kuten käytettäessä kudosvil-jelmäsoluja mRNA-lähteenä, RN-aasiepäpuhtaus voi olla niin vähäinen, ettei edellä kuvattua RN-aasin inhibointia tarvita. 10 Tällöin ennestään tunnetut RN-aasiaktiivisuuden poistomenetelmät riittävät.

3. cDNArn muodostaminen Tässä yhteydessä viitataan kuvioon 1, jossa on kaavioesitys menetelmän jäljellä olevista vaiheista. Ensiramäi-15 senä vaiheena on puhdistetun mRNA:n kanssa komplementaarisen DNA-sekvenssin muodostaminen. Tämän reaktion entsyymiksi valitaan käänteistransskriptaasi, vaikka periaatteessa voidaan käyttää mitä tahansa sellaista entsyymiä, joka kykenee muodostamaan komplementaarisen DNA-säikeen käyttämällä mRNA:ta 20 templaattina. Reaktio voidaan suorittaa ennestään tunnetuissa olosuhteissa siten, että mRNAsta käytetään templaattina ja neljän deoksinukleosiditrifosfaatin seosta DNA-säikeen prekursorina. On edullista, jos yksi deoksinukleosiditrifos- 32 faateista on merkitty Q,-asemassa P-atomilla, sillä sen 25 avulla voidaan seurata reaktiota, se toimii merkkinä erotusmenetelmissä, kuten kromatografiässä ja elektroforeesissa, ja sen avulla voidaan tehdä kvantitatiivisia päätelmiä, ks.

Efstratiadis, A., et ai., edellä.

Kuten kuvasta ilmenee, käänteistransskriptaasin 30 reaktiotulos on kaksisäikeinen hiusneularakenne, jossa RNA-säiettä ja DNA-säiettä yhdistää toisiinsa ei-kovalenttinen sidos.

Käänteistransskriptaasireaktion tuote poistetaan reaktioseoksesta tunnetuilla menetelmillä. On havaittu hyö-35 dylliseksi käyttää fenoliuuton, kromatografiän ("Sephadex G-100", Pharmacia Inc., Uppsala, Ruotsi) ja etanoliuuton yhdistelmää.

65447

Kun CDNA on syntetisoitu entsymaattisesti, RNA-templaatti voidaan poistaa. Ennestään tunnetaan useita menetelmiä, joilla RNA voidaan hajottaa selektiivisesti DNA:n läsnäollessa. Alkalinen hydrolyysi on edullinen menetelmä, 5 koska se on hyvin selektiivinen ja sitä voidaan hyvin helposti säädellä pH:n avulla.

Alkalisen hydrolyysin ja neutraloinnin jälkeen 32 P:llä merkitty cDNA voidaan haluttaessa väkevöidä etanoli-saostuksella.

10 Tällaisen kaksisäikeisen hiusneula-cDNA:n synteti sointi tapahtuu sopivan entsyymin, kuten DNA-polymeraasin tai käänteistransskriptaasin avulla. Reaktio-olosuhteet ovat 32 aikaisemmin kuvatun kaltaiset, Cfc- P:llä merkitty nukleosi-ditrifosfaatti mukaanluettuna. Käänteistransskriptaasia saa-15 daan useista lähteistä. Linnun myeloblastosis-virus on edullinen lähde. Virusta valmistaa tri D. J. Beard, Life Sciences Incorporated, St. Petersburg, Florida, National Institutes of Health'in kanssa tekemällään sopimuksella.

Kun cDNA-hiusneula on muodostettu, saattaa olla 20 edullista puhdistaa se reaktioseoksesta. Kuten aikaisemmin mainittiin, on havaittu edulliseksi käyttää fenoliuuttoa, kromatografiaa ("Sephadex G-100") ja etanolisaostusta, kun DNA halutaan saada puhdistetuksi proteiiniepäpuhtauksista.

. Hiusneularakenne voidaan muuntaa tavalliseksi kak- 25 sisäikeiseksi DNA-rakenteeksi siten, että komplementaarisia säikeitä yhdistävä yksittäinen säie poistetaan. On olemassa useita entsyymejä, jotka kykenevät spesifisesti hydrolysoimaan DNA:n yksisäikeisiä osia. Tähän tarkoitukseen hyvin sopiva entsyymi on Aspergillus oryzaesta eristetty S1-nukle-30 aasi (valmistaja Miles Research Products, Elkhart, Indiana). Kun DNA-hiusneularakenne käsitellään S1-nukleaasilla, saadaan hyvällä saannolla sellaisia molekyylejä, joissa on emäs-paripäät. Tämän jälkeen suoritetaan uutto, kromatografia ja etanolisaostus, kuten edellä on kuvattu. Efstratiadis et ai. 35 ovat edellä mainitussa julkaisussa selostaneetmRNA:n kaksi-säikeisten cDNA-transskriptioiden syntetisointia käänteistransskriptaasin ja S1-nukleaasin avulla.

2θ 65447

Tylppäpäisten cDNA-molekyylien osuutta voidaan mahdollisesti lisätä, jos suoritetaan käsittely E. colin DNA-polymeraasi I:llä neljän deoksinukleosiditrifosfaatin läsnäollessa. Entsyymin eksonukleaasiaktiivisuuden ja polymeraasi-5 aktiivisuuden yhteisvaikutus toimii siten, että ulkoneva 3'-pää poistuu ja ulkoneva 5'-pää täyttyy. Näin voidaan varmistaa, että mahdollisimman suuri määrä cDNA-molekyylejä osallistuu seuraavan vaiheen liittämisreaktioihin.

Keksinnön mukaisen menetelmän seuraavassa vaiheessa 10 käsitellään cDNA-tuotteen päät niin, että kuhunkin päähän saadaan restriktioendonukleaasin tunnistuskohdan sekvenssi. Käytännön syyt määräävät päihin liitettävän DNA-fragmentin valinnan. Päihin lisättävä sekvenssi valitaan restriktioendonukleaasin perusteella ja tämä puolestaan valitaan sen DNA-15 vektorin perusteella, johon cDNA liitetään. Valittavassa plas-midissa pitäisi olla vähintään yksi kohta, johon restriktioendonukleaasin katkaisuvaikutus voi kohdistua. Esimerkiksi plasmidi pMB9 sisältää yhden tunnistuskohdan entsyymille Hind III. Hind III eristetään Haemophilus influenzaesta ja 20 puhdistetaan seuraavalla menetelmällä: Smith, H. 0. ja Wilcox, K. W., J. Mol. Biol. 51, 379 (1970). Haemophilus aegyptious-organismin entsyymi Hae III puhdistetaan seuraavalla menetelmällä: Middleton, J. H., Edgell, M. H. ja Hutchison III, C. A., J. Virol. 10, 42 (1972). Haemophilus suis-organismin entsyymi, 25 Hsu I, katalysoi saman paikkaspesifisen hydrolyysin samassa tunnistuskohdassa kuin Hind III. Näin ollen näitä kahta entsyymiä voidaan pitää funktionaalisesti vaihtoehtoisina.

Kaksois-cDNA:n päihin liittämistä varten on edullista käyttää kemiallisesti syntetisoitua kaksisäikeistä dekanuk- 30 leotidia, joka sisältää Hind III:n tunnistuskohdan. Kaksisäi-keisen dekanukleotidin sekvenssi on esitetty kuvassa 1, ks.

Heyneker, H. L. et ai., ja Scheller, R.H. et ai., edellä. Alalla työskenteleville on tarjolla useita tällaisia tunnis-tuskohtasekvenssejä, ja tästä syystä on mahdollista valita 35 kaksois-cDNA:n päät kussakin tapauksessa tarvittavalle restriktioendonukleaasille sopiviksi.

21 65447

Restriktiokohtasekvenssien liittäminen cDNA:n päihin voidaan toteuttaa menetelmällä, jota kutsutaan tylppään päähän liittämiseksi, ja jolloin katalysoidaan DNA-ligaasilla, joka on puhdistettu seuraavalla menetelmällä: Panet, A. et 5 ai., Biochemistry 12, 5045 (1973). Edellä mainitut Sgaramel-la, V. et ai. ovat selostaneet tylppään päähän liittämisreak-tiota. Tylppään päähän liittämisessä, jossa reaktio tapahtuu tylppäpäisen cDNA:n ja suuren molaarisen ylimäärän kanssa kaksisäikeistä dekanukleotidia, joka sisältää Hind III endo-10 nukleaasin tunnistuskohdan,‘saadaan tuotteeksi cDNA, jonka kummassakin päässä on Hind III:n restriktiokohtasekvenssi.

Kun reaktiotuote käsitellään Hind ΙΙΙ-endonukleaasilla, tapahtuu katkeaminen restriktiokohdassa ja muodostuu yksisäikei-set itsekomplementoituvat 5'-päät, kuten kuviosta!ilmenee.

15 4. Yhdistelmä-DNAin siirtovektorin muodostaminen

Periaatteessa voitaisiin käyttää monenlaisia virus-ja plasmidi-DNA-molekyylejä muodostettaessa rekombinantteja juuri kuvatulla tavalla valmistetun cDNA:n kanssa. Pääehtoi-na ovat, että DNA:n siirtovektori kykenee pääsemään isäntä-20 soluun ja replikoitumaan siellä, ja vektorilla pitäisi olla sellainen geneettinen ominaisuus, jonka avulla voidaan erottaa ne isäntäsolut, jotka ovat saaneet vektorin. Yleisistä turvallisuussyistä pitäisi valinta kuitenkin rajoittaa koe-tyyppiin soveltuviin siirtovektorilajeihin NIH:n ohjeita 25 noudattaen, ks. edellä.

Tällä hetkellä käyttöön hyväksyttyjä sopivia siirto- vektoreita ovat mm. useat bakteriofagilambdajohdannaiset (ks. esim. Blattner, F.R., Williams, B.G., Blechl, A.E.,

Denniston-Thomson, K., Faber. H.E., Furlong, L.A., Grunwald, 30 D.J., Kiefer, D.O., Moore, D.D., Schumm, J.W., Sheldon, E.L.

ja Smithies, O., Science 196, 161 (1977)) ja col E1-plasmidi-johdannaiset (ks. esim. Rodriquez, R.L., Bolivar, S., Goodman, H.M., Boyer, H.W. ja Betlach, M.N., INC-UCLA Symposium on Molecular Mechanism in the Control of Gene Expression, 35 D.P. Nierlich, W.J. Rutter, C.F. Fox, Eds. (Academic Press, NY, 1976) ss. 471 - 477). Col E1:stä johdetuille plasmideil- 22 65447 le on ominaista suhteellisen pieni koko, sillä niiden mole-kyylipaino on muutaman miljoonan luokkaa, ja se että normaaliolosuhteissa plasmidi-DNA:n kopioiden luku isäntäsolua kohti on 20 - 40, mutta se saadaan nostetuksi tuhanteen tai 5 sitäkin suuremmaksi, kun isäntäsolut käsitellään kloramfeni-kolilla. Isäntäsolun kyky suurentaa sisältämäänsä geenimää-rää tekee tietyissä olosuhteissa mahdolliseksi sen, että isäntäsolu tuottaa pääasiassa plasmidigeenien koodaamia proteiineja. Näin ollen tällaiset col E1-johdannaiset ovat 10 edullisia siirtovektoreita tämän keksinnön sisältämässä menetelmässä. Sopivia col E1-johdannaisia ovat mm. plasmidit pMB-9, jonka sisältämä geeni aiheuttaa vastustuskyvyn tetra-sykliinille, ja pBR-313, pBR-315, pBR-316, pBR-317 ja pBR-322, jotka sisältävät tetrasykliiniresistenssigeenin ja ampisil-15 liiniresistenssigeenin. Resistenssiä aiheuttavan geenin läsnäolo tarjoaa sopivan keinon, jolla voidaan valita solut, jotka ovat infektoituneet plasmidilla, sillä tällaiset pesäkkeet kasvavat lääkkeen läsnäollessa, mutta jos plas-midia ei ole, solut eivät kasva. Tämän selityksen sisältä-20 missä esimerkeissä käytettiin col E1:stä johdettua plasmidia, joka sisälsi e.m. resistenssigeenin ja yhden Hind III-tun-nistuskohdan.

23 6 5 4 4 7

Plasmidia pBR-322 on pitkälle karakterisoitu.

Bolivar, F. et al. (Gene 2 (1977) 95) on kuvannut tämän plasmidin syntetisoinnin ja karakterisoinnin. Plasmidin

C

p3R322 molekyylipaino on 2,7 x 10 daltonia (Bolivar F., 5 Gene 4 (1978) 121), ja se sisältää ampisilliiniresistens-

R · R

sin (Ap :n) ja tetrasykliiniresistenssin (Te :n) aiheutta-

^ R

vat geenit. Edellä mainitussa Ap -geenissä on yksi

R

endonukleaasin Pst 1 tunnistuskohta. Te -geenissä on yksi tunnistuskohta kullekin seuraavista endonukleaaseista: 10 Hind III, Sal I ja Bam HI. Lisäksi pBR322 sisältää yhden Eco RI:n tunnistuskohdan, kaksi Hind II:n tunnistuskohtaa, viisi Eco RII:n tunnistuskohtaa, kolme Bgl I:n tunnistuskohtaa, 12 Alu I:n tunnistuskohtaa, 12 Hae II:n tunnistuskohtaa ja 17 Hae III:n tunnistuskohtaa. Tunnistuskohdat on 15 merkitty renkaan muotoiseen pBR322-plasmidiin sivulla 103

R

Bolivarin et ai. julkaisussa. Ap -geeni häviää lohkaistaessa plasmidi Pst I:n tunnistuskohdasta ja liitettäessä

R

vierasta DNA:ta siihen. Samoin Te häviää lohkaistaessa pBR 322 endonukleaaseilla Hind III, Vai I tai Bam I ja 20 liitettäessä vierasta DNArta niiden tunnistuskohtaan.

Liitettäessä DNA Pst I:n tunnistuskohtaan muodostuu rekombi- naatiomolekyylejä, jotka voidaan todeta kannoista, jotka e ovat sekä ampisilliinisensitiivisiä (Ap ) että tetrasyklii- ' n niresistenttejä (Te ) samoin liittämällä DNA Hind III:n, 25 Sal I:n tai Bam HI:n tunnistuskohtaan muodostuu rekombi-naatiomolekyylejä, jotka voidaan todeta kannoista, jotka ovat sekä ampisilliiniresistenttejä että tetrasykliini-sensitiivisiä. Siiriäjävektori, joka sisältää johonkin edel- 24 65447 lä mainittuun neljään tunnistuskohtaan liitettyä vierasta DNA:ta, voidaan karakterisoida siirtäjävektorin lääke-aineresistenssiominaisuuksien perusteella eli siitä, onko se ampisilliinisensitiivinen ja tetrasykliiniresis-5 tentti tai ampisilliiniresistentti ja tetrasykliini- sensitiivinen. Siirtäjävektori voidaan edelleen karakterisoida poistamalla siihen liitetty vieras DNA, määrittämällä muodostuneiden kahden tuotteen molekyylipaino ja vertaamalla näitä lähtöaineiden molekyylipainoihin. Li-10 saksi karakterisointia voidaan täydentää merkitsemällä siirtäjävektoriin eri endonukleaasien tunnistuskohdat. Siirretyn DNA-molekyylin sekvenssi voidaan myös määrittää. Mainitun plasmidin pBR322 koko nukleotidisekvenssi on esitetty J. Sutcliffen väitöskirjassa "Nucleotide 15 Sequence of pBR322", Harvard University, Cambridge, Massachusetts, USA.

Samoin plasmidia pBR313 on pitkälle karakterisoitu. Tämän plasmidin syntetisoinnin ja karakterisoinnin ovat kuvanneet Bolivar, F. et ai. (Gene 2 (1977) 75).

6 20 Plasmidin pBR313 molekyylipaino on 5,8 x 10 daltonia, ja se sisältää ampisilliiniresistenssin (Ap ) ja tetrasyk-liiniresistenssin (Te ) aiheuttavat geenit. Plasmidin pBR313 Te -geenissä on yksi tunnistuskohta kullekin seuraavista nukleaaseista: Hind III, Sal I ja Bam HI.

25 Plasmidin pBR313 tunnistuskohdat eri endonukleaaseille on määritetty täydellisesti, ja tästä tuloksena saatu tunnis-tuskohtakartta on esitetty sivulla 84 Bolivarin et ai. julkaisussa. Liitettäessä vierasta DNA:ta Hind III:n,

Sai I:n tai Bam HI:n tunnistuskohtaan tetrasykliiniresis-30 tenssi häviää. Täten yhdistelmä-DNA-molekyylejä löydetään kannoista, jotka ovat sekä ampisilliiniresistenttejä että tetrasykliinisensitiivisiä. Siirtäjävektori voidaan karakterisoida lääkeaineresistenssiominaisuuksien, siirretyn DNA-sekvenssin, restriktioentsyymin tunnistuskohtakartan 35 ja edellä mainittujen molekyylipainojen perusteella.

25 6 5 4 4 7

Kolmas plasmidi, jota on pitkälle karakterisoitu, on pMB 9. Tämän plasmidin valmistusmenetelmän ovat esittäneet Rodriguez, R.L. et ai. (edellä) ja Bolivar, F.

et ai. (Gene 2 (1977) 75). Plasmidin pMB 9 6 5 molekyylipaino on 3,5 x 10 daltonia, ja se sisältää

R

tetrasykliiniresistenssin (Te ) aiheuttavan geenin. Tämä plasmidi sisältää yhden tunnistuskohdan kullekin seu-raavista endonukleaaseista: Eco Rl, Hind III, Sal I ja

Bam HI; Näistä kolmen jälkimmäisen tunnistuskohdat si-10 jaitsevat Te -geenissä. Liitettäessä vierasta DNA:ta

Hind III:n, Sai I:n tai Bam Hirn tunnistuskohtaan tetra-sykliiniresistenssi häviää. Siirtäjävektori, joka sisältää vierasta DNArta joissakin näistä kohdista, voidaan karakterisoida tämän ominaisuuden perusteella. Tämä siir-15 täjävektori voidaan edelleen karakterisoida määrittämällä siirretyn DNA-molekyylin sekvenssi, vertaamalla molekyyli-painoja ja tunnistuskohta-analyysillä, kuten edellä on kuvattu.

Plasmidia pSCIOI on pitkälle karakterisoitu. Cohen, 20 S.H et ai. (Proc. Natl-Acad. Sei. USA 70 (1973) 1293) ovat kuvanneet tämän plasmidin syntetisoinnin ja alustavan karakterisoinnin. Karakterisointia ovat täydentäneet

Cohen, S.N. et ai. (Proc. Natl. Acad.Sci. USA 7 0 (1973) 32U0

Boyer, H.W. et ai (Recombinant Molecules), Beers, R.F. ja 25 Basset, E.G. toim. , Raven Press, New York, s. 13 (1977) ja Cohen, S.N. et ai (Recombinant Molecules, s. 91).

0

Plasmidin pSCIOI molekyylipaino on 5,8 x 10 daltonia,

R

ja se sisältää tetrasykliiniresistenssin (Te ) aiheuttavan

D

geenin. Te -geeni sisältää yhden tunnistuskohdan kullekin 30 seuraavista endonukleaaseista: Hind III, Sal I ja Bam HI. Lisäksi plasmidi pSCIOI sisältää yhden Eco RI:n tunnistuskohdan, yhden Hpa I:n tunnistuskohdan, yhden Sma I:n tunnistuskohdan ja neljä Hinc II:n tunnistuskohtaa. Tetrasykliiniresistenssi häviää halkaistaessa pSCIOI endo-35 nukleaaseilla Hind III, Cal I tai Bam HI ja liitettäessä vierasta DNArta näiden tunnistuskohtaan. Liitettä- 26 6 5 4 4 7 essä DNA Hind III:n, Sai I:n tai Bam HI:n tunnistuskohtaan rekombinaatiomolekyylejä löydetään viljelmistä, jotka ovat tetrasykliinisensitiivisiä. Siirtäjävektori, joka sisältää johonkin edellä mainittuun kolmeen kohtaan lii-5 tettyä vierasta DNA:ta, voidaan karakterisoida siirtä-jävektorin resistenssiominaisuuksien perusteella. Siirtäjävektori voidaan edelleen karakterisoida (a) poistamalla siirretty vieras DNA-sekvenssi, määrittämällä molekyylipainot ja vertaamalla niitä keskenään, (b) laati-10 maila tunnistuskohtakartta ja (c) määrittämällä siirretyn DNA-molekyylin sekvenssi.

Sopivan isännän valinnassa on monia mahdollisuuksia samoin kuin plasmidin valinnassa. Tässä selostuksessa kuvattuihin menetelmiin on kehitetty E. coli-kanta X-1776, 15 jonka NIH on hyväksynyt, kun käytetään P2-työskentelytilo-ja (ks. Curtiss III, R., Ann. Rev. Microbiol. 30, 507 (1976)). E. coli RR-1 on sopiva, kun P3-työskentelytilat ovat käytettävissä.

Rekombinoidut plasmidit muodostetaan siten, että 20 sekoitetaan keskenään restriktioendonukleaasilla käsiteltyä plasmidi-DNA:ta ja cDNA:ta, jonka pääteryhmät ovat vastaavasti käsitellyt. Plasmidi-DNA:ta käytetään suuri molaa-rinen ylimäärä cDNAihan verrattuna, jotta cDNA-segmentit muodostaisivat mahdollisimman vähän kombinaatteja toistensa 25 kanssa. Aikaisemmissa menetelmissä tämä on johtanut siihen, että suurin osa prosessin plasmideista on sellaisia, jotka eivät sisällä cDNA-fragmenttia. Näin ollen valintaprosessista on tullut vaivalloinen ja aikaavievä. Aikaisemmin tämä ongelma on ratkaistu siten, että on yritetty rakentaa sellai-30 siä DNA-vektoreita, joissa on restriktioendonukleaasin tunnis-tuskohta sopivan merkkigeenin keskellä siten, että rekombi-nantin liittäminen jakaa geenin ja samalla geenin koodaama toiminta häviää.

27 6 5 447

On edullista käyttää sellaista menetelmää, jolla niiden pesäkkeiden lukumäärä saadaan mahdollisimman pieneksi, joista rekombinoitua plasmidia etsitään. Menetelmässä toimitaan siten, että restriktioendonukleaasilla katkaistu 5 plasmidi-DNA käsitellään alkalisella fosfataasilla (valmistaja Worthington Biochemical Corporation, Freehold, New Jersey). Alkalinen fosfataasi poistaa 5'-päiden fosfaatit endonukleaasin synnyttämistä plasmidin päistä ja estää plasmidi-DNA:n itseligaation. Näin ollen renkaanmuodostus 10 ja samalla transformaatio riippuu siitä, että tapahtuu 5'-fosforyloidut päät sisältävän DNA-fragmentin liittyminen. Kuvattu menetelmä vähentää ilman rekombinaatiota tapahtuvan transformaation suhteellista esiintymistä määrään, joka on alle 1/104.

15 Tämä keksintö perustuu siihen, että DNA-ligaasin katalysoima reaktio tapahtuu DNA:n 5'-fosfaattipääteryhmän ja DNA:n 3'-hydroksyylipääteryhmän välillä. Jos 5'-fosfaatti puuttuu, ei liittymisreaktiota tapahdu. Kun kaksisäikei-set DNA:t pitää yhdistää, on olemassa kolme tilannetta, 20 kuten taulukosta 1 ilmenee: 28 65447

Taulukko 1

Tapaus Reagoivat yhdisteet Ligaasituote 1 3' 5’ 3' -5' -ΠΗ H 0 PO- -O-P-O-- -o?o3u + 1 ·*Η0- O-P-O--±zh2o 5’ 3' 5' 3’ II' 3' 5’ 3' 5’ --011 . }I2C3?-°---O-P-O-+u n -OH + 30H---OH HO-- l2° 5’ · 3' 5' 3' 111 3' 5’ .

_ou uo_ ei reaktiota -OH + KO- 5’ 3'

Taulukossa 1 on kaksisäikeinen DNA esitetty kaaviolli-sesti yhtenäisinä yhdensuuntaisina viivoina ja niiden vastaavat 5'- ja 3f-pääteryhmät on merkitty hydroksyy-leiksi (OH) tai fosfaateiksi (OPO^H^). Tapauksessa I on kummassakin reagoivassa molekyylissä päissä 5’-fosfaatti, ja näin ollen molemmat säikeet yhtyvät toisiinsa kovalent-tisesti. Tapauksessa II on liitettävistä päistä vain toisessa 5'-fosfaatti ja näin ollen vain toinen liitettävistä säikeistä liittyy toiseen kovalenttisesti ja toiseen säikeeseen jää epäjatkuvuuskohta. Kovalenttisesti liittymätön säie pysyy assosioituneena liittyneeseen säikeeseen vetysiltojen avulla, jotka esiintyvät vastakkaisten säikeiden komplementaaristen emäsparien välillä. Tapauksessa III ei kummassakaan reagoivassa päässä ole 5 1-fosfaattia eikä yhdistymisreaktiota tapahdu.

Näin ollen pitää poistaa 51-fosfaattiryhmä sellaisesta päästä, jonka liittyminen toiseen halutaan estää.

29 65447 Käytettäväksi sopii mikä tahansa 5'-fosfaattiryhmän poistomenetelmä, joka ei muuten vahingoita DNA-rakennetta.

Mieluiten käytetään alkalisen fosfataasin katalysoimaa hydrolyysiä.

5 Edellä kuvattu menetelmä on hyödyllinen myös siinä tapauksessa, että lineaarinen DNA-molekyyli halutaan katkaista kahteen alafragmenttiin, tavallisesti restriktio-endonukleaasia käyttämällä, ja sen jälkeen rekonstruoida 1 alkuperäiseksi sekvenssiksi. Alafragmentit voidaan puhdis-10 taa erikseen ja haluttu sekvenssi voidaan rekonstruoida yhdistämällä alafragmentit. Tähän tarkoitukseen voidaan käyttää DNA-ligaasia, joka katalysoi DNA-fragmenttien päiden liittymisen toisiinsa, ks. Sgaramella, V., Van de Sande, J.H. ja Khorana, H.G., Proc. Natl. Acad. Sei.

15 USA 67, 1468 (1970). Jos yhdistettävät sekvenssit eivät ole tylppäpäisiä, voidaan käyttää E. colista saatua ligaasia, ks. Modrich, P. ja Lehman, I.R., J. Biol. Chem 245, 3626 (1970).

Alkuperäisen sekvenssin rekonstruointia restriktio-20 endcnukleaasikäsittelyllä saaduista alafragmenteista parantaa suuresti^ jos voidaan käyttää menetelmää, jossa sopimattomien sekvenssien rekonstruoinnilta vältytään.

Sopimaton tulos voidaan välttää, jos halutun sekvenssin omaava homogeenisen pituinen cDNA fragmentti käsitellään 25 reagenssilla, joka kykenee poistamaan 5·-päätefosfaatti-ryhmät cDNA:sta ennen kuin homogeeninen cDNA lohkeaa res-triktioendonukleaasin vaikutuksesta. Tässä alkalinen fosfataasi on edullinen entsyymi. 5'-päätefosfaatit ovat rakenteellinen edellytys DNA-ligaasin alafragmentteja yhdistävälle 30 vaikutukselle. Näin ollen sellaisia päitä ei voida yhdistää kovalenttisesti, joissa ei ole 5'-päätefosfaattia. DNA-alafragmentit voidaan yhdistää vain sellaisiin päihin, jotka sisältävät 5'-päätefosfaatin, joka on muodostunut restriktioendonukleaasin eristettyyn DNA:han kohdistaman 35 katkaisevan vaikutuksen tuloksena.

30 65447

Edellä selostettu menettely estää sopimattomimman liittymisreaktion, nimittäin# että kaksi fragmenttia liittyisi käänteisessä järjestyksessä eli takaosa etuosaan eikä etuosa takaosaan. Muita mahdollisia sivureaktioita, \ 5 kuten dimeroitumista tai renkaanmuodostusta ei saada estetyksi#, koska nämä tapahtuvat reaktiotyypin II mukaisesti, vrt. taulukkoa 1 edellä. Tällaiset sivureaktiot ovat kuitenkin vähemmän haitallisia, koska ne johtavat fysikaalisesti indentifioitaviin ja erotettaviin tuottei-10 siin, kun taas käänteinen rekombinaatio ei sitä tee.

Edellä kuvattujen menetelmien valaisemiseksi rotan kasvuhormonin cDNA-koodi eristettiin# rekombinoitiin plas-midin kanssa ja siirrettiin E. coliin. Kun E. coli oli 15 replikoitunut voimakkaasti, havaittiin, että se sisälsi koodin rotan koko kasvuhormonille ja osille prekusoripep-tidiä ja osan translatioitumatonta 5'-aluetta.

Juuri kuvatulla menetelmällä voidaan eristää ja puhdistaa korkeamman organismin geeni, myös ihmisen geeni, 20 ja siirtää se mikro-organismiin, jossa se replikoituu. Selostuksessa kuvataan uusia rekombinoituja plasmideja, jotka sisältävät eristetyn geenin kokonaan tai osia siitä. Selostuksessa kuvataan uusia, mikro-organismeja, joita ei tähän mennessä ole löydetty luonnosta, ja joiden geneetti-25 nen rakenne sisältää korkeamman organismin geenin.

65447

Esimerkki 1 Tässä esimerkissä selostetaan rotan kasvuhormonin rakennegeenin DNA-sekvenssin eristys ja puhdistus, rotan kasvuhormonin koko rakennegeenin sisältävän siir-5 tovektorin syntetisointi ja sellaisen mikro-organismin konstruointi,jossa rotan kasvuhormonin rakennegeeni on geneettisen rakenteen osana.

Kun on kyse muista kuin ihmisestä peräisin olevista geeneistä, Yhdysvaltain turvallisuusmääräykset 10 eivät vaadi cDNA:n eristämistä niin puhtaana. Näin ollen oli mahdollista eristää rotan kasvuhormonin rakennegeenin koko cDNA siten, että eristettiin elektro-foreettisesti noin 800 emäsparia sisältävä DNA, jonka tiedettiin vastaavan rotan kasvuhormonin tunnettua 15 aminohapposekvenssiä. Rotan kasvuhormonin mRNA:n lähteenä käytettiin viljeltyjä rotan aivolisäkesoluja, jotka olivat solupolven GH-1 alaklooni, ja jota myy American Type Culture Collection, ks. Tashjian, A.H., et ai., Endochrinology 82, 342 (1968). Kun tällaisia 20 soluja kasvatetaan normaaliolosuhteissa, kasvuhormonin mRNA edustaa vain pientä prosenttiosuutta eli noin 1-3 % RNA:n sisältävästä kokonais-poly-A:sta. Kasvuhormonin mRNA:n tasoa pystytettiin kuitenkin nostamaan kilpirauhashormonien ja glukokortikoidien synergisti- g 25 sellä vaikutuksella. RNA saatiin 5 x 10 solusta, jotka oli kasvatettu suspensioviljelmässä, johon oli 4 vuorokautta ennen solujen talteenottoa lisätty 1 mM deksame-tasonia ja 10 nM L-trijodityroniinia. Polyadenyloitu RNA eristettiin viljeltyjen solujen sytoplasmisesta 30 kalvojakeesta, ks. Martial, J.A., Baxter, J.D., Goodman, H.M. ja Seeburg, P.H., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 1816 (1977) ja Bancroft, F. C., Wu, G. ja Zubay, G., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 70, 3646 (1973). mRNA puhdistettiin ja transkriboitiin kaksisäikeiseksi 3 5 cDNA:ksi oleellisilta osiltaan hakemuksen 810687 esimer- • keissä 1, 2 ja 3 kuvatuilla menetelmillä. Geelielektro- 32 65 4 47 foreesifraktioinnissa havaittiin heikko, mutta silti selvä kaista, joka vastasi noin 800 emäsparin pituista DNA:ta.

Koko viljeltyjen aivolisäkesolujen mRNArsta 5 transkriboidun cDNArn käsittely Hha I-endonukleaasilla antoi kaksi elektroforeettisessa erotuksessa ilmenevää suurempaa DNA-fragmenttia, jotka vastasivat noin 320 nukleotidia (fragmentti A) ja 240 nukleotidia (fragmentti B). Kun fragmenttien A ja B nukleotidisek-10 venssit analysoitiin esimerkissä 5 kuvatulla tavalla, havaittiin, että nämä fragmentit olivat todella rotan kasvuhormonin koodin osia, kun verrattiinjulkaistuihin rotan kasvuhormonin aminohapposekvenssitietoihin ja muihin tunnettuihin kasvuhormonisekvensseihin, ks.

15 Wallis, M. ja Davies, R.V.N., Growth Hormone and

Realted Peptides (Eds., Copecile, A. ja Muller, E.E.) ss. 1-14 (Elsevier, New York, 1976) ja Dayhoff, M.O., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5, suppl. 2, ss. 120-121 (National Biomedical Research Foundation, 20 Washington, D.C. 1976). Kun 800 emäsparia sisältävä kaksisäikeinen cDNA eristettiin elektroforeettisesti edellä kuvatulla tavalla ja sille suoritettiin samanlainen Hhal-endonukleaasikäsittely, päätuotteiden joukosta löydettiin kaksi fragmenttia, jotka vastasivat 25 pituudeltaan fragmentteja A ja B.

Koska noin 800 emäsparia sisältävää rotan kasvuhormonin cDNA:ta ei puhdistettu restriktioendonukle-aasikäsittelyä varten, oli tarpeen käsitellä DNA parittomien yksisäikeisten päiden poistamiseksi.

30 Tällaisten parittomien päiden poistaminen tapahtui ennen elektroforeettista erotusta liuoksessa, joka sisälsi 25 ^,ul 60 mM Tris-HCl, pH 7,5, 8 mM MgC^, 10 mM ^-merkaptoetanolia, 1 mM ATP ja dATP, dTTP, dGTP ja dCTP (200 ^uM kutakin). Kun seosta inkuboitiin 10 mi-35 nuuttia 10°C:ssa 1 yksikön kanssa E. colin DNA-polyme-raasi I:tä, saatiin ulkonevat 31-päät poistetuiksi ja 33 6 5 4 4 7 ulkonevat 5'-päät täytetyiksi eksonukleolyyttisesti. Boehringer-Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana, myy DNA-polymeraasi I:tä.

Noin 800 emäsparia sisältävään rotan kasvuhormo-5 n in cDNArhan liitettiin Hind III-tunnustuskohta hakemuksen 810687 esimerkissä 3 kuvatulla tavalla. Plasmidi pBR-322, jossa oli ainpi-silliinille vastustuskyvyn antava geeni ja Hind III-kohta siinä geenissä, joka antaa vastustuskyvyn tetrasykliinil-le, käsiteltiin Hind III endonukleaasilla ja alkalisella fosfa-10 taasilla esimerkissä 4 kuvatulla tavalla. Käsiteltyyn plasmidiin liitettiin 800 emäsparia sisältävä rotan kasvuhormonin cDNA DNA-ligaasin avulla hakemuksen 810687 esimerkin 3 mukaisella tavalla. Ligaasireaktioseos käytettiin E. coli X 1776-solusus-pension transformointiin hakemuksen 810687 esimerkissä 4 kuvatulla 15 tavalla. Rekombinanttipesäkkeet valittiin sen perusteella, että ne kasvoivat ampisilliiniä sisältävällä alustalla, mutta eivät kasvaneet alustalla, joka sisälsi 20 ^ug/ml tetrasykliiniä. Saatiin kymmenen sellaista pesäk-kettä, jossa oli plasmidi, johon oli liittyneenä 20 noin 800 emäsparia sisältävä osa, joka irtosi Hind III-katkaisulla.

800 emäsparia sisältävää rotan kasvuhormonin DNA:ta eristettiin preparatiivinen määrä rekombinanttikloonista pRGH-1 ja eristetyn DNA:n nukleotidisekvenssi määritettiin hakemuksen 2 5 810687 esimerkissä 5 kuvatulla tavalla. Löydetty nukleo tidisekvenssi sisälsi 5'-päässä alueen, jossa rotan kasvuhormonia vastaavaa translaatiota ei ollut tapahtunut, ja sekvenssin 26 aminohapolle, jotka ovat kasvuhormonin prekursoriproteiinissa ennen eritystä. Taulukossa 2 on 30 myös esitetty geenisekvenssistä johdettu mRNA-sekvenssi. Ennustettu aminohapposekvenssi vastaa kohtia 1 ja 8 lukuunottamatta hyvin rotan kasvuhormonin osia, joita Wallis ja Davies ovat selostaneet (vrt. edellä), ja jotka koskevat kohtia 1-43, 65-69, 108-113, 133-143 35 ja 150-190.

I 34 65447 1¾ 2 b 3 b Ϊ b .5 o » « w Ο Π U h > !> -1 u -3 ρ ο. η υϋ o <i j5 p < p

eft 2 h ,5 b 2. b « {J 3<J c-o o o G

•5| Ho O U oh St?. ft U ft d Gd G

8*5' £8 -5 b π H 3 b Pd pg «< b ft Ή U!~ ="^ ^ H Π P ft' C H H G U u .SiP jg °gb 5Ö S3b bb 5¾¾ 2,b < 8 -8 2 Ju <u ρ p oo-h< o < b 1¾ jb ;2b £G 3b 2G =< .2·« g .¾ fg £ “ ~ ^ -° -1° f- H O U “O o Q(J 8 Z U h h ,5 b £ b G b « s 3 0 u lie *>< OJ «0 <*fc 2 6 i3 2Ö b Q U o SP Z2H n y a U to U 30 C_ u o

-§ ft r, EC Go Go rt ho OH W < O

^ 2H w-. -CO < o HH < O HO <0 o 8§S £8 ud 5G £?b £b o P «o ' b

h< <o < < ft b < ö h^ G

§5jg oh 3h -5 83 3b £8 cp «g u ft.-ftf Ju °'J ^G g d st g <n 2b G b ft b 3 b HO ϊ 8 p ;$ g ft b " ° M p *- η < u b Eh h H (1) i y ft ft O O 8 ft ft b'G 'bp 2,0 5 % ? „ ^ - < ^ ^ PP op ft < b . »gf 28 IS £-5 3g 5C ?S S8 3 0 Ι·§ g p* Gd ft b Id |ft 18 Id b ^ 1 ill a§ si; s33 Ιδ §|g I!g η· ί *e§oj> cJu S;, ^’3 £f3 ojH > ο oj,- <

H lii Ju «« ' << x< 3b S8 38 X

C W C· U U f-^ π Π p*fn m < > * , . , H

[Λ ί {/)+** Λ) - > Jjh^ CO C.O i-< 5—< WP—« n •Hg< <c -< od Gd ftd ftd id *· H h! - Ο ϊ 8 2b b b ftb CO uoo pp Gd ftG ft 3^1 -5b Sb *fc «8 Sf: 3b < 1^2 <α - < CP Eh h o 3$ £% b <!:!§(§ Π U μ 2 u b’b bb C o 30 3 < u §^> I = < HU HH Gd M < Gd H O G O b δ|·5· lb l§ Gd Gd ^ 3 8 ί <L>Ejl/) ' · P PP << ou HO < O <

* c nb uG 2b UP OH 0)hP

^ g* s; <a < p <% nbb sal la S3 §8 *s sg »< i?8 3

T3 Τι Ρ PP PP HO HO <0 <UH

& S 5 " 3 fd jib ft b « Η « H O.H U>ud

C Hi, nC Η P HH HO (Λ-ι-, u O H

C a b °· H H < (X. H < O -r, o < O U

° 0 q 8 hG bbSSb COOCO HOOMHH

DMO U <b G d ft b n ; f OOOOHOO

(/)0-5 ο P P P P-iO OOHUU (/) < h oh h Ο Ό ^ G h’G 2 d J2 b HU 0)0 MO (nob

XXIO) b ud "T3 H O IUH HH U O >, <; O

3 O j o pp p *4 <u > o h< < o h«5< 3·5η G h G 2 b pc O O · >, O uU u O <

DEM H-b y? d HO HO HO 0)H OHH

H D O U ° Η Ρ HP PO x < z<o

§ C bb ft b bb HO 3 b c P ^ p U

jt .?. °° H< P c ou oo C y > o <

Mt b J0'5 «-b ^p cp c*1! do toob a 8 s- ·<- 0¾ s3 58 ;s ä G 2 G d G 3tJ °-P 3 O 0.0 3 0 < ! <6 38 ts S3 53 SC? -1 Ρ" P n)H Η -ί; Η-ζ 0.0 0/H v-() b

" Hb Gb db Ä8 ftd G

35 65447

Esimerkki la. (i) Esimerkki 1 toistettiin, paitsi että plasmidin pBR322 DNA:n tilalla käytettiin plasmidia pMB-9, joka oli valmistettu Rodriguezin et ai. kuvaamalla menetelmällä (edellä). Käytetyt olosuhteet olivat 5 muuten samat kuin esimerkissä 1, paitsi että selektio suoritettiin hakemuksen 810687 esimerkin 4 mukaisella tavalla. Yhdistel-mäplasmidiin liitetty DNA-fragmentti erotettiin, jolloin saatiin noin 800 emäsparia sisältävä DNA-fragmentti, jonka nukleotidisekvenssi on esitetty taulukossa 2.

10 (ii) Esimerkki 1 toistettiin, paitsi että plasmi din pBR322 DNA:n tilalla käytettiin plasmidin pSCIOI DNA:ta, joka oli valmistettu Cohenin et ai. kuvaamalla menetelmällä (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 70 (1973) 1293). Kaikki reaktio-olosuhteet olivat samat, ja selektio suo-15 ritettiin samalla tavalla kuin plasmidia pMB-9 käytettäessä. Yhdistelmäplasmidiin liitetty DNA-fragmentti erotettiin, jolloin saatiin noin 800 emäsparia sisältävä DNA-fragmentti, jonka nukleotidisekvenssi on esitetty taulukossa 2.

20 (iii) Esimerkki 1 toistettiin, paitsi että plasmidin pBR322 DNA:n tilalla käytettiin plasmidin pBR313 DNA:ta, joka oli valmistettu Bolivarin et ai. kuvaamalla menetelmällä (Gene 2 (1977) 75). Kaikki käytetyt olosuhteet lopullinen selektio mukaanlukien olivat 25 samat. Yhdistelmäplasmidiin liitetty DNA-fragmentti erotettiin, jolloin saatiin noin 800 emäsparia sisältävä DNA-fragmentti, jonka nukleotidisekvenssi on esitetty taulukossa 2.

Esimerkki 1. b. Esimerkit 1 ja 1 a toistettiin, paitsi 30 että E. colin X-1776 tilalla käytettiin E. colia RR1 tai E.colia HB101. Käytetyt olosuhteet olivat samat, ja saatiin samat tulokset.

f ( 65447 36

Esimerkki 2 Tässä esimerkissä selostetaan ihmisen kasvuhormonin koko rakennegeenin eristys ja puhdistus, ihmisen kasvuhormonin koko rakennegeenin sisältävän rekombinoidun plasmidin syntetisointi ja sellaisen mikro-organismin 5 tuottaminen, jossa ihmisen kasvuhormonin koko geeni on geneettisen rakenteen osana.

Ihmisen kasvuhormonin mRNA:n eristys suoritettiin oleellisilta osiltaan esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, mutta biologisena lähteenä käytettiin ihmisen aivolisäke-10 kasvaimen kudosta. Viisi hyvänlaatuista ihmisen aivolisä-kekasvainta, jotka oli poistettu leikkauksella ja nopeasti jäähdytetty nestemäisessä typessä, ja jotka painoi-vat 0,4-1,5 g kukin, sulatettiin ja jauhettiin 4°C:ssa liuoksessa, joka sisälsi 4 M guanidiniumtiosyanaattia 15 ja 1 M merkaptoetanolia, ja joka oli puskuroitu pH-ar-voon 5. Homogenaatti kerrostettiin 1,2 ml:aan 5,7 M CsCl, joka sisälsi 100 mM EDTA, ja sentrifugoitiin 18 tuntia 15°C:ssa nopeudella 37 000 r/min Beckman-ultra-sentrifugin roottorilla SW 50,1 (Beckman Instrument 20 Company, Fullerton, California). RNA kulkeutui putken pohjalle. Jatkopuhdistus tapahtui käyttämällä oligo-dT-pylvästä ja sakkaroosigradienttisedimentointia hakemuksen 810687 esimerkeissä 1-3 kuvatulla tavalla. Noin 10 % näin eristetystä RNA:sta koodasi kasvuhormonia päätellen 25 reaktioaktiivisen aminohappoprekursorin sisällyttämises tä vehnänalkiosta saatuun antikasvuhormonisaostusmate-riaaliin soluttomassa translaatiosysteemissä, ks.

Roberts, B.E. ja Patterson, B.M., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 70, 2330 (1973). Ihmisen kasvuhormonin cDNA val-30 mistettiin oleellisilta osiltaan esimerkissä 1 ku vatulla tavalla. Ihmisen kasvuhormonin cDNA fraktioitiin geelielektroforeettisesti ja kloonaukseen valittiin jae, joka liikkui noin 800 nukleotidia vastaavaan kohtaan. Valittu jae käsiteltiin DNA-polymeraasi I:llä 37 6544 7 esimerkissä 1 kuvatulla tavalla ja sen jälkeen näihin liitettiin Hind ΙΙΙ-tunnistuskohta. Tämän jälkeen cDNA rekombi-noitiin DNA-ligaasin avulla plasmidiin pBR-322, joka oli käsitelty alkalisella fosfataasilla. E. coli X-1776 transfor-5 moitiin rekombinoidulla DNA:11a ja valittiin kasvuhormonin DNA:n sisältämä kanta esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Kasvuhormonin DNA:n sisältävää kantaa kasvatettiin preparatii-vinen määrä ja kasvuhormonin DNA eristettiin nukleotidisek-venssin määrittämistä varten. Kasvuhormonin kloonatun DNA:n 10 havaittiin sisältävän ihmisen kasvuhormonin koko aminohappo-sekvenssin nukleotidikoodin. Ihmisen kasvuhormonin ensimmäiset 23 aminohappoa ovat H„N-Phe-Pro-Thr-Ile-Pro-Leu-Ser- 10 ^ 20 Arg-Leu-Phe-Asp-Asn-Ala-Met-Leu-Arg-Ala-His-Arg-Leu-His-

Gln-Leu-. Sekvenssin loppuosa on esitetty taulukossa 3.

ni l 5 38 6 5 447 8.

CL, C 3 tj . ,

Jc 8 ub ' S2

8¾ · GG 3U ^ <u · ÄS

ii ° a 2 G 2 b 2 b Si «υ §s · ao ;y υυ •5- 19 53 2tS Jg 3§ 5.8 eJ 2P 2b 2;? is “c Era

1 Λ GO cu c J <** GO

?·3 ^o J5 3 «3 2g “t: o-u a « 'in · < ^ OO su "in ·

ft in — ° u u - .. -w — <J

•i< C ., ,, 3 u 2 2 u o Co -. ,. · <-> -. S? W H <2 « H 5 2 " μ

<υ λ> cui- w< "·' <·. m< J

I? 3»s -3 \ Jö 3g P . :

£<srw^ e u -,.. “ ^ < U

?H z .. - h wo u << -,. o >u u u 2 P £θ v u 2 P υ · 2 E 2*2 υ H -wii 2Π . u TJ fr- c --. ,_, . -1 O <j .V Tj r-t Π Π C *C ,-.. (_ 3 s >-5 u0 -¾ 3d Is 1¾ ¾ 1 5 0cu 22 |u 2g .< 2.

pw -0 Si O >,u · C.U*' h< y

g« in' o-j 2 b 25¾ »< 2 2 H

• 5 C J 3 c a u „ _ ° u u < "z. m i°o o c r; r* r-ι < 2 i —· u 2 <*> * S> J < tfb ^ H ^ O b

O W < o < ?. ^ < 2 < ^ vt o ’, G

S «2g £ H uu ^ $< d Ί §!ς ^ fr ' 3 ί · J; » cu y 2·*·^ □ p ^ ° -Ju J2 < o H .2B HH 2 2 la 5-¾ ea uu o · .

§ t ’ ir! hh 2 £ u 0¾ ^ υ ip bo ^ i a cl u p ni > ντ —I u ^ t-O wj< £2 u) <; u.

2 in ^ 0 u_, ύ 1-2 gg §p“ -δ «g g§ & g

_ C u ^ ocj r ,, J < (J

Cdl p* t_i «7 -« 3 0 * o to M C2 δ .2 β-υ .,2 p U.O o X i u -J-i: < < a

:^-¾ o o h 1? ^ H w 2. 2 2 ω ° U

Λ —i- · w η < o £ r j: !- P

L >> i, u -.. cut- b §ω 22 ou i'P £b 2 C-E OU 2 2 *υ ^ UH ί ä.v) 22 o tJ ib «t- 22 22 — mu G Ο v.., ou i'i 2 2b q:d p2 Ä'- ^5b Ib bd 2 ^ 2b q -3 ϋ a EP 2 b ί> b ib 2^ «h d cu — u -*ο to -t; p P «{ «- >>u il is !:- s-s ..«s |g ig s» 1¾ iJH ^ 22 la 22a r s u Oiu rto i^l-ria «3> i- ib -E a £a 22 ^ u •g 3 ~<u -O ou ^ ' <* ou fi-® p pri b a 2 a 2ra ^ °

Rw · -<<-i U(J J >> -j r,P

j ^ »j < > o ( m 39 65447

Esimerkki 3a. (i) Esimerkki 1 toistettiin, paitsi että plasmidin pBR322 DNA:n tilalla käytettiin plasmidin pMB-9 DNA:ta, joka oli valmistettu Rodriguezin et ai. kuvaamalla menetelmällä (edellä). Kaikki reaktio-olo- 5 suhteet olivat samat, paitsi että lopullinen selektio ' suoritettiin esimerkin 4 mukaisesti. Yhdistelmäplasmidiin liitetty DNA-fragmentti erotettiin edellä kuvatulla tavalla, jolloin saatiin DNA-fragmentti, joka sisälsi noin, 800 emäsparia ja jonka nukleotidisekvenssi on esi- 10 tetty esimerkissä 1.

(ii) Esimerkki 1 toistettiin, paitsi että plasmidin pBR322 DNA:n tilalla käytettiin plasmidin pSCIOI DNA:ta, joka oli valmistettu Cohenin et al kuvaamalla menetelmällä (Proc.Natl. Acad. Sei. USA 70 (1973) 1293).

15 Käytetyt olosuhteet olivat samat, ja selektio suoritettiin samalla tavalla kuin plasmidi pMB-9 käytettäessä. Yhdistelmäplasmidiin liitetty DNA-fragmentti erotettiin edellä kuvatulla tavalla, jolloin saatiin noin 800 emäs-paria sisältävä DNA-fragmentti, jonka nukleotidisek- 20 venssi on esitetty esimerkissä \.

(iii) Esimerkki 1 toistettiin, paitsi että plasmidin pBR322 tilalla käytettiin plasmidin pBR313 DNA:ta, joka oli valmistettu Bolivarin et ai. kuvaamalla menetelmällä (Gene 2 (1977) 75). Käytetyt olosuh- 25 teet lopullinen selektiomenetelmä mukaanlukien olivat samat. Yhdistelmäplasmidiin liitetty DNA-fragmentti erotettiin edellä kuvatulla tavalla, jolloin saatiin noin 800 emäsparia sisältävä DNA-fragmentti, jonka nukleotidisekvenssi on esitetty esimerkissä 1.

30 Esimerkki 3b. Esimerkit 2 ja 2a toistettiin, paitsi että E. colin X-1776 tilalla käytettiin E. colia RR1 tai E. colia HB101. Käytetyt olosuhteet olivat samat ja saatiin samat tulokset.

r ^

Claims (1)

1. 4? 6 5 447 Patenttivaatimus Menetelmä kasvuhormonia koodaavan nukleotidisekvenssin sisältävän bakteerin valmistamiseksi, tunnettu 5 siitä, että a) mRNA eristetään aivolisäkesoluista homogenoimalla ne ribonukleaasia inhiboivan aineen läsnäollessa, jona aineena voidaan käyttää esimerkiksi noin 4 mol/1 guanidiniumtiosyanaattia ja 0,05...1,0 mol/1 fi- 10 merkaptoetanolia sisältävää liuosta pH:ssa 5,0...8,0, jolloin siis mRNA:n ribonukleaasihajoamista ei tapahdu, b) valmistetaan saadusta mRNAssta sinänsä tunnetulla tavalla käänteistransskriptaasientsyymin avulla sellainen cDNA, jolla on kasvuhormonia koodaava nukleotidisekvens- 15 si, ja mainittu cDNA muutetaan kaksisäikeiseksi, c) liitetään restriktioendonukleaasin tunnistus-kohtasekvenssit saadun kaksisäikeisen cDNA:n päihin sinänsä tunnetulla tavalla, jolloin restriktioendonukleaasina on sama entsyymi kuin seuraavassa kohdassa d), jonka jäl- 20 keen cDNA katkaistaan mainitun restriktioendonukleaasin avulla siten, että muodostuu kohesiivisia päitä, d) avataan bakteerin plasraidivektori restriktioendonukleaasin avulla, esimerkiksi Hind Ill:n, Hsu I:n tai Eco Rl:n avulla, sinänsä tunnetulla tavalla esimerkik- 25 si inkuboimalla pHrssa 7,6 37°C:ssa 2 tunnin ajan, jotta saadaan avattu plasmidivektori, jolla on kohesiiviset päät, e) hydrolysoidaan kohdassa d) saadun plasmidivek-torin 5'-fosfaattipääteryhmät käsittelemällä esimerkiksi alkalisella fosfataasilla pH:ssa 8,0 65°C:ssa 30 minuutin 30 ajan, jolloin kohdassa d) mainitut kohesiiviset päät eivät voi liittyä toisiinsa, f) liitetään kohdan e) mukaisesti käsitelty plasmidivektori ja kohdassa c) saatu cDNA sinänsä tunnetulla tavalla inkuboimalla DNA-ligaasin ja ATP:n läsnäollessa, 35 esimerkiksi pH:ssa 7,6 14°C:ssa tunnin ajan, käyttäen plas- 41 65447 midivektorin moolista ylimäärää, ja g) sekoitetaan bakteeri, kuten E. coli, esimerkiksi E. coli X-1776, ja kohdassa f) saatu reaktiotuote, jotta saadaan kasvuhormonia koodaavan nukleotidisekvenssin sisäl-5 tävä bakteeri. 42 6 5 4 4 7 Förfarande för framställning av en bakterie som in-nehäller en för tillväxthormon kodande nukleotidsekvens, 5 kännetecknat därav, att a) mRNA isoleras ur hypofysceller genom att homogenisera dessa i närvaro av ett ribonuk-leas inhiberande ämne, vilket kan utgöras t.ex. av en lös-ning innehällande 4 mol/1 guanidiumtiocyanat och 0,05...1,0 10 mol/1 /ft-merkaptoetanol, vid ett pH av 5,0...8,0, varvid säledes nägot ribonukleassönderfall av mRNA ej sker, b) ur den erhällna mRNA framställes pä i och för sig känt sätt med tillhjälp av ett reverstransskriptasenzym en sädan cDNA, vilken har en för tillväxthormon kodande nukleo- 15 sekvens, och den nämnda cDNAsn omvandlas tili tväträdig, c) tili den erhällna tväträdiga cDNA:ns ändar fo-gas restriktionsendonukleasens igenkänningsställesekvenser pä i och för sig känt sätt, varvid säsom restriktionsendo-nukleas användes saitana enzym som i följande steg d) , var- 20 efter cDNA:n kapas med tillhjälp av nämnda restriktionsendo-nukleas sä, att kohesiva ändar uppstär, d) en bakterieplasmidvektor öppnas med tillhjälp av en restriktionsendonukleas, t.ex. med Hind III, Hsu I, eller Eco Rl, pä i och för sig känt sätt t.ex. genom att 25 inkubera vid ett pH av 7,6 och en temperatur av 37°C i 2 timmar, för erhällande av en öppnad plasmidvektor med kohesiva ändar, e) den i punkt d) erhällna plasmidvektorns 5'-fosfatändgrupper hydrolyseras genom behandling med t.ex. al- 30 kalisk fosfatas vid ett pH av 8,0 och en temperatur av 65°C i 30 minuter, varvid de i punkt d) nämnda kohesiva ändarna ej kan förenas med varandra, f) den enligt punkt e) behandlade plasmidvektorn och den i punkt c) erhällna cDNA:n kopplas tili varandra 35 pä i och för sig känt sätt, genom att inkubera i närvaro av